JPH07504203A - Method of treating TNF-dependent inflammation using tumor necrosis factor antagonists - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍壊死因子アンタゴニストを用いるＴＮＦ−依存性炎症の治療方法本出願は、 １９８９年９月５日出願の米国特許出願筒４０３．２４１号（放棄された）の一 部継続出願である、１９８９年９月１１日出願の米国特許出願筒４０５．３７０ 号（放棄された）の一部継続出願である、１９８９年１０月１３日出願の米国特 許出願筒４２１，４１７号（放棄された）の一部継続出願である、１９９０年５ 月１０出願の米国特許出願筒５２３，６３５号の一部継続出願である。[Detailed description of the invention] Method of treating TNF-dependent inflammation using tumor necrosis factor antagonists This application provides: No. 403.241 (abandoned), filed September 5, 1989. U.S. Patent Application No. 405.370, filed September 11, 1989, which is a continuation application U.S. patent application filed October 13, 1989, which is a continuation-in-part application of No. May 1990, a partial continuation of patent application No. 421,417 (abandoned) This is a continuation in part of U.S. Patent Application No. 523,635, filed on October 10th.

発明の背景 本発明は概括的にはサイトカインリセプターに関し、より具体的にはＴＮＦ−依 存性炎症性疾患を抑制するために腫瘍壊死因子アンタゴニストを用いる方法に関 する。Background of the invention FIELD OF THE INVENTION This invention relates generally to cytokine receptors, and more specifically to TNF-dependent receptors. Related to the use of tumor necrosis factor antagonists to suppress existing inflammatory diseases do.

腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα、カケクチンの名でも知られている）および腫瘍壊 死因子−β（ＴＮＦＲ，リンホトキシンの名でも知られている）は、多くのタイ プの細胞に種々の効果をひきおこすことができる、哺乳類のホモロガスな内分泌 タンパク質である。これら二種のサイトカインは構造的および機能的な特性が高 度に類似するため、まとめてｒＴＮＦＪと称される。ＴＮＦα（Ｐｅｎｎｉｃａ 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１２ニア２４．１９８４）およびＴＮＦＲ （Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１２ニア２１．１９８４）をコ ードする相補的ｃＤＮＡクローンは単離されており、その結果としてさらに、Ｔ ＮＦの構造的および生物学的な特徴も明らかにされている。Tumor necrosis factor-α (TNFα, also known as cachectin) and tumor necrosis Death factor-β (TNFR, also known as lymphotoxin) is a Homologous endocrine system in mammals that can induce various effects on the cells of the human body. It is a protein. These two cytokines have highly structural and functional properties. Because of their similarities, they are collectively referred to as rTNFJ. TNFα (Pennica et al, , Nature 312 Near 24.1984) and TNFR (Gray et al, Nature 312 Near 21.1984) Complementary cDNA clones encoding T Structural and biological features of NF have also been characterized.

ＴＮＦタンパク質は、ＴＮＦ一応答性細胞の細胞膜上に発現された特異的ＴＮＦ リセプター（ＴＮＦＲ）タンパク質に結合することにより、細胞に対するその生 物学的効果を開始する。ＴＮＦＲには二種類の異なる形の存在；約７５キロダル トンの分子量のタイプＩ　ＴＮＦＲ（ＴＮＦＲ［）　、および約５５キロダルト ンの分子量のタイプ■ＴＮＦＲ（ＴＮＦＲＩＩ）が知られている。ＴＮＦＲｆお よびＴＮＦＲｎは各々ＴＮＦαおよびＴＮＦＲの両方に結合する。ＴＮＦＲＩお よびＴＮＦＲＵは共に分子クローニングされており（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ、 、５ｃｉｅｎｃｅ　２４８＋１０１９．１９９０；　Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ　ｅｔ 　ａｔ、、　Ｃｅ１ｌ　６１：３５１．１９９０および５ｃｈａｌｌ　ｅｔ　ａ ｔ、、@Ｃｅ１ １６１：３５１．１９９０）　、それにより、可溶性のＴＮＦＲタンパク質の組 換え法による発現および精製が可能になっている。TNF protein is a specific TNF protein expressed on the plasma membrane of TNF-responsive cells. Its activation on cells by binding to receptor (TNFR) proteins. Initiate physical effects. TNFR exists in two different forms; about 75 kilodal Type I TNFR (TNFR[) with a molecular weight of tons, and about 55 kilodaltons The molecular weight type of TNFR (TNFRII) is known. TNFRf and TNFRn each bind to both TNFα and TNFR. TNFRI and TNFRU have both been molecularly cloned (Smith et al. , 5science 248+1019.1990; Loetscher et at, Ce1l 61:351.1990 and 5chall et a t,,@Ce1 161:351.1990), thereby reducing the set of soluble TNFR proteins. expression and purification using alternative methods.

ヒト尿からの可溶性のＴＮＦ結合タンパク質も突き止められている（Ｐｅｅｔｒ ｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｈａｅｍａｔｏｌ、　４１：４１４．１ ９８８；　Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、@Ｍｅｄ、　 １６ ７：１５１１．１９８８；　Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６４：１１９６６、１９８９；　Ｓ■モ汲奄獅■■ ｒらの英国特許出願公開Ｎｏ、２２１８１０１＾；　Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ　ｅｔ 　ａｌｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｆｉ、　２６４：１１９７４．１９８ ９）。Soluble TNF-binding proteins from human urine have also been identified (Peetr e et al, Eur, J, Haematol, 41:414.1 988; Seckinger et at, J, Exp, @Med, 16 7:1511.1988; Seckinger et al, J, Bi ol, Chew, 264:11966, 1989; British Patent Application Publication No. 2218101^; Engelmann et al. all, J, Biol, Chelfi, 264:11974.198 9).

ＴＮＦアンタゴニスト、例えば可溶性のＴＮＦＲおよびＴＮＦ結合タンパク質は 、ＴＮＦに結合して、ＴＮＦが細胞膜に結合しているＴＮＦリセブターに結合す ることを阻害する。従って、そのようなタンパク質はＴＮＦにより生じる生物学 的作用を抑制するために有用であろう。TNF antagonists, such as soluble TNFR and TNF binding proteins , binds to TNF, and allows TNF to bind to the TNF receptor, which is bound to the cell membrane. to prevent things from happening. Therefore, such proteins may be involved in the biological It may be useful to suppress the negative effects.

ＴＮＦが介在する炎症性疾患におけるＴＮＦの役割、および前記の可溶性ＴＮＦ ＲおよびＴＮＦ結合タンパク質がＴＮＦ依存性炎症疾患を抑制するｉｎ　ｖｉｖ ｏの生物学的効果は十分に解明されておらず、そしてＴＮＦアンタゴニストの治 療用途の可能性もまだ判明していない。The role of TNF in TNF-mediated inflammatory diseases, and the soluble TNF described above. In vivo, R and TNF-binding proteins suppress TNF-dependent inflammatory diseases The biological effects of The potential for therapeutic use has not yet been determined.

発明の概要 本発明はＴＮＦ依存性の炎症性疾患を抑制するために、ＴＮＦアンタゴニストを 使用する方法を提供する。具体的には、本発明ＴＮＦアンタゴニスト、例えば可 溶性ヒトＴＮＦＲをヒトに投与する工程からなる、関節炎患者の治療方法を提供 する。Summary of the invention The present invention uses TNF antagonists to suppress TNF-dependent inflammatory diseases. Provide methods for use. Specifically, the TNF antagonists of the present invention, e.g. Provides a method for treating arthritis patients comprising the step of administering soluble human TNFR to a human. do.

上記およびその他の本発明の観点を、以下の詳細な説明で明らかにする。These and other aspects of the invention will become apparent in the detailed description below.

図面の簡単な説明 図１は組換えヒトＴＮＦＲ／Ｆｃ融合タンパク質のダイマー構造を示す。ｒｈｕ ＴＮＦＲ／Ｆｃをコードするプラスミドの一次翻訳産物は、ヒトＩｇＧ１から誘 導されたＦｃの単一鎖につながれた可溶性ＴＮＦＲの単一分子である。この融合 分子は、翻訳の後しかし分泌の前に、Ｆｃ領域の３つのシスティン残基によって ダイマー化し、ダイマーのｒｈｕＴＮＦＲ／Ｆｃを形成する。？Ｊｊｆｉのボッ クス部分はＴＮＦＨの構造ドメインを示す。Brief description of the drawing Figure 1 shows the dimeric structure of recombinant human TNFR/Fc fusion protein. rhu The primary translation product of the plasmid encoding TNFR/Fc was derived from human IgG1. A single molecule of soluble TNFR linked to a single chain of guided Fc. This fusion The molecule is isolated by three cysteine residues in the Fc region after translation but before secretion. dimerizes to form dimeric rhuTNFR/Fc. ? Jjfi's box The box part indicates the structural domain of TNFH.

図２はプラスミドｐＣＡＶＤＨＦＲｒｈｕ　ＴＮＦＲ／Ｆｃの構築を示す。略号 は次の通りである：ＡＤＨ２，酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子および 調節領域、ＣＭＶ、　サイトメガロウィルスの即時型初期エンハンサ−（ｉｍｍ ｅｄｉａｔｅｌｙ　ｅａｒｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅｒ）　；　Ｔ　Ｐ　Ｌ、アデノ ウィルス−２のトリパータイト　リーダー　（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ　１ｅａｄ ｅｒ）　；　ＶＡ、アデノウィルス−２のウィルス関連ＲＮＡ遺伝子Ｉおよびｎ 　；ＤＨＦＲ，ハムスターのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子。Figure 2 shows the construction of plasmid pCAVDHFRrhu TNFR/Fc. Abbreviation are: ADH2, yeast alcohol dehydrogenase gene and regulatory region, CMV, cytomegalovirus immediate early enhancer (imm ediately early enhancer); TPL, adeno Virus-2 tripartite leader (tripartite 1ead er) ; VA, virus-associated RNA genes I and n of adenovirus-2 ; DHFR, hamster dihydrofolate reductase gene.

図３および４は、組換えヒトＴＮＦＲ／Ｆｃ、モノマーＴＮＦＲ，組換えマウス ＩＬ−＝ＩＲ，およびＴＮＦＲモノマーとｒｍｕｌＬ−ＩＲの組み合わせを、関 節内投与したときの、ラットの抗原−誘導関節炎に対する効果を示すグラフであ る。データは、ＴＮＦＲ／Ｆｃ１ＴＮＦＲモノマー、ｒｍｕｌＬ−ＩＲ，および ＩＬ−ＩＲと組み合わせたＴＮＦＲは、抗原−誘導関節炎に関連する炎症を抑１ １することを示している。Figures 3 and 4 show recombinant human TNFR/Fc, monomeric TNFR, recombinant mouse IL-=IR, and the combination of TNFR monomer and rmulL-IR, This is a graph showing the effect of intranodal administration on antigen-induced arthritis in rats. Ru. Data represent TNFR/Fc1 TNFR monomer, rmulL-IR, and TNFR in combination with IL-IR suppresses inflammation associated with antigen-induced arthritis. 1.

図５は、ＢＩＯ，Ｒｍマウスでコラーゲンにより誘導した関節炎（ＣＩ　Ａ）の 発症に対する、組換えヒトＴＮＦＲ／ＦｃおよびＰＢＳ　（担体コントロール） の腹腔的投与の効果を示す。ＴＮＦＲ／ＦｃはＣＩＡの開始を有意に遅らせた。Figure 5 shows collagen-induced arthritis (CIA) in BIO, Rm mice. Recombinant human TNFR/Fc and PBS (carrier control) against disease onset The effect of intraperitoneal administration of TNFR/Fc significantly delayed the onset of CIA.

図６は、ＤＢＡ／１マウスでコラーゲンにより誘導した関節炎（ＣＩ　Ａ）の発 症に対する、組換えヒトＴＮＦＲ／ＦｃおよびＰＢＳ　（担体コントロール）の 腹腔的投与の効果を示す。ＴＮＦＲ／ＦｃはＣＩＡの開始を有意に遅らせた。Figure 6 shows the development of collagen-induced arthritis (CIA) in DBA/1 mice. of recombinant human TNFR/Fc and PBS (carrier control) against The effect of intraperitoneal administration is shown. TNFR/Fc significantly delayed the onset of CIA.

図７は、ＴＮＦＲ／Ｆｃをマウスに投与すると、関節炎指数および関節炎の兆候 を示す関節の数が減少したことを示す。Figure 7 shows the arthritic index and signs of arthritis when TNFR/Fc was administered to mice. Indicates that the number of joints has decreased.

本明細書において、ｒＴＮＦリセプター」およびｒＴ　Ｎ　Ｆ　ＲＪは、哺乳類 の天然ＴＮＦリセブターまたはＴＮＦ結合タンパク質のアミノ酸配列と実質的に 類似するアミノ酸配列を有し、そしてＴＮＦ分子と結合することにより、細胞膜 に結合しているＴＮＦＲに対してＴＮＦが結合することを阻害するタンパク質を 意味する。二種の異なるタイプのＴＮＦＲ，即ち、タイプ［ＴＮＦＲ（ＴＮＦＲ Ｉ）およびタイプＩＩ　ＴＮＦＲ（ＴＮＦＲｆｆ）の存在が知られている。完全 長のヒト成熟ＴＮＦＲＩは分子量約７５−８０キロダルトン（ｋＤａ）の糖タン パク質である。完全長のヒト成熟ＴＮＦＲｎは分子量約５５−６０キロダルトン （ｋＤａ）の糖タンパク質である。本発明の好ましいＴＮＦＲは、ＴＮＦＩおよ びＴＮＦＩＩの可溶性型並びに可溶性のＴＮＦ結合性タンパク質である。可溶性 ＴＮＦＲ分子は、例えば、ＴＮＦＲＩ、ＴＮＦＲＩＩまたはＴＮＦ結合結合タン パ色質通の生物活性を少なくともある程度有する、天然タンパク質の少なくとも ２０アミノ酸を有するサブユニットの類縁体を包含する。可溶性ＴＮＦＲ構造物 は、膜貫通領域を欠いている（そして細胞から分泌されている）が、しかしＴＮ Ｆと結合する能力は保持している。種々の生物学的に均等なタンパク質およびア ミノ酸類縁体が、天然ＴＮＦＨの細胞外領域の全てまたは一部に相当するアミノ 酸配列を有しており（例えば、ｈｕＴＮＦＲＩΔ２３５、ｈｕＴＮＦＲＩΔ１８ ５、およびｈｕＴＮＦＲｒΔ１６３、または配列番号１のアミノ酸１−１６３、 アミノ酸１−１８５、またはアミノ酸１−２３５の配列に実質的に類似するアミ ノ酸配列がある）、そしてそれらはＴＮＦリガンドに結合するという点で生物学 的活性を有する。均等な可溶性ＴＮＦＲには、上記配列とは一つまたはそれ以上 の置換、削除または挿入により異なるが、ＴＮＦに結合する能力または細胞表面 に結合したＴＮＦリセブタータンパク質を介するＴＮＦのシグナル伝達活性を阻 害する能力を保持しているポリペプチドが含まれ、例えば、ｈｕＴＮＦＲＩΔＸ （ここで、Ｘは配列番号１のアミノ酸１６３−２３５の任意のものからなるグル ープから選択される）がある。同様の削除はｍｕＴＮＦＲにも施すことができる 。ＴＮＦシグナル伝達活性の阻止の測定は、細胞を組換えＴＮＦＲＤＮＡで形質 転換して、組換えリセブターを発現させて行うことができる。この細胞を続いて ＴＮＦと接触させ、生じる代謝効果を調べる。リガンドの作用に帰することがで きる効果が生じたならば、組換えリセブターはシグナル伝達活性を有すると判断 される。ポリペプチドがシグナル伝達活性を有するか否かを調べる方法の例は、 Ｉｄｚｅｒｄａ　ｅｔ　ａＬ、、　ｊ。As used herein, "rTNF receptor" and rTNF RJ refer to mammalian substantially the amino acid sequence of the natural TNF receptor or TNF binding protein of It has a similar amino acid sequence and binds to the TNF molecule, thereby forming a cell membrane. A protein that inhibits the binding of TNF to TNFR that binds to means. Two different types of TNFR, namely the type [TNFR The existence of type I) and type II TNFR (TNFRff) is known. Perfect Long human mature TNFRI is a sugar protein with a molecular weight of approximately 75-80 kilodaltons (kDa). It's a good quality. Full-length human mature TNFRn has a molecular weight of approximately 55-60 kilodaltons. (kDa) glycoprotein. Preferred TNFRs of the present invention include TNFI and and soluble forms of TNF II, as well as soluble TNF-binding proteins. soluble A TNFR molecule can be, for example, TNFRI, TNFRII or a TNF-binding binding protein. At least one of the naturally occurring proteins that has at least some degree of biological activity Includes analogs of subunits with 20 amino acids. Soluble TNFR construct TN lacks a transmembrane region (and is secreted from the cell), but TN It retains the ability to combine with F. Various biologically equivalent proteins and The amino acid analog corresponds to all or part of the extracellular region of natural TNFH. acid sequence (e.g., huTNFRIΔ235, huTNFRIΔ18 5, and huTNFRrΔ163, or amino acids 1-163 of SEQ ID NO: 1, amino acids 1-185, or amino acids substantially similar in sequence to amino acids 1-235; amino acid sequences), and they have biological significance in that they bind to TNF ligands. It has therapeutic activity. Equivalent soluble TNFRs include one or more of the above sequences. the ability to bind TNF or the cell surface, depending on the substitution, deletion or insertion of Inhibits the signaling activity of TNF through the TNF receptor protein bound to including polypeptides that retain the ability to harm, e.g., huTNFRIΔX (Here, X is a group consisting of any of amino acids 163-235 of SEQ ID NO: 1. (selected from a group). Similar deletions can also be made to muTNFR. . Measurement of inhibition of TNF signaling activity was performed by transfecting cells with recombinant TNFR DNA. This can be done by transforming and expressing recombinant receptors. Continue this cell Contact with TNF and examine the metabolic effects that occur. can be attributed to the action of the ligand. If a positive effect occurs, the recombinant receptor is considered to have signal transduction activity. be done. An example of a method for examining whether a polypeptide has signal transduction activity is Idzerda et aL,, j.

Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１７１：８６１　（＋９９０）；　Ｃｕｒｔｉｓ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　tＳ＾８６： ３０４５　（＋９８９）；　Ｐｒｙｖｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＩ３０　Ｊ、 　５：２１７９　（１９８６）およびＣｈｏｕ　ｅｔ　ａｌ戟A　Ｊ、　Ｂ ｊｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６２：１８４２　（１９８７）に記載されている。別 の方法として、内在的にＴＮＦリセブターを発現し、ＴＮＦに対して検出可能な 生物学的応答を示す、初代細胞もしくは細胞ラインを用いてもよい。Exp, Med, 171:861 (+990); Curtis et al,, Proc, Natl, Acad, Sci, tS^86: 3045 (+989); Pryves et al,, EMI30 J, 5:2179 (1986) and Chou et al. AJ, B Jol, Chew, 262:1842 (1987). another As a method of endogenously expressing a TNF receptor and detectable Primary cells or cell lines that exhibit a biological response may also be used.

