JPH07504896A

JPH07504896A - アミノプロコラーゲン１（１）ペプチド

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Publication number: JPH07504896A
Application number: JP5513368A
Authority: JP
Inventors: ベイリンク，デビッド　ジェイ．; リンクハート，スーザン
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Current assignee: Individual
Priority date: 1992-01-31
Filing date: 1993-01-25
Publication date: 1995-06-01
Also published as: DE69315989T2; EP0631586A1; DE69315989D1; EP0631586A4; CA2128877A1; ATE161543T1; WO1993015107A1; US5599679A; EP0631586B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】アミノプロコラーゲンｌ　（１）ペプチド発明の分野本発明は、タイプＩコラーゲンのプロコラーゲン（α）１鎖のアミノ末端プロペプチドのレベルを測定することによって骨形成速度を決定するための方法に関する。

発明の背景を椎動物における骨形成は、骨の連続した生成及び連続した骨吸収を包含する動的工程である。オステオベニアは、骨吸収の速度が骨形成の速度よりも早い、いづれかの骨消耗疾病を説明するために使用される一般的用語である。オステオポローシスは、骨形成よりも骨吸収が高いために生じる骨格骨質量の進行性正味損失に起因する。オステオポローシスは、アメリカ合衆国のみにおいてほぼ２子方人が苦しんでおり、そしてオステオポローシス関連損傷からの合計費用は、年間少なくとも７０億ドルに達している（Ｂａｒｎｅｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ２３６　：　９１４　（１９８７））。その疾病をモニターするための主な困難性は、種々の処置法から生じる急性変化を測定する特定のアッセイの欠乏である。骨形成のための容易で信頼できる試験を有する必要性が存在する。

タイプＩコラーゲンは、他の組織の中で結合組織にユニークであり、そして骨において主成分である。このタイプのコラーゲンの正常な合成及び分解は、多くの種類の疾病、たとえばオステオポローシスの間、変えられ得る。骨は生命期間、代謝的に活性的な組織であるので、タイプＩコラーゲンのターンオーバーのインジケーターは、代謝的骨疾病におけるマーカーとして有用である。しかしながら、骨コラーゲンの代謝速度を評価するための主な手段は、コラーゲン性タンパク質に由来する、ヒドロキシプロリンの尿排出を定量化することであった。この試験は、退屈であり、いくつかの誤差源に関連し、そしてタイプＩコラーゲンに対して特異的ではない。

Ａｚｒｉａ、　Ｃａ１ｃｉｆ、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｉｎｔ、４５：　７〜１１　（１９８９）を参照のこと。

個々のタイプ■コラーゲン繊維は、お互い堅く結合している３個の長いらせん状のポリペプチド鎖（α鎖）から構成される。個々のタイプＩコラーゲンポリペプチドは、アミノ及びカルボキシ末端で追加の配列を含む大きなプロコラーゲン分子として合成される。プロコラーゲンの大きなアミノ及びカルボキシ末端はトリマーの整合及び結合において重要であると思われる。アミノ及びカルボキシ末端のプロペプチドは、α鎖が繊維にアセンブルされる前、特定のプロテイナーゼにより細胞外切断される。

タイプ■コラーゲンのカルボキシ末端プロペプチドとして言及される、カルボキシ末端から除去されるプロコラーゲンポリペプチドの部分は血液に見出されており、ここでその濃度は増殖の間、及び代謝的骨疾病において変化する。カルボキシ末端プロペプチドについてのラジオイムノアッセイは報告されており（たとえば、Ｔａｕｂｍａｎなど、、　５ｃｉｅｎｃｅ　１８６　：　１１１５〜１１１７（１９７４）　；　Ｔａｕｂ＋ａａｎなど、、　Ｐｒｏｃ。

Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、１５２　：　２８４〜２８７　（１９７６）　；及びＰａｒｆｉｔｔなど。

Ｊ、Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎ、Ｒｅｃ、　２：　４２７〜４３６　（１９８７））　、ここで前記アッセイは、培養されたヒト皮膚繊維芽細胞から得られ、そして次に消化、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過及びイオン交換ＨＰＬＣ（たとえばＭｅｉｋｋｏなど、、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、　３６：　１３２Ｂ　〜１３３２　（１９９０）により精製されたカルボキシ末端プロコラーゲンの消化物の使用を包含する。

タイプＩコラーゲンのアミノ末端プロペプチドに関する研究も少々報告されている。１９８７年、主な担汁性肝硬変を有する患者のグループにおいて、タイプ■ 及びタイプ■の両者のプロコラーゲンアミノプロペプチドが測定されたことが報告されている。これは、ウシ皮膚からの精製された抗原を用いてＥＬＩＳＡにより行なわれた。この研究は、タイプＩプロペプチドの量は、肝臓バイオプシーに基づく組織学的線維症の程度にかかわらず不変であるが、しかしタイプ■プロコラーゲンは疾病状態により有意に変化した（Ｄａｖｉｓなど、。

Ａｍｊ、Ｐａｔｈ、、　１２８　：　２６５　（１９８７））。

従って、生成するのに実際的であり、そして使用するのに便利である、骨形成の敏感且つ特異的測定のための必要性が存在する。たとえば、天然のプロコラーゲンの消化物は、便利には調製されず、対象の十分に定義されたエピトープに対する抗体の生成を可能にせず、そして開発するのに費用がかかる。本発明はそれらの多くの問題を回避し、そして感受性及び特異性に関する必要条件を満たし、そして他の関連する必要性を満たす。

発明の要約ヒトタイプＩコラーゲンのアミノプロペプチドのレベルを決定することに有用である組成物及び方法が提供される。アミノプロペプチドのレベルは、個人においてコラーゲン合成のマーカーとして使用され、そして従って、骨形成の敏感且つ特異的なインジケーターとして作用する。アミノプロペプチドのためのアッセイは、代謝的骨疾患、たとえばオステオポローシス又は閉経後の急速な骨損失者の診断、そのような疾病を処置するように企画された治療手段の効能のモニター、骨形成及び吸収の間の不均衡の程度の決定等に使用される。

本発明のアッセイは、プロコラーゲンαｌタイプＩのアミノ末端のペプチド及び前記ペプチドに対して特異的な抗体を使用する。より特定には、本発明のペプチドは、６〜５０個のアミノ酸を含んで成り、そしてプロコラーゲンα１タイプ■ の天然のアミノ末端プロペプチドと免疫学的に競争する少なくとも１つのエピトープを有する。

