JPH07503238A - コレラ予防用の無毒化lps−コレラ毒素結合ワクチン - Google Patents
コレラ予防用の無毒化lps−コレラ毒素結合ワクチンInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
コレラ予防用の無毒化LPS−コレラ毒素結合ワクチン発明の分野
本明細書中で開示される発明は、概して、細菌感染からの回復のためのワクチン
の製造に関する。更に詳しくは、本発明は、細菌対象菌株由来の無毒化されたリ
ポ多糖を、細菌対象によって更に生産されたタンパク質に対して結合することに
よる抗細菌性ワクチンの製造を記載する。
背景技術
]レラは、3大陸の少な(とも40か国において病因および死因として存続して
おり;ペルーにおいて1991年1月に流行が始まって以来、西半球において約
340,000の症例が報告されてきた[16.33]。免疫感作による世界的
なコレラ予防は、利用可能なワクチンが制限されるために達成されなかった。
新しいワクチンの研究は、防御免疫応答を最もよく引出す成分に関する一致した
見解がないことから困難である。疾患を特徴付ける細菌侵入の不存在、全身性症
状および腸管炎症がないことは、コレラが空腸の管腔表面の毒素媒介疾患である
という理解および、局所腸管応答が防御免疫に必要とされるという概念をもたら
した[4.10〜12.21.22.24.26.32.36.44]。
コレラ菌(Vibrio cholerae)のリポ多糖(LPS)は防御抗原
であると考えられるが[3,18,22,36,38,43,51,60]、コ
レラに対する防御免疫に関与した構造、病原の役割および宿主成分は完全に理解
されていない。コレラ菌01 LPSは、リピドAと、4−アミノ−4−デオキ
シ−し−アラビノース、キノボサミン、D−グルコース、D−フルクトースおよ
びヘプトースから成るコアオリゴ糖を含む[23,30,47]。3−デオキシ
−D−マンノーオクツロソン酸(KDO)が最近同定されており、リピドAに隣
接するコア中にあると考えられている[5]。イナバ(Inaba)血清型コレ
ラ菌OのO特異的多糖(0−3P)は、アミノ基が3−デオキシ−し−グリセロ
−テトロン酸でアシル化されている1→2−結合D−ベルオサミンから成る約1
2残基のサツカライドを含む[23,30,47]。コレラ菌LPSを合成する
酵素をコードしている遺伝子の配列と、イナバおよびオガワ(Ogawa)血清
型(LPS型)[23,36]の血清学的特異性との関係は明らかにされていな
い。
非経口投与された細胞性ワクチンまたは部分精製LPSは、コレラに対する統計
的に有意の防御を成人(約60%)において約6か月間誘導する[3.7.18
.22.38.45]。細胞性ワクチンは、乳児および小児に対してあまり効果
的でないし、コレラ発生の抑制には無効である[38.51]。これらのワクチ
ンによって引出された防御免疫成分は、殺ビブリオ活性を有する血清LPS抗体
であると提案されている[1.3.18.22.38.40]。細胞性ワクチン
は、血清抗毒素も[37]、また同様の生成物との類推により、分泌抗体も[5
6]もたらさない。同様の効果は、更に、経口投与された失活コレラ菌によって
得られる[7.10〜12]。このワクチン製剤に対してCTのBサブユニット
を加えても、更に別の防御が補充されることはない[12]。
多数の研究者によって「マーカー」と考えられ、防御成分とは考えられないが、
殺ビブリオ性抗体濃度は、コレラ耐性を予測するのに信頼できる方法である。
血清殺ビブリオ活性は、主属毒化菌株の投与により、または単独で若しくはCT
のBサブユニットと一緒の失活コレラ菌により、コレラから回復後の疾患に対す
る抵抗性と相関する。更に、流行区域における年令に関係した殺ビブリオ性抗体
の獲得は、年長の子供および成人において観察された増加するコレラ抵抗性に対
応している[1.3.4.7.10.11.18.22.38.50]。これら
のデータについての本発明者の解釈は、細胞性コレラワクチンが、同様の生成物
および多糖で観察されたように免疫原に乏しく且つT細胞依存性であるというこ
とである[37.49]。
同様の理由に基き、カビア(Kabir)は、コレラ菌395(オガワ)のタン
パク質抽出物に結合したイナバおよびオガワ血清型からのNaOH処理LPSか
ら成る二価結合体を合成した[27]。完全フロインドアジュバント中のこの結
合体1mgは、2種類の血清型に対する殺ビブリオ活性を有するウサギの抗体を
もたらした。CFAを用いる免疫感作経路および用いられる投与量は臨床的に許
容できない。
コラレ菌からのもう一つの成分の使用は、本発明者の結合体によってもたらされ
た防御の性質を不明瞭にすることがあるが、CTはインフルエンザ菌(H。
inf 1uenzae)b型およびVi多糖双方の免疫原性担体として役立つ
ので[49,54]、本発明者はそれを選択した。更に、感染性菌株のCTに特
異的な血清抗毒素は防御性でありうるしまたはLPS抗体による相乗作用の防御
活性を示すことがある[28.43.52]。
結合体ワクチンは、細胞性ワクチンと比較して多数の利点を有する。すなわち、
(1)LPS11度が低いので重大な副作用は考えられない; (2)結合した
糖は、細胞性ワクチンと比較して免疫原性が大きく且つT細胞依存性であると予
想することができ[9,14,31,48]、したがって、結合体は一層安全性
で且つ一層免疫原性の(そしてそれによって一層有効な)ワクチンでありうるし
;(3)結合体は、乳児に対してジフテリアおよび破傷風トキソイド、百日咳(
DTP)並びにインフルエンザb型詰合体と同時に投与することができ[48]
、したがって、結合体は、コレラの流行地域において発病率が最大の年令群であ
る乳児および子供の日常的免疫感作に組込むことができると考えられ[38]、