本明細書においてＴＮＦＲ類縁体に対して用いる命名法は、タンパク質（例えば ＴＮＦＲ）の命名規約に従つており、ｈｕ（ヒトの場合）またはｍｕ（マウスの 場合）が先に置かれ、そしてΔ（削除を意味するため）およびＣ−末端アミノ酸 の番号が後に置かれている。例えば、ｈｕＴＮＦＲΔ２３５はＣ−末端アミノ酸 としてＡｓｐ２３ｓを有するヒトＴＮＦＲ（即ち、配列番号１のアミノ酸１−２ ３５の配列を有するポリペプチド）を意味する。ヒトまたはマウスの指定がない 場合のＴＮＦＲは、一般的に哺乳類ＴＮＦＲを意味する。同様に、削除変異の指 定がないときは、ＴＮＦＨの用語はＴＮＦＲの生物学的活性を有する変異体およ び類縁体を含めて全ての型のＴＮＦＲを意味する。The nomenclature used herein for TNFR analogs refers to proteins (e.g. It follows the nomenclature convention of TNFR), and is named hu (for humans) or mu (for mice). ) is placed first, and Δ (to signify deletion) and the C-terminal amino acid number is placed after it. For example, huTNFRΔ235 has a C-terminal amino acid Human TNFR with Asp23s as (i.e., amino acids 1-2 of SEQ ID NO: 1) 35). No human or mouse designation TNFR generally refers to mammalian TNFR. Similarly, deletion mutation fingers When in doubt, the term TNFH refers to biologically active variants and TNFRs. TNFR refers to all types of TNFR, including TNFR and analogs.

本明細書においてＴＮＦＲタンパク質もしくはその組成物の純度を定義するため の、「単離された」または「精製された」という用語は、タンパク質またはタン パク質組成物が天然もしくは内在性の起源の他のタンパク質を実質的に含まず、 そして製造工程の残存夾雑タンパク質が約１％未満しか含まれないことを意味す る。しかしながら、そのような組成物は、安定剤、担体、助剤または共存薬剤と して他の添加タンパク質を含んでもよい。ポリアクリルアミドゲルで銀染色によ り単一タンパク質バンドとして検出可能であれば、ＴＮＦＲは単離されたことに なる。As used herein to define the purity of a TNFR protein or composition thereof The term "isolated" or "purified" refers to a protein or the protein composition is substantially free of other proteins of natural or endogenous origin; This means that it contains less than about 1% of contaminant proteins left over from the manufacturing process. Ru. However, such compositions may contain stabilizers, carriers, auxiliaries or co-agents. It may also contain other added proteins. Silver staining on polyacrylamide gel TNFR is isolated if it can be detected as a single protein band. Become.

本明細書において「組換え」とは、タンパク質が組換え発現系（例えば微生物ま たは哺乳類）に由来することを意味する。「微生物」とはバクテリアまたは真菌 （例えば酵母）発現系で製造された組換えタンパク質であることを意味する。As used herein, "recombinant" means that the protein is expressed in a recombinant expression system (e.g., by a microorganism or or mammals). "Microorganisms" are bacteria or fungi Refers to a recombinant protein produced in a (eg yeast) expression system.

製造物としての「組換え微生物」の用語は、実質的に天然の内在物質を含まない 微生物発現系で製造されたタンパク質を定義する。大部分のバクテリア、例えば 大腸菌、の培養により発現されたタンパク質は、糖（グリカン）を含まない。酵 母で発現されたタンパク質は、哺乳類細胞で発現されたものとは異なるグリコジ ル化パターンを有するであろう。The term "recombinant microorganism" as a product of manufacture is substantially free of naturally occurring endogenous substances. Define proteins produced in microbial expression systems. Most bacteria, e.g. Proteins expressed by culturing E. coli do not contain sugars (glycans). fermentation Proteins expressed in the mother have a different glycodilation than those expressed in mammalian cells. pattern.

本明細書全体を通じて、ＴＮＦリセプターの特徴として「生物学的に活性な」と いうときは、特定の分子が本明細書に開示されている本発明の態様と十分なアミ ノ酸配列の類似性を共有して、検出可能量のＴＮＦと結合し、例えばハイブリッ ドリセブター構造物の成分として細胞にＴＮＦの刺激を伝達することができ、ま たは天然（即ち、非組換え）源からのＴＮＦＨに対して調製した抗ＴＮＦＲ抗体 と交叉反応することを意味する。好ましくは、本発明の範囲内の生物学的に活性 なＴＮＦリセブターは、標準的結合アッセイ（後記）において、１ナノモルのり セブター当たり０．１ナノモルより多量の、そして最も好ましくは１ナノモルの りセブター当たり０．５ナノモルより多量のＴＮＦと結合する能力をもつ。Throughout this specification, TNF receptors are characterized as "biologically active." when a particular molecule is compatible with the embodiments of the invention disclosed herein, share amino acid sequence similarity and bind detectable amounts of TNF, e.g. As a component of the Drisebuter construct, it can transmit TNF stimulation to cells and or anti-TNFR antibodies prepared against TNFH from natural (i.e., non-recombinant) sources. This means that there is a cross-reaction with Preferably, biologically active within the scope of the present invention TNF receptors were tested at 1 nanomolar concentration in standard binding assays (see below). more than 0.1 nanomole, and most preferably 1 nanomole per septar. It has the ability to bind more than 0.5 nanomoles of TNF per cebuter.

可溶性ＴＮＦアンタゴニストおよび類縁体本発明は単離および精製されたＴＮＦ アンタゴニストポリペプチドを使用する。Soluble TNF Antagonists and Analogs The present invention provides isolated and purified TNF antagonists and analogs. using an antagonist polypeptide.

本発明で用いる単離および精製されたＴＮＦアンタゴニストポリペプチドは、天 然起源または内在性起源の他の夾雑物質を実質的に含まず、そして製造工程の残 存夾雑タンパク質を約１％未満しか含まない。本発明で用いるＴＮＦアンタゴニ ストポリペプチドは、所望により付随する天然の糖タンパク質パターンを有しな い。The isolated and purified TNF antagonist polypeptides used in the present invention are Substantially free of other contaminants of natural or endogenous origin and free from manufacturing process residues. Contains less than about 1% of contaminant proteins. TNF antagonist used in the present invention The stop polypeptide optionally has no associated native glycoprotein pattern. stomach.

本発明の好ましい観点においては、ＴＮＦアンタゴニストは可溶性ヒトＴＮＦＲ １およびＴＮＦＲＩｒからなる群から選択される。ヒトＴＮＦＲＩ　ｃＤＮＡク ローン１を含むｐＣＡＶ／Ｎ０Ｔ−ＴＮＦＲベクターを用いて、可溶性ヒトＴＮ ＦＲＩ　ヲＪ［すｆｆ１ｌ製シタ。ｐＣＡＶ／Ｎ０Ｔ−ＴＮＦＲは、ＡＴＣＣ（ １２３０１バークレーンドライブ、ロックビル、　ＭＤ　２０８５２．米国）に 受託番号６８０８８（名称ｐＣＡＶ／Ｎ０Ｔ−ＴＮＦＲ）として寄託すれテいル 。In a preferred aspect of the invention, the TNF antagonist is a soluble human TNFR. 1 and TNFRIr. Human TNFRI cDNA Using pCAV/NOT-TNFR vector containing loan 1, soluble human TN FRI wo J [Sff1l made. pCAV/N0T-TNFR was purchased from ATCC ( 12301 Bark Lane Drive, Rockville, MD 20852. United States) Deposited as accession number 68088 (name pCAV/N0T-TNFR) .

多くの哺乳類遺伝子と同様に、哺乳類ＴＮＦリセブターは、おそらくマルチエク ソン遺伝子によりコードされている。転写に続（異なるｍＲＮＡのスプライス現 象に起因する異なるｍＲＮＡ構築物であって、本明細書中で特許請求されている ｃＤＮＡと多くの領域が同一性または類似性を共有するものを使用することも可 能であろう。Like many mammalian genes, the mammalian TNF receptor is likely a multi-extractor. It is encoded by the son gene. Following transcription (splice expression of different mRNAs) different mRNA constructs originating from elephants, which are claimed herein. It is also possible to use DNA that shares many regions of identity or similarity with cDNA. It would be Noh.

他の哺乳類ＴＮＦＲｃＤＮＡは、適当なヒトＴＮＦＲＤＮＡ配列をプローブとし て、特定の哺乳類ｃＤＮＡライブラリーを種間ハイブリダイゼーションによって スクリーニングすることにより単離できる。本発明で用いられる哺乳類ＴＮＦＲ には、例として、霊長類、ヒト、ネズミ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマおよ びブタのＴＮＦＲが含まれる。哺乳類のＴＮＦＲは、種間ハイブリダイゼーショ ンにより、ヒトＴＮＦＲＤＮＡに由来する一本鎖ｃＤＮＡをハイブリダイゼーシ ョンプローブとして、哺乳類ｃＤＮＡライブラリーからＴＮＦＲｃＤＮＡを単離 することにより得られる。Other mammalian TNFR cDNAs were probed with appropriate human TNFR DNA sequences. specific mammalian cDNA libraries by interspecies hybridization. It can be isolated by screening. Mammalian TNFR used in the present invention includes, for example, primates, humans, rats, dogs, cats, cows, sheep, horses and and swine TNFR. Mammalian TNFRs are caused by interspecies hybridization. Hybridization of single-stranded cDNA derived from human TNFR DNA Isolation of TNFR cDNA from a mammalian cDNA library as a reaction probe It can be obtained by

本発明で用いることができるＴＮＦＲの誘導体には、元のタンパク質の生物学的 活性を保持している種々の構造型も含まれる。例えば、イオン化可能なアミノ基 およびカルボキシル基の存在のため、ＴＮＦＲタンパク質は酸性塩または塩基性 塩であっても、あるいは中性の形であってもよい。各アミノ酸残基はまた、酸化 または還元により修飾されてもよい。Derivatives of TNFR that can be used in the present invention include biological derivatives of the original protein. Also included are various structural types that retain activity. For example, ionizable amino groups Due to the presence of carboxyl groups and carboxyl groups, TNFR proteins can be either acidic or basic. It may be a salt or a neutral form. Each amino acid residue is also oxidized Alternatively, it may be modified by reduction.

元のアミノ酸の構造は、他の化学的部分、例えばグリコジル基、脂質、ホスフェ ート、アセチル基、その他と共有結合もしくは凝集による複合体を形成すること により、あるいはアミノ酸配列に変異を生じさせることにより修飾してもよい。The structure of the original amino acid is modified by other chemical moieties, such as glycosyl groups, lipids, phosphates, etc. form a complex with acetate, acetyl group, etc. by covalent bond or aggregation. The modification may be made by mutating the amino acid sequence or by causing a mutation in the amino acid sequence.

共有結合による誘導体は、特定の官能基をアミノ酸の側鎖またはＮ−もしくはＣ −末端に結合することにより調製される。他のＴＮＦＲの誘導体には、ＴＮＦＲ もしくはそのフラグメントと他のタンパク質もしくはポリペプチドとの共有結合 もしくは凝集による複合体、例えばＮ−末端またはＣ−末端融合体のような組換 え培養で合成されるような複合体も含まれる。例えば、複合相手のペプチドは、 タンパク質のＮ−末端のシグナル（もしくはリーダー）ポリペプチドであってよ く、シグナルは翻訳と同時にまたは翻訳後にタンパク質をその合成部位から細胞 膜もしくは細胞壁の内部もしくは外部の作用部位に輸送することをつかさどる（ 例えば、酵母のα因子のリーダー）。ＴＮＦＲタンパク質融合体は、ＴＮＦＲの 精製または同定を容易にするために付加されたペプチド（例えば、ｐｏｌｙ−Ｈ ｉｓ）を含んでよい。ＴＮＦＲリセブターのアミノ酸配列は、ペプチドＡｓｐ− Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ　（ＤＹＫＤＤＤＤ Ｋ）に結合してもよい（Ｈｏｐｐ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ　６：１２０４．１９８８）　ｏこの配列は非常に抗原性が強く、特異的モ ノクローナル抗体により可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現された組 換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。この配列はま た、ウシの粘膜エンテロキナーゼによってＡｓｐ−Ｌｙｓ対の直後の残基で特異 的に開裂することができる。頭部にこのペプチドをかぶせた融合タンパク質は、 大腸菌での細胞内分解６ど対する抵抗性ももっている。Covalent derivatives link specific functional groups to the side chains of amino acids or to N- or C- - prepared by ligation at the end. Other TNFR derivatives include TNFR or covalent linkage of fragments thereof with other proteins or polypeptides. or complexes by aggregation, such as N-terminal or C-terminal fusions. It also includes complexes that are synthesized in culture. For example, the conjugate partner peptide is It may be a signal (or leader) polypeptide at the N-terminus of a protein. signals that move proteins from their sites of synthesis into cells, either co-translationally or post-translationally. Responsible for transport to the site of action inside or outside the membrane or cell wall ( e.g., yeast α-factor leader). TNFR protein fusions are Peptides added to facilitate purification or identification (e.g. poly-H is). The amino acid sequence of the TNFR receptor is the peptide Asp- Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDD (Hopp et al., Bio/Technolo gy 6:1204.1988) This sequence is highly antigenic and has a specific model. provides an epitope that is reversibly bound by the noclonal antibody and Allows rapid assay and easy purification of engineered proteins. This array is In addition, the residue immediately following the Asp-Lys pair was identified by bovine mucosal enterokinase. can be cleaved directly. A fusion protein whose head is covered with this peptide is It also has resistance to intracellular degradation6 by E. coli.

天然型に付随するグリコジル化をもつ、もしくはもたないＴＮＦＲを用いること もできる。酵母または哺乳類の発現システム、例えばＣＯ５−７細胞で発現され たＴＮＦＲは、発現システムに応じて、天然分子のものと類似のまたは若干具な る分子量およびグリコジル化パターンを有するであろう。大腸菌のようなバクテ リア内でのＴＮＦＲの発現は、グリコジル化されていない分子を生じる。不活性 化されたＮ−グリコジル化部位をもつ哺乳類ＴＮＦＲの機能的ミュータント類縁 体は、オリゴヌクレオチド合成およびライゲーションにより、または部位特異的 変異形成法により製造することができる。これらの類縁体タンパク質は、酵母発 現システムを用いて、均一な炭水化物減少型として製造することができる。真核 タンパク質におけるＮ−グリコジル化部位は、特徴的二連アミノ酸Ａｓｎ−Ａｌ 　−Ｚ　（Ａ、はＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり、ＺはＳｅｒまたはＴｈｒ である）を有する。この配列において、Ａｓｎは炭水化物への共有結合のための 側鎖アミノ基を提供する。そのような部位の削除は、Ａｓｎまたは残基Ｚを他の アミノ酸に置換し、Ａｓｎまたは残基Ｚを削除し、またはＡ１とＺの間に非Ｚア ミノ酸を挿入しもしくはＡｓｎとＡ１の間にＡｓｎ以外のアミノ酸を挿入するこ とにより行うことができる。Using TNFR with or without glycosylation associated with its native form You can also do it. expressed in yeast or mammalian expression systems, e.g. CO5-7 cells. Depending on the expression system, the derived TNFR may be similar or slightly more specific to that of the natural molecule. It will have a molecular weight and glycosylation pattern of Bacteria like E. coli Expression of TNFR within the lya results in a non-glycosylated molecule. inert Functional mutant analogs of mammalian TNFRs with modified N-glycosylation sites by oligonucleotide synthesis and ligation or by site-specific It can be produced by a mutagenesis method. These analog proteins are produced in yeast. Using the current system, it can be manufactured as a uniform reduced carbohydrate version. eukaryotic N-glycosylation sites in proteins are characterized by the characteristic diamic acid Asn-Al -Z (A, is any amino acid other than Pro, Z is Ser or Thr ). In this sequence, Asn is for covalent attachment to carbohydrates. Provides side chain amino groups. Deletion of such a site may replace Asn or residue Z with other amino acid substitutions, deletion of Asn or residue Z, or non-Z amino acid substitutions between A1 and Z. Inserting a amino acid or inserting an amino acid other than Asn between Asn and A1 This can be done by

ＴＮＦＲ誘導体は、ＴＮＦＲまたはそのサブユニットを変異させることによって も得ることができる。本明細書において、ＴＮＦＲ変異体（ミュータント）とは 、ＴＮＦＲとホモロガスであるが、削除、挿入または置換によって天然ＴＮＦＲ と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。TNFR derivatives are produced by mutating TNFR or its subunits. You can also get In this specification, what is a TNFR variant (mutant)? , homologous to TNFR, but by deletion, insertion or substitution means a polypeptide having an amino acid sequence different from that of

ＴＮＦＲタンパク質の生物学的に均等な類縁体の構築は、例えば、残基または配 列に種々の置換を行うことにより、または生物活性に必要ない末端もしくは内部 の残基もしくは配列を削除することにより行いうる。例えば、システィン残基（ 例えば（：ｙＳＩｔｓ）は削除するかまたは他のアミノ酸と置換して、再生時に 不要なまたは誤った分子内ジスルフィド架橋が形成されることを防止することが できる。池の変異形成手段には、隣接する二塩基性アミノ酸残基を修飾して、Ｋ ＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母システムでの発現を高めることが含まれ る。Construction of biologically equivalent analogs of TNFR proteins can be accomplished by, for example, By making various substitutions in the sequence, or by making terminal or internal changes that are not necessary for biological activity. This can be done by deleting a residue or sequence. For example, cysteine residues ( For example, (:ySIts) can be deleted or replaced with other amino acids to Preventing the formation of unnecessary or erroneous intramolecular disulfide bridges can. Ike's mutagenesis procedure involves modifying adjacent dibasic amino acid residues to create K This includes enhancing expression in yeast systems where EX2 protease activity is present. Ru.

置換アミノ酸残基と物理化学特性が類似するものである。同様に、削除または挿 入法を採用する場合は、削除もしくは挿入が生物活性に及ぼす可能性がある影響 を考慮すべきである。上記定義の実質的に類似するポリペプチド配列は、概して 同じ程度の数のアミノ酸の配列であるが、可溶性ＴＮＦＲを構築する目的で作ら れたＣ−末端欠失体はアミノ酸の数が少ない配列である。ＴＮＦＲの生物活性を 保存するために、削除および置換は、好ましくはホモロガスなまたは保存的に置 換された配列を生じ、即ち、特定の残基が生物学的に類似の残基で置換されてい ることを意味する。保存的置換の例には、一つの脂肪族性の残基を化合物の脂肪 族性のものに代えること、例えば、ｌｉｅ、Ｖａｔ、ＬｅｕまたはＡｌａ相互間 の置換、一つの極性残基を別の極性残基に代えること、例えばＬｙｓとＡｒｇ； ＧｌｕとＡｓｐ；またはＧｌｎとＡｓｎの交換が含まれる。そのような保存的置 換の別の例としては、例えば類似の疎水性をもつ領域で全体的に置換することが 良く知られている。さらに、ヒト、ネズミおよび他の哺乳類ＴＮＦＲの間の個々 のアミノ酸の相違は、ＴＮＦＲの必須な生物学的特性を変化させることなく行い つる、さらなる保存的置換の可能性を示唆するものである。It has similar physicochemical properties to the substituted amino acid residue. Similarly, delete or insert If an entry method is adopted, the effect that the deletion or insertion may have on biological activity. should be considered. Substantially similar polypeptide sequences as defined above generally include A sequence of similar number of amino acids, but created for the purpose of constructing soluble TNFR. The resulting C-terminal deletion is a sequence with a reduced number of amino acids. The biological activity of TNFR To be conservative, deletions and substitutions are preferably homologous or conservatively placed. resulting in an altered sequence, i.e., a particular residue is replaced with a biologically similar residue. It means to do something. An example of a conservative substitution is replacing one aliphatic residue with the fatty acid of a compound. Replacement with family, such as between lie, Vat, Leu or Ala substitutions, replacing one polar residue with another, e.g. Lys and Arg; Includes exchange of Glu and Asp; or Gln and Asn. Such a conservation Another example of substitution is e.g. global substitution with regions of similar hydrophobicity. well known. Furthermore, the individual differences between human, murine and other mammalian TNFRs Amino acid differences in TNFRs can be made without altering the essential biological properties of Vine, suggesting the possibility of further conservative substitutions.

