JPH07503855A - Methionine biosynthesis using a sulfur reducing source - Google Patents
Methionine biosynthesis using a sulfur reducing sourceInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 各工程からなることを特徴とする方法。[Detailed description of the invention] A method characterized by comprising each step.
2、 前記外因性の硫黄化合物が、硫化水素、メチルメルカプタンまたはそれら の塩からなる還元硫黄化合物であることを特徴とする請求の範囲第1項記載の方 法。2. The exogenous sulfur compound is hydrogen sulfide, methyl mercaptan, or The method according to claim 1, which is a reduced sulfur compound consisting of a salt of Law.
3、 前記外因性の硫黄化合物が、硫酸塩、硫化物またはチオ硫酸塩からなる酸 化硫黄化合物であることを特徴とする請求の範囲第1項記載の方法。3. The exogenous sulfur compound is an acid consisting of sulfate, sulfide or thiosulfate. The method according to claim 1, characterized in that it is a sulfur compound.
4、 前記ホモセリン活性化酵素が、ホモセリンキナーゼ、ホモセリンアセチル トランスフェラーゼおよびホモセリンスクシニルトランスフェラーゼからなる群 より選択されることを特徴とする請求の範囲第2項または第3項記載の方法。4. The homoserine activating enzyme is homoserine kinase, homoserine acetyl A group consisting of transferases and homoserine succinyltransferases The method according to claim 2 or 3, characterized in that the method is selected from:
5、 前記硫黄取込み酵素が、0−スクシニルホモセリン(チオール)−リアー ゼ、0−アセチルホモセリン(チオール)−リアーゼおよび植物シスメチオニン ガンマシンターゼからなる群より選択されることを特徴とする請求の範囲第2項 または第3項記載の方法。5. The sulfur uptake enzyme is 0-succinylhomoserine (thiol)-rea lyase, 0-acetylhomoserine (thiol)-lyase and plant cismethionine Claim 2, characterized in that it is selected from the group consisting of gamma synthase. Or the method described in Section 3.
6、 前記硫黄取込み酵素がホモセリンおよび硫化水素またはそれらの塩をホモ システィンに直接転化することを特徴とする請求の範囲第2項記載の方法。6. The sulfur uptake enzyme homoserine and hydrogen sulfide or their salts The method according to claim 2, characterized in that it is directly converted to cysteine.
7、 前記硫黄取込み酵素がホモセリンおよびメチルメルカプタンまたはそれら の塩をメチオニンに直接転化することを特徴とする請求の範囲第2項記載の方法 。7. The sulfur uptake enzyme is homoserine and methyl mercaptan or The method according to claim 2, characterized in that the salt of methionine is directly converted into methionine. .
8、 前記硫黄取込み酵素がホモセリンをホモシスティンに直接転化することを 特徴とする請求の範囲第3項記載の方法。8. The sulfur uptake enzyme directly converts homoserine to homocysteine. A method according to claim 3, characterized in that:
9、 微生物細胞のメチオニン生合成経路を変更することにより該微生物細胞の 発酵工程におけるホモシスティンの産生を高める方法であって、i)ホモシステ ィンメチラーゼ以外のホモセリン活性化酵素を発現できるホモセリン活性化酵素 遺伝子断片および硫黄取込み酵素を発現できる硫黄取込み酵素遺伝子断片を前記 微生物細胞中に形質転換または形質導入し、ii)前述した両方の酵素遺伝子断 片の形質転換または形質導入を行なえる条件下で前記微生物細胞を成長させ、 1ii) 形質転換した微生物細胞または形質導入した微生物細胞を回収し、i v)ホモシスティンを産生ずるための硫黄源としてシスティンとメチオニン以外 の外因性の硫黄化合物を前記形質転換した微生物細胞または形質導入した微生物 細胞に加える、 各工程からなることを特徴とする方法。9. By changing the methionine biosynthesis pathway of microbial cells, A method for increasing the production of homocysteine in a fermentation process, the method comprising: i) homocysteine; Homoserine activating enzymes that can express homoserine activating enzymes other than methylase The gene fragment and the sulfur uptake enzyme gene fragment capable of expressing the sulfur uptake enzyme are ii) transform or transduce into the microbial cell, growing the microbial cell under conditions that permit transformation or transduction of the microorganism; 1ii) Collect the transformed or transduced microbial cells, i. v) Other than cysteine and methionine as a sulfur source for producing homocystine the transformed microbial cells or transduced microorganisms with an exogenous sulfur compound of add to cells, A method characterized by comprising each step.
10、前記外因性の硫黄化合物が、硫化水素、またはその塩からなる還元硫黄化 合物であることを特徴とする請求の範囲第9項記載の方法。10. Reductive sulfurization in which the exogenous sulfur compound is hydrogen sulfide or a salt thereof 10. The method according to claim 9, which is a compound.
11、前記外因性の硫黄化合物が、硫酸塩、硫化物またはチオ硫酸塩からなる酸 化硫黄化合物であることを特徴とする請求の範囲第9項記載の方法。11. The exogenous sulfur compound is an acid consisting of sulfate, sulfide or thiosulfate. 10. The method according to claim 9, which is a sulfur compound.
12、前記ホモセリン活性化酵素が、ホモセリンキナーゼ、ホモセリンアセチル トランスフェラーゼおよびホモセリンスクシニルトランスフェラーゼからなる群 より選択されることを特徴とする請求の範囲第10項または第11項記載の方法 。12. The homoserine activating enzyme is homoserine kinase, homoserine acetyl A group consisting of transferases and homoserine succinyltransferases The method according to claim 10 or 11, characterized in that the method is selected from .
13、前記硫黄取込み酵素が、0−スクシニルホモセリン(チオール)−リアー ゼ、0−アセチルホモセリン(チオール)−リアーゼおよび植物シスメチオニン ガンマシンターゼからなる群より選択されることを特徴とする請求の範囲第10 項または第11項記載の方法。13. The sulfur uptake enzyme is 0-succinylhomoserine (thiol)-rea lyase, 0-acetylhomoserine (thiol)-lyase and plant cismethionine Claim 10, characterized in that it is selected from the group consisting of gamma synthase. or the method described in paragraph 11.