好ましい態様において、エピトープは、配列Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ− Ｇｌｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ　（ＰＥＰ２３−３１　［配列番号１））に含まれる。そのペプチドは典型的には、ラベリング及び同様のために接合を促進するために、Ｎ−又はＣ−末端で少なくとも１つのＣｙｓ及び／又はＴｙｒ残基をさらに含むであろう。プロコラーゲン分子のアミノ末端からの他のペプチドがまた提供される。本発明のペプチドに対して特異的に結合し、そして従って種々のイムノアッセイ型を可能にするポリクローナル又はモノクローナル抗体が供給される。

対象の個人から得られたサンプル、たとえば血清又は血漿におけるアミノ末端プロコラーゲンタイプ■のレベルを便利に決定するラジオイムノアッセイ及び酵素結合イムノソルベントアッセイが特に好ましい。

図面の簡単な説明第１図は、希釈され、そして合成ペプチド自体又は培養におけるヒト皮膚細胞から精製されたアミノプロコラーゲンα１　（■）のいづれかの種々の量と共にインキュベートされたペプチド（配列番号２）により注射されたウサギからの抗血清を示す。これは、合成ペプチド及び天然のアミノプロコラーゲンの両者が同等且つ類似する大きさのものであることを示す。

第２図は、正常な対象のグループ及び骨のパゲット（Ｐａｇｅｔ）病を有する患者のグループから得られた値、並びに、前記グループ間での平均値の大きな差異を示す。

特定の態様の記載本発明は、個人における骨形成の診断、スクリーニング及びモニターのための組成物及び方法に使用するためのタイプＩコラーゲンのプロコラーゲンα１鎖に由来するペプチドを提供する。前記ペプチド及び／又はそれに対する抗体は、プロコラーゲンα１　（１）活性のレベルを決定し、そして従って、骨生成の特異的且つ敏感な決定を提供するアッセイにおいて有用である。

好ましい態様において、本発明のペプチドは、タイプＩコラーゲンのプロコラーゲンα１鎖のアミノ末端プロペプチドに由来する。

そのアミノ末端プロペプチドは、タイプ■コラーゲンのプロα１鎖の残基２３〜１６１まで延び（残基ｌ〜２２はシグナル配列である）、ここで番号付けはＴｒａｍｐなど、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　２５４＋　９１９〜９２２　（１９８８）に従ってである。従らて、本発明によれば、アミノ末端プロペプチド配列の６〜５０個のアミノ酸〔配列番号１１）を含むペプチドが供給され、そしてこのペプチドは天然のアミノ末端プロペプチドと免疫学的に競争する少なくとも１つのエピトープを含む。ペプチド、便利には合成的に生成されたペプチドに対して生成された抗体は、良く知られたアッセイ方法を用いて、免疫学的に競争する少なくとも１つのエピトープを含む抗体と容易にアッセイするために使用され得る。

競争は典型的には、抗体に結合するためのエピトープによる特異的結合によるが、しかし多くの場合、エピトープ形状における立体的障害がまた、競争に寄与するかも知れないが、それ自体では、アッセイは典型的には、競争の実際の機構に無関係に最終結果のみを測定する。

本明細書に記載されるより好ましい態様において、プロコラーゲンペプチド（ＰＥＰ）は、アミノ酸残基２３〜３４（ＰＥＰｇｓ−ｚｔ　）　、残基２８〜３６（ＰＥＰｏ−０）　、残基４６〜５３（ＰＥＰ、＠−！３　）　、残基５２〜５８（ＰＥＰｓｘ−ｓｓ）、残基７６〜８２（ＰＥＰ７＠−１２）　、残基８４〜９１（ＰＥＰｓ＋−＊＋　；配列番号７）、残基９７〜１０８（ＰＥＰｓｔ−Ｉｏｓ　；配列番号８）、残基１１２〜１２１（ＰＥＰ＋　＋ｔ−＋＊＋　；配列番号９）又は残基１３０〜１３７　（ＰＥＰ＋３゜−１，７；配列番号１０）のＮ−末端領域に由来する。

本発明のプロコラーゲンαｌタイプＩ　“ペプチド”とは、プロコラーゲンα１タイプＩＮ−末端プロペプチド領域からの少なくとも７個のアミノ酸残基、時々好ましくは、本明細書に示される選択されたプロコラーゲンαｌタイプＩプロペプチド配列領域に由来する少なくとも８〜９、時４１０〜１２個の残基、及び通常約５０個よりも多くない、より通常には約３５よりも少なく、そして好ましくは２５よりも少ないアミノ酸残基の連続鎖を意味する。用語ペプチドは、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシ基との間でペプチド結合により結合される一連のアミノ酸を意味するように本明細書においては使用される。そのペプチドは、“合成的に”又は組換えＤＮＡ技法により調製され得る。ペプチドは好ましくは、天然に存在するプロコラーゲンαｌタイプＩタンパク質及びそのフラグメントを実質的に有さないであろう。ペプチドは、それらの中性（未変化）形又は塩である形で存在し、そして変性、たとえばグリコジル化、側鎖の酸化又はリン酸化のない形又はそれらの変性を含む形、たとえば前記変性がペプチドの免疫反応性を破壊しない条件を受けやすい形で存在する。

所望には、ペプチドは、大きなペプチドの免疫反応性の実質的にすべてを維持しながら、できるだけ小さくあるべきであろう。免疫反応性とは、プロコラーゲン αｌタイプ■のアミノ末端プロペプチドと免疫学的に競争する本発明のペプチドの能力を意味し、そして／又はそのペプチドは、プロコラーゲンα１タイプＩのアミノ末端プロペプチドに特異的に結合できる抗体の生成を刺激する能力を免疫原として使用される場合に有する。

本発明の好ましい免疫反応性プロコラーゲンαＩタイプ■アミノ末端ペプチドは、Ｎ−末端領域、すなわちアミノ酸残基２３〜３４（ＰＥＰ２．、、　）に由来する。この領域の代表的なペプチド態様は、次の配列のペプチドであり：ＰＥＰ２３−１．Ｃ配列番号ｌ〕ＧＩｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−ＶａｉＧｌｕ−Ｇｌｙ−ＧＩｎ−Ａｓｐ−ＧＩｕ−八ｓｐここで、前記ペプチドは、任意にＮ−及びＣ−末端を両端に有し、モして／又は所望には、プロコラーゲンα１タイプ■アミノ末端プロペプチド配列からのアミノ酸、キャリヤーに連結される、連結、ラベリング、他のＮ−及びＣ−末端変性を促進するために付加されるアミノ酸、等によりＮ−及びＣ−末端の１つ又は両者で変性され得る。ＰＥＰ２．、、の特に好ましい態様において、Ｃ−末端はさらに、特定用途のために所望される場合、便利なラベリング、ジスルフィド結合を通しての重合、吸収、等のためにＴｙｒ−Ｃｙｓ残基を含む。従って、そのように変性された１つのＰＥＰ２ｓ−ｚ、ペプチドは、Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ　（配列番号２〕を有し、そして下記例にさらに詳細に示される。

