JPH07503371A - Chiral synthesis using modified enzymes - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 改変した酵素によるキラル合成 本発明はキラル合成に関する。より詳しくは本発明はかかる合成を促進するため の酵素の改変に関する。[Detailed description of the invention] Chiral synthesis using modified enzymes This invention relates to chiral synthesis. More specifically, the present invention aims to facilitate such synthesis. Concerning the modification of the enzyme.

酵素は生物触媒であり、化学的活性および基質の構造という両方の点において特 異的であり、この特異性のため、様々な商業的用途に用いられている。かかる活 性の多くは知られているが、ある特定の酵素の触媒作用に対して、触媒に適合す る基質の範囲を変えることおよび／または触媒効率を変化させることが希望され る場合がある。キーとなる要素すなわち基質選択性およびこれに由来する活性の わかっている既存の酵素を、これらの要素を目的に応じて変化させる所望の改変 を生じせしめ、これによって特定の酵素の工業的利用可能性を高めることが可能 であるかもしれない。Enzymes are biocatalysts that are unique in terms of both their chemical activity and the structure of their substrates. Because of this specificity, it is used in a variety of commercial applications. Such life Many of the properties are known, but for the catalytic action of a particular enzyme, there are It is desired to change the range of substrates used and/or to change the catalytic efficiency. There may be cases where Key factors: substrate selectivity and the resulting activity Desired modifications of known existing enzymes that change these elements according to the purpose This can increase the industrial applicability of certain enzymes. It may be.

酵素活性は、基本的にはアミノ酸組成、特に酵素の特定の機能領域におけるアミ ノ酸組成によりその活性が制御され、これらのアミノ酸を変えるとその活性が変 ることが知られているが、これはアミノ酸の交換は特異的または非特異的方法に より行うことができる。例えば、中和性アミノ酸を導入すれば荷電の変化した基 質への触媒作用が促進される。これは予測し得る変化といえるが、しかしながら 、全体としての確実性が予測される結果は、特に酵素の３次構造が完全な情報と して必要とされる程度まで知られていない場合においては得られていない。個々 の変化を既知の方法により生じさせることは可能であるが、これは殆ど無限の仕 事となることか呟最初に「マクロな変化」を生ぜしめ、その後に「細かい調整」 を別個に行うことが便利である、もちろん、ある場合には、マクロな変化が十分 な場合があるかもしれないし、または実際に必要とされるのは細かな調整のみで あるかもしれない。Enzyme activity is fundamentally determined by the amino acid composition, especially amino acids in specific functional areas of the enzyme. Its activity is controlled by its amino acid composition, and changing these amino acids alters its activity. It is known that amino acids can be exchanged in a specific or non-specific manner. You can do more. For example, by introducing a neutralizing amino acid, a group with a changed charge can be used. The catalytic effect on quality is promoted. This is a predictable change, but , results that can be predicted with overall certainty are particularly important when the tertiary structure of the enzyme is not fully informed. If it is not known to the extent required, it has not been obtained. individual Although it is possible to cause changes in by known methods, this is an almost infinite number of First, make "macro changes," then make "detailed adjustments." There are, of course, cases in which it is convenient to do the macro changes separately; There may be cases where only minor adjustments are actually needed. Might happen.

酵素構造の変化を記載したが、これはいかなる直接の影響をアミノ酸組成に及ぼ しても１専られないが、タンパク質転写の前に酵素をコード化するＤＮＡを既知 の方法によって処理することによって達成し得る。例えば、乳酸デヒドロゲナー ゼ（天吠の基質はピルビン酸である）を、ピルビン酸のカルボン酸アナログであ るオキサロ酢酸に作用させる場合、活性部位に導入された負電荷によって活性が 実質的に減少するであろう。この場合、中和電荷を活性部位の正しい領域へ導入 することを含む部位特異的変異処理によって、基質特異性が変化し、酵素がマレ イン酸デヒドロゲナーゼに期待される活性を有するようになることが予測される 。Although we have described changes in enzyme structure, this does not have any direct effect on amino acid composition. However, it is known that the DNA encoding the enzyme is used before protein transcription. This can be achieved by processing according to the method of For example, lactate dehydrogener (Tenbo's substrate is pyruvate), which is a carboxylic acid analogue of pyruvate. When acting on oxaloacetate, the activity is inhibited by the negative charge introduced into the active site. will be substantially reduced. In this case, the neutralizing charge is introduced into the correct region of the active site. Site-directed mutagenesis, including It is predicted that it will have the activity expected for inate dehydrogenase. .

かかる特異的な変異処理はおおざっばには予測し得ると考えられるが、かかる基 質に対する特異性の増加において最終的な改善をするものであるとは言えない。Although such specific mutation processing can be roughly predicted, It cannot be said that this is a final improvement in increasing specificity to quality.

代わりの基質、例えばアルキル鎖の伸びたもの、フェニル残基またはへテロ環の 付加があったもの等に対して、部位特異的変位の予測は頼り得るものであるとは 言えない。かかる「非天然基質」に適合させるために必要な変化は、酵素の活性 部位の隣接部位もしくは活性部位内に生じせしめることが殆どの場合に必要であ り、多くの酵素はこの活性部位はアミノ酸２０個までで構成されており、これは １次間列中の多くの異なる部分から構成されていてもよい。個々のアミノ酸の交 換により進めようとする場合、その試験のスケールは現代の技術をもっても不可 能な大きさとなるであろうことは明らかである。Alternative substrates, e.g. extended alkyl chains, phenyl residues or heterocycles Is prediction of site-specific displacement reliable for things that have been added? I can not say. The changes necessary to adapt to such "non-natural substrates" may alter the activity of the enzyme. It is necessary in most cases to occur adjacent to the site or within the active site. The active site of many enzymes consists of up to 20 amino acids; It may be composed of many different parts in the primary intercolumn. Interaction of individual amino acids If we try to proceed by using conversion, the scale of the test would be impossible even with modern technology. It is clear that it will be of a reasonable size.

上述の不利益を迂回しつつ所望の目的に達成するためには、例えば乳酸デヒドロ ゲナーゼの場合には、活性部位の一部分を構成する既知のループ領域を利用する ことが可能である。便利な第１段階として、ループ領域の少なくとも一部を、同 一酵素の大きいかまたはより小さいループ領域の断片と交換してもよい。これに よって基質特異性および触媒の比効率にいくらかの変化が生じる一方、典型的な 活性は保持される。所望の基質に対して最も約束されたループ領域を選択すると 実際、野生型の出発ループであってもよく、特定のアミノ酸残基をさらなる変化 の標的としてもよい。最も効果的な選択を確保するため、興味のある部位におけ る全ての可能なアミノ酸の組み合わせを調べる二とが必要である。これはランダ ムなヌクレオチドを、標的としたアミノ酸をコードするコドン領域へ導入するこ とによって達成される。多くの交換生成物から所望の修飾物を選択するためには 続いてのルーチンのクローニング操作が必要である。このスクリーニングは通常 の方法てｆｌわれる。酵素エンノニアリングへのこのアプローチは、コードＤＮ Ａ内に唯一のエンドヌクレアーゼ制限部位を、それがすでに存在していない場合 には、所望の部位に導入することによって促進される。かかる変化はしばしば塩 基を、コードの変性によりコード化されるアミノ酸を変えることなく変化させる こと、またはこの代わりに、コードの導入を、可能な限り同一アミノ酸を維持す るよう行う。これによって特に操作したい興味のある領域をその他より独立して 扱うことが可能である。In order to achieve the desired objective while bypassing the above-mentioned disadvantages, for example, lactic acid dehydro In the case of genease, it utilizes a known loop region that forms part of the active site. Is possible. As a convenient first step, at least part of the loop region Fragments of the larger or smaller loop regions of one enzyme may be replaced. to this While this results in some variation in substrate specificity and specific efficiency of the catalyst, the typical Activity is retained. Selecting the loop region with the most promise for the desired substrate In fact, the wild-type starting loop may be modified to make further changes to specific amino acid residues. It can also be a target. in the area of interest to ensure the most effective selection. It is necessary to investigate all possible amino acid combinations. This is Randa Introducing a unique nucleotide into a codon region encoding a targeted amino acid. This is achieved by In order to select a desired modification from many exchange products, A subsequent routine cloning operation is required. This screening is usually The method is flapped. This approach to enzymatic ennonearing is the code DN A unique endonuclease restriction site in A, if it is not already present. This is facilitated by introduction to the desired site. Such changes are often caused by salt change the group without changing the encoded amino acid by degenerating the code Alternatively, the introduction of the code can be carried out to maintain as many identical amino acids as possible. I will do it so that it will work. This allows you to specifically manipulate areas of interest independently from others. It is possible to handle

上述のことより本発明は好ましい触媒活性を保持しつつ酵素の特異性および／ま たは効率を改変する方法に関し、以下の特徴を有する二３次構造が実質的に公知 であるかまたは演鐸されている酵素を選択する；少なくとも１カ所の特異性およ び／または効率の関係する領域を同定する：該同定領域に結合した唯一の制限部 位を、この領域をコードするＤＮＡ内へ導入または同定する：少なくとも１のコ ドンのヌクレオチドがランダマイズされている以外は該同定領域の少なくとも一 部に対応するＤＮＡを合成する、または該同定領域の少なくとも一部と！換する ために、それ自身同様にランダマイズされている代わりとなる領域を選択する、 合成されたまたは置換されたＤＮＡ配列をオリジナルのかかる領域と交換するの に用いる二合成されたまたは置換されたＤＮＡ配列を発現させる；および所望の 改変を、それをコードするＤＮＡが単離し得るように選択する。Based on the above, the present invention improves the specificity and/or Regarding the method of modifying the efficiency of Select an enzyme that is or has been identified; at least one site of specificity and Identify regions of interest and/or efficiency: unique restriction sites bound to the identified region. introducing or identifying a position into the DNA encoding this region: at least one At least one of the identified regions, except that the nucleotide of the DON is randomized. or at least a part of the identified region! exchange to select an alternative region that is itself randomized as well, Replacing a synthesized or substituted DNA sequence with such region of the original expressing the synthesized or substituted DNA sequences used for; and the desired The modification is selected such that the DNA encoding it can be isolated.