そして(4)本発明者の結合体の組成は、新ロットの効力を実験室検定によって
調節することができるように規格化することができる。
発明の概要
細胞性ワクチンにおけるLPSの副作用、乳児および小児における少ない免疫原
性並びにT細胞依存性の問題を解決するために、本発明者は、CTを含むいくつ
かのタンパク質に対してコレラ菌イナバ血清型の無毒化LPSから成る結合体を
合成した。担体としてCTを用いるこれらのワクチンの合成法および免疫学的性
質を以下に記載する。
LPS抗体を引出す結合体の製造は、(1)2種類の血清型のLPSの完全な構
造が知られていないし、そして(2)イナバo−spの寸法が比較的小さい(約
6,000ダルトン分子量(d))ので難しい。(単独のまたは結合体中のサツ
カライドの免疫原性はそれらの寸法に直接関係する)[2,17,54]。菌株
569B (イナバ)からのLPSを、1%酢酸によって100℃で90分間処
理することにより、臨床的に許容しつる量の内毒素を有するが超免疫血清によっ
て沈降しない約5,900dの生成物を生じる。ヒドラジンによる処理はLPS
を許容しつる程度まで無毒化し、分子量が約13,000および6.0OOdの
生成物を生じ且つそれらの抗原性を維持する。したがって、ヒドラジン処理した
LPSを用いて結合体を製造する。志賀赤痢菌(Shigelladysent
eriae)1型のo−spに関して実証されたように[9]、多点結合によっ
て製造された結合体(DeA−LPS−CTI I)は、単点結合によって製造
されたもの(DeA−LPS−CTI)よりも高濃度のLPS抗体を引出す。提
案されたヒト投与量の10分の1において食塩水中で皮下注射された本発明者の
結合体は、若い異系交配マウスにおいて殺ビブリオ活性を有するLPS抗体を引
出した。この免疫感作スキームは、DTPを同時に注射された乳児におけるイン
フルエンザ上型−破傷風トキソイド結合体の免疫原性を予想させた[49]。L
ALおよびウサギ発熱物質検定によって測定される低レベルの「内毒素」活性は
、本発明者の結合体が、コレラの細胞性ワクチンで遭遇する副作用をほとんどま
たは全(引起こさないという確信を与える[25]。
本発明の最も一般的な説明は、対象細菌菌株由来のリボ多糖成分と同菌株由来の
タンパク質との結合体を含む抗細菌性ワクチン製剤についてである。ワクチンは
、この結合体と、ワクチン製造の分野において知られている薬学的に許容しうる
担体、安定剤、アジュバント等のいずれかを用いて配合される。このような担体
は、注射可能なワクチン製造用の滅菌食塩水であってよい。結合体は、更に、小
児期免疫感作プロトコルでの使用において同時に、製剤、特に、米国の子供達に
一般的に投与されているジフテリアおよび破傷風トキソイド、百日咳(DTP)
ワクチン中に配合することができる。
結合体ワクチンの臨床的有用性に関する大きな利点は、ワクチンのLPS成分を
無毒化することによって得られる。このような無毒化は、ヒドラジンを用いてL
PSのリピドA成分からエステル化脂肪酸を除去することによってまたはLPS
の酸加水分解によって達成することができる。したがって、本発明の一つの目的
は、このような無毒化LPS成分を用いてLPS−タンパク質結合体ワクチンを
提供することである。
更に、細菌対象によって合成されたタンパク質に対する無毒化LPSの結合は、
特に、細菌表面上に局在したタンパク質を用いる場合に有用なワクチンを提供す
るであろうと予想される。細菌によって分泌された毒素に対して中和抗体応答を
生じるワクチンも有用なワクチンであると考えられる。したがって、本発明の第
二の目的は、無毒化L P Sがこのような分泌毒素に対して結合しているワク
チンを提供することである。
本発明の好ましい実施態様は、細菌対象によって生産された毒素タンパク質に対
する無毒化LPSの結合である。
結合反応は種々の試薬を用いて行なうことができる。結合は、LPSおよびタン
パク質問で直接的でありうるしまたは架橋剤を用いて行なうことができる。この
ような架橋剤は、二価のリンカ−でありうる。本発明において用いることができ
る二価のリンカ−の例としては、制限されないが、アジピン酸ジヒドラジド、ジ
アミノヘキサン、アミノ−ε−カプロン酸およびN−ヒドロスクシンイミド酸無
水物基剤へテロ三官能性リンカ−がある。
好ましい実施態様として、ヒドラジン処理によって無毒化されたLPSに関して
2種類の結合方法、すなわち、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチ
オ)プロピオネート(SPDP)との反応または、アジピン酸ジヒドラジド(A
DH)との反応に続く1−エチル−3(3−ジメチルアミノプロピ)カルボジイ
ミド(EDAC)との反応を記載する。後者の方法は、LPS−タンパク質結合
体の共有結合凝集体(格子)の形成を引起こす。本発明の好ましい実施態様はこ
れらの結合法の一方を用いる。
実験動物に対する結合体ワクチンの投与によって生じた多クローン性または単ク
ローン性抗体は、対象生物による感染の診断用キットの成分としてまたは治療法
の成分として用いることができる。したがって、本発明のもう一つの目的は、結
合体のLPSか若しくはタンパク質部分または双方を有する生物の検出11 す
る診断用キットを提供することである。本発明の最終目的は、結合体のLPSか
若しくはタンパク質部分または双方を有する生物によって引起こされた感染を治
療するのに用いることができる、或いはこのような生物によって分泌された毒素
を中和する抗体を提供することである。
図面の簡単な説明
図1は、コレラ菌イナバ血清型(レーン1)および大腸菌(Escherich
ia coli)Olli (レーン2)からのLPSの2.5mgの銀染色5
DS−PAGEゲル(14%)を示す。