本発明のもう１つのプロコラーゲンαｌタイプエアミノ−末端プロペプチドは、下記アミノ酸２８〜３６の配列領域に由来する少なくとも６個の連続したアミノ酸残基を含んで成り：ＰＰＰ２＠−３６　（配列番号３〕Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｐｒ。

これは任意に、Ｎ−及び／又はＣ−末端で、たとえば追加のＴｙｒ及び／又はＣｙｓ残基を含む変性を包含する。

本発明のさらにもう１つのプロコラーゲンαｌタイプエアミノ−末端プロペプチドは、下記アミノ酸４６〜５３の配列領域に由来する少なくとも６個の連続したアミノ酸残基を含んで成り：ｐｃｐ４＆−ｓｓ　［配列番号４］Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ｔｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｔ−Ｔｒｐこれは任意に、Ｎ−及び／又はＣ−末端て、たとえば追加のＴｙｒ及び／又はＣｙｓ残基を含む変性を包含する。

プロコラーゲンαｌタイプＩのアミノ末端プロペプチドに由来する他のペプチドは、下記配列のアミノ酸５２〜５８の配列領域からのアミノ酸残基を包含し：ＰＥＰ５ｚ−５ｓ　［配列番号５〕Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓこれは再び、任意に、Ｎ−及び／又はＣ−末端での変性を包含する。

１つの典型的な変性は、Ｃ−末端でＴｙｒを含むが、しかし他の変性も本発明の範囲内に包含される。

追加のペプチドは、その領域が下記配列を有する、アミノ−末端プロペプチドプロコラーゲンαｌタイプ■のアミノ酸領域７６〜８２に由来し：ＰＥＰ７ｇ−ａｔ　Ｃ配列番号６〕Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒ。

これは任意に、Ｎ−及び／又はＣ−末端で追加のＴｙｒ及び／又はＣｙｓ残基及びより好ましくはペプチドＰＥＰ７＠−ｓ２のＣ−末端でＴｙｒを含む変性及び／又は特定用途のために所望されるような他の変性を包含する。

本発明はまた、その領域が下記配列を有する、アミノ末端プロペプチドプロコラーゲンαｌタイプＩのアミノ酸領域８４〜９１からのペプチドを含み：ＰＥＰ＝４−＊＋　（配列番号７〕Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓこれは任意に、Ｎ−及び／又はＣ−末端で、追加のＴｙｒ及び／又はＣｙｓ残基、より好ましくはたとえばペプチドＰＥＰ、、−９，のＣ−末端でＴｙｒを含む変性を包含する。

他のペプチドは、次の配列を有する、残基９７〜１０８．１１２〜１２１及び１３０−１３７からのプロコラーゲンα１タイプ■のアミノ−末端プロペプチドの領域に由来し；ＰＥＰｏ□−５゜、〔配列番号８〕Ａｓ　ｐ−Ｇ　Ｉ　ｙ−３ｅ　ｒ−Ｇ　Ｉ　ｕ−３ｅ　ｒ　−Ｐｒｏ−Ｔｈ　ｒ −Ａｓ　ｐ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｇ　１ｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈ　ｒＰＥＰｌｌ、−１□１　〔配列番号９〕Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＧｌｙＰＥＰ１＋。−１，７〔配列番号１０）Ｇｌｙ−Ａｒｇ− Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎこのペプチドは、任意に、Ｎ −及び／又はＣ−末端で追加のＴｙｒ及び／又はＣｙｓ残基を含む変性、及び／又は特定の用途のために所望される他の変性を包含する。

先に記載したように、追加のアミノ酸を、互いのペプチド結合を容易にするために、担体、支持体又はより大きなペプチドと結合させるために、そのペプチドの物理的又は化学的性質を修飾等するために、ペプチドの末端に付加させることができる。１以上のアミノ酸、例えば、チロシン、システィン、リジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸等を、そのペプチドのＣ−又はＮ−末端において導入することができる。さらに、ペプチド配列は、アミノ末端のアシル化、例えば、アセチル化、又はチオグリコール酸アミド化、カルボキシ末端アミド化、例えば、アンモニア、メチルアミン等により、修飾されることにより、プロコラーゲンα １タイプ！配列の生来のヒト・アミノ末端プロペプチドと異なることができる。

ある場合には、これらの修飾は、支持体又は他の分子への結合のための部位を提供することができる。

本発明のペプチド又はそれらのアナログであってプロコラーゲンα１タイプＩのアミノ末端との免疫反応性をもつものが、生来のプロコラーゲン配列から得られる非修飾のペプチドの免疫反応性を増加させ又は少なくとも有意に減少させないで、他の望ましい特性、例えば、改善された免疫反応性（例えば、生来のタンパク質との増加された免疫反応性）を提供するのに必要なものとして修飾されることができることが、理解できよう。例えば、そのペプチドを、様々な変更、例えば、挿入、欠失、及び置換であって、保存的又は非保存的ないずれかのものに、このような変更がそれらの用途において特定の利点を提供することができる場合に、供されることができる。保存的置換とは、アミノ酸残基を、生物学的及び／又は化学的に類似の他のものにより、例えば、ある疎水性残基を他のものと、又はある極性残基を他のものと、置換することを意味する。この置換は、例えば、Ｇｌｙ　、　Ａｌａ；　ＶａｌＳＩｌｅ　５Ｌｅｕ；　Ａｓｐ、　Ｇｌｕ；　Ａｓｎ、　Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；　ＬｙｓＳＡｒｇ；及びＰｈｅＳＴｙｒの組み合わせを含む。普通には、免疫反応性のプロコラーゲン・エピトープを実質的に真似ることを意図される配列の部分は、生来のプロコラーゲン配列から約２０％を超える程は違わないであろう。但し、追加のアミノ酸が、例えば、結合又はカップリング等を容易にするためにそのペプチドの物理的又は化学的性質を修飾する目的をもっていずれかの末端において添加されることができる場合がある。

プロコラーゲン・アミノ末端プロペプチドと免疫反応性である本発明の異なるペプチドが同定されるれば、ある場合には、組成物又は混合物内で２以上のペプチドを合わせることが望ましいかもじれない。組成物中のペプチドは、同一の又は異なるものであることができ、そしてそれらは、−緒に、親ペプチドよりと等価な又はそれよりも大きな免疫反応性を提供するはずである。例えば、本明細書中に記載する方法を使用して、２以上のペプチドは、異なる又は同じＮ−末端プロコラーゲン領域とは異なる又は重複する免疫反応性エピトープを定めることができ、このペプチドは、増強した免疫反応性を提供するためのカクテル内で組み合わされることができる。