14、前記硫黄取込み酵素が、ホモセリンおよび硫化水素またはその塩をホモシ スティンに直接転化することを特徴とする請求の範囲第10項記載の方法。14. The sulfur uptake enzyme homocytes homoserine and hydrogen sulfide or its salts. 11. A method according to claim 10, characterized in that it is directly converted into tin.
15、前記硫黄取込み酵素が、ホモセリンをホモシスティンに直接転化すること を特徴とする請求の範囲第11項記載の方法。15. The sulfur uptake enzyme directly converts homoserine to homocysteine. 12. The method according to claim 11, characterized in that:
16、前記形質転換した微生物細胞または形質導入した微生物細胞が、形質転換 しない微生物細胞または形質導入しない微生物細胞のアミノ酸より大きいアミノ 酸を産生ずることを特徴とする請求の範囲第1項または第9項記載の方法。16. The transformed microbial cell or transduced microbial cell is transformed Amino acids greater than those in microbial cells that do not transduce or transduce microbial cells 10. The method according to claim 1 or 9, characterized in that an acid is produced.
17、前記形質転換した微生物細胞または形質導入した微生物細胞が、ウシコリ ネバクテリア、Brevibacteriaまたは大腸菌からなる群より選択さ れることを特徴とする請求の範囲第1項または第9項記載の方法。17. The transformed microbial cell or transduced microbial cell is selected from the group consisting of Brevibacteria, Brevibacteria or Escherichia coli. 10. A method according to claim 1 or claim 9, characterized in that:
明 細 書 メチオニンは動物の食餌における必須アミノ酸であり、食物および飼料の補給物 に広く用いられている。メチオニンは従来、一般的にアクロレイン、メチルメル カプタン、およびシアン化物を出発材料として用いる様々な多段階化学合成によ り生成されている(H,H,ズマント、「化学工業の有機ビルディングブロック (Building Blocks ) J 182頁、ジョーン ウィリー アンド サンズ、ニューヨーク、1989)。得られる生成物には2種類の形態 、すなわち、D、L−メチオニンとそのヒドロキシ相似体(analog)があ る。他の全てのアミノ酸とは異なり、D−メチオニンはイン ビボで好ましいL 形に変換される。その結果として、この場合化学合成は、実施可能であり費用効 率がよい。なお、化学合成によって通常り型とL型の混合物が生じる。Specification Methionine is an essential amino acid in animal diets and is a food and feed supplement. widely used. Methionine has traditionally been commonly used as acrolein, methyl mer captan, and various multistep chemical syntheses using cyanide as starting materials. (H. H. Zumant, “Organic Building Blocks of the Chemical Industry”) (Building Blocks) J 182 pages, Joan Willie and Sons, New York, 1989). The resulting product has two forms , that is, D,L-methionine and its hydroxy analog Ru. Unlike all other amino acids, D-methionine has a preferred L converted into shape. As a result, chemical synthesis is feasible and cost-effective in this case. Good rate. Note that chemical synthesis usually produces a mixture of the L-type and the L-type.
しかしながら、多くの低コストアミノ酸を生成する普通の方法である発酵産生方 法は、メチオニンの場合には適用できない(K、アイダ、■、チバタ、K、ナカ ヤマ、K、タキナミ、およびH,ヤマダ、「アミノ酸産生のバイオテクノロジー 」、工業微生物学の進歩24、エルセピア−11986)。生化学関連の必須ア ミノ酸であるリシンとスレオニンの両方が、糖みつ、デンプン加水分解物、コー ンス ゛ティープリカー、およびダイズ加水分解物のような安い原料を用いた発 酵方法により費用効率よく産生されるとすれば、このことは驚くべきことである (例えば、P、L、 ロジャース、R,G、カイル、D、F、ミツシリ−1およ びC,フライヤー、「オーストラリアにおけるし一リシン産生の展望」、オース トラリアの食品技術38.514−518頁、1986 、およびS、フルサワ 、A、オザキ、およびT、ナカニシ、「大腸菌のし一アスパラギン酸−およびL −ホモセリン−耐性変異体によるし一スレオニン産生」、応用微生物学およびバ イオテクノロジー29.550−553頁、1988)。However, fermentation production, which is a common way to produce many low-cost amino acids, method is not applicable in the case of methionine (K, Aida, ■, Chibata, K, Naka Yama, K. Takinami, and H. Yamada, “Biotechnology of Amino Acid Production. ”, Advances in Industrial Microbiology 24, El Sepia-11986). Biochemistry related essentials Both the amino acids lysine and threonine are found in molasses, starch hydrolysates, and corona. production using cheap raw materials such as tea liquor and soybean hydrolyzate. This is surprising given that it can be produced cost-effectively by fermentation methods. (For example, P, L, Rogers, R, G, Kyle, D, F, Mitsushiri-1 and C. Fryer, “Prospects for lysine production in Australia”, Aus. Tralia Food Technology 38, pp. 514-518, 1986, and Furusawa, S. , A. Ozaki, and T. Nakanishi, “Escherichia coli aspartic acid and L. -Threonine Production by Homoserine-Resistant Mutants”, Applied Microbiology and Biotechnology 29, pp. 550-553, 1988).
L−リシンおよびL−スレオニンを生成するのに様々な微生物を用いてきた。Various microorganisms have been used to produce L-lysine and L-threonine.