図2は、二重免疫拡散法によるLPSおよびLPS−CT結合体の特性表示を示
す。左、A、超免疫コレラ菌イナバ血清型血清、外側ウエノI/:1−イナバL
PS、250m1m1.2−イナバDeA−LPS、250m1m1.3−イナ
パo−sp、250m1m1゜右:A、超免疫コレラ菌イナバ血清型血清、B、
超免疫コレラ毒素抗血清、3−イナバDeA−LPS、250m1m1.4−結
合体DeA−LPS−CT I I0
図3は、コレラ菌イナバ血清型からのヒドラジン処理されたリポ多糖(DeA−
LPS)の13C核磁気共鳴スペクトルを示す。10個の主要シグナルは、ケン
ネ(Kenne)らによって報告されたもの[30]と同一である。酸処理され
たリポ多糖(0−8P)の’ 3C−N、 M、R,スペクトルは、このスペク
トルとほぼ一致した。
図4は、0.2M NaC110,01Mトリス、O,OOIM EDTA、0
.25%デオキシコール酸、pH8中のスペロース(Superose)12の
lOx300mmカラムによる試料100mL (1,0mg/ml)の高速液
体クロマトグラフィープロフィールを示す。a、LPSイナバ血清型:b、De
A−LPSイナバ:C,0−8Pイナバ。
発明の開示
本出願において引用した科学論文および他の参考文献は、本明細書中に参考とし
て完全に包含される。
本発明の好ましい実施態様を、典型的な実施例によって以下に詳細に記載する。
これらの実施例は、本発明を単に例証するためのものであり、本発明の範囲を制
限するものととられるべきではない。
実施例において記載した手順を実施するための化学試薬は、以下に記載の製造元
から入手することができる。
無水ヒドラジン(ロット104F−3523) 、アジピン酸ジヒドラジド(A
DH、ロット77F−5016) 、ジチオトレイトール(DTT、ロフト49
F−0138)、1−エチル−3(3−ジメチルアミノプロピル)カルボンイミ
ド(EDAC,ロット105F−0308) 、EDTA二ナトリウム(ロット
119F−0275) 、KDO,RNアーゼ(ロット128F−0462)、
DNアーゼ(ロフト89F−9605)およびプロナーゼ(ロット99F−03
91)は、ジグ7−ケミカル・カンパ=−(Sigma Chemical C
o、)、セント・ルイス、MOから購入することができる。HEPES (ロッ
ト051790)およびデオキシコール酸(ロット264101)は、カルビオ
ケム(Calbiochem) 、ラホヤ、CAから購入することができる。タ
ンパク質決定用のN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオ
ネート(SPDP、ロット900707084) 、ミョウバン(ロット891
120103)およびBCA試薬は、ピアス・ケミカル・カンパニー(P i
e r c eChemical Co、)、ロックフォード、ILから入手す
ることができる。臭化シアン(CNBr、ロット014783A)は、イースト
マン・ケミカル(Eastman Chemical)、oチェスター、NYか
ら購入することができる。分子量検定用のセファデックス(Sephadex)
G−25(ロットP10036)、セファクリル(Sephac ry I)S
−300、lOx300mmスペロース12カラムおよびデキストランは、ファ
ーマンア(Pha rmac i a)−LKB、ピスカタウエイ、NJから購
入することができる。コレラ菌菌株569B (イナバ)からのLPSは、リス
ト・バイオロジカルズ(List Biologicals)、カンブベル、C
Aから購入することができる。リムルス(Limulus)アメーバ様細胞溶解
産物(LAL)は、アソンエーツ・オブ・ケープ・コツト(Associate
s ofCape Cod) 、ウッズ・ホール、MAから購入することができ
る。リン酸p−ニトロフェニルは、フル力(Fluka)、ロンコンコマ、NY
から入手することができる。内毒素の米国標準規格は、ドナルド・ホフスタイン
(Donald Hochstein)、米国食品医薬品症から入手することが
できる[25]。コレラ毒素変種1、ロット582は、パスツール・メリュー・
セラムズ・アンド・ヴアクンンズ(Pasteur MerieuxSerum
s & Vaccins)、リヨン、フランスから入手することができ、そして
コレラ毒素変種1、ロットrstは、コレラ菌イナバ菌株569Bから精製され
る[21.28]。抗マウスIgGおよびIgMアルカリ性ホスファターゼ結合
体は、キルケガード・アンド・ぺり−・ラボラトリーズ・インコーホレーテッド
(Kirkegaard & PerryLaboratories、Inc、
)、ゲイサーズバーグ、MDから購入することができる。
実施例において用いられた細菌菌株は、コレラ菌の古典的生物型、イナバ血清型
菌株569Bおよびコレラ菌、古典的生物型、オガヮ血清型菌株NlH41であ
り、殺ビブリオ性検定に用いられる。コレラ菌古典的イナバ菌株2524 (キ
ャサリン・グリーン(Katherine Green)、C,D、C,、アト
ランタ、GA)を、マウスにおいてLPSに対する抗血清を生じさせるのに用い
る。コレラ菌イナバ血清型、EI Tor生物型、コレラ毒素(CT)変種2、
菌株075は、南米からの新しい単離物である(リチャード・ハーバーベルガー
(Richard Haberberger) 、ナヴアル・リサーチ・メディ
カル・インスティテユート(Naval Re5earch MedicalI
ns t i tute) 、ベセスダ、MD)。これらの菌株は全て、ショウ
サン・スー博士(Dr、5housun 5zu)の実験室であるラボラトリ−
・オブ・ディベロプメンタル・アンド・モレキュラー・イムニティ、ナショナル
・インスティテユート・オブ・チャイルド・ヘルス・アンド・ヒユーマン・ディ