本発明のペプチドは、ポリマーを形成するための結合を介して組み合わされることができる。同一のペプチドがそれ自体に結合し、それによりホモポリマーを形成する場合には、多数の反復エピトープ単位が提供される。そのペプチドが異なるとき、例えば、カクテルが異なるプロコラーゲン領域を提示するとき、反復単位をもつヘテロポリマーが提供される。共有結合に加えて、分子間及び構造内結合を作ることができる非共有結合も、本発明により、も（ろまれることかできる。

ホモ−若しくはヘテロ−ポリマーのための又は担体とのカップリングのための結合は、様々な方法で提供されることができる。例えば、システィン残基を、そのペプチドがそのシスティン残基の制御された酸化を介して共有結合される場合には、アミノ−及びカルボキシ−末端の両方において付加することができる。１つの官能基端におけるジスルフィド結合及び他におけるペプチド結合を作り出す多数のへテロ２官能価剤であってＮ−スクシジミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を含むものも有用である。

この試薬は、それ自体とあるタンパク質的のシスティン残基との間ジスルフィド結合及びリジン上のアミノ又は他の内の他の自由アミノ酸基を通してのアミド結合を創出する。多くのこのようなジスル（１９８２）を参照のこと。他の２官能価カップリング剤は、ジスルフィド結合よりもちしろチオエーテルを形成する。

これらのチオエーテル形成剤の多くは、商業的に入手可能であり、そして６−マレイミドカプロン酸、２ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド− メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸、等の反応性エステルを含む。このカルボキシル基は、それらを、スクシンイミド又はｌ−ヒドロキシ−２−ニトロ− ４−スルホン酸、ナトリウム塩とを組み合わせることにより活性化されることができる。特に好ましいカップリング剤は、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）である。もちろん、結合がその結合基のいずれの免疫反応性を実質的に妨害してはならないということが理解されよう。

他の態様においては、本発明のペプチドは、プロコラーゲン・エピトープを提示する他のペプチド、例えば、プロコラーゲン０１２４１１分子のカルボキシ末端からのものと、組み合わされ又は結合されることができ、それらの幾つかは、欧州特許公開第ＥＰ　３０４，２９２号（引用により本明細書中に取り込む。）中に記載されている。

先に述べたように、アミノ酸アームは、ペプチド又はオリゴペプチドのＣ−及び／又はＮ−末端において提供されることができる。

存在する場合には、そのアームは、普通には、少なくともｌのアミノ酸であろうし、そして５０以上のアミノ酸、よりしばしば１−１０アミノ酸、そして好ましくは、合成を容易にするために５未満のアミノ酸であることができる。このアームは、様々な目的、例えば、ペプチドを担体に付着させるための、固相にペプチドを固定化するための、スペーサー等を、提供する。担体、固相への結合のために有用な官能性を提供するために、又はより高次の構造、例えば、ダイマー、トリマー、又は他のマルチマーを形成するために、アミノ酸、例えば、トリプシン、システィン、アスパラギン酸等を、そのアーム又はペプチドのＣ−及び／又はＮ−末端において導入又は提供することができる。エピトープ提示及び／又は放射標識を強化するために、特に興味を有するものは、Ｃ−及び／又はＮ−末端における１からｌＯまでのアミノ酸の、より好ましくは、１〜５アミノ酸の、そして最も好ましくは、約１〜３アミノ酸の存在である。本明細書中に記載する特定のアミノ酸の特に好ましい態様は、３アミノ酸がアームとして付加されるとき、そのアームのＮ−末端残基を好ましくはＣｙｓとしながら、一般的にＮ−末端において、得られる。例示的な態様においては、そのペプチドとその末端官能基との間のスペーサー残基は、ＧＩｙである。末端のＣｙｓ残基も、ジチオ−若しくはチオ−官能性支持体へのジスルフィド結合又は活性化オレフィン支持体へのチオエーテル結合を通して結合されることができる。

本発明のペプチドは、多種多様な方法で製造されることができる。

それらの比較的短いサイズのため、そのペプチドは、慣用の技術に従って溶液中で又は固体支持体上で合成されることができる。様々な自動合成装置が商業的に入手可能であり、そして公知のプロトコールに従って使用されることができる。

例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ。

５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　２ｄ、　ｅｄ、、　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

（１９８４）　；　Ｔａｍ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　１０５：６４４２　（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３２：３４１−３４７　（１９８６）　；及びＢａｒａｎｙ　ａｎｄ　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　Ｇｒｏｓｓ　ａｎｄ　Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ、　ｅｄｓ、、　ＡｃｅｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、　１−２８４　（１９７９）（これらのそれぞれを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。本明細書中に記載する選択された領域に対応する、普通には約６から約３５〜５ｏアミノ酸までの、短いペプチド配列、又は重複ペプチドのライブラリーは、容易に合成されることができ、そして次に、タイプＩプロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド免疫優勢エピトープ等をもつ免疫反応性ペプチドを同定するために設計されたスクリーニング検定においてスクリーンされることができる。

あるいは、組換えＤＮＡ技術であって、問題のペプチドをエンコードしているヌクレオチド配列が発現ベクター内に挿入され、適当な宿主細胞内に形質転換又はトランスフェクトされ、そして発現に好適な条件下で培養されるようなものを、使用することができる。これらの手順は、一般的にＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）；　Ａｕ５ｕｂｅｌ　ｅＬ　ａｌ、、　（ｅｄ、）　ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８７）　、及び米国特許第４．２３７．２２４号、第４．２７３．８７５号、第４．４３１．７３９号、第４．３６３．８７７号及び第４．４２８．９４１号（例えば、これらの開示を、引用により本明細書中に取り込む。）中に記載されるように、本分野において一般的に知られている。したがって、本発明の１以上のペプチド配列を含んで成る融合タンパク質は、αｌタイプ■コラーゲンのアミノ末端プロペプチドの決定基を提供するために使用されることができる。

本明細書中でもくろまれた長さのペプチドのためのコーディング配列が化学的技術、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ。

１０３　：　３１８５　（１９８１）のホスホトリエステル法により合成されることができるので、修飾は、単に、生来のペプチド配列をエンコードしているもの代わりに適当な塩基を置換することにより、行われることができる。このコーディング配列は、次に、適当なリンカ−を提供され、本分野において一般的に入手可能な発現ベクター中に連結されることができ、そしてそのベクターを、所望の融合タンパク質を作り出すために好適な宿主を形質転換させるために使用する。多数の上記のようなベクター及び好適な宿主系が目下入手可能である。

