JPH07504399A - Treatment for chronic rheumatoid arthritis based on T-cell receptors - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 Ｔ細胞リセプターに基づいた慢性間接リウマチの治療法関連する出願との相互参 照 この出願は１９９１年８月２８日に米国特許商標庁に提出された米国第７５０゜ ９１３号、表題「Ｔ細胞リセブターを基とする慢性間接リウマチの治療法」の一 部継続出願であり、この出願明細書は引用により本明細書の一部をなす。[Detailed description of the invention] Treatment of chronic rheumatoid arthritis based on T-cell receptors Cross-reference with related applications light No. 750, filed with the United States Patent and Trademark Office on August 28, 1991. No. 913, entitled “Treatment of chronic rheumatoid arthritis based on T cell receptors” This application is a continuation application, and the specification of this application is incorporated herein by reference.

産業上の利用分野 本発明は哺乳類の治療学の分野に関する。さらに詳しくは、慢性間接リウマチの 治療法及び、慢性間接リウマチに対する免疫化の方法を提供する。Industrial applications The present invention relates to the field of mammalian therapeutics. For more information, see Chronic Rheumatoid Arthritis Provided are methods of treatment and immunization against rheumatoid arthritis.

政府の権利 ここに提出された研究は一部、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉ ｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）研究助成ＩＲ−２９ＡＩ−２８５０３ｉこよる 援助を受けた。米国政府は本発明にある特定の権利を持つ。government rights Some of the research submitted here was published by the National Institutes of Health (National Institutes of Health). tute of Health) Research Grant IR-29AI-28503i Koyoru received assistance. The United States Government has certain rights in this invention.

発明の背景 慢性関節リウマチ（ＲＡ）は病理学的に、滑膜の繊維芽細胞様およびマクロファ ベブチドによって典型的に活性化される（ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰ／ＤＱ）。免疫遺 伝学的な解析は、ＲＡがＨＬＡ−ＤＲ４に付随していること、さらに厳密番ごは ＨＬＡ−ＤＲβ鎖の７０／７１番目のアミノ酸グルタミン／リジンに結合してｔ ）ることを明らかにした。Background of the invention Rheumatoid arthritis (RA) is pathologically characterized by synovial fibroblast-like and macrophages. Typically activated by Bebutide (HLA-DR/DP/DQ). immunology Genetic analysis shows that RA is associated with HLA-DR4 and that the exact number It binds to the 70th/71st amino acid glutamine/lysine of the HLA-DRβ chain and ) was revealed.

現在の慢性関節リウマチに対する治療法は効き目が小さいあるいは毒性のもので ある。多くの方面からの証拠が、リウマチ様関節疾患の発達にＴ細胞が関与して いる事を示している。これは、滑膜において湿潤化したリン（球力（上唇こＣＤ ４＋Ｔ細胞から構成されている事（２，２Ｌ−２３）　、ＣＤ４＋Ｔ細胞抗原Ｉ Ｊセブターのりガントを構成するＲＡとＩＩＬＡ−ＤＲ４の連結（３−８）、お よびＴ細胞系によって伝達される関節炎および関連する自己免疫疾患の実験モデ ル（１０，１３，２４−３３）を含む。動物実験系およびヒトの慢性関節リウマ チの両研究は、抗−Ｔ細胞試薬が治療に効果がある可能性を示す（１１，２５， ３４−４０）。しかしながら、もしこれらの試薬が非特異的であり、Ｔ細胞のレ パートリ−の大きすぎる部分が除去された場合、免疫不全（後天性免疫不全症候 群あるいはＡＩＤＳに見られるような）に至る可能性がある。Current treatments for rheumatoid arthritis are ineffective or toxic. be. Evidence from many sources implicates T cells in the development of rheumatoid joint disease. It shows that there is. This is caused by moistened phosphorus in the synovium (upper lip CD). Composed of 4+ T cells (2,2L-23), CD4+ T cell antigen I Connection of RA and IILA-DR4 (3-8) that make up the J Sebuter glue gantt, and experimental models of arthritis and related autoimmune diseases mediated by T-cell lineages. (10, 13, 24-33). Rheumatoid arthritis in animal experiments and humans Both studies indicate that anti-T cell reagents may be therapeutically effective (11, 25, 34-40). However, if these reagents are nonspecific and T cell levels are If too large a part of the parti is removed, immunodeficiency (acquired immunodeficiency syndrome) may occur. (as seen in AIDS).

よりよい治療の代替え法は、自己免疫応答に関与するＴ細胞のみを除去する事で ある。これらはＴ細胞の全レパートリ−の中で、ごく小さい部分のみを占めるた め、これらのＴ細胞の除去は重大な全般的免疫抑制を引き起こさないはずである 。A better treatment alternative would be to eliminate only the T cells involved in the autoimmune response. be. Because they make up only a small portion of the total T cell repertoire, Therefore, removal of these T cells should not cause significant general immunosuppression. .

発明の概要 本発明は哺乳類における慢性関節リウマチの新しい治療法を提供する。本性は、 この哺乳類からの滑膜試料を採集するステップ、上記試料におけるＴ細胞可変領 域を同定するステップ、及び上記Ｔ細胞可変領域の最低一つあるいはその抗原性 断片に対する抗体を、効果のある量を上記哺乳類に対して投与するステップから 構成される。Summary of the invention The present invention provides a new treatment for rheumatoid arthritis in mammals. The true nature is collecting a synovial membrane sample from the mammal; at least one of the T cell variable regions or its antigenicity; administering to the mammal an effective amount of an antibody against the fragment; configured.

本発明はさらに、Ｖａｌ７、Ｖａｌ、Ｖａｌ２、Ｖａｌ４、Ｖａｌ７、およびＶ Ｂ２及びそれらの抗原性断片から構成されるグループから選択された哺乳類Ｔ細 胞リセプター可変領域に対する抗体を効果のある量、上記哺乳類に投与するステ ップから構成される、哺乳類における慢性関節リウマチの新しい治療法を提供す る。The invention further provides Val7, Val, Val2, Val4, Val7, and V Mammalian T cells selected from the group consisting of B2 and antigenic fragments thereof. A step of administering to the mammal an effective amount of an antibody against the cell receptor variable region. We aim to provide a new treatment for rheumatoid arthritis in mammals, consisting of Ru.

本発明はさらに、慢性関節リウマチの予防および進行中の慢性関節リウマチの治 療のための哺乳類の免疫化の新しい方法を含む。この方法は、Ｖａｌ７、Ｖａｌ 、Ｖａｌ２、Ｖａｌ４、Ｖａｌ７、およびＶＢ２及びそれらの抗原性断片から構 成されるグループから選択された咄乳類Ｔ細胞すセブター可変領域を上記哺乳類 に投与するステップから構成される。The present invention further provides the prevention of rheumatoid arthritis and the treatment of ongoing rheumatoid arthritis. Including new methods of immunization of mammals for therapeutic treatment. This method uses Val7, Val , Val2, Val4, Val7, and VB2 and their antigenic fragments. The mammalian T cell selector variable region selected from the group consisting of The procedure consists of the step of administering the drug to the patient.

本発明の方法に有用な、Ｖａｌ７、Ｖａｌ、Ｖａｌ２、Ｖａｌ４、Ｖａｌ７、お よびＶＢ２及びそれらの抗原性断片から！Ｒ成されるグループから選択された哺 乳類Ｔ細胞すセプター可変領域、および上記可変領域に対する抗体から構成され るキットも本発明によって提供される。Val7, Val, Val2, Val4, Val7, and and from VB2 and their antigenic fragments! Mammals selected from the group It consists of a mammalian T cell receptor variable region and an antibody against the above variable region. Also provided by the invention are kits that include:

慢性関節リウマチはＣＤ４＋　Ｔ細胞による組織の湿潤を伴う滑膜組織の広範囲 にわたる増殖、ＨＬＡ　ＤＬ抗原の発現上昇、および主要紐織適合抗原系（ＭＨ Ｃ）抗原ＨＬＡ−ＤＲ４との遺伝的連鎖によって特徴づけられる。Ｔ細胞はＤＲ ４のようなクラスＩＩＭＨＣ分子によって制限される事がら、病因にＣＤＪ十細 胞が直接的な役割を持つ事が示唆される。Ｔ細胞を介した自己免疫に対する新し い治療法の開発の一つのストラテジーは、自己反応するＴ細胞を除去する事であ る。このようなストラテジーは、自己反応性のＴ細胞リセプタ−（ＴＣＲ）の分 子構造の理解に依存する。ＲＡにおけるＴＣＲの用法を調査するために、主要Ｔ ＣＲサブファミリーであるＴＣＲ　α鎖およびβ鎖の各々に特異的なオリゴヌク レオチドプライマーのセットを使用した。これらは全滑膜あるいは滑膜組織Ｔ細 胞系からｃＤＮＡをサブファミリー特異的に増幅するのに使用した。増幅したｃ ＤＮＡの配列を決定して対応するアミノ酸配列を決定した。増幅されたＤＮＡの 検出は、ＴＣＲのある一定の頌域に由来するオリゴヌクレオチドプライマーを使 用する事で容易にした。′／ＲｖＡのＴ細胞系はフィトヘムアグルチニンの刺激 によって確立させ、ｆＬ−２で保持させた。これらのＴ細胞系に存在するＴＣＲ のレパートリーはきわめて異質組成であり、平均して１５のα鎖および１５，８ のβ鎖か検出された。滑膜組織の解析においては、顕著に検出されたＴＣＲザブ ファミリーはより制限されている傾向があり、平均して４．２のα鎖および９． ７のβ鎖が検出された。いくつかの滑膜組ｍ試料では、一つのサブファミリーの 優勢が明らかであった。これらの結果は、ポリクローナルなＴ細胞の集団がＲ八 滑膜に存在するにもかかわらず、優勢なパターンのＴＣＲ転写物はよりいくらが 制限されている事を示唆する。このことはＴＣＲを基にしたＲＡの治療法が可能 である事を示唆する。Rheumatoid arthritis is characterized by widespread synovial tissue infiltration by CD4+ T cells. proliferation, increased expression of HLA DL antigens, and major tissue-compatible antigen system (MH C) Characterized by genetic linkage with the antigen HLA-DR4. T cells are DR Although limited by class II MHC molecules such as This suggests that cells play a direct role. A new approach to T cell-mediated autoimmunity One strategy for developing new treatments is to eliminate self-reactive T cells. Ru. Such strategies target autoreactive T-cell receptor (TCR) Depends on understanding the child structure. To investigate the usage of TCR in RA, the main TCR Oligonucleotides specific for each of the TCR α and β chains of the CR subfamily A set of leotide primers was used. These include whole synovium or synovial tissue T-cells. was used for subfamily-specific amplification of cDNA from cell lines. amplified c The DNA was sequenced and the corresponding amino acid sequence was determined. of amplified DNA Detection is performed using oligonucleotide primers derived from a certain region of the TCR. It was made easier by using '/RvA T cell lineage stimulates phytohemagglutinin and maintained in fL-2. TCR present in these T cell lines The repertoire is highly heterogeneous, with an average of 15 α-chains and 15,8 The β-chain of In the analysis of synovial tissue, TCR sub-abs were significantly detected. The family tends to be more restricted, with an average of 4.2 alpha chains and 9. 7 β chains were detected. In some synovial specimens, one subfamily of The advantage was clear. These results indicate that polyclonal T cell populations are Despite being present in the synovium, the predominant pattern of TCR transcripts is Indicates that it is restricted. This means that a TCR-based treatment for RA is possible. This suggests that

図面の簡単な説明 図１は、Ｔ細胞リセプターに特異的なオリゴヌクレオチド及びその相対的位置を 示す。Brief description of the drawing Figure 1 shows T cell receptor specific oligonucleotides and their relative positions. show.

図２は、ＲΔ滑膜′ｒ細胞系におけるＴＣＲ転写物を示す。リウマチ滑膜Ｔ細胞 系は３−５日間のＰＨＡ中での第１培養で確立し、ＩＯＵ／ｍｌのＩＬ−２中で 保持した。１−３週間後に細胞を凍結させ、後にＴＣＲの発現解析のために材料 及び方法で概要を示した方法でＲＮＡを抽出した。試料の名称は左に示し、使用 されたＴＣＲαおよびβファミリー特異的プライマーは各々のレーンの上に示し た。Figure 2 shows TCR transcripts in the RΔ synovial 'r cell line. Rheumatoid synovial T cells The system was established with a first culture in PHA for 3-5 days and then grown in IOU/ml of IL-2. held. After 1-3 weeks, the cells were frozen and the material was used for later TCR expression analysis. RNA was extracted as outlined in and Methods. Sample names are shown on the left and used TCRα and β family-specific primers are shown above each lane. Ta.

図３は、ＲＡ滑膜中におけるＴＣＲ転写物を示す。関節手術の際に得られた１０ のリウマチ滑膜組織からＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成した。これらはＴＣＲ の発現が上記の様に解析された。試料の名称は左に示し、使用されたＴＣＲαお よびβファミリー特異的プライマーは各々のレーンの上に示した。Figure 3 shows TCR transcripts in RA synovium. 10 obtained during joint surgery RNA was extracted from rheumatoid synovial tissue and cDNA was synthesized. These are TCR The expression of was analyzed as described above. The name of the sample is shown on the left, and the name of the TCRα used is shown on the left. and β family-specific primers are shown above each lane.

図４は、（Ａ）’Ｊウマチ滑膜組織及びＴ細胞系における個々のα鎖の可変領域 の出現頻度をグラフで示す。（Ｂ）リウマチ滑膜組織及びＴ細胞系における個々 のβ鎖の可変頌域の出現頻度をグラフで現した。Figure 4. (A) Individual α chain variable regions in J equine synovial tissue and T cell lines. The frequency of appearance of is shown in a graph. (B) Individual in rheumatoid synovial tissue and T cell lineage. The frequency of appearance of the variable region of the β chain is expressed in a graph.

図５は、Ｔ細胞リセプターＰＣＲプライマーを示す。Ｃβ１およびＣβ２プライ マーは等モル濃度に混合して使用した。Figure 5 shows T cell receptor PCR primers. Cβ1 and Cβ2 ply The mer were mixed at equimolar concentrations and used.