ＴＮＦＲのサブユニットは末端もしくは内部の残基もしくは配列を削除すること により、構築できる。特に好ましい配列は、ＴＮＦＲの膜貫通領域および細胞内 ドメインが削除されまたは親水性残基に置換されていて、リセブターが細胞培養 の培地中に分泌できるようにされているものである。このようにして得られるタ ンパク質は、可溶性ＴＮＦＲ分子と呼ばれ、ＴＮＦに対する結合能力を保持して いる。特に好ましい可溶性ＴＮＦＲ構築物は、ＴＮＦＲＩΔ２３５（配列番号１ のアミノ酸１−２３５の配列）であり、これはＴＮＦＲｒの細胞外領域を完全に 含み、膜貫通領域に直ぐ隣接するＡＳｐ２３５で終了している。ＴＮＦ結合活性 を保持しつつさらに多くのアミノ酸を膜貫通領域から削除することもできる。例 えば、ｈｕＴＮＦＲＩΔ１８３（配列番号１のアミノ酸１−１８３の配列からな る）、およびＴＮＦＲＩΔ１６３（配列番号１のアミノ酸１−１６３の配列から なる）は、ＴＮＦリガンドに結合する能力を残している。しかしながら、ＴＮＦ Ｒ］Δ１４２はＴＮＦリガンドに結合する能力を保持していない。このことは、 ＴＮＦＲＩの適切な折り畳みのための分子内ジスルフィド架橋の形成のために、 ＣｙｓＩ５７およびＣｙｓ１６３の一方または両方が必要であることを示唆する 。Ｃｙ　ｓ　Ｉ　７　＆は、削除しても可溶性ＴＮＦＲＩがＴＮＦに結合する能 力に明らかな悪影響を及ぼさなかったため、ＴＮＦＲｒの適切な折り畳みのため に必須ではないと考えられる。従って、ＣｙＳＩ６３までのＣ−末端側の削除体 は全て生物学的に活性な可溶性ＴＮＦＲＩを生じるであろうと期待される。本発 明は、このようにＣｙｓ１６３の後方の任意のアミノ酸で終了し、ＴＮＦＲの細 胞外領域の全部もしくは一部に相当する可溶性ＴＮＦＲ構築物を使用することを 意図している。他のＣ−末端削除体、例えばＴＮＦＲＩΔ１５７の製造は、ＴＮ ＦＲのｃＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、必要なら合成オリゴヌクレオチドリ ンカーをもつ特定の配列に再構築することにより、容易に行うことができる。Ｎ −末端削除を有する可溶性ＴＮＦＲも本発明に用いることができる。例えば、Ｔ ＮＦＲＩのＮ−末端はＬｅｕ’　、Ｐｒｏ”またはＡｌａ３のどれから開始して も、ＴＮＦＲＩがＴＮＦアンタゴニストとして効果的に作用する能力に有意な影 響は生じない。こうして得られる可溶性ＴＮＦＲ構築物は、次に適当な発現ベク ターに挿入して発現させ、ＴＮＦ結合能をアッセイする。Deletion of terminal or internal residues or sequences in TNFR subunits It can be constructed by Particularly preferred sequences include the transmembrane region of TNFR and intracellular If the domain is deleted or replaced with a hydrophilic residue, the receptor is not compatible with cell culture. It is designed to be secreted into the culture medium. The data obtained in this way The protein is called a soluble TNFR molecule and retains the ability to bind TNF. There is. A particularly preferred soluble TNFR construct is TNFRIΔ235 (SEQ ID NO: 1 (sequence of amino acids 1-235), which completely covers the extracellular region of TNFRr. and terminates in ASp235 immediately adjacent to the transmembrane region. TNF binding activity It is also possible to delete more amino acids from the transmembrane region while retaining . example For example, huTNFRIΔ183 (from the sequence of amino acids 1-183 of SEQ ID NO: 1) ), and TNFRIΔ163 (from the sequence of amino acids 1-163 of SEQ ID NO: 1), ) remains capable of binding TNF ligands. However, TNF R]Δ142 does not retain the ability to bind TNF ligands. This means that Due to the formation of intramolecular disulfide bridges for proper folding of TNFRI, Suggests that one or both of CysI57 and Cys163 is required . Even if CysI7& is deleted, the ability of soluble TNFRI to bind to TNF remains for proper folding of TNFRr, as there was no obvious negative effect on the force. It is considered that it is not essential. Therefore, the C-terminal deletion up to CySI63 All are expected to yield biologically active soluble TNFRI. Main departure The light ends in this way at any amino acid after Cys163, and the TNFR fragment The use of soluble TNFR constructs that represent all or part of the extravesicular region Intended. The production of other C-terminal deletions, such as TNFRIΔ157, Cut the FR cDNA with an appropriate restriction enzyme, and add synthetic oligonucleotides if necessary. This can be easily done by reconstructing a specific sequence with a linker. N -Soluble TNFRs with terminal deletions can also be used in the present invention. For example, T Does the N-terminus of NFRI start from Leu', Pro' or Ala3? also have a significant impact on the ability of TNFRIs to act effectively as TNF antagonists. There is no sound. The soluble TNFR construct thus obtained is then placed in a suitable expression vector. The cells are inserted into a microtube, expressed, and assayed for TNF binding ability.

類縁体ＴＮＦＨの発現のために構築されるヌクレオチド配列中の変異は、コード 配列の読み枠を保持していなければならないのは勿論であるが、好ましくは、相 補性領域の出現による領域同士のハイブリダイゼーションのために、ループやヘ アピン等の二次構造がリセブタ−ｍＲＮＡに生じて、その翻訳に悪影響を受ける おそれがないものである。変異の部位は予め決定できるが、変異の性質そのもの を予め決定しておく必要はない。例えば、特定の部位に最適特性をもつ変異体を 選択するためには、標的コドンに無作為の変異形成をおこさせ、発現させたＴＮ ＦＲ変異体から所望活性のものをスクリーニングすることができる。Mutations in the nucleotide sequence constructed for expression of analog TNFH Of course, the reading frame of the sequence must be maintained, but preferably, the reading frame of the sequence must be maintained. Due to hybridization between regions due to the appearance of complementary regions, loops and Secondary structures such as apin occur in receptor mRNA and adversely affect its translation. There is no danger. Although the site of mutation can be determined in advance, the nature of the mutation itself There is no need to determine it in advance. For example, we can create mutants with optimal properties at specific sites. For selection, random mutagenesis is performed on the target codon, and the expressed TN FR mutants having desired activity can be screened.

ＴＮＦＲをコードするヌクレオチド配列中の変異は、その全てが最終産物に発現 されるわけではな（、例えば、発現の増大のため、転写されるｍＲＮＡに二次構 造のループができることを防止するのを主目的として（参照して本明細書に含め るＥＰＡ　７５，４４４Ａを参照）、または選択した宿主によってより容易に翻 訳されるコドン（例えば、大腸菌による発現のための、良く知られている大腸菌 が好むコドン）の提供のためにヌクレオチドの置換を行うこともできる。All mutations in the nucleotide sequence encoding TNFR are expressed in the final product. (e.g., to increase expression, secondary structures may be added to the transcribed mRNA.) (herein incorporated by reference), with the primary purpose of preventing the formation of structural loops. (see EPA 75,444A), or more easily translated by the host of choice. Codons to be translated (e.g., for expression in E. coli, the well-known E. coli Nucleotide substitutions can also be made to provide preferred codons).

変異は、天然配列のフラグメントへのライゲーションを可能ならしめる制限部位 を両側にもつ、変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定 の部位に導入することができる。ライゲーションにより得られる再構築配列は、 所望のアミノ酸の挿入、置換または削除を有する類縁体をコードする。Mutations create restriction sites that allow ligation into fragments of the native sequence. By synthesizing an oligonucleotide containing a mutant sequence with It can be introduced into the site. The reconstructed sequence obtained by ligation is Encode analogs with the desired amino acid insertions, substitutions or deletions.

別の方法としては、オリゴヌクレオチドに対する部位特異的変異形成法を用いて 、特定のコドンが要求に応じて置換、削除または挿入によって変更された変更遺 伝子を得ることができる。上記のような変更を行う方法の例としては、？ａｌｄ ｅｒｅｔ　ａｌ、　（Ｇｅｎｅ　４２：１３３．１９８６）；　Ｂａｕｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、　（Ｇｅｎｅ　３１：１３．１９８５）；　Ｃｒａｉ求@（Ｂｉ。Another method is to use site-directed mutagenesis of oligonucleotides. , where specific codons have been modified by substitution, deletion or insertion as required. You can get the message. An example of how to make changes like the above? ald eret al, (Gene 42:133.1986); Bauer e tal, (Gene 31:13.1985); Crai request @ (Bi.

Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　Ｊａｎｕａｒｙ　１９８５．１２−１９）；　Ｓｍ１ ｔｈ　ｅｔ　ａＬ、　（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒ奄獅■F　Ｐｒ１ ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　１ ９８１）；および米国特許４．５１８．５８４および４、７３７．４６２に適当 な技術が開示されており、これらは参照により本明細書の一部とする。Techniques, January 1985.12-19); Sm1 th et aL, (Genetic Engineer Amashi F Pr1 ciples and Methods, Plenum Press, 1 981); and as appropriate in U.S. Pat. techniques are disclosed, which are hereby incorporated by reference.

本発明においては、−価のＴＮＦＲおよび多価のＴＮＦＲの両方とも使用できる 。多価の形のＴＮＦＲは、ＴＮＦリガンドに対する複数のＴＮＦＲ結合部位を有 する。例えば、二価の可溶性ＴＮＦＲは、配列番号１のアミノ酸１−２３５二つ をリンカ−領域で分離された形で直列につないで構成してよい。別の多価形状も 構築することができ、例えばＴＮＦＲを任意の臨床的に許容される担体分子、フ ィコール、ポリエチレングリコール、またはデキストランからなる群から選択さ れるポリマーに、慣用のカップリング手段を用いて化学的にカップリングさせて 構築できる。別の方法として、ＴＮＦＲをビオチンに化学的にカップリングさせ 、ビオチン−ＴＮＦＲ複合体をアビジンに結合させて、四価のアビジン／ビオチ ン／ＴＮＦＲ分子を得ることもできる。また、ＴＮＦＲをジニトロフェノール（ ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合でカップリングさせ 、生じた複合体を抗−ＤＮＰまたは抗−ＴＮＰ−ｒｇＭで沈殿させて、ＴＮＦＲ 結合部位に関して１０価の１０量体（デカマー）複合体を生じさせることもでき る。Both -valent and multivalent TNFRs can be used in the present invention. . Multivalent forms of TNFR have multiple TNFR binding sites for TNF ligands. do. For example, a bivalent soluble TNFR contains two amino acids 1-235 of SEQ ID NO:1. may be configured by connecting them in series separated by a linker region. Another multivalent shape For example, TNFR can be constructed using any clinically acceptable carrier molecule, fluorophore, etc. selected from the group consisting of glycol, polyethylene glycol, or dextran. chemically coupled to the polymer using conventional coupling means. Can be built. Alternatively, TNFR can be chemically coupled to biotin. , the biotin-TNFR complex is bound to avidin to form a tetravalent avidin/biotin It is also possible to obtain molecule/TNFR. In addition, TNFR was determined by dinitrophenol ( DNP) or trinitrophenol (TNP). , the resulting complex was precipitated with anti-DNP or anti-TNP-rgM to A 10-valent decameric (decamer) complex can also be generated with respect to the binding site. Ru.

組換えキメラ抗体分子、例えば免疫グロブリン分子の重鎮および軽鎖の一方また は両方の可変領域がＴＮＦＲ配列で置換され、そして定常領域のドメインは修飾 されていない、組換えキメラ抗体分子も製造できる。例えば、二つのキメラ遺伝 子−−ＴＮＦＲ／ヒトに軽鎖キメラ（ＴＮＦＲ／Ｃに）およびＴＮＦＲ／ヒトγ １重鎖キメラ（ＴＮＦＲ／Ｃγ−１）から、キメラＴＮ　Ｆ　Ｒ／　Ｉ　ｇ　Ｇ 　１を製造することができる。これら二つのキメラ遺伝子から転写および翻訳の 後に生じた二つの遺伝子産物は、一つのキメラ抗体分子に組み立てられ、ＴＮＦ Ｒを二価として提示する。そのような多価型のＴＮＦＲは、ＴＮＦリガンドに対 する結合親和性が増加している。ＴＮＦＲ／Ｆｃ融合タンパク質の一つの具体例 は、配列番号３および配列番号４に開示されている。このようなキメラ抗体分子 の構築に関するさらなる詳細は、ＷＯ８９１０９６２２およびＥＰ　３１５０６ ２に開示さ組換え発現ベクターは、好ましくはＴＮＦＲコードＤＮＡを増幅もし くは発現させて純化されたＴＮＦＲを得るために用いられる。組換え発現ベクタ ーは、複製能力をもつＤＮＡ構築物であり、合成のまたはｃＤＮＡ由来の哺乳類 ＴＮＦＲまたはその生物学的に均等な類縁体をコードするＤＮＡフラグメントを 、哺乳類、微生物、ウィルスまたは昆虫遺伝子由来の、転写もしくは翻訳を調節 する要素と機能的につながれた状態で有している。転写の単位は一般的には、（ １）遺伝子の発現を調節する役目をもつ単数もしくは複数の遺伝子要素、例えば 、転写のプロモーターまたはエンハンサ−、（２）ｍＲＮＡに転写されてタンパ ク質に翻訳される構造配列もしくはコード配列、および（３）後で詳述する転写 および翻訳の適当な開始配列および停止配列、の集合体からなっている。そのよ うな調節配列には、転写をコントロールするオペレーター配列、適当なｍＲＮＡ リポゾーム結合部位をコードする配列が含まれる。宿主内で複製する能力（通常 は複製起点により付与される）、および形質転換体を識別することを可能にする 選択用遺伝子も一緒に含ませることができる。ＤＮＡの複数の領域は、相互に機 能的に関連しているならば、機能的につながっている（ｏｐｅｒａｂｌｙ　１ｉ ｎｋｅｄ）といってよい。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ は、ポリペプチドの分泌に携わる前駆体として発現されるならば、ポリペプチド のＤＮＡと機能的につながっており：プロモーターはコード配列の転写をコント ロールすれば、コード配列と機能的につながっており、リボゾーム結合部位は翻 訳を可能にするように配置されていれば、コード配列と機能的につながっている 。一般的には、機能的な繋がりとは、隣接することを意味し、分泌リーダー配列 の場合には、隣接し且つ読み枠内に存在することを意味する。酵母発現システム 内において用いることを意図する場合は、構造要素には好ましくは宿主細胞によ る翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列が含まれている。その 代わりに、組換えタンパク質がリーダー配列もしくは輸送配列を用いずに発現さ れる場合は、Ｎ−末端メチオニンを含んでもよい。所望により、この残基を発現 された組換えタンパク質からその麦分離して最終生成物を得てもよい。Recombinant chimeric antibody molecules, such as one or more of the heavy and light chains of an immunoglobulin molecule. Both variable regions are replaced with TNFR sequences and the constant region domains are modified Recombinant chimeric antibody molecules, which have not yet been produced, can also be produced. For example, two chimeric genes Child--TNFR/human to light chain chimera (to TNFR/C) and TNFR/human γ From single heavy chain chimera (TNFR/Cγ-1), chimera TNF R/IgG 1 can be manufactured. transcription and translation from these two chimeric genes. The two resulting gene products are then assembled into one chimeric antibody molecule and R is presented as divalent. Such multivalent forms of TNFR are binding affinity is increased. One specific example of TNFR/Fc fusion protein is disclosed in SEQ ID NO:3 and SEQ ID NO:4. Such chimeric antibody molecules Further details regarding the construction of WO89109622 and EP 31506 The recombinant expression vector disclosed in No. 2 preferably also amplifies TNFR-encoding DNA. It is used to express and obtain purified TNFR. recombinant expression vector - is a replication-competent DNA construct, synthetic or cDNA-derived A DNA fragment encoding TNFR or a biologically equivalent analog thereof , regulating transcription or translation of mammalian, microbial, viral or insect genes. It is functionally connected to the elements that The unit of transcription is generally ( 1) Single or multiple genetic elements that play a role in regulating gene expression, e.g. , transcription promoter or enhancer, (2) transcribed into mRNA and protein (3) the transcription as detailed below; It consists of a collection of appropriate initiation and termination sequences for translation. That's it Such regulatory sequences include an operator sequence that controls transcription, an appropriate mRNA Contains a sequence encoding a liposome binding site. ability to replicate within the host (usually conferred by the origin of replication), and allows transformants to be identified A selection gene can also be included. Multiple regions of DNA are mutually functional. If they are functionally related, they are functionally connected (operably 1i nked). For example, signal peptide (secretory leader) DNA If expressed as a precursor involved in secretion of the polypeptide, The promoter controls the transcription of the coding sequence. When rolled, it is functionally connected to the coding sequence and the ribosome binding site is transliterated. functionally connected to a coding sequence if arranged in such a way as to permit translation. . Generally, functional linkage means contiguous and secretory leader sequence In the case of , it means that they are adjacent and within the reading frame. yeast expression system If the structural elements are intended for use within the host cell, the structural elements are preferably It contains a leader sequence that enables extracellular secretion of the translated protein. the Alternatively, recombinant proteins can be expressed without leader or transport sequences. If present, it may contain an N-terminal methionine. Express this residue if desired The resulting recombinant protein may be separated to obtain the final product.