融合タンパク質の発現のために、そのコーディング配列に、作用可能な状態で結合された開始及び終止コドン、プロモーター及びターミネータ−領域を、そして普通には、所望の細胞宿主内での発現のための発現ベクターを提供するための複製系を、提供する。例えば、バクテリア宿主と互換性のプロモーター配列を、所望のコーディング配列の挿入のために便利な制限部位を含むプラスミド内に提供する。得られた発現ベクターを、好適なバクテリア宿主内に形質転換させる。もちろん、酵母又は哺乳類細胞宿主も、好適なベクター及び制御配列を使用して、使用することができる。

本発明のペプチド及び抗体並びにそれらの組成物は、診断試薬としての使用がある。例えば、本明細書中に記載するようなペプチド、及び／又はそのペプチドに対する抗体を、個体内の骨形成の速度を測定するために使用することができる。

骨形成のための診断検定法は、しばしば骨再吸収検定法と共に、個体内の正味の骨バランスを評価するために使用されることができる。骨形成における適当な補足的増加を伴わない骨再吸収における増加は、骨粗しよう症又は他の失調をもたらすことができる。特定の個体における自由なアミノ末端タイプＩプロコラーゲンの量を、長い間にわたり監視し、そして骨形成における進行又は退行を測定することができる。また、個体からのサンプルを、類似の患者の１群から測定された相対レベルと比較し、そしてそれからのバラツキを疾患の進行又は退行のマーカーとして使用することができる。したがって、また、本明細書中で提供される診断検定を、骨再吸収関連疾患のための特定の治療養生法に対する個体の応答性を評価するために、治療プロトコールを修正するために、又は患った個体にための予後を確立するために、使用することができる。さらに、診断検定法を、個体が骨再吸収失調、例えば、骨粗しよう症に発展する実質的な危険状態にあるであろうことを予言するために、使用することができる。また、皮膚がプロコラーゲン・ペプチドの全循環プールに貢献するため、本明細書中に記載する検定法は、やけど患者又は重症な皮膚病変をもつ患者の症状を監視するために使用されることができる。

また、本発明の抗体及びペプチドは、例えば、プロコラーゲンを生産し、それによりその周囲のマトリックス内に沈着すべきコラーゲンを活発に生産する細胞を同定する骨芽細胞又は他の間充繊細胞を同定するための、免疫細胞化学における使用がある。他の用途は、プロコラーゲン・タイプ■の免疫アフィニティー精製を含み、ここでは、免疫精製技術は本分野において一般的に知られ、そして所望により、実質的に純粋な形態においてプロコラーゲンを単離するための本明細書中に記載する抗−ペプチド抗体のために改良されることができる。また、患者のサンプルを、米国特許第４．４５２．９０１号（引用により本明細書中に取り込む。）中に記載されるような、ウェスタン・プロット技術においてそのペプチドに対して調製された抗体を使用してプロコラーゲン・タイプＩアミノ末端の存在について分析することができる。本発明の抗体及びペプチドは、多種多様な他の検定、例えば、遺伝子ライブラリー等のスクリーニングにおける用途がある。

当業者により理解されるであろうが、多くにタイプの免疫検定を、本発明における使用のために利用できる。例えば、直接及び間接結合検定、競合検定、サンドイッチ検定、等であり、一般的に、例えば、米国特許第４．６４２．２８５号；第４．３７６、１１０号；第４．０１６．０４３号；第３．８７９．２６２号；第３．８５２．１５７号；第３．８５０．７５２号；第３．８３９．１５３号；第３．７９１．９３２号；及びＩ（ａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　Ｎ、Ｙ。

（１９８８）（これらのそれぞれを、引用により本明細書中に取り込む。）中に記載されている。

検定されるべきサンプルは、細胞外液、細胞成分又は細胞生成物であって、これに限定されないが、細胞及び細胞培養上澄液、細胞抽出物、組織抽出物、損傷液、尿、唾液、血液、血漿、血清、及びそれらの両分を含むものから得られる。プロコラーゲンαｌタイプｌの性質が細胞外で解裂すると信じられているので、典型的には、生物学的サンプルは、細胞外液又はそれから得られたものであろう。

但し、細胞表面を検定することもできる。

本ペプチド及び抗体組成物を、それらの用途に依存して非標識で又は標識して使用することができる。標識とは、検出可能なシグナルを直接的に又は間接的に提供する分子を意図する。様々な標識、例えば、放射性核種（例えば、　＋′Ｉ、　１３１ｔ、Ｊ（、”Ｃ）　、酵素蛍光剤、化学発光剤、酵素基質、補因子又はインヒビター、粒子（例えば、磁気粒子）、リガンド及びレセプタの組み合わせ（例えば、アビジン及びビオチン）、染料、等を、意図する。さらに、本ペプチド及びそれらへの抗体は、特定表面、例えば、マイクロタイター・プレート、ガラス又はラテクス・ビーズ、チューブ、フィルター、クロマトグラフィー表面、ニトロセルロース紙、セルロース、シリカ・ゲル、等に結合させるために、様々な方法で修飾されることができる。ペプチド及び抗体が他の化合物又は固相表面に結合されることができるような特定のやり方は、文献中に沢山の説明がある。

例えば、米国特許第４．３７１．５１５号：第４．４８７．７１５号；及びその中で引用される特許を参照のこと。先に述べたように、試薬、例えば、ｐ−マレイミド安息香酸、ｐ−メチルジチオ安息香酸、マレイン酸無水物、コハク酸無水物、グルタルアルデヒド、ヘテロ−２官能価架橋剤、等が、上記目的のために一般的に使用される。

１つの検定フォーマットにおいては、生物学的サンプル中のａｌタイプ■コラーゲンのアミノ末端プロペプチドの量を、そのサンプル中のアミノ末端タイプ■プロペプチドがそのペプチドに特異的な抗体との結合について本発明のペプチドと競合する程度を測定することによる競合タイプの検定において、測定する。幾つかの競合的検定フォーマットは公知であるが、１つの液相競合検定、例えば、ラジオイムノアッセイにおいては、（標識された又は標識されることができる）抗体及びペプチドが、免疫複合体形成を誘導する条件下でバッファー系内で相互作用に供される。アミノ末端プロペプチドを含む疑いのあるサンプルが、次に添加され、そしてその系は、一般的に平衡に達せられる。インキュベーションから得られる免疫複合体を、その後、回収し、そして標識の量は、その抗体に結合した本発明の標識ペプチドの量に正比例ながら、測定される。あるいは、そのサンプルを、最初にその抗体とインキュベートし、そしてその後又は同時に、本発明の標識ペプチドと共にインキュベートすることができる。