以下にさらに詳しく述べるが、本発明の方法はデヒドロゲナーゼを例として、特 にα−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ、例えば乳酸デヒドロゲナーゼ等を例とし て説明される。この説明において、最初に特異性および／または効果が関与して いる領域として同定されたのは酵素のループ領域である。一般に、ランダム化さ せたＤＮＡはイノノントリホスフェ−１−ＰＣＲ法またはスパイクトオリゴヌク １／オチド法もしくはＰＣＲアッセンブリ法により合成される。これらのすべて は以下により詳しく記載する。興味ある領域の少なくとも一部に対して置換を選 択する場合、同じ酵素の関連配列に基づく場合が多い。オリジナルのＤＮＡ配列 を合成されたまたは置換ＤＮＡで置き換えた後、プラスミドまたはフ７−ノベク ターへ内へクロー７化し、発現のために細菌またはウィルスを形質転換する。そ の１＆、スクリーニングを所望の改変を選択するために行ってもよい。し−乳酸 デヒドロゲナーゼを例に取ると、１０１及び１０２位が特にランダマイズに適当 であることが判明した。As will be described in more detail below, the method of the present invention uses dehydrogenase as an example. For example, α-hydroxy acid dehydrogenase, such as lactate dehydrogenase, etc. It is explained as follows. In this explanation, specificity and/or efficacy are first involved. The loop region of the enzyme was identified as the region in which this occurs. Generally, randomized The isolated DNA was analyzed using inonontriphosphate-1-PCR method or spiked oligonucleotide. It is synthesized by the 1/otide method or the PCR assembly method. all of these is described in more detail below. Select replacements for at least part of the region of interest. selection is often based on related sequences of the same enzyme. original DNA sequence After replacing the DNA with synthesized or replacement DNA, the plasmid or 7-novectin clone into a target and transform bacteria or viruses for expression. So 1&, screening may be performed to select desired modifications. lactic acid Taking dehydrogenase as an example, positions 101 and 102 are particularly suitable for randomization. It turned out to be.

本発明はまた、かかる改変酵素を、特にキラル生成物の合成に用いることに関す る。しばしば、かかる操作にはコファクター・リサイクリング系を含む。−例と して、ループ領域が本発明の方法により改変させられているし一乳酸デヒドロゲ ナーゼの使用を含む、２−オキソ−４−フェニル−プロパン酸の還元が挙げられ 、その他の例として、本発明の方法により得られたＭＶＳ／ＧＧを使用すること に特徴付けられる４−メチル−２−オキソ−３−ペンテン酸の還元が挙げられる 。The present invention also relates to the use of such modified enzymes, particularly in the synthesis of chiral products. Ru. Often such operations involve cofactor recycling systems. - Examples and and the loop region has been modified by the method of the present invention. reduction of 2-oxo-4-phenyl-propanoic acid, including the use of , as another example, using MVS/GG obtained by the method of the present invention The reduction of 4-methyl-2-oxo-3-pentenoic acid characterized by .

本発明のアウトラインを述べたので、以下、さらに詳細に説明する。Having outlined the invention, it will now be described in more detail.

化学合成において酵素を用いることは、理論的には可能であるとして広く受け入 れられているが、その化学工業への応用は稀である。酵素の触媒としての強力な 有用性、例えば立体特異性および位置特異性を穏やかな条件下で得ることができ ること、特定の化学的転移に適合する酵素を得るべ（多くの試みがなされはじめ た。The use of enzymes in chemical synthesis is widely accepted as theoretically possible. However, its application to the chemical industry is rare. Powerful enzyme catalyst utilities, such as stereospecificity and regiospecificity, can be obtained under mild conditions. (Many attempts have begun to be made to obtain enzymes that are compatible with specific chemical transitions.) Ta.

酵素を選択するにはいくつかのアプローチが可能である。現在用い得る酵素によ る試験によって驚くべき結果が、文献より予期し得なかった基質特異性の幅につ いて得られる。従って市販の酵素が、低い触媒効率しか有さないものであっても 、経済性の点から工業的操作の基礎とすることが可能であるかもしれない。第２ のアプローチは多数の周囲の微生物から特定の形質転換を示すものをスクリーニ ングすることである。かかる活性を得るためには、微生物の細胞全体としてまた はその粗精製物としてより、酵素は純粋な物質として得られることが要求される 。酵素をかかるスクリーニングより十分な量および工業生産に足るリーズナブル なコストで得るには、しばしばクロニングおよび遺伝子の発現を含む大規模な開 発が必要である。適当な酵素触媒を選択するための他のアプローチは、既存の酵 素の構造を、その特定の基質に対しての触媒活性を改善するべく変えることであ る。このアプローチは「酵素工学」と呼ばれており、はんの最近になってホモキ ラル分子の合成用触媒として有用なものを提供するのに大いなる有用性を示した 。夏品および農業用化学品の合成において、異性体の一方を合成することの重要 性はよく認りされていることである。Several approaches are possible for selecting enzymes. Currently available enzymes Surprising results from these studies reveal a breadth of substrate specificity that was unexpected from the literature. You can get it. Therefore, even if commercially available enzymes have low catalytic efficiency, , it may be possible to use it as the basis for industrial operations from an economical point of view. Second The approach screens a large number of surrounding microorganisms for those exhibiting specific transformation. It is to conduct In order to obtain such activity, the microbial cell as a whole or Enzymes are required to be obtained as pure substances rather than as crudely purified products. . Enzymes can be screened in sufficient quantity and reasonable enough for industrial production. Obtaining affordable cost often requires extensive development, including cloning and gene expression. There is a need for development. Other approaches to selecting suitable enzyme catalysts include By changing the structure of the element to improve its catalytic activity towards a particular substrate. Ru. This approach is called ``enzyme engineering,'' and it has recently been It has shown great utility in providing a useful catalyst for the synthesis of ral molecules. . The importance of synthesizing one of the isomers in the synthesis of summer produce and agricultural chemicals Gender is a well-recognized thing.

酵素工学上における明らかな魅力にもかかわらず、酵素の複雑な構造のため、ア ミノ酸の変化の結果は、最も良くても限定された予測しかできない。現在、基質 の大きさが変えられ、天然の基質に対してその他の機能が誘導されている基質認 識および触媒機能の細かい領域における特定のアミノ酸の変化の影響については 予測不可能である。酵素のメカニズムおよび機能に関する古典的な研究により一 般に知られている触媒活性中心のアミノ酸のうちの一つを除くことにより活性を なくすことは一般に容易である。非天然基質に対する活性を増強することに関し てはまだ開発されていない。Despite their obvious appeal in enzyme engineering, the complex structure of enzymes The consequences of amino acid changes are at best limitedly predictable. Currently, the substrate substrate recognition in which the size of the substrate is altered and other functions are induced relative to the natural substrate. For the effects of specific amino acid changes on fine-grained areas of catalytic and catalytic function. Unpredictable. Classical research on the mechanism and function of enzymes The activity can be increased by removing one of the commonly known amino acids that are central to catalytic activity. It is generally easy to eliminate. Regarding enhancing activity towards non-natural substrates has not yet been developed.

酵素工学上の可能性としては２０種類のアミノ酸３００残基からなるタンパク質 には、１０３９０個の可能な配列がある。これらの配列のほとんど大部分は生物 的な機能を示さない。３００アミノ酸残基の典型的な大きさのタンパク質は、い かなる生物的機能に対してであっても全体的に最適化することは不可能であり、 良くて２５〜３５のアミノ酸ドメインの実験的組み合わせしかできないことが示 唆される。従って、酵素工学はいずれの目的とする機能に対しても、大きな骨格 を改良することが可能であるべきである。A protein consisting of 300 residues of 20 types of amino acids is a possibility in enzyme engineering. There are 10390 possible arrays. Most of these sequences are biological does not exhibit any specific function. A typical sized protein of 300 amino acid residues is It is impossible to globally optimize any biological function; It has been shown that at best only experimental combinations of 25-35 amino acid domains are possible. be suggested. Therefore, enzyme engineering has a large framework for any desired function. It should be possible to improve the

近年、ＤＮＡのランダム配列を、ファージＭ１３コートタンパク質の融合タンパ ク質として発現させる方法が開発されており、これは適当なアフィニティークロ マトグラフィーに類似する展開方法によって所望のタンパク質配列およびその遺 伝子を単離することができることを示唆する（カン（Ｋａｎｇ）、ピーエヌエー エス（ＰＮＡＳ）、旦旦、１９９１．４３６３）。しかしながら、展開はすべて の可能な配列のサンプルについてできるわけではなく、タンパク質工学において もスクリーニングし得るＭ１３ファージの数は限られている（１０１Ｓ個のプラ ーク形成ユニットがＭ１３）７−ノ含有イー・コリ（Ｅ、Ｃｏ１１）細胞の培養 物１１あたりより産生される）。］ＯＩ５の変異体において、ＤＮＡの長さを最 適化した場合、４Ｎ＝１０１Ｓであることから、すなわちＮ＝２４塩基または８ アミノ酸となる。Recently, random sequences of DNA have been transformed into fusion proteins of phage M13 coat protein. A method has been developed to express the protein as a clone using an appropriate affinity clone. Desired protein sequences and their residues are extracted by a development method similar to matography. suggests that the gene can be isolated (Kang, PNA). PNAS, Dandan, 1991.4363). However, all developments In protein engineering, this cannot be done for a sample of possible sequences. The number of M13 phages that can also be screened is limited (101S phages). Culture of E. coli (E, Co11) cells containing M13)7-no arch-forming unit 11). ] In the OI5 mutant, the length of the DNA is maximized. When optimized, since 4N=101S, that is, N=24 bases or 8 Becomes an amino acid.

池の発生する問題は、ファー７発現系は触媒でなく結合を規定し、従って新たな 化学的効果を有する酵素を得るためにデザインされているものではないというこ とである。The problem that arises is that the Far7 expression system specifies binding, not catalysis, and therefore new It is not designed to produce enzymes with chemical effects. That is.