微生物中で発現させるためには、哺乳類ＴＮＦリセブターをコードするＤＮＡ配 列は、好ましくはＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を未成熟のまま中止するようなイ ントロンを含まないものである：しかしながら、未成熟での転写の終了が好まし い場合もあり、例えば有利なＣ−末端短縮を有する変異体が得られる場合、例え ば、細胞膜に結合していない可溶性リセブターを得るために膜貫通領域を削除す る場合である。コードの縮重のため、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチ ド配列には相当の変化が可能である。他の態様には、提供されたｃＤＮＡに対し て中程度に厳密（ストリンジェント）な条件下（５０℃、２ＸＳＳＣ）でハイブ リダイズできる配列、および生物学的に活性なＴＮＦリセブターボリペプチドを コードする配列にハイブリダイズしたり縮重関係にある配列も含まれる。For expression in microorganisms, a DNA sequence encoding a mammalian TNF receptor is used. The column preferably contains an species that prematurely terminates transcription from DNA to mRNA. However, premature termination of transcription is preferable. For example, if a variant with an advantageous C-terminal truncation is obtained, e.g. For example, removing the transmembrane region to obtain a soluble receptor that is not bound to the cell membrane. This is the case. Due to the degeneracy of the code, nucleotides that encode the same amino acid sequence Considerable variations in the code arrangement are possible. In other embodiments, the provided cDNA Hive under moderately stringent conditions (50°C, 2X SSC). sequence that can be redized and a biologically active TNF receptor polypeptide. Sequences that hybridize to or have a degenerate relationship with the coding sequence are also included.

組換えＴＮＦＲＤＮＡの発現または増幅は、適当な宿主微生物の実質的に均一な 単一培養物からなる組換え発現システム中で行われ、例えば形質転換またはトラ ンスフェクションによって染色体ＤＮＡに組換え転写単位が安定に組み込まれる か、または生息プラスミドの成分として組換え転写単位を有する大腸菌のような バクテリアあるいはＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母中で行われる。Expression or amplification of recombinant TNFR DNA is carried out in a substantially homogeneous manner in a suitable host microorganism. carried out in a recombinant expression system consisting of a single culture, e.g. transformation or transduction. Stable integration of recombinant transcription units into chromosomal DNA by transfection or with a recombinant transcription unit as a component of the population plasmid, such as E. coli. It is carried out in bacteria or yeast such as S. cerevisiae.

一般に、システムを構成する細胞は、単一形質転換体祖先からの子孫である。本 明細書中で定義する組換え発現システムは、発現させるべきＤＮＡ配列もしくは 合成遺伝子につながれた調節要素の誘導によって異種タンパク質を発現する。Generally, the cells that make up the system are descended from a single transformant ancestor. Book A recombinant expression system as defined herein comprises a DNA sequence to be expressed or Heterologous proteins are expressed by induction of regulatory elements linked to synthetic genes.

形質転換宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたＴＮＦＲベクターで 形質転換または感染された細胞である。形質転換細胞は通常ＴＮＦＲを発現する が、ＴＮＦＲＤＮＡのクローニングまたは増幅を目的として形質転換された宿主 細胞は、ＴＮＦＲを発現する必要はない。発現されたＴＮＦＲは、選択されたＴ ＮＦＲＤＮＡに応じて、細胞膜に蓄積されるか、または、培養液上清中に分泌さ れる。哺乳類ＴＮＦＲの発現に適切な宿主細胞には、適切なプロモーターの支配 下におかれた原核細胞、酵母、または高等真核細胞が含まれる。原核細胞には、 例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）またはバチルス（ｂａｃ　ｉ　］　Ｉ　ｉ）の ような、ダラム陰匂若しくはダラム陽性の生物が含まれる。高等真核細胞には、 後述するような、哺乳類の器官の確立された細胞系が含まれる。本発明のＤＮＡ 構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）由来のＲＮＡを用いた無細胞翻訳系を適用して哺 乳類ＴＮＦＲを生産することもできる。細菌、真菌（ｆｕｎｇｕｓ）、酵母およ び哺乳類細胞宿主と共に用いることのできる適切なりローニング及び発現ベクタ ーについてはＰｏｕｗｅｌｓらによって記載されている（Ｃｌｏｎｊｎｇ　Ｖｅ ｃｔｏｒｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、、１９８５）。この文献の相当する部分の記載は参考文献と して本明細書中に取り入れられる。The transformed host cell is a TNFR vector constructed using recombinant DNA technology. A transformed or infected cell. Transformed cells usually express TNFR is a host transformed for the purpose of cloning or amplification of TNFR DNA. Cells do not need to express TNFR. The expressed TNFR is Depending on the NFR DNA, it is either accumulated in the cell membrane or secreted into the culture supernatant. It will be done. Suitable host cells for the expression of mammalian TNFRs must be under the control of an appropriate promoter. Includes underlying prokaryotic cells, yeast, or higher eukaryotic cells. In prokaryotic cells, For example, Escherichia coli (E coli) or Bacillus (bac i) This includes organisms that are Durum-negative or Durum-positive, such as. Higher eukaryotic cells have Included are established cell lines of mammalian organs, such as those described below. DNA of the present invention By applying a cell-free translation system using construct-derived RNA, Mammalian TNFRs can also be produced. Bacteria, fungus, yeast and suitable cloning and expression vectors that can be used with mammalian and mammalian cell hosts. - is described by Pouwels et al. (Clonjng Ve ctors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985). Corresponding parts of this document are referred to as references. and incorporated herein by reference.

精巧な分解加工およびジスルフィド加工を必要としないＴＮＦＲの発現には原核 発現宿主を用いることもできる。原核発現ベクターは、通常、１つまたはそれ以 上の表現選択用マーカー（例えば、抗生物質耐性を与える、または栄養要求性を 満たすタンパク質をコードする遺伝子）および、宿主内での増殖を可能にするた めの、宿主によって認識される複製起点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｒｉｇｉ ｎ）を含む。形質転換のための適当な原核細胞には、Ｅ、ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｆ ｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓＳＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ。Prokaryotic Expression hosts can also be used. Prokaryotic expression vectors usually contain one or more phenotypic selection markers (e.g., conferring antibiotic resistance or auxotrophy) (genes encoding proteins that satisfy the origin of replication recognized by the host n). Suitable prokaryotic cells for transformation include E. coli, Bacif. lus subtilis SS Salmonella typhimurium.

並びにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔ　ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属および５ｔａ ｐｈｙｏｌｏｃｏｃｃｕｓ属中の様々な種が含まれるが、その他のものも選択に よって適用できる。and Pseudomonas spp., Streptomyces spp. and 5ta Includes various species within the genus Phylococcus, but others are also available for selection. Therefore, it can be applied.

細菌に使用するための利用可能な発現ベクターは、選択用マーカーおよび、広く 知られているクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝 的構成要素（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む商業的に入手可能なプラ スミド由来の細菌の複製起点を含む。そのような商業的に入手可能なベクターに は、例えば、ｐＫＫ２２３−３　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＧＥＭｌ　（Ｐｒｏｍｅｇ ａＢｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ、ＵＳＡ）が含まれる。これらのｐＢＲ ３２２”骨組み”部分に適切なプロモーターおよび発現すべき構造配列を結合さ せる。Ｅ、ｃｏｌｉは通常、Ｅ、ｃｏｌｉ種由来のプラスミドである、ｐＢＲ３ 質転換する。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための 遺伝子含むので、形質転換された細胞を同定するための簡易な方法を提供する。Available expression vectors for use in bacteria include selectable markers and Genetics of the known cloning vector pBR322 (ATCC37017) Commercially available platforms containing genetic elements Contains a bacterial origin of replication derived from Sumid. In such commercially available vectors For example, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemi cals, Uppsala, Sweden) and pGEMl (Promeg aBiotec, Madison, Wl., USA). These pBRs An appropriate promoter and structural sequence to be expressed are attached to the 322 “skeleton” part. let E. coli is usually a plasmid derived from the E. coli species, pBR3. Transform. pBR322 for ampicillin and tetracycline resistance Because it contains the gene, it provides a simple method for identifying transformed cells.

組換え微生物発現ベクター中で通常用いられるプロモーターは、β−ラクタマー ゼ（ｐｅｎｊｃｉｌｌｉｎａｓｅ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎ ｇら、Ｎａｔｕｒｅ　２７５：６１５，１９７８；　およびＧｏｅｄｄｅｌら、 Ｎａｔｕｒｅ　２８１：５４４．　１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロ モーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、８：４０５７ 、　１９８０：およびＥＰＡ　３６，７７６）、並びにｔａｃプロモーター（Ｍ ａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ、ｐ、４１２．１９８２）を含む。特に有用な細菌発現系は、ファージλ ＰＬプロモーターおよびｃ１８５Ｔｘ熱不安定性リプレッサー（ｒｅｐｒｅｓｓ ｏｒ）を適用する。Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ ｃｔｉ。Promoters commonly used in recombinant microbial expression vectors are β-lactamer penjcillinase and lactose promoter system (Chan g et al., Nature 275:615, 1978; and Goeddel et al. Nature 281:544. 1979), tryptophan (trp) pro Motor system (Goeddel et al., Nucl, Ac1ds Res, 8:4057 , 1980: and EPA 36,776), and the tac promoter (M aniatis, Mo1ecular Cloning: A Laborato ry Manual, Col1d Spring Harbor Laborat ory, p. 412.1982). A particularly useful bacterial expression system is phage λ PL promoter and c185Tx thermolabile repressor (repress or) is applied. American Type Cu1ture Co11e cti.

ｎから入手可能な、λＰＬプロモーターの派生体を取り込んだプラスミドベクタ ーは、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＪＭＢ９中のプラスミドｐＨＵＢ２　（ＡＴＣＣ３７０９ ２）およびＥ、ｃｏｌｉ株ＲＲＩ中のｐＰＬｃ２８　（ＡＴＣＣ５３０８２）を 含む。A plasmid vector incorporating a derivative of the λPL promoter available from plasmid pHUB2 (ATCC3709 2) and pPLc28 (ATCC53082) in E. coli strain RRI. include.

組換えＴＮＦＲタンパク質は、酵母宿主（好ましくはＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種由来のもの）中で発現させることもできる。The recombinant TNFR protein is derived from a yeast host (preferably S. cerevisiae). and other Saccharomyces species).

その池の属の酵母、例えば、ＰｉｃｈｉａｌまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ 属を利用することもできる。酵母ベクターは、通常、２μ酵母プラスミド由来の 複製起点若しくは自己複製配列（ＡＲ３）　、プロモーター、ＴＮＦＲをコード するＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終結のための配列、並びに選択用遺伝子 を含む。好ましくは、酵母ベクターは、複製起点、酵母とＥ、ｃｏｌｉ双方の形 質転換を可能にする選択用マーカー、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉのアンピシリン耐性 遺伝子およびＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴＲＰ１若しくはＵＲＡ３遺伝子（トリ プトファン中での増殖能を喪失している酵母の突然変異株のための選択用マーカ ーを提供する）、並びに、下流の構造遺伝子の転写を誘導するための高度発現酵 母遺伝子由来のプロモーターを含む。こうして、酵母宿主細胞ゲノム中にＴＲＰ 　１若しくはＵＲＡ３の欠損が存在すると、トリプトファン若しくはウラシル非 存在下で増殖させることによって形質転換を検出するための有効な環境が提供さ れる。Yeasts of the pond genus, such as Pichial or Kluyveromyces You can also use the genus. Yeast vectors are usually derived from the 2μ yeast plasmid. Origin of replication or self-replicating sequence (AR3), promoter, encodes TNFR DNA, sequences for polyadenylation and transcription termination, and selection genes including. Preferably, the yeast vector has an origin of replication, both yeast and E. coli forms. Selectable markers to enable transformation, e.g. ampicillin resistance of E. coli gene and S, cerevisiae TRP1 or URA3 gene (avian Selectable marker for yeast mutants that have lost the ability to grow in putophane ), as well as highly expressed enzymes to induce transcription of downstream structural genes. Contains a promoter derived from the mother gene. Thus, TRP is present in the yeast host cell genome. 1 or URA3 deficiency causes tryptophan or uracil deficiency. Provides an effective environment for detecting transformation by growing in the presence of It will be done.

酵母ベクター中の適切なプロモーター配列は、メタロチオネイン、３−ホスフォ グリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５５ ：２０７３，１９８０）、並びに、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン 酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスフ ォフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスフォグリ セリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホス フォグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ等のその他の解糖系酵素（Ｈ ｅｓｓら、Ｊ、Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、７：１４９．１９６８；および Ｈｏ１ｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７：４９００，１９７８）を含む。酵母 での発現に使用できる適当なベクターおよびプロモーターについては、さらにＲ ，Ｈｉｔｚｅｍａｎら、ＥＰＡ　７３，６５７に記載されている。Suitable promoter sequences in yeast vectors include metallothionein, 3-phosphorus, Glycerate kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 :2073, 1980), as well as enolase, glyceraldehyde-3-phosphorus acid dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosph fructokinase, glucose-6-phosphate isomerase, 3-phosphoryl Serate mutase, pyruvate kinase, triosephosphate isomerase, phosphorus Other glycolytic enzymes such as foglucose isomerase and glucokinase (H ess et al., J. Adv. Enzyme Reg, 7:149.1968; and Holland et al., Biochem, 17:4900, 1978). yeast For suitable vectors and promoters that can be used for expression in R. , Hitzeman et al., EPA 73,657.

好ましい酵母ベクターは、Ｅ、ｃｏｌｉ中での選択および複製のためのｐ［ＪＣ １８由来のＤＮＡ配列（Ａ、ｍｐ’遺伝子および複製起点）、並びにグルコース 抑制ＡＤＨ２プロモーター配列およびα−因子分泌リーダー配列を含む酵母ＤＮ Ａ配列を用いて構築することができる。Ａ　Ｄ　Ｈ２プロモーターは、Ｒｕ５ｓ ｅｌら（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８：２６７４．１９８２）およびｌ３ｅ ｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ　３００ニア２４．１９８２）によって記載されている 。α−因子分泌リーダー配列は、異種タンパク質の分泌を促進するもので、プロ モーターと発現すべき構造遺伝子の間に挿入することができる。例えば、Ｋｕｒ ｊａｎら。A preferred yeast vector is p[JC 18-derived DNA sequence (A, mp' gene and origin of replication), and glucose Yeast DN containing repressible ADH2 promoter sequence and α-factor secretion leader sequence It can be constructed using the A sequence. AD H2 promoter is Ru5s el et al. (J, Biol, Chem, 258:2674.1982) and l3e As described by Ier et al. (Nature 300 Near 24.1982) . The α-factor secretion leader sequence promotes the secretion of foreign proteins. It can be inserted between the motor and the structural gene to be expressed. For example, Kur Jan et al.

Ｃｅ１ｌ　３０：９３３．１９８２、およびＢｉｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ。Ce1l 30:933.1982, and Bitter et al., Proc. Nat. l.

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１：５３３０，１９８４を参照されたい。リーダ ー配列を、３゛末端近傍で、１つまたはそれ以上の利用可能な制限酵素部位を含 むように修飾し、リーダー配列の外来遺伝子への融合を促進させるようにするこ ともできる。See Acad, Sci, USA 81:5330, 1984. leader -sequence containing one or more available restriction enzyme sites near the 3' end. The leader sequence can be modified to promote the fusion of the leader sequence to a foreign gene. Can also be done.

酵母形質転換のための適切なプロトコールは、当業者に知られている；具体的的 技術はＨｉ　ｎ　ｎ　ｅ　ｎらによって記載されている（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１ ．Ａｃａｄ。Suitable protocols for yeast transformation are known to those skilled in the art; The technique is described by Hinn et al. (Proc, Nat 1 ．． Acad.

Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　７５　：１９２９．　１９７８）　。Ｔｒｐ’″形質転換体 については、０．６７％酵母窒素塩基、０．５％カゼアミノ酸、２％グルコース 、１０μｇ／ｍｌ　アデニン、および２０μｇ／ｍｌ　ウラシルを含む選択培地 中で、またはＵＲＡ＋形質転換体については、０．６７％ＹＮＢを含む培地中で 選択を行い、その際、アミノ酸および塩基についてはＳｈｅｒｍａｎらによって 記載されているものが使用できる（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａ ｎｕａｌ　ｆ。Sci, USA 75:1929. 1978). Trp''' transformant For: 0.67% yeast nitrogen base, 0.5% casein amino acids, 2% glucose , 10 μg/ml adenine, and 20 μg/ml uracil. or for URA+ transformants, in medium containing 0.67% YNB. Selection was made for amino acids and bases according to Sherman et al. Those listed can be used (Laboratory Course Ma nual f.

ｒ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８６）。r Methods in Yeast Genetics, Cold Spr ing Harbor Laboratory, Co1d Spring Ha rbor, New York, 1986).

ＡＤＨ２プロモーターを含むベクターで形質転換された宿主菌株を、８０μｇ／ ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルを加えた、１％酵母エキストラクト 、２％ペプトン、並びに、１％若しくは４％グルコースを含む富栄養培地中で、 発現のために増殖させることができる。培地中のグルコースが枯渇すると、ＡＤ Ｈ２プロモーターの脱抑制がおこる。未精製の酵母上清を濾過によって回収し、 さらに精製を行うまで４℃で保存する。A host strain transformed with a vector containing the ADH2 promoter was added at 80 μg/ 1% yeast extract with ml adenine and 80 μg/ml uracil , 2% peptone, and 1% or 4% glucose in a rich medium containing can be propagated for expression. When glucose in the medium is depleted, AD Derepression of the H2 promoter occurs. The unpurified yeast supernatant was collected by filtration, Store at 4°C until further purification.

種々の哺乳類細胞または昆虫細胞の培養系を有効に用いて、組換えタンパク質を 発現させることもできる。哺乳動物細胞中で組換えタンパク質を発現させること は特に好ましい。それは、このようなタンパク質が、一般に、正確に折り畳まれ 、適切に修飾され、そして完全に機能するからである。適切な哺乳類宿主細胞の 例としては、サル腎臓細胞のＣＯ３−７系（Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｃｅ　Ｉ　ｌ　２ ３：１７５．　１９８１）、並びに、例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７，３Ｔ３、チャ イニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）　、ヒーラおよびＢＨＫ細胞系を含む、適切 なベクターを発現できるその他の細胞系が含まれる。哺乳類発現ベクターは、複 製起点、発現すべき遺伝子に結合させた適切なプロモーターおよびエンハンサ− １および、他の５′若しくは３゛側の非転写配列などの非転写要素、並びに、必 要なリポソーム結合部位、ポリアゾニレ−ジョン部位、スプライス供給および受 容部位、および、転写終結配列などのの５°若しくは３°の非翻訳配列を含む。Recombinant proteins can be produced using various mammalian or insect cell culture systems. It can also be expressed. Expressing recombinant proteins in mammalian cells is particularly preferred. It is important to note that such proteins are generally folded correctly. , properly qualified, and fully functional. of suitable mammalian host cells. An example is the CO3-7 system of monkey kidney cells (Gluzman, CeIl2 3:175. 1981), as well as, for example, L cells, C127,3T3, Cha Innie's Hamster Ovary (CHO), including HeLa and BHK cell lines, suitable Other cell lines capable of expressing vectors are included. Mammalian expression vectors are production origin, appropriate promoter and enhancer linked to the gene to be expressed 1 and other non-transcribed elements such as 5' or 3' non-transcribed sequences, as well as the necessary Necessary liposome binding sites, polyazonylation sites, splice supply and acceptance sites and 5° or 3° untranslated sequences such as transcription termination sequences.

昆虫細胞中で異種タンパク質を生産するためのバキュロウィルス系については、 ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｂｊｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６　：　 ４７　（１９８８）の総説がある。For the baculovirus system for producing heterologous proteins in insect cells, Luckow and Summers, Bjo/Technology 6: 47 (1988).