図６は、１０のリウマチ滑膜におけるＴ細胞リセブターβ鎖の発現。アステリス クは平均からの標準誤差〉２を示す。Figure 6. Expression of T cell receptor β chain in 10 rheumatoid synovial membranes. asteris h indicates standard error from the mean 〉2.

図７は、１０のリウマチ滑膜におけるＴ細胞リセプターα鎖の発現。アステリス クは平均からの標準誤差〉２を示す。Figure 7. Expression of T cell receptor α chain in 10 rheumatoid synovial membranes. asteris h indicates standard error from the mean 〉2.

発明の詳細な説明 本発明の一つの側面において、ヒトなどの噛乳類の慢性関節リウマチの治療方法 が提供される。この方法は、上記咄乳類から滑膜試料を採集するステップ、上記 試料におけるＴ細胞可変領域を同定するステップ、及び上記Ｔ細胞可変領域の最 低一つあるいはその抗原性断片に対する抗体を、効果のある量を上記桶乳類に対 して投与するステップから構成される。Detailed description of the invention In one aspect of the present invention, a method for treating rheumatoid arthritis in mammals such as humans. is provided. This method includes the steps of collecting a synovial membrane sample from the mammal, as described above. identifying the T cell variable region in the sample, and identifying the most of the T cell variable region; An effective amount of an antibody against the antibody or an antigenic fragment thereof is administered to the above-mentioned mammals. The procedure consists of the following steps:

滑膜組織あるいは分泌液などの滑膜試料は当業者に知られている方法で採集され る。Synovial samples, such as synovial tissue or secretions, are collected by methods known to those skilled in the art. Ru.

ヒトＴｅｌ胞リセプターの分子レベルの解析はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） の適用によって最近著しく促進された。（１９）例えば参考文献に引用すること でここにその全てを開示したムリス（Ｍｕ　ｌ　ｌ　ｉ　ｓ）に発行された米国 特許第４，３８６．２０２号も参照せよ。Ｔ細胞リセブターの可変領域の異なる ファミリーに対する特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する事で、フ ァミリー特異的な増幅が可能である（１４−１６）。このテクニックは興味のあ るＴ細胞リセブターの同定に容易に適用できる。Molecular level analysis of human Tel receptors is performed using polymerase chain reaction (PCR). has recently been significantly facilitated by the application of (19) For example, quoting in references. Published in the United States by Mulis, who hereby discloses all of it. See also Patent No. 4,386.202. Different variable regions of T cell receptors By using family-specific oligonucleotide primers, Family-specific amplification is possible (14-16). I'm interested in this technique It can be easily applied to the identification of T cell receptors.

Ｔ細胞リセブターの配列は一般的に、文献及びｒＧｅｎｂａｎｋＪやｒＥＭＢＬ 」などのコンピューター配列データベースにおいて入手可能である。したがって 興味のあるファミリー特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、コンピューター ソフトウエアツール（例えばウィスコンシン大学パッケージ（ｔｈｅ　Ｕｎｉｖ ｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｃｉｎ　ｐａｃｋａｇｅ）　（４９））と［ Ｗｏｒｄ　ＳｅａｒｃｈＪやｒＢｅｓｔ　ＦｉｔＪなどのプログラムを用いてこ れらのデータベースに一致させる事ができる。一致した配列をデータベースから 検索し、核酸からタンパク質の配列に翻訳する。別法として、興味のあるＴ細胞 リセブターは、滑膜分泌液あるいは組織においてファミリー特異的ブローブを用 いたｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンあるいはサザンプロット 解析、あるいは入手可能な様々なＴ細胞リセブターの可変領域に対する抗体を用 いた免疫紐織学または免疫蛍光の解析により同定が可能である。Sequences of T cell receptors are generally available in the literature and in rGenbankJ and rEMBL. are available in computer sequence databases such as ``. therefore Family-specific oligonucleotide primers of interest can be Software tools (e.g. the University of Wisconsin package) ersity of Wisconsin package) (49)) and [ Use programs such as Word SearchJ or rBest FitJ. These databases can be matched. Matched sequences from database Search and translate from nucleic acids to protein sequences. Alternatively, the T cell of interest The receptor uses family-specific probes in synovial secretions or tissues. In situ hybridization, Northern or Southern plot analysis or using antibodies against the variable regions of various available T cell receptors. Identification is possible by immunohistochemistry or immunofluorescence analysis.

次に、最低１つのＴ！ｉｌｌｌ胞リセプターの可変領域に対する抗体を有効量、 唾乳類に投与する。「最低１つのＴ細胞リセプターの可変領域に対する抗体」と は、Ｔ細胞リセブターの可変領域及び部分あるいはその断片を認識する抗体を示 す事が意図されている事を特に記しておく。有効量の抗体とは、滑膜中における 対応するりセプターを持つＴ細胞のレベルを低くする量、あるいは患者において 臨床的に回復の兆候が現れるｍである。Next, at least one T! an effective amount of an antibody against the variable region of the cell receptor; Administer to salivary mammals. "An antibody against the variable region of at least one T cell receptor" indicates an antibody that recognizes the variable region and portion of T cell receptor or a fragment thereof. Please note in particular what it is intended to do. An effective amount of antibody is defined as a dose that lowers the level of T cells with the corresponding receptor, or in the patient. This is the stage at which clinical signs of recovery appear.

抗体は、ある分子と特異的に反応してその分子を抗体に結合する事ができる場合 に、その分子と「結合できる」と言う。「エビトープ」は、抗体によって認識さ れ結合される抗原の部分として言及される。一つの抗原は一つあるいはそれより 多くのエビトープを持ち得る。「抗原」は動物にその抗原のエビトープに結合で きる抗体の生産を誘発させる事のできる物質である。先に言及した特異的な反応 とは、抗原が対応する抗体と高度に選択的に免疫反応するが、他の抗原によって 誘発され得るその他の複数の抗体とは反応しない事である。When an antibody can specifically react with a certain molecule and bind that molecule to the antibody is said to be able to "combine" with that molecule. “Ebitopes” are recognized by antibodies. It is referred to as the part of the antigen that is bound. One antigen has one or more Can have many evitopes. An “antigen” is an animal that can bind to the epitope of that antigen. It is a substance that can induce the production of anti-inflammatory antibodies. Specific reactions mentioned earlier means that an antigen is highly selectively immunoreacted with the corresponding antibody, but is not affected by other antigens. It does not react with other antibodies that may be induced.

ここで使われる［抗体Ｊ　（Ａｂ）あるいは「モノクローナル抗体Ｊ　（ＭＡｂ ）という言墓は、完全な分子および抗原と結合できるその断片（例えばＦａｂや Ｆ（ａｂ’）２断片など）を含む事が意図される。ＦａｂおよびＦ　（ａｂ’　 ）　２断片は完全な抗体のＦｃ断片を欠失しており、循環系からより速やかに消 失し、非特異的な組織への結合がより少ない可能性がある。[Antibody J (Ab) or "monoclonal antibody J (MAb)" used here ) refers to the complete molecule and its fragments that can bind to the antigen (e.g. Fab and F(ab')2 fragment, etc.). Fab and F (ab’) ) 2 fragments lack the Fc fragment of the complete antibody and are cleared more quickly from the circulation. less binding to non-specific tissues.

本発明において有用な抗体は、様々などのような方法によっても調整し得る。Antibodies useful in the invention may be prepared by any number of different methods.

本発明において有用な抗体は、Ｔ細胞リセプターの可変領域およびその抗原性断 片に対する抗体を含む。このような抗体の生産方法はよく知られており、文献に 詳細に説明されている。（１９）例えばペプチドを発現する細胞、合成ペプチド やその抗原性断片が、このペプチドと結合できるポリクローナル抗体を含む血清 の生産を誘発させるために動物に投与され得る。本発明において有用なペプチド は長さが２５から５００アミノ酸の範囲であり得る。本発明のいくつかの態様で は、ベブチドは長さが約５０から３００アミノ酸で有り得る。本発明のさらに他 の態様では、ペプチドは長さが５０から２００アミノ酸であり得る。一般的にペ プチド断片は天然の汚染物質の混入がない状態に調製、精製され、あるいは当業 者に明らかな方法で合成される。精製された断片、あるいは合成された断片、あ るいは精製された断片及び／あるいは合成された断片を組み合わせたものが、よ り高い特異的活性を持つポリクローナルな抗血清を生産させるために動物体内に 導入される。Antibodies useful in the present invention include T cell receptor variable regions and antigenic fragments thereof. Contains antibodies against the fragment. Methods for producing such antibodies are well known and documented in the literature. Explained in detail. (19) For example, cells expressing peptides, synthetic peptides or its antigenic fragments in serum containing polyclonal antibodies that can bind to this peptide. can be administered to animals to induce production of. Peptides useful in the invention can range in length from 25 to 500 amino acids. In some aspects of the invention The bebutides can be about 50 to 300 amino acids in length. Further aspects of the present invention In embodiments, the peptide can be 50 to 200 amino acids in length. generally The fragments are prepared, purified, free of natural contaminants, or Synthesized by a method obvious to the person. Purified or synthesized fragments, or a combination of purified and/or synthesized fragments. in the animal body to produce polyclonal antiserum with high specific activity. be introduced.

モノクローナル抗体は、知られているハイブリドーマ技術を用いて調製され得る 。一般的に、このような操作は動物をＴ細胞リセプター可変領域およびその抗原 性ペプチドを含むベブチド抗原で免疫化する事を含む。このような動物の牌臓細 胞を抽出し、適百なミエローマ細胞系と融合させる。適当などのようなミエロー マ細胞系でも本発明に従って適用できる。融合させた後、生じたハイブリドーマ 細胞を適当な培地において選択的に保持し、次に限定希釈法によりクローン化し た。このような選択で得られたハイブリドーマ細胞は次に、ペプチド抗原と結台 できる抗体を分泌するクローンを同定するために検査される。Monoclonal antibodies can be prepared using known hybridoma technology . Generally, such manipulations allow animals to develop T-cell receptor variable regions and their antigens. immunization with a bebutide antigen containing a sex peptide. The viscera of such animals The vesicles are extracted and fused with appropriate myeloma cell lines. Appropriately myelow Mac cell systems can also be applied according to the invention. Hybridoma generated after fusion Cells were selectively maintained in appropriate media and then cloned by limited dilution. Ta. Hybridoma cells obtained through such selection are then combined with peptide antigens. tested to identify clones that secrete antibodies that can be used.

もしペプチド材料が不純である場合、いくつかのハイブリドーマ細胞しかペプチ ドの結合できる抗体を生産しない（他のハイブリドーマは不純物のペプチドと結 合できる抗体を生産する）。したがってハイブリドーマ細胞からペプチドと結合 できる抗体を分泌する事ができる細胞をふるい分ける事が必要であり得る。いっ たんハイブリドーマ細胞が同定されれば、ペプチドに特異的なモノクローナル抗 体を生産させるために、当業者知られた方法でクローンとして増殖させ得る。If the peptide material is impure, only some hybridoma cells will be exposed to the peptide. (Other hybridomas do not produce antibodies that can bind to impure peptides.) produce antibodies that can be combined with other antibodies). thus binding peptides from hybridoma cells It may be necessary to screen for cells capable of secreting antibodies. Good Once peptide hybridoma cells have been identified, peptide-specific monoclonal antibodies can be used to In order to produce cells, they can be clonally propagated by methods known to those skilled in the art.

多くのしトドＴ細胞サセプター可変領域の配列は知られており、ｒＧｅｎｂａｎ ｋＪやｒＥＭＢＬＪなどのデータベースから入手可能である。興味のある他の配 列は、滑脱組織あるいは分泌液から分離したＴ細胞リセブターのｃＤＮＡクロー ンのクローニングおよびシーケンシングにより決定し得る（４８）。The sequences of many Shitodo T cell susceptor variable regions are known, and rGenban It is available from databases such as kJ and rEMBLJ. Other arrangements that may be of interest The columns show T cell receptor cDNA clones isolated from sloughed tissues or secretions. (48).

特に、Ｔ細胞リセブター可変領域Ｖβ１４、Ｖβ１７、Ｖα１とＶＣｌ２の配列 が好ましい。これらの領域の好ましいＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を表 １に開示した。表１はヒトリウマチ滑膜組織由来のＴ細胞リセプターα鎖とβ鎖 の可変頭載の好ましい配列を開示する。このような配列及びその配列の部分は、 本発明において抗体を作成するのに有用である。当業者には明かではあるが、本 発明のいくつかの態様では、天然の核酸の代わりに核酸のアナログを使用し得る 。In particular, the sequences of T cell receptor variable regions Vβ14, Vβ17, Vα1 and VCl2 is preferred. The preferred DNA sequences and corresponding amino acid sequences of these regions are listed. Disclosed in 1. Table 1 shows T cell receptor α and β chains derived from human rheumatoid synovial tissue. Preferred sequences of variable headers are disclosed. Such an array and parts of that array are Useful in the present invention to generate antibodies. Although it is clear to those skilled in the art, the book In some embodiments of the invention, analogs of nucleic acids may be used in place of naturally occurring nucleic acids. .

本発明の好ましい態様では、核酸の配列の長さは、Ｔ細胞リセブター可変領域の コードされる部分とある特定のＴ細胞リセブター可変領域の大きさから、約７５ から約１５００塩基の範囲内であり得る。他の好ましい態様では核酸の配列の長 さは約１５０から約９００塩基の範囲内であり得る。本発明のさらに他の態様で は約１５０から約６００塩基の核酸が選択されたＴ細胞リセプター可変領域ある いはその部分をコードし得る。In a preferred embodiment of the invention, the length of the nucleic acid sequence is that of the T cell receptor variable region. Due to the size of the encoded portion and certain T cell receptor variable regions, approximately 75 may range from about 1500 bases. In another preferred embodiment, the length of the nucleic acid sequence is The length can range from about 150 to about 900 bases. In yet another aspect of the invention The selected T cell receptor variable region is a nucleic acid of about 150 to about 600 bases. Or you can code that part.

浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 目ｊ　具左　韮＝瑚５ｉ己 足′：＞　８普　８シ　足評　ツ五い Ｅ−＋？’　ｈｃ＋）Ｃ！ｌｃ５　Ｕ（（！ＩＬ）ｒ−浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ＬＪり　０口　Ｑ−〇− ぺ―　く−　ぺ＞トー Ｃリ　（Ｊ（５Ｅ−１ト　ロ〉 （ＪＰｎ　ｕ＆、Ｉｕ：ｈｔｎ　ｕ＝＞　＜ｔａむ；　淀エ　８己ゞ　む３　８ 篇 七普　８：　８ピ　足升Ｓ　−ヨ （１／ｌ　Ｉ：ＪＲ，ぺ＜　Ｕべ　０Ｑ浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） Ｅα　乏、：￥　８ｇ９８と　拓躍 Ｃコ　υ絢　＋、ｙｃ　ｕｃ ベー　０ｇ　（− ｕｕ　＜ｒｓ　ｕｕ　乏芝 ト細　ｏｏ　ｇ細哨　υ− ＣＪａｌ　ｔＪｋ　＜：ｓｅ　ｄ：ｔｎ　乏シ、ト切　（Ｊ山　？？　（１）べ 　ＬＩＣ５ＣＪ、−１ｕｕ　ｕｓ、＋　ｕ：Ｉｏ＜ｂＥ＠ｌＩＩ　Ｌｌ＠Ｊ　Ｃ ＪＪ：　４＋ｔｏｕｌす＞　（（１）　＜＆４　ＬＪロ　−ψ浄書（内容に変更 なし） ｎ　辱　お　話　ｄ書ニ ド細　ＣＪＯ４醋い Ｅ−１（／ｌ　ＣＪＱｔ　Ｌｌべ　ｏｕ　Ｈｃ。Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Eye j Left side Ni = Go 5i self Feet:＞　8P　8S　Foot review: tsugoi E-+? 'hc+)C! lc5　U((!IL)r-Engraving (no change in content) Engraving (no changes to the content) LJri 0 mouth Q-〇- pe-ku-pe>to C ri (J (5E-1 Toro) (JPn u&, Iu: htn u=> <tam; Yodoe 8 self 3 8 Edition Seven Pus 8: 8 Pi Ashisho S-Yo (1/l　I:JR,Pe<　Ube　0Q engraving (no change in content) Engraving (no changes to the content) Eα deficiency: ￥8g98 and Takuyaku C co　υ絢　＋、yc　uc Be 0g (- uu　<rs　uu　Koshiba Tossou　oo　gssei　υ− CJal　tJk　:se　d:tn　Poor Shi, Tokiri　(J Mountain?? (1) Be LIC5CJ, -1uu us, +u: Io<bE@lII Ll@J C JJ: 4+toulsu＞((1)　＜&4　LJro　−ψEngraving (changed in content) none) n humiliation story d book 2 Thin CJO4 E-1 (/l CJQt Llbe ou Hc.

ＣＪＰ’ｌ　ＣＪＬＩ　＜■　ペーロ　ペ。CJP’l　CJLI　＜■　Pero　pe.

七ｇ　淀！　８ミ　拓ｒとに 話　エル　１茨　転）　３５ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） モ≧　と品　乏３　藁屑　ミ是０　て芝　〉３妊！　瑚Ｂ　ＨＦ妊フ　３１　却 μ　１屓、路　ｇ５　３．５　哩ｙ８韮　肘　Ｉ浄書（内容に変更なし） Ｅ−４Ｓ、Ｉ　Ｅ４−　ぺ−０９Ｃり　Ｑ−（：１−Ｉ　ＣＪ＠Ｊ　ＣＪニ　ト Φ　べ―ロ　Ｑ−トドＥ４り　ベト　ベニ　ＣＣω　Ｑぺｔ５　打　ヨｙ訂　軒 ３　エル 韮　Ｅ５　瑚コ　韮８Ｅ１　瑚５　連３目足　目Ｓ　ｌｉｄ　３母　■まｉａ　 ■浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ａ云　Ｈお　詰　目３　妊是：　目　１５ＵＳ　＜　諷 ｉａ　瑚５　韮＝目フ　■　。イ　。。Seven grams! 8mi Taku Toni Story Elle 1 Thorn Turn) 35 Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Mo≧ and poor quality 3 straw waste Mi is 0 Teshiba 3 pregnancy! Go B HF Pregnancy 31 Rejection μ　1〓, 路　g5　3.5　y8　　elbow　I engraving (no change in content) E-4S, I E4-Pe-09Cri Q-(:1-I CJ@J CJ Nit Φ Bero Q-todo E4ri Beto Beni CCω Qpet5 hit Yoy edition 3 Elle Nira E5 Goko Nira 8E1 Go 5 consecutive 3rd leg Eye S lid 3 mother ■Maia ■Engraving (no changes in content) Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) aun H Ome 3 Pregnancy: 15US ia Go 5 Nira = Mefu ■. stomach . .

淀ヨ　１只　ツ５　ミオ８　包合　ぺ５　Ｑ“０ｏＪ＜１−＋ ｕｕ　＜Ｉ−ＩＣＪＬＩ　Ｌ）べ　＜ＶＪ　Ｅ−１ｃＱ　ｕａｔヨ　耘５　ｕ　 吋　Ｉま　討　吋 上記に述べた最低１つのＴ細胞リセブター可変領域に対する抗体の効果のある量 を次に、該哺乳類に投与する。効果のある抗体の量とは、対応するりセブターを 持っＴ細胞の滑膜中でのレベルを低くする、あるいは患者において臨床的な快復 の兆候が現れる量である。Yodoyo 1 piece 5 Mio 8 package 5 Q “0oJ<1-+ uu <I-ICJLI L)be <VJ E-1cQ uatyo 5 u 吋　　　　　　》 An effective amount of an antibody directed against at least one T cell receptor variable region as described above. is then administered to the mammal. The effective amount of antibody is the corresponding amount of antibody. Lowering the level of T cells in the synovium or clinical recovery in patients This is the amount at which the symptoms of

本発明の慢性間接リウマチの治療法は勿論、必要であれば従来の治療法と併せて 行われ得る。The treatment method for chronic rheumatoid arthritis of the present invention can be used in conjunction with conventional treatment methods if necessary. It can be done.

本発明の治療は慢性間接リウマチのどの進行状態においても、施すことが可能だ と信じられている。慢性間接リウマチの予防、あるいは進行している病状を快復 させるための哺乳類の免疫化の方法も、本発明によって提供される。この方法は ＶＣｌ２、Ｖα１、ＶＦ１２、ＶＦ１４、ＶＦ１７、およびＶＦ６及びそれらの 抗原性断片からＷ４成されるグループから選択された唾乳類Ｔ細胞すセプター可 変領域を上記踊乳類に投与する事からなる。本発明のいくつかの態様では、表１ ゜に開示したアミノ酸配列及びその部分が好ましい。The treatment of the present invention can be administered in any advanced stage of chronic rheumatoid arthritis. It is believed that Preventing chronic rheumatoid arthritis or reversing progressive disease Also provided by the invention is a method of immunizing a mammal to cause the immunization of a mammal. This method is VCl2, Vα1, VF12, VF14, VF17, and VF6 and their A salivary mammalian T cell receptor selected from the group consisting of antigenic fragments W4 The method consists of administering the modified region to the above-mentioned mammals. In some aspects of the invention, Table 1 Preferred are the amino acid sequences and portions thereof disclosed in .

補乳類は、上記のＴ細胞リセブター可変類域およびその抗原性断片単独で、ある いは当業者には知られている免疫原性を高める試薬を共に用いて免疫化し得る。Complementary mammals include the T cell receptor variable region described above and its antigenic fragments alone. Alternatively, immunization may be performed with reagents that enhance immunogenicity known to those skilled in the art.

一般的に、抗原あるいはタンパク質は１μｇ／ｍｌからＩｇ／ｍｌの濃度で、滅 菌生理食塩水あるいは媒介物として０．４ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含 む生理食塩水に溶解する。一般的にこのタンパク質溶Ｍ０．５からＬＯｍｌを筋 肉内注射して、続いて第１回目の免疫から１及び６−１２力月後に追加抗原刺激 を行う。該動物中に十分量の抗体が生じる抗原の量が、有効量である。Generally, the antigen or protein is administered at a concentration of 1 μg/ml to Ig/ml. Bacterial saline or containing 0.4 mg/ml aluminum hydroxide as a vehicle. Dissolve in physiological saline. Generally, LOml of this protein solution M0.5 is Intracutaneous injection followed by booster challenge 1 and 6-12 months after the first immunization. I do. The amount of antigen that produces a sufficient amount of antibodies in the animal is an effective amount.

桶乳類をＴ細胞リセプター可変領域で免疫化する事は、実験系における自己免疫 脳を髄炎の予防において先例がある（１１．１２）、免疫化が必要なのは、ここ で述へられた慢性間接リウマチの臨床的証拠をもつ患者、慢性間接リウマチを患 ってきた家系を持つ患者、あるいは遺伝的に慢性間接リウマチの疾病素質がある 患者であると信じられている。ここで述べられた、慢性間接リウマチの治療のた めに有用な抗体を含むキットあるいは、免疫化のための抗原を含むキットも、本 発明の範囲内にある。Immunization of mammals with T-cell receptor variable regions can prevent autoimmunity in experimental systems. There is precedent for preventing myelitis of the brain (11.12), and this is where immunization is needed. patients with clinical evidence of chronic rheumatoid arthritis as described in Patients with a family history of chronic rheumatoid arthritis or a genetic predisposition to chronic rheumatoid arthritis. believed to be a patient. For the treatment of chronic rheumatoid arthritis mentioned here, Kits containing antibodies useful for immunization or antigens for immunization are also included in this book. within the scope of the invention.

材料及び方法 滑Ｌ１組織及び細胞系、　組織は間接手術の際に得られ、無菌的に取り扱われた 。Materials and methods Synthetic L1 tissue and cell lines, tissues were obtained during indirect surgery and handled aseptically. .

この組織を滅菌したリン酸緩衝溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）でリンスし、ペトリ皿に置き 、表層をはさみで切りとり、メスで切り刻んだ。切り刻んだ組織を５％ＨＥＰＥ Ｓ緩衝液、０．４ｇヒアルロニダーゼ（タイプＬ−３）、０．０４ｇ　ＤＮａｓ ｅｌ（ウシすい臓タイプＩＩＬ１．２ｇコラーゲナーゼ（タイプＺ）（全てＳｉ ｇｍａ社、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉａ、ＭＯ）、１％ウシ胎児血清を含む２０ｍ１のＰ ＢＳに加え、３７℃で９０分間、継続的に撹はんした。組織の大きな塊をデカン トして取り除き、細胞を遠心分離して培養液（ＲＰＭ１１６４０．ペニシリン／ ストレプトマイシン（ｐｅｎ／５ｔｅｐ）、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリ ウム、非必須アミノ酸、ＨＥＰＥＳ緩衝！、５Ｘ１０−ｓＭβ−メルカプトエタ ノール（全てＧｉｂｃｏ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））と１０％ＦＣ ８（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で２回洗浄した。Ｔ細胞を標準的なナイロンウールクロマ トグラフィーで精製しく１７Ｌ培地中で一晩ｌＸｌ０’／ｍｌまで培養し、非付 着細胞を分離し、培地中に保持した。細胞の活性化は、フィトヘムアグルチニン （１％溶液、Ｓ　ｉ　ｇｍａ社）、インターロイキン−２（Ａｍｇｅｎ　Ｂｉｏ ｌ。Rinse the tissue with sterile phosphate buffered saline (PBS) and place it in a Petri dish. , the surface layer was cut off with scissors and chopped with a scalpel. Add 5% HEPE to the chopped tissue. S buffer, 0.4g hyaluronidase (type L-3), 0.04g DNas el (bovine pancreatic type IIL 1.2g collagenase (type Z) (all Si GMA, St. Louis, MO), 20 ml of P containing 1% fetal bovine serum. Added to BS and stirred continuously for 90 minutes at 37°C. Decant large chunks of tissue Cells were centrifuged and cultured (RPM11640.penicillin/ Streptomycin (pen/5tep), L-glutamine, sodium pyruvate Um, non-essential amino acids, HEPES buffer! , 5X10-sM β-mercaptoeta (all Gibco, Gaithersburg, MD)) and 10% FC. 8 (Hyclone) twice. Standard nylon wool chroma T cells Purified by chromatography, cultured in 17L medium overnight to 1X10'/ml, and then Adherent cells were separated and kept in culture medium. Cell activation is caused by phytohemagglutinin (1% solution, S i gma), interleukin-2 (Amgen Bio l.

ｇｉｃａｌｓ社、Ｔｈｏｕｓａｎｄ、０ａｋｓ、ＣＡ）あるいは培地単独で行っ た。細胞の活性化刺激は３−５日間行い、つぎに、解析をする前に、ＩＯＵ／ｍ １のＩＬ−２中で様々な時間保持した。Gicals, Thousand, Kansas, CA) or the medium alone. Ta. Cell activation stimulation was performed for 3-5 days, and then, before analysis, IOU/m 1 in IL-2 for various times.

