JPH07502483A

JPH07502483A - 新規ペプチド抗原およびそれを用いるイムノアッセイ、試験キットおよびワクチン

Info

Publication number: JPH07502483A
Application number: JP3515876A
Authority: JP
Inventors: ラル，レヌ　バンサル
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1990-08-29
Filing date: 1991-08-29
Publication date: 1995-03-16
Also published as: EP0551308A4; AU8610091A; CA2090470A1; AU641554B2; WO1992004046A1; EP0551308A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規ペプチド抗原およびそれを用いるイムノアッセイ、試験キットおよびワクチン発明の背景発明の分野本発明はＢｎｖ−１（ＨＴＬＶ−１；アミノ酸（ａ、ａ、　）１９１−２１５）、ＩＥｎｖ−２（ＨＴＬＶ−［１；ａ、　ａ、　１８７−２１０）、Ｂｎｖ５　（ＨＴＬＶ−１；ａ、ａ、２４２−２５７）　、　Ｇａｇｌａ（ＨＴＬＶ−１；ａ、ａ、１０２−１１７）　、Ｐａｌ−３（ＨＴＬＶ−１；ａ、ａ、４８７−５０２）　、　Ｅｎｖ−２０（ＨＴＬＶ−１１；ａ、ａ、８５−１０２）、　Ｂｎｖ−２３（ＨＴＬＶ−［［；ａ、ａ、２７４−２８９）　、Ｇａｇ−１０（ＨＴＬＶ−［／ＩＩ；ａ、ａ、３６４−３８５）およびＥｒｓ　（内因性レトロウィルス配列）からなる群から選択されるＨＴＬＶ−１およびＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩの構造遺伝子産物から誘導されるペプチド、および該ペプチドを用いるイムノアッセイ、試験キットおよびワクチンに関する。

関連技術の記載ヒトＴリンパ球指向性ウィルス（ＨＴ、ＬＶ）夏型および夏型は密接に関連したヒトレトロウィルスである（Ｗａｃｈｓｍａｎ　Ｗ、　Ｇｏｌｄｅ　ＤＷ、　Ｃｈｅｎ　［ＳＹ、　ＨＴＬＶおよびヒト白血病：その見通し、　Ｓｅｍ１ｎ　Ｈｅｍａｔｏｌ　１９８６；２３；２４６−５６）。

ＨＴＬＶ−１は成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）およびＨＴＬＶ−１関連ミニロバシー／熱帯痙性不全対麻痺として知られている慢性神経失調症（ＨＡＭ／Ｔ　Ｓ　Ｐ　；　Ｆｌｈｒｌｉｃｈ　ＧＤ、　Ｐｏ１ｅｓｚ　ＢＪ、　ＨＴ　Ｌ　Ｖ　− ｎ感染の臨床および分子パラメータ、　Ｃ１１ｎ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ　１９８８；８：６５−８４）の原因として関連する。一方、変種の毛細胞白血病の患者から最初に単離されたＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−ｎ　（Ｋａｌｙａｎａｒａｍａｎ　ＶＳ、　ＳａｒｎｇａｄｈａｒａｎＭＧ、　Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ　Ｍ等１毛細胞白血病のＴ細胞変種と関連するヒトＴ細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ−ＩＩ）の新規亜種、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８２；２１８：５７１−３）は何らかの特定の疾病と関連づけられていない（Ｂｌａｔｔｎｅｒ　ＷＡ、レトロウィルス、　Ｂｖａｎｓ　ＡＳ編　ヒトのウィルス感染：病因および防除、第３版、ニューヨーク：　Ｐｌｅｎｕｍ　１９８９：５４５−９２）　、　ＨＴＬＶ−１感染は日本南西部、カリブ地方およびアフリカの一部に特有であるが（Ｆ３ｈｒｌｉｃｈ　ＧＤ、　Ｐｏ１ｅｓｚ　ＢＪ、　ＨＴＬＶ−ｎ感染の臨床および分子パラメータ、　Ｃ１１ｎ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ　１９８８；８：６５−８４）、ＨＴＬＶ− ＩＩは静脈薬剤使用者中に主として報告されている（Ｌｅｅ　Ｈ，Ｓｗａｎｓｏｎ　Ｐ、　５ｈｏｒｔｙ　ＶＳ、　Ｚａｃｋ　ＪＡ、　Ｒｏｓｅｎｂｌａｌｔ　ＪＤ、　Ｃｈｅｎ　［、ニューオルレアンでの血清陽性■薬剤乱用者における高率のＨＴＬＶ−ｎ感染、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８９；２４４：４７１−５）　ｏ混入血液産物からのＨＴＬＶ−１／ＩＩ感染の伝播についての関係はボランティアの血液供給者中のＨＴＬＶ−１の血清学的証拠により確認され（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ＡＢ、　Ｐａｎｇ　ＣＴ、　Ｓｌａｍａｎ　ＤＪ等、米国血液供給者におけるＨＴＬＶ−１感染の血液流行および病因的関連、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８８：２４０：６４３−６；　Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｄ、Ｗ、。