を椎動物細胞の形質転換に適用する発現ベクター中の転写および翻訳制御配列は ウィルス供給源から提供され得る。例えば、一般に使用されるプロモーターおよ びエンハンサ−はポリオーマ、アデノウィルス２．５１ｍ１ａｎ　Ｖｉｒｕｓ４ ０　（ＳＶ４０）　、およびヒトサイトメガロウィルスに由来する。ＳＶ４０ウ ィルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ複製起点、初期および後期プロモ ーター、エンハンサ−、スプライスおよびポリアゾニレ−ジョン部位を、異種Ｄ ＮＡ配列の発現に必要とされる他の遺伝子要素を提供するのに利用できる。初期 および後期プロモーターは、共に、ＳＶ４０ウィルス複製起点をも含む断片とし てウィルスから容易に得ることができるので特に有用である（Ｆ　ｉ　ｅ　ｒ　 ｓら、Ｎａｔｕｒｅ　２７３：１１３．１９７８）。ウィルス複製起点中のＨｉ ｎｄ３部位からＢｇ１１部位にわたる約２５０ｂｐ配列が含まれる限り、より短 いあるいは長いＳＶ４０断片を使用できる。さらに、哺乳類ゲノムＴＮＦＲプロ モーター、制御配列および／またはシグナル配列も、そのような制御配列が選択 された宿主細胞と適合すれば使用できる。組換え哺乳類ＴＮＲ受容体を生産する ための哺乳類高度発現ベクターの使用に関するより詳しい説明は、後述の実施例 ２および７において提供される。具体的なベクターはＯｋａｙａｍａおよびＢｅ ｒｇ（Ｍ。Transcriptional and translational control sequences in expression vectors that are applied to the transformation of vertebrate cells are It can be provided from a viral source. For example, commonly used promoters and and enhancer is polyoma, adenovirus 2.51m1an Virus4 0 (SV40), and is derived from human cytomegalovirus. SV40u DNA sequences derived from the virus genome, e.g. SV origin of replication, early and late promoters The promoter, enhancer, splice and polyazonylation sites are It can be used to provide other genetic elements required for expression of the NA sequence. initial and the late promoter are both fragments that also contain the SV40 viral origin of replication. It is particularly useful because it can be easily obtained from viruses (Fierr S et al., Nature 273:113.1978). Hi in the viral origin of replication shorter as long as it contains approximately 250 bp of sequence spanning from the nd3 site to the Bg11 site. Alternatively, longer SV40 fragments can be used. In addition, the mammalian genome TNFR protein Motors, control sequences and/or signal sequences may also be selected by such control sequences. It can be used if it is compatible with the host cell used. Producing recombinant mammalian TNR receptors A more detailed explanation of the use of mammalian high expression vectors for 2 and 7. Specific vectors are Okayama and Be rg(M.

１、ｃｅｌｌ、Ｂｉｏｌ、３：２８０．１９８３）の記載に従って構築できる。1, Cell, Biol, 3:280.1983).

哺乳類受容体ｃＤＮＡを、Ｃ１２７ネズミ補乳類上皮細胞中で恒常的に高度に発 現するのに有効な系は、実質的にＣｏｓｍａｎら（Ｍｏ１．Ｉｍｍｕｎｏｌ。Mammalian receptor cDNAs are constitutively highly expressed in C127 murine mammalian epithelial cells. Effective systems for this purpose include those described by Cosman et al. (Mo1. Immunol.

２３：９３５，１９８６）の記載に従って構築できる。23:935, 1986).

ＴＮＦＲｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターは宿主細胞ＤＮＡに安定して（Ｓｔ ａｂｌｙ）挿入される。増幅されたベクターＤＮＡを有する細胞系を選択するこ とによって、産物の発現レベルを増加させることができる。例えば、既知の薬剤 によって抑制される酵素をコードするＤＮＡ配列を含むベクターで宿主細胞を形 質転換することによって、増幅されたベクターＤＮＡを有する細胞系が選択され る。さらに、ベクターに所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含ませるこ とができる。または、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む、第二の ベクターで宿主細胞を共形質転換（ｃｏ−ｔ　ｒａｎｓ　ｆｏｒｍ）させること もできる。次に、形質転換された、または共形質転換された細胞を既知の薬剤の 濃度を増加させた中で培養し、薬剤耐性細胞を選択する。このような薬剤耐性細 胞は、薬剤によって阻害される酵素が、大抵、その酵素をコードする遺伝子が増 幅されるた結果、過剰発現することによって、毒性薬剤の濃度が増加した中でも 生き残ることができる。阻害される酵素をコードするベクターＤＮＡのコピー数 の増加によって薬剤耐性が誘導される場合、宿主細胞ＤＮＡ中の所望のタンパク 質（ＴＮＦＲ）をコードするベクターＤＮＡも同時に増幅される。The recombinant expression vector containing the TNFR cDNA is stably attached to the host cell DNA (St ably) inserted. Selecting cell lines with amplified vector DNA The expression level of the product can be increased by For example, known drugs A host cell is formed with a vector containing a DNA sequence encoding an enzyme that is inhibited by Cell lines with amplified vector DNA are selected by transformation. Ru. Furthermore, the vector can contain a DNA sequence encoding the desired protein. I can do it. Alternatively, a second protein comprising a DNA sequence encoding the desired protein. Co-transforming host cells with vectors You can also do it. The transformed or co-transformed cells are then treated with a known agent. Culture in increasing concentrations to select drug-resistant cells. Such drug-resistant microorganisms The enzyme that is inhibited by the drug is usually caused by an increase in the gene encoding that enzyme. As a result of overexpression, even when the concentration of toxic drugs increases, can survive. Copy number of vector DNA encoding the enzyme to be inhibited If drug resistance is induced by an increase in the desired protein in the host cell DNA. Vector DNA encoding TNFR is also amplified at the same time.

このような共増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のための好ましい系は 、薬剤メトトレキセ−１−（ＭＴＸ）によって阻害されるジヒドロ葉酸還元酵素 （ＤＨＦＲ）の遺伝子を使用する。共増幅を行うために、ＤＨＦＲをコードする 活性遺伝子を欠く宿主細胞を、ＤＨＦＲおよび所望のタンパク質をコードするＤ ＮＡ配列を含むベクターで形質転換するか、または、ＤＨＦＲをコードするＤＮ Ａ配列を含むベクターおよび所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むベ クターで共形質転換する。形質転換した、または共形質転換された宿主細胞を、 ＭＴＸ！度を増加させた培地中で培養し、生き残った細胞系を選択する。A preferred system for such co-amplification is , dihydrofolate reductase inhibited by the drug methotrexe-1- (MTX) (DHFR) gene is used. encode DHFR to perform co-amplification Host cells lacking active genes are transformed into DHFR and D encoding the desired protein. Transformed with a vector containing the NA sequence or a DNA encoding DHFR A vector containing the A sequence and a vector containing the DNA sequence encoding the desired protein. co-transform with vector. the transformed or co-transformed host cell, MTX! Cell lines that survive are selected by culturing in media with increasing concentrations.

特に好ましい共増幅系は、グルタミン合成酵素（ＧＳ）（反応を進めるためにＡ ＴＰからＡＤＰとリン酸への加水分解を用いて、グルタミン酸およびアンモニア の合成に関与する）の遺伝子を用いたものである。ＧＳは、例えば、メタチオネ インスルフォキシミン（ＭＳＸ）等の様々の阻害剤による阻害を受けやすい。A particularly preferred co-amplification system is glutamine synthetase (GS) (A Glutamate and ammonia using hydrolysis of TP to ADP and phosphoric acid This method uses the gene (involved in the synthesis of). GS is, for example, metathione It is susceptible to inhibition by various inhibitors such as insulinsulfoximine (MSX).

従って、ＧＳおよび所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターで 形質転換するか、または、ＧＳをコードするＤＮＡ配列を含むベクターおよび所 望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターで共形質転換して細胞を 共増幅し、宿主細胞をＭＳＸｆｉ度を増加させた培地中で培養し、生き残った細 胞系を選択することによって、ＴＮＦＲを高濃度で発現させることができる。Ｇ Ｓ共増幅系、適切な組換え発現ベクターおよび細胞系は下記のＰＣＴ出願に記載 されている：ｗ０８７１０４４６２、ＷＯ３９１０１０３６，ＷＯ３９／１０４ ０４およびＷＯ３６１０５８０７゜ ＰＣＴ出願、ＷＯ３９／１０４０４およびＷＯ３６１０５８０７に開示されてい るように、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類 宿主細胞、ＳＰ２１０−Ａｇ１４若しくはＮ３０等のマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ミ エローマ細胞系、または、ＹＢ２／３．０−Ａｇ２Ｏ等のラットミエローマ細胞 系中でＤＨＦＲまたはＧＳを共増幅させることによって、組換えタンパク質を発 現させる。Therefore, in a vector containing GS and a DNA sequence encoding the desired protein, Transformation or vectors containing GS-encoding DNA sequences and Cells are co-transformed with a vector containing a DNA sequence encoding the desired protein. Co-amplify and culture host cells in media with increased MSX fi By selecting a cell system, TNFR can be expressed at high concentrations. G S co-amplification systems, suitable recombinant expression vectors and cell lines are described in the PCT application below. Has been: w087104462, WO39101036, WO39/104 04 and WO36105807゜ Disclosed in PCT applications WO39/10404 and WO36105807 Preferably, mammalian cells such as Chinese hamster ovary (CHO) cells host cells, murine strains such as SP210-Ag14 or N30; Eloma cell line or rat myeloma cells such as YB2/3.0-Ag2O Recombinant proteins are developed by co-amplifying DHFR or GS in the system. make it appear

ＴＮＦＲＤＮＡの発現のための好ましい真核細胞ベクターは後述の実施例１に開 示されている。このベクター（ｐＣＡＶ／ＮＯＴと呼ぶ）は、哺乳類高度発現ベ クターｐＤｃ２０１に由来しており、ＳＶ４．Ｏ、アデノウィルス−２およびヒ トサイトメガロウィルス由来の制御配列を含む。Preferred eukaryotic vectors for expression of TNFR DNA are disclosed in Example 1 below. It is shown. This vector (referred to as pCAV/NOT) is a highly mammalian expression vector. SV4. O, adenovirus-2 and human Contains control sequences derived from tocytomegalovirus.

組換えＴＮＦＲの精製 精製哺乳類ＴＮＦ受容体若しくはその類縁体（ａｎａｌｏｇｓ）は、本発明のＤ ＮＡの組換え翻訳産物を発現するための適切な宿生／ベクター系を培養し、該翻 訳産物を培養培地若しくは細胞抽出物から抽出することによって調製する。Purification of recombinant TNFR Purified mammalian TNF receptor or analogs thereof can be used as D of the present invention. Cultivate a suitable host/vector system for expressing the recombinant translation product of NA and The translation product is prepared by extraction from the culture medium or cell extract.

例えば、培養培地に組換えタンパク質を分泌する系からの上清を、初めに、例え ば、Ａｍ１ｃｏｎ若しくはＭｉ　Ｉ　ｌ　１ｐｏｒｅ　Ｐｅ　Ｉ　Ｉ　１ｃｏｎ 超濾過ユニツト等の商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルターを用いて濃縮 することができる。４縮過程の後、濃縮物を適当な精製マトリックス上に適用で きる。例えば、適切なアフィニティーマトリックスは、適切な支持体に結合させ たＴＮＦ、レクチンまたは抗体分子を含むことができる。または、陰イオン交換 樹脂、例えば、吊り下がった（ｐｅｎｄａｎｔ）ジエチルアミノエチル基（ＤＥ ＡＥ）を有するマトリックスまたは物質、を使用することもできる。マトリック スは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、または、タン パク質精製に通常使用するその他のタイプのマトリックスを使用できる。または 、陽イオン交換過程を用いることもできる。適切な陽イオン交換は、スルフォブ ロピルまたはカルボキシメチル基を含む、種々の不溶性マトリックスを含む。ス ルフォプロビル基が好ましい。　最後に、ＴＮＦＲ組成物をさらに精製するため に、例えば、吊り下がったメチル基またはその他の脂肪族基を有するシリカゲル 等の疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣメディアを使用した、１回のまたはそれ以上の逆相高 速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いることができる。均一 な組換えタンパク質を得るために、前述の精製過程のいくつかまたは全てを様々 に組み合わせて適用することができる。For example, the supernatant from a system secreting recombinant protein into the culture medium is initially For example, Am1con or Mi Il 1pore Pe I I 1con Concentrate using commercially available protein concentration filters such as ultrafiltration units. can do. After the 4-condensation step, the concentrate can be applied onto a suitable purification matrix. Wear. For example, a suitable affinity matrix can be attached to a suitable support. TNF, lectin or antibody molecules. Or anion exchange Resins, such as pendant diethylaminoethyl groups (DE It is also possible to use matrices or substances with AE). matric The base may be acrylamide, agarose, dextran, cellulose, or protein. Other types of matrices commonly used for protein purification can be used. or , cation exchange processes can also be used. Suitable cation exchange is sulfob Contains various insoluble matrices, including lopyls or carboxymethyl groups. vinegar Lufoprovir group is preferred. Finally, to further purify the TNFR composition For example, silica gels with pendant methyl groups or other aliphatic groups One or more reversed phase reactions using hydrophobic RP-HPLC media such as A high performance liquid chromatography (RP-HPLC) process can be used. Uniform Some or all of the purification steps described above may be varied to obtain a recombinant protein that is Can be applied in combination.

細菌培養物中で生産された組換えタンパク質は、通常、細胞沈着物（ｐｅｌｆｅ ｔ）から初めの抽出によって単離され、続いて、−回またはそれ以上の濃縮、塩 析、水性イオン交換またはサイズ限外クロマトグラフィ一工程を行う。最後に、 最終精製工程として高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を適用することが できる。組換え哺乳類ＴＮＦＲの発現に用いた微生物細胞は、凍結融解サイクル 、超音波処理、物理的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む、所望の慣用法を用 いて破壊することができる。Recombinant proteins produced in bacterial cultures are usually isolated from cell deposits (pelfe). t) by first extraction, followed by - or more concentration, salting Perform one step of analysis, aqueous ion exchange or size ultrachromatography. lastly, High performance liquid chromatography (HPLC) can be applied as the final purification step. can. Microbial cells used for expression of recombinant mammalian TNFR were subjected to freeze-thaw cycles. using the desired conventional method, including sonication, physical disruption, or use of cell lysing agents. and can be destroyed.

哺乳類ＴＮＦＲを分泌細胞として発現する酵母の発酵は、精製を非常に簡易にす る。大量スケールの発酵によって得られた分泌組換えタンパク質を、ＵｒｄａＩ ら（Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ、２９６：１７１，１９８４）によって開示された のと類似の方法によって精製することができる。この参考文献は、準備されたＨ 　Ｐ　Ｌ　Ｃカラム上の組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの精製に、２つの連続した逆相 ＨＰＬＣ工程を用いることを記載している。Fermentation of yeast expressing mammalian TNFRs as secretory cells greatly facilitates purification. Ru. The secreted recombinant protein obtained by large-scale fermentation was purified by UrdaI (J, Chromatog, 296:171, 1984) It can be purified by a method similar to that of This reference is based on the prepared H For the purification of recombinant human GM-CSF on a PLC column, two consecutive reversed phases were used. It is described that an HPLC process is used.

組換え培養中で合成されたヒトＴＮＦＲは、タンパク質を含む非ヒト細胞構成要 素が存在し、その量と性質は培養物からヒトＴＮＦＲを回収するのに用いる精製 工程に依存する、という性質を有する。これらの構成要素は、通常、酵母、原核 若しくは非ヒト高等真核細胞に由来し、好ましくは、無害な混在量、約１重量％ 未満の単位で存在する。さらに、組換え細胞培養物は、その由来に応じて、例え ば、細胞、細胞抽出物または体液中で天然に発見されるように、通常はＴＮＦＲ に付随しているタンパク質を、含まないようにＴＮＦＲを生産することができる 。Human TNFR synthesized in recombinant culture is a protein-containing component of non-human cells. The presence, amount and nature of human TNFR can be determined by the purification process used to recover human TNFR from culture. It has the property of being process dependent. These components are usually yeast, prokaryotic or derived from non-human higher eukaryotic cells, preferably in a harmless amount of about 1% by weight Exists in units of less than Furthermore, depending on its origin, recombinant cell cultures may be For example, TNFRs are typically found naturally in cells, cell extracts, or body fluids. TNFR can be produced without containing the proteins associated with .

組換え可溶性ＴＮＦＲの治療用投与 本発明は、ＴＮＦＲ等の有効量のＴＮＦアンタゴニスト、並びに適切な希釈剤お よび担体を投与することから成る、ヒトのＴＮＦ依存性炎症反応を抑制する方法 を提供する。Therapeutic administration of recombinant soluble TNFR The present invention provides an effective amount of a TNF antagonist, such as a TNFR, as well as a suitable diluent or A method for inhibiting a TNF-dependent inflammatory response in a human comprising administering a carrier and a carrier. I will provide a.

治療のための使用には、精製された可溶性ＴＮＦＲタンパク質を患者、好ましく はヒトの関節炎の治療のために投与する。従って、例えば、可溶性ＴＮＦＲタン パク質組成物を、例えば、巨丸薬、継続点滴、インブラントからの継続的な遊離 、その他の適当な技術を用いて、関節内、腹腔内または皮下経路にによって投与 することができる。典型的には、可溶性のＴＮＦＲ治療剤は、精製タンパク質を 生理学的に受容可能な担体、補助剤または希釈剤と共に含む組成物の形で投与さ れる。このような担体は、適用される量および濃度で患者に無毒である。通常、 そのような組成物の調製は、ＴＮＦＲを緩衝剤、アスコルビン酸等の酸化防止剤 、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコー ス、スクロースまたはデキストランを含む炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート 剤、グルタチオンおよびその他の安定化剤、並びに補助剤と結合させることを内 含する。中性塩緩衝液または同種の血清アルブミンを混合した塩水は、適切な希 釈剤の具体例である。好ましくは、産物は、適切な補助剤溶液（例えば、スクロ ース〕を希釈剤として用いて凍結乾燥した形で処方される。適切な用量は試行に よって決定される。適切な産業上の標準によれば、ベンジルアルコール等の補助 剤を加えてもよい。投与の用量および頻度は、当然、治療対象の性質および重度 、所望の反応、患者の状態等の因子に依存する。For therapeutic use, purified soluble TNFR protein is administered to a patient, preferably is administered for the treatment of arthritis in humans. Thus, for example, soluble TNFR proteins Continuous release of protein compositions from, for example, bolus pills, continuous infusions, and implants. , by intra-articular, intraperitoneal or subcutaneous route using any other suitable technique. can do. Typically, soluble TNFR therapeutic agents are purified proteins. Administered in the form of a composition containing together with a physiologically acceptable carrier, adjuvant or diluent. It will be done. Such carriers are non-toxic to patients in the amounts and concentrations applied. usually, The preparation of such compositions involves combining TNFR with a buffering agent, an antioxidant such as ascorbic acid, etc. , low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides, proteins, amino acids, glucose Carbohydrates including sugar, sucrose or dextran, chelates such as EDTA glutathione and other stabilizers, as well as adjuvants. Contains. Neutral salt buffer or saline mixed with homologous serum albumin should be prepared at appropriate dilution. This is a specific example of a diluent. Preferably, the product is prepared in a suitable adjuvant solution (e.g. It is formulated in lyophilized form using a diluent (base) as a diluent. Appropriate dose requires trial Therefore, it is determined. According to appropriate industry standards, supplements such as benzyl alcohol Agents may also be added. The dose and frequency of administration will, of course, depend on the nature and severity of what is being treated. , the desired response, the patient's condition, and other factors.