蛍光−活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）による解析：　培養後、細胞を遠心分離し て、洗浄し、ＦＡＣ５培地（１％ウシ血清アルブミン、（Ｌ　１％アジ化ナトリ ウムを含むＰＢＳ）に１００μｌ当たりｌＸｌ０’に懸濁した。１次抗体を加え て水上で２０−４００分置た。２回洗浄後、細胞に２次抗体（フルオレセインイ ソチアン酸結合ヤギ抗−マウスＩ　ｇＧ　（Ｓｉ　ｇｍａ社）；１００培希釈） を反応させ、再び２回洗浄した。これらの細胞をペンシルヴアニア大学癌センタ ーＦＡＣ８施設（ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎ ｉａ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒ　ＦＡＣＳ　ｆａｃｉｌｉｔｙ）で解析した 。１次抗体を加えていないコントロールと比較して陽性のパーセンテージを決定 した。使用された抗体は、０ＫＴ３　抗−ＣＤ３　（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏ ｓｔｉｃｓ社、Ｒａｒｉｔａｎ、ＮＪ）、Ｌｅｕ３ａ　抗−ＣＤ４　（Ｂｅ　ｃ 　ｔ　ｏｎ−Ｄｉ　ｃｋｉｎｓｏｎ社、ｐｒｏｖｉｄｅ　１ｏｃａｔｉｏｎ）、 および０ＫＴ８　（Ｏｒｔｈｏ）であり、業者の指示する希釈率で用いた。Analysis using fluorescence-activated cell sorter (FACS): After culturing, cells are centrifuged. Wash, add FAC5 medium (1% bovine serum albumin, (L) 1% sodium azide) 1×10' per 100 μl. Add primary antibody and placed on water for 20-400 minutes. After washing twice, cells were treated with secondary antibody (fluorescein antibody). Sothianic acid-conjugated goat anti-mouse IgG (Si gma); diluted in 100 medium) was reacted and washed twice again. These cells were transferred to the University of Pennsylvania Cancer Center. -FAC8 facility (the University of Penn5ylvan) Analyzed with ia Cancer Center FACS facility) . Determine the percentage of positive results compared to a control without primary antibody did. The antibody used was 0KT3 anti-CD3 (Ortho Diagno stics, Raritan, NJ), Leu3a anti-CD4 (Bec t on-Di ckinson, provide 1 location), and 0KT8 (Ortho), which were used at dilution rates specified by the manufacturer.

ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ台成、合成織をグアニジウムイソチアン酸（ＧＩＴＣ ）中でホモジナイズ、あるいは細胞をＧＩＴＣ溶液に懸濁して３０秒間ポルテッ クスした。０．１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４を加え、溶液をポルテックス し、１．０ｍｌのジエチルピロ炭酸（ＤＥＰ）−ホー飽和フエノールを次に加え 、試料を混合した後、０．２ｍｌのフェニルイソアルコールを加えて完全にポル テックスし、ｍＨを滅菌したエッペンドルフチューブに移した。次に各試料を水 上で２０分インキュベートして、マイクロチューブ遠心機で１０分間遠心分離し 、上層を回収し、２．５容積の１００％エタノールと１／１０容積の１Ｍ酢酸ナ トリウムｐＨ５，５を加えてドライアイス／エタノール中で３０分間インキュベ ートしてＲＮＡを沈澱させた。この溶液をマイクロチューブ遠心機で１５分間遠 心分離し、上清をデカントして、ベレットを７０％エタノールで洗浄し、ロータ リーエバポレーターで乾燥させた。乾燥させたベレットを５０μｍのり、ＥＰ− 水に溶解し、ＲＮＡを分光学的に定量した。RNA extraction and cDNA preparation, synthesis was performed using guanidium isothianate (GITC). ), or suspend cells in GITC solution and incubate for 30 seconds. I giggled. Add 0.1 ml of 2M sodium acetate pH 4 and portex the solution. and 1.0 ml of diethyl pyrocarbonate (DEP)-ho saturated phenol was then added. After mixing the sample, add 0.2 ml of phenylisoalcohol to completely dissolve the porosity. Tex and transferred the mH to a sterile Eppendorf tube. Next, add each sample to water. Incubate for 20 minutes and centrifuge for 10 minutes in a microtube centrifuge. , collect the upper layer and add 2.5 volumes of 100% ethanol and 1/10 volume of 1M sodium acetate. Add thorium pH 5.5 and incubate for 30 minutes in dry ice/ethanol. The RNA was precipitated by heating. Centrifuge this solution for 15 minutes in a microtube centrifuge. Separate the hearts, decant the supernatant, wash the pellet with 70% ethanol, and place in a rotor. It was dried in a Lee evaporator. Glue the dried pellet with 50 μm glue and EP- It was dissolved in water and the RNA was quantified spectroscopically.

逆転写は、１０μｌ当たり１−２０ｇｇのＲＮＡを用いて、次の組成の反応溶液 でランダムヘキサマーをプライマーとしてｃＤＮＡを合成させた。３μＩ　Ｍ　 。Reverse transcription was performed using 1-20 gg of RNA per 10 μl, using a reaction solution with the following composition: cDNA was synthesized using random hexamers as primers. 3μI　M .

１ｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素、６μｌ　５Ｘ逆転写酵素バフフア ー、１．５μＩＲＮａｓｅインヒビター、および３μＩＯ，１Ｍジチオスレイト ール（全てＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、３ｕｌ ランダムヘキサマー（ファルマシアＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｐ ｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、および１あるいは３μ＋の１００ｍＭ　ｄＮＴＰ ｓ（各ｄＮＴＰは２５ｍＭ、ベーリンガーマンノ１イム社、ＧｍｂＨ，Ｇｅ　ｒ ｍａｎｙ）。２５℃で１０分ブレインキュベーションした後、反応を４２℃で１ 時間行い、次に９５℃で５分置き後に一２０℃で使用するまで保存した。1 one murine leukemia virus reverse transcriptase, 6μl 5X reverse transcriptase buffer -, 1.5 μI RNase inhibitor, and 3 μIO, 1M dithiothrate (all GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD), 3ul Random hexamer (Pharmacia LKB Biotechnology, P iscataway, NJ), and 1 or 3μ+ 100mM dNTPs s (each dNTP is 25mM, Boehringer Mannolium, GmbH, Ger many). After a 10 min incubation at 25°C, the reaction was incubated at 42°C for 1 After heating at 95°C for 5 minutes, the mixture was stored at -20°C until use.

Ｔ細胞リセブター可変領域のＰＣＲによる増幅：　ｃＤＮＡは表５に示したプラ イマーを用いてＶａ／βｎ（！：Ｃａ／βａｉｄが濃度０．２μＭで増幅した。Amplification of T cell receptor variable region by PCR: cDNA was prepared using the platform shown in Table 5. Va/βn(!:Ca/βaid was amplified at a concentration of 0.2 μM using an imer.

ｃＤＮＡはＴｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ボリメラー−ゼ）を用いて、業者（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｃ ｏｒｐ。The cDNA was prepared using Thermus aquaticus DNA polymerase (Taq (Perkin-Elmer Cetus C) orp.

、Ｎｏ　ｒｗａ　ｌｋ、ＣＴ）の指示する標準反応条件に従って増幅した。反応 溶液は、１０μｍのＩＯＸ反応バッファー、１６μｌの１．２５ｎＭ　ｄＮＴＰ ｓ　（各ｄＮＴＰの最終濃度は２００μＭ）、５μｍのオリゴヌクレオチドプラ イマー各２０μＭ（各プライマーの最終濃度は１μＭ）、５μｌ　ＤＮＡ、０． ５μ１ＤＮＡ、０．５μｌ　Ｔａｑ　ポリメラーゼ、５８．　５μｌ　蒸留／脱 イオン水を含む。プライマーはＷｉｓｔａｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅオリゴヌクレ オトド合成機で合成した。使用したプログラムは、低いストリンジエンシーのた めの低温のサイクル（９５℃　１分、３７℃　２分、５２℃　２分）が５回、続 いて高いストリンジエンシーのサイクル（９５℃　１分、５２℃　２分、７２℃ 　２分）が４０回、最後に伸長合成のための７２℃で５分間で構成されていた。The amplification was carried out according to standard reaction conditions as directed by Phys., Norwa, CT). reaction The solution was 10 μm IOX reaction buffer, 16 μl 1.25 nM dNTPs. s (final concentration of each dNTP is 200 μM), 5 μm oligonucleotide plate 20 μM of each primer (final concentration of each primer is 1 μM), 5 μl of DNA, 0. 5 μl DNA, 0.5 μl Taq polymerase, 58. 5 μl distillation/desorption Contains ionized water. The primer is Wistar In5 titute oligonucleotide. Synthesized with Otodo Synthesizer. The program used was low stringency. 5 consecutive low temperature cycles (95°C for 1 minute, 37°C for 2 minutes, 52°C for 2 minutes) High stringency cycles (95°C for 1 minute, 52°C for 2 minutes, 72°C 2 min) for 40 times, and a final 5 min at 72°C for elongation synthesis.

いくつかの実験では、上記の２０サイクルの後に続いて高いストリンジエンシー のサイクル（９５℃　１分、５２℃　２分、７２℃　２分）を５サイクルづつ増 やしていき、この各５サイクルごとにＰＣＲ産物を解析のために採集した。産物 はエチジウムブロマイドで染色した２−３％アガロースゲルで解析した。In some experiments, the above 20 cycles were followed by a high stringency test. Increase the number of cycles (95℃ for 1 minute, 52℃ for 2 minutes, 72℃ for 2 minutes) by 5 cycles. The PCR products were collected for analysis after every 5 cycles. product were analyzed on a 2-3% agarose gel stained with ethidium bromide.

Ｔ細胞リセブター可変頭域の配列の決定　ＰＣＲ産物をキットの指示に従ってＴ Ａクローニングベクターにクローン化した（ＩｎＶｉ　ｔ　ｒｏｇｅｎ％Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。このクローンから、参考文献として引用する事でここにそ のすべてが含まれる、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　 Ｙｏ　ｒｋ、　Ｎ、　Ｙ、　）でＡｕ５ｕｂｅｌらによって、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｃ１゜ｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、）でＳａｍｂｒｏｏｋらによって述べ られている通りにプラスミドＤＮＡを単離した。参考文献として引用する事でこ こにそのすべてが含まれる、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ。Determining the sequence of the T cell receptor variable head region: PCR products were transduced into T cells according to the instructions of the kit. A cloning vector (InVit rogen%San Diego, CA). From this clone, hereby cite it as a reference. Current Protocols in Molec ular Biology (John Wiley & 5ons, New Molecula by Aubel et al. r C1゜ning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Co1d Spring Harbor, N.Y.) as described by Sambrook et al. Plasmid DNA was isolated as described. You can cite it as a reference. Current Protocols in Mo includes all of this. 1ecular Biology (John Wiley & 5ons, N ew York.

Ｎ、Ｙ、　）でＡｕ５ｕｂｅｌらによって、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ。N, Y, ) by Aubel et al., Molecular Clonin g.

Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏ　ｒ、　Ｎ、　Ｙ、　）でＳａｍｂｒｏｏｋらによって述べられている方法 により、クローン化したｃＤＮＡの配列の一部を決定した。アミノ酸配列を、表 １に開示した通りに決定した。表２に開示した相対的位置は、使用したファミリ ー特異的プライマーと公表されたデータに提供されている不変配列および知られ ているＴ細胞リセブターの配列の番号との関係から決定された（Ｋａｂａｔ、Ｅ 、Ａら、５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ　第４版、米国保険社会福祉省、公衆衛生総局国 立研究所（１９８７））。A Laboratory Manual (Cold Spring Har bar Laboratory Press, Co1d Spring Har The method described by Sambrook et al. A part of the sequence of the cloned cDNA was determined. Amino acid sequence, table The decision was made as disclosed in 1. The relative positions disclosed in Table 2 are based on the family used. – Specific primers and invariant sequences provided in published data and known It was determined from the relationship with the sequence number of the T cell receptor (Kabat, E. , A et al., 5equence of Proteins of Immunolo gical Interest 4th edition, U.S. Department of Health and Human Services, Surgeon General Ritsumeikan Institute (1987)).

浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし］ 浄書（内容に変更なし） 浄１！ｆ（内容に変更なし） トランスファーおよびブロービング：　アガロースゲルからナイロン繊維（Ｇｅ ｎｅｓｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ、Ｄｕ　Ｐｏｎｔ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕ ｃｌｅａｒ社、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）に−晩キャビラリートランスファーを行っ た。ハイブリダイゼーシヨンは、図５に示したＣα５″あるいはＣβ５′のいず れかを使用して行った。オリゴヌクレオチドの標識反応は、１１００ｎ　ＤＮＡ 。Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Engraving (no change in content) Engraving (no changes to the content) Pure 1! f (no change in content) Transfer and blobbing: From agarose gel to nylon fiber (Ge nesscreen Plus, DuPont New England Nu Clear Inc., Boston, MA) - overnight cavillary transfer was performed. Ta. Hybridization can be performed using either Cα5″ or Cβ5′ shown in Figure 5. This was done using The oligonucleotide labeling reaction was performed using 1100n DNA. .

７５μＣ＋　”Ｆ　ＡＴＰ−２，５μｌ　ＩＯＸキナーゼバッファ　（５００ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，６，１００ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、５０ｍＭ　ジチ オスレイトール、１ｍＭ　スペルミジン、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）、ＩＯＵ　Ｔ４Ｄ ＮＡキナーゼ、を含み、全量を蒸留水で２５μｍに調整した。標識反応は、３７ ℃で３０分使用前に行った。ポリエチレン製のシールバッグ中でプロットを５Ｘ ＳＳＣ，５ＸＤｅｎｈ、ａ　ｒｄｔ溶液、０．１％　ＳＤＳ中で１−１．５時間 、５５°Ｃでプレハイブリダイズし、はとんどの溶液を流して捨て、”Ｐｍ！し たオリゴヌクレオチドを加え（７５μＣυ４２℃で２−３時間あるいは４℃で一 晩ハイブリダイズさせ、プロットを２ＸＳＳＣ，０，１％　ＳＤＳで１０００℃ で２０分間洗浄し、次に５ＸＳＳＣ，０，１％　ＳＤＳで３回４５℃で２０分間 洗浄し、コダック　ＸＲＰフィルムを一７０℃で２−７２時間露光させた。75μC+”F ATP-2, 5μl IOX Kinase Buffer (500m M Tris-HCI pH 7, 6, 100mM MgC1z, 50mM Dithi Ostreitol, 1mM spermidine, 1mM EDTA), IOU T4D The total volume was adjusted to 25 μm with distilled water. The labeling reaction is 37 ℃ for 30 minutes before use. Plot 5X in polyethylene sealed bag SSC, 5X Denh, ardt solution, 1-1.5 hours in 0.1% SDS , prehybridize at 55°C, drain and discard most of the solution, and Add oligonucleotide (75 μC υ at 42°C for 2-3 hours or at 4°C for one hour). Hybridize overnight and plot in 2X SSC, 0.1% SDS at 1000°C. Wash for 20 minutes with After washing, the Kodak XRP film was exposed at -70°C for 2-72 hours.