既存のタンパク質のランダム変異処理もまた、ラジカル的に変化させられたタン パク質を産生させる能力において、すべての可能なバリアントをサンプリングす るという問題により制限されている。さらに、遺伝子コードは変化に対する抵抗 性が非常に高い。コドンの第３位が余分であるのみならず、同様の性質を有する アミノ酸残基が同様の配列によりコードされることから、散在する変異に対して 抵抗性である。例えば：　（Ｄ　Ｔを第２部位に有するコドンは常に疎水性側鎖 を有するアミノ酸をコードする；　（ｉｉ）アスパラギン酸およびグルタミン酸 をコードするコドンはその３位が異なるのみである。従って、チオエートヌクレ オチド類を使用するごとき戦略（ホルム（Ｈｏ１ｍ）、プロトエング（Ｐｒｏｔ 　Ｅｎｇ）、３．１９９０．１８１）によりランダムに分計した変異（唯一の変 異がいずれかのコドンに同じ可能性で存在する）によっては、親のタンパク質に 対して劇的に異なる性質を有する新規タンパク質を得ることが難しい。Random mutagenesis of existing proteins also produces radically altered proteins. Sample all possible variants in their ability to produce protein. It is limited by the problem of Additionally, the genetic code is resistant to change. Very sensitive. Not only is the third position of the codon redundant, but it also has similar properties. Amino acid residues are encoded by similar sequences, making it possible to prevent scattered mutations. It is resistant. For example: (a codon with DT in the second position always has a hydrophobic side chain (ii) aspartic acid and glutamic acid The codons encoding the two differ only in the third position. Therefore, the thioate nucleotide Strategies such as using otids (Ho1m, Protoeng) Mutations (only one mutation) were randomly counted according to differences in the parent protein (with equal probability of being present in either codon) It is difficult to obtain new proteins with dramatically different properties.

どのようにデザインされた性質でもタンパク質の枠組内へ操作することは可能で あるはずであるが、よく調べられているもののみ再デザインがうまくゆくであろ う。It is possible to manipulate any designed property into the protein framework. There should be some, but only those that have been well researched will be successful in redesigning. cormorant.

合理的再デザインに必要な基本的情報を得るために、結晶解析、部位指定変異お よび瞬間力イネティック手法（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｋｉｎｅｔｉｃ　ｔｅｃｈ ｎｉｑｕｅｓ）を組み合わせて原核および真核生物両方のＮＡＤ依存性乳酸デヒ ドロゲナーゼの機能と構造とを相関させた。この知識は触媒経路に必要であるア ミノ酸を明らかにするのみならず、負にチャージした基質の酸が活性部位に入っ た場合に誘導される形状の王な再配置部分であり、基質の大きさに感受性が高く 、正確にチャージのバランスが取れている内部空隙と隔離する原因となっている アミノ酸地図を明らかにする。Crystal analysis, site-directed mutagenesis, and and transient kinetic technique NAD-dependent lactate dehydration in both prokaryotes and eukaryotes. We correlated the function and structure of drogenase. This knowledge is necessary for the catalytic pathway. In addition to revealing the amino acid, the negatively charged substrate acid enters the active site. It is the major rearrangement part of the shape induced when , causing isolation with an internal void where the charge is precisely balanced. Revealing the amino acid map.

この知識を用いて、チャージした基質に関して特異的で新規な酵素作用を有する 酵素をデザインすることが可能となり、そしてランダム変異のごとき低い統計的 可能性を避けることができる。もちろん、本発明はこの特定の例に限定されずよ り一般的に用いることができる。Using this knowledge, we have specific and novel enzymatic actions on charged substrates. It is now possible to design enzymes with low statistical possibility can be avoided. Of course, the invention is not limited to this particular example. It can be used generally.

図１には乳酸デヒドロゲナーゼの活性部位を示す。本図においては、基質特異性 を規定するい（つかの残基が「アッパー・ノヤウ（ｕｐｐｅｒ　ｊａｗ）Ｊ上に ある。乳酸デヒドロゲナーゼ触媒の律速段階は本ループが粘性の高い溶媒中をヘ リックスα２Ｇの上へ接近する速度である。律速段階は「アッパー・ジャク」上 のアミノ酸配列に大きく依存し、そして化学的反応が形状の変化より非常に速い ため、乳酸デヒドロゲナーゼ系はループ配列を、化学反応が律速となる危険性を 伴わずに容易に異なる基質特異性を有するよう変化させることができる。従って 、酵素工学によって特定の基質に対して改良された酵素を得るためには、い（つ かの技術の組み合わせが好適に用いられる。特定の残基を適応する官能基、例え ば異なった荷電を有するように、天然の基質と異なる荷電を有するものに対する ために交換してもよいが、酵素の異なる基質へ対する活性を完全にするためには 、無限のランダムなアミノ酸交換の実行が必要となる。これを酵素の特定の領域 に適応し、スクリーニング操作へ用いるために選択してもよい。Figure 1 shows the active site of lactate dehydrogenase. In this figure, substrate specificity I (a few residues are on the upper jaw) that define be. The rate-limiting step in lactate dehydrogenase catalysis is when this loop moves through a highly viscous solvent. This is the speed at which it approaches the top of Rix α2G. The rate-limiting stage is on the “upper jack” highly dependent on the amino acid sequence of the substance, and the chemical reaction is much faster than the change in shape Therefore, the lactate dehydrogenase system uses loop sequences to avoid the risk of chemical reactions becoming rate-limiting. can be easily changed to have different substrate specificities without the need for Therefore In order to obtain improved enzymes for specific substrates through enzyme engineering, A combination of these techniques is preferably used. Functional groups that apply specific residues, examples natural substrates and those with different charges, such as those with different charges. However, in order to complete the enzyme's activity towards different substrates, , which requires performing an infinite number of random amino acid exchanges. This is a specific region of the enzyme. may be selected for use in screening operations.

本発明の目的のひとつは、すでに有用であるが基質が限定されている酵素である Ｓ乳酸デヒドロゲナーゼを改変して、天然の基質であるピルビン酸より大きな酸 のαケト基を還元する触媒に対して、改良された効果を有する酵素を提供するこ とである。特に興味のある基質は、大きな芳香族基を含有するものである。One of the objects of the present invention is to develop enzymes that are already useful but have limited substrates. S-lactate dehydrogenase has been modified to produce acids larger than its natural substrate, pyruvate. To provide an enzyme having an improved effect on a catalyst for reducing the α-keto group of That is. Substrates of particular interest are those containing large aromatic groups.

操作のベースとして用いる天然の酵素は好熱性乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ） のバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏｔｈｅ ｒａｏｐｈｉｌｕｓ）より単離されたものであって、工・ｌンエリンア・コリ（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）内へクローン化し、発現させたものである 。The natural enzyme used as the basis for the operation is thermophilic lactate dehydrogenase (LDH). Bacillus stearothermophilus (Bacillus 5tearothermophilus) raophilus), and was isolated from E. raophilus). It was cloned into Escherichia coli and expressed. .

本酵素はタンパク質骨格が最もよく調べられている酵素のうちのひとつであり（ ダン（Ｄｕｎｎ、　Ｃ，Ｒ，）ら、フィロス・トランス・アール・ツク・ロンド ン（ｐｈｉｌｏｓＴｒａｎｓ、Ｒ，Ｓｏｃ、　Ｌｏｎｄｏｎ）　Ｂ、１９９１． ３３２，１８４）、阻害、基質相互作用および遺伝子操作の研究もまたされてい る。酵素の物理的安定性、特に軌による変性に対する安定性は、一般にαヒドロ キシ酸デヒドロゲナーゼとして適応可能であるリデザインの性質を示すのに理想 的な候補者となり得る。This enzyme is one of the enzymes whose protein skeleton has been most well studied ( Dunn, C, R, et al. Philos Trans, R, Soc, London) B, 1991. (332,184), inhibition, substrate interactions, and genetic manipulation studies have also been conducted. Ru. The physical stability of enzymes, particularly against denaturation by orbitals, is generally determined by Ideal for demonstrating the adaptable redesign properties of oxyacid dehydrogenases Can be a good candidate.

野生型酵素の改変にはある種のチャレンツである、というのは、ある程度の文献 的知識を有するタンパク質である場合でさえ、その結果は予期せざるものであり 、また驚くべきものであるからである。従って、良く研究されている酵素の再デ ザインでさえ、限定された範囲の予測しかつかないのである。There is some literature that suggests that there are certain challenges to modifying wild-type enzymes. Even for proteins with specific knowledge, the results can be unexpected. , because it is also surprising. Therefore, redetailation of well-studied enzymes Even Zain has only a limited range of predictions.

酵素のアミノ酸組成の変化およびこれによる、カイネティックと基質特異性への 影響は自然に生じるものであり、この自然の酵素骨格の変化を強化するため、様 々な方法が開発されている。ランダム変異処理は遺伝情報（およびこれがコード するタンパク質）内に、古典的な変異方法によって誘導される。その後、部位指 定変異処理により、遺伝子内の特定の塩基を変えることが可能となり、こうして 標的タンパク質の既知の位置にあるアミノ酸を指定して変化させることが可能と なる。同様の方法を用いて、酵素内の機能的に重要な領域の特定のアミノ酸配列 を置換することによっても達成することができる。Changes in the amino acid composition of enzymes and their effects on kinetics and substrate specificity The effects are naturally occurring and various treatments are used to enhance this natural enzyme skeleton change. Various methods have been developed. Random mutation processing uses genetic information (and this code (proteins) that are induced by classical mutagenesis methods. Then, the part finger Constant mutagenesis makes it possible to change specific bases within a gene, thus It is possible to specify and change amino acids at known positions in target proteins. Become. Using similar methods, specific amino acid sequences of functionally important regions within enzymes can be identified. This can also be achieved by replacing .

タンパク質の詳しい情報、例えば】次配列およびＸ線解析より得た３次構造、は 分子モデルと共に、保Ｉ！領域として知られている箇所の内部の様々なアミノ酸 の部位の特定を可能とする。これは様々な乳酸デヒドロゲナーゼ酵素のアミノ８ れている構造は、保護されているものであり酵素の機能の維持に重要であると考 えられる。この情報により特定の酵素におけるいかなる変化も、一般的なすべて の基質にわたる他のすべてのホモロガスな酵素に対して正確に指摘することが可 能となるが、これが可能でなければ同じ生化学反応を満たすことができないであ ろう。特に現在興味のある酵素はαーヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼであり、こ れはＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ依存性のα−ケト基の還元、およびカルボン酸のα位 または反対にα−ヒドロキシ基をケトンへ酸化させる逆反応を触媒する。Detailed information about the protein, such as the following sequence and tertiary structure obtained from X-ray analysis, is Along with the molecular model, keep it! various amino acids within locations known as regions It is possible to identify the part of the body. This is the amino-8 of various lactate dehydrogenase enzymes. This structure is considered to be protected and important for maintaining enzyme function. available. This information allows any changes in specific enzymes to be can be pinpointed for all other homologous enzymes across the substrates of However, if this is not possible, the same biochemical reaction cannot be satisfied. Dew. The enzyme of particular interest at present is α-hydroxy acid dehydrogenase, which This is due to the NADH/NADPH-dependent reduction of α-keto groups and the α-position of carboxylic acids. Or, conversely, it catalyzes the reverse reaction of oxidizing an α-hydroxy group to a ketone.