ＴＮＦアンタゴニストタンパク質を、哺乳動物、好ましくはヒトに、関節炎等の ＴＮＦ依存性炎症性疾患の治療のために投与する。例えば、ＴＮＦＲＩタンパク 質はＴＮＦ依存性関節炎反応を抑制する。ＩＬ−１およびＩ　Ｌ−２の主要な機 能はＴＮＦの生産に関与するので、ＴＮＦＲをＩＬ−ＩＲおよび／または［Ｌ− ２Ｒと組み合わせて使用する、組み合わせ治療は、ＴＮＦの関与示す臨床示標の 治療に好ましいと考えられる。ヒトの治療には可溶性ヒトＴＮＦＲが好ましい。The TNF antagonist protein is administered to a mammal, preferably a human, for treatment of arthritis, etc. Administered for the treatment of TNF-dependent inflammatory diseases. For example, TNFRI protein quality inhibits TNF-dependent arthritic responses. Main features of IL-1 and IL-2 TNFR is involved in the production of TNF; When used in combination with 2R, combination therapy can reduce clinical signs of TNF involvement. considered favorable for treatment. Soluble human TNFR is preferred for human therapy.

本発明によれば、関節炎等のＴＮＦ依存性炎症性疾患を治療するために、タイプ Ｉ　ＩＬ−ＩＲまたはタイプｎ　ＩＬ−ＩＲのどちらでも、またはこれらの組み 合わせを用いることもできる。その他のタイプのＴＮＦ結合タンパク質も同様に 使用できる。According to the present invention, in order to treat TNF-dependent inflammatory diseases such as arthritis, type Either I IL-IR or type n IL-IR, or a combination of these A combination can also be used. Similarly, other types of TNF-binding proteins Can be used.

関節炎の治療のためには、ＴＮＦＲを約０．１ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋから約１０ ０ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋの範囲の全身量で投与する。本発明の好ましい態様では 、ＴＮＦＲを約０．５ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋから約５Ｑｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋの 範囲の量で投与する。局所的な関節内投与の場合は用量は、好ましくは、１回の 投与当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１．０ｍｇ／ｋｇの範囲である。For the treatment of arthritis, the TNFR should be increased from about 0.1 mg/kg/week to about 10 mg/kg/week. Administer at systemic doses in the range of 0 mg/kg/week. In a preferred embodiment of the invention , TNFR of about 0.5mg/kg/week to about 5Qmg/kg/week Administer in a range of amounts. For local intra-articular administration, the dose is preferably one It ranges from about 0.01 mg/kg to about 1.0 mg/kg per dose.

下記の実施例は本発明を説明するためのものであり、制限するためのものではな い。The following examples are intended to illustrate the invention and are not intended to limit it. stomach.

実施例 実施例１ 可溶性ヒトＴＮＦＲＩの発現と精製 ヒトＴＮＦ受容体の８０ｋＤ型のｃＤＮＡのクローニングについては詳細に記載 されている（Ｓｍｔ　ｔｈら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４８：１０１９．１９９０） 。Example Example 1 Expression and purification of soluble human TNFRI The cloning of the 80kD cDNA of human TNF receptor is described in detail. (Smt th et al., 5science 248:1019.1990) .

ＴＮＦＲｃＤＮＡクローン１を含む発現ベクターｐＣＡＶ／Ｎ０Ｔ−ＴＮＦＲ（ ＡＴＣＣ６８０８８）を用いて、可溶性ヒトＴＮＦＲＩを下記のように調製し発 現させた。Expression vector pCAV/NOT-TNFR containing TNFR cDNA clone 1 ( Soluble human TNFRI was prepared and released using ATCC 68088) as follows. Made it appear.

制限酵素ＮｏｔｌおよびＰｖｕ２を用いてｐＣＡＶ／Ｎ０Ｔ−ＴＮＦＲから８４ ０ｂｐ断片を切り出すことによって、可溶性ＴＮＦＲＩ△２３５（配列番号１の アミノ酸配列２２−２３５を有する一次翻訳産物）をコードするｃＤＮＡを構築 した。ＮｏｔｌはｐＣＡＶ／Ｎ０Ｔ−ＴＮＦＲのマルチクローニング部位を切断 し、Ｐｖｕ２は細胞膜貫通領域の２０ヌクレオチド５′側であるＴＮＦＲコード 領域中を切断する。ＴＮＦＲ配列の３゛末端を再構築するために、２オリゴヌク レオチドを合成し、配列番号１のアミノ酸残基２２９−２３５に相当するアミノ 酸残基をコードする下記のオリゴヌクレオチドリンカーを生成するために結合さ せた。84 from pCAV/NOT-TNFR using restriction enzymes Notl and Pvu2. By excising a 0 bp fragment, soluble TNFRIΔ235 (SEQ ID NO: 1) Construction of a cDNA encoding the primary translation product (having the amino acid sequence 22-235) did. Notl cleaves the multiple cloning site of pCAV/NOT-TNFR However, Pvu2 encodes the TNFR code, which is 20 nucleotides 5' of the transmembrane region. Cut through the area. To reconstruct the 3′ end of the TNFR sequence, two oligonucleotides were added. Reotide was synthesized and the amino acids corresponding to amino acid residues 229-235 of SEQ ID NO: 1 were synthesized. conjugated to generate the oligonucleotide linker below encoding an acid residue. I set it.

このオリゴヌクレオチドリンカーは、末端Ｐｖｕ２およびＢｇ１２制限酵素部位 を有し、ＴＮＦＲの２０ヌクレオチドを再生し、終始コドン（下線部）およびＢ ａｍＨ１制限酵素部位（Ｎｏｔ　１／ＢａｍＨ１消化によって完全な可溶性ＴＮ ＦＲを単離するのに便利なように設けた）。このオリゴヌクレオチドを８４０ｂ ｐ　Ｎｏｔ　ｌ／Ｐｖｕ２　ＴＮＦＲ挿入断片と共にＢｇ１２／Ｎｏｔｌ切断し たｐＣＡＶ／ＮＯＴに結合し、ｐｓｏｌｈｕＴＮＦＲ△２３５／ＣＡＶ／ＮＯＴ を作成した。これを上述したようにＣ０８−７細胞に形質転換した。宿主細胞は アミノ酸配列１−２３５の配列を有する、ＴＮＦに結合できる成熟可溶性ヒトＴ ＮＦＲＩタンパク質を発現した。This oligonucleotide linker has terminal Pvu2 and Bg12 restriction enzyme sites. , regenerates 20 nucleotides of TNFR, and closes the stop codon (underlined) and the B amH1 restriction enzyme site (Not1/BamH1 digestion completes soluble TN) (provided for convenience in isolating FR). This oligonucleotide is 840b pNotl/Pvu2 Bg12/Notl was cleaved together with the TNFR insert fragment. psolhuTNFRΔ235/CAV/NOT It was created. This was transformed into C08-7 cells as described above. host cells are Mature soluble human T capable of binding TNF, having the amino acid sequence 1-235 NFRI protein was expressed.

実施例２ 可溶性ヒトＴＮＦＲ／Ｆｃ融合タンパク質の構築と発現図１に、組換え可溶性ヒ トＴＮＦＲ：Ｆｃ発現ベクターの構築を表す概略図を示す。ｒｈｕ　ＴＮＦＲ： Ｆｃ融合遺伝子は、商業的に入手可能なりローニングベクターであるＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔ　（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に以下の断片を結合するこ とによって作成した；１）欠損を有する（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＴＮＦＲをコー ドするｃ　ＤＮＡを含む、ｐＣＡＶ／Ｎ０Ｔ−ＴＮＦＲ（ＡＴＣＣ６８０８８） 由来の８６７ｂｐＡｓｐ７１８−Ｐｖｕ２断片。Example 2 Construction and expression of soluble human TNFR/Fc fusion protein. A schematic diagram depicting the construction of a TNFR:Fc expression vector is shown. rhu TNFR: The Fc fusion gene is commercially available in the loning vector Blues cipt (registered trademark) (Stratagene) by combining the following fragments. 1) Coding the truncated TNFR. pCAV/N0T-TNFR (ATCC68088) The 867 bp Asp718-Pvu2 fragment derived from.

２）ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分の２３２アミノ酸をコードするプラスミドｐＩ　Ｘ Ｙ４９８由来の７００ｂｐ　５ｔｙｌ−３ｐｅｌ断片。プラスミドｐｒｘｙ４９ ８は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片を含む酵母発現ベクターである（図２参照）。2) Plasmid pIX encoding 232 amino acids of the Fc portion of human IgG1 700bp 5tyl-3pel fragment derived from Y498. plasmid prxy49 8 is a yeast expression vector containing an Fc fragment of human IgG1 (see FIG. 2).

３）欠損ＴＮＦＲをヒトＩｇＧＩ　Ｆｃ断片に結合するためのオリゴヌクレオチ ドリンカー。該リンカ−は、以下の２つのプライマーを用いたＰＣＲ（複製連鎖 反応）増幅によって作成された。プライマーの１つは、欠損ＴＮＦ受容体の３′ 末端およびヒト［ｇＧｌの５°末端をコードする配列ＣＣＣＣＡＧＣＴＧＡＡＧ ＧＧＡＧＣＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡ ＣＴＣ（配列番号３の８３３−８８３） を有し、もう一方のプライマーは、ヒトＩｇＧ１のヌクレオチド２５７−２３７ をコードするアンチセンス配列 ＣＧＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧＴＴＡＣＴＧＣ（配列番号５）を有する。本反 応の鋳型はｐｌＸＹ４９８であった。反応産物をＰｖｕ２および５ｔｙｉで消化 し、１１５ｂｐの断片を単離した。3) Oligonucleotide for binding defective TNFR to human IgGI Fc fragment drinker. The linker was created using PCR (replication chain reaction) using the following two primers. reaction) created by amplification. One of the primers is 3′ of the defective TNF receptor. end and the sequence encoding the 5° end of human [gGl CCCCAGCTGAAG GGAGCACTGGCGACGAGCCCAAATCTTGTGACAAA CTC (833-883 of SEQ ID NO: 3) and the other primer contains nucleotides 257-237 of human IgG1. antisense sequence encoding CGGTACGTGCTGTTGTTACTGC (SEQ ID NO: 5). Hontan The corresponding template was plXY498. Digest the reaction products with Pvu2 and 5tyi A 115 bp fragment was isolated.

この構築物をＮ０ｔｌで消化し、ｒｈｕＴＮＦＲ：Ｆｃ融合ＤＮＡ配列を有する 得られた１、４キロベ一ス断片をプラスミドＣＡＶ／ＮＯＴ／ＤＨＦＲのＮ。This construct was digested with N0tl and contained the rhuTNFR:Fc fusion DNA sequence. The obtained 1 and 4 kilobase fragments were added to the N of plasmid CAV/NOT/DHFR.

ｔ１部位に結合させた。プラスミドｐＣＡＶ／ＮＯＴ／ＤＨＦＲＩ；！、ｐＣＡ Ｖ／ＮＯＴのＨｐａ１部位にハムスターンヒドロ葉酸還元酵素ＤＮＡ配列（ＤＨ ＦＲ）を挿入させることによって、プラスミドｐＣＡＶ／Ｎｏｒから得られた（ 図２）。It was attached to the t1 site. Plasmid pCAV/NOT/DHFRI;! , pCA The hamstern hydrofolate reductase DNA sequence (DH FR) was obtained from plasmid pCAV/Nor by inserting ( Figure 2).

この構築物をプラスミドｐＣＡＶＤＨＦＲｈｕＴＮＦＲＦｃと名付けた。完全コ ード領域配列はＤＮＡ配列決定によって確認され、図２に描かれている。This construct was named plasmid pCAVDHFRhuTNFRFc. complete The code region sequence was confirmed by DNA sequencing and is depicted in FIG.

宿主細胞系を調製するために、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の発現を欠失 するＤＸＢ−１１ＣＨＯ細胞をコロンビア大学のＬａｗｒｅｎ　Ｃｈａｓｉｎ博 士から得た。これらの細胞の１００バイアルの銀行が確立され、代表的なノくイ アルが以下の工程に従って検査を行うためにＭｆｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＡ ｓｓｏｃｉａｔｅｓに送られた。To prepare host cell lines, expression of dihydrofolate reductase (DHFR) is deleted. DXB-11CHO cells were collected by Dr. Lawrence Chasin of Columbia University. I got it from a master. A bank of 100 vials of these cells was established and a representative cell MfcrobiologicalA to perform the test according to the following steps. sent to ssociates.

ミニ上　懸 １、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）　タイプＡのみ２、繁殖−細菌および真菌　陰 性 感染および増幅工程は全て、本目的のために準備された隔離された実験室で行わ れた。マイコプラズムを含まない細胞系のみが本施設に導入された。Mini top hanging 1. Transmission electron microscope (TEM) type A only 2. Propagation - bacteria and fungi - shade sex All infection and amplification steps are performed in an isolated laboratory set up for this purpose. It was. Only mycoplasm-free cell lines were introduced into our facility.

感染は、ｐＣＡＶＤＨＦＲｈｕＴＮＦＲＦｃプラスミドＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃ ｔｉｎ（登録商ＩＩ）（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）と混合することによって行われた 。Infection was carried out using Lipofec pCAVDHFRhuTNFRFc plasmid DNA. tin (Registered Trademark II) (Gibco BRL) .

約１０〉ｇのＤＮＡ−１−ＣＨＯＤＸＢ−１１細胞を含むｌＱｃｍへトリ皿に添 加した。初めの感染の後、グリシン、ヒポキサンチン、チミジンを欠失する選択 培地中でサブ培養することによってＤＨＦＲ発現を行う細胞を選択した。続いて 、得られたコロニーを２４穴プレートに移し、ｒｈｕ　ＴＮＦＲ：Ｆｃ発現につ いて分析した。最も発現の多い培養物をメトトレキセート（ＭＴＸ）濃度を増加 させた環境にさらすことによって増殖させた。２５ｎＭＭＴＸで増殖できる細胞 を９６穴プレート中の限界希釈によってクローン化した。最も発現の多いクロー ンを懸濁培養に移し、これらの条件下で最もｒｈｕ　ＴＮＦＲ：Ｆｃ発現レベル が高いということを基準として、最終的にクローン４−４ＦＣ１０２Ａ５−３を 選択した。Add about 10〉g of DNA-1-CHODXB-11 cells to a lQcm bird dish. added. After initial infection, selection for deletion of glycine, hypoxanthine, and thymidine Cells expressing DHFR were selected by subculturing in culture medium. continue The resulting colonies were transferred to a 24-well plate and assayed for rhu TNFR:Fc expression. and analyzed it. The highest expressing cultures were treated with increasing methotrexate (MTX) concentrations. It was propagated by exposing it to a controlled environment. Cells that can grow with 25nMMTX were cloned by limiting dilution in 96-well plates. The most expressed clone cells into suspension culture, and under these conditions the highest rhu TNFR:Fc expression levels Clone 4-4FC102A5-3 was finally selected based on the high Selected.

実施例３ ＣＨＯ細胞中でのモノマー可溶性ＴＮＦ受容体の発現グルタミン合成酵素（ＧＳ ）遺伝子増幅系を用い、実質的にＰＣＴ特許出願Ｎｏｓ、ＷＯ３７１０４４６２ およびＷＯ３９１０１０３６の記載に従って、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃ ）（Ｏ）細胞中で可溶性ＴＮＦ受容体を発現させた。Example 3 Expression of monomeric soluble TNF receptors in CHO cells ) Using a gene amplification system, substantially PCT patent application No. WO37104462 and Chinese hamster ovary (C) as described in WO39101036. ) (O) Soluble TNF receptors were expressed in cells.

簡単に述べると、ＣＨＯ細胞をＴＮＦＲとＧＳの双方を含む発現ベクターで感染 させる。低レベルのメチオニンスルフォキシミン（ＭＳＸ）への耐性を与える感 染ＤＮＡの能力を指標にＧＳ遺伝子を発現する細胞を選択する。このような細胞 中でＧＳ配列が増幅されているものについては、ＭＳＸ濃度を増加させたものを 用いて選択する。このようにして隣接するＴＮＦＲ配列も増幅され、ＴＮＦＲの 発現を増加させることができる。Briefly, CHO cells were infected with an expression vector containing both TNFR and GS. let Sense of tolerance to low levels of methionine sulfoximine (MSX) Cells expressing the GS gene are selected using the ability of the dyed DNA as an indicator. cells like this For those in which the GS sequence has been amplified, those with increased MSX concentration are used. Select by using In this way, the adjacent TNFR sequences are also amplified, and the TNFR sequence is amplified. Expression can be increased.

ＧＳ発現系で用いられたベクターはｐｓｏ　ＩＴＮＦＲ／Ｐ６／ＰＳＶＬＧＳで あり、これは以下のようにして構築された。まず初めに、ベクターｐＳＶＬＧ５ ゜１　（ＰＣＴ出願　Ｎｏｓ、ＷＯ３７１０４４６２およびＷＯ３９１０１０３ ６に記載されており、Ｃｅ１ｌｔｅｃｈ、Ｌｔｄ、、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅより入 手可能）をＢａｍＨ１制限酵素で切断し、ベクターが自己内で再結合するのを防 止するためにラン腸アルカリホスファターゼ（（ｊＡＰ）で脱リン酸化した。ｐ ＳｖＬＧＳ、１のＢａｍＨ１切断断片を、ｐＥＥ６ｈＣＭＶ　（ＰＣＴ出願　Ｎ ｏ、Ｗ０８９１０１０３６に記載されており、同様にＣｅ１ｌｔｅｃｈより入手 可能）のＢａｍＨｌ−Ｂｇ１２断片（２つの断片が似た大きさになるのを避ける ために８ｇ１２、ＢａｍＨｌおよびＦｓｐｌで切断しである）に結合さ也１１． ２ｋｂのベクターｐ６／５ＶＬＧＳ、１を作成した。ｐＳＶＬＧＳ、１はＳＶ４ ０後期プロモーター支配下でグルタミン合成酵素を選択できるマーカーを含んで いる。The vector used in the GS expression system was pso ITNFR/P6/PSVLGS. There is, and it was built as follows. First of all, vector pSVLG5 ゜1　(PCT application Nos, WO37104462 and WO3910103 6 and is available from Ce1ltech, Ltd., Berkshire. ) is cut with BamH1 restriction enzyme to prevent the vector from religating within itself. It was dephosphorylated with orchid intestinal alkaline phosphatase ((jAP)) to The BamH1 cleavage fragment of SvLGS, 1 was converted into pEE6hCMV (PCT application N o, described in W089101036, also obtained from Ce1ltech possible) BamHl-Bg12 fragment (avoid the two fragments being of similar size) 8g12, which is cleaved with BamHl and Fspl) is also attached to 11. A 2kb vector p6/5VLGS, 1 was created. pSVLGS, 1 is SV4 Contains a marker that allows selection of glutamine synthetase under the control of the 0 late promoter. There is.