ベロブメント、ナショナル・インスティテユーツ・オブ・ヘルス(Labora
tory of Developmental andMolecular I
mmunity、NationalInstitute of Child H
ealth and HumanDevelopment、National
In5titutes ofHealth)、ベセスダ、MD20892または
同宛名のジョンB、ロビンズ博士(Dr、John B、Robbins)の実
験室に連絡することによって入手することができる。同等の菌株は、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレク/ヨン(American Type Cu1t
ureCal Iect 1on)、ロックビル、MDから入手することができ
る。これらの菌株を、コレラ菌(イナバ) 、ATCC9459およびコレラ菌
(イナバ、EI Tor生物型)ATCC14033として目録に記載する。
実施例1・無毒化リボ多糖の製造および特性決定LPSを2種類の方法によって
無毒化する。酸加水分解に関しては、1%酢酸中10mg/mlのLPSを10
0℃で90分間加熱する[59]。反応混合物を60,000xg、10℃で5
時間超遠心分離し、上澄みを滅菌0.22ミクロンフィルター(ナルジ(Nal
ge)、ロチニスター、NY)に通過させ且つ凍結乾燥する(0−8Pと称する
)。塩基加水分解による無毒化に関しては、10mg/mlのLPSをヒドラジ
ンによって37℃で2時間処理する。ヒドラジン処理は、エステル化脂肪酸をリ
ピドAから除去することが報告されており、したがって、この生成物をDeA−
LPSと称する。この物質を、沈殿が生成するまで水浴中においてアセトンと混
合しく約90%アセトン)、そして反応混合物を15.000xg、10℃で3
0分間遠心分離する。沈殿を0.15M NaC1、pH7,0中に約3mg/
mlまで溶解させる。反応混合物を60. 000xgにおいて10℃で5時間
遠心分離し、上澄みを820に対して徹底的に透析し、0.22ミクロンフィル
ターに通過させ、そして凍結乾燥させる。0−8PおよびDeA−LPSのタン
パク質および核酸濃度はく1%である。EI Tor生物型オガワ血清型菌株3
083−13のアセトン乾燥コレラ菌細胞から抽出されたLPSを、殺ビブリオ
活性の阻害用に用いる。
インビトロおよびインビボ技術双方を用いて、LPSの種々の予備的特性決定を
行なう。5DS−PAGEをLPSの検出に用いる[56]。LALによって検
定されたLPSa度は、米国標準規格に関する内毒素単位(EU)で表わされる
[25] 。LPS、0−3Pおよび脱アシル化LPS (DeA−LPS)の
分子寸法は、0.2M NaC1,1mM EDTA、10mMトリス、0,2
5%デオキシコール酸、pH8,0中のスペロース12によるゲル濾過により、
カラムを検定するのにデキストラン標準を用いて推定される。KDOは、KDO
を標準として用いるチオバルビッール酸検定によって測定される[5]。二重免
疫拡散法は、リン酸緩衝溶液(PBS)中1%アガロース中において行なわれる
。
NMRスペクトルのデータは、JEOL G5X−500スペクトロメーターで
記録される。それぞれのスペクトルは、90°10−m5ec炭素観察パルス;
フーリエ変換の前に64,000ポイントまでゼロ充填される32,000デー
タポイント;30KHzスペクトルウインドー(獲得時間0.54秒);パルス
サイクル間の遅れ3.0秒での広幅1)(デカップリングによって得られる。フ
ーリエ変換の前に、各自由誘導減衰シグナルは、周波数ドメインスペクトルにお
いて追加の4Hz幅が広がるように指数的に増大する。各試料約10mgをD2
0の0.5mL中に溶解させ且つ周囲プローブ温度(21℃)で記録する。
イナバからのLPS2.5mgの銀染色SDS PAGEは、中央に「はしご状
」を有する2本の薄いバンドおよびゲルの底部付近の2本の濃いバンドを示す(
図1)。高分子量o−spの典型的な「はしご状」は、大腸菌0111からのL
PSによって形成される。o−spかまたはDeA−LPSの試料10mgでは
バンドが観察されなかった。LAL検定により、イナパ血清型のLPSは3〜6
x103EU/mgを有し且つDeA−LPSは3EU/mgを有しており、こ
の量は>1ooo倍の低下を示す。免疫拡散法は、LPSおよび超免疫LPS血
清間に単一沈降バンドを示す(図2)。あまり濃くな(てより拡散するバンドは
、LPSとの部分的同一性反応を生じるDeA−LPSで観察される。0−8P
もCTも、この超免疫血清によっては沈降しない。LPSlo−8PおよびDe
A−LPSの分子寸法は、スペロース12での高速液体クロマトグラフィーによ
って推定される(図3)。LPSおよびDeA−LPSは二つのピークを示す。
すなわち、LPSのKd値は0.40 (16,000d)および0. 46
(8,700d)であり且っDeA−LPSのKd値は0.38 (13,0O
Od)および0.50 (6,000d)である。o−spは、DeA−LPS
の第二ピークに対応する1個のピーク(Kdo、51.5,900d)のみを示
した。一層顕著な抗原性および高分子量のために、DeA−LPSを結合体のサ
ツカライドとして用いるのが好ましい。本発明者は、チオバルビッール酸検定に
よって0−8PかまたはDeA−LPS中のKDOを検出することができない[
5,57]o DeA−LPSおよびo−spの13CNMRスペクトルは、従
来の報告[30,47]と一致する。それぞれのスペクトルは、報告されたこれ
らのものと同一のまたはほぼ同一の化学シフトを有する10個の主要シグナルを
示す(図3)。
実施例2:DeA−LPS−コレラ毒素結合体の製造および特性決定DeA−L