乳酸デヒドロゲナーゼを改変して天然の基質特異性を拡大し、様々な官能基を有 するより大きな基質によっても増加した反応速度が得られるようにする試みは、 従来技術からは予期し得ぬ結果をもたらした。基質およびこれに対応する目的と するキラル生成物を化学合成により合成することは可能であるかもしれないが、 野生型酵素による還元の後では、かかるアプローチは魅力的ではなく、タンパク 質骨格の再デザインによりさらに合理的で経済的なアプローチが可能となり得る 。Lactate dehydrogenase can be modified to expand its natural substrate specificity and contain various functional groups. Attempts to obtain increased reaction rates also with larger substrates This yielded results unexpected from conventional techniques. Substrates and corresponding purposes and Although it may be possible to synthesize chiral products by chemical synthesis, After reduction by the wild-type enzyme, such an approach is unattractive and protein Redesigning the quality framework may enable a more rational and economical approach .

さらに、酵素の変化は火勢の基質に対する活性が劇的に減少し、完全に異なった 基質特異性が生成されることが示された。これは、酵素が唯一の基質を還元すれ ばよい場合のバイオトランスフオーメーンヨン触媒では要求されないかも知れな いが、強力な基ｉ１を混合物が存在する場合、例えば生物試料である場合等には 選択的な転換または特定の化学種の決定が必要である。この基質特異性の変化は 、基質が必ず他の存在物により汚染されており、これもまたトランスフオームさ れる細胞全体を用いたバイオトランスフすーメーンヨンにおいて特に有用であり 得る。In addition, the enzyme changes dramatically reduced its activity towards the substrates of the enzyme, making it completely different. Substrate specificity was shown to be generated. This is because the enzyme reduces only one substrate. This may not be required for biotransformation catalysts in certain cases. However, if a mixture of strong groups i1 is present, for example in the case of biological samples, Selective conversion or determination of specific species is required. This change in substrate specificity is , the substrate is necessarily contaminated by other entities, which also may be transformative. It is particularly useful in biotransfusion using whole cells. obtain.

ウイルクス（ｆｉｌｋｓ）らの仕事（バイオケミストリー、１９９０、ｌユ、８ ５８７）において、ＮＡＤ依存性デヒドロゲナーゼの基質特異性を変化させるの に用いた変異戦略が記載されている。開示された酵素は、一般式。The work of Wilkes et al. (Biochemistry, 1990, IU, 8) 587) to change the substrate specificity of NAD-dependent dehydrogenase. The mutation strategy used is described. The disclosed enzyme has the general formula:

Ｃ．Ｈ２．、、Ｃｏ　Ｃ０ＯＨであって直鎖および分岐鎖状のアルキル残基を有 していてもよいピルビン酸の同族体の還元を触媒する。本研究の最初の目的は、 長いアルキル基、およびヒドロキシルおよびケト置換基に加えて芳香族基がα− オキソ酸の同じ基本骨格に結合している基質に対するデザイン方法を開発するこ とである。C. H2. ,, Co　C0OH with linear and branched alkyl residues Catalyzes the reduction of pyruvate congeners that may be oxidized. The first purpose of this research is to Long alkyl groups, and aromatic groups in addition to hydroxyl and keto substituents are α- Developing a design method for substrates that are bonded to the same basic skeleton of oxoacids. That is.

かかる基質を還元し得る酵素は特に、α−ケト化合物を立体特異的に対応する２ 級アルコールへ転換させることができ、化学合成の分野において有用である。Enzymes capable of reducing such substrates are particularly capable of reducing α-keto compounds by stereospecifically corresponding 2 It is useful in the field of chemical synthesis.

２級アルコールの個々の光学異性体を合成することは薬剤および薬品の中間体の 光学異性体を合成する上で非常に効果的である。いくつかのαーヒドロキシ酸デ ヒドロゲナーゼに認められる好熱性は、酵素反応を反応が加速されるであろう比 較的高温で行わせることが可能であり、また酵素が本質的に安定であるという利 点を有する。これらの酵素はある種の疾病状況の生物学的試料から得られた特定 の基質のレベルの測定に導入することができる。Synthesizing individual optical isomers of secondary alcohols is useful for drugs and pharmaceutical intermediates. Very effective in synthesizing optical isomers. Some α-hydroxy acids The thermophilic property observed in hydrogenases is the thermophilic property of hydrogenases, which limits the enzymatic reaction to a rate at which the reaction will be accelerated. The advantage is that it can be carried out at relatively high temperatures and the enzyme is inherently stable. Has a point. These enzymes have been identified in biological samples from certain disease situations. can be introduced to measure the levels of substrates.

ＮＡＤ依存性デヒドロゲナーゼの分野で番号付が行われており、これはもともと つのざめ（ｄｏｇｆｉｓｈ）筋肉の乳酸デヒドロゲナーゼのＸ線構造に基づいた ものである。このシステムはアミノ酸に、Ｎ末端から昇順に番号を付ける。本シ ステムにより保存されている残基同定すると、例えば３０及び３３位のグリノン 、８５位の千口／ン、１０９位のアルギニン、１６３位のセリン及び１６８位の アスｌくラキン酸である。Numbering is used in the field of NAD-dependent dehydrogenases, which was originally Based on the X-ray structure of dogfish muscle lactate dehydrogenase It is something. This system numbers amino acids in ascending order starting from the N-terminus. This book Identification of residues conserved by the stem, e.g. glinones at positions 30 and 33 , 85th place Senku/n, 109th place arginine, 163rd place serine and 168th place The most common is laconic acid.

したがって、天然または変異処理によるいずれの既存のＮＡＤ依存デヒドロゲナ ーゼであっても番号により規定された同一のアミノ酸配列の領域を有する。本規 定において重要な観点は、ＮＡＤ依存性デヒドロゲナーゼのいずれのアミノ酸力 咬換されているかを正確に記載し得ることである。Therefore, any existing NAD-dependent dehydrogena, either natural or by mutational treatment, Even the enzymes have regions of the same amino acid sequence defined by numbers. Main regulations An important point in determining the amino acid strength of NAD-dependent dehydrogenase is It is possible to accurately describe whether or not the bite has been replaced.

以下の表１において、並べたアミノ酸配列は３つのＮＡＤ依存性乳酸デヒドロゲ ナーゼを示す．ブタのＭ４アイソエンザイム、ヒト精巣のアイソエンザイムお（ 「−」は連続的なポリペプチド鎖が分断されることを意味するのではなく、他の 酵素と最大ホモロジーを示す配列を一列に並べるために、番号表示を中断したこ とを表示するものである。） 表１（つづき） 従来の番号系には、おりたたまれたポリペプチドにおける特定の′ｕ４造要素と 相関したり、および基質認識部位または活性化部位のごとき特定の機能性を有し ていたりする短い配列がある。In Table 1 below, the aligned amino acid sequences are of three NAD-dependent lactate dehydrogenes. Indicates naze. Porcine M4 isoenzyme, human testis isoenzyme ( "-" does not mean that a continuous polypeptide chain is broken, but rather The numbering was interrupted in order to align the sequences with the greatest homology to the enzyme. and is displayed. ) Table 1 (continued) Traditional numbering systems include specific 'u4 structural elements in folded polypeptides and have a specific functionality, such as a substrate recognition site or an activation site. I have a short array that is

基質認識部位はポリペプチド鎖の稼働性ループに誹りその一部が担われており、 通常これは９８位から１１０位である。この配列は伝統的に１０３位の残基とは 隣接しているが、これを含まない。The substrate recognition site is partially carried out by the operational loop of the polypeptide chain, Usually this is between 98th and 110th. This sequence traditionally corresponds to the residue at position 103. Adjacent to, but not including.

ヒトロキ／官能基への還元をするに際してＳ型異性体を生成するり、型α−ヒド ロキシ酸デヒドロゲナーゼは、可動性表面ループが存在し基質の結合の後にコン フォメ〜ノヨンを変えることが知られている。このループはアミノ酸残基９８位 −１１０位から構成されており、１０９位にアルギニンを含有するが、このアル ギニンのアミノン基のからの正電荷が引き伸ばされた基質カルボニル基を安定化 し、それゆえ水素転移に必要な遷移状すとするのに要求されるエネルギーを減少 させるため、触媒作用には重要である。Upon reduction to the human loki/functional group, S-type isomer is generated or α-type α-hydroisomer is generated. Oxyate dehydrogenase has a flexible surface loop and is converted after substrate binding. It is known to change fome~noyon. This loop is located at amino acid residue 98 -110 and contains arginine at the 109th position; The positive charge from the amino group of ginine stabilizes the stretched substrate carbonyl group. and therefore reduces the energy required to achieve the transition state necessary for hydrogen transfer. It is important for catalytic action.

ループ領域はまた、基質選択領域においても含有されており、それゆえ本発明の 酵素工享研究において重要である。The loop region is also contained in the substrate selection region and is therefore a feature of the present invention. It is important in enzyme engineering research.

乳酸デヒドロゲナーゼが異なる基質を区別する機構は、可動性表面ポリペプチド ループがタンパク質表面上を閉鎖した場合に形成されるブコトンー不透過性の、 大きさの固定された内部空洞内へ基質の適合する能力による。ループによる閉鎖 は適当な小さくそして単独の負荷電基質を適合させることが可能なだけでなく、 ループによる閉鎖はアルギニン１０９残基を通じて触媒のトリが−ともなり得る 。The mechanism by which lactate dehydrogenase distinguishes between different substrates is based on mobile surface polypeptides. Bucoton-impermeable, which is formed when a loop closes on a protein surface. By the ability of the matrix to fit into an internal cavity of fixed size. Closure with a loop Not only is it possible to accommodate suitable small and single negatively charged substrates, but also Closure by the loop can also lead to the catalytic triggering through the arginine 109 residue. .

