JPH07503238A - コレラ予防用の無毒化ｌｐｓ−コレラ毒素結合ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コレラ予防用の無毒化ＬＰＳ−コレラ毒素結合ワクチン発明の分野 本明細書中で開示される発明は、概して、細菌感染からの回復のためのワクチン の製造に関する。更に詳しくは、本発明は、細菌対象菌株由来の無毒化されたリ ポ多糖を、細菌対象によって更に生産されたタンパク質に対して結合することに よる抗細菌性ワクチンの製造を記載する。

背景技術 ］レラは、３大陸の少な（とも４０か国において病因および死因として存続して おり；ペルーにおいて１９９１年１月に流行が始まって以来、西半球において約 ３４０，０００の症例が報告されてきた［１６．３３］。免疫感作による世界的 なコレラ予防は、利用可能なワクチンが制限されるために達成されなかった。

新しいワクチンの研究は、防御免疫応答を最もよく引出す成分に関する一致した 見解がないことから困難である。疾患を特徴付ける細菌侵入の不存在、全身性症 状および腸管炎症がないことは、コレラが空腸の管腔表面の毒素媒介疾患である という理解および、局所腸管応答が防御免疫に必要とされるという概念をもたら した［４．１０〜１２．２１．２２．２４．２６．３２．３６．４４］。

コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）のリポ多糖（ＬＰＳ）は防御抗原 であると考えられるが［３，１８，２２，３６，３８，４３，５１，６０］、コ レラに対する防御免疫に関与した構造、病原の役割および宿主成分は完全に理解 されていない。コレラ菌０１　ＬＰＳは、リピドＡと、４−アミノ−４−デオキ シ−し−アラビノース、キノボサミン、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトースおよ びヘプトースから成るコアオリゴ糖を含む［２３，３０，４７］。３−デオキシ −Ｄ−マンノーオクツロソン酸（ＫＤＯ）が最近同定されており、リピドＡに隣 接するコア中にあると考えられている［５］。イナバ（Ｉｎａｂａ）血清型コレ ラ菌ＯのＯ特異的多糖（０−３Ｐ）は、アミノ基が３−デオキシ−し−グリセロ −テトロン酸でアシル化されている１→２−結合Ｄ−ベルオサミンから成る約１ ２残基のサツカライドを含む［２３，３０，４７］。コレラ菌ＬＰＳを合成する 酵素をコードしている遺伝子の配列と、イナバおよびオガワ（Ｏｇａｗａ）血清 型（ＬＰＳ型）［２３，３６］の血清学的特異性との関係は明らかにされていな い。

非経口投与された細胞性ワクチンまたは部分精製ＬＰＳは、コレラに対する統計 的に有意の防御を成人（約６０％）において約６か月間誘導する［３．７．１８ ．２２．３８．４５］。細胞性ワクチンは、乳児および小児に対してあまり効果 的でないし、コレラ発生の抑制には無効である［３８．５１］。これらのワクチ ンによって引出された防御免疫成分は、殺ビブリオ活性を有する血清ＬＰＳ抗体 であると提案されている［１．３．１８．２２．３８．４０］。細胞性ワクチン は、血清抗毒素も［３７］、また同様の生成物との類推により、分泌抗体も［５ ６］もたらさない。同様の効果は、更に、経口投与された失活コレラ菌によって 得られる［７．１０〜１２］。このワクチン製剤に対してＣＴのＢサブユニット を加えても、更に別の防御が補充されることはない［１２］。

多数の研究者によって「マーカー」と考えられ、防御成分とは考えられないが、 殺ビブリオ性抗体濃度は、コレラ耐性を予測するのに信頼できる方法である。

血清殺ビブリオ活性は、主属毒化菌株の投与により、または単独で若しくはＣＴ のＢサブユニットと一緒の失活コレラ菌により、コレラから回復後の疾患に対す る抵抗性と相関する。更に、流行区域における年令に関係した殺ビブリオ性抗体 の獲得は、年長の子供および成人において観察された増加するコレラ抵抗性に対 応している［１．３．４．７．１０．１１．１８．２２．３８．５０］。これら のデータについての本発明者の解釈は、細胞性コレラワクチンが、同様の生成物 および多糖で観察されたように免疫原に乏しく且つＴ細胞依存性であるというこ とである［３７．４９］。

同様の理由に基き、カビア（Ｋａｂｉｒ）は、コレラ菌３９５（オガワ）のタン パク質抽出物に結合したイナバおよびオガワ血清型からのＮａＯＨ処理ＬＰＳか ら成る二価結合体を合成した［２７］。完全フロインドアジュバント中のこの結 合体１ｍｇは、２種類の血清型に対する殺ビブリオ活性を有するウサギの抗体を もたらした。ＣＦＡを用いる免疫感作経路および用いられる投与量は臨床的に許 容できない。

コラレ菌からのもう一つの成分の使用は、本発明者の結合体によってもたらされ た防御の性質を不明瞭にすることがあるが、ＣＴはインフルエンザ菌（Ｈ。

ｉｎｆ　１ｕｅｎｚａｅ）ｂ型およびＶｉ多糖双方の免疫原性担体として役立つ ので［４９，５４］、本発明者はそれを選択した。更に、感染性菌株のＣＴに特 異的な血清抗毒素は防御性でありうるしまたはＬＰＳ抗体による相乗作用の防御 活性を示すことがある［２８．４３．５２］。

結合体ワクチンは、細胞性ワクチンと比較して多数の利点を有する。すなわち、 （１）ＬＰＳ１１度が低いので重大な副作用は考えられない；　（２）結合した 糖は、細胞性ワクチンと比較して免疫原性が大きく且つＴ細胞依存性であると予 想することができ［９，１４，３１，４８］、したがって、結合体は一層安全性 で且つ一層免疫原性の（そしてそれによって一層有効な）ワクチンでありうるし ；（３）結合体は、乳児に対してジフテリアおよび破傷風トキソイド、百日咳（ ＤＴＰ）並びにインフルエンザｂ型詰合体と同時に投与することができ［４８］ 、したがって、結合体は、コレラの流行地域において発病率が最大の年令群であ る乳児および子供の日常的免疫感作に組込むことができると考えられ［３８］、 そして（４）本発明者の結合体の組成は、新ロットの効力を実験室検定によって 調節することができるように規格化することができる。

発明の概要 細胞性ワクチンにおけるＬＰＳの副作用、乳児および小児における少ない免疫原 性並びにＴ細胞依存性の問題を解決するために、本発明者は、ＣＴを含むいくつ かのタンパク質に対してコレラ菌イナバ血清型の無毒化ＬＰＳから成る結合体を 合成した。担体としてＣＴを用いるこれらのワクチンの合成法および免疫学的性 質を以下に記載する。