固相の競合タイプ免疫検定においては、本発明のペプチドの中の１つの配列内に含まれるエピトープ、例えば、ＰＥＰ２３−３４　［配列番号ｌ〕と免疫学的に反応性である一次抗体であってそのエピトープがプロコラーゲンα１タイプＩのアミノ末端プロペプチドのエピトープと免疫学的に競合するようなものが、共有結合又は非共有結合により、担体、典型的には不溶性固相、例えば、マイクロタイター・ウェルに、結合される。テストされるべき生物学的サンプルを、免疫複合体形成に誘導的な条件下でその抗体と共にインキュベートし、そして同時に又はその後のいずれかにおいて、再び、免疫複合体形成に誘導的な条件下で、本発明の標識されたペプチドの中の少なくともｌと、接触させる。特異的に結合した標識を、その後に検出し、そしてそのサンプル中のプロコラーゲンα１タイプＩのアミノ末端プロペプチドの存在又は量を測定する。典型的には、その抗体に結合する標識されたペプチドの量は、そのサンプル中のアミノ末端プロペプチドの量に（逆に）比例する。（例えば、物理化学的又は免疫化学的な）分離段階及び洗浄段階が、背景を超える特異的結合を区別するために必要であるかもしれない。

ＥＬＩＳＡタイプの免疫検定においては、再び、様々なフォーマットがもくろまれる。１つの方法においては、本発明の合成ペプチドが、固相、例えば、マイクロタイター・ウェルに、吸着、架橋等により結合される。テスト・サンプルを、本発明の抗−ペプチド抗体と共にインキュベートし、そして次に、その混合物を、そのペプチド−コート・ウェル内に入れ、そしてインキュベートする。そのサンプル中のアミノ末端プロペプチドにより結合されない抗体が、その固相上のペプチドに結合される。分離段階の後、結合抗体の存在及び量を、−次抗体がウサギ抗血清として産生されるとき、標識された第二抗体、例えば、抗−ウサギＩｇＧ　、及び便利な発色基質を使用して、測定することができる。

また、個体内のプロコラーゲンのレベルの測定における、本発明の組換え又は合成のアミノ末端プロコラーゲン・タイプＩペプチドによる使用のために、キットを供給することができる。したがって、対象のペプチド組成物を、普通には、凍結乾燥形態において、容器内で、単独で又は追加の試薬、例えば、プロコラーゲン特異的抗体、標識、及び／又は抗−抗体、等と一緒にのいずれかにおいて、提供することができる。標識に結合されることができる、又は結合されていない、ペプチド及び抗体も、バッファー、例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、炭酸塩、等、安定剤、殺生剤、不活性タンパク質、例えば、血清アルブミン、等と共に、キット内に含まれる。しばしば、活性成分を希釈する不活性の増量剤又は賦形剤であってその賦形剤が組成物全体の約１から９９％までで存在することができるものを含むことが望ましい。プロコラーゲンのアミノ末端に及び本発明のペプチドに結合することができる抗体が検定において使用される場合には、それらは、典型的には、別々のバイアル内に存在するであろう。

診断用途のためのモノクロナール抗体であって本発明のヒト・プロコラーゲン・タイプ■及びペプチドのアミノ末端に結合するものを、様々な手段により製造することができる。ネズミ・モノクロナール抗体の製造は、よく知られており、そして例えば、その動物を組換え又は合成のペプチド分子あるいはそれらの選ばれた部分（例えば、ヒト・プロコラーゲン・タイプ１のアミノ末端のエピトープと競合するエピトープのドメイン）により免疫感作することにより、行われることができる。免疫感作された動物から得られた抗体産生細胞を、不死化し、そしてスクリーンし、又は例えば、ペプチド及びアミノ末端プロコラーゲン分子を使用する競合的検定において機能する抗体の製造のために最初にスクリーンし、そしてその後、不死化させる。抗血清（ポリクロナール抗体）又はモノ特異的抗体は、典型的には、起源において非ヒト、例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、等であり、そして増加した免疫原性のために担体、例えば、ｋｅｙｈｏｌｅ１ｉｍｐｅｔヘモシアニにしばしば結合されるであろう適当なペプチドによる免疫感作により作られることができる。このやり方での抗体の調製は、本分野においてよく知られており、例えば、Ｆｌａｒｌｏｗ　ａｎｄＬａｎｅ、前記中に記載されている。

先に述べたように、様々な検定プロトコールを、サンプル中のプロコラーゲン・タイプＩのアミノ末端のプロペプチドの存在及び／又はレベルを検出するために、使用することができる。本ペプチドは、そのサンプル中のペプチドに対する抗体が表面上でそのペプチドに結合するようになる場合には、その表面上に直接的又は間接的にのいずれかにおいて、固定化されることができる。そのペプチドに結合した抗体の存在を、次に、免疫グロブリン、正常にはＩｇＧ及びＩｇＭの両方に特異的な異種抗体、又は免疫複合体に特異的な標識検出することができる。

以下の実施例を、限定によらず、説明により、提供する。

タイプＩコラーゲンのプローα鎖は、ヒト血清中で多量に循環する。それらの鎖はタイプ■コラーゲン合成の直接的な結果であるので、それらの測定が新しい骨生成の決定因子として使用される。

配列Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａ　１−Ｇ　１ｕ −Ｇ　１ｙ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａｓｐ−Ｇ　１ｕ−Ａｓｐ−Ｔｙ秩|Ｃｙｓ〔配列番号２〕の合成ペプチドに対する抗体を製造した。それらの抗体を生成するために、前記ペプチドを、ｌ（ａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ、前記に記載されるようにして、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いてＫＬＨに接合した。ペプチド−ＫＬＨ免疫原を、標準の抗体生成手段を用いてウサギ中に注射した。ニューシーラントホワイトウサギに、完全フロインドアジュバント中、接合ペプチド５０μｇを皮下注射した（１回目）。２１日目、ウサギに、ミョウバン中、接合ペプチド１５０／Ｚｇを皮下又は筋肉的注射した。４９日目（４週間後）、ウサギは２１日目と同じように、３回目の注射を受けた。５週間後（８４日目）、動物は前記のような注射を受けた。試験放血を、第３回目の及び続く追加免疫の後、１ｎ日目で行なった。４回目の注射からの血清に関するアッセイを行なった。

次に、免疫化された動物の血清から調製された単一特異的ポリクローナル抗体を用いて、血清に見出されるタイプＩブローαアミノ末端プロコラーゲンを循環することによって決定されるようなコラーゲン合成のための敏感且つ特異的なＲＩＡマーカーアッセイを生成した。ｐＨ８，４の硼酸塩緩衝液における抗体が、対照（天然のタイプＩプロコラーゲンアミノブロペプチド又は合成ペプチド）又は未知の及びトレーサー分子〔クロラミン−Ｔ方法（Ｈｕｎｔｅｒ　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ。