この可動性ループの組成および長さの多様性は目下の目的である。これらの実験 の便宜のため、野生型バチルス・ステアロガーモフィラス乳酸デヒドロゲナーゼ のアミノ酸２３５位と２３６位のアラニンがグリノンと交換されているものの遺 伝子を選択した。この特定のアミノ酸１換の効果はウイルクス（ｆｉｌｋｓ）ら によって限定された範囲の基質に関して報告されており（バイオケミストリー、 旦、８５８７）一般に、より大きなアルキル基を有する基質に対する活性を増強 することがわかっている。ループ交換の原理を示すために用いたものであるが、 本挾術はこの特定の酵素に限定されるものではなく、この変異酵素のみならず池 のすへての構造的に関連のあるα−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼに例えば用い ることができる。This diversity in composition and length of flexible loops is of current interest. These experiments For convenience, wild-type Bacillus stearogermophilus lactate dehydrogenase Although alanine at amino acid positions 235 and 236 of I chose Denden. The effect of this specific amino acid substitution was demonstrated by Wilks et al. have been reported on a limited range of substrates (biochemistry, 8587) generally enhances activity towards substrates with larger alkyl groups. I know I will. It was used to demonstrate the principle of loop exchange, This technique is not limited to this particular enzyme; it is not limited to this mutant enzyme; For example, it can be used for all structurally related α-hydroxy acid dehydrogenases. can be done.

２３５位および２３６位のアラニンをグリシンと交換する変異は、可動性ポリペ プチドループ（残基９８〜１１２）における他の３つの変異、すなわちグリノン １０２をメチオニンに、リノン１０３をバリンにおよびプロリン１０５をセリン に交換することと連動している（ＭＶＳ／ＧＧ）。Mutations that exchange alanine at positions 235 and 236 with glycine result in a mobile polypeptide. Three other mutations in the petid loop (residues 98-112), namely glinone 102 to methionine, linone 103 to valine, and proline 105 to serine (MVS/GG).

この新しい酵素の構築の、より長い基質への活性を評価した、特に不飽和分岐鎖 基質である４−メチル−２−オキソ−３−ペンテン酸であって以下のアルコール へ還元されるものに対する評価を行った。We evaluated the activity of this new enzyme construct on longer substrates, especially unsaturated branched chains. The substrate 4-methyl-2-oxo-3-pentenoic acid and the following alcohols We evaluated what could be returned to the government.

定常力イネティンク測定によれば、野生型酵素によってはこの化合物の還元がゆ っくり進み、ターンオーバー値が０．０３Ｓ″であったが、一方、変異酵素によ れば１．２９−’であった。Ｋｍを、５ｍＭのフルクトース１．６−ビスホスフ ェートの存在下、同じ条件の基質濃度（１〜２０ｍＭ）下で測定したところ２２ ｍＭであった。この測定結果は特異性がよりフレキノプル性の少ない基質へと変 化したものと考えられ、ループ領域が基質の還元に重要であることを示すもので ある。Steady-state force Inetink measurements show that some wild-type enzymes are unable to reduce this compound. It progressed slowly, and the turnover value was 0.03S'', but on the other hand, the mutant enzyme It was 1.29-'. Km is 5mM fructose 1,6-bisphosph When measured under the same conditions of substrate concentration (1-20mM) in the presence of 22 It was mM. This measurement result indicates that the specificity has changed to a less flexinopletic substrate. This suggests that the loop region is important for substrate reduction. be.

新しいループの構築に用いた方法は、制限酵素部位をループ配列をコードするＤ ＮＡの両方の末端へ挿入することである。これらの新規制限部位はこの酵素をコ ードするＤＮＡの中において唯一のものであり、開裂され、その後新しいループ 領域をコードするようにデザインされた合成りＮＡと再度ライゲートされる。The method used to construct the new loop was to convert the restriction enzyme site into the D It is inserted into both ends of NA. These new restriction sites coexist with this enzyme. It is the only one of the DNA that codes, is cleaved, and then a new loop is formed. It is religated with a synthetic NA designed to encode the region.

を用いて、野生型の遺伝子と容易に区別し得るという利点も得られる。Another advantage is that the gene can be easily distinguished from the wild-type gene.

ループのデザインアプローチを酵素工学への利用性を説明するために、３アミノ 酸分短い２ループと４アミノ酸分長い１の新規ループを導入した。この方法によ って製造された新規酵素を基質試験に供し、ループ交換の効果を測定した。To illustrate the applicability of the loop design approach to enzyme engineering, we We introduced two new loops with a short acid length and one new loop with a length of 4 amino acids. This method The novel enzyme produced by this method was subjected to a substrate test to measure the effect of loop exchange.

新規ループは酵素の性質を、その構築に用いた骨格から変えることが明らかに示 された。２３５位および２３６位のアミノ酸におけるアラニン−グリシン交換に よっても、および９７位アミノ酸システィンをスレオニンと交換した場合の結果 もまた示した。It has been clearly shown that the new loop changes the properties of the enzyme from the backbone used for its construction. It was done. Alanine-glycine exchange at amino acids 235 and 236 Therefore, and the result when the amino acid cysteine at position 97 is replaced with threonine also showed.

アラニン−グリノン二重変異によるα−ケトカプロエートとα−ケトイソカプロ レートのターンオーバーの増加はウイルクスら（バイオケミストリー、２９．１ ９９０．８５８７）の結果と矛盾しない。芳香族基質２−オキソ−フェニル−プ ロパン酸。α-ketocaproate and α-ketoisocapro by alanine-glinone double mutation The increase in the rate of turnover was reported by Wilkes et al. (Biochemistry, 29.1 990.8587). Aromatic substrate 2-oxo-phenyl-p Lopanoic acid.

に対するターンオーバーにおける増加はＫｍの増加を伴い、これは自明ではなく 、この芳香族基質のキラルなα−ヒドロキシ基の合成において本発明の変異酵素 を使用する点において、有用な改良であることが示される。An increase in turnover for is accompanied by an increase in Km, which is non-trivial. , the mutant enzyme of the present invention in the synthesis of the chiral α-hydroxy group of this aromatic substrate. This is shown to be a useful improvement in the use of .

アミノ酸９７位のンステインをスレオニンと交換しても、２−オキソ−４−フエ に対する有益なＫｍ値が野生型酵素のまま保たれる。Even if stein at amino acid position 97 is replaced with threonine, 2-oxo-4-phenylene The beneficial Km value for the wild-type enzyme is retained.

これらの個々の変異の芳香族基質の還元に及ぼす影響は、ホモキラルヒドロキシ 酸が生理活性化合物の合成のための有用なキラル構築プロＩりから合成されると いう、明らかに興味あるものである。The effect of these individual mutations on the reduction of aromatic substrates is When acids are synthesized from chiral building blocks useful for the synthesis of bioactive compounds, That's obviously interesting.

新しいループ配列の導入によりさらに酵素の基質特異性が変わり、野生型酵素の 場合より天然基質のターンオーバーを減少させる。３つの新しいループ酵素はほ とんどの野生型の触媒能を２−オキソ−４−フェニルプロパン酸に対してターン オーバーおよびＫｍ＠に見られるように、はぼ保持し、長いループおよび第２の 短いループの場合にはターンオーバーが増加する結果となった。The introduction of the new loop sequence further changes the substrate specificity of the enzyme, and Reduces turnover of natural substrates. Three new loop enzymes Most of the wild-type catalytic ability was turned towards 2-oxo-4-phenylpropanoic acid. Hold the habo, long loop and second as seen in Over and Km@ In the case of short loops, turnover increased.

これらの実施例は酵素の活性が、天然の基質およびこれより大きな非天然基質の 両方に対してループ内の配列の交換により劇的に変えることができることを説明 する。These examples show that the activity of the enzyme is dependent on the natural substrate and the larger non-natural substrate. Explain that both can be dramatically changed by swapping arrays within the loop. do.

大きなループにおいては、２−オキソ−フェニルに対するＫｃａｔ／Ｋｍがピル ビン酸に対してより１７００倍も良く、一方野生型酵素では反対にピルビン酸に 対しての方が２３０倍良好であったことは、特異性が３９１０００倍変化したこ とを示す。In large loops, Kcat/Km for 2-oxo-phenyl is 1700 times better than pyruvate for the wild-type enzyme, whereas the wild-type enzyme did the opposite for pyruvate was 230 times better than the previous one, which means a 391,000-fold change in specificity. and

酵素の特異性のピルビン酸から２−オキソ−４−フェニルプロパン酸への交換は 新規酵素が医化学領域においてはしばしばフェニルピルビン酸と名付けられる２ −オキソ−４−フェニルプロパン酸の、特に血液および尿のごとき生体液内濃度 の測定に好適であることを示す。The exchange of enzyme specificity from pyruvate to 2-oxo-4-phenylpropanoic acid is A new enzyme is often named phenylpyruvate in the medical chemistry field2. -Concentrations of oxo-4-phenylpropanoic acid in biological fluids, especially blood and urine. This indicates that it is suitable for measuring.

フェニルピルビン酸レベルは正常では低いが、フェニルアラニン１度の増加によ り有意な増加を示し、これは遺伝子病であるフェニルケトン尿症に関与する（う 〕／ゲンベツク（Ｌａｎｇｅｎｂｅｃｋ）ら、ノエイ・インバー・メタブ・ディ ス（Ｊ、　ＩｎｈｅｒＭｅｔａｂ、　Ｄｉｓ、）、迭、１９８１．６９）。フェ ニルピルビン酸還元酵素またはフェニル乳酸デヒドロゲナーゼ酵素はフェニルア ラニンデヒドロゲナーゼと共に使用する事も可能であり、フェニルケトン尿レベ ルを測定する際に使用すれば、フェニルピルビン酸からの干渉を打ち消すことが 可能であり、これによってフェニルアラニンをベースとする方法の感度が上昇す る。Phenylpyruvate levels are normally low, but an increase in phenylalanine This is associated with the genetic disease phenylketonuria ( ]/Langenbeck et al. (J, InherMetab, Dis, ), 1981.69). Fe Nilpyruvate reductase or phenyllactate dehydrogenase enzyme is It can also be used with ranin dehydrogenase to reduce phenylketonuria levels. It can be used to negate interference from phenylpyruvate when measuring possible, and this increases the sensitivity of phenylalanine-based methods. Ru.