これらの微生物は、突然変異誘発および選択を用いる伝統的な方法並びに遺伝子 工学により開発されてきた(K、アイダ、前出)。歴史的に、コリネバクテリア およびBrevibacteriaを用いて大きな成功をおさめてきたが、大腸 菌のような他の微生物を用いても実施可能であることが明らかである。メチオニ ンの経済的な発酵産生が可能となるように、メチオニン生合成の複雑さおよび代 謝コストを低減し、理想的にはそれらをリジンまたはスレオニンの場合と同程度 にする方法が必要とされている。These microorganisms can be developed using traditional methods using mutagenesis and selection as well as genetic It has been developed through engineering (K., Ida, supra). Historically, Corynebacteria Although great success has been achieved using Brevibacteria and Brevibacteria, large intestine It is clear that other microorganisms such as fungi can also be used. Methioni The complexity and substitution of methionine biosynthesis has been reduce metabolic costs and ideally reduce them to the same extent as for lysine or threonine. A method is needed to do so.
発明の概要 本発明は、発酵硫黄源として硫酸塩の代わりに還元硫黄化合物を使用することを 含み、および/または生化学経路を再設計し、それによりその生化学経路を簡単 にすることを含むメチオニンを合成する実施可能な発酵方法を提供するものであ る。本発明はまた、発酵硫黄源として硫酸塩の代わりに還元硫黄化合物を使用す ることを含み、および/または生化学経路を再設計し、それによりその生化学経 路を簡単にすることを含むホモシスティンを合成する発酵方法を提供するもので ある。本発明の好ましい実施態様においては、還元硫黄源は硫化水素、メチルメ ルカプタンまたはそれらの塩である。Summary of the invention The present invention proposes the use of reduced sulfur compounds instead of sulfates as fermentation sulfur sources. contain and/or redesign a biochemical pathway, thereby simplifying that biochemical pathway. The present invention provides a viable fermentation method for synthesizing methionine, including Ru. The present invention also utilizes reduced sulfur compounds instead of sulfates as fermentation sulfur sources. and/or redesign a biochemical pathway, thereby improving its biochemical pathway. provides a fermentation method for synthesizing homocystine that be. In a preferred embodiment of the invention, the reduced sulfur source is hydrogen sulfide, methyl sulfide, lucaptan or their salts.
本発明の別の好ましい実施態様においては、生化学経路を再設計または変更し、 それによりその生化学経路を簡単にすることを含む発酵工程の改良方法を提供す る。In another preferred embodiment of the invention, redesigning or altering biochemical pathways; thereby providing a method for improving the fermentation process, including simplifying its biochemical pathways. Ru.
図面の簡単な説明 第1a図は、大腸菌中のりシン、メチオニンおよびスレオニンへの通常の生合成 経路を示す図である。Brief description of the drawing Figure 1a shows the normal biosynthesis of lysine, methionine and threonine in E. coli. It is a diagram showing a route.
第1b図は、大腸菌中のスレオニン生合成経路を示す図である。FIG. 1b is a diagram showing the threonine biosynthesis pathway in E. coli.
第1c図は、大腸菌中のりシン生合成経路を示す図である。FIG. 1c is a diagram showing the ricin biosynthesis pathway in E. coli.
第1d図は、大腸菌中のメチオニン生合成経路を示す図である。FIG. 1d is a diagram showing the methionine biosynthesis pathway in E. coli.
第2図は、メチオニン生合成の様々な経路:(1))ランススルフリレーション 経路;(2)スルフヒトリレーション経路;(3)メチルスルフヒドリルシーシ ョン経路を示す図である。Figure 2 shows the various pathways of methionine biosynthesis: (1)) Lance sulfurylation Pathway; (2) Sulfhydrylation pathway; (3) Methyl sulfhydryl sheath FIG.
本発明はメチオニンおよびホモシスティンの発酵合成方法に関するものである。The present invention relates to a method for fermentative synthesis of methionine and homocystine.
メチオニン合成のための費用効率のよい発酵方法が存在しない一方で、リシンお よびスレオニンについてはそのような方法がある理由を理解するために、メチオ ニン、リシン、およびスレオニンの生合成経路の差異をより詳しく検討すること が有益である。3つのアミノ酸は全て同一の中間代謝産物(アスパラギン酸)か ら生化学的に誘導される(第1図)。実際、スレオニンとメチオニンは追加の生 化学工程および共通の中間体であるホモセリンを共有している。しかし、それら の特定の経路の枝分れを考える場合、合成は相当具なる(第1図)。これらを表 1に比較する(J、 L、イングラハム、0.マーロー、およびF、 C,ニー ドハード、「バクテリア細胞の成長J 、122−135頁、マサチューセッツ 州、サンダーランド、シナーラー アソシエート社、1983)。大腸菌中に存 在する経路を比較の基準として選択するが、微生物および植物におけるこれら経 路には相違点があること、およびこの比較は本発明を大腸菌を用いた経路に限定 するものではないことは明らかである(K、 M、バーマンおよびR,L、サマ ービル、「アミノ酸:生合成および遺伝的調節」のチャプター9−13、アジソ ンーウェズリー出版社、1983.W、B、ジャコピーおよびO,W、グリフイ ス、酵素学における方法143のセクションII1. D、 、アカデミツクプ レス、ニューヨーク、1987)。While cost-effective fermentation methods for methionine synthesis do not exist, lysine and To understand why there is such a method for methionine and threonine, To take a closer look at the differences in the biosynthetic pathways of nin, lysine, and threonine. is beneficial. Are all three amino acids the same intermediate metabolite (aspartic acid)? (Figure 1). In fact, threonine and methionine are They share a chemical process and a common intermediate, homoserine. But those Synthesis becomes quite useful when considering the branching of a particular pathway (Figure 1). Table these Compare to 1 (J. L. Ingraham, 0. Marlow, and F. C. Nee. Dohard, “Growth of Bacterial Cells J,” pp. 122-135, Massachusetts. Sunderland, Sunderland, Shinara Associates Ltd., 1983). present in E. coli The existing pathways in microorganisms and plants are selected as the basis for comparison. There are differences between the routes, and this comparison limits the invention to the E. coli route. (K, M, Berman and R, L, Summer) Bill, “Amino Acids: Biosynthesis and Genetic Regulation” Chapters 9-13, Ajiso Wesley Publishing, 1983. W, B, Jacopee and O, W, Griffey. Section II1 of Methods in Enzymology 143. D ,Academic Cup Les, New York, 1987).
