JPH07502901A - ヒトインターロイキン−４に対するヒト化モノクローナル抗体のクローニング及び発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトインターロイキン−４に　る しト化Ｆツクローナル抗゛のクローニング及び魚曳又哩ユ五景 ヒトイノターロイキン−４（ＩＬ−４）は、最初、ヨコタ（ＹｏｋｏＬａ）ら［ Ｐｒｏｃ。

Ｎａ１１．Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８３：５８０４　（１９Ｒ６）ＩＩによって クローン化され、特徴が明らかにされた。ｌ　Ｌ−４は、免疫系の多くの異なる 成分に影響を及ぼす高度に多面作用性のリノフォカイノである。それは、Ｔ細胞 成長因子（ＴＣＧＦ）活性、及びＢ細胞成Ｉ因１−活性をす１“場る。それは、 インターロイキン−２（ＩＬ−２）のＴＣＧＦ活性及び！自拉珪−マクロファー ジコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ９Ｆ）のコロニー形成活性を増強する、−とがで きる。それは、ＩｇＧ＋及びＩｇＥの優先的産生を誘導り、ＩｇＥの低親和性レ セプター（ＣＤ２３）を誘導し、そしてヒト白血球クラスＩＩＤＲ抗原の発現を 誘導する。

これら活性は、ｌ　＋、−４の幾つかの治療的用途の可能ＰＩ０．、例えば、抗 腫瘍剤「テバー（Ｔｒｐｐｅｒ）ら、　ＣＰＩ＋　５７：５０３　（１９８９） ］　、ＩＩＬ、　−２抗癌治療の増強剤として、ＧＭ−ＣＳＦ刺激骨髄再生の増 強剤として、又は露出リン＜球症候群（ｈａｒｅｌｙｍｐｈ’ｏＣＹＬｃ　ｓｙ ｎｄｒｏｍｅ）を治療するための物質〔ト・シレーヌ　（Ｔｏｕｒａｉｎｅ）。

１、ｇｙ：ｃｔ、ｐｇｓ、　Ｔｈ１Ｑ−１２１（Ｆｐｂｒｕａｒｙ　７．　１４ １８り　；　ｌ今し−ヌら、　）Ｉｕｍａｎ　Ｉｍｔｕｒ＋盾撃潤mＶ ？ロア　（１９８１）　：　伎びサリバン（Ｓｕ　ｌ　Ｉ　１ｖａｎ）　ら、　 Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　７６：７５（１！］８５））と（−での用途 を示唆している。かくして、ＩＬ−４及びＩＬ−４アゴニストは、潜在的に有用 な治療剤である。

＋　Ｌ−４のＩｇＥ及びＣＤ２３誘導活性は、アレルギー牲疾！ｉ！を兜つでｔ ）る人にとって重要性を有しているかも知れない。ＩＬｉＬｉアンタボ−トが利 用できれば、特に長期使用で多くの有害な副作用を有するグルココルチコイドス テロイドを用いる代わりになるかも知れないしゴソドマノ（Ｇｏｏｄｓａｎ）及 びギルマンＣＧ１１ｌ簡ａｎ）、Ｔｈｅ　Ｉ’ｈａｒ２ａｒｏｌｎｇｉｃａｌ　 Ｂａ！、ｉｓ　ｏｒ　ＴｈｅｒａｐｃｎＬｉｃｓ、６ｔｂ　Ｐｄ。

（’！ａｃＭｉｌｌａｎ　ｒ’ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　ＣｏＩＩｐａｎｙ、　Ｎｅ ｗ　Ｙｎｒｋ、　ｌ！Ｅ（１’ｊ　。

ヒトＩ　Ｌ−４に特異的な強い遮断性のモノクローナル抗体は、抗イデイオタイ プ抗体を生成させることによるζ米国特許第４．７３１．２３７号）か又はミモ トーブ（ｓｉｍｎＬｏｐｃ＞　７．クリーニングによる〔ゲイセン（Ｇｅｙｓｐ ｎ）　ら、　Ｊ、　ｌ＋ｎｕｎｎｌ。

Ｍｅｓｈ、　１０２：２５９　（＋９８７）　；　ＰＣＴ特許出願ＷＯ３６１０ ０９９１及びＷＯ３６１０６４８７）アゴニスト又はアンタゴニストの構築手段 を提供する。殆どのモノクローナル抗体はげ一つ歯頚細胞起源のものであるので 、人の治療に用いる場合、持に長ＪＦＡ間用いる場合は、それらは免疫原性であ る可能性がある１、この可能性を回避するには、ヒトＩＬ〜４に対するヒト抗体 又は“ヒト化°抗体を有するのが望ましい。

げっ索類抗体の免疫原性を低下さＩ±２１−うとする初期の’Ｐｆ　ｊＪは、マ ウス可変領域をヒト不変領域と融合させたキメラ抗体の産生を包へした〔リウ（ Ｌｉｕ）ら。

Ｐｒｏｃ、　ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾　８４：３４３９　 （１９８７））　、　ｔ、かじながら、ヒト可変領域とマウス不変領域のハイブ リッドを注射されたマウスは、ヒト可変領域に対して向けられた強い抗抗体ｌゾ 応を示（ことが分かった１、二のことは、ｌニドの系において、かかるキメラ扛 百番内に金縁げっ歯類Ｆｖ領域を保持することが、依然とし。

てヒト抗マウス抗体のもとになり得ることを示唆している。

可変ドメインのＣＩ）　Ｒループか抗体分子の結合部位を含むと一般に考えられ ている。ヒトフ）７・−ムワーブ上−・のげ−、！Ｆｌ類ＣＤＲループの移殖・ ′耶ち、ヒト化）は、げっ肉類の配列を更に最小限にし、ようとしたものであっ た〔ジダウンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、　ＮａＬｕｒｅ３２１：５２２　（１９８６ ）　：ベルホーヤエンら、　５ｃｉｅｒ＋Ｃｅ　２３９：１５３４（１９８８） ］　、カハト　（ＫａｂａＬ）　らによる研究（Ｊ、Ｉｓｍｕｎｏｌ、　１４７ ：１７０９　（＋９９１）］により、坑鉢体可変メイノの７レームワーク残基は 、ＣＤＲループ支持体の中に包含されていることか示された。

抗原結合親和性を保存するためにヒト化抗体のフレームワーク支持体残基内の変 化か要求され得ることも見出された。幾つかのヒト化抗体構築体内にＣＤＲ移植 を用いること及びフレー１１ワーク１ｉ５．基を６存することが、例えば、クイ ーン（Ｑｕｅｅｎ）らｆＰｒ！］Ｃ，Ｎａ１ｌ　へｃａｄ、　Ｓｃｉ、　１１． ｓ、＾、　８６：１０ｔ１２９　（＋９８９）１　、ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ） らｒＰｒａｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８８：４ １８１　（１９！１１）］及びホジソン（Ｈｏｄｇｓｏｎ）　ｒＢｉｏ／Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ　９：４２１　（１９９１））により報告されている。正確な配 列ｆｆ＋報は、僅かなヒｌ−化構築体について報告され′Ｃいるに過ぎない。

Ｊ、記の事柄から、ＩＬ−４に特異的な治療に用いることができるモノクローナ ル抗体が必要とされていることは明らかである。好ましくは、これら抗体はヒト 化抗体であるべきである。

産肌の翌１ 本発明は、ＴＬ−４関連疾患の治療に有用なモノクローナル抗体及び組成物、及 びかかる物質を作るための中間体を提供することにより、この必要性を満足する ものである。。

より詳しくは、本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受Ｊ ｆ、ＪＩＡＴＣＣ）１１　０８０りの下に寄託された細胞系の同定用特徴をｆｌ するｒ＼イブリ）：　−ｌによ−）で産生されろモノ：ｒＣＪ−ナル抗体、及び 該ハイブリドーマ自体を提供する。。

本発明は、更に、配列番号：Ｉ、配列番号＝２により明示されたアミノ酸配列又 はそれらの小配列を有するモノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖可変領域を含むポ リペプチドを提供ずろ。

本発明は、なお更に、ヒトインター０イキンー４にＰ？ｎ的に結合するモノクロ ーナル抗体の重鎮又は軽鎖可変領域又はかかる抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ） をコードする１ｌｌｌされたＤＮＡ、又はその機能的等傷物を提供する。

本発明は、’４．　＝更に、上記モノクローナル抗体の軽鎖及び／又は重鎖可変 領域からのＣＤＲを含む結合組成物、単鎖結合タンパク質、及びキメラ又はヒト 化モノクローナル抗体を提供する。

アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号ＡＴＣＣＨＢ　９８θ ９の下に寄託された細ｔ［、の同定用特徴を有するハイブリドーマによ−）て産 生されるモノクローナル抗体、該ハイブリドーマにより産生されるモノグローナ ル抗体からの重鎮可変領域及び軽鎖可変領域を含むヒトインターロイキン−４に 特異的に結合する結合組成物、該ハイブリドーマにより産生されるモノクローナ ル抗体の軽鎖及び／′又は重鎖可変領域からのＣＤＲをａむヒト・ｒンクーロ・ ｒキン−４に特異的に結合する単鎖結合タンパク質、該ハイブリドーマにより産 生されるモノクローナル抗体の重鎮及び軽鎖可変領域を含むヒトインターロイキ ン−４に特異的に結合するキメラモノクローナル抗体、及び該ハイブリドーマに より産生されるモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域からのｃＤｈを含む ヒトインターロイキン−４に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体からな る群から選ばれるヒトＩＬ−４アンタゴニスト；及び生理学的に許容できるキャ リヤーを含む医薬組成物も本発明により提供される。

Ｘ皿二簾星五皿肌 本発明は、添付の図面を参照することによってより容易に理解することができる 。

図１は、細菌宿主内で末グリコジル化ヒトＩＬ−４を発現させるのに適する発現 べ２ターを図示したものである。

図２は、ヒト目６−４の最終精製段階における２１５ｎｍ吸収プロフィールを示 すものである。

図３（バートＡ及びＢ）は、ダウン（Ｉｌａｕｄｉ）細胞に結合している１ｆｆ ｌｌ　Ｃ１１０ＨｕｌＬ−４の中和を示す。

図４は、プラスミドｐＫＭ２０を図示したものである。

図５は、プラスミドｐｓｈ２５Ｄ２Ｈ−１を図示したものである。

図６は、種々のヒト化抗体内に行ったアミノ酸残基の置換を、抗体２５ｐ２及び Ｌ　Ａ　Ｙと１１−較して示Ｊものである。

皇胆ユ脱二 ここに引用される全ての参考文献は、参照によってそっくりそのままここに取り 込まれるものとする。

、：こて用いる場合、“Ｄ　Ｎ　Ａ　”という用語は、標準的な５゛がら３°ま でのホスホジエステル箱内に連結されたデオキシリボヌクレオチドを含む分子と して定義され、小さなオリゴデオキシリボヌクレオチド及び大きなデオキシリボ 核酸のいずれをも含む。

抗体は、ジスルフィド架橋によって共に連結されたポリペプチド鎖の集合体を含 む。軽鎖及び！ｌ鎖といわれる２本の最も重要なポリペプチド鎖は、抗体の全て の主要構造クラス（アイツタイカを作り上げている。−鎖及び軽鎖のいずれも、 可変領域及び不変領域といわれる小領域に更に分割される。重鎮はｌの可変領域 と３又は４の異なる不変領域を含み、軽鎖は１の可変領域（重鎖のものとは乳な る）と１の不変領域（重鎖のものとはｎなる）を含む。重鎮及び軽鎖の可変領域 は、抗体の結合性ＩＡ性のもとにな−ている。

ここで用いる場合、“ＣＤ　Ｒ構造ループ”という用語は、抗体分子の結合部分 上のβ鎖を架橋する抗体の可変部分内の３軽鎖領域と３重鎖領域を靭味する。こ れらループは、特徴的な規範的構造を有しているｒコヂア（Ｃｈｏｌ、ｈｉａ） ら、Ｊ。

Ｍｏｔ、　Ｒｉｏｔ、　ｌワ６：９０１　（１９１ｔ７）；つチアら、　ｊ、　 Ｍｎ！、　Ｂｉｏｌ、　２２７４９９　（＋９９２））。

“カバトＣＤＲ”という用語は、カバトら（Ｓｃ＋＋ｕｅｎｃｅｓ　ｏｒ　ｒ’ ｒｏＬｅｉｎｓ　ｏｒＩｗｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ、４１ｈＥ ｄｉｔｉｏｎ、１９８７．Ｕ、Ｓ、ＤｅｐａｒＬｓｅｎＬｏｒＩｌｅａｌｔｈａ ｎａｌ　ｌＩｌｌｍａｎ　５ｃｒｖｉｃｅｓ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｌｉ ＬｕＬｅｓ　ｏｆ　１ＩｅｄｌＬｈ（により定義されたｉ狽■ 及び軽鎖上の超可変抗体配列のことをいう、。

ここで用いる場合、“重鎖可変領域′という用語は、（１）長さが１１０〜１２ ５アミノ酸であり、そして（２）そのアミノ酸配列が本発明のモノクローナル抗 体のＩＰＦＩのＮ末端アミノ酸から始まるアミノ酸配列と一致する七「１ペプチ ドを意味する。同しく４　“軽鎖可変領域”という用語は、（１）長さが９５〜 １１５アミノ酸であり、そして（２）そのアミノ酸配列が本発明のモノクローナ ル抗体の軽鎖のＮ末端アミノ酸から始まるアミノ酸配列と一致するポリペプチド を意味する。

Ｆ１口〕、Ｆ・；、Ｆくａｂ）ｔ、及びＦｖｌＪ、それらの標準的な免疫学的意 味で用いられる（クライン（にＩＬ′！ｉｎ）、　１ｍ＋ｕｎｎｌｒ＋Ｂｙ　（ ｊ＋＋ｈｎ　Ｗｉｌｐｙ、　Ｈｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８２）　；１’ａｒｈａ ｖ　Ｃｈａｐｔｅｒ　１４．　ｉｎ　Ｗｅｉｒ、ｃｄ、　Ｉｍ曽ｕｎｏｃｈｅｍ ｉｓｌｒｙ、４Ｌｈ　Ｐ、ｄ、（Ｂｌａｃｋｗ■撃■ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉ”ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　１９８６ ））。

ここで用いる４６、゛モノクローナル抗体”という用語は、ヒトＩＬｉに特異的 に結合できるイムｌグロブリンの同種集団のことをいう。ヒト＋１．−４は、（ １）ヒト１し一４内の１本のペプチド鎖からなるペプチド抗原決定基、（２）■ を超える空間的に近接したペプチド鎖であってそれぞれのアミノ酸配列がヒトＩ Ｌ−１ポリペプチド配列に沿って分離１−で位置するペプチド鎖からなる配座性 （ｒｎｎｆｎｒ！ＩａＬｉｏｎａｌ）抗原決定基：及び（３）炭水化物基等の如 き、翻訳後にヒトＩＬ−４に共有結合で結合した分子構造から全体的又は部分的 になる翻訳後抗原決定基を含む、１又は２以上の抗原決定基を有してもよいと理 解される。本発明の抗体は、１又は２以上のこれら決定基に対して向けられてい てもよい。

ここで用いる場合、゛結合組成物”という用語は、（１）　Ｒｔｆ−できるよう に会合した時に、ヒト！■、−４にり・１する高い結合親和性を有するコンフォ メーシＤンをとり、そして（２）ヒトＩＬ−４に特異的なモノクローナル抗体を 産生するハイブリドーマ由来である、２本のポリペプチド鎖を含む組成物を意味 する。“機能できるように会合した”という用語は、Ｆａｂ又はＦｖの如き天然 の抗体断片における会合又（−！カルボキシル末端で遺伝子操作されたシスティ ン含有ペプチドリフカーを介する会合を含む、種々の手段による結合のために該 ２本のポリペプチド鎖が相互に関連して配置され得ることを意味する。

本発明のハイブリドーマは、周知の技術によって作ることができる。通常、その 方法は、不死化細胞系と目的の抗体を産生ずるＢリンパ球との融合を包含する。

また、不死抗体産生細胞系を生ずる非融合技術、例えば、ウィルス的に誘導され た形質転換〔キャナ１）　（Ｃａｓａｌｉ）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：４ ７６　（１９８Ｂ））が可能であり、本発明の範囲内のものである。不死化細胞 系は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげ１ｖ１１類、ウシ、及びヒト 起源のミエローマ細胞である。便利でありかつ入手容易であることから、ラット 又はマウスミエローマ細胞系が最も頻繁に用いられる。

標的抗原を注射した哺乳動物から適当なリンパ球を得る技術は周知である。一般 に、ヒト起源の細胞が望ましい場合には末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が用いられ、 また非ヒトＩＩ乳動物源が望ましい場合には牌臓細胞又はリンパ節細胞が用いら れる。宿主哺乳動物を精製した抗原で繰り返し注射して、目的の抗体産生細胞を 生成させた後、これらを採取して不死化細胞系と融合させる。融合技術も当該技 術分野で周知であり、−唆に細胞をボリエ千レンゲリコールの如き融合剤と混合 することを含むつ ＨＡＴ　（ヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択の如き標準操作に よりハイブリドーマを選択する。これらハイブリドーマの中から、ウェスタンブ ロッティング、ＥＬＩＳＡ　（、酵素結合免疫吸着検定法）、ＲＩＡ（放射性免 疫検定法）等の如き標準的免疫検定法によりそれらの培地を分析することによっ て、目的の抗体を分泌するものを選択する。抗体は、標準的タンパク質精製技術 を用いて培地から回収するｒｒイユセン（Ｔｉｊｓ＊ｅｎ）、　ＰｒａｅＬｉｃ ｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｒ１！ｎｚｙｍｅｌ−ｓｕｎｏａｓｓａｙｓ　（ ［１！５ｃｖｉｅｒ、＾ｍ５Ｌｅｒｄａｖ　１９８５）］　ａｎのどの技術を適 用するに当たっても、多くの参考文献を利用することができる〔コーラ−（にｏ ｈｌｅｒ）ら、Ｈｙｂｒｉｄｏｓａ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａＬｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１り８０）　；テイユセン、　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｌ＋ｅｏｒｙ　ｏ ｆ　ｌ！ｎＨｍｅ　Ｉｉ＋５ｕｎｏａｓｓａｙｓ　（［Ｅｌ唐■魔奄■秩B ＾−ｓｔｅｒｄａｍ、１９８５）　；キャンベｌしくＣａｍｐｂｃｌｌ）、　Ｍ ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ＡｎＬｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ■■ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、＾ｎ５ｔｅｒｄａｖ　１９１１４）　：ヒルル（Ｈｕｒｒ ｅｌｌ）、　１Ｊｏｎｏｃｌすｎａｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｓａ＾ｎＬｉｂｏｄｉｅ ｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　（ＣＲＣＰｒ ｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｄｏｎ、　Ｐk。

＋９８２）　）。

モノクロ−六ル抗体は、周知のファージうイブラリ−系を用いて産生させること もできる。

抗体の断片の使用及び生成も周知であり、例えば、Ｆａｂ断片〔ティユセン。

１’ｒａｃＬｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｘｙ＊ｒ：　Ｉｓｍｕ ｎｏａｓｓａｙｓ　Ｏ！ｌ５ｃｖｉＣｒ、＾ｍ５Ｌｅｒｄｉ{ｉ、１９８５）） 　、 Ｆｖ断片〔ホックマン（Ｉｌｕｃｌｎａｎ）ら５口ｉｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ　１ ２：１１１０　（＋９７３）；シャロン（Ｓｈａｒｏｎ）ら、　［１ｉｎｃｈｅ ＠１ｓＬｒｙ　１５：１５９１　（１９７６）　；エールリッヒ（１’！ｈｒｌ ｉｃｈ）ら。

米国特許第４．３５５．０２３号〕及び抗体半分子（ａｎＬｉｂｏｄｙ　ｈａｌ ｆ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）　（オーダトーレーハーグリーブズ（＾ｕｄｉＬｏｒ ｅ−１（ａｒｇｒｅａｖｃｓ）、米国特許第４．４７０．９２５号）のようであ る。更に、本発明のかかる化合物及び組成物は、公知の技術により、例えば、ハ イブリドーマの更なる融合（即ち、いわゆるクワドローマ（ｑｕａｄｒｏｓａ） の生成；リーディング（Ｒｅａｄｉｎｇ）、米国特許第４．４７４．４９３号） により、又は半分子の化学的再結合（ブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）、　５ｃｉｅ ｎｃｅ　２２９：８１ＣＩ９８５））により、７４重特異性抗体の構築に用いる ことができる。