ループ領域の両端に制限部位を有する構築物は、様々な長さおよび様々な配列の ループを有するデヒドロゲナーゼの調製に用い得る。従って、ランダム変異処理 を乳酸デヒドロゲナーゼの基′ｇ１認識に重要であると同定されている領域に制 限することによって、所望のキラル還元を１１わせる酵素を単離することが可能 である。ランダム変異処理はスパイク・オリゴヌクレオチドを特定の位置または 異なった長さのループへ導入する、あるいはこれに代えてイノノントリホスフェ ートをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）へ導入して、ループ領域全体または特定 の残基のいずれかを変異させてもよい。これらの操作の両方は、変異ライブラリ ーを、ＬＤＨのループ領域をコードするＤＮＡ内へ導入された制限部位を用いて 調製する場合に用いられる。さらなるＰＣＲ法を、ループ領域の特定の位置のラ ンダムに組み合わせたＤＮＡのライブラリーを作成するのに用いた。この方法で は、酵素の基質特異性を規定する領域に含有される１０１位及び１０２位を標的 として行った。Constructs with restriction sites at both ends of the loop region can be constructed of various lengths and sequences. It can be used to prepare dehydrogenases with loops. Therefore, the random mutation process to a region that has been identified as important for group 'g1 recognition of lactate dehydrogenase. It is possible to isolate the enzyme that causes the desired chiral reduction by limiting the It is. Random mutagenesis is a process that mutates spike oligonucleotides at specific positions or Introducing loops of different lengths or alternatively inonontriphosphate into the polymerase chain reaction (PCR) to isolate entire or specific loop regions. Any of the residues may be mutated. Both of these operations are performed on mutant libraries using a restriction site introduced into the DNA encoding the loop region of LDH. Used when preparing. A further PCR method was performed on specific positions of the loop region. It was used to create a library of randomly combined DNA. using this method targets positions 101 and 102, which are contained in the region that defines the substrate specificity of the enzyme. I went as.

ＰＣＲは最初に、相補的な重複する末端を有する３００および８００塩基対フラ グメントを生成させるのに用いた。これらの重複部位にランダムな配列が導入さ れているプライマリ−生成物を、その後お互いにプライムさせ、延長させＬＤＨ ハイブリッド遺伝子を得た。非重複末端にアニーリングする２つの外部プライマ ーと共に行う第２のＰＣＲを、最終的にＬＤＨ生成物を増幅させるのに用いた。PCR was first carried out using 300 and 800 base pair fragments with complementary overlapping ends. was used to generate the segment. Random sequences are introduced into these overlapping sites. The primary products that are present are then primed together and extended to form LDH. A hybrid gene was obtained. Two external primers that anneal to non-overlapping ends A second PCR, performed with a 100% chromatinase, was used to amplify the final LDH product.

バチルス・ステアロサーモフィラスのＬＤＨ遺伝子の前処理にはＥｃｏＲＩ／旦 且土工で消化させた遺伝子をＰＫＫ２３３−２またはＭ１３プラスミドベクター 内へクローニングすることを含む。現在ではＰＣＲ生成物を数多くのベクターの いずれへもクローニングすることができるがこれは、コード領域以外にアニーリ ングする外部プライマー（２）のうちのひとつへさらにＥｃｏＲ１部位を導入し ているからである。例えば、所望の部位にランダム配列を有する代表的なライブ ラリーがあることを確認するために、唯一のＥｃｏＲ１部位を有する遺伝子をＰ ＵＣ１８内へクローン化し、これによって高い収率でＤＮＡが小さな断片より得 られ、その（ｌｔ　Ｐ　ＣＲ生成物をＰＫＫ２３３−２のごときプラスニドまた はファー７発現ベクター内へクローン化してもよい（図２参照）。For pretreatment of LDH gene of Bacillus stearothermophilus, EcoRI/Dan The gene digested by earthworks is transferred to PKK233-2 or M13 plasmid vector. Including cloning into. Nowadays, PCR products can be used with many vectors. It is possible to clone to any region, but this is because the annealing region Introducing an additional EcoR1 site into one of the external primers (2) This is because For example, a representative live library with a random sequence at the desired site To confirm that there is a library, the gene with a unique EcoR1 site was cloned into UC18, which yields high yields of DNA from small fragments. and its (lt　P　CR product) may be cloned into the Fur7 expression vector (see Figure 2).

ＰＣＲ法により以下の利点が得られる。The PCR method provides the following advantages.

１　高い収率てＰＣＲ生成物が得られる。1. PCR products can be obtained with high yield.

２　生成物を変異ＤＮＡとして識別し、これを野生型配列からＹ±旦土工消化よ り選択し冴る。2. Identify the product as mutant DNA and digest it from the wild type sequence by Select and choose clearly.

３、　ｌｋｂの生成物を取り扱い、モニターするのが、４ｏ塩基対の野生型配列 が変異配列と交換されるよう両端に制限部位をデザインすることを含む従来の試 みより容易である。3. The 4o base pair wild-type sequence handles and monitors the lkb product. Traditional attempts involve designing restriction sites at both ends so that the sequence is exchanged with the mutant sequence. It's easier than it looks.

４　処理スピード。4. Processing speed.

５、　ＥｃｏＲ１部位を有するプライマー２のデザインにより、多くのベクター 内へ遺伝子生成物のクローニングが可能になった。5. Due to the design of Primer 2 with EcoR1 site, many vectors can be used. It became possible to clone gene products into

６、　二本鎖鋳型を変異処理に使用する。6. Use the double-stranded template for mutation processing.

７、　ＬＤＨ遺伝子の他の領域へ処理する方法を適応し、この重複伸展法を用い て一つの分子内の異なった領域の変異が容易になる。7. Adapting the processing method to other regions of the LDH gene and using this overlap extension method This facilitates mutation of different regions within one molecule.

８３゛末端において鋳型と相補性の高い領域を有する変異オリゴヌクレオチドに より、このオリゴヌクレオチドベクターへのアニーリング効率が高い。A mutant oligonucleotide with a region highly complementary to the template at the 83′ end Therefore, the annealing efficiency to this oligonucleotide vector is higher.

酵素のループ領域または実際のいずれかの標的酵素のいずれかの標的領域をカバ ーする変異体のライブラリーを作成する指定ランダム変異処理法をうまく利用す るためには、所望の性質を有する変異体の遺伝子を発現するクローン選択のため の適当なスクリーニングが必要である。デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨ生成物と フェナジンメタスルフェートとのカップリングによるブルー・フォルメザン（ｂ ｌｕｅ　ｆｏｒｍａｚａｎ）染料の形成により検出される。Cover either the loop region of the enzyme or the target region of either the actual target enzyme. The use of directed random mutagenesis methods to create libraries of mutants that For selection of clones expressing mutant genes with desired properties, Appropriate screening is necessary. Dehydrogenase produces NADH and Blue formesan (b) by coupling with phenazine metasulfate It is detected by the formation of a dye (blue formazan).

スクリーニングはカソツエ：／　（Ｋａｔｚｅｎ）とシムケル（Ｓｃｈｉｍｋｅ ｌＸ　Ｐ　Ｎ　Ａ　Ｓ　、　５４．１２１８）の研究に基づき、所望の基質に対 する特異性およびＮＡＤ”をＮＡＤＨへ還元させる酵素を発現する能力により行 う。還元された補酵素はその後フェナジンメタスルフェートを還元し、これが次 にニトロブルー・テトラゾリウムを不溶性のブルー染料に還元する。The screening was conducted by Katzen and Schimke. Based on the research of IXPNAS, 54.1218), This is achieved through the specificity of reducing NAD to NADH. cormorant. The reduced coenzyme then reduces phenazine metasulfate, which in turn nitroblue tetrazolium is reduced to an insoluble blue dye.

コンピテントなイー・コリ細胞内へ変異ＤＮＡを形質転換させ、これを１５％グ リセロールとアンピノリンを含有する寒天培地上に一８０℃で保存した。高い形 質転換効率を有するエレクトロ−コンピテント細胞を得、これはＤＮＡ１μｌあ たり１０６の生成効率を示し、この効率はスクリーニングに供する代表的な変異 コロニーを産生させるのに十分である。本プレートのコピーをベルベ・ｌト復製 材を用いて作成し、該コピーを一晩培養した。（イー・コリＬＤＨ活性はフィル ターベーパーを６７℃で３０分間培養すると消失するが、野生型酵素の活性はこ の温度において４５分間まで失われなかった。）これらのコピーをその後ある範 囲の基質に対してスクリーニングし個々のコロニーを比較した。各マスタープレ ートを少なくとも３回各場合の条件を同一としてスクリーニングに供し、１ｉｉ ｉＪした。The mutant DNA was transformed into competent E. coli cells, and this was incubated with 15% It was stored at -80°C on an agar medium containing lycerol and ampinoline. high shape Electro-competent cells with transformation efficiency were obtained, which was obtained by adding 1 μl of DNA. It shows a production efficiency of 106 molecules, and this efficiency is based on the typical mutations used for screening. sufficient to produce colonies. A copy of this plate is reproduced in velvet. The copies were cultured overnight. (E. coli LDH activity is The activity of the wild-type enzyme disappears when turbapor is incubated at 67°C for 30 minutes; It was not lost for up to 45 minutes at a temperature of . ) These copies can then be Screening and comparison of individual colonies against surrounding substrates were performed. Each master play screened at least three times using the same conditions each time, I did iJ.

この方法を用いると異なった比串の染色部が乳酸およびマレイン酸をそれぞれ基 質として野生型コロニーのフィルターコピーと、マレイン酸デヒドロゲナーゼ活 性の変異酵素（Ｑ１０２Ｒ）の該コピーとの間に染色度の違いが認められ、各コ ロニーの識別のためのスクリーニングの正当性を確認した。Using this method, dyed areas of different ratios are based on lactic acid and maleic acid, respectively. Filter copies of wild-type colonies as a quality and maleate dehydrogenase activity. Differences in staining intensity were observed between the copies of the sex mutant enzyme (Q102R), and each copy The validity of the screening for Ronnie's identification was confirmed.