リシン 1 12300 スレオニン 1 02200 メチオニン 1 07811 アデノシン三リン酸(ATP)および還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ ドリン酸(NADPH)に関する、メチオニン生合成の生化学エネルギー必要条 件はりシンとスレオニンのものより約3倍大きい。これは、硫酸塩同化の必要条 件によるためである(J、L、イングラハム、前出)。3モルのATPと4モル のNADPHの全体が硫酸塩を硫化物に生化学的に還元するのに必要である。Ricin 1 12300 Threonine 1 02200 Methionine 1 07811 Adenosine triphosphate (ATP) and reduced nicotinamide adenine dinucleotide Biochemical energy requirements for methionine biosynthesis regarding phosphoric acid (NADPH) It is about 3 times larger than those of Rishin and Threonine. This is a necessary condition for sulfate assimilation. (J.L. Ingraham, supra). 3 moles of ATP and 4 moles of NADPH is required to biochemically reduce sulfate to sulfide.
硫酸塩を細胞中に輸送し、硫化物をシスティン中に取り込むのに、各々1モルの ATP、すなわち、さらに2モルのATPが必要である。最終的に、メチオニン の生合成において硫黄供与体として機能するのはシスティンである(第1図)。1 mole each to transport sulfate into the cell and incorporate sulfide into cysteine. ATP, ie 2 more moles of ATP are required. Finally, methionine Cysteine functions as a sulfur donor in the biosynthesis of cystein (Fig. 1).
さらに、メチオニン生合成には特有にメチル基を取り込むことが必要である(第 1図、表■)。このメチル基は、セリンのグリシンへの転化により5−メチル− テトラヒドロ葉酸(CH3−THF)として由来する。上述したことを考慮する と明らかに、硫黄源としての硫酸塩によりメチオニンを合成する代謝コストおよ び複雑さは、リシンまたはスレオニンのものよりはるかに大きい。Furthermore, methionine biosynthesis uniquely requires the incorporation of a methyl group (the Figure 1, Table ■). This methyl group is converted to 5-methyl- by conversion of serine to glycine. Originated as tetrahydrofolic acid (CH3-THF). Considering the above Clearly, the metabolic costs and metabolic costs of synthesizing methionine with sulfate as a sulfur source The complexity is much greater than that of lysine or threonine.
メチオニンの生合成における微生物と植物の中には自然の多様性がある。このこ とは第2図により模式的に表され、以下のように要約できる(K、 M、バーマ ン、前出;W、B、′)ヤコビ−1前出、F、C,ニードハード、大腸菌および ネズミチフス菌のチャプター27、米国微生物学会、ワシントンD、C,,19 B?、M、ディクストンおよびE、C,ウェブ、「酵素」、第3版、アカデミツ クプレス、ニューヨーク、1979.S、ヤマガタ、パイオキミー71、(19 89) 1125−1143)1) 全ての微生物のメチオニン生合成経路にお いて、スクシニル−CoA (大腸菌およびネズミサルモネラ菌)またはアセチ ル−Co A (Brevibacteriumおよびバシラス属のようなバク テリア、酵母、および菌類)のいずれかにより、ホモセリンは最初に活性化され る。これらの反応は、それぞれホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ(EC 2,3,1,46)およびホモセリンアセチルトランスフェラーゼ(EC2,3 ,1,31)により触発される。There is natural diversity among microorganisms and plants in methionine biosynthesis. this child is schematically represented in Figure 2 and can be summarized as follows (K, M, barma N, supra; W, B,') Jacobi-1 supra, F, C, Needhard, Escherichia coli and Typhimurium Chapter 27, American Society for Microbiology, Washington D.C., 19 B? , M. Dixton and E. C. Webb, "Enzymes", 3rd edition, Akademitsu. Kupres, New York, 1979. S, Yamagata, Paiokimi71, (19 89) 1125-1143) 1) In the methionine biosynthesis pathway of all microorganisms. and succinyl-CoA (E. coli and murine Salmonella) or acetyl-CoA. Ru-CoA (bacteria such as Brevibacterium and Bacillus) homoserine is first activated by either Ru. These reactions each involve homoserine succinyltransferase (EC 2,3,1,46) and homoserine acetyltransferase (EC2,3 , 1, 31).
2) 植物のメチオニン生合成経路において、ホモセリンキナーゼ(EC2,7 ,139)により触発される反応でATPによりホモセリンは活性化される。2) In the plant methionine biosynthesis pathway, homoserine kinase (EC2,7 , 139) homoserine is activated by ATP.
ホモセリンキナーゼ反応はまた微生物中でも行なわれるが、産生じたO−ホスホ ホモセリンは、メチオニン合成ではなくスレオニン合成における中間体である。The homoserine kinase reaction also occurs in microorganisms, but the O-phosphorus produced Homoserine is an intermediate in threonine synthesis rather than methionine synthesis.
したがって、植物においては、0−ホスホホモセリンはメチオニン経路とスレオ ニン経路の間の分岐点であり、−万機生物において分岐点はホモセリンである。Therefore, in plants, 0-phosphohomoserine is linked to the methionine pathway and It is a branching point between the nin pathway, and in all living organisms, the branching point is homoserine.