ｐＥＥ６ｈＣＭＶのＢａｍＨｌ−ＢｇＩ　２断片は、ヒトサイトメガロウィルス 主要即時型初期プロモーター（ｈＣＭＶ）　、ポリリンカーおよびＳＶ４０初期 ポリアゾニレ−ジョンシグナルを含む。発現ベクターｐｓｏ　ＩＴＮＦＲ／ＣＡ ＶＮＯＴ（実施例３の上述の記載に従って作成）からＮｏｔ　１−ＢａｍＨ１断 片を切り出し、クレーノー酵素で平滑末端化し、脱リン酸化されたＳｍａ１切断 ｐ６／５ＶＬＧＳ、１と結合し、それにより５ｏｌＴＮＦＲコ一ド配列をｈＣＭ Ｖプロモーターの支配下におくことによって、可溶性ＴＮＦＲのコード配列をｐ 　６／５ＶＬＧＳ、１に付加した。こうして、１つのプラスミドベクター内で、 ＳＶ４０／ＧＳとｈＣＭＢ／ｓｏ　ＩＴＮＦＲ転写単位が反対方向に転写される ものが得られた。このプラスミドをｐｓｏ　ＩＴＮＦＲ／Ｐ６／ＰＳＶＬＧＳと 名付けた。The BamHl-BgI 2 fragment of pEE6hCMV is derived from human cytomegalovirus. Major immediate early promoter (hCMV), polylinker and SV40 early Contains a polyazonylation signal. Expression vector pso ITNFR/CA Not1-BamH1 cut from VNOT (prepared as described above in Example 3) The pieces were cut out, blunt-ended with Klenow enzyme, and dephosphorylated Sma1 cleaved. p6/5VLGS, 1, thereby converting the 5ol TNFR cod sequence into hCM By placing the coding sequence of soluble TNFR under the control of the pV promoter, Added to 6/5 VLGS, 1. Thus, within one plasmid vector, SV40/GS and hCMB/so ITNFR transcription units are transcribed in opposite directions I got something. This plasmid is called psoITNFR/P6/PSVLGS. I named it.

ｐｓｏ　ＩＴＮＦＲ／Ｐ６／ＰＳＶＬＧＳを用いてＣＨＯ−Ｋｌ細胞（ＡＴＣＣ 。CHO-Kl cells (ATCC .

Ｒｏｃｈｖ　ｉ　Ｉ　Ｉ　ｅ、ＭＤから受託番号ＣＣＩ　６１）を下記のように トランスフェクトした。グルタミンを含まず、透析した１０％ウシ胎児血清（Ｇ ｉｂｃｏ：２２０−６３００ＡＪ）　、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓ　ｉ　 ｇｍａ）　、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ：３２０−１１４０ＡＧ）、５ ００μＭアスノくラギン酸およびグルタミン酸（Ｓｉ　ｇｍａ）並びにヌクレオ チド（３０μＭアデノソン、グアノシン、ンチジンおよびウリジン、並びに１０ μＭチミジン）（Ｓ　ｉｇｍａ）を添加した、最小栄養培地（ＭＥＭ）ＩＯＸ　 （Ｇｉｂｃｏ：３３０−１．５８１ＡＪ）中でＣＨＯ−Ｋｌ細胞の単層をサブコ ンフルエントになるまで成長させた。Accession number CCI 61) from Rochv i I I e, MD as below. transfected. Glutamine-free, dialyzed 10% fetal bovine serum (G ibco:220-6300AJ), 1mM sodium pyruvate (Si) gma), MEM non-essential amino acids (Gibco: 320-1140AG), 5 00 μM Asuno lagic acid and glutamic acid (Si gma) and nucleotide tide (30 μM adenosone, guanosine, antidine and uridine, and 10 Minimal nutrient medium (MEM) IOX supplemented with μM thymidine) (Sigma) (Gibco: 330-1.581AJ) by subcoating the monolayer of CHO-Kl cells. I grew it until it became fluent.

実質的にＧｒａｈａｍ＆ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５ ６（１，９８３）に記載されたように、約ｌＸｌ０’／１．０ｃｍペトリ皿の細 胞に１０μｇのｐｓｏ　ＩＴＮＦＲ，／Ｐ６／ＰＳＶＬＧＳｔ−ｉｉ１常ノリン 酸カルシウム沈殿法を用いてトランスフェクトした。実質的にＦｒｏｓ　ｔ＆Ｗ ｉ　Ｉ　ｌ　ｉａｍｓ。Virtually Graham & van der Eb, Virology 52:45 6 (1,983); 10μg of psoITNFR,/P6/PSVLGSt-ii1 Transfection was performed using the acid calcium precipitation method. Practically Fros t&W i　I　　iams.

Ｖｉ　ｒｏｌｏｇｙ　９１　：３９　（１９７８）に記載されたように、トラン スフェクトからおよそ４時間後に細胞にグリセロールショックを与え（非血清培 養培地中１５％グリセロールを約１．５分間）、非血清培地で洗浄した。１日後 、トランスフェクトした細胞に、最終濃度が２５μＭとなるようにＭＳＸを含ん だ新たな選択培地によって乗置を与えた。ＭＳＸ耐性の生存細胞のコロニーは３ −４週間で可視化した。生存コロニーを２４穴プレートに移し、選択培地中でコ ンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）になるまで増殖させた。コンフルエントな ウェル由来の馴化培地を、標準的な結合分析を用いて可溶性ＴＮＦＲ活性につい て分析した。これらの分析はコロニーは生物学的に活性な可溶性ＴＮＦＲを発現 することを示した。As described in Virology 91:39 (1978), Approximately 4 hours after infection, the cells were subjected to glycerol shock (in non-serum medium). 15% glycerol in nutrient medium for approximately 1.5 minutes) and washed with serum-free medium. 1 day later , transfected cells containing MSX to a final concentration of 25 μM. Transplants were given with fresh selection medium. There are 3 colonies of viable MSX-resistant cells. -Visualized at 4 weeks. Transfer viable colonies to 24-well plates and incubate in selection medium. The cells were grown until confluent. confluent Conditioned medium from the wells was assayed for soluble TNFR activity using standard binding assays. It was analyzed. These analyzes indicate that colonies express biologically active soluble TNFR. It was shown that

ＧＳ遺伝子増幅について選択するために、いくつかのＭＳＸ耐性細胞系をｐｓｏ 　ＩＴＮＦＲ／Ｐ６／ＰＳＶＬＧＳでトランスフェクトし、種々の濃度のＭＳＸ 中で増殖させる。各細胞系について、約ｌＸ１０’の細胞を、１００μＭ１２５ ０μＭ、５００μＭおよび１．ｍＭと徐々に濃度を増加させたＭＳＸを含む中に プレートし、１０−１４日間インキュベートする。１２日後、高濃度のＭＳＸに 耐性なコロニーが現れる。生存コロニーのＴＮＦＲ活性について分析する。これ らの耐性の強い細胞系はそれぞれ、複数の独立した増幅事象によって生じた細胞 を含んでいる。これらの細胞系から、１つまたはそれ以上の最も耐性の細胞系を 単離する。続いて、高い生産率を有する増幅された細胞を限界希釈クローニング によって単離する。トランスフェクト細胞の大量細胞培養は活性な可溶性ＴＮＦ Ｒを分泌する。To select for GS gene amplification, several MSX-resistant cell lines were pso Transfected with ITNFR/P6/PSVLGS and various concentrations of MSX grow inside. For each cell line, approximately lX10' cells were incubated with 100 μM 125 0 μM, 500 μM and 1. Containing MSX at increasing concentrations from mM to Plate and incubate for 10-14 days. After 12 days, high concentration of MSX Resistant colonies emerge. Surviving colonies are analyzed for TNFR activity. this Each of these highly resistant cell lines is derived from multiple independent amplification events. Contains. From these cell lines, select one or more of the most resistant cell lines. isolate Subsequently, limiting dilution cloning of the amplified cells with high production rates isolated by Large-scale cell cultures of transfected cells contain active soluble TNF. secretes R.

実施例４ ラット中の抗体誘導関節炎に対する可溶性ＴＮＦＲの効果あらかじめ完全Ｆｒｅ ｕｎｄアジュバント中のメチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）で免疫化した Ｌ　ｅ　ｗ　ｉ　ｓラットは、膝詰合部をｍＢＳＡが攻撃すると、抗体誘導性関 節炎（Ａ　Ｉ　Ａ）が引き起こされる。ｒｈｕ　ＴＮＦＲ：Ｆｃ５ＴＮＦＲモノ マー、組替えネズミ可溶性ｒＬ−１受容体（ｒｍ　ＴＬ−ＩＲ）、またはＴＮＦ ＲモノマーとｒｍｌＬ−ＩＲの組み合わせの投与は、ラットの抗体誘導性関節炎 の効果を抑制するのに有効であることが示された。Example 4 Effect of soluble TNFR on antibody-induced arthritis in rats. und immunized with methylated bovine serum albumin (mBSA) in adjuvant. When rats are attacked with mBSA at the knee joint, antibody-induced Arthritis (AI) is caused. rhu TNFR: Fc5 TNFR mono mer, recombinant murine soluble rL-1 receptor (rmTL-IR), or TNF Administration of the combination of R monomer and rmlL-IR inhibited antibody-induced arthritis in rats. It was shown to be effective in suppressing the effects of

Ｌｅｗｉｓラットを完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント中Ｑ、５ｍｇ　ＢＳＡで後側 腹部（ｈ　ｉｎｄ　ｆ　］　ａｎｋ）において免疫化した。２１日後（第０日と する）、動物の両方の後部膝詰合部（ｊｏｉｎｔ）に発熱源を含まない塩水中の ５０μｇＢＳＡを投与した。下記の表Ａに示すように、６匹のラットのグループ を、その日および続く２日間（第０，１および２日）両方の膝詰合部に関節内投 与した表Ａ １　ｒｈｕ　ＴＮＦＲ／Ｆｃ　１０μｇ２　ｒｂｕ　ＴＮＦＲ／Ｆｃ　５μｇ ３ｒｍｕｌＬ−１受容体　１μｇ ４　ＴＮＦＲモノマー　５μｇ ５　ＴＮＦＲモノ？−／ｒｍｕ　［、−１１０μｇ／ｌμｇ６　希釈剤（塩水） 膝詰合部の幅を治療ｉ＆０−６日に毎日測定した。ＴＮＦＲモノマーは実施例２ に従ってＣＨＯ細胞中で作成した。本実験において使用したｒｈｕ　ＴＮＦＲ・ ＦｃはＢＨＫ　（ハムスター腎臓）細胞中で生産した。この材料はＣＨＯ細胞由 来ＴＮＦＲに類似している。Lewis rats were placed dorsally with Q, 5 mg BSA in complete Freund's adjuvant. Immunizations were made in the abdomen (hindf]ank). After 21 days (day 0 and ), and placed both rear joints of the animal in saline water without a heat source. 50 μg BSA was administered. Groups of 6 rats as shown in Table A below was administered intra-articularly to the knee joint on both that day and the following two days (days 0, 1 and 2). given table A 1 rhu TNFR/Fc 10μg2 rbu TNFR/Fc 5μg 3rmulL-1 receptor 1μg 4 TNFR monomer 5μg 5. TNFR thing? -/rmu [, -110μg/lμg6 Diluent (salt water) The width of the knee joint was measured daily on treatment days i & 0-6. TNFR monomer is Example 2 was produced in CHO cells according to the method. rhu TNFR used in this experiment Fc was produced in BHK (hamster kidney) cells. This material is derived from CHO cells. It is similar to TNFR.

図３および４は、ｍＢＳＡ攻撃時および攻撃に続く２日間、ＢＨＫ由来ｒｈｕＴ ＮＦＲ：Ｆｃを用いた治療を行うと、希釈剤で治療したコントロールラットと比 較して膝詰合部の腫れ（ｓｗｅ　Ｉ　Ｉ　ｉｎｇ）が小さくなったことを示す。Figures 3 and 4 show BHK-derived rhuT during mBSA challenge and for 2 days following challenge. Treatment with NFR:Fc resulted in an increase in This shows that the swelling (sweIing) at the knee joint area has become smaller.

結合部の腫れおよび炎症の減少は、５若しくは１０μｇ　ＢＨＫ由来ｒｈｕ　Ｔ ＮＦＲＦｃまたは５μｇ　ＴＮＦＲモノマーまたは１μｇ　ｒｍｕｌＬ−ＩＲで 治療されたラットで観察された。ｒｍｕ　Ｉ４．−ＩＲおよびＴＮＦＲモノマー 冶療を組み合わせると、結合部の腫れの減少はより促進された。Reduction of swelling and inflammation at the junction was achieved by 5 or 10 μg of BHK-derived rhu T. NFRFc or 5 μg TNFR monomer or 1 μg rmulL-IR observed in treated rats. rmu I4. -IR and TNFR monomers Combining therapy was more effective in reducing swelling at the junction.

第６日に回収された結合部の組織病理学的検査を行い、腫れの度合いを確認した 。下記のように、膝詰合部の評価およびそれらの状態のスコアーを付けることに よって組織病理値を出したニ グレード１　最小、く１０％の領域が冒されているグレード４　最大、全領域が 酷く冒されている５つの膝結合構造を含む種々の欠失／変異を評価し、た、関節 包（ｊｏｉｎｔ　ｃａｐｓｕｌｅ）、関節スペース（ｊｏｉｎｔ　５ｐａｃｅ） 、滑層（ｓｙｎｏｖｉａｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）、関節軟骨（ａｒｔｉｃｕｌａ ｒ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ）および肋軟骨下の骨（ｓｕｂｃｈｏｎｄｒａｌ　ｂｏ ｎｅ）ｏそれぞれの構造上の変異を１−４に評価し、スコアーを加え平均を計算 した。組織病理学の結果は各治療グループ中の平均スコアーとして表される。A histopathological examination of the junction recovered on the 6th day was performed to confirm the degree of swelling. . To evaluate knee joints and score their condition as described below: Therefore, the tissue pathological value was Grade 1: Minimum, 10% area affected; Grade 4: Maximum, all areas affected. We evaluated various deletions/mutations involving five severely affected knee joint structures and joint capsule, joint space (joint 5 pace) , synovial membrane, articular cartilage r cartilage) and subchondral bone ne) o Evaluate each structural variation from 1 to 4, add the scores and calculate the average. did. Histopathology results are expressed as mean scores within each treatment group.

下記の表Ｂは組織病理学の結果を表すが、この結果は、ｒｈｕ　ＴＮＦＲ：Ｆｃ 。Table B below represents the histopathology results, which indicate that rhu TNFR:Fc .

ＴＮＦＲモノマーおよびｒｍｕ　ＩＬ−ＩＲは抗体誘導性関節炎の重度を減少さ せるのに有効であり、並びにｒｍｌＬ−ＩＲとＴＮＦＲモノマーの組み合わせは 各受容体単独よりもより有効であったことを示す。TNFR monomer and rmuIL-IR reduce the severity of antibody-induced arthritis. and the combination of rmlL-IR and TNFR monomers indicating that it was more effective than each receptor alone.

表Ｂ １．０μｇ　ｒｍｕ　１Ｌ−ＩＲ１３，１±４．７（１，７）　８１０．０μｇ 　ＴＮＦＲモノマー　１２．８±３．１（１，１）　８１０μｇ　ｒｍｕ　ＴＬ −ＩＲ ＋１０、ＯμｇＴＮＦＲモ／ｖ−７，９＋　５．２（２，０）　５５、　Ｏｔｌ ｇ　ＴＮＦＲ−Ｅ／７−　１．３．４＝！＝　２．８（１，０）　９５、Ｏｕｇ 　ｒｈｕ　ＴＮＦＲ：Ｆｃ　１３．４±３．６（１，３）　８（ＢＨＫ） まとめると、ｍＢＳＡ攻撃時および攻撃に続く２日間、ｒｈｕ　ＴＮＦＲ：Ｆｃ 。Table B 1.0μg rmu 1L-IR13,1±4.7(1,7) 810.0μg TNFR monomer 12.8±3.1 (1,1) 810μg rmu TL -IR +10, Oμg TNFR mo/v-7,9+ 5.2 (2,0) 55, Otl g TNFR-E/7- 1.3.4=! = 2.8 (1,0) 95, Oug rhu TNFR: Fc 13.4±3.6 (1,3) 8 (BHK) In summary, during the mBSA attack and for the 2 days following the attack, rhu TNFR:Fc .

ＴＮＦＲモノマーまたはｒｍｕ　ＩＬ−ＩＲを用いた治療を行うと、希釈剤で治 療したコントロールラットと比較して膝詰合部の腫れ小さくなった。ｒｍｕ　Ｉ Ｌ−ＩＲとＴＮＦＲモノマーの双方の組み合わせは、各受容体単独よりも腫れを より減少させた。組織病理学的結果は、ｒｈｕ　ＴＮＦＲ：Ｆｃ、ＴＮＦＲモノ マーおよびｒｍｕ　ＩＬ−ＩＲは抗体誘導性関節炎の重度を減少させるのに有効 であり、並びにｒｍｌＬ−ＩＲとＴＮＦＲモノマーの組み合わせは各受容体単独 よりもより有効であったことを示した。Treatment with TNFR monomer or rmu IL-IR can be cured with diluents. The swelling at the knee joint was reduced compared to treated control rats. rmu　I The combination of both L-IR and TNFR monomers causes more swelling than each receptor alone. decreased further. Histopathological results showed rhu TNFR:Fc, TNFR mono Mu and rmu IL-IR are effective in reducing the severity of antibody-induced arthritis , and the combination of rmlL-IR and TNFR monomers corresponds to each receptor alone. showed that it was more effective than

実施例５ ＢＩＯ，ＲＩＩ［マウス中のコラーゲン誘導性関節炎に対する可溶性ＴＮＦＲの 効果あらかじめ完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント中のブタタイプ■コラーゲン（Ｃ ＩＩ）で免疫化したＢ　１０．　Ｒｍマウスは、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩ Ａ）力躬ｌき起こされる。ｒｈｕ　ＴＮＦＲ・Ｆｃの投与がマウスのＣＩＡの兆 候を抑制するのに有効であることが示された。Example 5 BIO, RII [Soluble TNFR against collagen-induced arthritis in mice] Effect Pig type collagen (C) in complete Freund adjuvant B immunized with II) 10. Rm mice have collagen-induced arthritis (CI) A) Being woken up by force. Administration of rhu TNFR/Fc shows signs of CIA in mice It was shown to be effective in suppressing the symptoms.

関節炎の兆候を誘導するために、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント中の１００μｇ ブタタイプ■コラーゲン（ＣＨＩ）でＢ１０．Ｒｍマウスを皮下内に免疫化した 。100 μg in complete Freund's adjuvant to induce signs of arthritis Pig type ■Collagen (CHI) B10. Rm mice were immunized subcutaneously. .