PSとタンパク質との結合は、2種類の方法のどちらかを用いて行なわれる。方
法1において、タンパク質に対するLPSの共有結合は、肺炎球菌の細胞壁多糖
に関して記載されたように[52] 、5PDPを用いてタンパク質およびDe
A−LPS双方をチオール化することによって達成される。DeA−LPS (
3mg/m+)またはタンパク質(1,0mg/ml)を0.15M HEPE
S、2mM EDTA、pH7,5中に溶解させる。5PDP(エタノール中2
0mM)を、DeA−LPS0.5およびタンパク質0.2の重量比で滴加する
。反応混合物を周囲温度で1時間撹拌し、そしてDeA−LPS−8PDPに関
してはH2O中でおよびタンパク質に関してはPH3中で5X35cmセファデ
ックスG−25カラムを通過させる。DeA−LPS−5PDPを凍結乾燥し、
タンパク質を膜濾過(アミコン(Ami con) 、YMIO)によって濃縮
する。DeA−LPSまたはタンパク質のアリコート中の5PDPによる誘導の
程度は、40mM DTTによるN−ピリジルジスルフィド結合の還元の後34
0nmでのモル吸光係数を8.08xlO’と仮定して分光光度計によって決定
される[53]。DeA−LPS−8PDP上のN−ピリジルジスルフィドを4
0mM DTTによって還元し、0.2M NaCl中のG−25セフアデツク
スの2.5x50cmカラムを通過させ、そして空隙容量画分(void vo
lume fractions)をタンパク質の5PDP誘導体と混合する。
この反応混合物を室温で2時間撹拌し、0.2M NaCl中のS−300セフ
アリルの5xlOOcmカラムを通過させ、そし空隙容量画分をプールする。コ
レラ毒素をタンパク質成分として用いるこの方法によって合成された結合体をD
eA−LPS−CTIと称する。食塩水中のDeA−LPS−CTIのアリコー
トを、0.05M EDACによって室温においてpH6,0で1時間処理して
結合体を架橋させる。未反応EDACを、水に対する徹底的な透析によって除去
する。
方法2においては、インフルエンザ菌(Haemoph i l usinf
Iuenzae)b型に関して記載されたように、DeA−LPSをADHによ
って誘導する[9.48]。食塩水中のDeA−LPS、10mg/mlをIN
NaOHでpH10,5にし、そして等量のCNBr(アセトニトリル中1g
/ml)を加エル。pHをIN Na0Hl:よッテl O,0〜11. Oi
l:3分間維持する。0.5M NaHCOg 中の0.5M ADHを等容量
用え、そしてpHを8.5に調整する。反応混合物を室温で1時間、続いて3〜
8℃で一晩中撹拌し、モしてH,O中で5X35cmセファデックスG−25カ
ラムに通過させる。空隙容量からの画分をプールし且つ凍結乾燥する。DeA−
LPS−AH誘導体を0.15M NaC1中に10mg/m+まで溶解させる
。等容量の9:/バク質(約10mg/ml)を加え、そしてpHをO,LM
HCIで5.51:i整す6゜EDACをII終濃度0.05Mまで加え、pH
を5.5〜60で1時間維持する。反応混合物を0.2M NaCl中のS−3
00セフアクリルの2.5x90cmカラムに通過させ、そして空隙容量中の画
分をプールする。CT(ロット582)およびCT(ロットrst)をタンパク
質成分としテ用いて合成すレタ結合体ヲ、DeA−LPS−CTI IおよびD
eA−LPS−CTIIIと称する。
実施例1の場合と同様に、結合体はい(っがのインビトロおよびインビボの方法
によって特徴付けられる。アジピン酸ヒドラジドによるDeA−LPSの誘導の
程度は、ADHを標準として用いるトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)
との反応によって測定される[9]。タンパク質は、ウシ血清アルブミンを標準
として用いるBCA試薬によって測定される[17]。ヘキソースは、o−8P
を標準として用いるアントロン反応によって測定される[55]。内毒素濃度は
実施例1の場合と同様に推定される。二重免疫拡散法も実施例1の場合と同様に
行なう。CTのインビトロ細胞毒性は、CHO細胞の伸長の観察によって測定さ
れる[15]。結合体の発熱性は、ウサギにおいてホフスタインらの方法[25
]を用いて検定される。
表1は、結合体の特性決定の結果を示す。
表1.コレラ菌のヒドラジン処理リポ多糖−タンパク質結合体の特性決定*0.
05M EDACで更に処理された(マテリアルズ・アンド・メリーズ(MAT
ERIALS AND METHODS)。
NA:不適切
標準としてDeA−LPSとのアントロン反応によって測定された多糖[]。収
率は、アジピン酸ヒドラジド誘導体の出発重量と比較された結合体中のサツカラ
イドの重量に基いて計算された。
5PDPによるまたはADHによるDeA−LPSの誘導の程度は同様である。
DeA−LPS/タンパク質(重量/重量)比は、ADHによるよりも5PDP
によって製造されたCTの結合体の方が僅かに低く、DeA−L、PS−CTI
の領 72からDeA−LPS−CTI Iの1.5の範囲である。結合体全部
に関する収率は、誘導多糖と比較される結合体中のサツカライドの回収率によっ
て計算したところ約80%である。同様の結果は、破傷風トキソイドを結合体の
タンパク質成分として用いる方法[1によって得られる。典型的な二重免疫拡散
実験は、イナバ血清型超免疫抗血清が、DeA−LPSおよびDeA−LPS−
CTllに関して同一の沈降線を生じることを示す(図2)。同様に、CTおよ
びLPS抗血清は、DeA−LPS−CTI IおよびCTに関して同一性の線
を生じる。CT抗血消による薄いスパーは、LPS抗血清および結合体を越えて
広がり、この標品中に僅かな量の非結合CTが存在することを示唆している。上
記のインビトロおよびインビボ検定によって推定される結合体中のCTおよびD
eA−LPSの残留毒性は極めて低い。熱誘導試験において、DeA−LPSは
、1mg/Kg(ウサギ体重)で注射された場合、発熱性ではなかった。結合体
の内毒素含量は、LAL検定により約2EU/mgであった。CTは、CHO細
胞において0.4ng/mlで伸長をもたらした。同程度の伸長をもたらすのに
必要とされる結合した形でのCTの量は、103〜101°より大であった。臨
床的使用を目的とした標品であるDeA−LPS−CTI I Tは、CHO細
胞検定において1.0mg/mlで毒性が検出されなかったし、しかも米国規制
法Cの規定に記載の10種類のヒト投与量(DeA−LP325mg/投与量)
でモルモットにおける一般的な安全性試験に合格した。
実施例3:細胞性ワクチンおよびLPS−CT結合体ワクチンの効力の比較超免
疫LPS抗血清を、雌の成体BALB/cマウスに熱殺菌コレラ菌菌株2524
[41]を注射することによって調製する。ロバCT抗血清を記載されたよう
に[13]調製する。免疫原性を評価するために、6週令のBALB/cまたは
一般用マウス(NIH)lニーDeA−LPSを2.5mgまたは10mg単独
でまたは結合体として食塩水中で皮下注射する。マウスに2週間間隔で注射し、
そしてそれぞれの免疫感作後7日月に採血する。4回目の投薬を3回目の注射後
4週間目に行ない、マウスは7日後および6か列後に採血される。マウスの群を
、水酸化アルミニウム0.125mgまたは1.25mg/投与量に吸着した結
合体によって同様に免疫感作する。イナバおよびオガワ血清型をそれぞれ4xl
O@含む細胞性コレラワクチン(ワイエス・エアスト・ラボラトリーズ(Wye
tb−Ayerst Laboratories)、マリエツタ、PAから購入
可能)を対照として用いる。マウスをワクチンO,1mlまたは0.2mlで免
疫感作する。
補体媒介殺ビブリオ性抗体は、イナバおよびオガワ菌株に対して測定される[1
9.20]。10倍血清希釈を、モルモット血清で希釈された等容量の細胞約1
000個/mlと混合し且つ37℃で1時間インキュベートする。超免疫血清を
各検定において標準として用いる。血清力価は、50%殺ビブリオ活性を生じた
血清の最高希釈度の逆数として表わされる。いくつかの血清を、イナバ血清型菌
株569Bおよび075に対する殺ビブリオ性抗体に関して検定し、これらの血
清の力価は両方の菌株に対して同一であった。したがって、血清の殺ビブリオ活
性を菌株569Bによって検定する。殺ビブリオ活性の阻害は、細菌を加える前
に、LPSSDeA−LPS、0−3PまたはCT100mg/mIを種々の希
釈度の抗血清と37℃で1時間混合することによって検定される[20]。
LPSおよびタンパク質抗体濃度は、イムノロン(Immuno I on)4
プレート(ダイナチク(Dynatech)、ンヤンティリー、VA)を用いる
酵素結合イムノソルベント検定法(エリザ)によって決定される。プレートを、
リン酸緩衝溶液(PBS)中のLPSl、Omg/mlかまたはCT5mg/m
lの100m1/ウエルで被覆する。LPS抗体濃度は、超免疫血清を対照とし
て用いてエリザ単位で表わされる。CT抗体濃度は、当該技術分野において典型
的に知られている方法を用いて、CTによるマウスの反復免疫感作によって調製
された超免疫マウスプール標準血清を用いてエリザ単位で表わされる。抗体濃度
は幾何平均として表わされる。エリザの感度未満の抗体濃度は、その濃度の2分
の1の値とする。幾何平均の比較は、両側を試験およびウィルコクソン(Wil
coxon)試験によって行なわれる。
いずれの注射後もDeA−LPSのみを2.5mgまたは10mg用いて免疫感
作された一般用かまたはBALB/cマウスにおいて、LPS抗体は検出されな
い。表2は、DeA−LPS−CTIおよびDeA−LPS−CTI Iで免疫
感作された一般用マウスにおけるLPSに対する抗体濃度を示す。
表2.単独でまたは結合体としてのDeA−LPSで免疫感作された一般用マウ
スにおいて引出された血清1gMおよびIgG LPS抗体(エリザ)a3約6
週令の雌の一般用マウスに、抗原の食塩水溶液を3回目までは毎週皮下に再度採
血された。
h対fSh対dSp=NS、h対gSp=0.002、d対cSp=o、 08
;f対eSp=0.06、h対i、NS0どの結合体も、最初の免疫感作後には
LPS抗体を引出さない。DeA−LPS−CTIIは、2回目の注射後にIg
GおよびIgM抗体を引出す。両方の結合体は、3回目および4回目の注射後に
IgG抗体を有意に上昇させる(p〈0.01)。4回目の注射後のIgG濃度
は、LPSかまたはDeA−LPS−CTIIを注射されたマウスにおいて同様
である。2.5mgまたは10.0mgのLPS投与量は、3回目の注射後にの
みIgG抗体を引出す。IgG濃度は、DeA−LPS−CTI Iの4回目の
注射後7日目または6か列目に採取された血清中において同様である。抗体の同
様の濃度は、結合体の投与量10mgによって、EDAC処理されたDeA−L
PS−CTIによって、そしてミョウバン上に吸着した結合体によってもたらさ
れる。
表3は、BALB/cマウスにおいて結合体によってもたらされたLPS抗体濃
度が一般用マウスのそれよりも低いことを示す。
表3、DeA−LPS−CT結合体または細胞性コレラワクチンで免疫感作され
たBALB/cマウスにおいて引出された血清1gMおよびIgG LPS抗L
PS抗体
*33回目免疫感作後5か月目に採血されたマウス。
e対a、P=0.0004、e対す、P=NS、e対d、P=0.0001、d
対c、 P=0.02゜
1回目および2回目の投薬後、結合体を注射されたBALB/cマウスにおいて
IgM抗体は低いし且つIgG抗体は検出されない。3回目の注射後に低濃度が
検出される。抗体濃度は、最後の注射後5か月目に同様の状態のままである。
細胞性ワクチンは、2回目の注射後に高濃度のIgGおよび1gM双方を誘導し
、そして3回目の注射後にIgG抗体濃度によるブースター効果を誘導する。投
薬量0.1mlおよび0.2mlは同様の濃度をもたらす。細胞性ワクチンを注
射されたマウスのIgG濃度は、最後の注射後5か月目にそれらの最適値の約1
/20まで下降しくp=0.oool) 且っDeA−LPS−CTI Iにょ
っrもたらされた値と同様である。
DeA−LPSまたはPBS (対照)の2.5mgも10mgも、コレラ菌イ
ナバおよびオガヮ血清型に対する殺ビブリオ性抗体を引出さない。表4に示した
ように、DeA−LPS−CTI Iは、一般用マウスにおいて最初の注射後に
、イナバ菌株に対する低濃度の殺ビブリオ性抗体を引出す。
表4.結合体またはLPSで免疫感作されたNIH一般用マウスからのプール血
清の殺ビブリオ性抗体力価
*ND−検査されない。
NIHの一般用マウスに、DeA−LPS2.5μgを皮下注射し、それらの血
清を各群に関して等量ずつプールした。
DeA−LPS−CTIおよびDeA−LPS−CTI Iは両方とも、次の二
回の注射後にブースタ一応答を引出す。LPSは最高濃度の殺ビブリオ性抗体を
引出す。BALB/cマウスにおいて、両方の結合体は、最初の注射後に殺ビブ
リオ性抗体を引出し;DeA−LPS−CTI Iのみが2回目および3回目の
注射後にブースタ一応答を引出す(表5)。
表5.コレラ毒素(CT)に結合したDeA−LPS単独でまたは全細胞コレラ
ワクチンで免疫感作されたBALB/cマウスがらの血清の殺ビブリオ活性本発
明者の結合体の内で、最初の注射後にIgG抗体を引出すものはない。莢膜多糖
によるもの[48]と比較されるDeA−LPS−CT結合体のこの明らかに小
さい免疫原性は二つの因子、すなわち、(1)コレラ菌01のo−spのより小
さい免疫原性は、その単純さく4−アミノ−4,6−シデオキシーI、−グリ七
ローテトロン酸によってアシル化されたベルオサミンの線状ホモポリマー)によ
る[30.47] ; (2)コレラ菌01の比較的低分子量の0−8P [3
6,46]によると考えられる。
本発明者は、非侵入性微生物によって引起こされる疾患であり、その症状は内毒
素によって媒介され且つ炎症を伴わないものであるコレラを、血消殺ビブリオ性
抗体が予防する以下の機序を提案する。
第一に、血清抗体、特に、クラスIgG抗体は、腸の管腔中に侵入する[28.
59]。補体タンパク質も存在すると考えられる。第二に、腸管壁は螺動のため
に接触し合う。第三に、胃の酸性条件で生き残る接種材料は、おそらく、約10
3のコレラ菌である[22.31コ。第四に、コレラ菌はそのLPS上に短い多
糖を有し;この特徴は、血清抗体の補体依存作用に対する高い感受性に関係して
いる[42コ。これらの因子、すなわち、互いの表面を圧迫し合い且つ感受性微
生物を撹拌している粘膜表面での低接種材料、血消殺ビブリオ性抗体および補体
は、血消殺ビブリオ性抗体がコレラをどのように防御するか、すなわち、摂取さ
れたコレラ菌が腸管粘膜表面でどのように溶菌されるかを説明する。
結合体は、異種血清型(オガワ)に対するよりも同種血清型(イナバ)に対して
高い殺ビブリオ活性をもたらす。両方の血清型を有する細胞性ワクチンは、イナ
バよりもオガワに対して高水準の殺ビブリオ性抗体を誘導する。イナバ血清型に
対する殺ビブリオ性レベルは、結合体と比較して、細胞性ワクチンによって初期
におよび高力価でもたらされる。3回目の注射後、全細胞および結合体ワクチン
によってもたらされたイナバに対する殺ビブリオ性レベルは同様である。殺ビブ
リオ活性はいずれも、イナバ血清型のLPSか、DeA−LPSかまたは0−8
Pで吸着した後は、結合体に誘導された抗体から除去される。イナバLPSによ
る吸着は、更に、細胞性ワクチンを注射されたマウスの血清から殺ビブリオ活性
を全て除去する。対照的に、DeA−LPSおよびo−spは、これらの血清か
ら殺ビブリオ活性の約90%を除去する。オガワLPSによる吸着は、イナバ菌
株に対する殺ビブリオ活性の約90%を除去する。CTによる吸着は、結合体か
または細胞性ワクチンを注射されたマウスの血清からの殺ビブリオ性力価を変化
させない。DeA−LPS−CTI、DeA−LPS”CTI lまたは他の結
合体のミョウバン上への吸着は、それらの免疫原性に影響しない。
表6は、結合体による免疫感作によって誘導されるコレラ毒素抗体を示す。CT
抗体の有意の上昇は、両方の菌株の全マウスにおいて各注射後の両方の結合体に
よってもたらされる。
表6.DeA−LPS結合体で免疫感作されたマウスにおける血清IgGコレラ
毒素抗体慄何平均(25〜75センチル(centiles))8全細胞コレラ
ワクチン、DeA−LPSまたはPBSで免疫感作されたマウスのエリザ抗体濃
度は<0.01であった。
b対aSP=<0.001;d対c、 P=領0001;e対d、 P=0.0
4、hSg対f、 P<0.01 ;b対eSP=0.01: L k対i、
P<0゜01゜
実施例4:診断および治療用途
本発明のLPS−タンパク質結合体は、ヒトまたは動物被験者に対して、該LP
Sおよび/またはタンパク質抗原を含む微生物によって引起こされた感染を治療
するまたは予防する目的のワクチンの形で投与することができる。このようなワ
クチンは、LPS−タンパク質結合体を約5〜100μg含むことができる。
これらのワクチンは、皮下にまたは筋肉内に投与することができる。結合体に対
して生じた抗体は、滅菌濾過されたまたは放射線滅菌された乳(ラン、ヒツジま
たはヤギ)中に導入され且つ経口投与されることができる。結合体は、ミョウバ
ン、食塩水、緩衝溶液または油−水エマルジヨン中に懸濁させることができ、そ
して被験者には一連の注射1、好ましくは、12か月間にわたる1〜5回の注射
によってワクチン注射することができる。
ヒトまたは動物起原の単クローン性または多クローン性抗体は、上記のワクチン
の使用によって製造することができる。これらの抗体は、動物およびヒトに対し
て、本発明のLPS−タンパク質結合体のLPSおよびタンパク質成分が得られ
る1種類または複数の微生物によって引起こされた感染の予防または治療のため
に単独でまたは該結合体ワクチンとの組合せで投与することができる。これらの
抗体は、受動免疫の目的に関して単独でかまたは、補助療法として本発明のLP
S−タンパク質結合体ワクチンとの組合せで、それらを必要としている被験者に
対して投与することができる。このような抗体は、問題の抗体を含む血清または
ガンマグロブリンの形で得ることができる。
特に興味深いのは、コレラ菌のLPSおよびCT抗原に対する抗体である。これ
らの抗体は、関連細菌毒素抗原、特に、大腸菌、カンピロバクタ−・ジェジュニ
(Campylobaceter jejeuni)およびアエロモナス・ヒド
ロフイリア(Aeromonas hydrophi l ia)によって分泌
された毒素に対する中和活性を実証する。
本発明の結合体ワクチンの使用によって製造された単クローン性または多クロー
ン性抗体は、更に、診断目的に、或いはt、 p s−タンパク質結合体などの
複合体分子の成分としてのLPS単独のまたはこの多糖フラグメント若しくはそ
の誘導体を発現する微生物の開発法、病原、予防、免疫病理学の研究用に用いる
ことができる。抗体は、更に、上記抗原に対する免疫学的応答を研究するのに用
いることができる。
このような抗体は、他の物質を誘導するかまたはそれと反応させて、疾患診断用
または、結合体中で用いられるLPS若しくはタンパク質を含む微生物の同定用
キットを製造することができる。
本発明をこのように記載しているが、同様のことを多数の方法で変更しうろこと
は明らかである。このような変更は、本発明の精神および範囲からの逸脱とみな
されるべきではなく、当業者に明らかであると考えられるこのような変更はいず
れも、特許請求の範囲に記載の範囲内にふくまれることを意味する。
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平成 6年 7月181
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.無毒化され、そして哺乳動物において低発熱性を示す単離精製された細菌リ ポ多糖(LPS);および薬学的に許容しうる担体を含むワクチン。 2.LPSがヒドラジンとの反応によって無毒化された請求項1に記載のワクチ ン。 3.LPSが酸加水分解によって無毒化された請求項1に記載のワクチン。 4.細菌菌株から単離されたかまたは細菌菌株によって分泌されたタンパク質に 対して二官能性リンカーによって共有結合した請求項1に記載のLPSを含む結 合体化合物。 5.前記タンパク質が細胞表面局在性タンパク質である請求項4に記載の結合体 。 6.前記タンパク質が細菌性毒素である請求項4に記載の結合体。 7.前記LPSおよび前記の細菌性毒素が同一微生物から得られる請求項6に記 載の結合体。 8.前記微生物がコレラ菌である請求項6に記載の結合体。 9.前記毒素がコレラ菌のコレラ毒素であり且つ前記の徴生物がコレラ菌である 請求項7に記載の結合体。 10.前記共有結合が、アジピン酸ジヒドラジド、ジアミノヘキサン、アミノ− ε−カプロン酸およびN−ヒドロスクシンイミド酸無水物基剤ヘテロ二官能性リ ンカーから成る群より選択される二官能性リンカーとの反応によって達成される 請求項4に記載の結合体。 11.前記N−ヒドロスクシンイミド酸無水物基剤ヘテロ二官能性リンカーがN −スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネートである請求項 10に記載の結合体。 12.アジピン酸ジヒドラジド反応成分が、1−エチル−3(3−ジメチルアミ ノプロピル)カルボジイミドと更に反応している請求項10に記載の結合体を含 むLPS−タンパク質結合体の共有凝集体。 13.LPS−タンパク質結合体の共有凝集体を製造する方法であって、(1) 結合体のLPS成分を無毒化し、(2)工程(1)の無毒化しPS成分をアジピ ン酸ジヒドラジドと反応させ、(3)工程(2)から誘導された無毒化LPSを 結合体のタンパク質成分と混合し、 (4)工程(3)の混合物に対して1−エチル−3(3−ジメチルアミノプロピ ル)カルボジイミドを加え、そして (5)LPS−タンパク質結合体の共有凝集体を集めることを含む上記方法。 14.LPSを、工程(1)においてヒドラジンとの反応によって無毒化する請 求項13に記載の方法。 15.第二のワクチンを更に含む請求項1に記載のワクチン。 16.前記第二ワクチンが、一般に利用可能なDTPワクチンである請求項15 に記載のワクチン。 17.請求項4に記載の結合体および第二ワクチンを含むワクチン。 18.前記第二ワクチンが、一般に利用可能なDTPワクチンである請求項17 に記載のワクチン。 19.コレラに対して患者を免疫感作する方法であって、コレラに対する防御を 与えるのに十分な量の請求項1に記載のワクチンを患者に対して投与することを 含む上記方法。 20.コレラに対して患者を免疫感作する方法であって、コレラに対する防御を 与えるのに十分な量の請求項4に記載の結合体を患者に対して投与することを含 む上記方法。 21.コレラに対して患者を免疫感作する方法であって、コレラに対する防御を 与えるのに十分な量の請求項9に記載の結合体を患者に対して投与することを含 む上記方法。
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