以下により本発明をさらに詳細に説明する乳酸デヒドロゲナーゼの変異処理 バチルス・ステアロサーモフィラスの乳酸デヒドロゲナーゼ変異体をウィンター （Ｗｉｎｔｅｒ）らのオリゴヌクレオチド・ミスマツチ法（ネイチャー、１９８ ２．１９９．７５６）によりＭ１３内に、変異オリゴヌクレオチドをイン・ビト ロの鎖延長のためのプライマーとして用いて作成した。２３５位及び２３６位に おけるアラニンからグリノンへの二重置換はオリゴヌクレオチド配列コ’ＣＧＣ ＧＣＴＡＣＣＧＣＣＣ；ＡＴＣ；ＴＴＴＡ５’を用いて行７た。野生型および変 異型酵素はイ・−コリ内のＰＫＫ２２３−３プＳａｃ　Ｉ　ｌおよびＸｂａ１部 位を野生型活性部位ループをコードする遺伝子の両末端へ構築するための変異処 理 ５４−マー（５４−ｍｅｒ）のオリゴヌクレオチドを、それぞれ唯一の制限部位 （ＳａｃｌｌおよびＸｂａｌ）を活性部位ループ（アミノ酸９８〜１１０）の両 端へ導入するための、野生型鋳型（バーストフ、ロック・ノット（ｌｏｃ、　ｃ ｉｔ））を用いた変異処理を制御するのに用いた。変異を起こさせるオリゴヌク レオチドは以下のものである： Ｓ’（ｉＴｃｃＭＪＪｔＧＧＴｃＴ、！ｔＧＡＣＧＣＣＴＣＴＣ（、ＣＣＣＧＧ Ｔゴーｙｃｃｒｒｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃ丁ＡＡＴＧＡＣＡ`Ｃ３’ アニーリング、鎖延長およびクローニングはクラルケ（Ｃ１ａｒｋｅ）らの方法 （ネイチャで制限処理をし、小さなフラグメン１−をＡｌａ２３５Ｇｌｙおよび Ａｌａ２３６Ｇ１ｙ変異ＬＤＨを含有するＰＫＫ２２３−３内へサブクローン化 させ、これより小さなＥｃｏＲＩ／Ｘｈｏｌフラグメントをはずした（ウイルク スら、バイオケミストリー、１９９０、到、８５８７）。得られたプラスミド（ ｐＬＤＨｒｓ）をコンビチットなイー・コリＴＧ２細胞内へ形質転換した。全体 の配列は自動間７７１１決定装置「デュポン・７ｚ−７−／ス２０００４を用い て再度決定し、正確なル−プ配列が導入されていることが示された。野生型遺伝 子および変異体の挿入された制限部位を有する部分的なりＮＡ配列を表２に示し た。Mutation treatment of lactate dehydrogenase, which describes the invention in further detail by: Winterize lactate dehydrogenase mutants of Bacillus stearothermophilus (Winter) et al.'s oligonucleotide mismatch method (Nature, 198 2.199.756) into M13 in vitro. This primer was used as a primer for chain extension. 235th and 236th place The double substitution of alanine to glinone in the oligonucleotide sequence co'CGC 7 was carried out using GCTACCGCCC; ATC; TTTA5'. Wild type and mutant The heterotypic enzymes are PKK223-3, SacIl and Xba1 parts in E. coli. mutagenesis to construct positions at both ends of the gene encoding the wild-type active site loop. Reason Each 54-mer oligonucleotide has a unique restriction site. (Sacll and Xbal) in both active site loops (amino acids 98-110). Wild-type mold (burstoff, lock knot (loc, c It)) was used to control the mutation process. Oligonucleus that causes mutations Reotide is: S’(iTccMJJtGGTcT,!tGACGCCTCTC(, CCCGG T go yccrrcccccccccc dingAATGACA`C3' Annealing, chain extension and cloning were performed according to the method of C1arke et al. (Nature restricts the small fragment 1- to Ala235Gly and Subcloned into PKK223-3 containing Ala236G1y mutant LDH and removed the smaller EcoRI/Xhol fragment (Wilk Biochemistry, 1990, 8587). The obtained plasmid ( pLDHrs) was transformed into convict E. coli TG2 cells. whole The sequence of The loop was re-determined and it was shown that the correct loop sequence had been introduced. wild type genetics Partial NA sequences with inserted restriction sites for offspring and mutants are shown in Table 2. Ta.

Ｂ、ステアロサーモフィラスＬＤＨ遺伝子のループ領域のランダムに組み合わせ たライブラリーを構築するためのＰＣＲ組み立て法：１、　アミノ酸１０１及び １０２位をコード化する位置においてのみ野生型配列と異なり、かかる部位にお いては各塩基Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｇのそれぞれが等しい確率で挿入されるよう一本鎖オ リゴヌクレオチドを製造した（オリゴミックス１０１．１０２フオワード）。B, Random combination of loop regions of stearothermophilus LDH gene PCR assembly method for constructing a library: 1, amino acids 101 and It differs from the wild-type sequence only at the position encoding position 102; In this case, each base A, T, C, and G is inserted with equal probability. Ligonucleotides were produced (Oligomix 101.102 forward).

２、　野生型鋳型に存在するＭｌｕｌ制限部位を１０８位アミノ酸第３コドン位 を、スレオニンをコードするコドンであることはそのままＡＣＧからＡＣＴへと 変えて破壊した。Ｍ　Ｉ　ｕ　１部位がないことによって、変異体が生成されて いることが確認でき、野生型より変異体を選択し得る。2. Move the Mlul restriction site present in the wild type template to the 108th amino acid 3rd codon position. The fact that it is a codon encoding threonine is changed from ACG to ACT. Changed and destroyed. The absence of the MIu1 site generates mutants. The mutants can be selected over the wild type.

３　オリゴミックス１０１．１０２フオワー・ドに対して１４塩基のホモロジー を有するＤＮＡプライマーをフレノウ反応を用いて相補鎖を作成する（オリゴミ ックス１０１．１０２リバース）のに用いた。3 Homology of 14 bases for oligomix 101.102 forward and do A complementary strand is created using a DNA primer with 101, 102 Reverse).

４、−重鎖ライブラリーオリゴをプライマー１および５ｎｇの野生型鋳型と共に 、３００塩基対の生成物を２５サイクルのＰＣＲ（９４℃で１分間、５５℃で１ 分間、７２℃で２分間）にて作成するために用いた。4. - Heavy chain library oligo with primer 1 and 5 ng of wild type template , a 300 base pair product was subjected to 25 cycles of PCR (1 min at 94°C, 1 min at 55°C). 72° C. for 2 minutes).

５、　二本鎖フレノウオリゴをプライマー２および５ｎｇの野生型鋳型と共に、 ８００塩基対の生成物であって３００塩基対の生成物と重複するものを作成する ために用いｆ：ｃＰｃＲ条件は４と同じである）。5. Double-stranded Frenow oligo with primer 2 and 5 ng of wild type template. Create an 800 base pair product that overlaps with a 300 base pair product The f:cPcR conditions used for this are the same as in 4).

５において二本鎖オリゴをプライマーとして用いることは、３００および８００ 塩基対の生成物の両方が変異オリゴを用いて作成され、プライムされており、１ ０１及び１０２位における野生型配列がコピーされていないようにするために非 常に重要である。The use of double-stranded oligos as primers in 300 and 800 Both base-paired products were created and primed using mutant oligos, and 1 To ensure that the wild-type sequences at positions 01 and 102 are not copied, Always important.

６　ゲルで精製した後、２０ｎｇの３００塩基対生成物および６０ｎｇの８００ 塩基対生成物をプライマーなしで混合し、フラグメントを結合させるために７回 熱サイクル（９４℃で２分、５５℃で１分、７２℃で４分）を回した。6 After gel purification, 20 ng of 300 base pair product and 60 ng of 800 base pair product Mix the base-paired products without primer and 7 times to join the fragments. A thermal cycle (2 minutes at 94°C, 1 minute at 55°C, 4 minutes at 72°C) was performed.

７　７回のサイクルの汝、プライマー１および２を添加し、生成物を２０サイク ル分増幅させた（９４℃て１．５分、５５°Ｃで１分、７２℃て２．５分）。7 For 7 cycles, add primers 1 and 2 and cycle the product for 20 cycles. The cells were amplified for 1 minute (94°C for 1.5 minutes, 55°C for 1 minute, and 72°C for 2.5 minutes).

８、　ｌｋｂのＰＣＲ生成物をその後ゲルにて精製し、ＥｃｏＲＩで消化して再 びゲル精製を行い、その後ＥｃｏＲＩで開裂させたＰＵＣ１８プラスミドベクタ ー内にライゲーノヨンさせ、これをイーコリ内部へ形質転換した。8. The lkb PCR product was then gel purified, digested with EcoRI, and re-produced. The PUC18 plasmid vector was subjected to gel purification and then cleaved with EcoRI. This was then transformed into E. coli.

９、　組換コロニーをＩＰＴＧおよびＸ−Ｃ；ａｌ挿入による不活性化により選 択した。9. Recombinant colonies were selected by inactivation by IPTG and X-C;al insertion. I chose.

１０、　９個の白色コロニーを選択し、そのうちの７個はＬＤＨ遺伝子の存在お よびＭ工旦工消化に対する抵抗性を示すことが、ゲルおよび制限酵素分析により 示された。他の２つは挿入部位を有していなかった。10. Selected 9 white colonies, 7 of which showed the presence of LDH gene. By gel and restriction enzyme analysis, it was shown that the Shown. The other two had no insertion site.

１１、かかる変異体の６つの配列をデュポン２０００配列決定機で決定し、ラン ダム変異処理が成功したことを確認した。11. Sequences of six such mutants were determined on a DuPont 2000 sequencer and ran It was confirmed that the dumb mutation treatment was successful.