本発明のハイブリドーマ及びモノクローナル抗体は、■換え体産！を成熟しト１ Ｌ−４のグリコリル化型又は未グリコジル型のいずれかに対して作られる。一般 ｇこ、ヒトＩ　１．−４の未グリコジル型は大腸菌内で産生され、ゲリコンル型 は１乳動物細胞宿主、例えば、ＣＶＩ又はＣＯＳサル細胞、マウス１−細胞、又 はそれらに西したもので産生される。組換え体産生成熟しト１し−４は、標準的 ′＋−顕ｒマニアチスＩ：ＭａａｉａＬｉｓ）ら、　！Ｊｕｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ １ａｒｉｔｙ：　／ｌ　Ｌａ１Ｏｒａ【ｔｒ）　ｋｉａｎ＋＋ａｉ　f、Ｃｏｌ ＋ｊ Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒ！＋ｏｒ　ｌ、ａｂｏｒｐ、ｊｎｒｙ、　Ｎｅｙ　Ｗｏ ｒｋ、　＋９８２）　；オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）及びバ[ ブ（ｔｌｅｒｇ）、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｒｉａｌ、　２：１６１　（１９ ８２）　；オカヤマ及びバーブ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ−Ｒｉａｌ、３：２８０ 　（１り８３）；　ハーフ　−（Ｈａｓｅｒ）、ＧｅｎｅＬｉｃ　［、ｎｇｉｎ ｅｅｒｉｎｇ　２：８３　（１９８０j ：米国特許第４．５９９．３０８号：カウ７マン（にａｕｒ−ａｎ）ら、　Ｍｏ １．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　２：ｌ３０４　（１９８２））を用いて宿主細胞内に発現ベクター を導入することによって産生される。

目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列が公知であるが又は入手可能で ありさえすれば、細菌又は哺乳動物発現ベクターの構築は当該技術分野で周知で ある。例えば、デボアー（Ｄｅ口ｏｅｒ）　（米国特許第４．５１１，４３３号 ）は、細菌発現ベクターに用いるプロモーターを開示している。′）ｇ−デル（ Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら（米国特許第４．６０１．９８０号）及びリッグス（Ｒｉｇ ｇｓ）　（米国特許第４，４３１，７３９号）は、大ｍｉｑ現系にょる哺乳動物 タンパク質の産生を開示している。リッグス（前記文献）、フエリッチ（Ｐｅｒ ｒｅＬＬｉ）ら［Ｐｒｏｃ、　ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８３：５９９ 　（＋９８６））　、スプロート（ＳｐｒｏａＬ）ら［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３：２９５’ｌｌ　（１９８５）］及びマリンバツク（Ｍｕ 　ｌ　ＩｅｎｂａｃｈＪら［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｖ　２６１ニア１９　（ １９８６））は、細菌自発現用の合成遺伝子の構築法を開示している。

成熟ヒトＩ　＋、　−４のアミノ酸配列は、ヨコタら（前記文献）により開示さ れており、ヨコタらにより開示されたｐｃＤベクターにより保持されたヒトＩＬ −４をコードするｃＤＮＡか、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション （ＡＴＣＣ）、０ツクビル、　ＭＤ、　ｌ：、受託番号ＡＴＣＣ６７０２９（７ ）下に寄託された。

多くの細菌発現ベクター及び宿主が市販されているか又はＡＴＣＣを介して入手 可能である。好ましくは、宿主動物を免疫感作するためのヒトＩＬ−４を、上記 のｐｃＤベクターにより一過的に形質移入されたＣＯ３，ＣＶＩ、又はマウスＬ 細胞の培養、ヒ澄み液から単離する。組換えヒト！Ｌ−４は、例えば、ジエンザ イム（ＧｅｎｚＹ謙ｅ）・コーポレーション（ボストン、ＭＡ）から及びＩＣＮ ・フロー（Ｆｌｏｗ）　（コスタメサ、ＣＡ）から購入することもできる。

特に、かかる技術は、１つの種の結合領域がもう１種の抗体の非結合領域と組み 合わさっている種間モノクローナル抗体を産生ずるのに用いることができる〔リ ウら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾、　８４ ：３４３９　（１９８７））　、例えば、げっ歯頚モノクローナル抗体からのＣ ＤＲをヒト抗体上に移植し、それによって、該げっ歯頚抗体を“ヒト化”するこ とができる〔リークマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）ら。

Ｎａｔｕｒｅ　３３２：３２３　（１９８Ｂ）１　、より詳しくは、ＣＤＲをヒ ト不変領域を有しても有さなくてもよいヒト抗体可変領域内に移植することがで きる。かかる方法は、ヒトインターロイキン−２レセプターのｐ５５（Ｔａｃ） サブユニットに対するマウスモノクローナル抗体をヒト化するのに用いられてき た「クイーンら、　Ｐｒｏｃ。

Ｍａｌｌ、＾ｒｅａｄ、　Ｓｃｉ、　１１．ｓ、Ａ、　８６：ｌ００２９　（１ ９８０））　一本発明のハイブリドーマから抽出した伝令ＲＮ八（ｍＲＮΔ）は 、細菌、酵母、又は他の宿主内でモノクローナル抗体の断片をクローニング又は 発現するのに有用である。かかるモノクローナル抗体の重鎮及び軽鎖可変領域及 びＣＤＲをコードするかかるｍＲＮΔから生成した相捕的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ） は、標準方法により操作した抗体及び単鎖結合タンパク質を産生ずるのに用いる ことができろう該抗体の可変領域内でのＣＤＲの位置は、幾つかの周知の標阜方 法を用いて決定することかできる。例えば、カバトら［５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏ ｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｒｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、 　４ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　１９Ｂ７．１１．ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　 ｏｆ　）撃■≠撃狽■ ａｎｄ　ｔｌｕｓａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ、　ＮａＬｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔ ｕｔｅｓ　ｏｆ　ＩＩｅａｌＬｈｌは、Ｃｒ）Ｒの位置を突きよめる方式を公表 した。これら方式を用いて決定されたＣＤＲをここでは“カバトＣＤ　Ｒ”とい う。例えば、以下に記載したようなコンピュータープログラムも利用でき、それ を抗体鎖の３次元結合部位ループに関与するアミノ酸残基に基ついてＣＤＲ構造 ループを同定するのに用いることができる。

以下に記載するヒト化抗体は、（ａ）ヒト化のためのヒトフレームワークとして 用いるべきヒ）・抗体配列を選択すること、及び（ｂ）選択したヒトフレームワ ーク内に挿入するのにげっ歯頚モノクローナル抗体のどの可変領域残基を選択す べきかを決定すること、を含む２段階法を用いて作−た。

第１段階は、配列情報が利用可能である最良の入手可能なヒトフレームワーク配 列の選択を含むものであった。この選択プロセスは、次の選択規卓に基づくもヒ ト化すべきげつ歯頚モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の配列を最適に なるように並べて、他の公知のヒト抗体の重鎖及び軽鎖可変領域配列と比較した 。これは、２つのヒト抗体、つまりＮＥＷ、！：ＫＯ１，だけを用いることに大 きく頼った先行技術の方法とは対照的である。これら抗体についての構造上の情 報は入手可能であって、該抗体の呼称はそれらが由来した患者（ヒト）のイニシ ャルである。抗体ＨＩＬの構造も今日では公知である（ブルークヘイブン・コー ド（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｃｏｄｅ）　Ｐ　８　ＦΔＢ）。

こうして配列を比較したからには、残基の同一性を記録して同一性のパーセント を決定する。他の全ての要因が等しければ、該動物抗体と最高の同一性パーセン トを有するヒト抗体を選択することが望ましい。

（２）ｙ舅漿味辻 次いで、未同定残基及び／又は配列不確実性である曖昧性の存在について、該公 知のヒト抗体鎖配列を評価した。かかる不確実性の最もありふれたものは、配列 分析操作中のアンモニアの損失によるアミドアミノ酸についての酸性アミノ酸の 誤った回定、例えば、タンパク質内に現実に存在する残基がグルタミン残基であ った場合に、グルタミン酸残基と同定する不正確な同定である。不確実性は、カ バトらの前記文献のものの如きデータベースの検定によって確認される。他の全 ての要因が等しければ、かかる曖昧性をできるだ１ブ少なく有するヒト抗体鎖を 選択することか望ましいう （３）ｈ”＞皿菖朋遍。

抗体鎖可変領域は、ドメイン内ジスルフィド架橋を含有する。これら架橋を含む ノステイノ残基間の距１Ｉｌ（残基の数）は、ピン領域間隔（Ｐｉｎ−ｒｅｇｉ ｏｎｓｐａｃｉｎｇ）　（コチアら、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１９６： ９０１　（１９８７））といわれる。他の全ての要因か等しければ、選択される ヒト抗体のピン領域間隔は、該動物抗体のそれと類似しているか又は同一である ことが最も望ましい。また、コンピューターモデリングを容易にするために、ヒ ト配列ピン領域間隔は、公知の抗体３次元構造のそれと類似しているか又は同一 であることが望ましい。

上述の規準に基づき、望ましい特徴の最良の総合的組み合わせを有するヒト抗体 、つまり抗体ＬＡＹか、げっ歯頚抗体のヒト化用フレームワークとして選択され た。

第２段階は、いずれのげっ肉類抗体可変領域配列がヒトフレームワーク内への移 植用に選択されるべきかの決定を含むものであった。この選択プロセスは、次の 選択規準に基づくものであった。

（１）塁ｌＪ碧 ２つのタイプの可能性ある可変領域残基をげっ肉類抗体配列内で評価した。その うちの最初のものを“最小残基”と呼んだ。これら最小残基は、ＣＤＲ構造ルー プに加えて、ＣＤＲ構造ループを支持及び／又は方向付けるのに要求される、コ ンピューターモデリングにより示された何らかの付加的残基を含んだ。

もう１つの可能性ある可変領域残基を“最大残基”と呼んだ。それらは、該最小 残基とカバトＣＤＲに加えて、約５人のＣＤＲ構造ループ残基内に収まりかつ約 ５人２又はそれより大きい水溶媒接触可能表面１リー（Ｌｅｅ）　ら、　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｃ■、　５５：３７９　（１９７１Ｎを有する、コンピューターモデリング により決められた何らかの付加的残基を含んだ１、 （２）コンピューターモデリング 可能性ある可変領域残基を特定するために、（ａ）ヒト化されるべきげっ索類抗 体の可変領域配列、（ｂ）　ｉ！ｌ択したヒト抗体フレ−１１ワーク配列、及び （Ｃ）種々の最小及び最大動物抗体残基が移植されたヒト抗体フレームワーク配 列を含む全ての可能な組換え抗体に関して、コンピューターモデリングを行った 。

このコンピューターモデリングは、タンパク質モデリングに適するソフトウェア −漫び（ａ）げっ索類抗体のものと殆ど同一である可変領域アミノ酸配列を有し かつ（ｂ）公知の３次元構造を有する抗体から得られる構造上の情報を用いて行 った。用いたノットウェアーは、５ＹＢＹＬバイオポリマー・モジュール・ソフ トウェア−（Ｔｒｉｐｏｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）であった。

上述の分析で得られた結果に基づき、げっ索類抗体のものに最も近いコンピュー ターモデリング構造をもたらずげっ索類可変領域を含有する組換え鎖を、ヒト化 用に選択した。

抗ヒトＩＬ−４モノクローナル抗体２５Ｄ２の重鎮（■□）及び軽鎖（ＶＬ）可 変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（その作成は以下に記載しであ る）をそれぞれ配列番号：ｌ及び２により配列表に明示している。これらヌクレ オチド配列から予測されるアミノ酸配列も配列番号、１及び２に明示している。

コバトらの前記文献の方法により決定したモノクローナル抗体２５Ｄ２の重鎖可 変領域のＣＤＲは、配列番号、１により明示されるアミノ酸配列のアミノ酸残ｌ Ａ３１〜３５．５０〜６６及び９９〜１１０を含む。ｙｌ下に記載する結合部位 ループ構造のコンピューター分析により決定して、モノクローナル抗体２５Ｄ２ の重鎖可変領域のＣＤＲは、配列番号：１により明示されるアミノ酸配列のアミ ノ酸残基２６〜３２．５３〜５６及びｔｏｏ　〜＋０８を含む。

上述の重鎮ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列は、配列番号＝１により明示さ れルヌクレオチド配列ノ塩１＆９１〜ｌｏ５、＋　４８〜１９８及ヒ２９５〜３ ３０（コバト決定法）及び塩基７６〜９６，１５７〜１６８及び２９８〜３２４ （ループ分析法）を含む。

コバトらの前記文献の方法により決定したモノクローナル抗体２５Ｄ２の軽鎖可 変領域のＣＤＲは、配列番号＝２により明示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基 ２４〜：Ｊ４．５０〜５６及び８９〜９６を含む。以下に記載する結合部位ルー プ構造のコンピューター分析により決定して、モノクローナル抗体２５Ｄ２の軽 鎖可変領域のＣＤＲは、配列番号＝２により明示されるアミノ酸配列の゛アミノ 酸残基２６〜３１．５０〜５２及び９１〜９５を含む。

上述の軽鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列は、配列番号＝２により明示さ れるヌクレオチド配列の塩基７０−１０２．１４８〜１６８及び２６５〜２８８ （コバト決定法）及び塩基７６〜９３，１４８〜１５６及び２７１〜２８５（ル ープ分析法）を含む。

上述の事柄から、こうして決定したＣＤＲは９〜５１塩基によりコードされるこ とが分かる。従って、タンパク質操作に有用なりＮＡは、それぞれ配列番号・ｌ 及び２により明示されたヌクレオチド配列の約１２〜３６３塩基及び約９〜３２ １塩基含む。また、重要なのは、タンパク質操作用のアイソタイプの選択のため の不変領域である。

本発明のＣＤＲをヒト抗体上に移植することによりヒト化された抗体を産生ずる のに用いる場合、ＣＤＲ又はＩＬ−４と相互作用しそうな１又は２以上のアミノ 酸残基をＣＤＨの外側に含めることが望ましいといえる（クイーンらの前記文献 ）。

本発明のＣＤＲは、抗体２５Ｄ２の機能的特性を真似る非ペプチド擬態化合物の 設計の基礎を形成することもできる。かかる擬響化合物を作る方法は、サラゴビ （Ｓａｒａｇｏｖｉ）らｒＳｃｉｅｎｃｅ　２５３ニア９２　（１９９１））に より記載されている。

抗体ヒト化の基礎を提供するのに加えて、配列番号：１及び２の情報は、バード （Ｂｉｒｄ）　ら〔５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：４２３　（１９８８））により記 載されたような、Ｆｖ領領域連結された重鎖及び軽鎖断片、又はヒユーストン（ ｌＩｕｓＬｏｎ）らｒｒｒｏｃ、　ＮａＬＩ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ＾　８５：５８７９　（＋９８８））により記載 されたような、生合成抗体結合部位（ＢへＢＳ）を含む単鎖ＩＬ−４結合タンパ ク質を作るのに用いることができる６単離した重鎖可変ドメインを含む単ドメイ ン抗体〔ワード（Ｗａｒｄ）ら。

Ｎａｔｕｒｅ　３４１＋５４４　（Ｈ１８９）！　し、配列番号　ｌにおける情 報を用いて調製することかできる。

本発明の２又は３以上のＣＤＲを直接に又はリンカ−配列によって１つのポリペ プチドにカップリングすることもできる。１又は２以ヒのＣＤＲを他の（非イム ノグロブリノ）ポリペプチド又はタンパク質１こ工学的に作り上げ、それによっ て、該ポリペプチド又はタンパク質にｌ　Ｌ　−４結合能力を付与することもで きる。

“配列番号　１又は２により明示された配列を有するモノクローナル抗体の重鎖 又は軽鎖可変領域、又はその小配列を含む”ポリペプチドは、上述のＣＤＲ含有 具体化物の全てを含むものとここで定義される。

抗体２５Ｄ２の重鎖及び軽鎖可変領域又はそれからのＣＤＲをコードするＤＮＡ は、配列番号＝１及び２に示した核酸配列情報を用いる標準方法によって調製す ることかできる。例えば、かかるＤＮＡは、例えば、マテウノシ（ＭａｔＬｅｕ ｃｃｉ）ら（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｐｍ、　Ｓｏｃ、　１０３：３１８５　（１９ ８１））のホスホラミダイト固体支持法（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｓｉｄｉｔｅ　５ ｏｌｉｄ　５ｕｐｐｏｒｔ　ｍｅｔｈｏｄ）、ヨー（Ｙｏｏ）　ら［Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　ＣｈｅＩＩB ７６４：１７０７８　（＋９８９）］の方法、又はその他の周知の方法を用いて 、化学的に合成することができる。

また、遺伝子の配列及び多くの入手可能な制限エンドヌクレアーゼの部位特異性 が公知であるので、当業者はハイブリドーマＭＰ４．２５　Ｄ２．１　＋のゲノ ミックＤＮＡから遺伝子を容易に同定及び単離して、目的の配列を得るために該 ＤＮＡを開裂することかできる。ドーハティ（ＤａｕｇｈｅｒＬｙ）ら［Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１９：２４７１　（１９９１））　Ｉ：ヨ’）例示すレタ、Ｊ−ウｔ：、ＰＣＲ 法（サイキ（Ｓａｉｋｉ）　ラ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７　（１９８８））を用いて同じ結果を得ること もできる。所望により、ＰＣＲに用いるプライマーをデザインして適切で新たな 制限部位を導入して、所与のベクターへの組み込みを容易にしてもよい。

抗体２５Ｄ２の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを得るためのいま１ツ ノ方法ハ、ハ（１’Ｊ　Ｆ−７１Ｃ１，Ｉ　ＩＯ２，６又はＭＰ４．２５Ｄ２． ｌ　＋から単１１したｍＲＮＡを鋳型として用いてｃＤＮＡの調製を行い、標準 方法を用いてそれから該可変領域をクローニングする方法である〔例えば、ウオ ール（Ｗａｌｌ）ら。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、５：３１１３　（１９７８）　；ザノは ノド　（ＺａｌｓｕＬ）　ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、８：３５９ １　（＋９８０）　；キャビンイ（Ｃａｈｉｌｌｙ）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１ ．　＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ。

＾、　８１：３２７３　（＋９８４）　；ボス（Ｂｏｓｓ）　ら、　Ｎｕｅｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２：：１７９１　（１９８４j　； アムスター（＾ａｓｔｅｒ）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８ ：２０５５　（１９８０）　；モーア（Ｍｏｏｒｅ）ら、米国特許第４．６４２ ．２３４号Ｊ０もちろん、遺伝子コードの縮ｉｆｌにより、多くの異なるヌクレ オチド配列が、配列番号＝１及び２に明示したアミノ酸配列を有するポリペプチ ド及びその中のＣＤＲをコードすることができる。コドンは、原核又は真核系で 最大に発現するように選択することができる。かがる機能的等傷物も本発明の一 部分である。更に、当業者であれば、生物学的機能を実質的に変えない重要でな いアミノ酸置換、付加又は欠失がある控えめに修飾された変異型が存在し得るこ とが分かるげンフィンセン（＾ｎｆｉｎｓｅｎ）、　５ｃｉｅｎｃｅ　１８１： ２２３　（１９７３）　；グランタム（Ｇｒａｎｌｈａｍ）。

５ｃｉｅｎｃｅ　１８５：８６２　（１９７４））。

配列番号・ｌ及び２により明示したアミノ酸配列のかがる控えめに修飾された変 異型も本発明により意図されている。例えば、化学合成により又は修飾したＰＣ Ｒプライマーを用いることにより又は部位特異的変異誘発法により本発明のＤＮ Ａを修飾して、所望によりかがる変異型を作ることは、十分に当該技術分野の軌 線の範囲内である。

より大幅な修飾を行うことも有益であり得る。例えば、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔ ｓ）ら［ＮａＬｕｒｅ　３２８ニア３１　（＋９８７））は、部位特異的変異誘 発法により結合部の周辺の２つの荷電した残基を除去することにより親和性と特 異性が高められた抗体を作つＩこ。

抗体２５Ｄ２の重鎮及び軽鎖可ｆ領域をコードするＤＮＡのベクターへの挿入は 、該ＤＮＡ及びベクター両方の末端が適合制限部位を含んでいれば、容易に行わ れる。もしもこれを行えないならば、制限エンドヌクレアーゼ開裂によって生じ た一本鎖ＤＮＡ張出し部分を消化することによって該ＤＮＡ及び／又はベクター の末端を修飾；７てプラントエンドを生成させるか、又は適当なりＮＡポリメラ ーゼで該一本鎖末端を充填することによって同じ結果を達成することが必要かも 知れない。また、該末端上にヌクレオチド配列（リンカ−）を連結するこによっ て、あらゆる目的の部位を生成させることができる。かかるリンカ−は、目的の 制限部位を規定する特有のオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。必要であれ ば、ホモポリマー性テーリング（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ　ｔａｉｌｉｎｇ ）によって、開裂したベクター及びＤＮＡ断片を修飾してもよい。

本発明のモノクローナル抗体、結合組成物又は単鎖結合タンパク質、又はかかる モノクローナル抗体に対して！ｌ！Ｉ製された抗イデイオタイプ抗体を用いて、 ＩＬ−４関連疾恵を治療する医薬組成物を調製することができる。

該組成物のあるものは、ＩＬ−４遮断作用又はアンタゴニスト作用を有するので 、ｌ　Ｌ−４活性を抑制するのに用いることができる。かかる組成物は、本発明 のモノクローナル抗体、結合組成物又は単鎖結合タンパク質及び生理学的に許容 できるキャリヤーを含む。

他の組成物は、本発明のモノクローナル抗体を抗原として用いて調製した抗イデ イオタイプ抗体及び生理学的に許容できるキャリヤーを含む。モノクローナルで あってもポリクローナルであってもよくかつ標準方法で作られるこれら抗イデイ オタイプ抗体は、ＩＬ−４自体の結合活性を真似ることができる。かくして、そ れらは、潜在的にＩＬ−４アゴニスト又はアンタゴニストとして有用であり得る 。

有用な製剤上の担体は、適合性で無毒であれば、本発明の組成物を患者に送達す るのに適する如何なる物質であっもよい。無菌水、アルコール、脂肪、ワックス 、及び不活性固体がキャリヤーに含まれ得る。該医薬組成物には、薬学的に許容 できるアジュバント（緩衝剤、分散剤）を加えてもよい。一般に、かかる薬品の 非経口投与に有用な組成物は周知であり：例えば、Ｒｅ■ｉｎｇｔｏｎ’　５Ｐ ｈａｒｉ＋ａｃｅｕＬｉｃａｌ　ｓｃｉ！！ｎｃｅ、　１５ｔｈ　Ｅｄ、　（Ｍ ａｃｋ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、　Ｂａ５狽盾氏A　ＰＡ。

１９８０）がある。また、本発明の組成物を移植可能な薬品送達系により患者の 体内に導入してもよい〔アーカート　（Ｕｒｑｕｈａｒｔ）ら、＾ｎｎ、　Ｒｅ ｖ、　Ｐｈａｒｓａｃｏｌ。

Ｔｏｘｉｃｏｌ、　２４＋１９９　（１９８４））。

寒旌烈 以下の非制限実施例は、本発明を例証するのに役立つものである。ベクターおよ び宿主の選択並びに試薬濃度、温度および他の変数値は、本発明の用途を単に例 示するものであり、本発明を制限するものと考えるべきではない。

特に断らない限り、固体混合物中固体、液体中液体および液体中固体に関して以 下に示した百分率は、それぞれ重量／重量、容量／容量および重量／容量基準に 基く。滅菌条件は、細胞培養の間維持された。

実施例Ｉ。

ｐｃＤ−ヒトＴ　Ｌ−４によるＣＯ５７サル細胞のトランスフェクションによる グリコリル化ヒト［Ｌ−４の製造 発現ベクターｐｃＤ−ヒトＩＬ−４および宿主Ｃ０８７細胞は、アメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ 　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から、それぞれ受託番号６７０２９およびＣＲＬ１６ り１として入手可能である。ｐｃＤ−ヒ目Ｌ−４クローンを増幅させ、プラスミ ドＤＮＡを精製した後、標準トランスフェクションプロトコルを用いてＣＯ５７ をトランスフェクトした。すなわち、ＣＯ３７細胞約１ｘ１０６個を、ダルベツ コ修飾イーグル培地（ＤＭＥ）　、１０％０％ウシ胎清および４ｒｎＭ　Ｌ−グ ルタミンが入っている１００ｍｍ組織培養プレート上に播種する。

播種して約２４時間後に、培地をプレートから吸引し、細胞を血清不含緩衝（５ ０ｍＭトリス）ＤＭＥて２回洗浄した。各プレートに対して血清不含緩衝ＤＭＥ （４ｍＭ　Ｌ−グルタミン含有）４ｍＬ　ＤＥＡＥ−デキストラン８０マイクロ リツトルおよびｐｃＤ−ヒトＩＬ−４ＤＮＡ５マイクログラムを加える。細胞を この混合物中において３０℃で４時間インキュベートした後、混合物を吸引除去 し、そして細胞を血清不含緩衝ＤＭＥで１回洗浄する。洗浄後、４ｍＭＬ−グル タミン、１００μＭクロロキニンおよび２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ５ｍｌを 各プレート対して加え、細胞を３時間インキュベートした後、血清不含緩衝ＤＭ Ｅで２回洗浄する。次に、４ｍＭ　Ｌ−グルタミンおよび４％ウシ胎児血清を含 むＤＭＥ５ｍｌを加え、細胞を３７℃で２４時間インキュベートする。次に、細 胞をＤＭＥまたはＰＢＳで１〜３回洗浄し、血清不含ＤＭＥ　（４ｍＭ　Ｌ−グ ルタミン含有）５ｍｌを加え、そして５日後に培養物上澄みを採取するまで細胞 を３７℃でインキュベートする。

実施例ＩＩ。

Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）活性を用いて、実施例Ｉによって製造された上澄み から精製中のヒトＩＬ−４を検定した。いくつかの標準検定がＴＣＧＦ活性に関 して記載されてきた［デヴオス（Ｄｅｖｏｓ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ６）、ロバー ト（Ｒｏｂｅｒｔ）−グロノ（Ｇｕｒｏｆｆ）ら、グロノ監修、９ｒｏｗｔｈ　 ａｎｄ　Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒｓ（ジョン・ウィリー（Ｊｏｈｎ 　Ｗｉｌｅｙ）、＝ニーヨーク、１９８４）の９章］。概して、ＴＣＧＦ検定は 、末梢Ｔリンパ球またはＩＬ−２依存Ｔ細胞系の増殖を促進する因子の能力に基 いている［ジリス（Ｇｉｌｌｉｓ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２０　：　２０ ２７　（１９７８）］。増殖は、標準的な技法、例えば、トリチウム化チミジン の取込みによってまたは比色定量法［モスマン（Ｍｏｓｍａｎｎ）、ヒトＩＬ− ４のＴＣＧＦ活性の検定は以下のように実施された。すなわち、健康な提供者か らの血液をヘパリン処理試験管中に採血し、モしてフィコール・ノ１イバクー（ Ｆｉｃｏｌ　Ｉ−Ｈｙｐａｑｕｅ）上に重層する。例えば、１５ｍ１遠心管中の フィコール・ハイパクー３ｍｌにつき血液５ｍｌ。３０００ｘｇで２０分間遠心 分離後、界面にある細胞を吸引し、そして１０％０％ウシ胎清、５０μＭ　２− メルカプトエタノール、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）２０μｇ　／　ｍｌお よび組換え体ヒトＩＬ−２を含むＲＰＭＴ１６４０から成る増殖培地中で希釈し た。３７°Ｃで５〜１０日間のインキュベーション後、ＰＨＡに刺激された末梢 血液リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）を洗浄し且つ２日間の比色定量検定（モスマン、上 記）において用いた。ＩＬ−４標準（ｐｃＤ−ヒトＩＬ−４でトランスフェクト されたＣ０８７細胞からの上澄み）または検査される部分の連続２倍希釈を、９ ６ウエルトレー中において上記の増殖培地を用いて実施して、最終容量５０μｌ ／ウエルを生成した。細胞約４〜８ｘｌＯ６個／ｍｌのＰＨＡ刺激ＰＢＬ５０μ ｍを各ウェルに対して加え、そしてトレーを３７℃で２日間インキュベートした 。次に、細胞増殖をモスマン（上記）にしたがって測定した。

本明細書中で用いられる１単位は、一つのウェル（０，１ｍ１）において２ｘ１ ０４個のＰＨＡ刺激ＰＢＬの５０％最大増殖を４８時間以上刺激する因子の量精 製は、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過および逆相高速液体クロマト グラフィーの連続利用によって達成された。全ての操作を４℃で実施した。

ＣＯ３７細胞を遠心分離によって除去し、上澄みを限外濾過によって約１０倍に 濃縮し、そして更に処理されるまで一８０℃で貯蔵した。ＩＬ−４力価は、フィ トヘマグルチニンに誘導されたヒト末梢血液リンパ球の増殖を刺激するタンパク 質の能力を検定することによって、すなわち、上記の標準検定を用いるＴＣＧＦ 活性によって決定された。

ＴＣＧＦ活性が約１０４〜１０６単位／ｍｌで且つタンパク質含量が約１５〜２ Ｑｍｇ／ｍｌであるａｍされたｃｏｓ−７上澄みを、５０ｍＭナトリウムヘペス （ＨＥＰＥＳ）　、ｐＨ７，０の２回交換に対して２４時間にわたって透析した （各交換は、一つの濃縮物の約１０〜１５倍容量である）。透析物を、５０ｍＭ ナトリウムヘペス、ｐＨ７，０で予め平衡させたＳ−セファロース（ＳＥＰＨＡ ＲＯ３Ｅ）（登録商標）（流速＋０．２ｍｌ／分）カラム（１ｘ２．５ｃｍ）に 入れた。カラムを１５カラム容量の平衡用緩衝液で洗浄した後、５０ｍＭナトリ ウムヘペス、ｐＨ７，０中Ｏ〜０．５Ｍ塩化ナトリウムに及ぶ直線塩化ナトリウ ム勾配の２０カラム容量で溶離した。溶離は、５カラム容量の５ＱｍＭナトリウ ムヘベス、０．５Ｍ　ＮａＣ１、ｐｉ（７，０による無勾配によって終結した。

１゜５ｍｌおよび１．８ｍ１部分を２種類の別個のバッチから集めた。ＩＬ−４ 力価は、両方のクロマトグラフィーに関して３００ｍＭおよび５００ｍＭ塩化ナ トリウムの間で溶離することが分かった。

Ｉ　Ｌ−４力価を有するＳ−セファロース（登録商標）カラムからの両分を、全 部の別個の容量９．０および１０．８ｍｌに関して混合した。両方の容量を、ア ミコン（Ａｍｉ　ｃｏｎ）ＹＭ５膜（分子量カットオフ＋５０００）を用いる限 外濾過によって１．９ｍｌまで１縮した。この工程からのタンパク質の回収率は 約８０％であった。濃縮ＩＬ−４溶液を、５０ｍＭヘペス、０，４Ｍ　ＮａＣＬ ｐＨ７，０で予め平衡させたセファデックス（ＳＥＰＨＡＤＥＸ）Ｇ−１００（ 登録商標）カラム（１，１ｘ５８ｃｍ）に入れ、そしてカラムを同緩衝液によっ て０．１５ｍ１／分で溶離した。５０の両分（１，０ｍｌ／画分）全部を集め、 そしてＩ　Ｌ−４力価を分析した。生物学的活性のピークは、見掛の分子量２２ ゜０００ダルトンで観察された。セファデックスＧ−１００（登録商標）カラム は、見掛の分子測定に関してウソ血清アルブミン（６５，０００ダルトン）、カ ルボニックアンヒドラーゼ（３０，０００ダルトン）およびシトクロムＣ（１１ ，７００ダルトン）を用いて検量された。

Ｉ　Ｌ−４活性を有するセファデックスＧ−１００（登録商標）カラムからの両 分を真空中において３〜４倍に濃縮し、モしてＶＹＤＡＣＣ−４（登録商標）が −ドカラム（４，６ｘ２０ｍｍ）上に注入した。領　１％（ｖ／ｖ）ｌ−リフル オロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）中０〜７２％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルの直線勾配を、 カラム温度３５℃および流速１．０ｍｌ／分において１５分間で生じさせた。２ １４ｎｍにおいて保持時間７分、８．２分および８．７分に検出された３個のピ ークが得られた（それぞれ図２のピーク１．２および３）。ピーク２（溶離時間 ８゜２分）のアリコート４０μｌを凍結乾燥させ且つ１０％ウシ胎児血清を含む 最少必須培地中に再溶解させた。この溶液は陽性のＴＣＧＦ応答を示した。ピー ク２のアリコート３００μｍを蒸発乾固させ且つ０．１％（Ｗ／　Ｖ　）　ドデ シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）２００μｌ中に再溶解させた。アリコート２μｌ を１％（Ｖ／ｖ）ＴＦＡ２００μｌ中で希釈し、そして再度クロマトグラフィー を行なった。

この試料の高速液体クロマトグラフィーは、２１５ｎｍでの単一ピークを実証し た。ピーク２物質は、約７ｘｌＯ’単位／ｍｇの活性を示した。

実施例ＩＩＩ。

ＴＲＰＣｌｌと示された大腸菌発現ベクターを、標準的な技法を用いて、例えグ ＋ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ ａｔｏｒｙ）　、ニューヨーク、１９８２年）において開示されたように構築し た。

ＴＲＩ”Ｃ１ｌベクターは、合成共通ＲＢＳフラグメントをＣ１ａｌリンカ−（ ＡＴＧＣ八Ｔ）へ対して連結することによっておよび得られたフラグメントを（ Ｃ］　ａ　１部位を含むように予め変更された）Ｃ１ａｌ制限ｐＭＴ１１ｈｃ中 にクローン化することによって構築された。ｐＭＴｌｌｈｃは、（マニアテイス ら、上記に引用、によって記載された）πＶＸプラスミドのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ ｄｌｌ＋ポリリンカー領域を有するｐＢＲ３２２の、小型（２，３キロベース） 高コピーＡ〜１ピ、ＴＥＴＳ誘導体である。それは、ｐＭＴｌｌｈｃをＥｃｏＲ ＩおよびＢａｍＨＩで制限し、得られた付着端にフィルインし、モしてＣ１ａｌ リンカ−（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）と連結し、それによってＥｃｏＲＩおよびＢａｍ ＨＴ部位を修復し且つＳｍａ　１部位をＣｌａｌ部位で置換することにより、Ｃ ｌａｌ部位を含むように変更された。

ＴＲＰＣ１１構築からの１種類の形質転換細胞は、Ｃｌａｌ部位が隣接したタン デムＲＢＳ配列を有していた。Ｃｌａｌ部位の一つおよびＲ，ＢＳ配列の第二コ ピーの一部分は、このプラスミドをＰｓｔｌで消化し、Ｂａ１Ｉヌクレアーゼで 処理し、ＥｃｏＲＩて制限し、そして全４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸 の存在下においてＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理することによって除去された 。

得られた３０〜４０ｂｐフラグメントをポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ て回収し且つＳｍａｌ制限ｐＵｃ１２中にクローン化した。次に、［ニコルス（ Ｎｉｃｈｏｌｓ）らによってＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

１０１巻、１５５頁（アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ） 、ニューヨーク、１９８３年）に記載された３　ｐＫｃ１０１由来の２４８ｂｐ の大腸菌ｔｒｐＰ含有ＥｃｏＲＩフラグメントをＥｃｏＲ１部位中にクローン化 して、図１に図示されているＴＲＰＣＩＩ構築を完了した。

ＴＲＰＣＩＩは、ヒトＩＬ−４ｃＤＮＡのベクターとして、それをＣｌａｌおよ びＢａｍＨＩで最初に消化し、それを精製した後、配列が配列番号３および４で 定義される２種類のオリゴヌクレオチドから成る二本鎖合成リンカー０．１マイ クロモルを含む標準的な連結反応溶液中において（受託番号６７０２９としてＡ ＴＣＣに寄託された）ｐｃＤ−１２５のＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩフラグメントと それを混合することによって用いられた。

大腸菌ＡＢ１８９９を、標準的な塩化カルシウム法を用いて連結反応溶液によっ て直接的に形質転換し、増殖させ、そして平板培養した。ＩＬ−４ｃＤＮＡイン サートを含むコロニーを、標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて選択した。

形質転換細胞をＬ−ブイヨン中で培養し、そしてＩＬ−４を本質的に発現させた 。

実施例■ｖ （エール大学大腸菌遺伝学センター（Ｙａｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｅ。

ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｅｎｔｅｒ）、ニューヘブン、ＣＴから入手し た）大腸菌Ａ３１８９９　（Ｉｏｎ−）の１リツトル培養物を０Ｄｓａｏ＝２　 （細胞約１．６ｘ１０’個／ｍ１）まで増殖させた。細胞を、４℃において４５ ００ｘｇで１５分間の遠心分離によって採取した。ペレットを、５０ｍＭ　Ｎａ Ｃ１，１ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸ＤＴＡ）および領　１ｍＭフッ化フェ ニルメチルスルフェニル（ＰＭＳＦ）を含む５０ｍＭ）リス緩衝液、ｐＨ８，０ の３０ｍ１中に再懸濁させた。ＥＤＴＡおよびＰＭＳＦは、精製前にヒトＩＬ− ４を分解するかもしれないプロテアーゼ活性を阻害するために加えられた。次に 、細胞を音波処理し［７０ワツトで５０パルス（５０％）］、そして４℃におい て２５゜０００ｘｇで１５分間遠心分離した。得られたペレットの主タンパク質 成分は、（ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中に可溶化され且つクマシーブル ーで染色された）電気泳動によって分離されたペレット物質のゲルバンドパター ンと陰性対照とを比較することによってｌ−４であることが分かった。

上澄みの除去後、ペレット物質を、５Ｍグニジン）（ＣＩ、２ｍＭグルタチオン （還元型）および領　２ｍＭグルタチオン（酸化型）を含むトリス緩衝溶液（５ ０ｍＭトリス、５０ｍＭＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ　ＰＭＳＦ。

ｐＨ８，ｏ；ベレット物質１グラムにつき９ｍ１）中に再懸濁させた。室温で約 １時間後、溶液を、２ｍＭグルタチオン（還元型）および０．２ｍＭグルタチオ ン（酸化型）を含むトリス緩衝溶液、ｐＨ８，０中に１：９に希釈した。希釈、 透析または濃縮工程中に沈殿が形成した場合は必ず、手順の前にそれらを遠心分 離によって除去した。次に、全容量を、リン酸緩衝溶液３リツトルに対して一晩 中に３回透析した。透析物（すなわち、透析バッグに残された物質）をアミコン ＹＭ５フィルターで濃縮しく最終濃度８ｍｇ／ｍ＋）、そしてゲル濾過クロマト グラフィーに供した（カラム：Ｐ２Ｏ（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）、１．５ｘ ９０ｃｍ；ＰＢＳ溶離緩衝液；流速８ｍ１／時）。両分を１５分間にわたって集 めた。両分２３〜２７をプールし、そして更に、逆相高速液体クロマトグラフィ ーによって分析した。このような分析により、プールされた画分が純粋なヒトＩ Ｌ−４を〉９５％含んでいたことが示された。１リツトル培養物（ＯＤ　ｓ　ｓ 。が２）からの収量は、比活性５ｘｌＯ’単位／ｍｇのヒトＩＬ−４が２ｍｇで あった。

実施例Ｖ。

ハイブリドーマＩＣ１，１１Ｂ４．６の製造雄のルイス（Ｌｅｗｉｓ）ラットを 、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）１ｍｌで乳化したヒトＩＬ−４溶液１ ｍｌを用いて腹腔内に免疫感作した。ヒトＩＬ−４溶液は、ｌＱｍＭ）リス−Ｈ ＣＬ　Ｏ，５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ７，４中に１４μｇ／ｍｌの濃度のヒ）ＩＬ− ４から成った。ヒトＩＬ−４は、実施例ＩおよびＩＩにしたがって製造され、そ の比活性は２ｘｌＯ’単位／ｍｇであった。

最初の免疫感作の２週間後、ラットに、ＣＦＡｌｍｌで乳化したヒトＩＬ−４溶 液１ｍｌを再度腹腔内注射した。２回目の注射の３か列後、ラットにヒトＩＬ− ４溶液１ｍｌ　（１５μｇ）を静脈内に追加投与した。ブースター注射の４日後 にラットを層殺し、血液を集め、そして融合用に牌臓を摘出した。

牌臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬ１ ５８０）とを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて１：１の比率で融合 した。細胞懸濁液（ＨＡＴ培地中細胞３．５ｘｌＯ’個／ｍｌ）を４０枚の９６ ウエルプレート中に分配した。１０日後、１１イブリドーマ上澄みを、微量滴定 プレート上に直接的に固定されたヒ）ＩＬ−４に対して（間接エリザ）またはウ サギ抗ヒトＩＬ−４の固定された多クローン性１ｇＧ部分に結合したヒトＴＬ− ４に対して結合するそれらの能力に関して検査した。結合抗体は、標準的なプロ トコルを用いるベルオキシダーゼ結合ヤギ抗ラット免疫グロブリンによって検出 された。

ＩＬ−４と反応するハイブリドーマ分泌抗体を限界希釈によってクローン化した 。ＩＣ１，１１Ｂ４．６は、これらの方法によって選択されたこのようなハイブ リドーマの一つであった。ＩＣ１，１１Ｂ４．６からの抗体は、■ｇＧ！、イソ タイプ由来であることが確認された。ハイブリドーマは貯蔵しく例えば、１０％ ＤＭＳＯ含有培地中−７０℃）且つ標準的な哺乳動物細胞培養技術（例えば、１ ｍＭグルタミンおよび５０ｍＭ　２−メルカプトエタノールを補足した１０％ウ シ胎児血清含有ＲＰＭ１１６４０）を用いて培養することができる。

実施例Ｖｌ。

ハイブリドーマＭＰ４．２５Ｄ２．１１の製造ハイブリドーマの集合を製造し、 そしてそれらの抗体のヒトＩＬ−４特異性を実施例Ｖの場合と実質的に同様の方 法でスクリーニングした。次に、集合の／％イブリドーマを、ヒトＩＬ−４のＴ ＣＧＦ活性を阻止するそれらの抗体の能力に関して（実施例ＩＩに開示されたよ うな）標準的なインビトロ検定において更にスクリーニングした。識別されたい くつかの阻止性単クローン性抗体の内、ＭＰ４゜２５Ｄ２．１１によって生産さ れたものを、最高力価の阻止活性を有するものとして選択した。ＭＰ４．２５Ｄ ２．１１によって生産された抗体はラットＩｇＧ１であることが確認された。

実施例Ｖｌｌ。

ヒトＩＬ−４のサンドイッチ検定 ウサギ多クローン性抗ヒトＩ　Ｌ−４抗体（プロティンＡアフィニティーカラム 上で精製されたＰＢＳ中１０μｇ／ｍ＋）１００μｌを、９６ウエルのポリ塩化 ビニル微量滴定プレート中の各ウェルの表面上に３７℃で２時間吸着させる。

（ＰＢＳは、蒸留水１リツトル中にＮａＣ１が８．０ｇ５ＫＨｚＰＯ４が０，２ ｇ、Ｎ　ａ　２ＨＰ　０４　・１２　Ｈ２Ｏが２．９ｇおよびＫＣＩが０．２ｇ から成る。ｐＨは７．４である。）プレートを、ＰＢＳ−トウイーン（Ｔｗｅｅ ｎ）（）ウィーン２０を０．５ｍｌ／リットル加えることを除き、ＰＢＳとして 正確に調製された）で洗浄して非結合抗体を除去した後、精製された大腸菌生産 ヒトＩＬ−４の二重反復連続希釈（ＰＢＳ中）を１２ウ工ル列の２列のウェル中 に、１０００　ｐ　ｇ／ｍ１〜１５ｐｇ／ｍｌの減少するＩＬ−４濃度の順に入 れる。以下の試料を残りのウェル中に入れた。すなわち、（１）ヒトＴ細胞クロ ーンからの培養物上澄み、例えば、ＣＴＬｙｌ’２７９　（ＡＴＣＣＣＲＬ　８ １７９）、（２）ｐｃＤ−ヒトＩＬ−４でトランスフェクトされたＣＯ３７細胞 の培養物上澄み、（３）種々の１度の精製Ｃ０８７生産ＩＬ−４を含むヒト血清 並びに（４）ヒトＩＬ−１α、ｌ−２、ＩＬ−３、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α２ｂ 、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＢＳＦ−２を含む試料。

全部の試料を室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−トウィーンで洗浄後、 ＩＣ１，１１Ｂ４．６の培養物からの上澄みの１：１０希釈を各ウェルに加え（ １００１／ウエル）、そして室温で１時間インキュベートした。インキュベーシ ョン後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗う・ノド抗体を加え、 そして室温で１時間インキュベートした後、そのプレートを洗浄した。次に、ペ ルオキシダーゼ基ＩＡＢＴｓを加え、モしてヒ目Ｌ−４ｉｆｌ１度をウェル中の 光学濃度によって決定した。結果は、検定が哺乳動物生産ヒトＩＬ−４をヒト血 清中において５０　ｐ　ｇ／ｍ　］程度の低１度で検出することができることお よび検定は前記に挙げたいずれのリンホカインも検出しないことを示す。

下記の表１および図３Ａは、ダウディ（Ｄａｕｄｉ）細胞に対するＨ５ｊ　）（ ｕｌＬ−４の結合を阻害する１１８４　Ｆ（ａｂ）、ＩｇＧおよび粗製上澄み（ 未精製抗体）の能力を示す。３種類の標品はいずれも、最大限７０％まで結合を 阻害した。対照単クローン性抗体ＧＬ１１７　Ｆ　（ａｂ）、ＩｇＧおよび粗製 上澄みは結合に影響を及ぼさなかった。（対照抗体は同様のイディオタイプに無 関係の抗原に対する。）結合を５０％阻害するのに必要とされる精製１１Ｂ４１ ｇＧまたはＦ（ａｂ）の濃度は、１０〜１１００ｎ／ｍｌの範囲内である０下記 の表２および図３Ｂは、同様の検定において結合を阻害する２５Ｄ２．１１Ｆ（ ａｂ）の能力を示す。この標品は、１１０−１５ｎ／ｍＩでの５０％最大効果に よって９０％阻害を引起こした。

図３Ａおよび３Ｂにおいて、Ｘ軸は（対数目盛りで）ｎｇ／ｍｌを示し且つＹ軸 は阻害パーセントを示す。

これらの実験において、ＨｕｌＬ−４はチャイニーズハムスター卵巣細胞におい て製造され且つ下記の表においてＣＨＯ−Ｈｕ　Ｉ　Ｌ−４と表示される。

表１ １１Ｂ４によるダウディ細胞に対する ”　Ｉ　−ＣＨｏ−Ｈｕ　Ｉ　Ｌ−４結合の中和試料　ｎ　ｇ／ｍ　ｌ　結合％ １１８４　Ｆ（ａｂ）　１　２８ １１Ｂ４　ＩｇＧ　１　０ １１Ｂ４上澄み　１０　０ ＧＬ１１７　Ｆ（ａｂ）　１　０ １００００　５．８ ＧＬ１１７　１ｇＧ　１　０ ＧＬ１１７上澄み　１０　７．５ １００　４．７ ２５００　５．５ 表２ ２５Ｄ２．１１　Ｆ　（ａｂ）７ラグメントによるダウディ細胞に対する”’ｌ −ＣＨ０−Ｈｕ　ＩＬ−４結合の中和ｎｇ／ｍ　１　阻害％ 実施例Ｖｌｌｌ 特に断らない限り、標準的な組換えＤＮＡ法を、本質的にはマニアナイスら、Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、 １９８２年、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−に記載されたよう に実施した。

飽和した一晩培養物からのプラスミドＤＮＡの小規模な単離は、バーンポイム（ Ｂ　ｉ　ｒｎｂｏ　ｉｍ）ら［Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、７：１５１３（１ ９７９）］の方法にしたがって実施した。この方法は、分析目的のための細菌培 養物からの少量のＤＮＡの単離を可能にする。特に断らない限り、多量のプラス ミドＤＮＡは、クルウェル（Ｃ１ｅｗｅ　Ｉ　１）ら［Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、１１０＋１１３５　（１９７２）］によって記載されたように製造された。

プラスミドＤＮＡの切断によって誘導された特異的制限酵素フラグメントを、ア ガロース中における分離用電気泳動によって単離した。９ｘ５　１載２ｃｍの寸 法のゲルをトリス−ホウ酸緩衝液（マニアナイスら、上記、４５４頁）中におい て５０ｍＡで１時間流した後、臭化エチジウム領　５μｇ／ｍｌで染色してＤＮ Ａを可視化した。適当なゲル部分を切取り、そしてＤＮＡを電気溶出した（マニ アナイスら、上記、１６４頁）。電気溶出後、ＤＮＡをフェノール抽出しくマニ アナイスら、上記、４５８頁）、そしてエタノール沈殿させた（マニアナイスら 、上記、４６１頁）。

制限酵素およびＴ４　ＤＮＡリガーゼは、ニュー・イングランド・パイオラブズ （Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）（ビバリー、ＭＡ）から購入した 。スーパースクリプトＲＮアーゼＨ−逆転写酵素はＢＲＬ／ギブコ（ＧｌｂＣＯ ）（ロツツクビル、ＭＤ）製であり、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼはストラタジ ーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（ラホヤ、ＣＡ）製、ＤＮＡポリメラーゼクレノ ウフラグメントはファーマシア・エルケイビー・バイオテクノロジー・インコー ホレーテッド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎ ｃ、）（ビス力タウエイ、ＮＪ）製、子ウシ腸ホスファターゼはベーリンガー・ マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　（インディアナポリス、ＩＮ）製、そしてＲＮアシ ンはプロメガ（Ｐ　ｒ　ｏｍｅ　ｇ　ａ）（マディソン、Ｗｌ）製であった。酵 素は全て製造者の指示にしたがって用も）だ。

ンークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）変型２．０配列決定システム（ま、ユナ イテソド・ステーツ・バイオケミカル（ＩＪｎｉｔｅｄ　ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃ ｈｅｍｉｃａｌ）　（クリーヴランド、ＯＨ）から得られた。

ドブノルヌクレオチド二リン酸およびオリ３６丁１□〜！８プライマーはファー マシア・ＬＫＢ・バイオテクノロジーから、ウシ血清アルブミンはベーリンガー ・マンハイム・バイオケミカルズから、そして再蒸溜フェノールはＢＲＬ／ギブ コからであった。

プラスミドベクターブルースクリプトはストラタジーンから購入したが、適格な 大腸菌菌株ＤＨ５−α（マクス・エフインェンシー（Ｍａｘｌ：ｆｆ１ｃｉｅｎ ｃｙ））はＢＲＬ／ギブコ製であった。

組織培養培地および補足物はＢＲＬ／ギブコ製であり、ウシ胎児血清はノ＼イク ローン・ラボラトリーズ・インコーホレーテッド（ＨｙｃｌｏｎｅＬａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、）（ローガン、ＵＴ）製であった０細胞培養 ハイブリドーマ細胞系ＭＰ４．２５Ｄ２．１１を、５％ＣＯ２を含む給温された ３７°Ｃの室中において、１０％熱不活化ウソ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよ びペニシリン／ストレプトマイノン１０単位／ｍｌを補足したＲＰＰ［１６４０ 培地中で維持した。

単クローン性抗体２５Ｄ２の単離および配列決定ハイブリドーマ細胞系ＭＰ４． ２５Ｄ２．１１によって状態調節された培地を限外濾過によって１０〜４０倍に 濃縮した後、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐ■４７０．０１５〜ｉ　ＮａＣｌ と０．００５％アジ化ナトリウム中のガンマノくインド（ＧＡＭＭＡＢＩＮＤ） Ｇ　（登録商標）−アガロースカラムに入れた。ガ〉マバインドＧ−アガロース は、組換え体連鎖球菌性プロティンＧが共有結合によって固定されているビーズ のアガロースである。次に、結合タンノくり質を、水酸化アンモニウムてｐＨ３ ，０に調整された領　５Ｍ酢酸によって溶離した。精製用クローン性抗体２５Ｄ ２を含む両分は、本質的にはレームリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）［Ｎａｔｕｒｅ　２ ２７：６８０　（１９７０）］ｌ二よって２載されたように、ドデンル硫酸ナト リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決定され た。

２種類の方法を用いて、配列決定のための精製抗体２５Ｄ２の重鎖および軽鎖を 分離した。最初の方法は、半分雌用５ＤＳ−ＰＡＧＥに続いてボリニフッ化ビニ ル（ｐＶＤＦ）膜上でのエレクトロブロッティングを用いた。簡単にいうと、高 度に精製された抗体１２０μｇ（８００ピコモル）を、２−メルカプトエタノー ルで還元後にＳＤＳ中でのスラブゲル電気泳動に供した（レームリ、上記）。

次に、分離された重鎮および軽鎖を、本質的にはマッダイン（Ｍａｔｓｕｄａｉ ｒａ）［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１　：１００３５　（１９８７）］のエ レクトロブロッティング法を用いて、イモピロン（ＩＭＭＯＢＩＬＯＮ）（登録 商標）膜（ミリポア（Ｍｉ　ｌ　Ｉ　１ｐｏｒｅ）　、ベッドフォード、ＭＡか らのＰＶＤＦ膜）上に移した。重鎮および軽鎖に対応するバンドを、クマンーブ リリアントブルーで染色後に膜から切取り且つＮ末端の配列決定用に処理した。

もう一つの方法は、多量の重鎮および軽鎖を溶液中において単離することを可能 にした。この方法を用いて、タンパク質１ｍｇ／ｍｌを含む精製抗体２５Ｄ２の 試料５ｍｌを、本質的にはモアヘッド（Ｍｏｒｅｈｅａｄ）ら［Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ　２３：２５００（１９８４）］によって記載されたように、領　Ｌ Ｍ）リス−ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０に対して４℃で透析した後、 ＮａＳＯ３／Ｎａ２５ｚＯｓ中での酸化的亜硫酸分解に供した。亜硫酸分解後、 抗体標品を１Ｍ酢酸に対して透析し、凍結乾燥させ、１Ｍ酢酸中に還元して容量 １．５ｍｌとし、そして同緩衝液で平衡させた１ｘ３０ｃｍのセファデックス（ ＳＥＰＨＡＤＥＸ）Ｇ−７５（登録商標）カラム（ファーマシア、ピスカタウエ イ、ＮＪ）中においてゲル濾過を行なった。

重鎮および軽鎖に富む画分を別個にプールし、そして別個に、１Ｍ酢酸中の１゜ ５ｘｌＯＯｃｍセファデックスＧ−７５　（登録商標）カラムでゲル濾過を行な った。この工程後の重鎮および軽鎖の純度は、分析的５ＤＳ−ＰＡＧＥによって 評価された。重（４ナノモル）鎖および軽（３ナノモル）鎖を含む両分を別個に プールし、そして配列決定用に約０．１ｍｌ容量まで真空中で濃縮した。

Ｎ末端アミノ酸の配列決定はいずれも、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４７７Ａ型タンパク質−ペプチドシ−クエン サーを用いて行なった。イモピロン（登録商標）膜上にプロットされた単離され た重鎮および軽鎖の配列決定は、本質的にはユヮン（Ｙｕ　ｅ　ｎ）ら［Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ヱ：　７４　（１９８９）］によって記載されたように 行なった。溶液中の単離された鎖の分析は、シークエンサーの製造者の指示にし たがって行なった。

オリゴヌクレオチドブライマーの設計およびクローニング計画前述のアミノ酸配 列分析から得られた情報に基いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法［サイキ （Ｓａｉｋｉ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７　（１９８８）］において 用いるための縮重オリゴヌクレオチドブライマーを設計した。

Ｂ１７９８と称する一つの縮重プライマーは、２５Ｄ２の成熟重鎖のアミノ末端 の１３アミノ酸残基をコードしているヌクレオチド配列を有していた。Ｂ１８７ ３と称するもう一つの縮重プライマーは、抗体の成熟軽鎖のアミノ末端の７アミ ノ酸残基をコードしているヌクレオチド配列を有していた。

更に、抗体重鎮をコードしているＤＮＡの３′非翻訳領域中のセグメントに対応 するヌクレオチド配列を有するＢ１７９７と称する非縮重オリゴヌクレオチドブ ライマー［ブルジェマン（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　 Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３：６０７５　（１９８６）］は、抗体軽鎖をコ ードしているＤＮＡのに不変部中のセグメントに対応するヌクレオチド配列を有 するＢ１８６８と称する非縮重オリゴヌクレオチドブライマー［シェパード（Ｓ ｈｅｐｐａｒｄ）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７旦 ・７０６４　（１９８１）］と同様に設計された。

他の非縮重プライマーは、完全な重鎮および軽鎖をコードしているｃＤＮＡのＰ ＣＲ増幅後に得られたヌクレオチド配列情報に基いて、抗体２５Ｄ２の重鎖およ び軽鎖の可変部をコードしているｃＤＮＡの単離において用いるために設計され た。

オリゴヌクレオチド合成 配列表に定義された配列を有するオリゴヌクレオチドブライマーを、アプライド ・パイオンステムダ３８０Ｂ型シンセサイザーを用いる標準法によって合成した 。

これらのプライマーの呼称は、括弧内に対応する配列番号を伴って以下の通りで ある。

Ｂ１７９７　（配列番号・５） Ｂ１７９８　（配列番号＝６） ８１８６８　（配列番号ニア） Ｂ１８７３　（配列番号：８） Ｂ１８８４　（配列番号＝９） Ｂ１９０２　（配列番号：１０） Ｂ１９２１　（配列番号：１１） Ｂ１９２２　（配列番号・１２） Ｂ１９３２　（配列番号・１３） Ｔ３（配列番号：１４） Ｔ７（配列番号：１５） プライマーＢ１７９８およびＢ１８７３は、クローニングを容易にするために、 ５’Ｎｏｔｌ制限部位を規定するように設計された。プライマーＢ１７９７およ びＢ１８６８は、同様の理由のために、３’５ｐｅｒ制限部位を規定するように 設計された。

ＲＮＡ単離 全細胞１ｉＲＮＡを、ハイブリドーマ細胞系ＭＰ４．２５Ｄ２．１１から、１０ ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４，１０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＭｇＣＩｘお よび０．５％ノニデト（Ｎｏｎ　ｉｄｅ　ｔ）Ｐ２Ｏ（フェノールのモル当り平 均９モルのエチレンオキシドを含むオクチルフェノール−エチレンオキシド濃縮 物）から成る溶解緩衝液中において細胞を１５分間インキュベートすることによ って単離した。４℃において２．ＯＯＯｘｇで５分間の遠心分離工程後、核ペレ ットを捨て、上澄みを４℃において１０．０００ｘｇで１５分分間間遠心分離し た。

２回目の遠心分離工程後、上澄み液を、２００ｍＭ　ＮａＣＬ　１０ｍＭトリス −ＨＣＩ＝　ｐＨ７，４，２０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および ２％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）を含む等量の溶液と混合した。混合 物を等量のトリス緩衝フェノール／クロロホルム（１：　１）で１回、そしてク ロロホルムで１回抽出した。抽出後、混合物を１／２０容量の０．２Ｍ酢酸ナト リウム、ｐＨ５，５および２．５容量の無水エタノールを用いて一２０°Ｃで一 晩中沈殿させた。

第−鎖合成 第一鎖ｃＤＮＡは、１０μｌの反応容量中において全細胞質ＲＮＡから直接的に ３７℃で９０分間合成された。反応混合物は、ピロ炭酸ジエチル処理された蒸留 Ｈ２Ｃ中のＲＮＡを５．６μｌ、ＲＮアシン（４０，０００単位／ｍ１）０゜２ ５μＬ　５Ｘ逆転写酵素反応緩衝液（２５０ｍＭトリスＨＣＩ、ｐＨ８，３，２ ００ｍＭ　ＫＣＩ、３０ｍＭ　ＭｇＣｈ、３ｍＭジチオトレイトール）２μｍ、 ウソ血清アルブミン（４ｍｇ／ｍ１）０．２５μｌ、１０ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物 （ｄＡＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰＳｄＧＴＰ）１μｍ１オリゴｄＴプライマー（０ ，５ｍｇ／ｍ１）０．４μｍおよびスーパースクリプトＲＮアーゼＨ−逆転写酵 素（２００単位／ｍり０．５μｌを含んでいた。

ポリメラーゼ連鎖反応 ＰＣＲ増幅は、テクネ（Ｔｅｃｈｎｅ）プログラム化可能熱サイクルを用いて行 なった。ＰＣＲ反応混合物は、第−鎖ｃＤＮＡ反応混合物１０μｍ、蒸留Ｈ２０ が５３．５ｍ！、ＩＱＸ　Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液（５００ｍＭ　ＫＣＬ 、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，３，１５ｍＭ　ＭｇＣｌ、、領　１％ゼ ラチン）１０μｌ、１．２５ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴ Ｐ、、ｄＧＴＰ）１．６μｍ１目的の各プライマー（２０ピコモル／μＩ）５μ ｍおよびサーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）Ｄ ＮＡポリメラーゼ０５μｍがら成った。

ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の変性、３７℃で２分間のブライマーアニーリン グ、７２°Ｃで３分間のプライマー伸長および７２°Ｃで９分間の最終伸長時間 を３０サイクル含んだ。増幅の最後に、１００ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物１μｌおよ びＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメント（５単位／μＩ）１μｍを、ＰＣＲ 反応それぞれに対して加え、そしてフィルイン工程を室温で１０分間進行させた 。

ｐｃＲａ全Ｒａ、臭化エチジウム０．５μｇ／ｍｌを含む１％アガロース／トリ ス−ホウ酸塩ゲル中の電気泳動に供した。目的のＰＣＲフラグメントをゲルから 切取り且つ電気溶出によって精製した。

サブクローニングおよびＤＮＡ配列決定ゲル精製されたＰＣＲフラグメントをＮ ｏｔＴおよびＳｐｅ　Ｉで消化した後、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ５ｐＨ７，５， １０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭジチオトレイトール、ライ血清アルブミン５０ μｇ／ｍｌ、１ｍＭ　ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ１０単位を含む混合物中 において脱リン酸化Ｎｏｔｌ／５ｐｅｒ消化ブルースクリプトプラスミドベクタ ーに対して１５℃で１６〜２４時間連結させた。適格大腸菌菌株ＤＨ５−α（マ クス・エフインエンシー）細胞を連結反応混合物で形質転換した。

得られた形質転換細胞の診断用分析は、Ｎｏｔ［およびＳｐｅ　Ｉを用いる制限 消化によって、更には、最初のプライマー反応において用いられるオリゴヌクレ オチドブライマーを用いるＰＣＲによって行なわれた。目的のサブクローンのイ ンサートを、ンークエンサーンステムを用いるＤＮＡ配列決定に供した。

オリゴヌクレオチドプライマーＴ７、Ｂ１８８４、Ｂ１９２１およびＢ１９２２ を用いて、重鎮の可変部をコードしているＤＮＡを得た。プライマーＴ３および Ｂ１９０２およびＢ１９３２を用いて、軽鎖の可変部をコードしているＤＮＡ単 ク単一ローン性抗体２５Ｄ２鎮および軽鎖の可変部中のＣＤＲを、カバト（Ｋａ ｂａｔ）らの上記方法および計算機結合部位ループ分析両方によって決定した。

後者の分析用に、フィル（Ｓｙｂｙｌ）またはインパクト（ＩＭＰＡＣＴ）ソフ トウェアを用いるシリコン・グラフィクス・パーソナル・イリス（Ｓｉｌｉｃｏ ｎ　Ｇｒａｐｈｉｃｓ　Ｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｉｒ１ｓ）４Ｄ／２５型計算機を用 いた。用いられた方法は、本質的に、セヴイル（Ｓｅｖｊｌｌｅ）ら［Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：８３４４（１９８８）］の３次元模型作成法と、チョ チア（Ｃｈｏｔｈｉａ）ら［Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１９６：９０１　（１９８ ７）；Ｎａｔｕｒｅ　３４２：８７７　（１９８９）コの免疫グロブリン超可変 部コンホメーション分析法と、トラモンタノ（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ）ら［ＰＲ ＯＴＥＩＮＳ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ９二工Ｌ］−し く且　旦：　３８２　（１９８９）３のタンパク質ループコンホメーション分析 法との組合せを必要とした。

制限酵素およびＤＮＡ修飾酵素は、二ニー・イングランド・バイラブズ製であっ た。Ｔａｑポリメラーゼは、パーキン・エルマー・ノータス・インコーホレーテ ッド（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、Ｉｎｃ、）から入手した。マウ ス抗ヒトＩｇＧ４−Ｆｃ抗体は、カルビオケム（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）から購 入した。ヒツジ抗ヒトＩ　ｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）ベルオキソダーゼ結合体およびヒ１ −ＴｇＧ４タンパク質標準は、ザ・パインディング・サイト・インコーホレーテ ッド（Ｔｈｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ、Ｉｎｃ、）から入手した。ヤギ抗う ッｔ−ｒｇＧは、ジャクラン・イムノ・リサーチ・ラブダ（Ｊａｃｋｓｏｎｌｍ ｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）から購入した。

精製ヒトＩ　Ｌ−４（ｈ　Ｉ　Ｌ４）は、本質的には、ランゾル（Ｌｕｎｄｅｌ ）ら［Ｊ、１ｎｄｕｓｔ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５：２１５　（１９９０）］に よって記載されたように、細菌発現システムから得られ、そして製造者の指示に したがってヨードジエン（ＩＯＤＯＧＥＮ）（登録商標）（ピアス・ケミカル・ カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）法によって放射性ヨウ 素化された。２５Ｄ２と称する精製ラット単クローン性抗体は、デクルイフ（Ｄ ｅＫｒｕｙｆｆ）ら［Ｊ、ＥｘｐｌＭｅｄ、１７０：１４７７（１９８９）］に よって記載された。

ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）標準およびヤギ抗つ勺ギＩｇＧペリオキシダーゼ結 合体は、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ・インコーホレーテッド から購入した。ウサギ抗ｈＧＨはダコ・コーポレーション（Ｄａｋ。

Ｃｏｒｐ、）製であり且つヒツジ抗ｈＧＨはバイオデザイン・インターナショナ ル（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔ、１ｏｎａｌ）から入手した０プロ ティン−〇セファロース（登録商標）ＣＬ−４Ｂは、ファーマノア・インコーホ レーテッドから購入した。オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステム ズ（ＡＢり３８０Ｂ型ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成した。

細菌菌株、プラスミド、細胞系および組換えＤＮＡ法プラプラスミドて、大腸菌 に一１２１１株ＭＭ２９４　（ＡＴＣＣ３３６２５）中において増殖させた。ブ ルースクリプト（ＫＳ）およびブルースクライブ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｂｅ）プラ スミドはストラタジーン・インコーホレーテッドカラ入手シタ。グラスミ）’Ｉ ）ＤＳＲ３（ＡＴＣＣ６８２３２）およびＤＳＲ８（ＡＴＣＣ６８２３４）は、 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能であ る。ヒトに不変部をコードしているプラスミドＨｕＣＫおよびヒトＩ　ｇＧ４不 変部をコードしているプラスミドｐ２４ＢＲＨは、ＡＴＣＣから（それぞれ受託 番号ＡＴＣＣ５９１７３およびＡＴＣＣ５７４１３として）入手した。プラスミ ドベクターｐＵＣ１９およびｐＳＶ、５ｐｏｒｔは、ＢＲＬ／ギブコ（ゲイサー ズバーグ、ＭＤ）製であった。

ＡＴＣＣから入手したＣ０８７細胞（ＡＴＣＣＣＲＨ１６５１）を、１０％ＦＢ Ｓおよび６ｍＭグルタミンを補足したダルベツコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ） ／高グルコース中において増殖させた。ＣＨＯ細胞系ＤＸＢＩＩは、Ｌ、チェイ ンン博士（Ｄｒ、Ｌ、Ｃｈａｓｉｎ）（ロー＝＋ｏンビア大学、ＮＹ、ＮＹ）か ら入手し、そして１０％ＦＢＳ、１６ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ 酸、０．１ｍＭヒボキサンチンおよび０．０１６ｍＭチミジンを補足したハム（ Ｈａｍ′　５）Ｆ１２培地中においてトランスフェクション前に増殖させた。ト ランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、１０に透析ＦＢＳ、１８ｍＭグルタミンお よび選択用の０．１ｍＭ非必須アミノ酸を補足したＤＭＥＭ／高グルコース中に おいて増殖させた。

ヒト生殖系ε転写プロモーターに対して機能的に結合したヒト成長ホルモンリポ ータ−遺伝子を含む組換え体ベクターによって安定に形質転換されたジジョアＤ 　ｉ　ｊｏｙｅ）細胞系（Ｃ１２細胞と称する）および細胞表面上において多量 のヒ１−ＩＬ−４受容体を発現するノジョア細胞系（ＣＪ細胞と称する）は、シ エリング・プラウ・コーポレーション（Ｓｃｈｅｒ　ｉｎｇ−Ｐ］　ｏｕｇｈＣ ｏｒｐｏｒａ　ｔ　１ｏｎ）のチャン・ハシエン博士（Ｄｒ、Ｃｈｕｎｇ−Ｈｅ ｒＪｅｎｈ）から入手した。両方の細胞系を、１５％ウマ血清、５％ＦＢＳ。

６ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、ジエネティシン（ギブコ）ｏ。

５ｍｇ、／ｍｌを含むＲＰＭＴ　（ギブコ）中において増殖させた。特に断らな い限り、組換えＤＮＡ法は、マニアティスら、上記に記載されたように行なった 。

ＰＣＲは、標準的な条件下において行なわれ［サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、５ｃｉ ｅｎｃｅ　２旦０　：　１３５０　（１９８５））、ＰＣＲによって生成された フラグメントの配列は、手動かまたは自動ＤＮＡ配列決定によって確証された。

手動ＤＮＡ配列決定は、ノークエナーゼ（登録商標）（ユナイテッド・ステープ ・バイオケミカル・カンパニー）を用いて、製造者の指示にしたがって行なった 。

自動ＤＮＡ配列決定は、八ＢＩによって提供されたＴａｑポリメラーゼサイクル 配列決定キットを用いるＡＢ！３７３Δ型ＤＮＡシークエンサーにおいて、製造 者の提示にしたがって行なった。プラスミドＤＮＡは、キアジェン（Ｑｉａｇｅ ｎ）カラム（キアンエン・インコーホレーテッド）を用いて製造者の指示にした がって製造した。

抗体ａ度は、１ｇＧ４特異的エリザによって決定された。簡単にいうと、ヌンク ・マキ／ソルダ（Ｎｕｎｃ　ＭＡＸＩＳＯＲＢ）（登録商標）イムノプレートに 、マウス抗ヒトＩｇＧ４　Ｆｃ単ツクローン性抗体５ＱｍＭ重炭酸塩緩衝液、ｐ ｌ−（９，５中に５μｇ／ｍｌで用いて４℃で少なくとも４時間被覆した。プレ ートをブロンキング緩衝液［ダルベツコ修飾リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ；ギブコー ＢＲＬ）中３％ウン血清アルブミン（ＢＳＡ）］中において室温で１時間ブロッ クした。プレートを洗浄緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム、ｐ）（’７．４．０ ０５％トウイージー２０）で洗浄後、精製抗体としてかまたは状態調節培地とし て１００Ｉｌｌ容員の連続希釈試料をプレートのウェルに入れた。

典型的に、人間化抗体を含む状態調節培地を、検定前に遠心濾過（アミコン・イ ンコーホレーテッド）によって１０〜３０倍に濃縮した。プレートを室温で１〜 ２時間インキュベー１−した後、試料を吸引し且つウェルを３回洗浄した。抗ヒ ト１　ｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）ベルオキシダーゼ結合体５０マイクロリットルを各ウェ ルに加え、そしてプレートを室温で１時間インキュベートした。次に、プレート を３回洗浄し、そして免疫複合体を検出するためにＡＢＴＳペルオキシダーゼ基 質（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ）５０μｍを各ウェルに加え た。

プレートを分光光度分析によって４０５ｎｍで読取った。

トランスフェクション 以下に記載の組換え体技体それぞれに関して、重鎮および軽鎖双方のプラスミド ５μｇを、バイオラド・ジーン・パルサー（Ｂｉｏｒａｄ　ＧｅｎｅＰｕｌｓｅ ｒ）を用いるエレクトロポレーションによって全容量２５０μｍ中において５ｘ １０６個のＣＯ３７細胞中にトランスフェクトした。４時間後、培地（Ｄ　Ｍ　 Ｅ　Ｍおよび１０％ＦＢＳ）を、血清を除いたＤＭＥＭに取替えた。細胞を７２ 時間増殖させた後、培地を採取し、遠心分離によって透明にし、そして引き続き 抗体精製するために一２０℃で貯蔵した。多量の人間化抗体を得るために、ｈ２ ５Ｄ２−１またはｈ２５Ｄ２−４と称する抗体を産生ずる組換え体ＣＨＯ細胞系 を樹立した。

安定なＣＨＯ細胞系を単離するために、適当な重鎮および軽鎖プラスミドＤＮＡ ［（ｄｈｆｒ遺伝子を含む）重鎮プラスミド：軽鎖プラスミドのモル比１０：１ ］２０μｇを、リン酸カルシウム沈降法［グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、Ｖｉｒ ｏｌｏｇｙ　５２：４５６　（１９７３）］によって５Ｘ１０’個ＣＨＯＤＸＢ ＩＩ細胞中にトランスフェクトした。２日後、ヒボキサンチンおよびチミジン飢 餓に対する耐性、すなわち、ｄｈｆｒ発現に関して細胞を選択した［シム抗体を 分泌するクローンをエリザによって識別し、増加させ、そしてメトトレキセート 媒介遺伝子増幅を行なった。最大量の抗体を分泌するクローンをローラーボトル 中に増加させ、そして血清不含培地を連続的に採取した。合流したローラーボト ル培養物を血清含有培地中において４８時間増殖させた後、細胞をダルベツコ修 飾ＰＢＳで洗浄し、そして培地を血清不含標品に取替えた。引き続き抗体精製す るために血清不含培地を３〜４日後に採取した。

抗体精製 抗体を含む血清不含状態調節培地を、連鎖球菌性プロティンＧ−セファロース（ 登録商標）ＣＬ−４Ｂ　（ファーマシア）のＭａｂ）ラップ（ＴＲＡＰ）（登録 商標）カラムに通過させ、そして製造者の指示にしたがって抗体を溶離した。最 終抗体濃度を上記のエリザによって決定した。

」叫神よ Ａ、親和定数 人間化抗体がヒトＩ　Ｌ−４を結合することができるかどうかを決定するために 、イムノプレートをマウス抗ヒトＩｇＧ４−Ｆｃ　（捕捉抗体）で被覆し、モし てエリザ検定に関して前記に記載したようにプレートをブロッキングすることに よって見掛の解離定数を決定した。ウェルを洗浄後、人間化抗体の１種類（１０ ０μｍ／ウェル）を含む濃厚状態調節培地と一緒にプレートを室温で２時間イン キュベートした。野生型ラット抗体２５Ｄ２を、比較のために平行して抗ラット ＩｇＧを捕捉抗体として用いて検定した。

ウェルを洗浄し且つ最終容量１００μ！中において４．０００〜２ｐＭ濃度の” ５ｌ−ｈｌＬ−４と一緒にインキュベートした。検定はいずれも三重反復試験で 行ない、そしてバックグラウンド結合は、対照ウェル中において１０００倍モル 過剰の非標識ｈｌＬ４を用いることによって決定された。室温で２時間インキュ ベーション後、ウェルを洗浄し、タンパク質を可溶化緩衝液［領　ＩＮ　ＮａＯ Ｈ／１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１７５μＩ中に可溶化し、そして溶 液をＬＫＢガンマカウンターで計数した。結合および遊離ｈＩＬ４の濃度を決定 し、そしてスキャッチャードプロット分析によって抗体の親和性を決定した［ベ ブレス（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、ニューヨーク、５９５〜６ ４４頁］。

Ｂ、競合的結合分析 野生型ラット抗体２５Ｄ２および人間化抗体による抗原結合の比較を、いずれも 精製された非標識抗体２５Ｄ２、人間化抗体ｈ２５Ｄ２−１または人間化抗体ｈ ２５Ｄ２−４の存在下において、抗体２５Ｄ２で被覆されたプレートに対する標 識ヒ）ＩＬ−４（１２５１−ｈｌＬ−４）の結合が測定されたプレート結合競合 検定を用いて行なった。

イムノソルブプレートを、ＰＢＳ　（１００μｌ／ウエル）中で希釈されたラッ ト２５Ｄ２抗体の溶液６０　ｎ　ｇ／ｍ　１を用いて４℃で少なくとも１６時間 被覆した。次に、ウェルをブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中３％ＢＳＡ）を用いて 室温で４時間ブロックした。２倍連続希釈された競合抗体５０マイクロリツトル および適当量のＩ”ｌ−ｈ　Ｉ　Ｌ−４（全容量５０μｍ）を各ウェルに加え、 そしてプレートを室温で１６〜２４時間インキュベートした。プレートを、リン 酸カリウム、ｐＨ７，４および０．０５％トウィーン２０で３回洗浄した。ウェ ルを吸引乾燥させ、そして可溶化緩衝液（０，ＩＮ　ＮａＯＨ／１％５ＤＳ）７ ５μｌを各ウェルに加え且つ室温で３０分間インキュベートした。溶液を各ウェ ルから取出し且つＬＫＢガンマカウンターで計数した。

受容体結合の阻害 人間化抗体を、微量滴定プレート中においてジジョアＣＪ細胞で発現された組換 え体ヒトＩＬ−４受容体に対する放射性標識されたｈｌＬ−４の結合を阻害する 能力に関して検定した。簡単にいうと、人間化抗体を、細胞増殖培地中において タンパク質屋度８．６ｎＭ〜４ｐＭで連続希釈した。ラット抗体２５Ｄ２を同　 ・様に希釈し且つ陽性対照として用いた。次に、ジジョアＣＪ細胞（細胞１０’ 個）および４４ｐＭ　”５ｌ−ｈＩＬ−４を各ウェルに加え（最終容量２００μ ｌ／ウエル）、プレートを４℃で２時間インキュベートした。

インキュベーション後、ウェルの内容物を混合し、１８５μｌを取出し、モして スクロースクッション（増殖培地および０．０２％アジアジ化ナトリウム中スク ロース１５０μｍ）上に重層した。遠心分離（１５００ｒｐｍ、４℃、１０分間 ）後、試験管を液体窒素中において急速冷凍し、そして細胞ペレットが入ってい る試験管底部を削り取り且つガンマカウンターで計数した。結合ｃｐｍを抗体濃 度に対してプロットし、そして受容体結合の５０％阻害を引起こすのに必要な濃 度（ＩＣ，。）で人間化抗体を天然抗体と比較した。

生殖系イブンロンプロモーター受容体遺伝子検定ジジョアＣＩ２細胞を、培地中 の細胞密度４ｘｌＯ’個／１２５μｌ／ウェルで９６ウ工ル皿中に播種した。連 続希釈された試験抗体およびｈ　Ｉ　Ｌ−４の１ｎｇ／ｍＬを細胞に加え、そし てプレートを３７℃で約６４時間インキュベートした。インキュベーション後、 状態調節培地１００μｍを各ウェルから取出し、そして炭酸ナトリウム緩衝液、 ｐＨ９，５中において１　：　２０００希釈のヤギ抗ヒト成長ホルモン（αｈＧ Ｈ）で予め被覆されたイムノプレートの個々のウェルに対して加えた。プレート を室温で２時間インキュベートし、そして０．０５％トウイージー２０含有１０ ｍＭリン酸カリウム緩衝液で５回洗浄した。（１：　１０００希釈の）ウサギａ ｈＧＨの１００マイクロリツトルを各ウェルに加え、そしてインキュベーション を１時間続けた。

ウェルを上記のように再開洗浄し、そして（１：　１０，０００希釈の）西洋ワ サビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ１００μｌを各ウェルに加えた。

洗浄後、免疫複合体の検出のために、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質５０μｍを ウェルに加えた。プレートを分光光度分析によって４０５ｎｍで読取った＠４０ ５ｎｍでの光学濃度（０，Ｄ）を抗体濃度に対してプロットし、そして生殖系ε プロモーターの制御下においてヒト成長ホルモンの発現の５０％阻害を引起こす のに必要な濃度（ＩＣ５ｏ）で人間化抗体を天然抗体と比較した。

上記の方法を用いて、抗体ＬＡＹが最適ヒトフレームワーク候補であることが確 認された。ＬＡＹ重鎖および軽鎖対を最初に追跡した。

フレームワーク配列中に移植しうる可能な最小および最大２５Ｄ２残基のリスト は、上記方法により、表３に示された通りであることが確認された。

Ｖ）最小リスト：２８．３０．３１，３２，５３，５４，５６，１００゜１０１ ．１０３．１０５，１０６，１０７Ｖド最大リストｂ：３３．３５，５０，５１ ，５２，５７，５８゜５９．６１，６５，１０９．１１０ Ｖ、最小リスト；２９．３０．　３１．　５０．　５２．　９１．　９４■Ｌ最 大リスト”：２４．　３４．　４６．　４９．　５３．　５４．　５６“　ＶＩ ＩおよびＶＬに関する残基は、それぞれ配列番号１および配列番号２における残 基数を意味する。

ｂ　ｙ、およびＶＬ最大リストは、対応する最小リストおよび更に別の表示され た残基を含む。

下記に記載の特異的構築物は、前述の表による以下の残基を含む。

ｈ２５Ｄ２Ｈ−１，Ｌ　ＶＩＩＬＡＹ最大、　ＶＬＬＡＹ最大ｈ２５Ｄ２Ｈ−１ ，Ｌ−Ｉ　Ｖ、ＬＡＹ最大＋　ＶＬＬＡ’ｌ大（より小さい残基 ４６および４９） ｈ２５Ｄ２Ｈ−２，Ｌ−１，Ｖ、ＬＡＹ最大＋　ＶＬＬＡＹ最大（より小さい残 基　（より小さい残基 ３３および３５）　４６および４９） ｈ２５Ｄ２Ｈ−３，Ｌ（Ｖ、ＬＡＹ最大：　ＶＬＬＡＹ最大（より小さい残基　 （より小さい残基 ２８および３０）　４６および４９） ｈ２５Ｄ２Ｈ４，Ｌ　Ｉ　ＶＨＬＡＹ最大、　ＶＬＬＡＹ最大（より小さい残基 　（より小さい残基 ２８．３０および６５）　４６および４９）ｈ２５Ｄ２Ｈ−５，Ｌ−Ｉ　Ｖ、Ｌ ＡＹ最大、　ＶＬＬＡＹ最大（より小さい残基　（より小さい残基 ３３．３５および６５）　４６および４９）（５′〜３′までの）１５個の５′ 非コーデイング塩基と、開始メチオニン残基、リーダー配列および抗体の可変部 をコードしている塩基とを含む人間化２５Ｄ２軽鎖（ｈ２５Ｄ２Ｌ）の最初の変 異型に関するＤＮＡのヌクレオチド配列は、該リーダーおよび該抗体の対応する アミノ酸配列と一緒に、配列表において配列番号　１６として定義される。

この人間化軽鎖の構築において、サイレント制限エンドヌクレアーゼ切断部位は 、ジエネティクス・コンピューター・グループ（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔ ｅｒ　Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ；マディラン、Ｗｌ）サイレント・マツプ（ＳＩＬ ＥＮＴ　ＭＡＰ）（登録商標）プログラムから推定された。タンパク質配列をコ ードするように選択されたヌクレオチド配列は、ラット２５Ｄ２配列中で見出さ れたコドンを利用したが、いくつかのコドンは、制限エンドヌクレアーゼ切断部 位を生成するように変更された。

抗体の可変部全部を、オリゴヌクレオチド対として合成された３個の隣接するＤ ＮＡフラグメントとしてクローン化した。これらのオリゴヌクレオチド対をＰＣ Ｒによって増幅させ、そして独特の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に結合した 。結果は、ＥｃｏＲＩ／Ｋｐｎ　Ｉ　（フラグメント１）　、Ｋｐｎ　Ｉ／Ｐｓ 　ｔ　１（フラグメント２）およびＰｓ　ｔ　Ｉ／Ｍｓｃ　ｒ　（フラグメント ３）部位によって輪郭が描かれる（５′　〜３′まで番号を付けた）３種類のフ ラグメントであった。

増幅反応において、各対の二つのオリゴヌクレオチドは、１８〜２４ヌクレオチ ドの伸長にわたって互いに相補的であった。したがって、それぞれのオリゴヌク レオチドはもう一方の鋳型としても役立った。

これらのオリゴヌクレオチドブライマーの呼称は、括弧内に対応する配列番号を 伴って以下の通りであった。

２４８１　（配列番号＝１７） ２４８２　（配列番号：１８） ２７００　（配列番号：１９） ２６４１　（配列番号：２０） ２４８３　（、配列番号：２１） ２４９１　（配列番号＝２２） ２６６２　（配列番号・２３） ２６６１　（配列番号：２４） フラグメント１の合成は、２回のＰＣＲ増幅を必要とした。プライマー２４８１ および２４８２を用いる最初のＰＣＲは、翻訳開始配列およびリーダーペプチド コーディング配列を欠いているフラグメントを生じた。このフラグメントを、プ ライマー２７００および２６４１を用いて再度増幅させて、翻訳開始およびリー ダーペプチドコーディング配列を伴ったＥｃｏＲ１部位に加えた。したがって、 最終フラグメント１は、その５′末端にのところに、ＥｃｏＲＴ部位に続いて翻 ８８）］に対応するリーダーペプチドをコードしている配列を含んだ。

フラグメント１配列は、Ｋｐｎ１部位によって伸長し且つ人間化軽鎖の可変部の アミノ酸残基１〜３６をコードした。フラグメント２は、５′および３′末端の それぞれＫｐｎｌおよびＰｓｔＩ部位を含む、人間化軽鎖の残基３６〜７９をコ ードした。フラグメント１および２を独特のＫｐｎ１部位において結合させ、そ してベクター中のＥｃｏＲＩおよびＰｓｔ１部位間のブルースクリプト（ＫＳ） ベクター中にサブクローン化してフラグメント１−２を生成した。フラグメント ３は、可変ドメインの残りのアミノ酸（残基７８〜１０６）をコードし且つ（可 変ドメインの３′末端の２２塩基上流に位置する）ＭｓｃＩ部位によってＰｓｔ ■部位から伸長し、そして３′末端にＥｃｏＲ１部位を含んだ。

フラグメント３を、ベクター中のＰｓｔｌおよびＥｃｏＲ１部位間の部位−スク リプト（ＫＳ）ベクター中にサブクローン化した。ヒトに不変部全部に関するコ ーディング配列に対して結合した、Ｍｓｃ１部位を含む人間化可変部の３′末端 にある２２ヌクレオチドを有する３２１ｂｐフラグメントは、鋳型としてのＨｕ ＣＫプラスミドと、配列がそれぞれ配列番号２５および配列番号２６として定義 されているプライマー２８５６および２８５７とを用いるＰＣＨによって生じた 。フラグメント４の５′末端のＭｓｃ■部位の他に、クローニングを容易にする ようにＥｃｏＲ１部位が３′末端に含まれた。

フラグメント４を、可変部中の共通ＭｓｃＩ部位と、フラグメント４の３′末端 およびベクター上に存在するＥｃｏＲＩ部位との間のフラグメント３に対して結 合した。ＥｃｏＲＶ部位は、ベクター中のフラグメント３−４の下流に存在した 。フラグメント３−４をＰｓ　ｔ　Ｉ／ＥｃｏＲＶフラグメントとして除去し、 そして可変部中の共通Ｐｓｔ１部位と、ベクター中のプラント末端Ｓｍａ　１部 位との間のフラグメント１−２に対して連結した。ｈ２５Ｄ２Ｌ軽鎖の完全なコ ーディング領域は、ブルースクリプトベクター中のコーディング領域に隣接した ５ａｌＩおよびＢａｍＨ１部位での切断後に得ることができた。

哺乳動物発現ベクターは、３′末端にｈ２５Ｄ２Ｌ配列を有するブルースクリプ トベクターをＢａｍＨＩによって最初に切断した後、平滑末端を残す条件下にお いて切断生成物をフレノウフラグメントＤＮＡポリメラーゼで処理することによ って構築された。次に、ｈ２５Ｄ２Ｌ　ＤＮＡフラグメントを、５ａｌＩによる ５′末端での切断後に得た。最後に、ｈ２５Ｄ２Ｌコーディング領域を、５ａＩ ＩおよびＳｍａ　Ｉによって予め消化されたベクターｐＤＳＲ８に対して連結し た。ｐ　Ｓ　Ｄ　ｈ　２５　Ｌと称する完成されたベクターは、シグナルペプチ ドを含む人間化２５Ｄ２抗体に関する全コーディング領域およびヒトに不変部を 含んだ。

前述のｈ２５Ｄ２Ｌ　ＤＮＡと重鎖ＤＮＡ　（ｈ２５ｄ２ｈ−１と称する。以下 に記載されたように製造された）とのＣＯ３７細胞中への共トランスフェクショ ンは、測定しうる抗体発現を生じなかったが、ｈ２５Ｄ２Ｌ　ＤＮＡを無関係の 抗体からの人間化重鎮のＤＮＡと共トランスフェクトした場合に抗体発現が観察 された（データは示されていない）。

ｈ２５Ｄ２Ｌ軽鎖は無関係の重鎮によって発現されることができたので、人間化 ２５Ｄ２軽鎖かまたは人間化重鎮の配列がｈ２５Ｄ２抗体発現を阻害したと考え られた。

２５Ｄ２分子模型のＦｖ界面の実験は、ヒトＬＡＹ残基ロイシン４６およびチロ シン４９の、動物残基フェニルアラニン４６およびフェニルアラニン４９による 置換が、重鎮と結合するｈ２５Ｄ２Ｌの能力に影響を与えることがあることを示 唆した。更に、スイス・プロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）タンパク質データベ ース（パイロソチ（Ｂａ　ｉ　ｒｏｃｈ）　、アモス（Ａｍｏｓ））におけるヒ トに鎖可変部配列の比較は、４６位アミノ酸のロイシンおよび４９位アミノ酸の チロノンが高度に保存されたことを示した。したがって、前述の人間化軽鎖遺伝 子は、これらの位置で突然変異を導くように再構築された。更に、ｈ２５Ｄ２Ｌ 　ＤＮＡにおいて抜けていた１０７位のアルギニン残基を置換した。

ｈ２５Ｄ２Ｌ　ＤＮＡを修飾するために、２対のオリゴヌクレオチドブライマー を合成して、ｈ２５Ｄ２Ｌコーディング領域のＰＣＲに基く突然変異誘発を行な った。５′プライマーとして用いられたプライマー３０１６　（配列番号：２８ ）は、軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基３８〜５１のコーディング領域を包含し 且つ５′末端に５ｔｕ１部位を含んでいた。更に、プライマー３０１６は、３種 類のヌクレオチド変更をｈ２５Ｄ２Ｌ配列中に組入れた。この結果、アミノ酸配 列の４６位のフェニルアラニン残基とロイシン残基との置換（Ｆ　４６　Ｌ）並 びに４９位のフェニルアラニン残基と４９位のチロシンコドンとの置換（Ｆ４９ Ｙ）が生じた。３０１７　（配列番号：２９）と称する３′プライマーは、２３ ７位にＰｓｔ１部位を包含した。

１２６ｂｐフラグメントは、オリゴヌクレオチドブライマー３０１６および３０ １７並びに鋳型ＤＮＡとしてのｈ２５Ｄ２Ｌブルースクリプトプラスミドを用い るＰＣＲによって生成された。５ｔｕｌ／ＰｓｔＩ　ＰＣＲフラグメントを用い て、ベクターｈ２５Ｄ２Ｌ中の対応するフラグメントを置換し、それによってＦ ４６Ｌ、Ｆ４９Ｙ変更を組入れた。

Ｍｓｃ１部位を５′末端に含む軽鎖可変部のアミノ酸残基９５〜１０６と、ヒト に不変部の最初の３残基とを包含した３０１８（５’　プライマーとして用いら れた：配列番号：３０）と称するオリゴヌクレオチドブライマーを合成した。更 に、アルギニンのコドン（Ｒ１０７）を、プライマー中の可変部および不変部の 結合部に挿入した。３０１９　（配列番号：３１）と称するもう一つのプライマ ーを、３′プライマーとして役立つように合成した。このプライマーは、Ｂａｍ ＨＩおよびＳｐｅ１部位を含むブルースクリプトベクター中の配列に対応した。

プライマー３０１８および３０１９並びに鋳型としてのｈ２５Ｄ２Ｌブルースク リプトプラスミドを用いて、可変ドメインの残基９５〜１０７およびヒトに鎖の 完全なコーディング領域を含んだフラグメントをＰＣＲによって生成した。この Ｍｓｃｌ／５ｐｅｌ　ＰＣＲフラグメントを用いて、上記のＦ４６Ｌ、Ｆ４９Ｙ ベクター中の対応するフラグメントを置換した。ＰＣＲフラグメントのＤＮＡ配 列を確証した後、ベクターをＳｐｅ　Ｉで消化し且つ平滑末端付き末端を生じる 条件下においてフレノウフラグメントＤＮＡポリメラーゼで処理した。人間化抗 体軽鎖ｈ２５Ｄ２Ｌ−１の完全なコーディング領域を含むフラグメントをＳａｌ ■消化ｉ＆に単離し、そして５ａｌｌおよびＳｍａＩで予め消化されたｐＤＳＲ Ｓベクターに対して連結させた。Ｆ４６ＬＳＦ４９ＹおよびＲ１０７を含む得ら れたｈ２５Ｄ２Ｌ−１発現ベクターを図４に図示する。

（５′　〜３′までの）１５個の５′非コーデイング塩基と、開始メチオニン残 基、リーダー配列および抗体の可変部をコードしている塩基とを含む人間化２５ Ｄ２軽鎖の修飾された変異型に関するＤＮＡのヌクレオチド配列は、該リーダー および該抗体の対応するアミノ酸配列と一緒に、配列表において配列番号：２７ として定義される。

（５゛　〜３′までの）１５個の５′非コーデイング塩基と、開始メチオニン残 基、リーダー配列および抗体の可変部をコードしている塩基とを含む人間化２５ Ｄ２重鎮の最初の変異型に関するＤＮＡのヌクレオチド配列は、該リーダーおよ び該抗体の対応するアミノ酸配列と一緒に、配列表において配列番号：３２とし て定義される。シグナルペプチドを含む、タンパク質配列をコードするように選 択されたヌクレオチド配列は、ラット２５Ｄ２配列中で見出されたコドンを利用 したが、いくつかのコドンは、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を生成するよう に変更された。

可変部全部を、オリゴヌクレオチド対として合成された３種類の隣接するＤＮＡ フラグメントとしてクローン化した。これらのオリゴヌクレオチド対をＰＣＨに よって増幅させ、そして独特の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に結合した。

結果は、Ｓａ　Ｉ　Ｉ／Ｓｍａ　Ｉ　（フラグメント１）　、Ｓｍａ　Ｉ／Ｐｓ 　ｔ　Ｉ　（フラグメント２）およびＰｓ　ｔ　Ｉ／Ａｐａ　Ｉ　（フラグメン ト３）部位によって輪郭が描かれる（５′〜３′まで番号を付けた）３種類のフ ラグメントであった。増幅反応において、各対の二つのオリゴヌクレオチドは、 １８〜２４ヌクレオチドの伸長にわたって互いに相補的であった。したがって、 それぞれのオリゴヌクレオチドはもう一方の鋳型としても役立った。

これらのオリゴヌクレオチドブライマーの呼称およびそれらの配列を定義する対 応する配列番号は以下の通りであった。

オリゴヌクレオチド　配列番号 フラグメント１の合成は、２回のＰＣＲ増幅を必要とした。プライマー２５８８ および２５９９の最初のＰＣＲ生成物を、オリゴヌクレオチド２２３２および２ ４４５による２回目の増幅に供して、フラグメント１を生成した。したがって、 最終フラグメント１は、その５′末端にのところに、５ａｉｌ部位に続いて翻訳 開始配列（コダノク、上記）および抗キャンパスー１抗体（ライヒマン、上記） に対応するリーダーペプチドをコードしている配列を含んだ。フラグメント１配 列は、Ｓｍａ　１部位によって伸長し且つ人間化重鎮の可変部のアミノ酸残基１ 〜４２のコーディング配列を含んだ。

フラグメント２は、５′および３′末端のそれぞれＳｍａ　ＩおよびＰｓｔ１部 位を含む人間化重鎮の残基４２〜８２をコードした。フラグメント１および２を 独特のＳｍａ　１部位において結合させ、そしてベクター中の５ａｉｌおよびＰ ｓｔＴ部位間のブルースクリプト（ＫＳ）ベクター中にサブクローン化してプラ スミドｐＢｓ１−２を生成した。

フラグメント３は、可変ドメインの残りのアミノ酸（残基８１〜１２１）をコー ドし且つ可変部の３′末端によっておよびヒト１ｇＧ４不変部のコーディング配 列の３０個のヌクレオチドによってＰｓｔＴ部位から伸長した。独特のＡｐａ■ 部位は、フラグメント３におけるＴｇＧ４不変配列の１６個のヌクレオチド中に 位置した。フラグメント３の合成も、２回の増幅反応を必要とした。プライマー ２５２３および２５８０の最初のＰＣＲ生成物を、プライマー２６４２および２ ６４６による２回目の増幅に供して、フラグメント３を生成した。

最初の重鎖発現ベクターを製造するために、プラスミドｐ　２４　ＢＲＨをＡｐ ａ■およびＳａｃ　Ｉによって切断し、そして１ｇＧ４ゲノムＤＮＡを有するＡ ｐａ！／５ａｃｌフラグメントを単離した。フラグメント３を、プラスミドｐ２ ４ＢＲＨから単離されたフラグメント上の共通Ａｐａ１部位に対して連結させた 。次に、得られた（完全なＩｇＧ４不変部不変−ドしている１ｇＧ４　ＤＮＡに 対して結合したｈ２５Ｄ２Ｈ−１可変部の残基８１〜１２１を包含する）Ｐｓｔ ｌ／Ｓａｃ　Ｉフラグメントを、ＰｓｔＴおよび５ａｃｌによって予め切断され たブルースクライブプラスミドに対して連結して、ｐＡＳ６と称するプラスミド を生じｔ二。

次に、１ｇＧ４ゲノムＤＮＡをｃＤＮＡと！換した。最初に、ｐＳＶ、Ｓｐ。

ｒｔベクターのＰｓｔＩおよびＮｏｔ１部位間に挿入された１ｇＧ４　ｃＤＮＡ を含むプラスミドを、ｃＤＮＡの上流のベクター中のＰｓｔ１部位でおよびＩｇ ＧＪ　ｃＤＮＡ中のＢｓ　ｔＥｌ　１部位で切断した。このプラスミドは以下の ように構築された。

無関係の人間化抗体の完全な重鎮可変部（Ｖ、）に対応するオリゴヌクレオチド ブライマーは、標準法によって合成された。これらのオリゴヌクレオチドの呼称 およびそれらの配列を定義する対応する配列番号は下記の通りであった。

オリゴヌクレオチド　配列番号 Ｂ２４７４ＣＣ４３ Ｂ２４１９ＣＣ４４ Ｂ２４２０ＣＣ４５ Ｂ２４７５ＣＣ４６ Ｂ２４７７ＣＣ４７ Ｂ２４７９ＣＣ４８ 対のオリゴヌクレオチドＢ２４７４ＣＣおよびＢ２４１９ＣＣと、Ｂ２４２０Ｃ ＣおよびＢ２４７５ＣＣと、Ｂ２４７７ＣＣおよびＢ２４７９ＣＣとを、熱変性 させ、アニールし、モしてＴａｑポリメラーゼまたはＰｆｕ　（ストラタジーン 、ラホヤ、ＣＡ）と−緒にインキュベートした。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）において、各対の二つのオリゴヌクレオチドは、約２４〜３０個のヌクレオチ ドによって互いに相補的であった。したがって、それぞれのオリゴヌクレオチド はもう一方の鋳型として役立った。

ＰＣＲは、１８サイクル実施した後、Ｖ、１、Ｖ□２およびＶｕ３と称する３種 類のＶｕの逐次的セグメントに対応する３種類の得られたＤＮＡフラグメントを 、アガロースゲル中で電気泳動させ且つ電気溶出によって精製した。

３種類のＶ、ＤＮＡフラグメントの相対順序、クローニングのための制限部位お よび用いられたクローニングベクターｐＳＶ、５ｐｏｒｔのマルチクローニング 部位地図は以下の通りであった。

ｐＳＶ、５ｐｏｒｔのマルチクローニング部位ＰＨＩＩにｐｎ　ＵＲｚｒＥＩＩ Ｅｃ　ｏＲＩＩＳｍｔｓ　ＩｔｓａｌＵＳｓＩＩ／Ｓｐｇ　ＩＩＮｔｓｌＬＩＸ ｂａ　ＩＩＢ　ａｍ　ＨＩfＨ（ｎｄｌｌＵｓｓａ　Ｂ　Ｉ／Ｍｌｕｌフラグメ ントＶ、１を酵素ＥｃｏＲ１および５ｐｅｌで制限し且つベクターｐＳＶ、５ｐ ｏｒｔ中にクローン化した。次に、フラグメントＶＭ２を、Ｓｐｅ　ＴおよびＸ ｂａ１部位での方向性挿入によってｐＳＶ、５ｐｏｒｔ中のＶＨＩに対して結合 した。フラグメント■Ｍ３を、ＥｃｏＲＩ／Ｘｂａ　ｌ−５ａ　Ｉ　Ｉ／Ａｐａ ｌ／５ｓｔｒフラグメントとしてｐＳＶ、５ｐｏｒｔ中に別個にクローン化した 。３種類のフラグメントをＤＮＡ配列決定によって実証した。

無関係の抗体の完全長さのＶＨｃＤＮＡは、下記に更に十分に記載されるように 、■、３をγ４　Ｈ鎖不変部（Ｃ，）のゲノムＤＮＡに対して結合した後、ｖＩ Ｉ３−ｃ、フラグメントをＶＨＩ−Ｖ、２フラグメントに対して結合することに よって組み立てられた。

重鎮の合成および分泌を促進するために、リーダーペプチドのコーディング配列 をＤＮＡ中に挿入した。このリーダーのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、抗 キャンパスー１抗体（ライヒマンら、上記）のリーダーのものであった。

完全長さの抗体Ｈ鎖をコードしているＤＮＡを構築するために、Ａｐａｌ制限切 断および連結を用いて、ＶＤ合合成ＤＮＡをヒトγ４不変部ゲノムＤＮＡ　（Ａ ＴＣＣ５７４１３）と結合させた。この手順は、ＶＨ２を含むプラスミドｐＳＶ 。

５ｐｏｒｔをＮｏｔｌで消化した後、フレノウＤＮＡホリラーゼ（ペーリンガー ・マンハイム）で処理してプラント末端を生じることによって開始された。得ら れたＤＮＡをエタノール沈殿さ上回懸濁さ也そしてＡｐａｌで消化した。

この制限プラスミドＤＮＡを、ゲノムγ４不変部のＡｐａｌ／５ｊａｌルミｌ／ ５ｊａｌ制限フラグメ ント、Ｖ、３−ＣＭ’７’ツムＤＮＡをＸｂａ　Ｉ／Ｈｉｎｄ　Ｉ　ｒ　Ｉフラ グメントとして切取り且つＶＨｌ−Ｖｅ２を既に含んでいるｐＳＶ、５ｐｏｒｔ 中に挿入し、それによって完全長さの重鎮ＤＮＡの組み立てを完了した。

次の操作において、ヒトγ４不変部ｃＤＮＡをゲノムＤＮＡに置換えるよう１こ 設計し且つ構築した。これは、標準法によって合成された６種類のオリゴヌクレ オチドＰＣＲプライマーを用いて達成された。これらのオリゴヌクレオチドの呼 称およびそれらの配列を定義する対応する配列番号は以下の通りであった。

オリゴヌクレオチド　配列番号 ８２４９１ＣＣ４９ ８２４９８ＣＣ５０ Ｂ２４９９ＣＣ５１ Ｂ２５９７ＣＣ５２ ８２５９８ＣＣ５３ ８２６５６ＣＣ５４ プライマーＢ２４９１ＣＣ，Ｂ２４９９ＣＣおよびＢ２５９８ＣＣは、γ４不変 部ｃＤＮＡのプラス鎖に対応した。プライマーＢ２４９８ＣＣＳＢ２５９７ＣＣ およびＢ２６５６ＣＣはマイナス鎖に対応した。ヒトγ４ゲノムＤＮＡを鋳型と して用いて、完全なγ４不変部コーディングｃＤＮＡを包含する３種類の逐次的 二本鎖ＤＮＡフラグメントをＰＣＲによって生成した。

３種類のＣｇ　ＤＮＡセグメント、クローニングのための制限部位および用いら れたプライマーは以下の通りであった。

セグメントＡを、５ａｌｌ／ＥｃｏＲＩ制限フラグメントとしてｐＵｃ１９中に クローン化した。セグメントＣをＳａｌ　Ｉ／Ｘｈｏｌ−Ｎｏｔ　Ｉ制限フラグ メントとしてｐＳＶ、５ｐｏｒｔ中にクローン化した。ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ　Ｉ ／５ａｌＩフラグメントとしてセグメントＢを、既にセグメントＣを含んでいる ｐＳＶ、５ｐｏｒｔ中にクローン化した。３種類全部のセグメントをＤＮＡ配列 決定によって実証した。

γ４　ｃＤＮＡは、セグメントＡをＰｓｔｌおよびＥｃｏＲＩによって切取り且 つこのフラグメントを、既にセグメントＢおよびＣを含んでいるｐＳＶ、５ｐｏ ｒｔ中にクローン化することによって組み立てられた。ヒトγ４　ＣＭ　ｃＤＮ Ａの制限地図およびｐＳＶ、５ｐｏｒｔマルチクロ一ニング部位におけるその相 対位置は以下の通りである。

７４　ＣＨｃＤＮＡを５ａｌｌ−−−Ｈ４ｎｄＩＩＩフラグメントとして切取り 、前記の完全長さのＨ鎖構築物中のゲノムγ４フラグメントに置換えた。最終生 成物１′１、前記のように切断されたｐｓＶｓＰＯＲＴ−１ベクターであった。

次に、プラスミドｐＡＳ６をＰｓｔｌによって直線状にし、そしてＩ　ｇＧ４配 列の範囲内でＢｓ　ｔＥＩ　Ｉによって部分的に消化した。Ｐｓｔ１部位（アミ ノ酸残基８１〜１２１）および１ｇＧ４　ｃＤＮＡからＢｓｔＥ１１部位（残基 １２２〜１９１）までの可変部のコーディング配列のセグメントを含むフラグメ ントを単離し、そして１ｇＧ４　ｃＤＮＡを含むｐＳＶ、５ｐｏｒｔ中のＰｓｔ ｌおよびＢｓｔＥ１１部位間にサブクローン化した。ｐＡＳ７と称する構築物は 、５′　Ｐｓｔ１部位および３’Ｘｂａ１部位に隣接した完全な１ｇＧ４　ｃＤ ＮＡに対して結合した可変部の残基８１〜１２を包含した。

プラスミドｐＡＳ７をＰｓｔｌおよびＸｂａｌによって切断し、そして（可変部 およびＩｇＧ４不変部ｃＤＮＡの残基８１〜１２１を含む）フラグメントを、（ フラグメント１−２を含む）ベクターｐＢｓ１−２中のＰｓｔｌおよびＸｂａ１ 部位間にサブクローン化した。次に、ｐＤＡ５と称するこのベクターを５ａｃＩ によって直線状にし、そして平滑末端を残す条件下において７４　ＤＮＡポリメ ラーゼで処理した。ｈ２５Ｄ２Ｈ−１重鎖の完全なコーディング領域を５ａｔＩ 消化後に単離し、そして５ａｌｌおよびＳｍａ　Ｉによって予め切断されたベク ターｐＳＲ３に対して連結した。ｐＳｈ２５Ｄ２Ｈ−１と称する最終プラスミド を図５に図示する。

ｈ２５Ｄ２Ｈ−１重鎖の４種類の変異型（ｈ２５Ｄ２〜２〜ｈ２５Ｄ２−５と称 する）を構築した。４種類の変異型中に組込まれたアミノ酸変化を図６に示して おり、そこにおいてアミノ酸残基は標準的な一文字略語を用いて示され、そして 抗体２５Ｄ２のＣＤＲ１，２および３の範囲内の配列並びに変異型は、抗体ＬＡ Ｙの配列と並べられている。示されていない残基は、抗体ＬＡＹ中の対応する位 置のものであった。

更に別の重鎮変異型はいずれも、プラスミドｐＤＡ５からのＤＮＡ制限エンドヌ クレアーゼフラグメントを、望ましい突然変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチド カセットに置換えることによって構築された。それぞれのカセットにおいて、タ ンパク質配列をコードするように選択されたヌクレオチド配列は、若干のコドン がアミノ酸変更を組込み且つ陽性の形質転換細胞の選択に関する独特の制限エン ドヌクレアーゼ切断を更に導入するように変更されたことを除き、元の変型にお いて用いられたコドンを維持した。

ｈ２５Ｄ２Ｈ−２を構築するために、「サイレントＪＮｈｅＩ部位を有する３１ １２（配列番号：５５）および３１１６　（配列番号：５６）と称するオリゴヌ クレオチドを含むオリゴヌクレオチドカセットを用いて、ｐＤＡ５中のＢａｍＨ １／Ｓｍａｌ　ＤＮＡフラグメントを置換し、新規のプラスミドをｐＫＭ２１と 称した。ｈ２５Ｄ２Ｈ−３を生成するために、ｐＫＭ２１のＤＮＡをＮｈｅｌお よびＳｍａ　Ｉで切断してＣＤＲＩを解放した。次に、このＮｈｅｌ／Ｓｍａｌ ＣＤＲＩ　ＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチド３１１７　（配列番号： ５７）および３１１８　（配列番号：５８）を含むオリゴヌクレオチドカセット で置換して、ｈ２５Ｄ２Ｈ−３配列を含むｐＫＭ２３を生成した。

ベクターｐＫＭ２１およびｐＫＭ２３を５ａｌｌおよびＳｍａ　Ｉで切断し、そ して変更されたＣＤＲＩ配列を含むフラグメントを単離し且つ引き続き用いて、 ベクターｐＳｈ２５Ｈ−１中の対応するＣＤＲＩ　ＤＮＡフラグメントを置換し た。ｈ２５Ｄ２Ｈ−２およびｈ２５Ｄ２Ｈ−３重鎖をコードしている得られた発 現ベクターをそれぞれｐＳｈ２５Ｈ−２およびｐＳｈ２５Ｈ−３と称した。

ｈ２５Ｄ２Ｈ−４コーディング配列を構築するために、プラスミドｐＫＭ２３を ＭｓｃｒおよびＰｓｔｌによって切断して、ＣＤＲ２を包含するＤＮＡフラグメ ントを解放した。同様に、プラスミドｐＫＭ２１をＭｓｃｌおよびＰｓｔｌによ って製造して、ｈ２５Ｄ２Ｈ−５コーディング配列を構築した。変更されたＣＤ Ｒ２を包含するオリゴヌクレオチド３１１９　（配列番号：５９）および３１２ ０（配列番号：６０）を含むオリゴヌクレオチドカセットを、両方のプラスミド 中のＭｓｃｌおよびＰｓｔ１間に挿入して、ｈ２５Ｄ２Ｈ−４およびｈ２５Ｄ２ Ｈ−５をそれぞれ生成した。

得られたプラスミドを５ａｃｌによって消化し、そして平滑末端を残す条件下に おいて７４　ＤＮＡポリメラーゼで処理した。ｈ２５Ｄ２Ｈ−４およびｈ２５Ｄ ２Ｈ−５重鎖のコーディング領域を５ａｌｌ切断後に単離し、そして５ａｌｔお よびＳｍａ　Ｉによって予め消化されたベクターｐＳＲ５中にサブクローン化し た。最終ベクターを、それぞれｐＳｈ２５Ｈ−４およびｐＳｈ２５Ｈ−５と称し た。

人間化抗体の発現および精製 人間化抗体ＤＮＡ全部を、エレクトロポレーションによってＣＯ３７細胞中にト ランスフェクトし、そしてトランスフェクションの４時間後に、培地を血清不含 培地に取替えた。細胞を血清不含培地中において３日間増殖させた後、培地を採 取した。多量の人間化抗体を得るために、ｈ２５Ｄ２−１およびｈ２５Ｄ２−４ 抗体を産生した安定なＣＨＯ細胞系を衝立した。

適当な重鎮プラスミド（それぞれｐＳｈ２５Ｈ−１およびｐＳｈ２５Ｈ−４）を 、ｐＫＭ２０軽鎖プラスミドと１０＝１の比率でＣ）（ＯＤＸＢＩＩ細胞中に共 トランスフェクトさせた。ヒボキサンチンおよびチミジン飢餓に対する耐性に関 して選択された約４０クローンの内、５０％を越えるものがヒトＩｇＧ４エリザ 検定におけるｈ２５Ｄ２−１抗体発現に関して陽性と検査された。

最大量の抗体ｈ２５Ｄ２−１を生産するクローンの１２種類を、メトトレキセー ト媒介ＤＮＡ増幅に供した。これらのクローンの内の（ｈ２５Ｄ２−１＃１、＃ ７、＃１５、＃１７、＃１８および＃２１と称する）６種類を、１００〜２５０ ｎＭメトトレキセートの存在下の増殖に関して選択した。これらのクローンによ って発現された抗体濃度は、エリザに基いて約２００〜７００ｎｇ／１０’個細 胞／日であると推定された。クローン＃１７クローンをローラーボトル中に増加 させて、精製および特性決定のための多量のｈ２５Ｄ２−１抗体を得た。

ｈ２５Ｄ２−４プラスミドを用いてトランスフェクトされた約４０クローンを、 更に、ヒボキサンチンおよびチミジン飢餓に対する耐性に関して選択した。これ らのクローンの約３０％が、ヒトＩｇＧ４エリザ検定における抗体発現に関して 陽性と検査された。陽性クローンを５ｎＭメトトレキセート存在下で増殖させた 。

ｈ２５Ｄ２−４クローンの内の（知−ン＃７Ａと称する）１種類の抗体濃度は、 １ｇＧ４エリザによって約５０〜１１００ｎ／１０’個細胞／日であると推定さ れた。この知−ンをローラーボトル培養中に増加させて、精製および特性決定の ための多量のｈ２５Ｄ２−４抗体を製造した。

ローラーボトル培養中のＣＨＯ細胞クローンによって産生された抗体を含む血清 不含状態調節培地を上記のように連続的に採取した。状態調節培地中の抗体を、 プロティンＧ−セファロース（登録商ｌｌ１ｌ）クロマトグラフィーによって部 分的に精製した。５ＤＳ−ＰＡＧＥの還元による抗体の分析は、高純度（少なく とも約９０％）を示した。一連のエリザ検定による抗体の分析は、それらがヒト におよびγ４不変部双方を含むことを示した。

実施例Ｘ、抗体特性決定 親和定数 人間化重鎮遺伝子の５種類の変異体全部を別個に、ｐＫ２０軽鎖ベクターを用い てＣＯ３７細胞中に共トランスフェクトさせた。血清不含状態調節培地を７２時 間後に採取し且つ濃縮した。親和定数は、上記のように、表５に示された結果を 用いて決定された。

表呈 抗体　原料＊　被覆用抗体　見掛のＫｄｈ２５Ｄ２−Ｉ　ＣＣ０３Ｃａ　ｈＩｇ Ｇ４　Ｆｃ　４ｎＭｈ２５Ｄ２−２　ＣＣ０５Ｃａ　ｈ１ｇＧ４　Ｆｃ　２９ｎ Ｍｈ２５Ｄ２−３　ＣＣ０８Ｃａ　ｈＩｇＧ４　Ｆｃ　５ｎＭｈ２５Ｄ２−４　 ＣＣ０３Ｃａ　ｈ１ｇＧ４　Ｆｃ　５ｎＭｈ２５Ｄ２−５　ＣＣ０３Ｃａ　ｈ１ ｇＧ４　Ｆｃ　３１ｎＭ２５Ｄ２　精製された　αラットＩｇＧ　Ｆｃ　１ｎＭ ＊ＣＯ５ＣＭＣ０５Ｃ細胞状態調節培地。

表５で示されたように、ヒトＩＬ−４に対する結合に関する人間化抗体ｈ２５Ｄ ２−１、ｈ２５Ｄ２−３およびｈ２５Ｄ２−４の親和性は、天然ラット２５Ｄ２ 抗体の場合と同様であった。抗体ｈ２５Ｄ２−２およびｈ２５Ｄ２−５抗体の親 和性は更に低かった。

競合的結合分析 人間化抗体変異体ｈ２５Ｄ２−１およびｈ２５Ｄ２−４を更に特性決定するため に、人間化抗体およびラット抗体２５Ｄ２を用いる競合的結合検定を前記のよう に実施した。結果は、室温において、抗体ｈ２５Ｄ２−１が、１２５Ｉ−ｈｌＬ −４に対する結合に関して抗体２５Ｄ２と競合する場合に抗体２５Ｄ２よりも有 効性が３倍少なかったことを示した。抗体ｈ２５Ｄ２−４は、同検定において抗 体２５Ｄ２よりも有効性が約１００倍少なかった。しかしながら、同検定を４℃ で実施した場合、人間化抗体ｈ２５Ｄ２−１は、競合検定において天然の抗体と 同程度に有効であり、そして抗体ｈ２５Ｄ２−４は有効性が２倍少ないだけであ った。

受容体結合阻害 人間化抗体ｈ２５Ｄ２−１およびｈ２５Ｄ２−４抗体を、ジジョアＣＪ細胞系で 発現された組換え体ｈ　Ｉ　Ｌ−４受容体に対する放射性標識ｈ　Ｉ　Ｌ−４の 結合を阻害する能力に関して前記のように検定した。一定濃度の放射性標識）１ １　Ｌ−４を用いて、受容体結合の５０％阻害を引起こすのに必要とされる抗体 ｈ２５Ｄ２−１およびｈ２５Ｄ２−４の濃度（ＩＣ，。）は、それぞれ０．５〜 １．０および１．０〜２．０ｎＭであると計算された。天然の２５Ｄ２抗体のＩ Ｃ，。は、０゜５〜１．ＱｎＭであると確認された。

生殖系イプシロンプロモーター活性の阻害ジジョアＣ１２細胞は、生殖系ε転写 物プロモーターに対して機能的に結合したヒト成長ホルモン受容体遺伝子の多数 の内在性コピーを含む。このプロモーターはＩＬ−４によって誘導可能である［ ロスマン（Ｒｏｔｈｍａｎ）ら、主２Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６８　：２３８５　（ １９８８）］。

抗体ｈ２５Ｄ２−１およびｈ２５Ｄ２−４が、生殖系εプロモーターのヒトＩＬ −４による誘導を阻止しつるかどうかを決定するために、前記のジジョアＣ１２ 細胞を用いて検定を行なった。抗体ｈ２５Ｄ２−１およびｈ２５Ｄ２−４のＩＣ ３゜値は、野生型抗体２５Ｄ２で観察された２０〜４０ｐＭの範囲と比較して、 それぞれ約１２０および６００ｐＭであることが分かった。

ハイブリドーマ寄託 ハイブリドーマＩＣ１，１１Ｂ４．６およびＭＰ４．２５Ｄ２．１１を、それぞ れ１９８７年９月２９日および１９８８年９月１日、アメリカン・タイプ・カル チャー・コレクション、ロックビル、ＭＤ、米国（ＡＴＣＣ）に、それぞれ受託 番号ＡＴＣＣＨＢ９５５０およびＡＴＣＣＨＢ９８０９として寄託した。

これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託に関するＡＴＣＣの承認に基いて 与えられる条件に基いて行なったものであり、それによって、寄託は、米国成文 法３５条１２２および米国規制基準３７条１．１４に従って米国特許商標局長に 対して利用可能にさせるものであることおよび米国特許証の公的発行に対して利 用可能にさせるものであることが保証され、それにようて寄託が維持されること が必要とされる。寄託された菌株の入手可能性は、いかなる政府のその特許法に よる代理権に基いて付与された権利に違反して本発明を実施する許可として解釈 されるべきではない。

本発明の多数の修正および変更は、当業者に明らかになるように、本発明の精神 および範囲を逸脱することな（行なうことができる。本明細書中に記載された具 体的な実施聾様は、単に実施例として与えられており、本発明は特許請求の範囲 によってのみ制限されるものである。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人：アブラムス・ジョーン（Ａｂｒａｍｓ、Ｊｏｈｎ）ダリー・パル バラ（Ｄａ　ｌ　ｉ　ｅ、Ｂａ　ｒｂａ　ｒａ）し・ハング（Ｌｅ、　ｆ（ｕｎ ｇ） ミラー・ケネス（Ｍｉ　ｌ　ｌ　ｅ　ｒ、Ｋｅｎｎｅ　ｔｈ）マルゴロー二：Ｉ ラス（Ｍｕｒｇｏｌｏ、Ｎ１ｃｈｏｌａｓ）ゲニン・ハン（Ｎｇｕｙｅｎ、Ｈａ ｎｈ）ピアス−フィテル（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｍｉｃｈａｅｌ）ティンダル・ステイ ーブン（Ｔｉｎｄａｌｌ。

５ｔｅｐｈｅｎ） ザヴオドニ・ポール（Ｚａｖｏｄｎｙ、Ｐａｕｌ）（ｉ　ｉ）発明の名称：ヒト インターロイキン−４に対する人間他車クローン性抗体のクローニングおよび発 現 （ｉ　ｉ　ｉ）配列の数：６０ （ｉｖ）宛先： （Ａ）住所：シェリング・プラウ・コーポレーション（Ｓｃｈｅ　ｒ　ｉｎｇ− Ｐｌｏｕｇｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｂ）地区：ワン・ジラルダ・ファー ムズ（Ｏｎｅ　ＧｉｒａｌｄａＦａｒｍｓ） （Ｃ）車名：マディラン （Ｄ）州名：ニュージャージ− （Ｅ）国名：米国 （Ｆ）郵便番号：　０７９４０−１０００（Ｖ）コンピューター読取り形式二 （Ａ）中型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータｍ：アップル・マツキントラシュ（ＡｐｐｌｅＭａｃｉｎｔ ｏｓｈ） （Ｃ）操作システム、マツキントラシュ６．　０．　５（Ｄ）ソフトウェア二マ イクロソフト・ワード（ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＷｏｒｄ）４．０ＯＢ （ｖｉ）現行出願資料： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願臼： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先行出願資料： （Ａ）出願番号：ＵＳＯ７／８４１６５９（Ｂ）出願臼：１９９２年２月１９日 （Ａ）出願番号：ＵＳＯ７／７８２７８４（Ｂ）出願臼：１９９１年１０月２４ 日（Ａ）出願番号＝ＵＳＯ７／４９９３２７（Ｂ）出願口：１９９０年５月２１ 日 （Ａ）出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ８８１０３６３１（Ｂ）出願臼＋１９８８年１０ 月２１日（Ａ）出願番号：ＵＳＯ７／６５５９６６（Ｂ）出願臼：１９９１年２ 月１４日 （Ａ）出願番号：ＵＳＯ７／１１３６２３（Ｂ）出願口：１９Ｂ７年１０月２６ 日（Ａ）出願番号：ＵＳＯ６／８８１５５３ＣＢ）出願臼：１９８６年７月０３ 日 （Ａ）出願番号：ＵＳＯ６／８４３９５８（Ｂ）出願臼：　１９８６年５月２５ 日（Ａ）出願番号：ＵＳＯ６／７９９６６８（Ｂ）出願臼：１９８５年１１月１ ９日（ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名：デュラク・ノーマン（Ｄｕｌａｋ、Ｎｏｒｍａｎ）Ｃ。

（Ｂ）登録番号：３１，６０８ （Ｃ）照会／事件整理番号：２４０９に７（ｉｘ）通信情報： （Ａ）ｉ話　２０１　８２２　７３７５（Ｂ）ファクシミリ：２０１　８２２　 ７０３９（Ｃ）テレックス：２１９１６５ （２）配列番号　１の情報： （１）配列の特＠： （Ａ）長さ・３６３塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖・２本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類・翫ツリ番号＝１ （２）配列番号　２の情報＝ （＋）配列の特徴； （Ａ）長さ＝３２１塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖＝２本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘ　ｉ）配列種類：配列番号＝２ （２）配列番号、３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ　１７塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖・１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類：配列番号：３ （２）配列番号：４の情報： （ｉ）配列の特徴− （Ａ）長さ・１５塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （Ｘｌ）配列種類　配列番号：４ へ丁ＣＧＣＡＣ？ＴＧ　ＴＧこ＾τ　１５（２）配列番号：５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ・４６塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー−＠鎖状 （ｘｉ）配列種類：配列番号：５ ＧＣＡＣＴＡＧＩＣＴｈＧＡ入Ｇ入入Ｃ八　へへへ〇〇ＧＧＣＣへ　Ｃ丁ＧＡＣ 〒ＣＴＧＧ　ＧＧτＣ＾Ｔ　４６（２）配列番号・６の情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ・５１塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖　１本 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 ぐｘｉ）配列種類、配列番号＝６ ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＲＹＴＮＣＡＩ’ＬＹ　ＴＮＧＴＮＧ入只ＷＳ　ＮＧ ＧＮＧＧＮＧＧＮ　ＣＴＮＧτＮＣＡ只ＣＣ５１（２）配列番号＝７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝５１塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類、配ｌり番号ニア ＧＣＡＣＴＡＧ？？ＣＴＡＧＡＴτＧＧＧＴ　ＣＴ入ＡＣＡ（ｊｃＡ　ＴＴＣＣ ＴＧＴＴＧＡ　ＡＧＣ”ＣＴＴＧＸＣＧ　５１（２）配列番号＝８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖・１本 （Ｄ）トポロジー；直鎖状 （ｘｉ）配列種類；配列番号＝８ ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＹＡＴＨＣＡＲＡ　ＴＧＡＣＮＣＡＲＡＧ　ＹＣＣ３ ３（２）配列番号：９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖＝１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類・配列番号＝９ （２）配列番号・１０の情報： （ｉ）配列の特徴： （ｘｉ）配列種類：Ｕり番号＝１６ ９０　９５　Ｗｏ。

（２）配列番号：１７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さニア２塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （ｐ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類・配列番号、１７ αＡＡＣＪ１．へ人ＡＧＣｍ入Ｃ＾τｃｃλ　Ｇ）ＴＧλＣＣＣ入Ｇ　ＡＧＣＣ ＣＡＡＧＣＡ　ＧＣＣＴＧｋＧＣＧＴ　ＧＡＧＣＧＴＧＧＧH　ｇ。

（２）配列番号−１８の情報； （り配列の特徴： （Ａ）長さニア３塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類＝ＶＪり番号：１８ （２）１り番号：１９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０５塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （Ｘｉ）配列種類二８１番号：１９ （２）配列番号：２０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝３６塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘ　ｉ）配列種類：配列番号＝２０ Ｃ？ＧＣτＧＧτ＾Ｃ二人ＧＧＣＣ＾ｒＡ７　〒ＣＴ丁Ｃ丁入Ｇ＾丁　ＧＷテＣ ＴＧ　コロ（２）配列番号：２１の情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ：８０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖・１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘ　ｉ）配列種類・配列番号　２１ （２）配列番号：２２の情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ：８４塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖　１本 （Ｄ）トボロノー：直鎖状 （Ｘり配列種類、配列番号：２２ （２）配列番号　２３の情報・ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６８塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロン−０直鎖状 （ｘｉ）配列種類：配ｙす番号：２３ （２）配列番号：２４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さニア４塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）配列種類：配ｙり番号：２４ （２）ｖり番号：２５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝３３塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖、１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類：配列番号：２５ ＧＴＣＧ入ＡＴ丁０丁　Ｃ入ＡＣＡＣＭＴＣＣＣＣＴＧ？丁Ｇ入入　００へ人　 ３３（２）酊り番号　２６の情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ：５９塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｌ）配列種類、配列番号、２６ ＧＴＴＴ？ＧＧＣＪ　ＡＧＧＣ入ＣＣ入λＧＧ丁ＧＱＡＧＧ〒Ｃ＾　入ＧＡＣＴ ＧＴ（、ＱＣＴＧＣスに入〒Ｃτ　ＧτＣτＴＣｋＴＣ５９（２）配列番号；２ ７の情報： （１）配列の特徴。

（Ａ）長さ：３９３塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖、２本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｌ）配列種類・配ｊり番号＝２７ （２）配列番号：２８の情報： （Ｄ配列の特徴； （Ａ）長さ＝３９塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖；１本 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）配列種類：配列番号：２８ ＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡ）Ｊｋ　ＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣ？ＡＣＪ ＩＡＣＧＣＣ３９（２）配列番号＝２９の情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）配列種類：配ｌり番号：２９ （２）配列番号・３０の情報・ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４５塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類：配列番号＝３０ （２）Ｕり番号＝３１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ　１８塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖８１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｌ）配列種類　配列番号、３１ τ口τ入Ｇ入＾Ｃτ＾　ＧτＧＧ入τＣ口　１８（２）配列番号・３２の情報 （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ：４３５塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖・２本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類：配列番号：３２ Ｇ＾ｃ　Ｇ＝ａ　ＡＧｃ　ｃｃ：　＾丁Ｃフ入ＣＴ＾ＣτＧＣＧｅｅ　ＣＧＣＧ ＡＣＣＣＡ　ＴＡＣＴ＾Ｃ？〒Ｃ＾ＧＣ３１１４ｉ：＋Ｌｕ　°Ｊ＆Ｌ　Ｓ会＝ 　ｋＬａ　ＸＬ＠　？ｙ：　丁ｙ：　こＹ３　人Ｌａ　＾ｒ９　λＳｐ　ＷｒＱ 　Ｔｙ：　τｙ：　Ｐｈｓ　Tａｒ （２）配列番号：３３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝８４塩基対 （Ｂ）種類二核酸 （Ｃ）鎖＝１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類・配列番号・３３ （２）Ｕり番号：３４の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８４塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘ　ｉ）配列種類、配列番号＝３４ ＧＣＡＧＣフＣＡＧＧ　Ｃ’；ＣＡＧＧＧＡＴＣＣＧＣ！−丁にＧＣＴＧ　Ｃ入 ＣＣλＧＧＣＣＧ　ＣＣＧＣＣＧＣ丁Ｃτ　に入ＧＣＡＧＣ嘯f　６０ ＣＡＣ口τ；ＧＧ入Ｇ　τＧＧ入Ｃ入ＣＣτＧ　へ人ＧＣ８４（２）Ｕり番号・ ３５の情報： （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さ：２１塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｘｉ）配列種類：配列番号、３５ ＡＧＣＧＴＣＧＡＣＧ　Ｃ１：ＧＣＣＡＣＣＡＴ　Ｇ　２１（２）翫ツリ番号： ３６の情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ＝８０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類：配列番号：３６ （２）配列番号：３７の情報＝ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さニア９塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖、１本 （Ｄ）トポロジー−直鎖状 （ｘｉ）配列種類、配列番号；３７ （２）配列番号：３８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さニア８塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｌ）配列種類二翫ツリ番号＝３８ （２）配列番号：３９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝８４塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖＝１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 Ｃｘ１）配列種類：配列番号＝３９ （２）配列番号＝４０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘ　ｉ）配列種類：配列番号：４０ ＧＴＣＡＣＣ＾ＧＧＧ　τＡＣ口ＣＴＧＧＣＣＣ（：ＡＧ入＾Ｇ丁ＣＧ　＾ＡＧ Ｔ＾ＧＴＧＧＣＣＧＣＴＧ入ＡＧ？Ａ　Ｇ丁ＡＴＧＧＧＴＣf　６０ （２）　Ｗｉ！ｙ１番号：４１の情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ、３６塩基対 （Ｂ）　１類：核酸 （Ｃ）鎖・１本 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｘｉ）配列種類、配列番号：４１ ＣＴＧＴＡＣ口？ＳＣＡＧＡＴＧ入＾ＣＧＧ　ＣＣＴＧＣ入ＡＧＣＣ（ＪＧＧτ Ｇ　３６（２）配列番号：４２の情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ二６０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類：配列番号：４２ （２）配！１番号：４３の情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ：１０２塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｘｉ）配列種類・配列番号＝４３ （２）配Ｊり番号　４４の情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ・１０２塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｘｉ）配列種類：配列番号：４４ （２）配列番号：４５の情報＝ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８６塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）配列種類：配列番号：４５ （２）配列番号、４６の情報： （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さニア３塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類、配列番号：４６ （２）し１番号：４７の情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ　１０４塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖、１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （Ｘｉ）配列種類、配ｌり番号：４７ （２）配列番号：４８の情報＝ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：９９塩基対 （Ｂ）種類二核酸 （Ｃ）鎖＝１本 （Ｄ）トボロンー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類：配列番号＝４８ （２）配列番号：４９の情報＝ （＋）配列の特徴： （Ａ）長さ、７０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖＝１本 （Ｄ）　ｌ−ボロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類　配列番号：４９ （２）配列番号＝５０の情報・ （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さニア９塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類：配プリ番号＝５０ （２）配列番号：５１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６８塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖＝１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｌ）配列種類：配列番号：５１ （２）　Ｅ３り番号：５２の情報： （Ｄ配列の特徴： （Ａ）長さ＝５１塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘ　ｉ）配列種類：ｉｉＪり番号：５２Ｃ＾ＧＧＣ？ＧＴＣＧ　ＡＣ丁こＧ＾ ＧＧＣＴ　Ｇ入ＣＣ？？τＧＧＣＴτ丁ＧＧ＾Ｇ＾τＧＧ７τττＣτＣＧＡ　 丁　５１（２）配列番号：５３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３８塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘ　ｉ）配列種類＝ＶＪす番号＝５３ＧＴＡＡＧＣＧＴＣＧ　ＡＣＴＣＧＡｃ ＡＧＣＣＡＣＡＧＧ？ＧＴＡ　ＣＡＣＣＣＴＧＣ３１１（２）配列番号：５４の 情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖、１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類：翫ｊり番号：５４ ＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣつニー’＞、？τ丁Ａ　Ｃ′：ＣＡＧＡＧ）、ＣＪ。Ｇ ＯＧｋＧｋＧＧＣ丁　４０（２）翫ツリ番号：５５の情報： （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さニア６塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）配列種類：配ｙり番号＝５５ （２）ｖす番号：５６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さニア２塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖＝１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類；配列番号＝５６ （２）配列番号：５７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５２塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （Ｘｉ）配ケリ種類：配列番号：５７ Ｃ丁入ＧＣＧＧＣττ　ＣＡＣＣττＣλＣＣ入ＣＣτ入Ｃ〒ＧＧＡ　〒Ｇ入ｃ ｃｔｃｃｃ〒　ＧＣ：ＧＣＣ入ＧＧＣＣＣＣ５２（２）配ｊり番号：５８の情報 ： （ｉ）配ｌすの特徴： （Ａ）長さ＝４８塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖＝１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配タリ種類：配列番号：５８ ＧＧＧＧＣ口ＴＧＧＣＧＣＡＣＣＪＧＧＴ　ＣＡＴＣＣ入ＧτＡＧＣ〒ＧＣＴＧ ＡＡＧＧ　ＴＧ入ｋＧＣＣＧ　４１１（２）配ｌり番号＝５９の情報： （＋）配列の特徴： （Ａ）長さ＝１００塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロンー：直鎖状 （ｘｉ）配列種類：配列番号：５９ （２）配列番号：６０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：９６塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （Ｘｉ）配列種類二配列番号＝６０ ＧＧＹＡＣＡＧＧＧＴ　Ｇ’ｒ”ｒＣＴＴＧＣＴＧ　ＴＣＧＴＴ’ＴＣＴＡＧ　 ＡＧＡＴＧＧＴＧＡＡ　ＧＣ（ａ：ＣＧＴＴＣ入ＣｒＧτＣsＧ　６０ ＧＧＴｋＧＴｋＧＧＴ　ＧＴＴＧＴＣＧＣＣＧ　ＣＴｃＡＴＧ％　ＴＧＣＴＧＧ 　９Ｇ請求の範囲を以下のとおりに訂正する。

「１　配列番号：１又は配列番号；２により明示されたアミノ酸配列又はかかる 小配列のうちの１つの小配列を有するモノクローナル抗体の可変領域を含むポリ ペプチド。

２、配列番号＝１により明示されたヌクレオチド配列の約１２〜３６３塩基又は 配列番号：２により明示されたヌクレオチド配列の約９〜３２１塩基を含むか、 又はかかる配列のうちの１つの機能的等傷物である単離されたＤＮＡ。

３、請求項２のＤＮＡを含む組換えベクター。

４、請求項３の組換えベクターを含む宿主細胞。

５、ＤＮＡが発現される条件下で請求項４の宿主細胞を培養することを含むポリ ペプチドの製造方法。

６、ヒトインターロイキン−４に特異的に結合しかつ配列番号：１又は配列番号 ：２により明示された可変領域アミノ酸配列を有するモノクローナル抗体の重鎮 及び軽鎖可変領域からのＣＤＲを含むキメラ又はヒト化モノクローナル抗体。

７、ｈ２５Ｄ２Ｌ−１、ｈ２５Ｄ２Ｈ−１、ｈ２５Ｄ２Ｈ−２、ｈ２５Ｄ２Ｈ− ３、ｈ２５Ｄ２Ｈ−４又はｈ２５Ｄ２Ｈ−５のアミノ酸配列を有する重鎮及び／ 又は軽鎖可変領域を含む請求項６のヒト化モノクローナル抗体。

８　請求項７の重鎮又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ。

９、請求項８のＤＮＡを含む組換えベクター。

１０、　請求項９の組換えベクターを含む宿主細胞。

１１、ＤＮＡが発現される条件下で請求項ＩＯの宿主細胞を培養することを含む ヒト化モノクローナル抗体の製造方法。

１２、生理学的に許容できるキャリヤー及び下記（ａ）〜（Ｃ）からなる群から 選ばれるヒトインターロイキン−４アンタゴニストを含む医薬組成物。

（ａ）配列番号＝１又は配列番号、２により明示された可変領域アミノ酸配列を 有するモノクローナル抗体の軽鎖及び／又は重鎖可変領域からのＣＤＲを含むヒ トインターロイキン−４に特異的に結合する単鎖結合タンパク質；（ｂ）配列番 号：１又は配列番号＝２により明示された可変領域アミノ酸配列を有するモノク ローナル抗体の重鎮及び軽鎖可変領域を含むヒトインターロイキン−４に特異的 に結合するキメラモノクローナル抗体；及び（ｃ）配列番号：１又は配列番号・ ２により明示された可変領域アミノ酸配列を有するモノクローナル抗体の重鎮及 び軽鎖可変領域からのＣＤＲを含むヒトインターロイキン−４に特異的に結合す るヒト化モノクローナル抗体。１以上 １＋ｌ　ｍ１Ａ−、ＰＣＴ／ｕｓ　９３１０１３０１フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０６ １５／１３　ＺＮＡ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＺ、　ＦＩ。

ＨＵ、ＪＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎ０２ＮＺ、ＰＬ、　Ｒ○、　Ｒ Ｕ、　ＳＤ、　ＳＫ、　ＵＡ、　ＵＳ（７２）発明者　し、ハング・ブイ アメリカ合衆国ニューシャーシー州０７８６６゜ロックアウェイ、ヴアレー・ヴ ユー・ドライヴ　７５ （７２）発明者　ミラー、ケネス アメリカ合衆国ニューシャーシー州０８８２０゜エディラン、ヒデン・ヴアレー ・ドライヴＦＩ （７２）発明者　マルゴロ、ニコラス・ジエイアメリカ合衆国ニューシャーシー 州０７９４６゜ミリントン、ローリング・ヒル・ドライヴ（７２）発明者　ゲニ ン、ハン アメリカ合衆国マサチューセッツ州０２１４６゜プルツクリン、チャペル・スト リート ２０、アパートメント　１０５−エイ （７２）発明者　ピアス、マイケル アメリカ合衆国ワシントン用９８１１５．シアトル、トウニンティサード・アヴ エニュー・ナンバー・イースト７０３３ （７２）発明者　ティンダル、ステイーブンアメリカ合衆国ニューシャーシー州 ０７９４０゜マディラン、バーンズデール・ロード　４０（７２）発明者　ザヴ オドニ、ボール・ジエイアメリカ合衆国ニューシャーシー州０７０９２゜マウン テンサイド、セントプル・アヴエニュー　２７９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号ＡＴＣＣＨＢ９８ ０９の下に寄託された細胞系の同定用特徴を有するハイブリドーマによって産生 されるモノクローナル抗体。 ２．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号ＡＴＣＣＨＢ９８ ０９の下に寄託された細胞系の同定用特徴を有するハイブリドーマ。 ３．配列番号：１又は配列番号：２により明示されたアミノ酸配列又はかかる小 配列のうちの１つの小配列を有するモノクローナル抗体の可変領域を含むポリペ プチド。 ４．配列番号：１により明示されたヌクレオチド配列の約１２〜３６３塩基又は 配列番号：２により明示されたヌクレオチド配列の約９〜３２１塩基を含むか、 又はかかる配列のうちの１つの機能的等価物である単離されたＤＮＡ。 請求項４のＤＮＡを含む組換えベクター。 請求項５の組換えベクターを含む宿主細胞。 ＤＮＡが発現される条件下で請求項６の宿主細胞を培養することを含むポリペプ チドの製造方法。 ８．ヒトインターロイキン−４に特異的に結合しかつ請求項１のモノクローナル 抗体の重鎖及び経鎖可変領域からのＣＤＲを含むキメラ又はヒト化モノクローナ ル抗体。 ９．ｈ２５Ｄ２Ｌ−１、ｈ２５Ｄ２Ｈ−１、ｈ２５Ｄ２Ｈ−２、ｈ２５Ｄ２Ｈ− ３、ｈ２５Ｄ２Ｈ−４又はｈ２５Ｄ２Ｈ−５のアミノ酸配列を有する重鎖及び／ 又は経鎖可変領域を含む請求項８のヒト化モノクローナル抗体。 １０．請求項９の重鎖又は経鎖可変領域をコードするＤＮＡ。 １１．請求項１０のＤＮＡを含む組換えベクター。 １２．請求項１１の組換えベクターを含む宿主細胞。 １３．ＤＮＡが発現される条件下で請求項１２の宿主細胞を培養することを含む ヒト化モノクローナル抗体の製造方法。 １４．請求項１のモノクローナル抗体、請求項１のモノクローナル抗体からの重 鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むヒトインターロイキン−４に特異的に結合す る結合組成物、請求項１のモノクローナル抗体の軽鎖及び／又は重鎖可変領域か らのＣＤＲを含むヒトインターロイキン−４に特異的に結合する単鎖結合タンパ ク質、請求項１のモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を含むヒトインタ ーロイキン−４に特異的に結合するキメラモノクローナル抗体、及び請求項１の モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域からのＣＤＲを含むヒトインターロ イキン−４に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体からなる群から選ばれ るヒトインターロイキン−４アンタゴニスト；及び生理学的に許容できるキャリ ヤーを含む医薬組成物。