Ｎａｔｕｒｅ　１９４　：　４９５〜４９６　（１９６２）により　目５Ｉによりヨウ素化された合成ペプチド〕のいづれかと共に、合計量２５０μｌで使用され、そして４℃で一晩平衡化された。相分離が、希釈された予備免疫ウサギ血清（典型的には、免疫血清の最適沈殿化を達成するための通常１：２０又はｌ：３０の希釈溶液１００μｌ）、希釈された第二抗体（予備免疫血清により希釈されたヤギ抗−ウサギＩｇＧ　４００μｍ）及び８％ポリエチレングリコール２００ μｌを添加することによって達成された。サンプルを十分に混合し、そして室温で３時間インキュベートした。沈殿物を遠心分離により集め、そして結合され、そして１２５Ｉによりラベルされた合計のペプチドをγカウンターで測定した。

このペプチドは、それがカルボキシ末端プロコラーゲン又は他の種のコラーゲンタンパク質（ラット又はイヌの血清が試験された）に対するペプチドを認識しなかったことで、ペプチドフラグメントに対して特異的であった。

第１図に示されるように、タイプ■コラーゲンのアミノ末端プロペプチド及び合成ペプチドに結合される単一特異的抗体が天然のタンパク質と共に示された。

予備研究におけるこのアミノ末端アッセイは、骨格のアルカリホスファターゼ（ｒ　＝０．０８６　、ｐ　＜０．００１）、すなわち骨形成のインジケーターと相互関係した（Ｆａｒｌｅｙなと、、Ｃｆ１ｎ、Ｃｈｅｍ、　２７　：２００２〜２００？　（１９８１））。それは酒石酸耐性酸ホスファターゼ（ｒ　＝０．０１６　。

ｎ、ｓ、）、すなわち骨吸収のためのマーカーとは相互関係しながった。

びオステオホーロシスを有する患者（ｎ＝ｌｏ）、上皮小体機能低下症（ｎ＝４）又は骨のパゲット疾病（ｎ　＝　１１）からの前もって集められた血清であった。それらの１八を上記のようにして行なった。

例■ プロコラーゲンのアミノ末端についてのＥＬＩＳ八アッへイプロコラーゲンαｌタイプ■の循環性免疫末端についてのこのＥＬＩＳＡタイプアッセイのために、ペプチド抗原Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ　（配列番号２〕を、９６ウエルプレートのウェルの底に結合した。これは、まず、異なったキャリヤータンパク質にペプチドを接合することによって、又はアミノ化された又はカルボキシ化されたプレート（Ｃｏｓｔａｒ）のいづれかにペプチドを直接的に架橋することによって達成される。試験溶液（滴定されたペプチド、未知の血清サンプル又は対照のいづれか）を、例■に記載される抗−ペプチド抗体と共にインキュベートする。

短時間のインキュベーションの後、その混合物を結合されたペプチドを含むウェルに配置し、モしていづれかの自由（未結合）抗体をプレートに結合する。洗浄の後、結合された抗体の存在を、ラベルされた第二抗体、たとえばＩＩＲＰ　（ホースラディシュペルオキシダーゼ）に接合される抗−ウサギＩｇＧを用い、次に着色基質、たとえばペルオキシダーゼ基質２．２′−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）又はＡＢＴＳを添加することによって検出する。α１タイプ■コラーゲンの高濃度アミノ末端プロペプチドが試験溶液に存在する場合、少々の抗体がその場所に結合し、従って色の反応は低い。はとんど又はまったく抗体が存在しない場合、抗体はその場所の抗原に完全に結合し、高い色彩状態を引き起こす。

抗原のレベルを定量化するために、ペプチドを滴定し、未知のサンプルに対して比較するために標準曲線を作る。

この技法の変法は、抗体がまず精製され、そしてラベル（たとえばＨＲＰ又はアルカリホスファターゼ又はビオチン）に直接的に接合され、従って二次反応の特別な段階により引き起こされる問題を排除することを可能にする。

例■に記載されるＲＩＡを用いて、プロコラーゲンターンオーバーにおける差異、及び従って、例■に記載されるような健康な対照に比較してのパゲット疾病を有する患者における骨形成の差異を決定した。その結果は、骨のパゲット疾病を有する患者からの血清に対する正常な個人のプロコラーゲンのアミノ末端の血清レベル間に５０倍以上の差異を示した（第２図を参照のこと）。それらのデータは、プロコラーゲンタイプ■のアミノ末端における少なくとも１つの選択されたエピトープを模倣する合成ペプチド及びそのペプチドに対する抗体が骨吸収に無関係に骨形成速度の変化を測定する能力を有する結論を支持する。

前記発明はより理解するために例示的により詳細に記載されて来たが、本発明の範囲内で一定の変更及び変性を行なえることは明らかであろう。

配列の列挙（１）一般情報：（ｉ）出願者：　Ｂａｙｌｉｎｋ、　Ｄａｖｉｄ　Ｊ。

Ｌｉｎｋｈａｒｔ、　５ｕｓａｎ（ｉｉ）発明の名称ゴミノブロコラーゲン１　（１）ペプチド（迅）配列の数− １ｌ（ｉｖ　）通信先：（Ａ）住所：　Ｔｏｗｎｓｅｎｄ　ａｎｄ　Ｔｏｗｎｓｅｎｄ（Ｂ）通り：　Ｏｎｅ　Ｍａｒｋｅｔ　Ｐｌａｚａ、　５ｔｅｕａｒｔ　５ｔｒｅｅｔ　Ｔｏｗｅｒ（Ｃ）町　：　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃ。

（Ｄ）州　：ＣＡ（Ｅ）国　：　ＵＳＡ（Ｆ）郵便番号：　９４１０５−１４９２（Ｖ）コンピューター読み取りフオーム：（Ａ）媒体タイプ　：フロ・ソビーディスク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｃ）操作システム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ５（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．Ｏ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５（ｖｉ　）現在の出願データ：（Ａ）出願番号：ＵＳ（Ｂ）出願日　：（Ｃ）分類　：（ｖｉ　）アトニー／エージェント情報：（Ａ）名称　：　Ｐａｒｍｅｌｅｅ、　５ｔｅｖｅｎ　Ｗ。