統計処理−各ＴＣＲＶ領域ファミＩＪ−で生じる標準誤差は次の式から計算した （ｐ　［１−ｐｌ　／ｎ）の２乗根の１００倍ただしｎは解析した試料の数であ り、ｐは陽性の数である。特定のＴＣＲＶ領域ファミリーの出現頻度は、該タイ プ（α対β）の全てのＶ領域の平均からの標準誤差が２以上である場合に有意に 増加したと考えられた。Statistical processing - The standard error generated in each TCRV region family IJ was calculated from the following formula. 100 times the square root of (p[1-pl/n) where n is the number of analyzed samples. , p is the number of positives. The frequency of occurrence of a particular TCRV region family is Significantly if the standard error from the mean of all V regions of It was thought that there was an increase.

結果 ＰＣＲプライマー ヒトＴＣＲαおよびβの定常領域由来のプライマーが、各々のファミリーの可変 領域に特異的なプライマーと併せて用いられた（１４−１６）。これらの研究で 用いたプライマーは図５に挙げられ、これらのｃＤＮＡのコーディング鎖におけ る相対的位置は図１に示されている。定常領域のプライマーは、ＰＣＲ反応のブ ライミング及びプロッティングにおけるプローブの両方に使用できるように、ア ンチセンスプライマーとして設計した。可変領域のプライマーは、以前に報告さ れているように、ファミリー特異的に働くように設計した（１４−１６）。result PCR primer Primers derived from human TCRα and β constant regions were used in conjunction with region-specific primers (14-16). In these studies The primers used are listed in Figure 5 and are The relative positions are shown in FIG. The constant region primers are used as primers in the PCR reaction. The access point can be used for both priming and probing in plotting. was designed as an antisense primer. Variable region primers were previously reported. It was designed to act in a family-specific manner as described (14-16).

これらの研究において、ＰＣＲプログラムは最初に低いストリンジエンシーのサ イクルが５回、続いて高いストリンジエンシーのサイクルが２０回で構成されて いるものが使われた。このプログラムを使用する事は、２重の意味で理由があっ た。これらの研究は、ＲＡ滑膜において発現されるＴ細胞リセブターのレンジを 調査するためにデザインされているが、全てのＴＣＲＶＲ域の配列が決定されて はいなく、ここで用いられたプライマーに近縁な配列を持つＴＣＲファミリーも 、最初の低いストリンジエンシーのサイクルで増幅される可能性がある。次の４ ０サイクルの増幅は、低い頻度で現れる転写物をも増幅する。この事は手術で得 た試料において起こり得る、サンプリングのエラーの潜在的問題を回避するのに 役立つ。従って、もし特定のＴＣＲを持つＴ細胞の局所的な蓄積があり、このよ うな局所的蓄積が手術試料から欠けていた場合に、それらの存在は、検討した手 術試料にそれらが低い頻度で含まれていれば検出できる。これらのプライマーお よび、材料および方法で述べたプログラムを用いた予備実験から、これらの全て （Ｖβ１６以外）がＰＨＡで刺激した末梢血液単核細胞からＴＣＲＶ領域を増幅 するが、Ｊｕｒｋａｔ細胞では適当なＶ領域プライマーのみがＴＣＲのｃＤＮＡ を増幅するのに効果的であった（２０、およびここに示さないデータ）。In these studies, the PCR program was initially run at low stringency. It consists of 5 cycles followed by 20 cycles of high stringency. What was available was used. There are two reasons for using this program. Ta. These studies reveal the range of T cell receptors expressed in the RA synovium. Although the entire TCRVR region has not been sequenced, There are no TCR families with sequences closely related to the primers used here. , may be amplified in the first low stringency cycle. Next 4 Zero cycles of amplification also amplify transcripts that occur at low frequencies. This can be achieved through surgery. to avoid potential problems of sampling error that can occur in Helpful. Therefore, if there is a local accumulation of T cells with a specific TCR, In cases where localized accumulations of cartilage were missing from the surgical specimen, their presence was They can be detected if they are contained in a surgical sample at a low frequency. These primers From preliminary experiments using the program described in Materials and Methods, all of these (other than Vβ16) amplify the TCRV region from peripheral blood mononuclear cells stimulated with PHA However, in Jurkat cells, only appropriate V region primers are used to target TCR cDNA. (20, and data not shown here).

滑１１！ｉＴ細胞： 全滑膜およびＰＨＡ刺激して［Ｌ−２で保持した滑膜Ｔ細胞系の両方から、ＲＮ Ａを抽出してｃＤＮＡを合成した。この方法で得られたＴ細胞系は以前（１７） 、及び早くから述べられており、表現型として混成の集団を示し、ＣＤａ＋とＣ Ｄ４＋細胞を含む（１７）。　ＦＡＣ３解析は、解析をした当時、これらの細胞 型のうち４つについて可能であり、データを表３に示す。これらのうち３つでは 、ＣＤＪ＋細胞が優勢を占めており、一方残りの１つではＣＤａ＋細胞がより優 勢であった。Slide 11! iT cells: RN from both whole synovium and PHA-stimulated [L-2-maintained synovial T cell lines A was extracted and cDNA was synthesized. T cell lines obtained using this method have been previously described (17) , and was described early on, showing a phenotypically mixed population, with CDa+ and C Contains D4+ cells (17). FAC3 analysis is based on these cells at the time of analysis. This is possible for four of the types, and the data are shown in Table 3. In three of these , CDJ+ cells predominate, while in the remaining one, CDa+ cells are more predominant. It was a strong force.

表３ 滑膜Ｔ細胞型の表現型 患者　対照　ＣＤ３＋　ＣＤ４＋　ＣＤ８＋ＥＰ、　１％　９０％　２５％　５ ４％ＮＪ、　１％　８０％　８１％　９％ ＭＷ１　１％　９９％　７７％　２８％ＨＲ，３％　９８％　７４％　１５％ Ｔ細胞リセプす−転写物は、リウマチ滑１１ｉＴ細胞系に由来するｃＤＮＡを用 いて合成した。全てのりウマチ滑膜は間接手術の際に採集され、したがってこれ らは最近の病状を表すものである。ｃＤＮＡを均等に分け、中央に位置する不変 領域プライマー（Ｃａ、１□とＣβ１．）と、表５に示した各々の可変領域のプ ライマーの組み合わせ（例えば、Ｃβ１．＋Ｃβ１、Ｃβ−＋＜＋Ｃβ２．　、 　、　、　Ｃ８，＋ｍ＋Ｃ／３２０　；　Ｃａｍ＋ｍ＋Ｃａ　１．　Ｃａｍ＋ｔ ＋ｃａ　２．　、　、　、　Ｃａ−＋ｍ＋Ｃａ　１８）で増幅した。これらを電 気泳動してトランスファーし、各々Ｃβ５゛あるいはＣα５°をプローブとして 検出した。滑膜Ｔ細胞における結果を図２に示す。これらの細胞系では、平均し て１５のα鎖と１５．８のβ鎖が検出された。この事はきわめて異種組成のＴ細 胞集団が滑膜に存在する事を示す。しかしながらこれらの細胞系は初期にＰＨＡ によって拡張されており、この培養中に様々なＴＣＲのサブセットが変化する可 能性がある。その上、ＰＨＡが休止期の細胞を活性化させる能力がある事は、活 性化の後と前での活性化されたＴ細胞の相対的な組成に注目させる。したがって 、同様な解析を刺激を加えない全リウマチ滑膜を用いて行った。Table 3 Synovial T cell type phenotype Patient Control CD3+ CD4+ CD8+ EP, 1% 90% 25% 5 4% NJ, 1% 80% 81% 9% MW1 1% 99% 77% 28% HR, 3% 98% 74% 15% T cell receptor transcripts were generated using cDNA derived from the rheumatoid arthritis 11i T cell line. and synthesized it. All rheumatoid synovium was collected during indirect surgery and therefore this These represent recent medical conditions. Divide the cDNA evenly and place an invariant in the center region primers (Ca, 1□ and Cβ1.) and each variable region primer shown in Table 5. Combinations of primers (e.g., Cβ1.+Cβ1, Cβ-+<+Cβ2., , , C8, +m+C/320; Cam+m+Ca 1. Cam+t +ca 2. , , , Ca-+m+Ca 18). These Transfer by aerophoresis and use Cβ5゛ or Cα5° as a probe respectively. Detected. The results for synovial T cells are shown in Figure 2. For these cell lines, on average 15 α chains and 15.8 β chains were detected. This means that the T-thickness has a very heterogeneous composition. This shows that a cell population exists in the synovium. However, these cell lines initially It has been extended by There is a potential. Furthermore, the ability of PHA to activate quiescent cells suggests that We draw attention to the relative composition of activated T cells after and before sexualization. therefore , a similar analysis was performed using unstimulated whole rheumatoid synovium.

リウマチ滑膜： 全滑膜、あるいは分離したばかりの刺激を加えていない、滑１１１Ｔ細胞を同様 に解析した結果を図３に示す。この方法により、平均して４．２のα鎖と９．７ のβ鎖ファミリーが検出された。図２．３において検出されたバンドの濃さはき わめて多様である。さらにこの方法を評価するために、４つの滑膜由来のｃ　Ｄ ＮＡを合わせ、これらのプライマーを用い、サイクルの数を増加させていき増幅 を行った（図４）サイクルの初期に現れたいくつかのバンドが、後のサイクルで 現れたバンドに比べて濃さが薄くなっているのに注目せよ。したがって、バンド の濃さはそれらの相対的な存在量の指標とはならない。Rheumatoid synovium: Whole synovium or freshly isolated, unstimulated synovial 111 T cells were Figure 3 shows the results of the analysis. With this method, on average 4.2 α-chains and 9.7 The β-chain family of was detected. The density of the band detected in Figure 2.3 is It is extremely diverse. To further evaluate this method, four synovial-derived cD Combine the NA and amplify using these primers in increasing numbers of cycles. (Figure 4) Some bands that appeared early in the cycle appeared in later cycles. Notice that the density is lighter than the band that appeared. Therefore, the band The density of these is not an indicator of their relative abundance.

滑膜組織における各ＴＣＲ可変領域の出現頻度を図６と７に示す。滑膜Ｔ細胞系 においてＴ細胞リセプターの発現がきわめて異種組成であったのに比べ、リウマ チ滑膜における発現はいくらかより制限されていた。特にＶＣｌ２は７／１０の 滑膜で見られ、■α１は５／１０の滑膜でみられた。ＶＢ１４は９／１０の試料 に存在するが、一方Ｖβ１７とＶＢ１２は８／１０の試料に存在し、ＶＢ２は７ ／１０に存在した。この事はこれらの可変領域が、多くの異なる患者の多くのリ ウマチ滑膜に存在する事を示唆する。統計学的解析を行ったところ、ＶＢ１２． １４、および１７の頻度は、検出された全てのＴＣＲＶβの平均より標準誤差≧ ２高く、ＶＣｌ２は検出された全てのＴＣＲＶαの平均より標準誤差≧２高かっ た。The frequency of appearance of each TCR variable region in synovial tissue is shown in Figures 6 and 7. synovial T cell lineage The expression of T cell receptors in rheumatoid arthritis was highly heterogeneous; Expression in the synovium was somewhat more restricted. Especially VCl2 is 7/10 ■α1 was seen in 5/10 synovial membranes. VB14 is a 9/10 sample while Vβ17 and VB12 were present in 8/10 samples and VB2 was present in 7/10 samples. /10 existed. This means that these variable regions are present in many different patients and in many regions. Suggests that it exists in the equine synovium. Statistical analysis revealed that VB12. The frequencies of 14 and 17 are standard error ≥ the average of all detected TCRVβ 2 higher, and VCl2 is ≥2 standard errors higher than the mean of all detected TCRVα. Ta.

浄書（内容に変更なし） 参考文献 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 目ａ　呂ａ　話　町３ Ｉ左　韮３■　仁！　關 す友　具ヨ　話　目丑Ｓ巨ｙ 浄書（内容に変更なし） Ｆ　５　３　Ｂ　５ −　−　〇い　へ　コ ５　謬　ｒエ　ｇ ｉ　シ　、！！　ミ　：Ｉｏ　細 ψ　＜ｔＪ（５φ ｋ　Ｓ　占　ｉ　」ま シ仝シ　馨　；　ヨ （！＋ｕｔ／Ｊ＞ｕ 浄書（内容に変更なし） ３ａ　Ｈ記ｚ　目 淀々″　２芝　薯ｔ　暑５ 浄書（内容に変更なし） ：！ｃａｒａ＋ −−二　ｇ ｃ５（！＋　ロー　へ ゆＬｌ’ｌｌ：Φ− １御　ψ　Ｊ：ｌ１１ ベ　ベ　ロ１　＞ 細　−〇　Ｒ− Φ　Ｊ：ｎ−為 ψトペー 一　し　コＩＩ：　コ ＋ａ　ω　−曽　−− 〉　９　＄３（ＩＪ ｋｇｋ　りＯＳ ａ　−Ｊ：　＠＋１− ＣＱ（？−（ −１，Ｉ　＞　ＱＩ　：Ｉ給 飄　Φ　−埴　−ト ）Ｉ　り　Ｃ＜　ロ ＞Ｏコ　Ｑｌ　り　− ｐｓｓ　Ｆ−１１，Ｉ　Ｆ−１Φ ｏｔ、ｉ　）Ｉ　ｕ　の 浄書（内容に変更なし） ８う　肘　ワ缶　菖ミ　３士 ＜ａｕｎ　（ＪＣ（Ｊ− 足二″　≦＝　（？＜ｊｔ５　−ψ υ−ｏ　ＣＪｕ　ＣＪコ　＜Ｏ ｒＪ″　υｇ°　足ｅ　む３　８と トク　ベト 冒　８普　８区＝Ｕヨ　韮 Ｃ〉　ぺψ　Ｑベ リ農　穏コ　Ｈ５鼎８Ｌ走 ％′−８普　Ｃｐｓ　ＮＳ　ｔｆ、、言ま■舎視己　！ｉ　Ｍ、Ｑ　ＩＡ 浄書（内容に変更なし） り　仁　−Ｑｌ　り〇 −−Ｊ：　ψ　−φ ｔｐｏｈ　＜　。Engraving (no changes to the content) References Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Eye A Roa Story Town 3 I left Nira 3 ■ Jin!　關 Friends Guyo Story Eye Ox S Huge Engraving (no changes to the content) F 5 3 B 5 −　−〇〇いへ　こ 5　Error　r　g i,! ! Mi:Io Thin ψ　<tJ(5φ k S divination i” Shi Kaoru; yo (!+ut/J>u Engraving (no changes to the content) 3a H No. z Tadashi'' 2 grass yam 5 Engraving (no changes to the content) :! cara+ --2 g c5 (!+ to low YuLl’ll:Φ- 1 ψ J:l11 Bebero 1> Thin -〇　R- Φ J:n-for ψtope Ishiko II: Ko +a　ω　-Zeng-- 〉　9　$3(IJ kgk OS a −J: @+1− CQ(?-( -1, I > QI: I salary 飄　Φ　－埴　－ト ) I ri C< ro ＞Oko Ql - pss F-11, I F-1Φ ot,i　I　u　 Engraving (no changes to the content) 8 Elbow Wakan Ayumi 3rd person <aun　(JC(J- Leg 2″≦=(?<jt5−ψ υ−o　CJu　CJ　＜O rJ″　υg°　leg e　3　8と Toku Beto Blasphemy 8th Ward 8th District = Uyo Nirayu C〉　Peψ　Q〉 Ri-no-kunko H5 ding 8L run %'-8P Cps NS tf,, I saw it! i M, Q IA Engraving (no changes to the content) Ri　人　-Ql　Ri〇 −−J:　ψ　−φ tpoh <.