3) メチオニンへの微生物トランススルフリレーション経路においては、O− スクシニルホモセリン(チオール)−リアーゼ(EC4,2,99,9)および シスメチオニンβ−リアーゼ(EC4,4,1,8)により触発される反応にお けるアシルホモセリンは、システィンから還元硫黄を受容してホモセリンを生成 する。(0−スクシニルホモセリン(チオール)−リアーゼはシスタチオニンγ −シンターゼとしても知られている。)4) 微生物スルフヒトリレーション経 路において、ホモシスティンは、0−スクシニルホモセリン(チオール)−リア ーゼまたはO−アセチルホモセリン(チオール)−リアーゼ(EC4,2,99 ,10)によりアシルホモセリンおよび硫化物から直接産生される。0−アセチ ルホモセリン(チオール)−リアーゼは、ホモシスティンシンターゼおよびメチ オニンシンターゼとしても知られている5) 微生物メチルスルフヒトリレーシ ョン経路においては、メチオニンは、0−スクシニルホモセリン(チオール)− リアーゼまたはO−アセチルホモセリン(チオール)−リアーゼによりアシルホ モセリンおよびメチルメルカプタンから直接産生される。3) In the microbial transsulfurylation pathway to methionine, O- Succinylhomoserine (thiol)-lyase (EC4,2,99,9) and The reaction triggered by cismethionine β-lyase (EC4,4,1,8) The acyl homoserine that produces homoserine accepts reduced sulfur from cysteine and generates homoserine. do. (0-succinylhomoserine (thiol)-lyase is cystathionine γ -Also known as synthase. )4) Microbial sulfhydration Homocystine is 0-succinylhomoserine (thiol) -ase or O-acetylhomoserine (thiol)-lyase (EC4,2,99 , 10) directly from acylhomoserine and sulfide. 0-acety Lehomoserine (thiol)-lyase is homocysteine synthase and methyl Also known as onine synthase 5) Microbial methyl sulfhydrylase In the cation pathway, methionine is converted into 0-succinylhomoserine (thiol)- lyase or O-acetylhomoserine (thiol)-lyase. Produced directly from moserin and methyl mercaptan.
6) 植物におけるトランススルフヒトリレーションおよびスルフヒトリレーシ ョンは、シスタチオニンγ−シンターゼにより触発される。植物酵素シスタチオ ニンγ−シンターゼはEC4,2,99,9とはまりたく別のものであり、基質 として0−ホスホホモセリンを使用する際に独特のものである。6) Trans-sulfhytylation and sulfhytylation in plants tion is triggered by cystathionine γ-synthase. plant enzyme cystachio Nin γ-synthase is completely different from EC4,2,99,9, and has a substrate It is unique in the use of 0-phosphohomoserine as
7) ***酵母ポンプ(poa+be )からの酵素の場合を除いて、ホモセリ ンはO−アセチルホモセリン(チオール)−リアーゼの貧基買である(S、ヤマ ガタ、前出)。7) Except for enzymes from fission yeast pump (poa+be), homocerate is an essential component of O-acetylhomoserine (thiol)-lyase (S, Yama). Gata, supra).
上述したメチオニン生合成酵素はピリドキサルリン酸含有酵素の群に属する。The methionine biosynthetic enzymes mentioned above belong to the group of pyridoxal phosphate-containing enzymes.
これらの酵素は、様々な除去反応および置換反応を行なうことが知られている柔 軟性のある触媒である(C,ワルシュ、「酵素反応機構」のチャプター24、W 。These enzymes are soft enzymes known to perform a variety of removal and substitution reactions. It is a flexible catalyst (C. Walsh, "Enzyme Reaction Mechanism", Chapter 24, W. .
H,フリーマン アンド カンパニー、サンフランシスコ(1979) ’)。H., Freeman & Company, San Francisco (1979)').
上述した群の別の酵素であるトリプトファンシンターゼは非常に高い比率でセリ ンと硫化物をシスティンに転化する(K、イシワタ、T、ナカムラ、M、シマダ 、およびN、マキグチ、「大腸菌のトリプトファンシンターゼによるし一システ ィンの酵素産生」、j1発酵および生物工学67.169−]、72.1989 )。この反応は、ホモセリンと硫化物の反応と類似している。Another enzyme in the group mentioned above, tryptophan synthase, is found in very high proportions in serine. Converts carbon and sulfide to cysteine (K, Ishiwata, T, Nakamura, M, Shimada) , and N. Makiguchi, “The tryptophan synthase system of Escherichia coli” "Enzyme production of phosphorus", J1 Fermentation and Biotechnology 67.169-], 72.1989 ). This reaction is similar to that of homoserine and sulfide.
実施可能な発酵方法の設計において、硫黄の取込みとメチオニン生合成に関連す る様々な反応がまだ検討されている。硫酸塩の代わりに硫化物またはメチルメル カプタンを使用することにより、メチオニン合成の代謝コストをリシンとスレオ ニンの水準まで低減させる。本発明においては、硫酸塩の活性輸送、硫酸塩の還 元、およびシスティンの合成がすべて削除されるので、2つのATPおよび3つ のNADPHLか必要としない。In designing a viable fermentation method, the link between sulfur uptake and methionine biosynthesis should be considered. Various reactions are still being considered. Sulfide or Methyl Mel instead of Sulfate By using captan, the metabolic cost of methionine synthesis can be reduced to lysine and threo. reduce to the level of nin. In the present invention, active transport of sulfate, reduction of sulfate, Since all original and cysteine synthesis is removed, two ATP and three Does not require NADPHL.
硫化物またはメチルメルカプタンを使用することにより、システィンの生合成お よび、メチルメルカプタンの場合には、CH3−THFの生合成が削除されるの で、メチオニン生合成の代謝の複雑さが低減される。さらに簡素化が可能であり 、当業者に公知の方法により植物生合成経路を微生物に適合させることによる簡 素化が望ましいであろう。ホモセリンキナーゼは微生物スレオニン経路で機能す る酵素としてすでに存在しているので、この変更には、植物シスタチオニンγ− リアーゼ活性のみが必要である。このことは、構造的に微生物0−アシルホモセ リン(チオール)−リアーゼを変更することにより、または微生物を産生ずる際 に植物シスタチオニンγ−リアーゼを発現することにより行なわれる。あるいは 、硫黄の取り込む際の基質として直接にホモセリンを効果的に使用するために、 これらの酵素または他の候補であるトリプトファンシンターゼのようなピリドキ サルリン酸酵素において、構造的変更が行なわれる。もしくは、***酵母ポンプ からのO−アセチルホモセリン(チオール)−リアーゼを変更せずに用いること もできる。By using sulfide or methyl mercaptan, cysteine biosynthesis and In the case of methyl mercaptan, CH3-THF biosynthesis is deleted. , the metabolic complexity of methionine biosynthesis is reduced. Further simplification is possible. , by adapting plant biosynthetic pathways to microorganisms by methods known to those skilled in the art. Naturalization would be desirable. Homoserine kinase functions in the microbial threonine pathway This modification involves the use of plant cystathionine γ- Only lyase activity is required. This suggests that the microbial O-acylhomose is structurally by modifying phospho(thiol)-lyases or when producing microorganisms. This is done by expressing plant cystathionine γ-lyase. or , to effectively use homoserine directly as a substrate for sulfur uptake. These enzymes or other candidates such as tryptophan synthase Structural changes are made in the monkey phosphate enzyme. Or fission yeast pump Using O-acetylhomoserine (thiol)-lyase from You can also do it.
硫黄の還元形は生化学エネルギーの必要条件を最小にするのに好ましいが、硫黄 の他のより酸化された形もまた有益である。上述したように、システィンよりも むしろ硫化物がホモセリンまたは活性化誘導体中に直接取り込まれるときはいつ も、代謝の簡素化による改良が行なわれる。したがって、硫酸塩、亜硫酸塩、お よびチオ硫酸塩のようなより酸化された形が硫黄源として用意されてもよく、生 化学的に硫化物に還元されてもよい。亜硫酸塩とチオ硫酸塩は硫酸塩より還元さ れた形態であるのでそれらはまた硫酸塩と相対的な生化学エネルギーの必要を減 少させるが、そのエネルギー必要条件は、硫化物またはメチルメルカプタンより も大きい。Although the reduced form of sulfur is preferred to minimize biochemical energy requirements, sulfur Other more oxidized forms of are also useful. As mentioned above, than cysteine Rather, when sulfide is incorporated directly into homoserine or activated derivatives, Improvements will also be made by simplifying the metabolism. Therefore, sulfates, sulfites, More oxidized forms such as sulfur and thiosulfates may be provided as sulfur sources May be chemically reduced to sulfide. Sulfite and thiosulfate are less reduced than sulfate. They also reduce the need for biochemical energy relative to sulfate. less, but its energy requirements are lower than that of sulfides or methyl mercaptans. It's also big.
メチオニン生合成経路の複雑さを減少させることにより、メチオニン過剰産生に おける微生物代謝の関与(engagement)が小さくなる。このことによ り、メチオニン生合成を脱調節(de−regulation )するために伝 統的な方法または遺伝工学的方法により産生微生物中に導入しなければならない 遺伝子変更の数を減少させ、一般的に微生物代謝の中断を制限する。ここに用い ている「脱調節」とは、微生物代謝の自己調節へのいかなる影響(例えば、フィ ードバック阻害または抑制による微生物自己調節へのいかなる影響)を意味する 。そのような脱調節は、例えば、伝統的な突然変異誘発および選択または遺伝工 学のような当業者に公知の方法により行なうことができる。Reduces methionine overproduction by reducing the complexity of the methionine biosynthetic pathway The involvement of microbial metabolism in this process is reduced. Because of this and to de-regulate methionine biosynthesis. must be introduced into the producing microorganism by systematic or genetic engineering methods. Reduce the number of genetic changes and generally limit disruption of microbial metabolism. used here "Deregulation" refers to any influence on the autoregulation of microbial metabolism (e.g. (any effect on microbial self-regulation by back-inhibition or suppression) . Such deregulation can be achieved by, for example, traditional mutagenesis and selection or genetic engineering. This can be done by methods known to those skilled in the art, such as those skilled in the art.
最終結果は、メチオニン生合成経路を、代謝コストと複雑さに関してリシンおよ びスレオニンの生合成経路と好ましく匹敵する生合成経路へ転換することにある 。このようにして、メチオニン産生の実施可能な発酵方法を実現できる。The end result is that the methionine biosynthetic pathway is compared to lysine and lysine in terms of metabolic cost and complexity. The goal is to switch to a biosynthetic pathway that is favorable and comparable to that of threonine and threonine. . In this way, a viable fermentation method for methionine production can be realized.
X線 以下の開示は、実施態様を示すことを意図したものであり、本出願の範囲を限定 するものとして考えるべきではない。X-ray The following disclosure is intended to represent embodiments and is intended to limit the scope of this application. It should not be thought of as something to do.
実施例1 アシルホモセリンによるメチオニンの産生(スルフヒトリレーション経路) 伝統的な方法または遺伝工学的方法により、ホモセリンの過剰産生について、大 腸菌、C,glutamicu履、およびB、 flavusを脱調節する。こ れらの微生物を、ホモセリン アセチルトランスフェラーゼ、0−アセチルホモ セリン(チオール)−リアーゼ、およびホモシスティン メチラーゼをコード化 するプラスミドで形質転換することにより、メチオニンへのスルフヒトリレーシ ョン経路をこれらの微生物中に導入する。親機生物および形質転換した微生物を 、グルコース、ダイズ加水分解物、および無機栄養物を含有する発酵培地中でこ こに培養する。メチオニン産生のための硫黄の供給源として硫酸塩または硫化物 のいずれかで培地を補う。表■は各々の菌株により産生されるメチオニンの相対 量を示している。Example 1 Production of methionine by acyl homoserine (sulfhydration pathway) Overproduction of homoserine has been largely investigated by traditional or genetic engineering methods. It deregulates C. enterica, C. glutamicularia, and B. flavus. child These microorganisms were treated with homoserine acetyltransferase, 0-acetyl homoserine Encodes serine (thiol)-lyase and homocysteine methylase sulfhydrylase to methionine by transforming with a plasmid that tion pathway into these microorganisms. Parent organism and transformed microorganisms , in a fermentation medium containing glucose, soybean hydrolysate, and inorganic nutrients. Cultivate this. Sulfate or sulfide as a source of sulfur for methionine production Supplement the medium with either Table ■ shows the relative amount of methionine produced by each strain. It shows the amount.
大腸菌母体 硫酸塩 − 大腸菌母体 硫化物 − 大腸菌形質転換体 硫酸塩 十 大腸菌形質転換体 硫化物 ++ C,glutaa+icum母体 硫酸塩 −C,glutaa+icum母体 硫化物 −C,glutaaiicum形質転換体 硫酸塩 十C,glut amicum形質転換体 硫化物 ++B、 flavui+母体 硫酸塩 − B、 flavum母体 硫化物 − B、flavui形質転換体 硫酸塩 十B、flavum形質転換体 硫化物 ++* 少ない(−)、中間(+)、多し・(++)実施例2 アシルホモセリンによるホモシスティンの産生(スルフヒトリレーション経路) 実施例1の親菌株はホモシスティン メチラーゼ活性が欠失してtする。次II Xで、ホモセリン アセチルトランスフェラーゼおよびO−アセチルホモセリン (チオール)−リアーゼをコード化するプラスミドで上記微生物を形質転換する 。ホモシスティン メチラーゼ陰性母体および形質転換した微生物を実施例1の ように培養する。表IIは各々の菌株により産生されるホモシスティンの相対量 を示し大腸菌母体 硫酸塩 − 大腸菌母体 硫化物 − 大腸菌形質転換体 硫酸塩 十 大腸菌形質転換体 硫化物 ++ C,glutamicル母体 硫酸塩 −C,glutamicua+母体 硫 化物 −c、 glutamicum形質転換体 硫酸塩 十C,glutam icum形質転換体 硫化物 ++B、flavua+母体 硫酸塩 − B、 flavum母体 硫化物− B、 flavum形質転換体 硫酸塩 十B、flavum形質転換体 硫化 物++* 全ての菌株はホモシスティン メチラーゼ活性が欠如して0る。Escherichia coli mother body sulfate − Escherichia coli mother body sulfide − Escherichia coli transformant sulfate 10 E. coli transformant sulfide ++ C, glutaa+icum parent sulfate -C, glutaa+icum parent Sulfide -C, glutaaiicum transformant Sulfate -C, glut amicum transformant sulfide ++ B, flavui + parent sulfate − B, flavum matrix sulfide - B, flavui transformant sulfate B, flavum transformant sulfide ++* Less (-), Medium (+), More (++) Example 2 Production of homocysteine by acylhomoserine (sulfhydration pathway) The parent strain of Example 1 lacks homocysteine methylase activity. Next II X, homoserine acetyltransferase and O-acetylhomoserine Transforming the above microorganism with a plasmid encoding (thiol)-lyase. . The homocysteine methylase-negative mother and the transformed microorganism were treated as described in Example 1. Cultivate like this. Table II shows the relative amount of homocysteine produced by each strain. Indicates that E. coli mother body sulfate − Escherichia coli mother body sulfide − Escherichia coli transformant sulfate 10 E. coli transformant sulfide ++ C, glutamic parent sulfate - C, glutamicua + parent sulfate -c, glutamicum transformant sulfate 10C, glutam icum transformant sulfide ++ B, flavua + parent sulfate - B, flavum matrix sulfide- B, flavum transformant sulfate 10B, flavum transformant sulfate All strains lack homocysteine methylase activity.
** 少ない(−)、中間(+)、多い(++)実施例3 アシルホモセリンによるメチオニンの産生(メチルスルフヒトリレーション経路 )実施例2の菌株を、補給硫黄源としてメチルメルカプタンを補うことを除(1 て、実施例1のように培養する。表IIIは各々の菌株により産生されるメチオ ニンの相対量を示している。メチオニンの産生は、機能して0るメチルスルリレ ーション経路を示している。** Low (-), Medium (+), High (++) Example 3 Production of methionine by acylhomoserine (methyl sulfhydration pathway) ) strain of Example 2 except supplemented with methyl mercaptan as a supplemental sulfur source (1 and culture as in Example 1. Table III shows the methionine produced by each strain. It shows the relative amount of nin. The production of methionine is a function of 0 methyl suluryl tion route.
大腸菌母体 − 大腸菌形質転換体 ++ C. glutamicum母体 − C.glutacicum形質転換体 ++B.flavum母体 − B. flavuI11形質転換体 +1* 全ての菌株はホモシスティン メ チラーゼ活性力(欠如して(Aる。E. coli mother body − E. coli transformant ++ C. glutamicum mother body - C. glutacicum transformant ++B. flavum mother body - B. flavuI11 transformant +1* All strains contain homocysteine Chylase activity (lack).
** 少ない(−)、多い(++) ホスホホモセリンによるメチオニンの産生(スルフヒトリレーション経路) 実施例1の親菌株を、ホモセリン キナーゼ、植物シスメチオニン γ−シンタ ーゼおよびホモシスティン メチラーゼをコード化するプラスミドで形質転換す る。親微生物および形質転換した微生物を実施例1のように培養する。表IVは 各々の菌株により産生されるメチオニンの相対量を示している。** Few (-), many (++) Production of methionine by phosphohomoserine (sulfhydration pathway) The parent strain of Example 1 was combined with homoserine kinase, plant cismethionine γ-synthesis Transformation with plasmids encoding homocysteine methylase and homocysteine methylase Ru. The parent microorganism and the transformed microorganism are cultured as in Example 1. Table IV is The relative amount of methionine produced by each strain is shown.
大腸菌母体 硫酸塩 − 大腸菌母体 硫化物 − 大腸菌形質転換体 硫酸塩 十 大腸菌形質転換体 硫化物 ++ C,glutamicum母体 硫酸塩−′C,glut、amicum母体 硫化物 −C,glutasjcum形質転換体 硫酸塩 十C,glutam icum形質転換体 硫化物 ++B、flavuI母体 硫酸塩 − B、 flavus母体 硫化物 − B、flavul形質転換体 硫酸塩子B、 flavui形質転換体 硫化物 十+* 少ない(−)、中間(+)、多い(++)実施例5 ホスホホモセリンによるメチオニンの産生(メチルスルフヒトリレーション経路 )実施例2の欠失親菌株を、ホモセリン キナーゼおよび植物シスタチオニンγ −シンターゼをコード化するプラスミドで形質転換する。親微生物および形質転 換した微生物を実施例3のように培養する。表■は各々の菌株により産生される メチオニンの相対量を示している。Escherichia coli mother body sulfate − Escherichia coli mother body sulfide − Escherichia coli transformant sulfate 10 E. coli transformant sulfide ++ C, glutamicum parent sulfate-'C, glutamicum parent Sulfide -C, glutasjcum transformant Sulfate -C, glutam icum transformant sulfide ++B, flavuI parent sulfate - B, flavus matrix sulfide - B, flavui transformant sulfate B, flavui transformant sulfide 10+* Less (-), Medium (+), More (++) Example 5 Production of methionine by phosphohomoserine (methyl sulfhydration pathway) ) The deletion parent strain of Example 2 was transformed into homoserine kinase and plant cystathionine γ. - Transform with a plasmid encoding the synthase. Parent microorganisms and transformation The transformed microorganisms are cultured as in Example 3. Table ■ is produced by each strain. The relative amount of methionine is shown.
微生物“ 産生したメチオニン0a 大腸菌母体 − 大腸菌形質転換体 +十 C0glutamicum母体 − C9glutamicua+形質転換体 +十B、 flavum母体 − B、 flavum形質転換体+十 * 全ての菌株はホモシスティン メチラーゼ活性が欠如しており、メチルメル カプタンを補給したものである。Methionine 0a produced by microorganisms E. coli mother body − E. coli transformant +10 C0glutamicum mother body - C9 glutamiqua + transformant + 10B, flavum mother - B, flavum transformant + ten *All strains lack homocysteine methylase activity, It is supplemented with captan.
** 少ない(=)、多い(++) 実施例1の親菌株はホモセリン アシルトランスフェラーゼ活性が欠失している 。微生物を、***酵母からの0−アセチルホモセリン(チオール)−リアーゼお よびホモシスティン メチラーゼをコード化するプラスミドで形質転換する。** Few (=), many (++) The parent strain of Example 1 lacks homoserine acyltransferase activity. . Microorganisms were treated with 0-acetylhomoserine (thiol)-lyase from fission yeast. and a plasmid encoding homocysteine methylase.
親微生物および形質転換微生物を実施例1のように培養する。表VIは各々の菌 株により産生されるメチオニンの相対量を示している。Parent microorganisms and transformed microorganisms are cultured as in Example 1. Table VI shows each bacteria. The relative amount of methionine produced by the strains is shown.
大腸菌母体 硫酸塩 − 大腸菌母体 硫化物 − 大腸菌形質転換体 硫酸塩 十 大腸菌形質転換体 硫化物 ++ C,glutamicum母体 硫酸塩 −C,glutamicuc母体 硫 化物 −C,glutamicum形質転換体 硫酸塩 十c、 glutam icum形質転換体 硫化物 ++B、 flavul母体 硫酸塩− B、flavum母体 硫化物− B、 flavu脇形質転換体 硫酸塩 十B、flavuI11形質転換体 硫化物 ++* 全ての菌株はホモシスティン メチラーゼ活性が欠如して(す る。Escherichia coli mother body sulfate − Escherichia coli mother body sulfide − Escherichia coli transformant sulfate 10 E. coli transformant sulfide ++ C, glutamicum parent sulfate -C, glutamicum parent sulfate -C, glutamicum transformant sulfate Toc, glutamicum icum transformant sulfide ++B, flavul mother sulfate- B, flavum matrix sulfide- B, flavu armpit transformant sulfate 10B, flavu I11 transformant Sulfide ++ * All strains lack homocysteine methylase activity (all Ru.
** 少ない(−)、中間(+)、多い(++)実施例7 ホモセリンによるメチオニンの産生 (メチルスルフヒトリレーション経路)実施例6の欠失親菌株を、***酵母から の0−アセチルホモセリン(チオール)−リアーゼをコード化するプラスミドで 形質転換する。親微生物および形質転換した微生物を実施例3のように培養する 。表VIIは各々の菌株により産生されるメチオニンの相対量を示している。** Low (-), medium (+), high (++) Example 7 Production of methionine by homoserine (Methylsulfhydration pathway) The deletion parent strain of Example 6 was obtained from fission yeast. A plasmid encoding 0-acetylhomoserine (thiol)-lyase of Transform. Parent microorganisms and transformed microorganisms are cultured as in Example 3. . Table VII shows the relative amount of methionine produced by each strain.
大腸菌母体 − 大腸菌形質転換体 ++ C,glutamicuI11母体 −Coglutamicum形質転換体 ++B、 flavum母体 − B、 flavum形質転換体 ++ * 全ての菌株はホモシスティン メチラーゼ活性が欠如して0る。E. coli mother body − E. coli transformant ++ C, glutamicuI11 mother - Coglutamicum transformant ++B, flavum mother body - B, flavum transformant ++ *All strains lack homocysteine methylase activity.
** 少ない(−)、多い(十+) 口G、1a 口G、 Ib き S 蒼 1 口G、 1d 入 ・−一一一・−1針6+1綿10. PCT/lJs93101351** Few (-), many (10+) Mouth G, 1a Mouth G, Ib Ki S Ao 1 Mouth G, 1d Enter ・-111・-1 needle 6+1 cotton 10. PCT/lJs93101351
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