（Ｂ）登録番号：３１，９９０（Ｃ）参照／ドケット番号：　１４５０８−３（ｉｘ　）電信情報：（Ａ）電話　＋　（２０６）　４６７−９６００（Ｂ）ファクシミリ：　（４１５）　５４３−５０４３（２）配列番号ｌについての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ：１２個のアミノ酸（Ｂ）型　二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー水路（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配　列：配列番号ｌ：Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐｌ　５　１０（２）配列番号２についての情報：（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長　さ：１４個のアミノ酸（Ｂ）型　二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー水路（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配　列：配列番号２：Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ５１Ｏ（２）配列番号３についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ：８個のアミノ酸（Ｂ）型　二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｂ）型　二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー水路（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配　列：配列番号９：（２）配列番号ｌＯについての情報＝（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ二８個のアミノ酸（Ｂ）型　二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー水路（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配　列：配列番号１０：（２）配列番号１１についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ：１６０個のアミノ酸（Ｂ）型　二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー水路（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配　列：配列番号１１：Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＧｌｕＣｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ＾ｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇ１ｎ５Ｆｉ、１プロフラーゲン（ｎｇ／ｍｌ）Ｆｉｇ、２

Claims

【特許請求の範囲】

１．６〜５０個のアミノ酸を有し、そして配列Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ −Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ（ＰＥＰ２３−３４〔配列番号１〕）に含まれるエピトープを有するペプチドであって、プロコラーゲンα１タイプＩのアミノ末端プロペプチドと免疫学的に競争することを特徴とするペプチド。
２．Ｎ−又はＣ−末端で少なくとも１つのＣｙｓ又はＴｙｒ残基をさらに含んで成る請求の範囲第１項記載のペプチド。
３．前記Ｃ−末端残基がＴｙｒ−Ｃｙｓを含んで成る請求の範囲第２項記載のペプチド。
４．配列Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−ｌＡｓｐ−Ｉｌｅ −Ｐｒｏ（ＰＥＰ２８−３６〔配列番号３〕）を有する請求の範囲第１項記載のペプチド。
５．Ｎ−又はＣ−末端で少なくとも１つのＣｙｓ又はＴｙｒ残基をさらに含んで成る請求の範囲第４項記載のペプチド。
６．個人におけるプロコラーゲンタイプＩのアミノ末端プロペプチドの存在を決定するための方法であって：（ａ）個人からのサンプル、（ｂ）プロコラーゲン α１タイプＩのアミノ末端プロペプチドのエピトープと免疫学的に競争する、配列Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ −Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ（ＰＥＰ２３−３４〔配列番号１〕）内に含まれるエピトープと免疫学的に反応する抗体及び（ｃ）前記抗体を免疫学的に結合し、そして検出可能なシグナルを供給するようにラベルされているペプチドを、免疫複合体形成の助けとなる条件下でインキュベートし、そして前記ラベルを検出し、そして前記個人におけるプロコラーゲンα１タイプＩのアミノ末端プロペプチドの存在をそれから決定することを含んで成る方法。
７．前記ペプチドが、配列Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｘ（ＰＥＰ２３−３４〔配列番号１〕）（ここでＸは任意に存在し、そして存在する場合、少なくとも１つのＣｙｓ及び／又はＴｙｒを含んで成る）のものである請求の範囲第６項記載の方法。
８．前記サンプル、抗体及びペプチドが同時にインキュベートされる請求の範囲第６項記載の方法。
９．前記ペプチドと前記サンプル及び抗体とのインキュベーションが、前記サンプルと前記抗体との最初のインキュベーションに続く請求の範囲第６項記載の方法。
１０．前記インキュベーション段階が洗浄段階により分離される請求の範囲第９項記載の方法。
１１．前記抗体が支持体上に固定される請求の範囲第６項記載の方法。
１２．前記支持体が不溶性である請求の範囲第６項記載の方法。
１３．前記ペプチドが、前記ペプチドを結合する抗体によりラベルされる請求の範囲第６項記載の方法。
１４．前記サンプルがヒト血清、血漿、尿、創傷流体又は培養培地である請求の範囲第６項記載の方法。
１５．前記ラベルが酵素、螢光体、放射性核種、化学発光体又は染料である請求の範囲第６項記載の方法。
１６．前記ラベルが１２５Ｉ又は１３１Ｉである請求の範囲第１５項記載の方法。
１７．個人におけるプロコラーゲンタイプＩのアミノ末端プロペプチドの存在を決定するための方法であって：個人からのサンプル、及びプロコラーゲンα１タイプＩのアミノ末端プロペプチドのエピトープと免疫学的に競争する、配列Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ（ＰＥＰ２３−３４〔配列番号１〕）内に含まれるエピトープと免疫学的に反応する抗体を、免疫複合体形成の助けとなる条件下でインキュベートし、サンプル及び抗体のインキュベーションと同時に又はそれに続いて、前記抗体に免疫学的に結合する、キャリヤーに結合されるペプチドをインキュベートし、未結合物質からキャリヤーに結合される免疫複合体を分離し、前記キャリヤーに結合される分離された免疫複合体を、プロコラーゲンα１タイプＩのアミノ末端プロペプチドに結合する抗体と共にインキュベートし、そして免疫複合体形成の存在を検出し、そして前記個人におけるプロコラーゲンα１タイプＩのアミノ末端プロペプチドの存在をそれから決定することを含んで成る方法。
１８．患者における骨形成の速度をモニターするための方法であって；請求の範囲第６項記載の方法に従って、患者からのサンプルにおけるプロコラーゲンタイプＩのアミノ末端の遊離プロペプチドの相対濃度を一定時間にわたって測定することを含んで成る方法。
１９．個人におけるプロコラーゲンタイプＩのアミノ末端プロペプチドの存在を決定するための試験キットであって：プロコラーゲンα１タイプＩのアミノ末端プロペプチドのエピトープと免疫学的に競争する、配列Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ −Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ（ＰＥＰ２３−３４〔配列番号１〕）内に含まれるエピトープと免疫学的に反応する抗体及び前記抗体を免疫学的に結合するラベルされているペプチドを含んで成るキット。
２０．前記ペプチドが、配列Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｙ（ＰＥＰ２３−３４〔配列番号１〕）（ここで個々のＸ及びＹは任意に存在し、そして存在する場合、少なくとも１つのＣｙｓ及び／又はＴｙｒを含んで成る）のものである請求の範囲第１９項記載のキット。
２１．前記ラベルが酵素、螢光体、放射性核種、化学発光体又は染料である請求の範囲第１９項記載のキット。
２２．前記抗体が、プロコラーゲンα１タイプＩのアミノ末端プロペプチドのエピトープと免疫学的に競争する、配列Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ −Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ（ＰＥＰ２３−３４〔配列番号１〕）内のエピトープを含む合成ペプチドにより免疫化された動物から得られたポリクローナル抗血清を含んで成る請求の範囲第１９項記載のキット。