ｏ′１いａ−；− １御　−Ｊ：　Ｐ４ｄｌ ＜＜１−ＩＯψ ｋｌａｏｌｉ：ＩＱ ａＩ≦ｎｔＱ− の　？１−４−〇ｉ １、Ｉｎ１ｅＬ＋口Φ ω　−−Ｊ：％ＤＪ： φぺ０ト− ＄ｉ１．Ｉ　り　コ　−１ と　Φ　ａｔ　ａｔ　ｍｈ Ｉｉ−Ｉ　切　−−〉 浄書（内容に変更なし） ０り　ＯＩ：　υ−〇− ＜ｓ　Ｉｌｌ：１−１４＞　）１１＋１ＬＩＬＩ　ｕａ　ｈｓ　ｔｐ＞ ＜σ＋ｖ　ＣＪ　＝　ｕｅ　Ｏ口 足！；！”　２芝　ご８　１＝ 目茨　韮３遥昌　ヨ３３占 ０−　０し　ｕ＞ｕ′Ｎ　（！１り　ペーしｇ　足８　８０ゞ　む３　８ズ じ普　８！　８「　藁訃Ｓ　乏只 （の　Ｑべ　べべ　Ｃべ　（５（５ Ｑ細　０し　ＣＪＱ、　（！ｌ　コ　ペー噴＜’：ｓ　（ＪＣに瞬　（−υΦト Ｅ−４Ｅ４　−ψ　Ｕペ　ロロ　−ψ り為ロ　Ｏコ　Ｕコ　ペ細　ぺ０ ８Ｇ″　ごぢ　し３　足Ｇ　８と 浄書（内容に変更なし） −−ロ　；　φ　コ Φ　ｇ１＋″１−＞− ψ　Ｅ４　ｔ３　Ｊ　ｔ５ −一＞い　コ　句 （ＩＩ　賞″　３　＝ ＞　ψ １−＋１Ｉｊｔ７ＩＱ＋Ｏ：ｊ １＋−１−ｕ＋ｗ　− ｔＡ＜４４ｔ３ １、Ｉｌ、１ｃＬ＋　り　細い ＞ａｌ　ψ　−〇さ ト　ψ　＜　Ｕ　ψ ご：　五　呂　竺　巳 Ｑｔｊ−Ｅ−１山 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ａ：３　＜ｏロ　、Ｌ、　−洲　コ ＞　ニ　−Φ む５　’ｅ３に−Ｊ　Ｉ−１゜− ｔ７１１：ロ　コ　− 巨ｓ　Ｅ＃　（＜　Ｊ　。o'1a-;- 1-J: P4dl ＜＜1−IOψ klaoli:IQ aI≦ntQ- of ? 1-4-〇i 1, In1eL + mouth Φ ω --J:%DJ: φpe0to $i1. I Riko-1 and Φ at mh Ii-I cut --- Engraving (no changes to the content) 0ri OI: υ−〇− <s Ill:1-14>) 11+1 LILI ua hs tp> <σ+v CJ = ue O mouth feet! ;! ” 2 Shiba Go 8 1= Meibara Ni 3 Harumasa Yo 33 fortune telling 0-0 し　u＞u′N　(!1ri page g foot 8 80ゞゞゞmu3　8z Jipu 8! 8 “Waraban S Houdai (Qbe Bebe Cbe (5 (5 Q small 0, CJQ, (!l Kope spout <':s (shun to JC (-υΦ) E-4E4 -ψ U Pe Roro -ψ Ritamero O co U co Pe thin Pe 0 8G″ Gojishi 3 foot G 8 and Engraving (no changes to the content) −−B; φ　ko Φ g1+″1->- ψ E4 t3 J t5 −1>Good phrase (II　Prize　3　= ＞　ψ 1-+1Ijt7IQ+O:j 1+-1-u+w- tA<44t3 1, Il, 1cL+ thin ＞al　ψ　−〇sa t　ψ　＜　U　ψ Thank you: Goro Jiku Mi Qtj-E-1 mountain Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) a:3　<oro　, L, -su　ko ＞　d　−Φ Mu5'e3-J I-1゜- t711: Roco- Giant s E # (< J.

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ＥＮ　Ｃ２Ｌｌ　＋、２　＆−Ｉ　Ｃ１ａ−Ｐ−ＩＮ＠ｌ　Ｊ：　ｊ 浄書（内容に変更なし） モζ　？α　１汐　足α　淀工“　ミ＝を１闘　託Ｚ　關　Ｕ　訂 ＥＮ　Ｈお＝韮　５曇　吋　市 妊３　目Ｂ　■Ｃ目ｊ　鼎　■ Ｆお　ｊｊＨ，５，日Ｓ■　罪 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ＠−ト細　（ｋ　（ｊ −Φ Ｈψ　盆　とエ　乏 Ｑｌ−レ ６　。　旺ＬｎＥａＥ ０１１１口 ２４．　ｔｉ　し案で 細論 、。　妊３　ＷＢ　ｆｌ ｌＩＩΦ ’ｎ　Ｑ＋　ｐＳ４（！ｌコ　Ｏ 〉　＜　モ≧　む５　ご ：Ｉか 、イ　目Ｅ　ｊ３　Ｅ コ０プ ａΦΦ −−足ｆ、″　む：Ａ　８ 浄書（内容に変更なし） ご　淀エ　知粥＠　乏；　ゴ３ Φ　ＬＪＷ　（Ｊ−リーい　０− −　トー　リペ　（ＪＬＩ　ｕベ ヨ　ご冒　：！＝　ミ号　淀よ＝ ・四″　七５　己宙　ゴ＝と８ 母　おＦ　Ｍｊ　吋　ヨ３ ぎ　話　拍　市：ａ！ ご　淀！ｉｉ　むｇ　藁ｆ　淀シ８ 浄１１（内容に変更なし） −−哨　−−０α　η ＞ｏＪ＞　Φ　ΦｃｏｔｌＩ＞ ｐｃＱ＋、２　ψ　工　べ　− 呻　Φ　Φ　ＱＩＱＩＩ：ｌｌ’ＩＱ＋ＩＪＩ−ＩＪ：Ｊ：　−ψ　−ω　切 ？　ｃＬＩＱ、　ｌＳ＜　Ｌｌ　（ Φ　−０コ　φ　Ｉ：ａ＋　−ロ ぶ　＞ｒ＋　ｐ−ｔ　−φ　−Φ− ｈＥ＠ｃ　エ　ベ　Ｈり一 コ　ψ　ｌ＋ＩＩＩ′Ｎ−切　ロ　− ＠Ｉ　＞　−ず　唖　−ψ　Φ −−べ　＞０：（ψ −り　プ　−ロ　−ロ　− ＞　Φ　−Φ１　ｇ　−５ ？＋、２Ｌ）　φ　トーー 浄書（内容に変更なし） ミミ　■　井　？１　淀ヨ：　８二 ｈｈ　ｈｗ　＜ｔｓ　＜’ｒ、　ｔｐｔ、＋　ＬｌべｅＱＩｔｔ’ｔｕｗ　ｃａ ｔ　（Ｊｌｌｌ　ｅｓ　ｈｏｕ’＋討″　ミｓ　＜ｓ　ｇｓ　＜ｓ　踵０ ＣＪＩＩＩ　（ＪＩＩＩＯＣＪ＞　＜ｕ　ｏｐ　ｕｃ肛起　己童０　冊　と工　 扛３　ご芝 す蕊′−ト３　慕ミ　ａａ　ワ側　ジジ贅Ｓ浄書（内容に変更なし） Ｑ＋Ｉｌ’ｌ　Φ　：Ｉ　ＩＩＩ　＝ｓ　ｏｔｎ−一　Ｆ−Ｉ　Ｆ−１１−４Ｆ −１＋、＋ｃｒｔｈ　ＨＢ　ぺ　Ｕ　山 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ピ　？雪ま　足升　為　プ　い −−細 ＜　ＩＪ＞　Ｌｌ（Ｌｌ　（ｊ　べ ａ’ｔ　ｏｌｌｌ＜ｙｏ　ｌ１ｌｌ’ｌＯゴ〉　２！′　淀七　＠１″−８ 切−じ Ｉａｌｌ’１（Ｊｌ−＋（Ｊｋ　ｋ＞ＩＩど　足ｆ　盆　＞ｓ＞ ＆４０− ｂ　ｏｌｌｌ　ｕｍｔｎ　クロ　−　りＮ　Ｌｌ−〇−〇　＞−−− ｈ　＜＜　ｕ＜ｓ　Ｌｌ　＜　Ｌ） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 話　３訃２１　目Ｅ　Ｅ５　ｕＥ 践ぎ　；Ｂ　ｇＦ　Ｕ、ｉ　蛙￥　慕ａ■　ヨ任　１．ｊ　ｐｐ莫Ｊ　詩 打　ＩＦ　５Ｂ　！ｊと　９ヨ　９左　、ま浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ε　：ｉ月　ごｌ　ごピ　ｇ；ま　足片Ｑｔ　ｔ！ＩＬＩ　ぺ−０べ　Ｌｌ＞　 Ｌｌべ５：ヨ３　ジ５　打　凹３　這貯 左　韮　Ｈａ　Ｅルま韮　踪 ！　ヨ弓　葺左　妊３ｇり：妊ｄ ！５＝　８シ　乏：　ミミ　８ピ　８二８ＬＩ　ＬＩＬＩ　ｔｐｏ　ｈｈ　べべ 　Ｃぺ一浄書（内容に変更なし） ｙ＝左　５　占　Ｉ　ｔミ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ′　むε＝　七二　む巳 Φ ｔｏ　ＣＪＱＩ　Ｏべ　ＣＪＱＩ ＣＪ１．＋！−＋ＩａＯＣＪ（Ｉ Ｓ＝　淀！　？ごｎ　Ｈｇ Ｃ′　淀：　８　ブ５ ■ ＜　ｒｓｕ　＜ＨＣＪＬＩ −８）　１！４　は か ぺ　Ｌ５＞　＜１−Ｉ　ｈｈ 浄１（内容に変更なし） 吋　ヨ３ま　討　睡ぎ　エル 浄書（内容に変更なし） Ｏｎ＋ａｏ　：Ｉ　Ｇｋｕ’ｌ：ｌＧ １４ＰＩＦ−１１，＋　ｐ−４＋−１＞小　−−！＋（ＩＬＬＩ（５←　ｏｐ ｌ、ＩＩＩ＋ロ　１１１　細　φ　−−ロ　細Ｗ　：ｈＭ　ぶ　φ　−ｆ　ぷ− 飄 ψ　ＬＩＡＩ　り　−　ト　ト一　− １：ＣＩ：１１′ＩＦＩＩＩＩｇＩ飄−哨一　切　−啼　帽　−−−１ａ〜 Ｕ＜Ｕ＞　ペ　ベ　ｔＳ　＞Ｓ −＋　ａＩ−〇　ｍｔｌ’ｌ　Ｑｌ　＞　０５　＝　ζ　と　３１　＝　四　と クロ　−　Ｑｌ　か　Ｇ＞ロ　Φ　ら Φ−Φ　１．Ｉ　−切　−Φ　淵　切 −切　−ベ　ペ　ＯＱ４　べ ｅａｔｎｏΦａｌｏ＠ｔｎ。EN C2Ll +, 2 &-I C1a-P-IN@l J: j Engraving (no changes to the content) Moζ? α 1st leg α Yodoko “Mi = 1 battle entrusted Z 關〜U　revised EN　H　=韮　5cloud》市 Pregnancy 3rd B　■Cth　　■ F o j j H, 5, day S■ sin Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) @- Thin (k (j −Φ Hψ Obon and E Hushi Ql-re 6.　 WantLnEaE 0111 units 24. ti plan thorough discussion ,. Pregnancy 3 WB fl lIIΦ 'n Q+ pS4(!lko O 〉　＜　Mo≧　Mu5　go :I? , 　　　E　j3　E cop0pu aΦΦ --Foot f, ″　　　:A　8 Engraving (no changes to the content) Go yodo e chi porridge @ poor; Go 3 Φ LJW (J-Lee 0- - To Lipe (JLI ube) Yo blasphemy:! = Mi-go Yodo = ・4″75 Self-space Go=to8 Mother O F Mj 2 Yo3 Gi story beat city: a! Good luck! ii Mug Straw f Yodoshi 8 Jyo 11 (no change in content) −−Sentai　−−0α　η ＞oJ＞　Φ　ΦcotlI＞ pcQ+, 2　ψ　work　- Moan Φ Φ QIQII:ll’IQ+IJI-IJ:J: −ψ −ω cut ? cLIQ, lS<Ll ( Φ -0ko φI:a+ -ro bu　r＋　pt　−φ　−Φ− hE@c Ebe H Riichi ko ψ l + III'N-cut ro- @I　　　-zu　　-ψ　Φ −−be>0: (ψ −ripp　−ro−ro− ＞　Φ　−Φ1　g−5 ? +, 2L) φ Toh Engraving (no changes to the content) Mimi　■　I　? 1 Yodoyo: 82 hh hw <ts <’r, tpt, + LlbeeQItt’tuw ca t (Jlll es hou’+ ”mis　s　gs　　s　heel 0 CJIII (JIIIOCJ) <u op uc anus original child 0 books and engineering Bamboo shoots 3 Susaku'-to 3 Mi AA Wa side Jiji Luxury S engraving (no changes to the content) Q+Il’l Φ: I III = s otn-1 F-I F-11-4F -1+, +crth HB Pe U Mountain Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Pi? It's snowing. --Thin <　IJ　Ll　Ll　(j　be a’t ollll<yo l1ll’lOgo> 2! ′ Yodoshichi @1″-8 Kiriji Iall'1(Jl-+(Jk k>II foot f tray>s> &40- b oll umtn black - ri N Ll -〇-〇>--- h<<u<s Ll<L) Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Story 3rd Death 21st E E5 uE Practice; B gF U, i Frog ￥ Moa■ Yoin 1. j pp Mo J Poetry Hit IF 5B! J and 9 yo 9 left, Majosho (no changes in content) Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) ε: i month, please, g; ma, leg piece Qt, t! ILI Pe-0be Ll> Llbe 5: Yo 3 Ji 5 stroke Concave 3 Kyoto Left Dwarf Ha E Luma Dwarf Disappearance !　Yo Bow　Fukisa　Pregnancy 3g: Pregnancy d ! 5 = 8shi poor: Mimi 8pi 828LI LILI tpo hh bebe C-pei copy (no changes to the content) y = left 5 fortune I t mi Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) ′　Muε＝　72　Mumi Φ to CJQI Obe CJQI CJ1. +! −+IaOCJ(I S = Yodo! ? Go n Hg C' Yodo: 8 bu 5 ■ ＜　rsu　＜HCJLI -8) 1!4 is mosquito Pe L5> <1-I hh Jyo 1 (no change in content) 吋　Y3　　　　　sleep　Elle Engraving (no changes to the content) On+ao:I Gku’l:lG 14PIF-11,+p-4+-1>small--! +(ILLI(5←op l, III + B 111 Thin φ--B Thin W:hM Bu φ-f Pu- air ψ LIAI - Totoichi - 1: CI: 11'IFIIIgI - Shoichi cut - Hat --- 1a ~ U<U>pebetS>S -+ aI-〇mtl’l　Ql　　　05　=　ζ　and 31　=　4　and Kuro-Ql or G>RoΦ et al. Φ−Φ　1. I - Cut - Φ Fuchi Cut -cut -bepe OQ4be eatnoΦalo@tn.