ＬＰＳ抗体を引出す結合体の製造は、（１）２種類の血清型のＬＰＳの完全な構 造が知られていないし、そして（２）イナバｏ−ｓｐの寸法が比較的小さい（約 ６，０００ダルトン分子量（ｄ））ので難しい。（単独のまたは結合体中のサツ カライドの免疫原性はそれらの寸法に直接関係する）［２，１７，５４］。菌株 ５６９Ｂ　（イナバ）からのＬＰＳを、１％酢酸によって１００℃で９０分間処 理することにより、臨床的に許容しつる量の内毒素を有するが超免疫血清によっ て沈降しない約５，９００ｄの生成物を生じる。ヒドラジンによる処理はＬＰＳ を許容しつる程度まで無毒化し、分子量が約１３，０００および６．０ＯＯｄの 生成物を生じ且つそれらの抗原性を維持する。したがって、ヒドラジン処理した ＬＰＳを用いて結合体を製造する。志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔ ｅｒｉａｅ）１型のｏ−ｓｐに関して実証されたように［９］、多点結合によっ て製造された結合体（ＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩ　Ｉ）は、単点結合によって製造 されたもの（ＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩ）よりも高濃度のＬＰＳ抗体を引出す。提 案されたヒト投与量の１０分の１において食塩水中で皮下注射された本発明者の 結合体は、若い異系交配マウスにおいて殺ビブリオ活性を有するＬＰＳ抗体を引 出した。この免疫感作スキームは、ＤＴＰを同時に注射された乳児におけるイン フルエンザ上型−破傷風トキソイド結合体の免疫原性を予想させた［４９］。Ｌ ＡＬおよびウサギ発熱物質検定によって測定される低レベルの「内毒素」活性は 、本発明者の結合体が、コレラの細胞性ワクチンで遭遇する副作用をほとんどま たは全（引起こさないという確信を与える［２５］。

本発明の最も一般的な説明は、対象細菌菌株由来のリボ多糖成分と同菌株由来の タンパク質との結合体を含む抗細菌性ワクチン製剤についてである。ワクチンは 、この結合体と、ワクチン製造の分野において知られている薬学的に許容しうる 担体、安定剤、アジュバント等のいずれかを用いて配合される。このような担体 は、注射可能なワクチン製造用の滅菌食塩水であってよい。結合体は、更に、小 児期免疫感作プロトコルでの使用において同時に、製剤、特に、米国の子供達に 一般的に投与されているジフテリアおよび破傷風トキソイド、百日咳（ＤＴＰ） ワクチン中に配合することができる。

結合体ワクチンの臨床的有用性に関する大きな利点は、ワクチンのＬＰＳ成分を 無毒化することによって得られる。このような無毒化は、ヒドラジンを用いてＬ ＰＳのリピドＡ成分からエステル化脂肪酸を除去することによってまたはＬＰＳ の酸加水分解によって達成することができる。したがって、本発明の一つの目的 は、このような無毒化ＬＰＳ成分を用いてＬＰＳ−タンパク質結合体ワクチンを 提供することである。

更に、細菌対象によって合成されたタンパク質に対する無毒化ＬＰＳの結合は、 特に、細菌表面上に局在したタンパク質を用いる場合に有用なワクチンを提供す るであろうと予想される。細菌によって分泌された毒素に対して中和抗体応答を 生じるワクチンも有用なワクチンであると考えられる。したがって、本発明の第 二の目的は、無毒化Ｌ　Ｐ　Ｓがこのような分泌毒素に対して結合しているワク チンを提供することである。

本発明の好ましい実施態様は、細菌対象によって生産された毒素タンパク質に対 する無毒化ＬＰＳの結合である。

結合反応は種々の試薬を用いて行なうことができる。結合は、ＬＰＳおよびタン パク質問で直接的でありうるしまたは架橋剤を用いて行なうことができる。この ような架橋剤は、二価のリンカ−でありうる。本発明において用いることができ る二価のリンカ−の例としては、制限されないが、アジピン酸ジヒドラジド、ジ アミノヘキサン、アミノ−ε−カプロン酸およびＮ−ヒドロスクシンイミド酸無 水物基剤へテロ三官能性リンカ−がある。

好ましい実施態様として、ヒドラジン処理によって無毒化されたＬＰＳに関して ２種類の結合方法、すなわち、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチ オ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）との反応または、アジピン酸ジヒドラジド（Ａ ＤＨ）との反応に続く１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピ）カルボジイ ミド（ＥＤＡＣ）との反応を記載する。後者の方法は、ＬＰＳ−タンパク質結合 体の共有結合凝集体（格子）の形成を引起こす。本発明の好ましい実施態様はこ れらの結合法の一方を用いる。

実験動物に対する結合体ワクチンの投与によって生じた多クローン性または単ク ローン性抗体は、対象生物による感染の診断用キットの成分としてまたは治療法 の成分として用いることができる。したがって、本発明のもう一つの目的は、結 合体のＬＰＳか若しくはタンパク質部分または双方を有する生物の検出１１　す る診断用キットを提供することである。本発明の最終目的は、結合体のＬＰＳか 若しくはタンパク質部分または双方を有する生物によって引起こされた感染を治 療するのに用いることができる、或いはこのような生物によって分泌された毒素 を中和する抗体を提供することである。

図面の簡単な説明 図１は、コレラ菌イナバ血清型（レーン１）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ　ｃｏｌｉ）Ｏｌｌｉ　（レーン２）からのＬＰＳの２．５ｍｇの銀染色５ ＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１４％）を示す。

図２は、二重免疫拡散法によるＬＰＳおよびＬＰＳ−ＣＴ結合体の特性表示を示 す。左、Ａ、超免疫コレラ菌イナバ血清型血清、外側ウエノＩ／：１−イナバＬ ＰＳ、２５０ｍ１ｍ１．２−イナバＤｅＡ−ＬＰＳ、２５０ｍ１ｍ１．３−イナ パｏ−ｓｐ、２５０ｍ１ｍ１゜右：Ａ、超免疫コレラ菌イナバ血清型血清、Ｂ、 超免疫コレラ毒素抗血清、３−イナバＤｅＡ−ＬＰＳ、２５０ｍ１ｍ１．４−結 合体ＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴ　Ｉ　Ｉ０ 図３は、コレラ菌イナバ血清型からのヒドラジン処理されたリポ多糖（ＤｅＡ− ＬＰＳ）の１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す。１０個の主要シグナルは、ケン ネ（Ｋｅｎｎｅ）らによって報告されたもの［３０］と同一である。酸処理され たリポ多糖（０−８Ｐ）の’　３Ｃ−Ｎ、　Ｍ、Ｒ，スペクトルは、このスペク トルとほぼ一致した。

図４は、０．２Ｍ　ＮａＣ１１０，０１Ｍトリス、Ｏ，ＯＯＩＭ　ＥＤＴＡ、０ ．２５％デオキシコール酸、ｐＨ８中のスペロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）１２の ｌＯｘ３００ｍｍカラムによる試料１００ｍＬ　（１，０ｍｇ／ｍｌ）の高速液 体クロマトグラフィープロフィールを示す。ａ、ＬＰＳイナバ血清型：ｂ、Ｄｅ Ａ−ＬＰＳイナバ：Ｃ，０−８Ｐイナバ。