表３参照のこと： の後Ｑ−セファロース・ファースト・フロラ・カラムヘロードし、塩グラジェン トにより溶出させた。ＬＤＨは０２５ＭのＮａＣｌ濃度により溶出された。二重 グリシン変異体酵素に対してブルー・セファロース−Ｆ３ＧＡに交換する以外は 、オキサメート・セファロースカラムによる最初のクロマトグラフィー操作と本 質的に同じとして行った。すべてのタンパク質は純度９８％以上であることをＳ ＤＳファスト（Ｐｈａｓｔ）ゲル（ファルマノア）上のクーマツシー・ブルー染 色強度を調べて確認した。タンパク質収量は通常原培養液の０．２　ｇ／　ｌで ある。See Table 3: Then load the Q-Sepharose Fast Flora column and salt gradient. It was eluted by LDH was eluted with a NaCl concentration of 0.25M. double Except for replacing Blue Sepharose-F3GA for the glycine mutant enzyme. , the first chromatographic operation with an oxamate sepharose column and book I assumed that they were qualitatively the same. All proteins are guaranteed to be 98% or higher in purity. Coomatsie blue staining on DS Phast gel (Pharmanoa) Confirmed by checking color intensity. The protein yield is usually 0.2 g/l of the original culture solution. be.

定常力イネティクス 定常測定を以下のごとく、３４０ｎｍの吸光度の減少によりＮＡＤＨ／ＮＡＤ” 転換を測定して行った。すべてのアッセイは２５℃にてＫＣＩ　（５０ｍＭ）を 含有するビス−トリスバッファーｐＨ６（２０ｍＭ）　、およびフルクトース− １゜６−ビスホスフェートを用いる場合には５ｍＭにて行った。タンパク質濃度 を２８０ｎｍの吸光度より、０．９１が経路１ｃｍおよびＭｒが３３０００の場 合に１ｍｇ／ｍｌのタンパク質に対応するという関係を用いて行った。steady force inetics The steady measurement is as follows: NADH/NAD" due to decrease in absorbance at 340 nm The conversion was measured. All assays were performed with KCI (50mM) at 25°C. Bis-Tris buffer pH 6 (20mM) containing, and fructose- When using 1°6-bisphosphate, it was used at 5mM. protein concentration From the absorbance at 280 nm, 0.91 is for a path of 1 cm and Mr of 33000. This was done using the relationship that 1 mg/ml of protein corresponds to 1 mg/ml of protein.

これらの測定の結果を表４に示す。The results of these measurements are shown in Table 4.

ＭＶＳ／ＧＧ　（６ユニット（μモル／分／３０℃）およびイーストギ酸デヒド ロゲナーゼ（５ユニツト）を、ＮＡＤＨ（０，０２ｍＭ）　、ギＭｔ　トＩＪｆ ｔ、（３゜１ｍＭ）、フルクトース−１，６−ビスホスフェート（０，４ｍＭ） およびジチオセレイトール（０，０８ｍＭ）を含有する４−メチル−２−オキソ −３−ペンテン酸（］、、ＯｍＭ）の脱酸素トリスバッフｙ−（５ｍＭ：　ｐＨ ６；　８０ｍ１）溶液へ添加した。溶液を室温（〜２０℃）にて窒素雰囲気下で ５日間撹拌し、０゜２ｍＭのＨＣＩをｐＨを６．　０から６．２の範囲に維持す るために定期的に添加した。ｐＨ２，０へと酸性化し、酢酸エチルにて抽出した ところ、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−４−メチル−３−ペンテン酸が９１％の収率 で単離できた。本（Ｒ）−ＭＴＰＡ誘導体を分析し、ラセミ標準物質と比較する と少なくとも９９％エナンチオマー過剰であることが認められた。MVS/GG (6 units (μmol/min/30°C) and yeast formic acid dehyde Logenase (5 units), NADH (0.02mM), GMT and IJf t, (3゜1mM), fructose-1,6-bisphosphate (0.4mM) and 4-methyl-2-oxo containing dithiocreitol (0,08mM). -3-Pentenoic acid (], , OmM) in deoxygenated Tris buffer y- (5mM: pH 6; Added to 80ml1) solution. The solution was incubated at room temperature (~20°C) under a nitrogen atmosphere. Stir for 5 days and add 0.2mM HCl to pH 6. Maintain within the range of 0 to 6.2 It was added periodically to Acidified to pH 2.0 and extracted with ethyl acetate. However, the yield of (S)-2-hydroxy-4-methyl-3-pentenoic acid was 91%. I was able to isolate it. Analyze this (R)-MTPA derivative and compare with racemic standards An enantiomeric excess of at least 99% was observed.

■ １＋＋＋＋＋ｓ＋＋＋１□、７＋ｌｌＩ＋　ＰＣＴ／ＧＢ　９３１００２０４フ ロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｐ　７／４２　８ １１４−４Ｂ ４１１００　Ｃ９４５２−４Ｂ ／／（Ｃ１２Ｎ　１５１０９ Ｃ１２Ｒ１：０７） （Ｃ１２Ｎ　９１０４　Ｆ Ｃ１２Ｒ１：１９） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。■ 1+++++s+++1□, 7+llI+ PCT/GB 93100204 Continuation of front page (51) Int, C1,6 identification symbol Internal office reference number C12P 7/42 8 114-4B 41100 C9452-4B //(C12N 15109 C12R1:07) (C12N 9104 F C12R1:19) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE.

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、ＧＡ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ 、ＴＤ。DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE) , GA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, SN , T.D.

ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＨ。TG), AT, AU, BB, BG, BR, CA, CH.

ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　Ｍ Ｇ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＵＳ ＦＩ Ｃ１２Ｒ１：０７） （７２）発明者　ハート、キース・ウィリアムイギリス、ビーニス７・０ピーニ ス、ブリストル、オーフィールド、ダーンシー・アベニュー３幡 （７２）発明者　エルハウラニ、アイマンイギリス、ビーニス８−１テイーデイ ー、ブリストル、ユニバージティー・オブ・ブリストル、デパートメント・オブ ・バイオケミストリー（番地の表示なし）DE, DK, ES, FI, GB, HU, JP, KP, KR, LK, LU, M G, MN, MW, NL, No, PL, RO, RU, SD, SE, US FI C12R1:07) (72) Inventor Hart, Keith William UK, Benis 7.0 Pini 3 Darnsey Avenue, Orfield, Bristol (72) Inventors Elhawlani, Ayman UK, Benis 8-1 T.D. -, Bristol, University of Bristol, Department of ・Biochemistry (no address displayed)

Claims (12)

【特許請求の範囲】[Claims] １．３次構造が既知である、あるいは演繹されている酸素を選択する；少なくと も１の特異性および／または効率に関与する領域を同定する；同定した領域に結 合して、これらをコードするＤＮＡ内へ単一の制限部位を同定または導入する該 同定した領域の、少なくとも１のコドンのヌクレオチドがランダマイズされてい る以外はその少なくとも一部に対応するＤＮＡ配列を作成するかまたは、これに 代えて該同定した領域の一部分と置換させるために、それ自身が同様にランダマ イズされていてもよい配列を選択する；作成したまたは置換ＤＮＡ配列を用いて オリジナルの配列を置換する；作成したまたは置換ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ を発現させる；そして所望の改変を、これをコードするＤＮＡを単離するために 選択することに特徴付けられる、酵素の触媒活性を保持しつつその特異性および ／または効率を改変する方法。1. Select an oxygen whose tertiary structure is known or deduced; at least Identify regions involved in the specificity and/or efficiency of Together, they identify or introduce a single restriction site into the DNA encoding them. The nucleotides of at least one codon in the identified region have been randomized. or create a DNA sequence corresponding to at least a part of it, or Alternatively, it can also be randomly generated to replace a portion of the identified region. Select sequences that may have been modified; using created or substituted DNA sequences. DNA that replaces the original sequence; contains a created or replaced DNA sequence to express the desired modification; and to isolate the DNA encoding the desired modification. Characterized by selection, while retaining the catalytic activity of the enzyme, its specificity and / or a method of modifying efficiency. ２．選択された酵素がデヒドロゲナーゼである第１項記載の方法。2. 2. The method of claim 1, wherein the selected enzyme is a dehydrogenase. ３．デヒドロゲナーゼがα−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼである第２項記載の 方法。3. Item 2, wherein the dehydrogenase is α-hydroxy acid dehydrogenase. Method. ４．酸素のループ領域を同定する第１項から３順いずれかに記載の方法。4. 3. The method according to any one of items 1 to 3 for identifying an oxygen loop region. ５．ＤＮＡのランダマイズをイノシントリホスフェートＰＣＲ法またはスパイク オリゴヌクレオチド法もしくはＰＣＲ機築法により行う第１項から４順いずれか に記載の方法。5. DNA randomization using inosine triphosphate PCR method or spiking Any one of the steps 1 to 4 performed using the oligonucleotide method or PCR mechanism method. The method described in. ６．選択された置換が同じ酵素の対応配列に基づいている第１項から５順いずれ かに記載の方法。6. Any of the 5th order from the 1st term in which the selected substitutions are based on the corresponding sequences of the same enzyme. Method described in Crab. ７．生成されたまたは置換ＤＮＡをプラスミドまたはファージベクター内へクロ ーン化し、これを細菌またはウイルス内へ発現のために形質転換する第１項から ６順いずれかに記載の方法。7. Clone the generated or replacement DNA into a plasmid or phage vector. from step 1, which involves converting the same into a bacterium or virus for expression. 6. The method described in any of the following methods. ８．酵素がＬ−乳酸デヒドロゲナーゼであり、１０１位と１０２位をランダマイ ズする第１項から７順いずれかに記載の方法。8. The enzyme is L-lactate dehydrogenase, and positions 101 and 102 are randomized. 7. The method described in any one of items 1 to 7, in which: ９．第１項から第８項いずれかに記載の方法により改変された酵素を用いること に特徴付けられるキラル生成物の製造法。9. Using an enzyme modified by the method described in any one of paragraphs 1 to 8. A method for producing chiral products characterized by: １０．コファクターのリサイクリング系を有する第９項記載の方法。10. 10. The method of claim 9, comprising a cofactor recycling system. １１．第１項から８項いずれかに記載の方法によりそのループ領域が改変されて いるＬ−乳酸デヒドロゲナーゼを用いることに特徴付けられる２−オキソ−４− フェニルプロパン酸を還元する方法。11. The loop region is modified by the method described in any one of paragraphs 1 to 8. 2-oxo-4- Method of reducing phenylpropanoic acid. １２．第１項から８項いずれかに記載の方法により得られるＭＶＳ／ＧＧを用い ることを含む、４−メチル−２−オキソ−３−ペンテン酸を還元する方法。12. Using MVS/GG obtained by the method described in any of paragraphs 1 to 8 A method for reducing 4-methyl-2-oxo-3-pentenoic acid.