−Ｐ−ＩＮ　ｌ−Ｉ　Ｐ−Ｉ　Ｊ：　ｋ　−ロ　−ｔ５１−ＩＬ　ＨＩＬＧｌｍ ｌ−１−へ浄書（内容に変更なし） ま己　ジ側　属ξ　ヨ３　昌ｔ ヨｙ釦　睦　ｕ３　臣コ ■　瑚コ＝■　訂　ａ昌 話　９左　１左　本　ｉト 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 配列番号：３５ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１８ （Ｂ）配列の型；核酸 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡ　ＡＣＴＡＣＴＣＡ配列番号＝３６ 配列番号列３６徴 （Ａ）配列の長さ＝２４ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＧＴＧＴＴＣＣＣＡＧ　ＡＧＧＧＡＧＣＣＡＴ　ＴＧＣＣ配列番号：３７ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝２１ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｌ）配列 ＧＧＴＧＡＡＣＡＧＴ　ＣＡＡＣＡＧＧＧＡＧ　Ａ配列番号＝３８ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝２１ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー：不明 浄書（内容に変更なし） （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＡＣＡＡＧＣＡＴＴＡ　ＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴ　Ａ配列番号＝３９ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１８ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トボロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＴＣＡＧＧＡ配列番号：４０ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝２０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＧＴＣＡＣＴＴＴＣＴ　ＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡ配列番号＝４１ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２１ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＡＧＧＡＧＣＣＡＴＴ　ＧＴＣＣＡＧＡＴＡＡ　Ａ配列番号：４２ （ｉ）配列の特徴 浄書（内容に変更なし） （Ａ）配列の長さ：２２ ＣＢ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｔ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧ　ＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡ　ＴＣ配列番号：４３ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝２１ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＡＴＣＴＣＡＧＴＧＣＴＴＧＴＧＡＴＡＡＴ　Ａ配列番号：４４ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ二２４ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｘｌ）配列 ＡＣＣＣＡＧＣＴＧＧ　ＴＧＧＡＧＣＡＧＡＧ　ＣＣＣＴ配列番号：４５ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２１ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー・不明 （ｉｆ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 浄ＩＦＣ内容に変更なし） ＡＧＡＡＡＧＣＡＡＧ　ＧＡＣＣＡＡＧＴＧＴ　Ｔ配列番号：４６ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２４ （Ｂ）配列の型；核酸 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｊｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＣＡＧＡＡＧＧＴＡＡ　ＣＴＣＡＡＧＣＧＣＡ　ＧＡＣＴ配列番号：４７ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１９ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｎ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＧＣＴＴＡＴＧＡＧＡ　ＡＣＡＣＴＧＣＧＴ配列番号＝４８ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｌ）配列 ＧＣＡＧＣＴＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＣＡＡＴ配列番号＝４９ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２０ （Ｂ）配列の型：核酸 浄書（内容に変更なし） （Ｄ）トポロジー二不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＡＧＡＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＡＡ配列番号＝５０ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・２】 （Ｂ）配列の型コ核酸 （Ｄ）トポロジー　不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｌ）配列 ＣＡＴＣＴＣＣＡＴＧ　ＧＡＣＴＣＡＴＡＴＧ　Ａ配列番号：５１ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１９ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー、不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＧＡＣＴＡＴＡＣＴＡ　ＡＣＡＧＣＡＴＧＴ配列番号：５２ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１８ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｆ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｌ）配列 ＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡ　ＴＧＡＣＡＡＧＧ配列番号＝５３ 浄書（内容に変更なし） （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２６ （Ｂ）配列の型二核酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｔ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＡＡＴＡＧＧＴＣＧＡ　ＧＡＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＴＧＧＡ配列番号：５４ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２９ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー二不明 （■）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｌ）配列 ＣＴＴＧＴＣＡＣＴＧ　ＧＡＴＴＴＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧ配列番号：５ ５ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｔ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＧＴＡＣＡＣＧＧＣＡ　ＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴ　ＴＣＴＧＧＡＴＡＴＴ配列番号 ：５６ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３０ ＣＢ）配列の型；核酸 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｉｔ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ浄書（内容に変更なし） （ｘｉ）配列 ＡＡＧＡＧＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＣＡＴＴＣＴＴＧＡＡＣ配列番号：５ ７ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝３０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー・不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＡＣＧＡＧ　ＣＡＡＧＧＣＧＴＣＧ配列番号− ５８ （Ａ）配列の長さ：３０ ＣＢ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロン−二不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＡＡＡＡＴＧＡＡＡＧ　ＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡ　ＴＡＴＴＣＣＴＧＡＧ配列番号 ：５９ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・３０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｌ）配列 ＣＴＧＡＧＧＣＣＡＣＡＴＡＴＧＡＧＡＧＴ　ＧＧＡＴＴＴＧＴＣＡ配列番号、 ６０ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３０ 浄書（内容に変更なし） （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）　トポロジー、不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ、ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＣＡＧＡＧＡＡＡＣＡ　ＡＡＧＧＡＡＡＣＴＴ　ＣＣＣＴＧＧＴＣＧＡ配列番号 ＝６１ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　３０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｉｉ）配列の種＊：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＧＧＧＴＧＣＧＧＣＡ　ＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧ　ＧＧＣＴＧＣＣＣＡＡ配列番号 二６２ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー、不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡＡＴＡＡＡＴＧＡＡＡ　ＧＴＧＴ ＧＣＣＡＡＧ　ＴＣＧＣＴＴＣＴＣＡ配列番号＝６３ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー二不明 （１ｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡＡＡＣＧＴＴＣＣＧＡ　ＴＡＧＡ ＴＧＡＴＴＣＡＧＧＧＡＴＧＣＣＣ浄書（内容に変更なし） 配列番号・６４ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ、３０ （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｄ）トポロジー・不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｌ）配列 ＣＡＴＴＡＴＡＡＡＴ　ＧＡＡＡＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＴＣＧＣＴＴ配列番号＝ ６５ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝３０ （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｄ）トポロジー　不明 （■）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＣＴＴＡＴＴＣＡＧＡ　ＡＡＧＣＡＧＡＡＡＴ　ＡＡＴＣＡＡＴＧＡＧ配列番号 ＝６６ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝３０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー　不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｌ）配列 ＴＣＣＡＣＡＧＡＧＡ　ＡＧＧＧＡＧＡＴＣＴ　ＴＴＣＣＴＣＴＧＡＧ配列番号 ＝６７ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー二不明 浄書（内容に変更なし） （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＧＡＴＡＣＴＧＡＣＡ　ＡＡＧＧＡＧＡＡＧＴ　ＣＴＣＡＧＡＴＧＧＣ配列番号 ：６８ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ、３０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｎ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＧＴＧＡＣＴＧＡＴＡ　ＡＧＧＧＡＧＡＴＧＴ　ＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧ配列番号 ＝６９ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー、不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＧＡＴＡＴＡＡＡＣＡ　ＡＡＧＧＡＧＡＧＡＴ　ＣＴＣＴＧＡＴＧＧＡ配列番号 ニア０ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＣＡＴＧＡＴＡＡＴＣＴＴＴＡＴＣＧＡＣＧ　ＴＧＴＴＡＴＧＧＧＡ配列番号ニ ア１ （ｉ）配列の特徴 浄書（内容に変更なし） （Ａ）配列の長さ＝３０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トボロジー：不明 （Ｕ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｊｃ　ＤＮＡ配列番号ニア２ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３０ （Ｂ）配列の型；核酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧ　ＧＡＡＴＧＣＣＡＡＡ　ＧＧＡＡＣＧＡＴＴＴ配列番号 ニア３ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・３０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｘｉ）配列 ＣＡＡＧＡＡＡＣＧＧ　ＡＧＡＴＧＣＡＣＡＡ　ＧＡＡＧＣＧＡＴＴＣ配列番号 ニア４ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー・不明 （■）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 浄書（内容に変更なし） ＡＣＣＧＡＣＡＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＧ　ＧＧＣＣＴＣＣＡＧＣ配列番号ニ ア５ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝３０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トポロジー・不明 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＣＣＣＴＡＧＣＡＧＧ　ＡＴＣＴＣＡＴＡＧＡ　ＧＧＡＴＧＧＴＧＧＣ配列番号 ＝７６ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トボロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類二Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＣＣＣＴＡＧＣＡＡＧ　ＡＴＣＴＣＡＴＡＧＡ　ＧＧＡＴＧＧＴＧＧＣ配列番号 ＝７７ （ｉ）配列の特徴 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｄ）トボロジー：不明 （ｎ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴ　ＧＡＴＧＧＣＴＣＡＡ　ＡＣＡＣＡＧＣＧＡＣ配列番号 ニア８ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・３０ （Ｂ）配列の型：核酸 浄書（内容に変更なし） （Ｄ）トポロジー・不明 （ｉｉ）配列の種類＋Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｉ）配列 ＣＴＣＧＧＧＴＧＧＧ　ＡＡＣＡＣＣＴＴＧＴ　ＴＣＡＧＧＴＣＣＴＣ配列番号 ニア９ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３０ （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｄ）トボロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類＋Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｘｌ）配列 ＣＴＣＧＧＧＴＧＧＧ　ＡＡＣＡＣＧＴＴＴＴ　ＴＣＡＧＧＴＣＣＴＣ工　−１ ｃ５　０−Ｇ　工　≧　ω　のΣ　７　く　ｄ　Σ　工　Σ　Σ　田 工　」Ｏａ：　≧　ω　つ　の Σ　′　Σ　工　Σ　Σ　Σ　田 浄書（内容に変更なし） −Ｔ々、４Ａ 浄書（内容に変更なし） ＝ｒ〜、　４１１ ＦＩＧｔＦＲｌ：５ 手続補正書坊幻 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０７２８９ 平成　５年特許願第５０５３０１号 ２、発明の名称 Ｔ細胞リセプターに基づいた慢性間接リウマチの治療法３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名　称　ザ・ウィスター・インスティチュート　（り）１１ａ）４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　平成　６年１１月２９日　（８日）６、補正の対象 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０２ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　９１６１−４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｙ　８３１０− ２Ｊ３３１５６４　Ｂ　９０１５−２Ｊ （７２）発明者　ウィリアムス、ウィリアム・ヴイアメリカ合衆国ペンシルバニ ア州１９０８３゜ハーバ−タウン、サイカモア・ロード　２５（７２）発明者　 ウェイナー、デーピッド・ビーアメリカ合衆国ペンシルバニア州１９０６６゜メ リオン、ビーコン・レーン　７１７-P-IN l-I P-I J: k -ro -t51-IL HILGlm Engraving to l-1- (no change in content) Maki Ji side Gen ξ Yo 3 Chang t Yoy button Mutsu u3 Omiko ■ Goko = ■ Edited by a-sho Story 9 left 1 left Book it Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Sequence number: 35 (i) Features of array (A) Array length: 18 (B) Sequence type; nucleic acid (D) Topology 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Type of sequence: Genomic DNA (xi) sequence GTCACTTTCT AGCCTGCTGA sequence number = 41 (i) Features of array (A) Array length: 21 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology: unknown (ii) Type of sequence: Genomic DNA (xi) sequence AGGAGCCATT GTCCAGATAA A Sequence number: 42 (i) Features of array Engraving (no changes to the content) (A) Array length: 22 CB) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology: unknown (it) Type of sequence: Genomic DNA (xi) sequence GGAGAGAATG TGGAGCAGCA TC sequence number: 43 (i) Features of array (A) Array length = 21 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology: unknown (ii) Type of sequence: Genomic DNA (xi) sequence ATCTCAGTGCTTGTGATAAT A Sequence number: 44 (i) Features of array (A) Array length 224 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology unknown (xl) array ACCCAGCTGG TGGAGCAGAG CCCT Sequence number: 45 (i) Features of array (A) Array length: 21 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology/Unknown (if) Type of sequence: Genomic DNA (xi) sequence (No change in IFC contents) AGAAAGCAAG GACCAAGTGT T Sequence number: 46 (i) Features of array (A) Array length: 24 (B) Sequence type; nucleic acid (D) Topology unknown (i) Type of sequence: Genomjc DNA (xi) sequence CAGAAGGTAA CTCAAGCGCA GACT Sequence number: 47 (i) Features of array (A) Sequence length: 19 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology unknown (n) Type of sequence: Genomic DNA (xi) sequence GCTTATGAGA ACACTGCGT sequence number = 48 (i) Features of array (A) Array length: 20 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology: unknown (ii) Type of sequence: Genomic DNA (xl) sequence GCAGCTTCCCCTTCCAGCAAT Sequence number = 49 (i) Features of array (A) Array length: 20 (B) Sequence type: Nucleic acid Engraving (no changes to the content) (D) Topology unknown (ii) Type of sequence: Genomic DNA (xi) sequence AGAACCTGACTGCCCAGGAA sequence number = 50 (i) Features of array (A) Array length 2] (B) Sequence type conucleic acid (D) Topology unknown (ii) Type of sequence: Genomic DNA (xl) 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sequence: Genomic, DNA (xi) sequence CAGAGAAACA AAGGAAAACTT CCCTGGTCGA sequence number =61 (i) Features of array (A) Array length 30 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology unknown (ii) Seed of sequence *: Genomic DNA (xi) sequence GGGTGCGGCA GATGACTCAG GGCTGCCCAA sequence number 262 (i) Features of array (A) Array length: 30 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology, unknown (ii) Sequence type: Genomic DNAATAAATGAAA GTGT GCCAAG TCGCTTCTCA sequence number = 63 (i) Features of array (A) Array length: 30 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology unknown (1i) Sequence type: Genomic DNAAAACGTTCCGA TAGA TGATTCAGGGATGCCC engraving (no changes in content) Sequence number 64 (i) Features of array (A) Sequence length, 30 (B) Sequence type/nucleic acid (D) Topology/Unknown (ii) Type of sequence: Genomic DNA (xl) sequence CATTATAAAAT GAAACAGTTCCAAATCGCTT sequence number = 65 (i) Features of array (A) Array length = 30 (B) Sequence type, nucleic acid (D) Topology unknown (■) Sequence type: Genomic DNA (xi) sequence CTTATTCAGA AAGCAGAAAT AATCAATGAG sequence number =66 (i) Features of array (A) Array length = 30 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology unknown (ii) Type of sequence: Genomic DNA (xl) sequence TCCACAGAGA AGGGAGATCT TTCCTCTGAG sequence number =67 (i) Features of array (A) Array length: 30 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology unknown Engraving (no changes to the content) (ii) Type of sequence: Genomic DNA (xi) sequence GATACTGACA AAGGAGAAGT CTCAGATGGC sequence number :68 (i) Features of array (A) Sequence length, 30 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology unknown (n) Type of sequence: Genomic DNA (xi) sequence GTGACTGATA AGGGAGATGT TCCTGAAGGG sequence number =69 (i) Features of array (A) Array length: 30 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology, unknown (ii) Type of sequence: Genomic DNA (xi) sequence GATATAAACA AAGGAGAGAT CTCTGATGGA sequence number Near 0 (i) Features of array (A) Array length: 30 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology: unknown (ii) Type of sequence: Genomic DNA (xi) sequence CATGATAATCTTTATCGACG TGTTATGGGA sequence number d A1 (i) Features of array Engraving (no changes to the content) (A) Array length = 30 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Tobology: unknown (U) Sequence type: Genomjc DNA sequence number near 2 (i) Features of array (A) Array length: 30 (B) Sequence type; nucleic acid (D) Topology: unknown (ii) Type of sequence: Genomic DNA (xi) sequence GATGAGTCAG GAATGCCAA GGAACGATTT sequence number Near 3 (i) Features of array (A) Array length: 30 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology unknown (xi) Array CAAGAAACGGAGATGCACAAGAAGCGATTC sequence number Near 4 (i) Features of array (A) Array length: 30 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology/Unknown (■) Sequence type: Genomic DNA (xi) sequence Engraving (no changes to the content) ACCGACAGGCTGCAGGCAGG GGCCTCCAGC sequence number d A5 (i) Features of array (A) Array length = 30 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Topology/Unknown (ii) Type of sequence: Genomic DNA (xi) sequence CCCTAGCAGG ATCTCATAGAGGGATGGTGGC sequence number =76 (i) Features of array (A) Array length: 30 (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Tobology: unknown (ii) Sequence type 2 Genomic DNA (xi) sequence CCCTAGCAAG ATCTCATAGA GGATGGTGGC sequence number =77 (i) Features of array (B) Sequence type: Nucleic acid (D) Tobology: unknown (n) Type of sequence: Genomic DNA (xi) sequence CTCTGCTTCT GATGGCTCAA ACACAGCGAC sequence number Near 8 (i) Features of array (A) Array length: 30 (B) Sequence type: Nucleic acid Engraving (no changes to the content) (D) Topology/Unknown (ii) Sequence type + Genomic DNA (xi) sequence CTCGGGTGGG AACACCTTGT TCAGGTCCTC sequence number Near 9 (i) Features of array (A) Array length: 30 (B) Sequence type Nucleic acid (D) Tobology: unknown (ii) Type of sequence + Genomic DNA (xl) sequence CTCGGGTGGG　AACACGTTTT　TCAGGTCCTC　-1 c5 0-G Work ≧ ω of Σ 7 Ku d Σ Work Σ Σ Field 　　Oa：　≧　ω　　　 Σ　′　Σ　工　Σ　Σ　Σ　田 Engraving (no changes to the content) -Ts, 4A Engraving (no changes to the content) =r~, 411 FIGtFRl:5 Procedural amendment book phantom 1.Display of the incident PCT/US 92107289 1993 Patent Application No. 505301 2. Name of the invention Treatment method for chronic rheumatoid arthritis based on T cell receptors 3, corrector Relationship to the case: Patent applicant address Name: The Wistar Institute (ri) 11a) 4, Agent Address: Shin-Otemachi Building, 206-ku, 2-2-1 Otemachi, Chiyoda-ku, Tokyo 5. Date of amendment order: November 29, 1994 (8th) 6. Subject of amendment Continuation of front page (51) Int, C1,' Identification symbol Internal office reference number Cl2N 15102 C12P 21108 9161-4BGOIN 33153 Y 8310- 2J331564 B 9015-2J (72) Inventor Williams, William Vui United States of America Pennsylvania 25 (72) Sycamore Road, Harbortown, CA 19083 Inventor Weiner, David Bee 19066, Pennsylvania, USA 717 Beacon Lane, Lyon

Claims (18)

【特許請求の範囲】[Claims] １．哺乳動物から滑膜のサンプルを得て；上記サンプル中のＴ細胞リセプター可 変領域を同定し；そして少なくともひとつの上記Ｔ細胞リセプター可変領域また はそれらの抗原性断片に対する抗体を有効量、上記哺乳動物に投与する工程から なる、哺乳動物の慢性関節リウマチの治療方法。1. Obtain a sample of synovial membrane from a mammal; identifying the variable region; and at least one of the T cell receptor variable regions or from the step of administering to the mammal an effective amount of antibodies against those antigenic fragments. A method for treating rheumatoid arthritis in mammals. ２．上記哺乳動物がヒトである、請求項１記載の方法。2. 2. The method of claim 1, wherein said mammal is a human. ３．上記滑膜のサンプルが滑膜組織または滑膜液である、請求項１記載の方法。3. 2. The method of claim 1, wherein the synovial sample is synovial tissue or fluid. ４．Ｖα１７、Ｖα１、Ｖβ１２、Ｖβ１４、Ｖβ１７およびＶβ７およびそれ らの抗原性断片からなる辞から選択される哺乳動物Ｔ細胞可変領域に対する抗体 を有効量、上記哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物の慢性関節リウマチ の治療方法。4. Vα17, Vα1, Vβ12, Vβ14, Vβ17 and Vβ7 and An antibody against a mammalian T cell variable region selected from the antigenic fragments of Rheumatoid arthritis in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of treatment method. ５．上記抗体が、表１のアミノ酸を有するひとつまたはそれ以上のペプチドの少 なくとも一部分に特異的である、請求項４記載の方法。5. The above antibodies contain a small amount of one or more peptides having the amino acids listed in Table 1. 5. The method of claim 4, wherein the method is at least partially specific. ６．上記哺乳動物がヒトである、請求項４記載の方法。6. 5. The method of claim 4, wherein said mammal is a human. ７．Ｖα１７、Ｖα１、Ｖβ１２、Ｖβ１４、Ｖβ１７およびＶβ７およびそれ らの抗原性断片からなる群から選択される哺乳動物Ｔ細胞可変領域を上記哺乳動 物に投与することからなる、慢性関節リウマチの発症を予防するために哺乳動物 を免疫化する方法。7. Vα17, Vα1, Vβ12, Vβ14, Vβ17 and Vβ7 and A mammalian T cell variable region selected from the group consisting of antigenic fragments of to prevent the development of rheumatoid arthritis in mammals. How to immunize. ８．上記哺乳動物がヒトであり、かつ、哺乳動物Ｔ細胞可変領域がヒトＴ細胞可 変領域である、請求項７記載の方法。8. The above mammal is a human, and the mammalian T cell variable region is human T cell variable region. 8. The method according to claim 7, wherein the method is a variable region. ９．上記哺乳動物がヒトであり、かつ、哺乳動物Ｔ細胞可変領域が表１のアミノ 酸配列の一つの少なくとも一部分からなる、請求項７記載の方法。9. The above mammal is a human, and the mammalian T cell variable region is an amino acid shown in Table 1. 8. The method of claim 7, comprising at least a portion of one of the acid sequences. １０．Ｖα１７、Ｖα１、Ｖβ１２、Ｖβ１４、Ｖβ１７およびＶβ７およびそ れらの抗原性断片からなる群から選択される哺乳動物Ｔ細胞可変領域を上記哺乳 動物に投与することからなる、慢性関節リウマチを治療するために哺乳動物を免 疫化する方法。10. Vα17, Vα1, Vβ12, Vβ14, Vβ17 and Vβ7 and their A mammalian T cell variable region selected from the group consisting of antigenic fragments of immunization of mammals to treat rheumatoid arthritis by administering to animals. How to become an epidemic. １１．上記哺乳動物がヒトであり、かつ、哺乳動物Ｔ細胞可変領域がヒトＴ細胞 可変領域である、請求項１０記載の方法。11. the mammal is a human, and the mammalian T cell variable region is a human T cell 11. The method of claim 10, wherein the variable region is a variable region. １２．上記哺乳動物がヒトであり、かつ、哺乳動物Ｔ細胞可変領域が表１のアミ ノ酸配列の一つの少なくとも一部分からなる、請求項１０記載の方法。12. The above mammal is a human, and the mammalian T cell variable region is an amino acid shown in Table 1. 11. The method of claim 10, wherein the method comprises at least a portion of one of the amino acid sequences. １３．Ｖα１７、Ｖα１、Ｖβ１２、Ｖβ１４、Ｖβ１７およびＶβ７およびそ れらの抗原性断片からなる群から選択される哺乳動物Ｔ細胞可変領域を含む、キ ット。13. Vα17, Vα1, Vβ12, Vβ14, Vβ17 and Vβ7 and their a mammalian T cell variable region selected from the group consisting of antigenic fragments thereof. t. １４．上記哺乳動物がヒトであり、かつ、哺乳動物Ｔ細胞可変領域がヒトＴ細胞 可変領域である、請求項１３記載のキット。14. the mammal is a human, and the mammalian T cell variable region is a human T cell The kit according to claim 13, which is a variable region. １５．上記哺乳動物がヒトであり、かつ、哺乳動物Ｔ細胞可変領域が表１のアミ ノ酸配列の一つの少なくとも一部分からなる、請求項１４記載のキット。15. The above mammal is a human, and the mammalian T cell variable region is an amino acid shown in Table 1. 15. The kit of claim 14, comprising at least a portion of one of the amino acid sequences. １６．Ｖα１７、Ｖα１、Ｖβ１２、Ｖβ１４、Ｖβ１７およびＶβ７およびそ れらの抗原性断片からなる群から選択される哺乳動物Ｔ細胞可変領域に対する抗 体を食む、キット。16. Vα17, Vα1, Vβ12, Vβ14, Vβ17 and Vβ7 and their an antibody against a mammalian T cell variable region selected from the group consisting of these antigenic fragments; Kit eats the body. １７．上記哺乳動物がヒトであり、かつ、哺乳動物Ｔ細胞可変領域がヒトＴ細胞 可変領域である、請求項１６記載のキット。17. the mammal is a human, and the mammalian T cell variable region is a human T cell The kit according to claim 16, which is a variable region. １８．上記哺乳動物がヒトであり、かつ、哺乳動物Ｔ細胞可変領域が表１のアミ ノ酸配列の一つの少なくとも一部分からなる、請求項１７記載のキット。18. The above mammal is a human, and the mammalian T cell variable region is an amino acid shown in Table 1. 18. The kit of claim 17, comprising at least a portion of one of the amino acid sequences.