発明の開示 本出願において引用した科学論文および他の参考文献は、本明細書中に参考とし て完全に包含される。

本発明の好ましい実施態様を、典型的な実施例によって以下に詳細に記載する。

これらの実施例は、本発明を単に例証するためのものであり、本発明の範囲を制 限するものととられるべきではない。

実施例において記載した手順を実施するための化学試薬は、以下に記載の製造元 から入手することができる。

無水ヒドラジン（ロット１０４Ｆ−３５２３）　、アジピン酸ジヒドラジド（Ａ ＤＨ、ロット７７Ｆ−５０１６）　、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、ロフト４９ Ｆ−０１３８）、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボンイミ ド（ＥＤＡＣ，ロット１０５Ｆ−０３０８）　、ＥＤＴＡ二ナトリウム（ロット １１９Ｆ−０２７５）　、ＫＤＯ，ＲＮアーゼ（ロット１２８Ｆ−０４６２）、 ＤＮアーゼ（ロフト８９Ｆ−９６０５）およびプロナーゼ（ロット９９Ｆ−０３ ９１）は、ジグ７−ケミカル・カンパ＝−（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏ、）、セント・ルイス、ＭＯから購入することができる。ＨＥＰＥＳ　（ロッ ト０５１７９０）およびデオキシコール酸（ロット２６４１０１）は、カルビオ ケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）　、ラホヤ、ＣＡから購入することができる。タ ンパク質決定用のＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ ネート（ＳＰＤＰ、ロット９００７０７０８４）　、ミョウバン（ロット８９１ １２０１０３）およびＢＣＡ試薬は、ピアス・ケミカル・カンパニー（Ｐ　ｉ　 ｅ　ｒ　ｃ　ｅＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、ロックフォード、ＩＬから入手す ることができる。臭化シアン（ＣＮＢｒ、ロット０１４７８３Ａ）は、イースト マン・ケミカル（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ｏチェスター、ＮＹか ら購入することができる。分子量検定用のセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ−２５（ロットＰ１００３６）、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃ　ｒｙ　Ｉ）Ｓ −３００、ｌＯｘ３００ｍｍスペロース１２カラムおよびデキストランは、ファ ーマンア（Ｐｈａ　ｒｍａｃ　ｉ　ａ）−ＬＫＢ、ピスカタウエイ、ＮＪから購 入することができる。コレラ菌菌株５６９Ｂ　（イナバ）からのＬＰＳは、リス ト・バイオロジカルズ（Ｌｉｓｔ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、カンブベル、Ｃ Ａから購入することができる。リムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）アメーバ様細胞溶解 産物（ＬＡＬ）は、アソンエーツ・オブ・ケープ・コツト（Ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｓ　ｏｆＣａｐｅ　Ｃｏｄ）　、ウッズ・ホール、ＭＡから購入することができ る。リン酸ｐ−ニトロフェニルは、フル力（Ｆｌｕｋａ）、ロンコンコマ、ＮＹ から入手することができる。内毒素の米国標準規格は、ドナルド・ホフスタイン （Ｄｏｎａｌｄ　Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ）、米国食品医薬品症から入手することが できる［２５］。コレラ毒素変種１、ロット５８２は、パスツール・メリュー・ セラムズ・アンド・ヴアクンンズ（Ｐａｓｔｅｕｒ　ＭｅｒｉｅｕｘＳｅｒｕｍ ｓ　＆　Ｖａｃｃｉｎｓ）、リヨン、フランスから入手することができ、そして コレラ毒素変種１、ロットｒｓｔは、コレラ菌イナバ菌株５６９Ｂから精製され る［２１．２８］。抗マウスＩｇＧおよびＩｇＭアルカリ性ホスファターゼ結合 体は、キルケガード・アンド・ぺり−・ラボラトリーズ・インコーホレーテッド （Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、 ）、ゲイサーズバーグ、ＭＤから購入することができる。

実施例において用いられた細菌菌株は、コレラ菌の古典的生物型、イナバ血清型 菌株５６９Ｂおよびコレラ菌、古典的生物型、オガヮ血清型菌株ＮｌＨ４１であ り、殺ビブリオ性検定に用いられる。コレラ菌古典的イナバ菌株２５２４　（キ ャサリン・グリーン（Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ　Ｇｒｅｅｎ）、Ｃ，Ｄ、Ｃ，、アト ランタ、ＧＡ）を、マウスにおいてＬＰＳに対する抗血清を生じさせるのに用い る。コレラ菌イナバ血清型、ＥＩ　Ｔｏｒ生物型、コレラ毒素（ＣＴ）変種２、 菌株０７５は、南米からの新しい単離物である（リチャード・ハーバーベルガー （Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｈａｂｅｒｂｅｒｇｅｒ）　、ナヴアル・リサーチ・メディ カル・インスティテユート（Ｎａｖａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＭｅｄｉｃａｌＩ ｎｓ　ｔ　ｉ　ｔｕｔｅ）　、ベセスダ、ＭＤ）。これらの菌株は全て、ショウ サン・スー博士（Ｄｒ、５ｈｏｕｓｕｎ　５ｚｕ）の実験室であるラボラトリ− ・オブ・ディベロプメンタル・アンド・モレキュラー・イムニティ、ナショナル ・インスティテユート・オブ・チャイルド・ヘルス・アンド・ヒユーマン・ディ ベロブメント、ナショナル・インスティテユーツ・オブ・ヘルス（Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉ ｍｍｕｎｉｔｙ、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃｈｉｌｄ　Ｈ ｅａｌｔｈ　ａｎｄ　ＨｕｍａｎＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　 Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆＨｅａｌｔｈ）、ベセスダ、ＭＤ２０８９２または 同宛名のジョンＢ、ロビンズ博士（Ｄｒ、Ｊｏｈｎ　Ｂ、Ｒｏｂｂｉｎｓ）の実 験室に連絡することによって入手することができる。同等の菌株は、アメリカン ・タイプ・カルチャー・コレク／ヨン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅＣａｌ　Ｉｅｃｔ　１ｏｎ）、ロックビル、ＭＤから入手することができ る。これらの菌株を、コレラ菌（イナバ）　、ＡＴＣＣ９４５９およびコレラ菌 （イナバ、ＥＩ　Ｔｏｒ生物型）ＡＴＣＣ１４０３３として目録に記載する。

実施例１・無毒化リボ多糖の製造および特性決定ＬＰＳを２種類の方法によって 無毒化する。酸加水分解に関しては、１％酢酸中１０ｍｇ／ｍｌのＬＰＳを１０ ０℃で９０分間加熱する［５９］。反応混合物を６０，０００ｘｇ、１０℃で５ 時間超遠心分離し、上澄みを滅菌０．２２ミクロンフィルター（ナルジ（Ｎａｌ ｇｅ）、ロチニスター、ＮＹ）に通過させ且つ凍結乾燥する（０−８Ｐと称する ）。塩基加水分解による無毒化に関しては、１０ｍｇ／ｍｌのＬＰＳをヒドラジ ンによって３７℃で２時間処理する。ヒドラジン処理は、エステル化脂肪酸をリ ピドＡから除去することが報告されており、したがって、この生成物をＤｅＡ− ＬＰＳと称する。この物質を、沈殿が生成するまで水浴中においてアセトンと混 合しく約９０％アセトン）、そして反応混合物を１５．０００ｘｇ、１０℃で３ ０分間遠心分離する。沈殿を０．１５Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ７，０中に約３ｍｇ／ ｍｌまで溶解させる。反応混合物を６０．　０００ｘｇにおいて１０℃で５時間 遠心分離し、上澄みを８２０に対して徹底的に透析し、０．２２ミクロンフィル ターに通過させ、そして凍結乾燥させる。０−８ＰおよびＤｅＡ−ＬＰＳのタン パク質および核酸濃度はく１％である。ＥＩ　Ｔｏｒ生物型オガワ血清型菌株３ ０８３−１３のアセトン乾燥コレラ菌細胞から抽出されたＬＰＳを、殺ビブリオ 活性の阻害用に用いる。