免疫化後約１４−１７日で、関節炎の臨床上の兆候がマウスに現れ始め、２８８ 日置でには９０−１００％のマウスが重度の関節炎を示した。可溶性ＴＮＦＲ／ ＦｃのＣＩＡに対する効果を調べるために、ＴＮＦＲ／ＦｃまたはＰＢＳをマウ スに腹腔内投与した。免疫化から１２週間後、関節炎の兆候についてマウスを評 価した。Approximately 14-17 days after immunization, clinical signs of arthritis began to appear in mice, 288 At Hioki, 90-100% of the mice showed severe arthritis. Soluble TNFR/ To examine the effect of Fc on CIA, TNFR/Fc or PBS was The drug was administered intraperitoneally to patients. Twelve weeks after immunization, mice were evaluated for signs of arthritis. I valued it.

第一の実験では、ＣＩＡが発生する全期間を越える期間ＴＮＦＲ，／Ｆｃを投与 した。１２匹のマウスに１０μｇＴＮＦＲ／Ｆｃを第０日から３５日まで１週間 に３回投与した。１２匹のコントロールマウスにはＰＢＳを投与した。図５は、 ＴＮＦＲ／Ｆｃがコントロールと比較して関節炎の発病率を有意に減少させたこ とを示す。ＴＮＦＲ／Ｆｃの治療を中止するとマウスは関節炎を発生した。In the first experiment, TNFR,/Fc was administered for a period exceeding the entire period during which CIA occurred. did. 10 μg TNFR/Fc was administered to 12 mice for 1 week from day 0 to day 35. was administered 3 times. Twelve control mice received PBS. Figure 5 shows TNFR/Fc significantly reduced the incidence of arthritis compared to control. and Mice developed arthritis when TNFR/Fc treatment was discontinued.

第二の実験では、ＣＩＡの誘導過程の間のみ、即ち、免疫化に関し第１−１７日 にのみＴＮＦＲ／Ｆｃを投与した。結果を下記の表Ｃに示す。In the second experiment, only during the induction process of CIA, i.e. on days 1-17 with respect to immunization. TNFR/Fc was administered only to patients. The results are shown in Table C below.

表Ｃ ＣＩＡの誘導過程中に投与されたｒｈｕ　ＴＮＦＲ：Ｆｃの効果治療　発病率　 病気の開始　重度 （陽性／総計）　（平均日数±ＳＥ）　（平均±ＳＥ）３０μｇ　ＴＮＦＲ／Ｆ ｃ　１０／１０　２４±２　１０．５±０．５日数−１，３ １ｈｇＴＮＦＲ／Ｆｃ　８／１０　２１±２　８．６±０６１００μ＋、　Ｐ［ ３ｓ　１０／１０　１８±１　１０．６±０．４これらのデータは、ＴＮＦＲ／ Ｆｃは関節炎の開始を遅らせるが、タイプ■コラーゲンで免疫化する１日前およ び３日後に、３０μｇ　ＴＮＦＲ／Ｆｃ／１日を投与されたマウスでもＣＩＡは 変化しなかったことを示す。第一１日から第１７日まで１日置きに１０ｔ１ｇ　 ＴＮＦＲ／Ｆｃ／１日を投与されたマウスは、ＰＢＳを投与されたコントロール と比較してＣＩＡの発病率および重度にわずかな減少を示した。Table C Effects of rhu TNFR:Fc administered during the induction process of CIA Incidence rate Start of disease Severity (Positive/Total) (Average number of days ± SE) (Average ± SE) 30μg TNFR/F c 10/10 24±2 10.5±0.5 days -1,3 1hg TNFR/Fc 8/10 21±2 8.6±06100μ+, P[ 3s 10/10 18±1 10.6±0.4 These data are TNFR/ Fc delays the onset of arthritis, but 1 day before immunization with type ■ collagen and After 3 days, CIA was also reduced in mice administered 30 μg TNFR/Fc/1 day. Indicates that there has been no change. 10t1g every other day from the 11th to the 17th day Mice administered TNFR/Fc/1 day were compared to controls administered PBS. showed a slight reduction in the incidence and severity of CIA compared to CIA.

第三の実験では、ＴＮＦＲ／Ｆｃを（ｊＡの進行過程の間のみ、即ち、免疫化後 筒１４−２８日にのみ１日おきにＴＮＦＲ／Ｆｃを投与した。結果を下記の表り に示す。In the third experiment, TNFR/Fc (only during the progression of jA, i.e. after immunization) TNFR/Fc was administered every other day only on days 14-28. The results are shown below. Shown below.

表Ｄ ＣＩＡの進行過程中に投与されたｒｈｕ　ＴＮＦＲ：Ｆｃの効果治療　発病率　 病気の開始　重度 （陽性／総計）　（平均日数±ＳＥ）　（平均±ＳＥ）１ｈｇＴＮＦＲ／Ｆｃ　 ８／９　２７±６　８６±１．３日数１４−２８ （１日おき） １０ｈ１．　ＰＢＳ　９／９　２１±１　８，７±０．６日数１４−２８ （１日おき） これらの結果は、第１４日から第２８日まで１日置きに１０μｇ　ＴＮＦＲ／Ｆ ｃ／１日を投与されたマウスは、ＰＢＳを投与されたコントロールと比較してＣ ＩＡの開始がやや遅れたことを示す。しかし、関節炎の発病率および重度は変化 しないようであった。Table D Effective treatment of rhu TNFR:Fc administered during the progression of CIA, incidence rate Start of disease Severity (Positive/Total) (Average number of days ± SE) (Average ± SE) 1hg TNFR/Fc 8/9 27±6 86±1.3 days 14-28 (every other day) 10h1. PBS 9/9 21±1 8,7±0.6 days 14-28 (every other day) These results indicate that 10 μg TNFR/F was administered every other day from day 14 to day 28. Mice given c/1 day showed lower C This indicates that the start of IA was slightly delayed. However, the incidence and severity of arthritis vary. It seemed like it wouldn't.

まとめると、これらの実験は、ＴＮＦＲ／ＦｃをＣＩＡ発生の全期間を通じて投 与された場合ＣＩＡの発生を遅らせるのに有効であったことを示す。Taken together, these experiments demonstrate that TNFR/Fc is injected throughout the entire period of CIA development. This indicates that it was effective in delaying the occurrence of CIA when given.

実施例６ ＤＢＡ／Ｉ　マウス中のコラーゲン誘導性関節炎に対する可溶性ＴＮＦＲの効果 あらかじめ完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント中のブタタイプ■コラーゲン（ＣＩＩ ）で免疫化したＤＢＡ／１マウスでの、可溶性ＴＮＦＲのＣＩＡの効果について も同様に調べた。ｒｈｕ　ＴＮＦＲ：Ｆｃの投与がＣＩＡの兆候を抑制するのに 有効であることが示された。Example 6 Effect of soluble TNFR on collagen-induced arthritis in DBA/I mice Porcine type Collagen (CII) in complete Freund's adjuvant in advance ) Effect of CIA on soluble TNFR in DBA/1 mice immunized with was similarly investigated. rhu TNFR: Administration of Fc suppresses symptoms of CIA It was shown to be effective.

この実験ではＤＢＡ／１マウスを１００μｇのＣ■で免疫化し、続いて、第２１ −２８０に無菌塩水中の５０μｇ組換え可溶性ヒトＴＮＦＲ／Ｆｃを腹腔内投与 した。コントロールマウスには無菌塩水（ｖｅｈｉｃｌｅ）を投与した。この治 療期間はＣＩＡの臨床上の指標が現れる前であるが、タイプ■コラーゲンに対す るＤＴＨ反応および迅速なＩｇＧ抗ｃ■生産が発生する期間である。In this experiment, DBA/1 mice were immunized with 100 μg of C -280 ip administration of 50 μg recombinant soluble human TNFR/Fc in sterile saline. did. Control mice received sterile saline vehicle. This cure The treatment period is before clinical indicators of CIA appear, but This is the period during which a DTH reaction and rapid IgG anti-c production occur.

両グループのマウスについて、免疫化の後７０日後のＣＩＡの発生および４４− ５５日後の発病開始について評価した。図６および７は、ＴＮＦＲ／Ｆｃはコン トロールと比較して有意にＣＩＡの発病を減少させ（２８％対８６％：ｐ＜０゜ ０３）、関節炎指標（重度の主観的測定）および罹患する結合部の数の双方を減 少させる。Ｃ■に対する抗体反応は、ＴＮＦＲ／Ｆｃ処理ｉ＆（第２８日）すぐ に低下するが、抗体のレベルは実験の最終まで変化しなかった（第７０日）。Development of CIA 70 days after immunization and 44- The onset of disease after 55 days was evaluated. Figures 6 and 7 show that TNFR/Fc is Significantly reduced the incidence of CIA compared to Troll (28% vs. 86%: p<0° 03), reducing both the arthritis index (a subjective measure of severity) and the number of joints affected. Make it less. Antibody response to C■ was detected immediately after TNFR/Fc treatment antibody levels did not change until the end of the experiment (day 70).

これらの結果は、ＴＮＦＲ／Ｆｃはマウスの］Ａ発病率を減少させるのに有効で あり、従って関節炎の治療に有効である可能性を示唆する。These results demonstrate that TNFR/Fc is effective in reducing the incidence of ]A disease in mice. Therefore, it suggests that it may be effective in treating arthritis.

配列表 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ・　１６４１塩基対 （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　一本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｌ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｆｆｌ）ハイボセティカル＝　Ｎｏ （ｉｖ’）アンチセンス二　Ｎｏ （ｖｉ）起源コ （Ａ）生物８二　Ｈｏｍｏ　５ａｐｉｅｎｓ（Ｇ）細胞の種類；　繊維芽細胞 （Ｈ）セルライン：　ＷＩ−２６ＶＡ４（ｖｉ）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：　Ｗｌ−２６ＶＡ４（Ｂ）クローン名：　クローンエ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ｃｐｓ （Ｂ）存在位置：　８８．、．１４７３（Ｌｘ）配列の特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　成熟タンパク質（Ｂ）存在位置：　１５４．、．１ ４７０（Ｌｘ）配列の特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　シグナルタンパク質（Ｂ）存在位置：　８８．、． １５３ （Ｘｉ）配列：　配列番号：１ ＣＴＧ八Ｃへ丁ＧＣＡ　Ｇ （２）配列番号：２ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：　４６１アミノ酸残基（Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （■）配列の種類：　タンノくり質 （ｘｉ）配列：　配列番号＝２ 原　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　ｖａＩ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌａ ｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｕｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌａｕτｒｐ　入１ａ　Ａｌａ 　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ 　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　ＴｙｒＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　 Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｑ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　 Ａｓｐ　Ｇ１ｎ丁ｈｒ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｈｅｍ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌ ｙｓ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｌｙｓ３０ 　３５　’　４０ Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｔ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　 Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　入３ｐＳｅｒτｈｒ　Ｔｙ ｒ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　ＶａｌＰｒｏ　Ｇｌｕ 　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　５ａｒ　ＣｙｓＧｌｙ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　 Ｓｅｔ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｉｕ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　 Ｔｈｒ　Ａｒｇ５ｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙａ　Ａｒｇ　Ｌ ｅｕ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ＣＹツ　八ｘｑ（２ ）配列番号：３ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：　１５５７塩基対 （Ｂ）配列の型；　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｌ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｔｔｉ）ハイポセティカル；Ｎ０ （ｔｖ）アンチセンス二ＮＯ （■）直接の起源； （Ｂ）クローン名：　ＴＮＦＲ／Ｆｃ融合タンパク質（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：　１．、．１５５７ （Ｌｘ）配列の特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　成熟タンパク質（Ｂ）存在位置：　１．、．１５５ ４ （ｘｊ）配列：　配列番号；３ 尤Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖａｎ　Ｐｈ＠Ｌｅｕ　Ｐｈ＠Ｐ ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ＾５ｐ丁ｈｒ　Ｌａｕ　Ｍ＠ｔ　ＸＬｅ 　Ｓｌ！ｘ　Ａｒｇ　丁ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｖａ ｌ　νａｌ　Ｖａｌ　Ａｓ■ Ｖａｌ　５ａｒ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　ＡＭＰ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　ζｙ；　 Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｖ、ａ：　Ａｓｐ　Ｇ１Dｙ 、　（２）配列番号・５ （ｉン配列の特性 （Ａ）配列の長さ：　２２塩基対 （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類二　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｔｉｔ）ハイポセティカル・　Ｎ ｏ （ｉ′ｖ）アンチセンス：　ＹＥＳ （報）直接の起源： （Ｂ）クローン名、　オリゴヌクレオチド（ｘｉ）配列・　配列番号＝５ ＣＧＧ？ＡＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧτ７ＡＣＴ　ＧＣ浄書（内容に変更なし） ＦＩＧＵＲＥ　１ ＦＩＧＵＲ三２ ＦＩＧｔＪＲＥ　３ 治療日数 ＦＩＧＵＲＥ　４ 治療 １００−一・ＰＢＳ Ｘ　−ＴＮＦＲ：Ｆｃ　１ 八　８０　７ や　−−− １　Ｉ　ｒ−一 ４４８４４十季十十十十十李李李十 日　数 免疫化後の日数 コントロール　ｒＴＮＦ−Ｒ 手続補正書坊幻 平成　６年１２月　ｒ′Sequence list (i) Characteristics of array (A) Sequence length: 1641 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of strands: single strand (D) Topology: Linear (il) Sequence type: cDNA (ffl) Hybothetical = No (iv’) Antisense 2 No. (vi) Origin (A) Organism 82 Homo5apiens (G) Type of cell; Fibroblast (H) Cell line: WI-26VA4 (vi) Direct origin: (A) Library name: Wl-26VA4 (B) Clone name: Clone (ix) Array characteristics: (A) NAME/KEY: cps (B) Location: 88. ,．． Features of 1473(Lx) array: (A) NAME/KEY: Mature protein (B) Location: 154. ,．． 1 Features of 470(Lx) array: (A) NAME/KEY: Signal protein (B) Location: 88. ,．． 153 (Xi) Sequence: Sequence number: 1 CTG 8C to Ding GCA G (2) Sequence number: 2 (i) Characteristics of array (A) Sequence length: 461 amino acid residues (B) Sequence type: Amino acids (D) Topology: Linear (■) Array type: Tannokuri quality (xi) Array: Sequence number = 2 Hara Ala Pro Val Ala vaI Trp Ala Ala La u Ala Val Guy Leu Glu Lauτrp Enter 1a Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gin Val Ala Phe Thr Pro TyrAla Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arq Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp G1n Dinghr Ala Gin Hem Cys Cys Ser L ys Cys Ser Pro Gly Gin His Ala Lys30 35’40 Val Phe Cys Thr Lys Thr Set Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu included 3pSerτhr Ty r Thr Gin Leu Trp Asn Trp ValPro Glu Cys Leu 5ar CysGly Sar Arg Cys Ser Set Asp Gin Val Giu Thr Gin Ala Cys Thr　Arg5er　Lys　Gin　Glu　Gly　Cya　Arg　L eu Cys Ala Pro Lau Arg Lys CYtsu 8 x q (2 ) Sequence number: 3 (i) Characteristics of array (A) Sequence length: 1557 base pairs (B) Sequence type; Nucleic acid (C) Number of chains 2 - heavy chain (D) Topology: Linear (il) Sequence type: cDNA (tti) Hypothetical; N0 (tv) antisense 2 NO (■) Direct origin; (B) Clone name: TNFR/Fc fusion protein (ix) Sequence characteristics: (A) NAME/KEY: CD5 (B) Location: 1. ,．． 1557 (Lx) Array characteristics: (A) NAME/KEY: Mature protein (B) Location: 1. ,．． 155 4 (xj) Sequence: Sequence number; 3 尤Leu　Gly　Gly　Pro　Ser　Van　Ph@Leu　Ph@P ro Pro Lys Pro Lys＾5p dinghr Lau M@t XLe Sl! x Arg Dinghr Pro Glu Val Thr Cys Va l　νal　Val　As■ Val　5ar　His　Glu　AMP　Pro　Glu　Val　ζy; Phe Asn Trp Tyr V, a: Asp G1Dy , (2) Sequence number 5 (Characteristics of i-in array (A) Sequence length: 22 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of chains: - heavy chain (D) Topology: Linear (ii) Sequence type 2 DNA (genome) (tit) hypothetical N o (i′v) Antisense: YES (Report) Direct origin: (B) Clone name, oligonucleotide (xi) sequence/SEQ ID NO: 5 CGG? ACGTGCTGTTGτ7ACT GC engraving (no change in content) FIGURE 1 FIGUR32 FIGtJRE　3 Treatment days FIGURE 4 treatment 100-1 PBS X - TNFR: Fc 1 8 80 7 Ya--- 1 I r-1 44844 10 seasons 1110 li li li 10 Number of days Days after immunization Control rTNF-R Procedural amendment book phantom December 1994 r'

Claims (9)

【特許請求の範囲】[Claims] １．治療に有効な量のＴＮＦアンタゴニストを必要とする哺乳動物に投与するこ とからなる、ＴＮＦ媒介炎症疾患の治療方法。1. administering a therapeutically effective amount of a TNF antagonist to a mammal in need thereof; A method for treating a TNF-mediated inflammatory disease, comprising: ２．ＴＮＦ媒介炎症疾患が関節炎である、請求項１に記載の方法。2. 2. The method of claim 1, wherein the TNF-mediated inflammatory disease is arthritis. ３．哺乳動物がヒトである、請求項２に記載の方法。3. 3. The method of claim 2, wherein the mammal is a human. ４．ＴＮＦアンタゴニストが可溶性ヒトＴＮＦＲである、請求項３に記載の方法 。4. 4. The method of claim 3, wherein the TNF antagonist is a soluble human TNFR. . ５．可溶性ヒトＴＮＦＲが、可溶性タイプ１ヒトＴＮＦＲおよび可溶性タイプＩ ＩヒトＴＮＦＲからなるグループから選択される、請求項４に記載の方法。5. Soluble human TNFR is divided into soluble type 1 human TNFR and soluble type I 5. The method of claim 4, wherein the TNFR is selected from the group consisting of I human TNFR. ６．可溶性ヒトＴＮＦＲがヒト免疫グロブリン分子のＦｃ領域に融合している、 請求項４に記載の方法。6. soluble human TNFR is fused to the Fc region of a human immunoglobulin molecule; The method according to claim 4. ７．ＴＮＦＲがＩＬ−１Ｒとの組み合わせにおいて投与される、請求項２に記載 の方法。7. Claim 2, wherein the TNFR is administered in combination with IL-1R. the method of. ８．約０．１ｍｇ／ｋｇ／週一約１００ｍｇ／ｋｇ／週の範囲の有効量の可溶性 ヒトＴＮＦＲを関節炎を病む哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物の関節 炎を治療する方法。8. Soluble in an effective amount ranging from about 0.1 mg/kg/week to about 100 mg/kg/week A mammalian joint comprising administering human TNFR to a mammal suffering from arthritis. How to treat inflammation. ９．可溶性ヒトＴＮＦＲの量が約０．５ｍｇ／ｋｇ／週一約５０ｍｇ／ｋｇ／週 の範囲である、請求項８に記載の方法。9. The amount of soluble human TNFR is approximately 0.5 mg/kg/week and approximately 50 mg/kg/week. 9. The method of claim 8, wherein: