JPH07503713A - 蛋白質の高度グリコシル化阻害剤として有用なアミノ酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛋白質の高度グリコジル化阻害剤として有用なアミノ酸関連文献 本出願人は、本発明の出願対象に関連する下記文献の共著者である：’Ｃｏｙａ ｌｅｎ４　ＡｔＨｃｈｍｅｎｆ　ｏｆ　５ｏｌｕｂｌｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｂ ７　Ｎｏｎｅ＋ｕ７＋ｕｊｉｃ−ｔｌ１７　Ｇｌｙｃｏｓ７１ａｔｃｄ　Ｃｏｌ Ｃｏ１１ａ、Ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎ　Ｓ目ｕ　Ｆｏ＋ｍｘｌｉｕ　ｏｆ 　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｃｏｗｐｌｏｔｓ　（非酵素的グリコジル化コラーゲンによる 溶解性蛋白質の共有結合付着、免疫複合体のイシントゥ形成における役割）　、 Ｂｒｏｖｎｌｅｅ、Ｍ；Ｐｏｎｇｏｒ　Ｓ、　：Ｃｅｒｘｍｉ、＾、　；　Ｉ、 　Ｅ！Ｐ、　Ｍｅｄ、、　１５８号、１７３９−１７４４ページ、■９８３年： ′Ａｇｉｎｇ　ｏｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：１ｓｏｌｉ＋ｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｄｅ ｎｌ百１ｃｘｌ−ｉｏｎ　ｏｌ　ａ　ＦｌｕｏｔｅｓｃｅｎｔＣｈｒｏｍｏｐｈ ｏｒｅ　Ｉｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｒｅ１ｃｌｉｏｎ　ｏ（Ｐｏ１ｙｐｅ−ｐｊｉｄｅ ＠ｗｉｔｈ　Ｇｌｕｃｏｓｅ（蛋白質の老化：ポリペプチドとグルコースの反応 から蛍光発色団の分離及び同定）　、Ｐｏｎｇｏｒ　Ｓ、　；Ｕｌｒｉｃｈ　Ｐ 、　；Ｂｅｎｃｓｘｌｈ、　Ａ、　Ａ、、　；Ｃｅｒａｍｉ、　Ａ、　；　Ｐｒ 盾■ 、Ｎｘ１ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８１号、２６ｇ２−２６８８ページ 、１９８４年：　’Ａｄｙｘｎｃｅｄ　Ｇ１７ｃｏｓｙｌａｊｉｏｎ　Ｅｎｄ　 Ｐ＋ｏｄｕｃｔｓｉｎ　Ｔｉ５ｓｕｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｃｍｉｃｘ ｌ　Ｂｘｓｉｓ　ｏｆ　c ｉａｂｅｌｉｃ　ＣｏｍｐｌｉｃＮｉｏｎｓ　（組織における高度グリコジル化 最終生成物及び糖尿合併症における生化学的基礎）　、Ｂｒｏｖｎｌｅｅ　Ｍ、 、　；Ｃｅｔｘｍｉ　Ａ、　；Ｖ１ｇｓｓａｒ！Ｈ，；　Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　３１８号、１３１５ −１３２１ページ、１９８８年。これら文献は参考のために提示した。

発明の背景 本発明は全体的に、グルコースの反応に起因する蛋白質の老化に関し、より詳し くは、蛋白質の非酵素的グリコジル化及びそれにつづく高度グリコジル化最終生 成物に至る反応ならびにその阻害のための方法及び薬剤に関する。

グルコースと蛋白質との反応は知られている。その最初の発現は食品を調理する 際の褐色化であり、これはメイラードにより１９１２年に確められた。メイラー ドはグルコースあるいはその他の還元糖がアミノ酸と反応して付加物を生成し、 これは一連の脱水化及び再構成を経て安定した褐色色素を生成することを観察し た。Ｍａｉｌａｒ＋１．Ｌ、Ｄ、、　Ｃ，Ｒ，Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、１５４号、 ６６−６８ページ、１９１２年。

メイラードの発見に続く数年、食品化学者は仮説である反応を詳細に研究し、保 蔵されあるいは熱処理された食品が、グルコースとポリペプチド鎖との反応の結 果として非酵素的褐色化を生ずること、その結果蛋白質は架橋結合（ｃｒｏｓｓ ｌｉｎｋｉｎｇ）Ｌ、それに応じてか減じることを確認した。この時、蛋白質グ リコジル化の結果として進行する褐色化にかかわる色素が、特徴的なスペクトル 及び蛍光特性を有することが確かめられた。しかしこの色素の化学構造は明確に 解明されなかった。

上に述べた還元糖及び食品蛋白質の間の反応は生体内（ｉｎ　ｖｉｖｇ）で同様 に行われていることが最近発見された。かくしてグリコースと、蛋白質の遊離ア ミノ基との間で非酵素的に反応して、アマトリ生成物として知られる安定したア ミノ、１−デオキシケトシル付加物を生成する反応は、ヘモグロビンとの間でも 生ずることがわかり、この場合、ヘモグロビンのβ−鎖のアミノ末端とグルコー スとの反応による再構成により、ヘモグロビンＡＩＣとして知られる付加物を生 成する。この反応はまた種々の身体プロティン、例えばレンズ結晶体、コラーゲ ン、神経蛋白質などでも生じることが発見された。Ｂｕｎｎ、　Ｈ，Ｆ、　、　 Ｈａｎｅｙ、　Ｄ、　Ｎ、　、　Ｇａｂｂａ７、　Ｋ、　Ｈ，及びＧ！　ｌ　ｌ ａｐ、　Ｐ、　Ｈ，、のＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ＋、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ ｍｍ、　、　６７号、１O３−１０９ ｒｄ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｎｕｔｔｉｔｉｏｎ、Ｗａ ｌｌｅｒ、Ｇ、Ａ、編集、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅ＋ ７．　２２５号、４３１−４４８ページ、１９８３年；　１Ｊｏｎｎｉｅｒ、　 Ｖ、　Ｍ、及びＣｅｒａｍｉ　Ａ、、のＣｌ１ｎｉｃｓ　ｉｎ　Ｅｎｄｏｃ−＋ １ｎｏｌＢ７　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、　１１号、４３１−４５２ペー ジ、１９８２年；参照。

更に、後期段階メイラード生成物のそれに類似するスペクトル特性、蛍光特性を 有する褐色色素もまた生体内に、いくつかの長寿命蛋白質、例えば老人のレンズ 蛋白質やコラーゲン中に観察された。加令による色素の直線的な増加が、２０乃 至９０才の年令の間で、人間に観察された。Ｍ。

ｎｎ１ｅ＋、Ｖ、Ｍ、及びＣｅ　＋ａｍｉ、　Ａ、　、の５ｃｉｅｎｃｅ、　２ １１号、４９１−４９３ページ、１９８１年；Ｍｏｎｎ１ｅ＋、　Ｖ、　Ｍ、及 びＣｅｒａｍｉ、　Ａ、　、のＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ、 　７６０号、９７−１０３ページ、１９８３年；及びＭｏｎｎ　ｉ　ｅ　ｔ、　 Ｖ、　Ｍ、　、　Ｋａｈｎ、　Ｒ，Ｒ及びＣｅｒａｍｉ、　Ａ、　、の′＾ｃｃ ｅｌｅ＋ａｔｅｄ　Ａｇｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｂ＋ｏｖｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｈｕｍ −ａｎ　ＣｏｌＣｏ１１ａ　ｉｎ　Ｄｉｚｈｅｆｅｓ　ＭｅｌｌＨａｓ’、　Ｐ ＋ｏｃ、　Ｎａｊｌ、’Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　８１号、５８３−５８７ペ ージ、１９８４年参照。興味深いことに、コラーゲンの老化は、グルコースによ り誘導される架橋結合により試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）でも模倣されてるこ と、また他の蛋白質の捕捉及びコラーゲンによる付加物が生成することも観察さ れ、架橋反応により生じることが理論ずけられ、これは、腎臓底部膜にアルブミ ン及び抗体の蓄積が観察される理由である、と信じられている。Ｂｒ５（１）号 、５７−５９ページ、１９８４年参照。

最近、非酵素的架橋結合における、果糖を含むその他の天然還元糖の役割が論議 された。特に、５ｑａｔｕ等の’ＡｄｍｉｎｉｓｌｒＮｉｏｎ　ｏｌ　ａｎ　Ａ ｌｄｏｓｅ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｉｎｄｏｃｅｓ　ａ　 Ｄｅｃｒｅａｓｅ　ｏｌ　ＣｏｌＣｏ１１ｘ　Ｆｌ−ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎ 　Ｄｉａｂｅ＋ｉｃ　Ｒａｆ＋’、］、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、　８２号、 ６２４−６２７ページ、１９８８年は、グルコースが先ずソルビトールに次いで 果糖に至るポリオールの経由する経路の結果、糖尿病における果糖濃度が上昇す ることを示している。これら研究者はまた、コラーゲンの蛍光により測定される ように、非酵素的架橋結合を生じさせる果糖の能力は、グルコースのそれより゛ も１０倍大きい、ことを示した。本発明の方法及び薬剤は、反応性のある糖のい ずれかにより仲介される非酵素的架橋結合を阻害することを目的とするのである から、果糖により仲介される架橋結合も防止することが期待される。生体内、あ るいはリボース及びガラクトースを含む食品中、に存在する他の反応性のある糖 により生ずる架橋結合もまた、本発明方法及び組成物により防止される。

親出願である米国特許出願筒５９０．８２Ｑ号（現在米国特許第４．６６５．１ ９２号）及び先述Ｐｏｎｇｏｒ、　Ｓ、　Ｍ、ほかによる文献によれば、′蛍光 発色団が単離同定され、ある種の褐色ポリペプチド、例えばウシ血清アルブミン やポリーＬ−リジン中に存在すること、また２−（２−フロイル）−４（５）　 −２（フラニル）−１Ｈ−イミダゾール、の構造を有すること、が示されている 。この化合物は互変異性状態で存在し、その構造中に二つのペプチド由来アミン 窒素を有することがわかった。化合物中にこのようなアミン窒素及び二つのグル コース残基を有することは、そのペプチド結合前駆体がメイラード反応の後期段 階に観察される、グルコースによる蛋白質の生体内架橋結合に関係するかもしれ ない、ということを示唆している（Ｃｈａｎｇ、　ｌ　Ｃ，Ｆ、　、　Ｕｌ＋ｉ −ｃｈ、　Ｐ、　Ｃ，、Ｂｕｃｘｌａ、　Ｒ，及びＣｅ＋ａｍｉ、　Ａ、　。

□　により、高度グリコジル化最終生成物の同定が可能であり、更に、蛋白質老 化プロセスを明かにすること、その阻害方法及び薬剤を開発するための特定の化 学の方向を定めることができる。本出願の方向はこのような目的に資するように する。

ごく最近、他の高度グリコジル化生成物が同定された。例えばＦａ＋ｍａ＋ほか の米国特許出願８９７．８５６号、出願臼：　１９８７．９．＋７．ビラリン（ 〕＼ヤセほか、’Ａｇｉｎｇ　ｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｌｌ　Ｄｅｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｌ　ＩＧｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｐｙｒ ｒｏｌｅ　Ｆｏｒｍｅｄ　ｄｕｒｉｎｇ　Ｍａｉｌｌｘｒｄ　Ｒｅｘｃ４ｉｏｎ ｉｎ　Ｖｉｖｏ’、　Ｊ、Ｂｉ’ｏ戟B Ｃｈｅｍ、　、　２６３号、３７５ｇ−３７６４ページ、１９８９年）、ペント シジン（Ｓｅｌｌ、　Ｄ及びＭｏｎｎ１ｅ＋　Ｖ、’Ｓｌ＋ｕｃｔｕｒｅ　Ｈｕ ｃｉｄｘｊｉｏｎ　ｏｆ　ａ　５ｅｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｃｒｏｓｓ−１ｉｎｋ　 Ｉｒｏｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｅｘｔ＋ａｃｅｌｌｕｌａ＋　Ｍｓｔ＋ｉｘ″、１．Ｂ ｉ−ｏｌ、ｃｈｅｍ、、２６４号、２１５９７−２１６０２ページ、１９８９年 ）、参照。これらの高度グリコジル化生成物の生成は、本発明方法及び薬剤によ り阻害されよう。即ち本発明はこれら特定の高度グリコジル化最終生成物のいず れかに限定されるものではなく、蛋白質と糖との反応の結果としてのそれらの生 成物生成の全体のプロセスにかかわる。

本発明の要約 本発明によれば、蛋白質老化阻害のための方法及び薬剤が提供される。

特に、高度グリコジル化最終生成物の生成に基づく蛋白質老化を阻害する薬剤が 、グルコースと蛋白質との反応による初期グリコジル化生成物と反応することが でき、それ以上の反応を防ぐ物質のなかから選ばれる。

かくして、例えば、ヒドラジン基などの活性窒素含有置換基を有する化合物ある いは組成物が、理論的には適当であり、アミノグアニジン、α−ヒドラジノヒス チジン及びリジンなどの化合物が適当であることがわかった。これら薬剤は、初 期グリコジル化生成物の反応性カルボニルと反応し、それにより、蛋白質架橋結 合を導く高度グリコジル化最終生成物の生成を阻害するように見える。

本発明に使用するために特に適当な薬剤は下記式を有するアミノ酸及びその誘導 体であり： ＮＨ２０ 式中Ｒは、水素：低級アルキル基、但し任意に１個又は２個のヒドロキシル、チ オール、フェニル、ヒドロキシフェニル、低級アルキルチオール、カルボキシ、 アミノカルボキシ又はアミノ基で置換されてもよい；及びその生体適合性があり 薬理学的に受けいれられる酸付加塩、のうちから選ばれる基から選択される。

ここで述べられる低級アルキル基は、炭素原子を１−６個有し、メチル、エチル 、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル及び枝分かれのある対応する異性体を 含む。

使用されるアミノ酸は、Ｌ＆Ｄ立体化学的構造を有するか、その混合物として使 用されるものであるが、Ｌ構造のものが好ましい。

本発明の式Ｉ化合物の均等物は、生体適合性があり薬理学的に受けいれられるそ の塩である。このような塩は種々の無機酸及び有機酸、例えばメタンスルホン酸 、塩酸、トルエンスルホン酸、硫酸、マレイン酸、酢酸、リン酸及び関連する酸 のうちから選ばれる。

式■の化合物のうち、ある種の置換体が好ましい。

本発明の代表的な化合物は、リジン；２，３−ジアミノコノλり酸エラスチン、 及びこれらの生体適合性があり薬理学的に受けいれられる塩である。

本発明はまた、初期グリコジル化生成物の段階で初期グリコジル化蛋白質を、本 発明薬剤の一種または数種のある量と接触させることにより、蛋白質老化を阻害 する方法に関わる。本発明方法に産業上の有用性を発揮するため、特定食品の早 過ぎる老化及び劣化を避けるよう、薬剤の一種あるいは数種を問題の蛋白質に適 用する。その際、蛋白質抽出物の場合にはその混合物に薬剤を導入し、蛋白質を 含む食品の場合、薬剤を塗布あるいは導入する。

治療用途に用いる場合、治療すべき動物宿主に適当な薬剤形態で薬剤の一種又は 数種を投与する。投与の方法は既に知られた方法で行えばよく、例えば経口的、 局部的あるいは腸管外方法、例えば皮肉注射、皮下注射、静脈注射、腹腔的注射 、あるいはその他の慣用手段によって行う。

薬剤投与量は長期間にわたり、例えば１ｋｇあたり約２５ｍｇまでの投与濃度で あってよい。

高度グリコジル化最終生成物の生成阻害能は、蛋白質老化が重大な障害をもたら す様々な分野で利用価値が見出される。食品工業では食品劣化を遅延させること により経済的、社会的な利益が得られることは明らかである。同様に、蛋白質の 劣化が問題となる他の工業分野でも、そのような蛋白質を含む組成物中に本発明 薬剤を混合させその利用可能寿命を延長させることにより、利益が得られる。今 日利用されている食品保存剤や変色防止剤、例えば動物におけるアレルギーやぜ ん息を含む中毒症状を引きおこすことが知られている二酸化イオウ、などはここ に記載されている化合物でとって代わられるかもしれない。

本発明方法は特有の治療用途をもつ。なぜならメイラード反応プロセスは身体、 特にコラーゲン、エラスチン、レンズ蛋白質、腎臓糸球底膜における蛋白質に重 大な影響を与えるからである。これら蛋白質は加令と共に劣化しく従って“蛋白 質老化（ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｇｉｎｇ）”なる用語を用いる）、また糖尿病の続 発症として劣化する。従って高度グリコジル化最終生成物の生成を遅延させるか 実質的に阻害しうろことは、糖尿病の症状を治療しつる期待を抱かせると共に、 動物寿命の延長とその質の改善をもたらすことになる。

従って本発明の主たる目的は、蛋白質と、グリコースあるいはその他の還元糖と の反応の最終的な結果として生じる蛋白質の広範な架橋結合を阻害することによ り、高度グリコジル化最終生成物の生成を阻害する方法を提供することである。

本発明の別の目的は、初期グリコジル化生成物との反応により特徴ずけられる上 記方法を提供することである。

本発明の別の目的は、前記高度グリコジル化最終生成物の生成をもたらす前記初 期グリコジル化生成物の再構成と架橋結合を防止する方法を提供することである 。

本発明の更に別の目的は、上記方法における前記初期グリコジル化生成物の反応 に関与しつる薬剤を提供することである。

本発明の更に別の目的は、動物蛋白の脆化及び食品の褐色化並びに劣化をもたら すことが明らかな蛋白質老化の悪影響に対処する方法を提供することである。

その他の目的及び利点は、図面を伴う以下の説明を読むことにより当業者には明 らかであろう。

図面の簡単な説明 第１図は、試験管内で、過剰のグルコースと反応したアルブミンにおける高度グ リコジル化の生成を阻害することを目的とした研究の結果を示すグラフである。

第２図は、コラーゲンのような構造蛋白質のグリコジル化による蛋白質の捕捉及 び蓄積を阻害することを目的とした研究の結果を示すグラフである。

第３Ａ図は、本発明の薬剤による処理をする場合及びしない場合のグルコースと 保温したコラーゲンの可溶化の度合いを示すグラフである。

第３Ｂ図は、本発明の薬剤で処理をする場合及びしない場合のグルコースと保温 したコラーゲンの臭化シアン処理後の蛋白質断片の分離を示すポリアクリルアミ ドゲルの写真である。

第４図は、本発明の薬剤が一定量投与された糖尿病のラットの腎臓糸球体底部膜 に結合した蛋白質の程度を検査する生体内の研究の結果を示すグラフである。

好ましい実施態様の詳細な説明 本発明によれば、動物体及び植物体の双方に存在する種々の標的蛋白質における 、高度グリコジル化最終生成物の生成を阻害する組成物及び方法が開発された。

本発明は特に、蛋白質の初期グリコジル化段階で生成する初期グリコジル化生成 物のカルボニル部分と反応させることにより、標的蛋白質の高度グリコジル化最 終生成物の生成を阻害することのできる一種又は数種の薬剤を含む組成物に関わ る。

初期グリコジル化生成物の糖部分と蛋白質部分の結合部近くに位置するカルボニ ル基は、蛋白質の架橋結合を生起させて高度グリコジル化最終生成物を生成する 活性部位を有すること、また生体内で皮膚のしわ、ある種の腎臓病、アテローム 硬化症、変形性関節症などの進行をもたらすことが明らかな他の蛋白質の捕捉、 に寄与することが理論化されている。かくしてこのカルボニル部分と本発明化合 物とを反応させることにより、後期メイラード反応を阻害し、上述のような有害 な変化に干渉することができると考えられる。

本発明の原理は、糖尿病の症状及び老化と関係するかこれに導くような、Ｐｏｎ ｇｏ＋ほか（先述）及びＦｕｍｕほか（先述）等により同定された蛍光発色団の 生成をもたらす後期グリコジル化段階を阻止する薬剤、を使用することに基礎を おく。理想的な薬剤は、発色団の生成及びそれに伴う蛋白質と蛋白質との架橋結 合、及び動脈や腎臓中で生じているような他の蛋白質上への蛋白質の捕集等を阻 害するものである。

本発明は初期蛋白質グリコジル化の阻害を意図するものではない。なぜなら、グ ルコースと蛋白質アミノ基との反応を防ぐ薬剤を使うことは殆んど不可能である からである。初期グリコジル化を防ぐことのできる薬剤は、毒性が極めて高く、 また初期グリコジル化は約３週間で平衡に達するため、この目的を達するために は時間的に不十分である。これにかわり理想的な薬剤の場合、老化及び糖尿病に 関係する病理の直接原因である最終的な進行グリコジル化生成物の生成を導く、 長期間の後期グリコジル化段階を防止あるいは阻害することを意図する。

本発明化合物が反応すると考えられる初期グリコジル化生成物の化学的性質は理 論上のものである。高度グリコジル化生成物の生成に関係すると考えられ、本発 明化合物との反応により阻止されるカルボニル部分、を有する初期グリコジル化 生成物について、仮説が考えられている。一つは、アマトリ生成物の反応性カル ボニル部分もしくはその脱水及び／または再構成生成物が縮合して高度グリコジ ル化最終生成物を生成するというものである。提案された別のメカニズムは、ア マトリあるいはその他の初期グリコジル化生成物の開裂からのカルボニル部分（ 例えばグリコアルデヒドあるいは３−デオキシグルコソン）を含む反応性カルボ ニル化合物を生成しく例えばＧｏｔｌｓｃｈａｌｋ、　Ａ、、１９７２年、Ｔｈ ｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏ＋ｅｉｎ＋　（Ｇｏｌｔｓｃｈａｌｋ、人９２編集）　、 Ｐａ「ｔ　Ａ、１４１−１５７ページ、Ｅｌｉｅｖｉｅ＋　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ ｇ　ＣＯ，、Ｎ、　Ｙ、　；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、　Ｔ、　Ｍ、　、１９６５年、 Ａｄｖ、　Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓ、　、　１４号、＋６V−２８ ３ページ参照）、引きつづくアミンもしくはアマトリ生成物との反応により、カ ルボニルを含む高度グリコジル化生成物、例えば先述Ｆａ＋ｍｕｌｉかにより記 載されるアルキルホルミルグリコシルビロールなどを生成するというものである 。

高度グリコジル化生成物生成のメカニズムについて焼入かの研究者が研究をした 。ニブル（Ｅｂｌｅ）ほかの試験管内研究である’Ｎｏｎｅｎｘｙ−ｍｘｊｉｃ における非グリコジル化蛋白質とグリコジル化蛋白質の架橋結合について記載し ている。ニブルはかば、メイラード反応のメカニズムの解明をこころみ、ＲＮＡ ａｓｅモデル系として、その初期グリコジル化を制御された状態で実施し、次い で様々な条件下で検査した。

一つの局面では、グリコジル化蛋白質材料を分離してグルコースのない環境下に おき、架橋結合の範囲を観察した。ニブルはかば、グリコジル化蛋白質のみなら ず非グリコジル化蛋白質についても、架橋結合の発生が継続することを観察した 。ニブルはかにより注目された観察の一つは、グルコースと蛋白質材料との反応 が蛋白質鎖のアミノ酸の位置で生じるように見えたことである。これについてニ ブルらが実施した確認試験の結果、遊離リジンは、グルコースと結合するためＲ ＮＡａｓｅのリジンと競合するということがわかった。これらのデータからリジ ンは高度グリコジル化の阻害剤として機能するということが推論できるかもしれ ない。

しかしこの結論及び根拠となる観察結果は、ニブルらにより準備され検査された モデル系の比較的限定された資料に基ずくものであることを考慮する必要がある 。明らかなことではあるが、ニブルほかは、生体内及び試験管内の双方で蛋白質 の高度グリコジル化を阻害することに関する本発明の詳細な説明を認識しておら ず、また示唆もしていない。

ニブルはかの実験は、グルコースが常に存在する高度グリコジル化最終生成物の 生体内生成における反応性開裂生成物メカニズム（ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｃｌｅａ ｖａｇｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）あるいはその他のメカニズム を示唆するものではない。実際他の研究音速は生体内における高度グリコジル化 最終生成物の生成を説明するこのメカニズムを支持している（例えばＨｘ７ａｓ ｅほか、１９８９年、既述；５ｅｌｌ及る阻害剤としてのリジンの使用は、生体 内でグルコースの存在下における高度グリコジル化最終生成物の生成の阻害及び 糖尿病余病や老化の改善に関する本発明化合物の有用性に何等の影響を与えるも のでない。

さて、本発明において有用な組成物は、初期グリコジル化生成物の活性カルボニ ル中間物と反応することができる薬剤からなるまたは含む。

適当な薬剤は活性窒素含有基あるいは置換基、例えばヒドラジン基、を有する化 合物である。薬剤はまたアミノ酸及びそのエステルならびにアミドから少くとも 部分的に由来するものである。なぜならこのような化合物は、接触する標的蛋白 質と一般的に生体適合性を有するからである。

例えば、薬剤は、アミノグアニジン、α−ヒドラジノヒスチジン、リジンあるい はこれら薬剤又は化合物の混合物を含むものであってよい。これら薬剤あるいは 化合物のそれぞれは、初期グリコジル化生成物のカルボニルと反応すると考えら れる活性窒素含有置換基を有する。かくして薬剤と、蛋白質のグリコシルーリジ ン部分との反応によって、この部分が他の基と架橋結合することが阻止される。

Ｈｏｍ５及びＳｍｃｋｂｅｒｇｅｒは、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、　２８号、 ２Ｂ２−５ページ、１９８５年において、酵素ヒスチジンジカルボキシラーゼの 公知阻害剤であるα−ヒドラジノヒスチジンの生体内投与により、ラットの大動 脈のアルブミンの蓄積が減少することを見出したことを記載している。著者はこ の薬剤がこの組織におけるヒスタミンの生産を減少させる作用をすること、また 従ってヒスタミンがアテローム硬化症に関係する低濃度リボ蛋白質蓄積の媒介物 であること、を提案している。これと対象的にアミノグアニジンはヒスタミンの 濃度を増加させることが知られており（Ｌｉｎｄｂｅｒｇほか、　Ａｃ１ａ　０ ｂｓｔ、Ｇ７ｎｅｃｏ１．５ｃａｎｄｉｎｕ、、４５号、＋３１−１３９ページ 、１９６６年）、α−ヒドラジノヒスチジン及びアミングアニジンは、ヒスタミ ン濃度に及ぼす影響が相反している。従って、α−ヒドラジノヒスチジン及びア ミノグアニジンの双方が生体内及び試験管内で蛋白質架橋結合を減少させる効果 を有するという本発明の基礎となる発見は、著者等の視野に入っていないもので あり、従って著者であるＨｏ１ｌｉｓ及び５ｊｒｉｃｋｈｅ−ＩｇｅＩらにより 提案されるメカニズムは、高度グリコジル化最終生成物生成を減する作用を有す る本発明化合物に力いゎる説明のそれと、まったく異なったものである。更に、 ｆｌａｌｌｉｓ及びＳＤｉｃｋｂｅｒｇｅｒの発見は本発明の概念及び利用とは 異なっている。なぜなら彼等により示唆されている、α−ヒドラジノヒスチジン によるヒスタミン合成抑制メカニズムは本発明の基礎をなす概念と機能的な相違 があり、実際上疑問の点があるからである。

本発明薬剤は、初期グリコジル化生成物のカルボニル部分と反応して高度に安定 な付加物をつくるというその能力をたしがめ試験を重ねたものであり、Ｈｏ１ｌ ｉｓ及びＳｊ＋１ｃｋｂｅ＋ｇｅ＋の研究がら示唆できるものではない。

アミノグアニジンなる化合物は動物体中で低度の毒性を示すことが知られている 。化学物質の毒性に関する１９７８年登録データによれば、アミノグアニジン塩 基は、ラットに１２５８ｍｇ／ｋｇ、マウスに９６３ｍｇ／ｋｇを皮下投与した 時、ＬＤ５０を有する。その塩酸誘導体をラットに２９８４ｍｇ／ｋｇ皮下投与 した時、ＬＤ５０であった。後者の化合物の毒性は極めて低いものである。

本発明組成物を生体内あるいは治療目的で利用する場合、これに含まれる化合物 あるいは薬剤は生体適合性のあるものであることに注意すべきである。医薬組成 物は、本発明薬剤又は化合物を薬理学的有効量と共に、目的に沿うような公知物 質のうちから選んだ治療学的に受けいれられる担体を使用して調製する。このよ うな組成物は投与形態に応じ種々の形に調製することができる。例えば、アミノ グアニジンは、溶解度を高め、腹腔内注射による刺激をより少くするために、塩 酸塩から市販されている炭酸塩にまでわたっていてもよい。また投与が静脈注射 あるいは腹腔内注射により行われる場合には液体の形にしてもよく、−刃口腔内 投与のためには錠剤、カプセルなどにしてもよい。皮膚に適用するためには、皮 膚中に退入するのに役立つ担体を用いてローションあるいは軟こうの形にしても よい。他の身体組織へ投与するための他の適当な形も考えられる。

本発明はまた標的蛋白質を本発明組成物と接触させることを含む、高度グリコジ ル化最終生成物の生成阻害方法にかかわる。標的蛋白質が、動物性であれ植物性 であれ食品中に含まれている場合、本発明薬剤を含む組成物を種々の慣用手段で 食品に適用してもよい。治療用途が意図される場合、治療される動物に本発明医 薬組成物を定規的に一定量投与すればよい。投与は例えば毎日行われ、投与量は 、動物体重１ｋｇあたり２５ｍｇまでであってよい。局部的な使用の場合、例え ば１０％までの本発明薬剤を含む軟こうあるいはローションを皮膚に適用する。

当然ながらこのような値にはある程度変動があってよく、記載した数値は、発明 の実施のための最良の形態を開示すべき出願人の義務を果すために提示されたも のである。

本発明の詳細な説明から明らかなように、本発明方法及び組成物は、動物、植物 双方におけるキーとなる蛋白質の老化を抑止することを意図し、同時にその結果 として経済的及び医学的な利益が得られるようにする。食品の場合、本発明組成 物を適用することにより食品劣化を遅延させ、それにより保存寿命を延長し、消 費者により多大な有益性をもたらすものである。人体にアレルギーや喘息を生じ させることが知られている二酸化イオウなどの現在使用されている防腐剤に代っ て、本発明により非毒性の生体適合性のある化合物を使うことができるのである 。

本発明の治療方向は老化プロセスの阻止であり、この老化プロセスは既に述べた ように高度グリコジル化及び架橋結合によるキーとなる蛋白質の老化であること が確かめられている。かくして身体蛋白質、特に身体構造蛋白質、例えばコラー ゲン、エラスチン、レンズ蛋白質、神経蛋白質、腎臓糸球体底膜などはすべて、 本発明を実施することによりその寿命の延長及び活性に好影響が得られる。本発 明はかくして標的蛋白質の架橋結合による蛋白質の捕捉から生じる例えば網膜症 、白内障、糖尿性腎臓病、糸球体硬化症、末梢血管病、閉塞性動脈硬化症、末梢 神経障害、発作、高血圧、アテローム硬化症、変形性関節症、大動脈硬化、皮膚 の弾力性欠損及びシワ、関節硬化、糸球体腎炎等の病理状態の発生を減じる。ま た、これら病的状態のすべては患者が真性糖尿病に悩んでいることを示す徴候で ある。かくして本治療方法は、高齢によるあるいは上記病理状態に悩む患者の治 療に関係する。

高度グリコジル化生成物生成をもたらす蛋白質架橋結合は、血管壁におけるコラ ーゲンなどの構造蛋白質の溶解性（Ｂ＋ｏｖｎｌｅｃほか、５ｃｉｅｎｃｅ。

２３２号、１６２９−１６３２ページ、１９８６年、参照）や、コラーゲンへの リボ蛋白質の結合などの捕集血清蛋白質の溶解性を減じる。またこれは、内皮上 基質における溢出血漿蛋白質の共有結合捕集や、酵素による血漿蛋白質及び基質 蛋白質の生理学的な減成への感受性の減少という結果ももたらし得る（Ｂ＋ｏｖ ｎｌｅｅほか、旧ａｂｅｔｅｓ、３５号、補巻１．４２Ａページ、１９８６年参 照）。これらの理由のため、慢性高血糖症により引き起こされる糖尿症血管の進 行性閉塞は、グルコース由来の架橋結合の過度の生成に基ずくと考えられている 。このような巨大血管病変や末梢血管閉塞は、本発明による組成物及び方法を用 いて高度グリコジル化生成物生成を化学的に阻害することにより、有効に阻止し うる。

他の研究により、標的器官の慢性の糖尿病損傷の進行が、主として高血糖症に関 係しており、厳格な代謝制御により末端器官損傷を遅らせるか阻止さえもするこ とが明らかになっている。Ｎ１ｃｈｏｌ−Ｉｓほか、Ｌａｂ、１ｎｔｅａ１．、 　６０（４）号、４８６ページ、１９８９年は、ネズミの糖尿性腎症における小 島同質移植（ｉｓｅｌｅｔ　ｉｓｏｇｒａｆｔｉｎｇ）化及びアミノグアニジン の効果を論じている。これらの研究は、本発明の薬剤であるアミノグアニジンが 、糖尿ラットの腎臓糸球体底部膜における蛋白質架橋結合を減じることを明らか にし、またＢｒｏｖｎｌｅｅらの５ｃｉｅｎｃｅ、　２３２号、１６２９−１６ ３２ページ、１９８６年、における先の研究を、糖尿症の併発症における別の標 的器官に適用することにまで及んでいる。別の研究では、アミノグアニジンによ り腎臓における免疫グロブリン捕集が減少することを示している（Ｂｔｏｖｎｌ ｅｅ　ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、３５号、補巻１．４２Ａページ、１９８６年）。

別の実証は、糖尿性腎臓病の証拠である腎臓中の形態学的変化について提出され た同上のＢｒｏｖｎｌｅｅほかの論文（１９８８年）において、アミノグアニジ ン投与か、ストレプトシトシン−糖尿ラットモデルにおいて糖尿性腎症の進行を 阻止すると述べていることである。これらの研究者は、末期段階の糖尿病性腎臓 病の主たる構造的異常である糸球体底部の膜厚増大が、アミノグアニジンにより 阻止されたことを報告している。これらのデータは、本発明により教示される高 度グリコジル化最終生成物の生成を阻害することにより、糖尿病による初期病変 及び後期病変、また老化過程でグリコジル化最終生成物の生成に起因する変化が 阻止されることを示唆している。

より硬化した細胞膜形成を招く赤血球細胞変形の糖尿病に由来する変化は、架橋 結合の別の証拠であり、アミノグアニジンはこれを生体内で阻止する、ことがわ かっている。

糖尿ラットにおけるコラーゲンの架橋結合の増大は、アミノグアニジンにより示 されている。０ｘｌｕｎｄ及びＡｎｄ＋ｅａｓｓｅｎは、“糖尿ラットにおける コラーゲンの生化学的及び生体力学的安定性の増大は、アミノグアニジン治療に より阻止される”なる論文、糖尿病研究に関するヨーロッパ協会、第２５年次大 会、５２５Ａページ、抄録第３７１号、１９８９年において、その効果を、鍵繊 維の熱安定性を尿素浴中で破砕時間及び機械的強度を評価した際に、示している 。５ｏｕｌｉｓほかは“アミノグアニジンは糖尿ラットにおける組織の蛍光を減 じるが、蛋白尿を減じない”なる論文、老化、糖尿病、及び栄養におけるメイラ ード反応に関する旧Ｈ会議、において、蛍光及び溶解度により測定した大動脈の コラーゲンに対し、同じ効果が得られたことを報告している。

Ｇｉａｍｂｉｏｎｅ及びＢｒｏｖｎｌｅｅは、′アミノグアニジン治療により長 期にわたるストレプトシトシン−糖尿ラットにおける腎臓のラミニンＢｌ　ｍＲ ＮＡの増大した安定状態を正常化する′なる論文において（Ｄｉａｂｅｔｅｓ、 　３８号、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎ１２　：　８３Ａ、アメリカ糖尿病学会第４９年 次総会、１９８９年）、糖尿ラットに対するアミノグアニジン治療により腎臓中 のラミニンｍＲＮＡの糖尿病に由来する上昇を阻止したことを示している。この ことは、アミノグアニジンが、腎臓その他の器官における底部膜の肥厚化、血管 の形態的、機能的劣化を引きおこす基質の過剰生成を阻止するかもしれないこと を示している。

糖尿病の別の影響は、通常慢性糖尿病と関係する骨形成の減少をもたらす骨基質 分化に及ぼす高血糖症の作用である。動物モデルでは、糖尿病は、基質誘導骨分 化を７０％減少させ、試験管モデルでもこの影響を追認する。アミノグアニジン はこのモデルにおける骨形成減少を防止する。

実施例１ 生体内における高度グリコジル化最終生成物の生産を阻害する本発明薬剤の効果 を測定するため、アルブミンとグルコースを２週間、いくつかの試験薬剤の存在 下に保温した。試料を分析のため定期的に採取した。

高度グリコジル化最終生成物を、蛍光化合物の出現を指標として測定し、初期グ リコジル化生成物は、放射線ラベルグルコースをアルブミンに組込むことにより 測定した。反応条件は以下の通りである。夫々混合物は、６ｍｇ／”ｍＬウシ血 清アルブミン、２００　ｄグルコース、２００　ｍＭ試験薬剤（塩酸アミノグア ニジン、α−ヒドラジノヒスチジン、又はリジンのいずれか）及びｐＨ７，６， ０，５Ｍりん酸緩衝液中で１４Ｃ−グルコースを１分あたりほぼ９．５Ｘ１０６ カウントを含んでいた。放射線ラベルグルコースは使用前に予備洗浄腰アルブミ ンと反応して初期グリコジル化生成物生成の濃度を誤った結果に導くような異物 を除去した。反応混合物を３７°Ｃで保温し、試料を０．５．　１．０．１．５ 及び２週間後採取した。対照混合物はグルコース又は薬剤を含まないものであっ た。

保温期間後、試料を以下のように処理した。未結合グルコースを除去するための 透析後、存在する蛋白質量を標準的な染料結合ア・ソセイにより測定した。アル ブミンに結合したグルコースの量、即ち初期グリコジル化生成物の量は、トリク ロロ酢酸と共にアルブミンを沈澱させることにより測定し、結合したグルコース の放射能は、シンチレーションカウンティングにより測定した。高度グリコジル 化最終生成物は、親出願である米国特許出願第５９０．８２０号、及び既述Ｐｏ ｎｇｏｒらが記載していた方法により定量した。阻害剤と共に付加物を形成する 結果これら数値がシフトしていないことを確かめるため、すべての試料について 、励起極大及び放出極大についてスペクトル測定した。

結果は、グルコースとアルブミンが反応して、保温（グルコース＋８ＳＩＩ）シ て０．５．　１．１．５及び２週間後、大量の蛍光性の高度グリコジル化最終生 成物を生成することを示している。２００　ｄのアミノグアニジンを含有させた 場合、対照試料の２週間保温（ＢＳＡ＋グルコース＋１＃２）　後と比較すると 、蛍光化合物の生成について８倍の減少がみられた。

実施例■ 蛋白質架橋結合阻害に及ぼす薬剤の影響をより正確に測定するため、不溶蛋白質 に溶解蛋白質が試験管内で結合する程度を測定するアッセイ装置を考案した。こ のアッセイ装置は組織内で生じる事態、即ち血管外基質において蛋白質に血清蛋 白質が結合し、蛋白質の蓄積を生じ、いくつかのその他組織における血管腔を狭 める事態を模倣するものである。

生体内におけるこのような事態は腎臓病やアテローム硬化症を生起させ、糖尿病 や老化に関係する性状を導く。

蛋白質捕集（即ち結合又は蓄積）を測定するため、ゼラチン（コラーゲン）を活 性化アガロースビーズ（＾ｆｆｉｇｃ１１０．バイオ−レッド研究所製）に通常 の方法で結合させた。結合後、ビーズの残るすべての活性部分は、グリジンエチ ルエステルとの反応により失活させた。

ビーズを、ウシ血清アルブミン及び４００　ｍＮグルコース−６−りん酸塩で２ 週間保温したところ、グルコースよりも迅速に蛋白質と初基グリコジル化生成物 を生成するより反応性の高いグルコース体が得られた。いくつかの実験で２００ ０ＩＮの試験薬剤、アミノグアニジン、α−ヒドラジノヒスチジン、又はリジン を加えた。ウシ血清アルブミンを放射線ラベルしてビーズに結合する量が測定さ れるようにした。ビーズに結合する放射線ラベル量が蛋白質捕集の直接測定値で ある。

この反応性混合物を２週間保温後、ビーズをカオトロピズム剤で洗い、共有結合 放射線活性を測定した。

リジンもまたアミノグアニジンのそれと同様の程度に蛋白質捕集量を減じる（示 されていない）。試験結果は、これら化合物が膜その他の組織に対する溶解蛋白 質の生体内捕集を減じさせること、またこれら薬剤が糖尿病や老化の病理を減じ る効果があることを示す。

実施例■ 蛋白質捕集、架橋結合及び高度グリコジル化最終生成物の生成を防止するモデル としてのアミノグアニジンの別の評価のため、子牛皮コラーゲンを用いた以下の 実験を行った。コラーゲンは皮のしなやかさに関与する皮膚蛋白質であって、こ れの架橋結合は、シワの形成、弾力性減少、蛋白分解性その他の変化を招来する 。

ウシ皮試料からのコラーゲンを酢酸中に抽出し、０．６Ｍの塩化ナトリウムと共 に沈澱させた。この処理により、溶液から、既に永久的に架橋結合しているか変 性している皮コラーゲンが除かれた。天然のコラーゲン原線維を０．０２Ｍりん 酸塩緩衝液で透析することにより新しくシ、次いで２００　ｍＭアミノグアニジ ンと共に、あるいはアミノグアニジンを使わずに、１４０　ｍＭグルコースの存 在下で、３５℃の温度で３週間保温した。保温後、試料を透析し次いで架橋結合 の程度を二つの方法で測定した。生ず、１００℃の２％ドデシル硫酸ナトリウム 中で処理することにより溶解する反応したコラーゲンの量を測定した。

グルコースとアミノグアニジンで保温したコラーゲンは、緩衝液だけの中で保温 したコラーゲンと同様の溶解性があった。これと対照的に、アミノグアニジンを 用いずグルコース中で保温したコラーゲンは５０％しか溶解しなかった。このこ とは、皮その他の組織中における年令に関係する変化をアミノグアニジンが防止 することを示す別の証拠である。

反応したコラーゲンは、ギ酸中の臭化シアン処理を行って破片化することにより 更に検査した。得られた蛋白質断片をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア ミドゲル電気泳動により、サイズ別に分けた。電気泳動後、銀染色法を用いてゲ ル中の蛋白質部分を同定した。

以上の結果は、アミノグアニジンが、コラーゲンをグルコースで保温した時に生 じる架橋結合の量を減すること、またこの薬剤を局部的に適用することにより、 弾力性の減少及びしわの形成を含む年令に関係する変化を防止しうろことを示し ている。

上記の試験管内実験はすべて、グルコースあるいはその他の還元糖の存在下で保 温された蛋白質から試験管内で形成される高度グリコジル化最終生成物の生成阻 害剤として、アミノグアニジンが有用であることを示している。身体内にはグル コースが存在しており、糖尿病の場合量が上昇しており、身体中では架橋結合が 行われ、高度グリコジル化最終生成物であることを示す蛍光化合物が生成される ことがわかっているから、この薬剤を生体内で使用することは、糖尿病と関連す る病理及び老化の過程で生じる変化の防止に有用であることが推論される。

かくして本発明の仮説を生体内で試験すべく、以下の実験を行った。

実施例■ 生体内における高度グリコジル化最終生成物の濃度を測定するため、ラットの腎 臓の、糸球体底部膜に着合した血清蛋白質について検査した。

これは良好なモデルであることがわかった。なぜなら、この器官の血管外基質に おける溢出血漿蛋白形成の結果、未治療糖尿病における著しい病理状態が生じる ことが観察されるからである。

実験は、正常ラット及び糖尿病ラットに対し、毎日、身体重量キログラムあたり ２５ｍｇの塩酸アミノグアニジン薬剤を１６週間腹腔内投与することにより行っ た。アミノグアニジンの塩酸塩は、もとの遊離塩基化合物よりも溶解性があり刺 激性が少いために使用された。薬剤投与前に糖尿病を一回のストレプトシトシン 投与により生じさせた。比較例である正常ラット及び糖尿病ラットには薬剤投与 は行われなかった。薬剤治療終了後、ラットは殺されて腎臓を除去した。夫々の 器官をその被膜から除去し、髄質を除去した。主として糸球体からなる組織残部 をドライアイスで凍結し、−７０°Ｃて保存した。各処置群毎に５匹のラットの 組織を標本とした。

糸球体底部膜を準備するため、組織をスライスし、一連のふるい分けをしく１７ ０　、　１００及び２７０）、文献に見られるように（Ｂｅｉｓｓｖｅｎｇｅ＋ 、　Ｐ。

１、、Ｓｐｉ＋ｏ、Ｒ，Ｇ、、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２２号、１８Ｇ−１９３ペー ジ、１９７３年）、細管その他の望ましくない組織構成分から分離した。糸球体 それ自体は８０−９０％であることがわかった。最終的な試料を集め、１５分間 １５００＋ｐｍで遠心分離して糸球体をペレット化し、−７０°Ｃで冷凍した。

融解した糸球体をＢ＋ａｎｓｏｎ　５ｏｎｉ！ｉｅ＋　２００型細胞粉砕機で、 氷の上で１分間の間隔を４回おいて粉砕した。試料を相コントラス顕微鏡で検査 して、糸球体すべてが粉砕されていることを確かめた。次に糸球体底部膜を３０ ００＋ｐｍで１０分間遠心分離を行うことによりペレット化し、１Ｍ塩化ナトリ ウムで、次いで蒸留水で、洗浄した。清浄化した糸球小体底部膜の残るペレット は冷凍し、凍結乾燥した。

酵素免疫アッセイ法を用いて、薬剤処理した後のあるいは薬剤処理しない正常ラ ット及び糖尿ラットの糸球体底部膜に結合した、血清免疫グロブリンＧ　（Ｉｇ Ｇ）の量を測定した。ＩｇＧを測定するため、凍結乾燥した糸球体底部膜組織の ６ｍｇ試料を、ｐＨ７，６のｆｌ、０５Ｍ炭酸塩緩衝液の０．５ｗＭ中に懸濁し 、アルカリりん酸塩に共役結合したラット抗−１ｇＧ抗体の１＝５．０ＧＯ希釈 液（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社製）の０．５　ｍＭを加えた。この混合物をポリスチレ ン管中で一晩保温した。このポリスチレン管は、りん酸塩で緩衝された食塩水（ ＰＢＳ）中に溶かした３％ヤギ血清プラス０．０５％　Ｔｖｅｅｎ　２Ｇ中で２ 時間保温することによりあらかじめブロックし、次いでＰＢＳプラスＴｗｅｃｎ で２回ゆすいだ。

一昼夜保温することにより抗体を、糸球体底部膜に架橋結合したいずれかのＩｇ Ｇに結合させた後、膜を５分間３２００＋ｐｍで遠心分離することによりペレッ ト化し、未結合抗体−酵素共役物をＢＢＳプラスＴｖｅｅｎで４回ゆすぎ次いで 蒸留水で３回すすぐことにより洗った。結合した抗体−酵素結合物の量を測定す るため、０．５ｍＭの基質溶液（１０％ジェタノールアミンに溶かした１ｍｇ／ ｍＬパラーニトロフェニルフォスフェート、ｐＨ９，８、を含む）を添加し、室 温で３０分間保温した。反応は０．２ｍＬの水酸化ナトリウムを添加することに より停止し、４００　ｎｏにおける吸収を測定した。

糖尿ラットは糸球小体底部膜（“Ｄ”）に結合したＩｇＧを高濃度有し、正常ラ ットの量（“Ｎ“）はその約１１５であった。塩酸アミングアニジンを毎日投与 された糖尿ラットのＩｇＧは正常ラット（“Ｄ＋１”）と同じ低い濃度であった 。薬剤を投与されない正常ラット（“Ｎ＋Ｉ”）も同じ濃度の低さであった。

これらの実験は、アミングアニジンが、ラットの糸球体底部膜に対するこの血漿 蛋白質の捕集及び蓄積を阻止すること、を示している。おそらく、腎臓、静脈壁 、その他糖尿病等により影響を受けることが知られている組織におけるこの蛋白 質あるいはその他の血清蛋白質の捕集もまた、同様に減少する、と考えられる。

静脈壁におけるリボ蛋白質の捕集は、アテローム硬化症を引きおこすことが知ら れている。

試験管内実験に加え、これらの生体内実験結果は、この種の薬剤治療が、蛋白質 の高度グリコジル化、及び蛋白質その他の巨大細胞相互の架橋結合形成と結びつ いた症状の阻害を効果があることの実証している。

この薬剤治療は、腎臓病、高血圧症、網膜損傷、朧、靭帯、関節等の血管外損傷 、を含む動脈疾病などの合併症を導く糖尿病や老化の場合に生じる、蛋白質の増 大した捕集及び架橋結合を阻害するために使用される。

この治療は、糖尿病や老化に伴うアテローム硬化症や結合組織変化を遅延させる ためにも行われる。治療は局部的あるいは全身的に行ってよく、投与の形態は局 部的、経口的、腹腔内投与であってもよい。

実施例Ｖ 上記実施例■に記載される動物の同じ群からの動脈試料を、高度グリコジル化最 終生成物（八ＧＦ）の内容及び溶解度の分析のため使用した。

動脈を切開はさみで細かくミンチし、５ｍＬのクロロホルム：メタノール（２： 　１）を加え、緩衝液で５回洗浄し、小部分に分割して、架橋結合のための以下 の評価に供するようにした：（Ａ）プロテアーゼＫ及びペプシンによる完全な可 溶化後コラーゲンの特定の蛍光。

（Ｂ）２５℃で２時間の抽出及び４℃で２４時間の抽出後、０．５Ｍ酢酸中の溶 解度を決定した。

（Ｃ）３０度Ｃで１８時間臭化シアン開裂後の溶解度を決定した。

（Ｄ）３７度Ｃで４８時間後、ｐＨ４，１の０．１Ｍ酢酸塩緩衝液に溶かしたペ プシン（１，０ｍｇ／ｍＬ）による減成後の溶解度。

所定期間の治療後、溶解部分を不溶解部分から遠心分離（５０，［ｌＨＸ　ｇ。

１時間）により分離し、各部分を凍結乾燥し、６ＭのＨＣＬで加水分解して、全 ヒドロキシプロリンを決定した。その分析結果を第１表に示す。

第１表 溶解されるコラーケ゛ン　の比率（％）群　治療　高度グリコリル化生成窃零　 ０．５ＭＩＩ　ＣＮＢｔ　ペプシン正常　なし　３．５±０．１１　８．０±０ ．３　１２．２±０．１　５０．９±０．３糖尿　なし　１９．４±０．８　２ ．０±０．２　４．４±０．１　１５．０±０．２正常　アミノグアニジン　２ ．８　±０．１　１８．７±０．３　１３．６±［１，３５２，５±０．２糖尿 　アミノグアニジン　４．５　±０．１　１２．６±０．３　１０．６±０．　 １　４６．　１ｍ！：０．４本ヒドロキシプロリン１ｍｇあたり特定蛍光第１表 かられかるように、未治療糖尿ラットからの動脈結合組織における蛍光性の、高 度非酵素的グリコジル化生成物の蓄積は、未治療正常ラットからの動脈組織より も５．５倍大きい。これと対照的に、アミノグアニジン治療糖尿ラットからの動 脈組織は、同じ期間同じ濃度の高血糖症にさらされたにもかかわらず、未治療正 常ラットのそれの１．３倍に過ぎない。これらのデータは、高度非酵素的グリコ ジル化生成物の蓄積が、生体内で、アミングアニジンにより阻害されること、を 示している。

三つの特定的な処理（酢酸、ＣＮＢｒ、ペプシン）のそれぞれにより溶解された 動脈結合組織の比率は、未治療糖尿ラットの場合、正常ラットのそれに比し著し く減じている。未治療ラットからの糖尿動脈結合組織は、酢酸溶解度により評価 した場合正常ラットより架橋結合が９倍あり、ＣＮＢｒ消化の場合２．８倍、ペ プシン消化による架橋結合は３．４倍である。

これと対照的にアミノグアニジン治療糖尿ラットの動脈結合組織は、同じ期間同 濃度の高血糖症にさらされているにもかかわらず、正常ラットに較べ僅かに１． １乃至１．４倍架橋結合しているにすぎない。これらのデータは、アミノグアニ ジンが高血糖症に由来する生体内における非酵素的コラーゲン架橋結合の増大を 阻止すること、を示している。

実施例■ 上記実施例■に記載されている同じ群の動物からの動脈試料を、酵素免疫アッセ イ法により、コラーゲンに対するリポ蛋白質の架橋結合分析に使用した。ウサギ におけるラットアボリプロ蛋白質−Ｂに対する抗血清、パーオキシダーゼをラベ ルした抗ラビット抗体、及び標準的な色素反応剤を用いて、結合した抗体の量を 検出した。結果を以下の第■表に示す。

第■表 治療群（コラーゲン）ｍｇあたりの結合したリポ蛋白質正常動物　０．６９ 糖尿動物　１．８６ 正常動物＋アミノグアニジン　０．５３糖尿動物＋アミノグアニジン　０．６４ これらのデータは、アテローム症初期における巨大血管系のリポ蛋白質蓄積が、 アミノグアニジン投与により治療可能であることを示す。

実施例■ このプロセスにおける高血糖症に由来する基質変化の積極的な役割を評価するた めに、生後３５週のＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラットの無機質脱落骨基質粒を準備し た。りん酸塩緩衝食塩水のみ（ＰＢＳ）、ＡＧＥの種々の糖前駆体を含むＣＰＢ Ｓ−Ｇ）及びＰＢＳと、糖＋＾Ｇε阻害アミノグアニジン（ＰＢＳ−Ｇ＋八へ） のそれぞれでこの骨基質を保温した。保温後、基質を正常ラットに皮下移植した 。移植して１２日後、４５Ｃａ　１２を注射して移植無機物化の状態を調べ、骨 芽細胞機能を評価するためアルカリフォスフォターゼ活性を測定した。複数の試 料を固定し、包埋し、組織学的評価を行うため染色した。

高度グリコジル化最終生成物（ＡＧＥ）前駆体グリコアルデヒドは、基質ＡＧＥ 含量（特定蛍光による）を２倍以上増加させる一方、骨分化を９０％以上阻害し た。これと対象的にＡＧＥ阻害剤であるアミノグアニジンと共に保温した場合、 蛍光は正常状態に減じ、骨分化は比較例の８０％まで回復した。

実施例■ 長期間（１２，７±３．２日）糖尿病であるニューシーラント産白色ウサギを、 赤血球（ＲＢＣ）変形に及ぼす試験化合物の効果を調べるために使用した。赤血 球成分におけるグルコースを介在する架橋結合により、より変形の少い、より硬 い膜を生じるようであれば、治療は、新しい赤血球におけるこの変化を防止する ようなものでなければならない。治療初期に既に存在している赤血球は治療の影 響を受けることはない。なぜなら赤血球は、治療を受けているとしても、絶えず 新しく生成される赤血球と取りかえられているからである糖尿ウサギ（ｎ＝６） の、２力月の投与前及び投与後の平均血糖は２９６．６プラスマイナス８４．６ ｍｇ／＋Ｉｌ、であった。

試験化合物は経口的に、１００　ｍｇ／ｋｇ／日の割合で投与された。

変形指数（ＤＩ）　（懸濁赤血球の緩衝液／濾液における減化率、Ｎマドクリッ ト＝４．１１％）を赤血球変形の尺度として使用した。緩衝され懸濁化された赤 血球は、３７℃で一２０ｃｍＨ２の圧力で、３μの微細孔膜（カナダプレザント ンのヌクレオポア社製）によりろ過した。正常なニューシーラント産白色ウサギ （ｎ＝Ｉ４）各群（年令、性別、重量）の基準範囲は、赤血球変形が２．６７乃 至４．８４、平均４．０２プラスマイナス０．６９、％ヘモグロビングリコジル 化が１．７から３．９６、平均２．６０プラスマイナス０．７０であった。糖尿 病のニューシーラント産白色ウサギに１００　ｍｇ／ｋｇ／日の割合でアミノグ アニジンを投与した結果を第１表に示す。

第１表 アミノグアニジンＨＣＩを投与した長期糖尿ウサギの赤血球変形指数投与期間（ 週）　赤血球変形指数 ０　１８．３２±６．０３ ４　７．１７±３．１２ ８　６．８３±２．９７ １２　４、６４±１，５８ １６　４、４４±１．３３ ２０　４．１４±１．０６ 糖尿病は変形指数を４．０から１８まで増大させる。上記の結果は、アミノグア ニジン投与により、糖尿病に由来する変形値（変形指数）が１２週後に正常値に 戻る、ことを示す。これら実験動物の赤血球変形値は非正常値にはならなかった 。これらの実験は、アミノグアニジンが糖尿病に由来する赤血球変形変化を防止 すること、治療が遅れたウサギについては、既に架橋結合が生じておりより変形 性のない古い赤血球と同様に、架橋結合を阻害するアミノグアニジンの影響によ り新しい赤血球と変えられるような効果がみられることを示している。

実施例■ ストレプトシトシン−糖尿病のオスのＬｅｖｉｓラットに対して９箇月間、毎日 塩酸アミノグアニジンを、０．６．２５．　＋２．５．２５、及び５０ｍｇ／ｋ ｇ／日、の割合で投与する治療を行った。治療期間経過後、尾部牌繊維のコラー ゲンに溶解度決定処理を施した。ＩＱｍｇの試料を、１ｍｇのペプシンを含む０ ．５Ｍの酢酸５Ｌ：Ｘ中で、４℃で５時間、ゆるやかにゆすりながら保温した。

次いで試料を１時間、５０．０００Ｘ　ｇで遠心分離し、溶解部分と不溶解部分 を洗浄処理により分離した。各部分を６ＮのＨＣＩで加水分解し、ヒドロキシプ ロリンの全量を測定した。結果を下記第■表に示す。

第■表 条件　アミノグアニジン）ＩｃＩ！与（ｍｇ／ｋｇ／日）　コラーゲン溶解正常 　０　８０．７±３゜４％ 糖尿　０　６４．８±０．８％ 糖尿　６６．７±１．２％ １２．５ 糖尿　７５．９±０．４％ 正常　８８．２±０．２％ ９箇月間の糖尿病により尾部爬コラーゲンの溶解度は９１％から８％に減少した が、経口的に６．２５から５０ｍｇ／ｋｇ／日の割合で塩酸アミノグアニジンを 投与することにより、投与量に応じこの変化を著しく阻害することができ、もっ とも高い投与量の場合、糖尿病に由来する架橋結合の８０％を防止した。

実施例Ｘ コラーゲン架橋結合に及ぼすアミノグアニジン投与の効果を遺伝的に糖尿である 動物モデルとしてＢＢ／Ｗｏｔｃｅｓｌｅ＋ラットを用いて検査した。動物が一 旦糖尿病になると、その生存のためには毎日インシュリンの注射をすることが不 可欠である。グルコース濃度が、ストレプトシトシン−糖尿動物のそれ（＞５０ ０　ｍｇ％）よりもはるかに低い適度な濃度（２５０−３５０ｍｇ％）に維持さ れるのである。

糖尿及び非糖尿の対照ラットに、６箇月間、１２．５及び５０＋ｎｇ／ｋｇ／日 の塩酸アミノグアニジンを経口投与した。対照ラットの一群には水のみを投与し た。次いて実施例１ｘに記載したペプシン法により、尾部鍵コラーゲンの溶解度 を調べた。結果を第７表に示す。

第７表 条件　アミノグアニジンＨＣＩ　（ｍｇ／ｋｇ／口）　コラーゲン溶解度正常　 ８０．７±３．４％ 糖尿　６４．８±０．８％ 糖尿　６６．７±１．２％ １２．５ 糖尿　７５．９±０．４％ 正常　８８．２±０．２％ これらのデータは、６箇月糖尿病であるラット尾部鍵コラーゲンの溶解度は８１ ％から６５％に減少していたが、共にアミノグアニジン治療により、投与量に応 じ、著しく阻害されたこと、を示す。６箇月以上糖尿であるＢＢ／’ウースター ラットのコラーゲンは、ストレプトシトシン−糖尿ラットよりも、溶解度の減少 が少い。これは、おそらく高血糖症の程度が低いこと、及び慢性的にコラーゲン がさらされていたグルコースの濃度が低いこと、によると思われる。

実施例ＸＩ 架橋結合の尺度であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）における蛍光のグルコース に媒介される進行を阻害する本発明化合物の能力を評価するため、以下の方法が 採用された。１，５Ｍのりん酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，４、中に溶かした４ ００　ｍＭグルコース及び１００　ｍｇ／＋＋＋ＩＢＳＡと共に、化合物を無菌 条件下で１ｍＭの濃度で保温した。

保温混合物の試料を、蛍光測定のため３７℃で一週間保温した。夫々の試験化合 物について、対照例として化合物単独（Ｃ）、化合物＋グルコース（Ｇ＋Ｃ）、 化合物＋ＢＳＣ（Ｂ　＋　Ｃ）の緩衝液保温物をつくった。グルコースとＢＳＡ との（Ｂ十Ｇ）保温物の別の組を化合物の阻害効果が測定された基準対照例とし て調製した。夫々の保温物を３組ずつつくった。

夫々の試料について、蛍光（励起、３７０ｎｍ；放出、４４Ｑ　ｎｍ）を、蒸留 水で１００倍に希釈した後で測定した。

夫々の試験化合物における褐色化の％阻害度を以下のように計算した。

夫々のＦ値は、保温前に対する、１週間保温後の試料の蛍光測定値を表わす。

％阻害度＝ ［Ｆｅ、ｃ−＜Ｆ’ｌｌ”ｃ−ｃ　−（Ｆｃ　＋ＦＧ、Ｃ＋ＦＢ、Ｃ）　）　ｘ ｌｏｏ　］　／Ｆ１１．Ｇ式中、Ｂ＝ＢＳＡ　、　Ｇ＝ニブルコースＣ＝試験化 合物。

１ｍＭの種々の試験化合物による褐色化の％阻害度は以下の通りである。

４３．０％　Ｌ−リジンモノヒドロクロライド；２０．８％　３−メルカプト− Ｄ−バリン；１６．７％　Ｌ−オルニチンモノヒドロクロライド；３１．５％　 ＤＬ−２，４−ジアミノブチル酸ジヒドロクロライド；１１．０％　Ｌ−システ ィンモノヒドロクロライド；及び３０．２％　４−アミノブチル酸 実施例Ｘ■ ＃　ｉＡ’ｌＪ　畦乙嫁煎史 式■の化合物　５゜ 澱粉　５０ マンニトール　５０ ステアリン酸マグネシウム　２ ステアリン酸　５ 化合物、澱粉及びラクトースを混合し、澱粉ペーストで含湿粒状化した。粒状物 をトレイ上に置き、４５℃の温度で一晩放置して乾燥させた。

乾燥した粒状物を粉砕機で粉砕してはマ２ｏメツシュの粒子径とした。ステアリ ン酸マグネシウム、ステアリン酸、残りを澱粉、としてこれらを添加し、適当な 錠剤プレスで圧縮する前に混合した。錠剤を、４ｋｇの固さを有する１１／３２ ’パンチで２３２　ｍｇの重さに圧縮した。これら錠剤は、ＵＳＰ　ＸＶＩに記 載されてい方法によれば、半時間で分解する。

実施例ｘｍ ローション　町Ｚ呈 式Ｉの化合物　１．０ エチルアルコール　４００．０ ポリエチレングリコール４００　３００．０ヒドロキシプロピルセルロース　５ ．０プロピレングリコール　全体で１．０ｇをつくるための残り分実雄側ＸｒＶ 経口リンス 式Ｉの化合物　１．４％ グルコン酸クロルヘキシジン　０．１２％エタノール　ｌ！、６％ ナトリウムサッカリン　０．１５％ ＦＤ＆ＣＢｌｕｅ　１号　０．００１％ペパーミントオイル　０．５％ グリセリン　１０．０％ Ｔｖｅｅｎ　６０　０．３％ 水を加えて　１００％ 実施例ＸＶ 歯みがき 式Ｉの化合物　５．５％ ソルビトールの７０％水溶液　２５％ ナトリウムサッカリン　０．１５％ ナトリウムラウリルスルフェート　１．７５％Ｃａ＋ｐｏｌ　９３４（６％水分 散液）　１５％スペアミントオイル　１．０％ 水酸化ナトリウム（５０％水溶液）　０．７６％二塩基カルシウムフォスフエー トジハイドレート４５％水を加えて　１００％ 歯の表面などに生じる蛋白質変色を防止するための非酵素褐色化の阻害剤の能力 を更に研究するため、以下の表面褐色化実験を行った。薄膜に覆われた歯表面の かわりに、露出していない現像済写真用紙を、紙を裏打ちされた固定蛋白質（ゼ ラチン；即ちコラーゲン）面をつくるために使用した。５ミリメートルの円をパ ンチし、３−のナトリウムアジドを含む１００ｍＭグルコース−６−りん酸塩と ０．５Ｍりん酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．４）の溶液中に、−週間、５０度Ｃで浸漬 した。グルコース−ｂ−りん酸塩は、グルコースよりも早い速度で行われる非酵 素的褐色化に関与する糖分である。グルコース−６−りん酸塩に加え、クロロへ キシジン及び／もしくは式Ｉの化合物を加える。保温後、このゼラチン紙ディス クを水ですすぎ、褐色を観察し、写真にとった。

グルコース−６−りん酸塩単独中でディスクを保温した場合、緩衝液のみの中に 浸した場合よりも、僅かに褐色化していた。クロルヘキシジン（最終濃度か０． ０４％クロルヘキシジンである登録商標名Ｐｅ＋ｉ−ｄｅｚ）を含有させた場合 、褐色が際立っていた。式■の化合物をクロルヘキシジンに添加した場合、クロ ルヘキシジンを使用することなく式ｌの化合物を含めた場合と同様に、ゼラチン の褐色化を阻害した。

ゼラチン面上におけるグルコース−６−りん酸塩の作用による僅かの褐色化と、 式Ｉ化合物によるその阻害は、本発明が、歯表面の非酵素的褐色化を防ぐために 有用である、ことを示している。クロルヘキシジンを使用した場合に褐色化が増 大すること、及び式Ｉ化合物でその褐色化が阻害されること、はシクロへキシジ ンと共に生じる耐プラグ剤で増大する非酵素的褐色化を、本発明化合物が有効に 防止しうること、を示している。

本発明は、その基本的な特徴を失うことなく、他の形態又は他の方法でも実施で きる。明細書の説明は従って限定的なものではなく本発明を理解するためのもの であり、均等の範囲に入る変更はすべて本発明請求の範囲に含まれる、と理解さ れるべきである。

国際調査報告 国際調査報告 ＵＳ　９３００７０９ Ｓ＾　７００３２ フロントページの続き （５１）　ｒａｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３１／１９ ５　ＡＤＡ （７２）発明者　セラミ、アンソニー アメリカ合衆国　ニューヨーク州　１１９６４シェルタ−アイランド、ラム　ア イラ ンド　ドライヴ　（番地なし） Ｉ

Claims (47)

【特許請求の範囲】
1. １．動物における標的蛋白質の、高度グリコシル化最終生成物の生成を阻害して 前記動物を治療する方法であって、前記動物に有効量の医薬組成物を投与するこ とからなり、前記医薬組成物が下記式（Ｉ）の薬剤であって、 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）式中Ｒは、水素；低級アルキル基、但 し任意に１個又は２個のヒドロキシル、チオール、フェニル、ヒドロキシフェニ ル、低級アルキルチオ、カルボキシ、アミノカルボキシ又はアミノ基で置換され てもよい；及びそれらの、生体適合性のあり薬学的に受入れられる酸付加塩；の うちから選ばれ、前記標的蛋白質の初期グリコシル化により生成する初期グリコ シル化生成物のカルボニル部分と反応することができる物質である薬剤と、その 担体とを含むものである方法。
2. ２．前記標的蛋白質が構造蛋白質である請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記標的蛋白質が、コラーゲン、エラスチンレンズ蛋白質、血管壁、神経蛋 白質及び糸球体底膜からなる群より選ばれる請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．前記医薬組成物が、前記薬剤と薬学的に受入れられる担体とを含む請求の範 囲第１項記載の方法。
5. ５．前記薬剤がＬ−リジンモノヒドロクロライド又はその薬学的に受入れられる 塩である請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．前記薬剤がＤＬ−２，４−ジアミノブチル酸である請求の範囲第１記載の方 法。
7. ７．前記薬剤がシスティンモノヒドロクロライド又はその薬学的に受入れられる 塩である請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．前記薬剤が３−メルカプト−Ｄ−バリンである請求の範囲第１記載の方法。
9. ９．前記薬剤が４−アミノブチル酸である請求の範囲第１項記載の方法。
10. １０．前記薬剤がＬ−オルニチンモノヒドロクロライド又はその薬学的に受入れ られる塩である請求の範囲第１項記載の方法。
11. １１．前記医薬組成物が非経口的に投与される請求の範囲第１項記載の方法。
12. １２．前記医薬組成物が局部的に投与される請求の範囲第１項記載の方法。
13. １３．前記医薬組成物が軟こうの形に調製され、前記薬剤が約１０重量％までの 分量含まれている請求の範囲第１項記載の方法。
14. １４．前記医薬組成物が経口的に投与される請求の範囲第１項記載の方法。
15. １５．前記医薬組成物が前記動物の約２５ｍｇ／ｋｇ体重までの分量で投与され る請求の範囲第１項記載の方法。
16. １６．身体中に蓄積した、高度グリコシル化最終生成物によりひきおこされる糖 尿病の合併症及び老化の治療に適用する請求の範囲第１記載の方法。
17. １７．糖尿性腎臓病の治療に適用する請求の範囲第１項記載の方法。
18. １８．糸球体硬化症の治療に適用する請求の範囲第１項記載の方法。
19. １９．末梢血管病の治療に適用する請求の範囲第１項記載の方法。
20. ２０．アテローム硬化症の治療に適用する請求の範囲第１項記載の方法。
21. ２１．細動脈硬化症の治療に適用する請求の範囲第１項記載の方法。
22. ２２．末梢神経症の治療に適用する請求の範囲第１項記載の方法。
23. ２３．網膜症の治療に適用する請求の範囲第１項記載の方法。
24. ２４．白内障の治療に適用する請求の範囲第１項記載の方法。
25. ２５．発作の治療に適用する請求の範囲第１項記載の方法。
26. ２６．高血圧の治療に適用する請求の範囲第１項記載の方法。
27. ２７．関節硬直の治療に適用する請求の範囲第１項記載の方法。
28. ２８．変形性関節症の治療に適用する請求の範囲第１項記載の方法。
29. ２９．皮膚の弾力性喪失及びシワの治療に適用する請求の範囲第１項記載の方法 。
30. ３０．関節硬化症の治療に適用する請求の範囲第１項記載の方法。
31. ３１．糸球体腎炎の治療に適用する請求の範囲第１項記載の方法。
32. ３２．標的蛋白質の高度グリコシル化を阻害する組成物において、下記式（Ｉ） の薬剤であって、 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）式中Ｒは、水素；低級アルキル基、但 し任意に１個又は２個のヒドロキシル、チオール、フェニル、ヒドロキシフェニ ル、低級アルキルチオ、カルボキシ、アミノカルボキシ又はアミノ基で置換され てもよい；及びそれらの生体適合性があり薬学的に受入れられる酸付加塩；のう ちから選ばれ、前記標的蛋白質の初期グリコシル化により生成する初期グリコシ ル化生成物のカルボニル部分と反応することができる物質である薬剤と、その担 体を含むことからなる組成物。
33. ３３．前記組成物が、哺乳動物における高度グリコシル化最終生成物の蓄積によ り生じる糖尿病の合併症及び老化の治療に有用である前記薬剤を含む請求の範囲 第３２項記載の組成物。
34. ３４．前記薬剤がＬ−リジンモノヒドロクロライド又はその薬学的に受入れられ る塩である請求の範囲第３２項記載の組成物。
35. ３５．前記薬剤が、ＤＬ−２，４−ジアミノブチル酸である請求の範囲第３２項 記載の組成物。
36. ３６．前記薬剤がシスティンモノヒドロクロライドまたはその薬学的に受け入れ られる塩である請求の範囲第３２項記載の組成物。
37. ３７．前記薬剤が３−メルカプト−Ｄ−バリンである請求の範囲第３２記載の組 成物。
38. ３８．前記薬剤が４−アミノブチル酸である請求の範囲第３２項記載の組成物。
39. ３９．前記薬剤がＬ−オルニチンモノヒドロクロライドまたはその薬学的に受け 入れられる塩である請求の範囲第３２項記載の組成物。
40. ４０．動物における標的蛋白質の高度グリコシル化を阻害するため前記動物に投 与する医薬組成物であって、前記標的蛋白質の初期グリコシル化により生成する 初期グリコシル化生成物のカルボニル部分と反応することができる、薬学的に有 効量の薬剤と、薬学的に受け入れられる担体とを含み、前記薬剤が、下記式（Ｉ ）で表わされ、▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）式中Ｒは、水素；低級 アルキル基、但し任意に１個又は２個のヒドロキシル、チオール、フェニル、ヒ ドロキシフェニル、低級アルキルチオ、ヵルボキシ、アミノカルボキシ又はアミ ノ基で置換されてもよい；及びそれらの、生体適合性があり薬学的に受入れられ る酸付加塩；のうちから選ばれ、前記標的蛋白質の初期グリコシル化により生成 する初期グリコシル化生成物のカルボニル部分と反応することができる物質であ る医薬組成物。
41. ４１．前記組成物及び薬剤が、哺乳動物における高度グリコシル化最終生成物の 蓄積により生じる糖尿病の合併症及び老化の治療に有効である請求の範囲第４０ 項記載の組成物。
42. ４２．前記薬剤がＬ−リジンモノヒドロクロライド又はその、薬学的に受け入れ られる塩である請求の範囲第４０項記載の組成物。
43. ４３．前記薬剤が２，３−ジアミノコハク酸である請求の範囲第４０項記載の組 成物。
44. ４４．前記薬剤がＬ−システィンモノヒドロクロライド又はその、薬学的に受け 入れられる塩である請求の範囲第４０項記載の組成物。
45. ４５．前記薬剤がメルカプト−Ｄ−バリンである請求の範囲第４０項記載の組成 物。
46. ４６．前記薬剤が４−アミノブチル酸である請求の範囲第４０項記載の組成物。
47. ４７．前記薬剤がＬ−オルニチンモノヒドロクロライド又はその、薬学的に受け 入れられる塩である請求の範囲第４０項記載の組成物。