インビトロおよびインビボ技術双方を用いて、ＬＰＳの種々の予備的特性決定を 行なう。５ＤＳ−ＰＡＧＥをＬＰＳの検出に用いる［５６］。ＬＡＬによって検 定されたＬＰＳａ度は、米国標準規格に関する内毒素単位（ＥＵ）で表わされる ［２５］　。ＬＰＳ、０−３Ｐおよび脱アシル化ＬＰＳ　（ＤｅＡ−ＬＰＳ）の 分子寸法は、０．２Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス、０，２ ５％デオキシコール酸、ｐＨ８，０中のスペロース１２によるゲル濾過により、 カラムを検定するのにデキストラン標準を用いて推定される。ＫＤＯは、ＫＤＯ を標準として用いるチオバルビッール酸検定によって測定される［５］。二重免 疫拡散法は、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中１％アガロース中において行なわれる 。

ＮＭＲスペクトルのデータは、ＪＥＯＬ　Ｇ５Ｘ−５００スペクトロメーターで 記録される。それぞれのスペクトルは、９０°１０−ｍ５ｅｃ炭素観察パルス； フーリエ変換の前に６４，０００ポイントまでゼロ充填される３２，０００デー タポイント；３０ＫＨｚスペクトルウインドー（獲得時間０．５４秒）；パルス サイクル間の遅れ３．０秒での広幅１）（デカップリングによって得られる。フ ーリエ変換の前に、各自由誘導減衰シグナルは、周波数ドメインスペクトルにお いて追加の４Ｈｚ幅が広がるように指数的に増大する。各試料約１０ｍｇをＤ２ ０の０．５ｍＬ中に溶解させ且つ周囲プローブ温度（２１℃）で記録する。

イナバからのＬＰＳ２．５ｍｇの銀染色ＳＤＳ　ＰＡＧＥは、中央に「はしご状 」を有する２本の薄いバンドおよびゲルの底部付近の２本の濃いバンドを示す（ 図１）。高分子量ｏ−ｓｐの典型的な「はしご状」は、大腸菌０１１１からのＬ ＰＳによって形成される。ｏ−ｓｐかまたはＤｅＡ−ＬＰＳの試料１０ｍｇでは バンドが観察されなかった。ＬＡＬ検定により、イナパ血清型のＬＰＳは３〜６ ｘ１０３ＥＵ／ｍｇを有し且つＤｅＡ−ＬＰＳは３ＥＵ／ｍｇを有しており、こ の量は＞１ｏｏｏ倍の低下を示す。免疫拡散法は、ＬＰＳおよび超免疫ＬＰＳ血 清間に単一沈降バンドを示す（図２）。あまり濃くな（てより拡散するバンドは 、ＬＰＳとの部分的同一性反応を生じるＤｅＡ−ＬＰＳで観察される。０−８Ｐ もＣＴも、この超免疫血清によっては沈降しない。ＬＰＳｌｏ−８ＰおよびＤｅ Ａ−ＬＰＳの分子寸法は、スペロース１２での高速液体クロマトグラフィーによ って推定される（図３）。ＬＰＳおよびＤｅＡ−ＬＰＳは二つのピークを示す。

すなわち、ＬＰＳのＫｄ値は０．４０　（１６，０００ｄ）および０．　４６　 （８，７００ｄ）であり且っＤｅＡ−ＬＰＳのＫｄ値は０．３８　（１３，０Ｏ Ｏｄ）および０．５０　（６，０００ｄ）である。ｏ−ｓｐは、ＤｅＡ−ＬＰＳ の第二ピークに対応する１個のピーク（Ｋｄｏ、５１．５，９００ｄ）のみを示 した。一層顕著な抗原性および高分子量のために、ＤｅＡ−ＬＰＳを結合体のサ ツカライドとして用いるのが好ましい。本発明者は、チオバルビッール酸検定に よって０−８ＰかまたはＤｅＡ−ＬＰＳ中のＫＤＯを検出することができない［ ５，５７］ｏ　ＤｅＡ−ＬＰＳおよびｏ−ｓｐの１３ＣＮＭＲスペクトルは、従 来の報告［３０，４７］と一致する。それぞれのスペクトルは、報告されたこれ らのものと同一のまたはほぼ同一の化学シフトを有する１０個の主要シグナルを 示す（図３）。

実施例２：ＤｅＡ−ＬＰＳ−コレラ毒素結合体の製造および特性決定ＤｅＡ−Ｌ ＰＳとタンパク質との結合は、２種類の方法のどちらかを用いて行なわれる。方 法１において、タンパク質に対するＬＰＳの共有結合は、肺炎球菌の細胞壁多糖 に関して記載されたように［５２］　、５ＰＤＰを用いてタンパク質およびＤｅ Ａ−ＬＰＳ双方をチオール化することによって達成される。ＤｅＡ−ＬＰＳ　（ ３ｍｇ／ｍ＋）またはタンパク質（１，０ｍｇ／ｍｌ）を０．１５Ｍ　ＨＥＰＥ Ｓ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，５中に溶解させる。５ＰＤＰ（エタノール中２ ０ｍＭ）を、ＤｅＡ−ＬＰＳ０．５およびタンパク質０．２の重量比で滴加する 。反応混合物を周囲温度で１時間撹拌し、そしてＤｅＡ−ＬＰＳ−８ＰＤＰに関 してはＨ２Ｏ中でおよびタンパク質に関してはＰＨ３中で５Ｘ３５ｃｍセファデ ックスＧ−２５カラムを通過させる。ＤｅＡ−ＬＰＳ−５ＰＤＰを凍結乾燥し、 タンパク質を膜濾過（アミコン（Ａｍｉ　ｃｏｎ）　、ＹＭＩＯ）によって濃縮 する。ＤｅＡ−ＬＰＳまたはタンパク質のアリコート中の５ＰＤＰによる誘導の 程度は、４０ｍＭ　ＤＴＴによるＮ−ピリジルジスルフィド結合の還元の後３４ ０ｎｍでのモル吸光係数を８．０８ｘｌＯ’と仮定して分光光度計によって決定 される［５３］。ＤｅＡ−ＬＰＳ−８ＰＤＰ上のＮ−ピリジルジスルフィドを４ ０ｍＭ　ＤＴＴによって還元し、０．２Ｍ　ＮａＣｌ中のＧ−２５セフアデツク スの２．５ｘ５０ｃｍカラムを通過させ、そして空隙容量画分（ｖｏｉｄ　ｖｏ ｌｕｍｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）をタンパク質の５ＰＤＰ誘導体と混合する。

この反応混合物を室温で２時間撹拌し、０．２Ｍ　ＮａＣｌ中のＳ−３００セフ アリルの５ｘｌＯＯｃｍカラムを通過させ、そし空隙容量画分をプールする。コ レラ毒素をタンパク質成分として用いるこの方法によって合成された結合体をＤ ｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩと称する。食塩水中のＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩのアリコー トを、０．０５Ｍ　ＥＤＡＣによって室温においてｐＨ６，０で１時間処理して 結合体を架橋させる。未反応ＥＤＡＣを、水に対する徹底的な透析によって除去 する。

方法２においては、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈ　ｉ　ｌ　ｕｓｉｎｆ　 Ｉｕｅｎｚａｅ）ｂ型に関して記載されたように、ＤｅＡ−ＬＰＳをＡＤＨによ って誘導する［９．４８］。食塩水中のＤｅＡ−ＬＰＳ、１０ｍｇ／ｍｌをＩＮ 　ＮａＯＨでｐＨ１０，５にし、そして等量のＣＮＢｒ（アセトニトリル中１ｇ ／ｍｌ）を加エル。ｐＨをＩＮ　Ｎａ０Ｈｌ：よッテｌ　Ｏ，０〜１１．　Ｏｉ ｌ：３分間維持する。０．５Ｍ　ＮａＨＣＯｇ　中の０．５Ｍ　ＡＤＨを等容量 用え、そしてｐＨを８．５に調整する。反応混合物を室温で１時間、続いて３〜 ８℃で一晩中撹拌し、モしてＨ，Ｏ中で５Ｘ３５ｃｍセファデックスＧ−２５カ ラムに通過させる。空隙容量からの画分をプールし且つ凍結乾燥する。ＤｅＡ− ＬＰＳ−ＡＨ誘導体を０．１５Ｍ　ＮａＣ１中に１０ｍｇ／ｍ＋まで溶解させる 。等容量の９：／バク質（約１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、そしてｐＨをＯ，ＬＭ　 ＨＣＩで５．５１：ｉ整す６゜ＥＤＡＣをＩＩ終濃度０．０５Ｍまで加え、ｐＨ を５．５〜６０で１時間維持する。反応混合物を０．２Ｍ　ＮａＣｌ中のＳ−３ ００セフアクリルの２．５ｘ９０ｃｍカラムに通過させ、そして空隙容量中の画 分をプールする。ＣＴ（ロット５８２）およびＣＴ（ロットｒｓｔ）をタンパク 質成分としテ用いて合成すレタ結合体ヲ、ＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩ　ＩおよびＤ ｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩＩＩと称する。

実施例１の場合と同様に、結合体はい（っがのインビトロおよびインビボの方法 によって特徴付けられる。アジピン酸ヒドラジドによるＤｅＡ−ＬＰＳの誘導の 程度は、ＡＤＨを標準として用いるトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ） との反応によって測定される［９］。タンパク質は、ウシ血清アルブミンを標準 として用いるＢＣＡ試薬によって測定される［１７］。ヘキソースは、ｏ−８Ｐ を標準として用いるアントロン反応によって測定される［５５］。内毒素濃度は 実施例１の場合と同様に推定される。二重免疫拡散法も実施例１の場合と同様に 行なう。ＣＴのインビトロ細胞毒性は、ＣＨＯ細胞の伸長の観察によって測定さ れる［１５］。結合体の発熱性は、ウサギにおいてホフスタインらの方法［２５ ］を用いて検定される。

表１は、結合体の特性決定の結果を示す。

表１．コレラ菌のヒドラジン処理リポ多糖−タンパク質結合体の特性決定＊０． ０５Ｍ　ＥＤＡＣで更に処理された（マテリアルズ・アンド・メリーズ（ＭＡＴ ＥＲＩＡＬＳ　ＡＮＤ　ＭＥＴＨＯＤＳ）。

ＮＡ：不適切 標準としてＤｅＡ−ＬＰＳとのアントロン反応によって測定された多糖［］。収 率は、アジピン酸ヒドラジド誘導体の出発重量と比較された結合体中のサツカラ イドの重量に基いて計算された。

５ＰＤＰによるまたはＡＤＨによるＤｅＡ−ＬＰＳの誘導の程度は同様である。

ＤｅＡ−ＬＰＳ／タンパク質（重量／重量）比は、ＡＤＨによるよりも５ＰＤＰ によって製造されたＣＴの結合体の方が僅かに低く、ＤｅＡ−Ｌ、ＰＳ−ＣＴＩ の領　７２からＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩ　Ｉの１．５の範囲である。結合体全部 に関する収率は、誘導多糖と比較される結合体中のサツカライドの回収率によっ て計算したところ約８０％である。同様の結果は、破傷風トキソイドを結合体の タンパク質成分として用いる方法［１によって得られる。典型的な二重免疫拡散 実験は、イナバ血清型超免疫抗血清が、ＤｅＡ−ＬＰＳおよびＤｅＡ−ＬＰＳ− ＣＴｌｌに関して同一の沈降線を生じることを示す（図２）。同様に、ＣＴおよ びＬＰＳ抗血清は、ＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩ　ＩおよびＣＴに関して同一性の線 を生じる。ＣＴ抗血消による薄いスパーは、ＬＰＳ抗血清および結合体を越えて 広がり、この標品中に僅かな量の非結合ＣＴが存在することを示唆している。上 記のインビトロおよびインビボ検定によって推定される結合体中のＣＴおよびＤ ｅＡ−ＬＰＳの残留毒性は極めて低い。熱誘導試験において、ＤｅＡ−ＬＰＳは 、１ｍｇ／Ｋｇ（ウサギ体重）で注射された場合、発熱性ではなかった。結合体 の内毒素含量は、ＬＡＬ検定により約２ＥＵ／ｍｇであった。ＣＴは、ＣＨＯ細 胞において０．４ｎｇ／ｍｌで伸長をもたらした。同程度の伸長をもたらすのに 必要とされる結合した形でのＣＴの量は、１０３〜１０１°より大であった。臨 床的使用を目的とした標品であるＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩ　Ｉ　Ｔは、ＣＨＯ細 胞検定において１．０ｍｇ／ｍｌで毒性が検出されなかったし、しかも米国規制 法Ｃの規定に記載の１０種類のヒト投与量（ＤｅＡ−ＬＰ３２５ｍｇ／投与量） でモルモットにおける一般的な安全性試験に合格した。

実施例３：細胞性ワクチンおよびＬＰＳ−ＣＴ結合体ワクチンの効力の比較超免 疫ＬＰＳ抗血清を、雌の成体ＢＡＬＢ／ｃマウスに熱殺菌コレラ菌菌株２５２４ 　［４１］を注射することによって調製する。ロバＣＴ抗血清を記載されたよう に［１３］調製する。免疫原性を評価するために、６週令のＢＡＬＢ／ｃまたは 一般用マウス（ＮＩＨ）ｌニーＤｅＡ−ＬＰＳを２．５ｍｇまたは１０ｍｇ単独 でまたは結合体として食塩水中で皮下注射する。マウスに２週間間隔で注射し、 そしてそれぞれの免疫感作後７日月に採血する。４回目の投薬を３回目の注射後 ４週間目に行ない、マウスは７日後および６か列後に採血される。マウスの群を 、水酸化アルミニウム０．１２５ｍｇまたは１．２５ｍｇ／投与量に吸着した結 合体によって同様に免疫感作する。イナバおよびオガワ血清型をそれぞれ４ｘｌ Ｏ＠含む細胞性コレラワクチン（ワイエス・エアスト・ラボラトリーズ（Ｗｙｅ ｔｂ−Ａｙｅｒｓｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マリエツタ、ＰＡから購入 可能）を対照として用いる。マウスをワクチンＯ，１ｍｌまたは０．２ｍｌで免 疫感作する。

補体媒介殺ビブリオ性抗体は、イナバおよびオガワ菌株に対して測定される［１ ９．２０］。１０倍血清希釈を、モルモット血清で希釈された等容量の細胞約１ ０００個／ｍｌと混合し且つ３７℃で１時間インキュベートする。超免疫血清を 各検定において標準として用いる。血清力価は、５０％殺ビブリオ活性を生じた 血清の最高希釈度の逆数として表わされる。いくつかの血清を、イナバ血清型菌 株５６９Ｂおよび０７５に対する殺ビブリオ性抗体に関して検定し、これらの血 清の力価は両方の菌株に対して同一であった。したがって、血清の殺ビブリオ活 性を菌株５６９Ｂによって検定する。殺ビブリオ活性の阻害は、細菌を加える前 に、ＬＰＳＳＤｅＡ−ＬＰＳ、０−３ＰまたはＣＴ１００ｍｇ／ｍＩを種々の希 釈度の抗血清と３７℃で１時間混合することによって検定される［２０］。

ＬＰＳおよびタンパク質抗体濃度は、イムノロン（Ｉｍｍｕｎｏ　Ｉ　ｏｎ）４ プレート（ダイナチク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）、ンヤンティリー、ＶＡ）を用いる 酵素結合イムノソルベント検定法（エリザ）によって決定される。プレートを、 リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中のＬＰＳｌ、Ｏｍｇ／ｍｌかまたはＣＴ５ｍｇ／ｍ ｌの１００ｍ１／ウエルで被覆する。ＬＰＳ抗体濃度は、超免疫血清を対照とし て用いてエリザ単位で表わされる。ＣＴ抗体濃度は、当該技術分野において典型 的に知られている方法を用いて、ＣＴによるマウスの反復免疫感作によって調製 された超免疫マウスプール標準血清を用いてエリザ単位で表わされる。抗体濃度 は幾何平均として表わされる。エリザの感度未満の抗体濃度は、その濃度の２分 の１の値とする。幾何平均の比較は、両側を試験およびウィルコクソン（Ｗｉｌ ｃｏｘｏｎ）試験によって行なわれる。

いずれの注射後もＤｅＡ−ＬＰＳのみを２．５ｍｇまたは１０ｍｇ用いて免疫感 作された一般用かまたはＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＬＰＳ抗体は検出されな い。表２は、ＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩおよびＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩ　Ｉで免疫 感作された一般用マウスにおけるＬＰＳに対する抗体濃度を示す。

表２．単独でまたは結合体としてのＤｅＡ−ＬＰＳで免疫感作された一般用マウ スにおいて引出された血清１ｇＭおよびＩｇＧ　ＬＰＳ抗体（エリザ）ａ３約６ 週令の雌の一般用マウスに、抗原の食塩水溶液を３回目までは毎週皮下に再度採 血された。

ｈ対ｆＳｈ対ｄＳｐ＝ＮＳ、ｈ対ｇＳｐ＝０．００２、ｄ対ｃＳｐ＝ｏ、　０８ ；ｆ対ｅＳｐ＝０．０６、ｈ対ｉ、ＮＳ０どの結合体も、最初の免疫感作後には ＬＰＳ抗体を引出さない。ＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩＩは、２回目の注射後にＩｇ ＧおよびＩｇＭ抗体を引出す。両方の結合体は、３回目および４回目の注射後に ＩｇＧ抗体を有意に上昇させる（ｐ〈０．０１）。４回目の注射後のＩｇＧ濃度 は、ＬＰＳかまたはＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩＩを注射されたマウスにおいて同様 である。２．５ｍｇまたは１０．０ｍｇのＬＰＳ投与量は、３回目の注射後にの みＩｇＧ抗体を引出す。ＩｇＧ濃度は、ＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩ　Ｉの４回目の 注射後７日目または６か列目に採取された血清中において同様である。抗体の同 様の濃度は、結合体の投与量１０ｍｇによって、ＥＤＡＣ処理されたＤｅＡ−Ｌ ＰＳ−ＣＴＩによって、そしてミョウバン上に吸着した結合体によってもたらさ れる。

表３は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて結合体によってもたらされたＬＰＳ抗体濃 度が一般用マウスのそれよりも低いことを示す。

表３、ＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴ結合体または細胞性コレラワクチンで免疫感作され たＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて引出された血清１ｇＭおよびＩｇＧ　ＬＰＳ抗Ｌ ＰＳ抗体 ＊３３回目免疫感作後５か月目に採血されたマウス。

ｅ対ａ、Ｐ＝０．０００４、ｅ対す、Ｐ＝ＮＳ、ｅ対ｄ、Ｐ＝０．０００１、ｄ 対ｃ、　Ｐ＝０．０２゜ １回目および２回目の投薬後、結合体を注射されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて ＩｇＭ抗体は低いし且つＩｇＧ抗体は検出されない。３回目の注射後に低濃度が 検出される。抗体濃度は、最後の注射後５か月目に同様の状態のままである。

細胞性ワクチンは、２回目の注射後に高濃度のＩｇＧおよび１ｇＭ双方を誘導し 、そして３回目の注射後にＩｇＧ抗体濃度によるブースター効果を誘導する。投 薬量０．１ｍｌおよび０．２ｍｌは同様の濃度をもたらす。細胞性ワクチンを注 射されたマウスのＩｇＧ濃度は、最後の注射後５か月目にそれらの最適値の約１ ／２０まで下降しくｐ＝０．ｏｏｏｌ）　且っＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩ　Ｉにょ っｒもたらされた値と同様である。

ＤｅＡ−ＬＰＳまたはＰＢＳ　（対照）の２．５ｍｇも１０ｍｇも、コレラ菌イ ナバおよびオガヮ血清型に対する殺ビブリオ性抗体を引出さない。表４に示した ように、ＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩ　Ｉは、一般用マウスにおいて最初の注射後に 、イナバ菌株に対する低濃度の殺ビブリオ性抗体を引出す。

表４．結合体またはＬＰＳで免疫感作されたＮＩＨ一般用マウスからのプール血 清の殺ビブリオ性抗体力価 ＊ＮＤ−検査されない。

ＮＩＨの一般用マウスに、ＤｅＡ−ＬＰＳ２．５μｇを皮下注射し、それらの血 清を各群に関して等量ずつプールした。

ＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩおよびＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩ　Ｉは両方とも、次の二 回の注射後にブースタ一応答を引出す。ＬＰＳは最高濃度の殺ビブリオ性抗体を 引出す。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、両方の結合体は、最初の注射後に殺ビブ リオ性抗体を引出し；ＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩ　Ｉのみが２回目および３回目の 注射後にブースタ一応答を引出す（表５）。

表５．コレラ毒素（ＣＴ）に結合したＤｅＡ−ＬＰＳ単独でまたは全細胞コレラ ワクチンで免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスがらの血清の殺ビブリオ活性本発 明者の結合体の内で、最初の注射後にＩｇＧ抗体を引出すものはない。莢膜多糖 によるもの［４８］と比較されるＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴ結合体のこの明らかに小 さい免疫原性は二つの因子、すなわち、（１）コレラ菌０１のｏ−ｓｐのより小 さい免疫原性は、その単純さく４−アミノ−４，６−シデオキシーＩ、−グリ七 ローテトロン酸によってアシル化されたベルオサミンの線状ホモポリマー）によ る［３０．４７］　；　（２）コレラ菌０１の比較的低分子量の０−８Ｐ　［３ ６，４６］によると考えられる。

本発明者は、非侵入性微生物によって引起こされる疾患であり、その症状は内毒 素によって媒介され且つ炎症を伴わないものであるコレラを、血消殺ビブリオ性 抗体が予防する以下の機序を提案する。

第一に、血清抗体、特に、クラスＩｇＧ抗体は、腸の管腔中に侵入する［２８． ５９］。補体タンパク質も存在すると考えられる。第二に、腸管壁は螺動のため に接触し合う。第三に、胃の酸性条件で生き残る接種材料は、おそらく、約１０ ３のコレラ菌である［２２．３１コ。第四に、コレラ菌はそのＬＰＳ上に短い多 糖を有し；この特徴は、血清抗体の補体依存作用に対する高い感受性に関係して いる［４２コ。これらの因子、すなわち、互いの表面を圧迫し合い且つ感受性微 生物を撹拌している粘膜表面での低接種材料、血消殺ビブリオ性抗体および補体 は、血消殺ビブリオ性抗体がコレラをどのように防御するか、すなわち、摂取さ れたコレラ菌が腸管粘膜表面でどのように溶菌されるかを説明する。

結合体は、異種血清型（オガワ）に対するよりも同種血清型（イナバ）に対して 高い殺ビブリオ活性をもたらす。両方の血清型を有する細胞性ワクチンは、イナ バよりもオガワに対して高水準の殺ビブリオ性抗体を誘導する。イナバ血清型に 対する殺ビブリオ性レベルは、結合体と比較して、細胞性ワクチンによって初期 におよび高力価でもたらされる。３回目の注射後、全細胞および結合体ワクチン によってもたらされたイナバに対する殺ビブリオ性レベルは同様である。殺ビブ リオ活性はいずれも、イナバ血清型のＬＰＳか、ＤｅＡ−ＬＰＳかまたは０−８ Ｐで吸着した後は、結合体に誘導された抗体から除去される。イナバＬＰＳによ る吸着は、更に、細胞性ワクチンを注射されたマウスの血清から殺ビブリオ活性 を全て除去する。対照的に、ＤｅＡ−ＬＰＳおよびｏ−ｓｐは、これらの血清か ら殺ビブリオ活性の約９０％を除去する。オガワＬＰＳによる吸着は、イナバ菌 株に対する殺ビブリオ活性の約９０％を除去する。ＣＴによる吸着は、結合体か または細胞性ワクチンを注射されたマウスの血清からの殺ビブリオ性力価を変化 させない。ＤｅＡ−ＬＰＳ−ＣＴＩ、ＤｅＡ−ＬＰＳ”ＣＴＩ　ｌまたは他の結 合体のミョウバン上への吸着は、それらの免疫原性に影響しない。

表６は、結合体による免疫感作によって誘導されるコレラ毒素抗体を示す。ＣＴ 抗体の有意の上昇は、両方の菌株の全マウスにおいて各注射後の両方の結合体に よってもたらされる。

表６．ＤｅＡ−ＬＰＳ結合体で免疫感作されたマウスにおける血清ＩｇＧコレラ 毒素抗体慄何平均（２５〜７５センチル（ｃｅｎｔｉｌｅｓ））８全細胞コレラ ワクチン、ＤｅＡ−ＬＰＳまたはＰＢＳで免疫感作されたマウスのエリザ抗体濃 度は＜０．０１であった。

ｂ対ａＳＰ＝＜０．００１；ｄ対ｃ、　Ｐ＝領０００１；ｅ対ｄ、　Ｐ＝０．０ ４、ｈＳｇ対ｆ、　Ｐ＜０．０１　；ｂ対ｅＳＰ＝０．０１：　Ｌ　ｋ対ｉ、　 Ｐ＜０゜０１゜ 実施例４：診断および治療用途 本発明のＬＰＳ−タンパク質結合体は、ヒトまたは動物被験者に対して、該ＬＰ Ｓおよび／またはタンパク質抗原を含む微生物によって引起こされた感染を治療 するまたは予防する目的のワクチンの形で投与することができる。このようなワ クチンは、ＬＰＳ−タンパク質結合体を約５〜１００μｇ含むことができる。

これらのワクチンは、皮下にまたは筋肉内に投与することができる。結合体に対 して生じた抗体は、滅菌濾過されたまたは放射線滅菌された乳（ラン、ヒツジま たはヤギ）中に導入され且つ経口投与されることができる。結合体は、ミョウバ ン、食塩水、緩衝溶液または油−水エマルジヨン中に懸濁させることができ、そ して被験者には一連の注射１、好ましくは、１２か月間にわたる１〜５回の注射 によってワクチン注射することができる。

ヒトまたは動物起原の単クローン性または多クローン性抗体は、上記のワクチン の使用によって製造することができる。これらの抗体は、動物およびヒトに対し て、本発明のＬＰＳ−タンパク質結合体のＬＰＳおよびタンパク質成分が得られ る１種類または複数の微生物によって引起こされた感染の予防または治療のため に単独でまたは該結合体ワクチンとの組合せで投与することができる。これらの 抗体は、受動免疫の目的に関して単独でかまたは、補助療法として本発明のＬＰ Ｓ−タンパク質結合体ワクチンとの組合せで、それらを必要としている被験者に 対して投与することができる。このような抗体は、問題の抗体を含む血清または ガンマグロブリンの形で得ることができる。

特に興味深いのは、コレラ菌のＬＰＳおよびＣＴ抗原に対する抗体である。これ らの抗体は、関連細菌毒素抗原、特に、大腸菌、カンピロバクタ−・ジェジュニ （Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｅｔｅｒ　ｊｅｊｅｕｎｉ）およびアエロモナス・ヒド ロフイリア（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｈｉ　ｌ　ｉａ）によって分泌 された毒素に対する中和活性を実証する。

本発明の結合体ワクチンの使用によって製造された単クローン性または多クロー ン性抗体は、更に、診断目的に、或いはｔ、　ｐ　ｓ−タンパク質結合体などの 複合体分子の成分としてのＬＰＳ単独のまたはこの多糖フラグメント若しくはそ の誘導体を発現する微生物の開発法、病原、予防、免疫病理学の研究用に用いる ことができる。抗体は、更に、上記抗原に対する免疫学的応答を研究するのに用 いることができる。

このような抗体は、他の物質を誘導するかまたはそれと反応させて、疾患診断用 または、結合体中で用いられるＬＰＳ若しくはタンパク質を含む微生物の同定用 キットを製造することができる。

本発明をこのように記載しているが、同様のことを多数の方法で変更しうろこと は明らかである。このような変更は、本発明の精神および範囲からの逸脱とみな されるべきではなく、当業者に明らかであると考えられるこのような変更はいず れも、特許請求の範囲に記載の範囲内にふくまれることを意味する。

引用文献 〜４４１　（１９７０）。

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Ｉ４１．オルスコツ（Ｏｒｓｋｏｖ）Ｆ、および１．オルスコツ（Ｏｒｓｋｏｖ ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１１：１〜７７　（１ ９Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　８８：１６４１〜１６４５（１９９１）。

４３、ピーターラン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）Ｎ、Ｆ、ら、Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、２６　：　５２８〜５３３　（１９７９）。

４４、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）Ｎ、Ｆ、ら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５６： １４２〜１４８　（１９８８）。

４５、フィリピンズ・コレラ・コミティー（Ｐｈｉ　ｌ　１ｐｐｉｎｅｓＣｈｏ ｌｅｒａ　Ｃｏｍｍｊ　ｔｔｅｅ）、Ｂｕｌｌ、Ｗ、Ｈ，０，４９＋３８９〜３ ９４　（１９７３）。

４６、ランラブイン（Ｒａｚｉｕｄｄｉｎ）Ｓ、　、Ｔｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、１ ５：６１１〜６１４　（１９７８）。

４７、レドモンド（Ｒｅｄｍｏｒ＋ｄ）Ｊ、Ｗ、　、Ｂｉ　ｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、５８４：３４６〜３５２　（１９７９）。

４８　ロビンス（Ｒｏｂｂｉｎｓ）Ｊ、Ｂ、およびＲ，シュネールラン（Ｓｃｈ ｎｅｅｒｓｏｎ）、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１６１：８２１〜８３２　（１ ９９０）。

４９、サック（Ｓａｃｋ）Ｄ、Ａ、ら、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、１６４：４０７〜４ １１　（１９９１）。

５０、ソ７−（Ｓｏｍｍｅ　ｒ）Ａ、　およびＷ、　Ｈ，モスリー（Ｍｏ　ｓ　 ］　ｅ　ｙ）、Ｌａｎｃｅｔ　ｉ　：１２３２−１２３５　（１９７３）。

５１、スヴエナーホルムＡ、−Ｍ、およびＪ、ホルムグレン、Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、１３　：　７３５〜７４０　（１９７６）。

５２、スー（Ｓｚｕ）Ｓ、Ｃ，ら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５４：４４８〜 ４５５　（１９８６）。

５３．７．−３．Ｃ，ら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５７：３８２３〜３８２ ７　（１９８９）。

５４、トレヴエリアン（Ｔｒｅｖｅ　Ｉ　ｙａｎ）Ｗ、Ｅ、およびＪ、　Ｓ、　 ハリラン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ）　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、５０：２９８〜３０３ （１９５２）。

５５、ツァイ（Ｔｓａｉ）Ｃ−Ｍ、　、Ｊ、Ｂｊｏｌ、５ｔａｎｄ、１４　：２ ５〜３３　（１９８６）。

５６、ワルドマン（Ｗａ　Ｉ　ｄｍａ　ｎ）　Ｒ，Ｈ，ら、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓ、１２６：４０１〜４０７　（１９７２）。

５７、アンガー（Ｕｎｇｅｒ）Ｆ、Ｍ、　、Ａｄｖ、Ｃａｒｂ、ＣｈｅｍＢｉｏ ｃｈｅｍ、３８：３２３〜３５７　（１９８１）。

５９　ウエストファル（Ｗｅｓ　ｔｐｈａ　Ｉ）Ｏ，およびに、ジャン（Ｊ　ａ ｎｎＬＭｅｔｈ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、Ｃｈｅｍ、５：８３−９１　（１９６５ ）。

、′１．′″・ 保持容量（ｍｌ） 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 平成　６年　７月１８１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．無毒化され、そして哺乳動物において低発熱性を示す単離精製された細菌リ ポ多糖（ＬＰＳ）；および薬学的に許容しうる担体を含むワクチン。 ２．ＬＰＳがヒドラジンとの反応によって無毒化された請求項１に記載のワクチ ン。 ３．ＬＰＳが酸加水分解によって無毒化された請求項１に記載のワクチン。 ４．細菌菌株から単離されたかまたは細菌菌株によって分泌されたタンパク質に 対して二官能性リンカーによって共有結合した請求項１に記載のＬＰＳを含む結 合体化合物。 ５．前記タンパク質が細胞表面局在性タンパク質である請求項４に記載の結合体 。 ６．前記タンパク質が細菌性毒素である請求項４に記載の結合体。 ７．前記ＬＰＳおよび前記の細菌性毒素が同一微生物から得られる請求項６に記 載の結合体。 ８．前記微生物がコレラ菌である請求項６に記載の結合体。 ９．前記毒素がコレラ菌のコレラ毒素であり且つ前記の徴生物がコレラ菌である 請求項７に記載の結合体。 １０．前記共有結合が、アジピン酸ジヒドラジド、ジアミノヘキサン、アミノ− ε−カプロン酸およびＮ−ヒドロスクシンイミド酸無水物基剤ヘテロ二官能性リ ンカーから成る群より選択される二官能性リンカーとの反応によって達成される 請求項４に記載の結合体。 １１．前記Ｎ−ヒドロスクシンイミド酸無水物基剤ヘテロ二官能性リンカーがＮ −スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートである請求項 １０に記載の結合体。 １２．アジピン酸ジヒドラジド反応成分が、１−エチル−３（３−ジメチルアミ ノプロピル）カルボジイミドと更に反応している請求項１０に記載の結合体を含 むＬＰＳ−タンパク質結合体の共有凝集体。 １３．ＬＰＳ−タンパク質結合体の共有凝集体を製造する方法であって、（１） 結合体のＬＰＳ成分を無毒化し、（２）工程（１）の無毒化しＰＳ成分をアジピ ン酸ジヒドラジドと反応させ、（３）工程（２）から誘導された無毒化ＬＰＳを 結合体のタンパク質成分と混合し、 （４）工程（３）の混合物に対して１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピ ル）カルボジイミドを加え、そして （５）ＬＰＳ−タンパク質結合体の共有凝集体を集めることを含む上記方法。 １４．ＬＰＳを、工程（１）においてヒドラジンとの反応によって無毒化する請 求項１３に記載の方法。 １５．第二のワクチンを更に含む請求項１に記載のワクチン。 １６．前記第二ワクチンが、一般に利用可能なＤＴＰワクチンである請求項１５ に記載のワクチン。 １７．請求項４に記載の結合体および第二ワクチンを含むワクチン。 １８．前記第二ワクチンが、一般に利用可能なＤＴＰワクチンである請求項１７ に記載のワクチン。 １９．コレラに対して患者を免疫感作する方法であって、コレラに対する防御を 与えるのに十分な量の請求項１に記載のワクチンを患者に対して投与することを 含む上記方法。 ２０．コレラに対して患者を免疫感作する方法であって、コレラに対する防御を 与えるのに十分な量の請求項４に記載の結合体を患者に対して投与することを含 む上記方法。 ２１．コレラに対して患者を免疫感作する方法であって、コレラに対する防御を 与えるのに十分な量の請求項９に記載の結合体を患者に対して投与することを含 む上記方法。