Ｂｐｓｔｅｉｎ　Ｊ、Ｓ、、　Ｌｅｅ　Ｔ、Ｈ，等、健康な血液および血漿供給者におけるヒトＴリンパ球ウィルス夏型感染の血清学的感染、　Ｂｌｏｏｄ　１，９８９；７４：２５８５−９１）、そして米国食品および薬剤認可局は提供された全ての血液のＨＴ４；Ｖ−１スクリーニングを示唆した（公衆衛生奉仕グループ、ヒトＴリンパ球指向性つィルス■型に対する抗体のスクリーニング試験の許可、　ＭＭＷＲ１９Ｂ８；３７：７３６−４７；　Ｋａｐｌａｎ　Ｊ、８゜、　Ｋｈａｂｂａｚ　Ｒ，Ｆ、ＨＴＬＶ　−１：血液供給者スクリーニングに対する最新事項、＾ｔａ、　Ｆａｌｌ、　Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ　１９８９；４０：１８９−９５）。血液供給者のスクリーニングからの最近のデータはＨＴＬＶ−１に対するこれらの血清陽性の半分以上がＨＴＬＶ−ＩＩに感染され得ることを示している（ＣｈｅｎＩＳＹ、　Ｒｏｓｅｎｂｌａｔ　ＪＤ、　Ｂｌａｃｋ　ＡＣ？＾ｒｒｉｇｏ　ＳＪ、　Ｇｒｅｅｎ　ＰＬ。

１９９０、ＨＴＬＶ−ｎの流行および遺伝子発現の制御：ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ　Ｈｕｍ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　６：１３４−５）６さらに、米国における静脈薬剤使用者間の高率のＨＴＬＶ血清反応性はＨＴＬＶ−ＩＦ感染に起因し得る（Ｌｅｅ　Ｈ，Ｓｗａｎｓｏｎ　Ｐ、　５ｈｏｒｔｙ　Ｖ、Ｓ、、　Ｚａｃｋ　Ｊ、＾、、　Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ　Ｊ、Ｄ、、　Ｃｈｅｎ　１．　＝ユーオルレアンでの血清陽性■薬剤乱用者における高率のＨＴＬＶ−ｎ感染、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８９；２４４：４７１−５）　ｏ　ＨＴ　ＬＶ−１感染とＨＴＬＶ −Ｉｔ惑染を区別し得る血清学的アッセイがないので（Ｃｈｅｎ　ＩｓＹ、　Ｒｏｓｅｎｈｌａｔ　ＪＤ、　Ｂｌａｃｋ　ＡＣ，Ａｒｒｉｇｏ　ＳＪ、　Ｇｒｅｅｎ　ＰＬ、　１９９０．　ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩの流行および遺伝子発現の制御：　ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ　）Ｉｕｏ＋　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　６：１３４ −５）、ＨＴＬＶ−１関連疾病についてそのような個人のカウンセリングは不適切であるかもしれない。

全体的構造的類似ならびに一次アミノ酸配列の多くの同一性（Ｍｙｅｒｓ　Ｇ、　Ｊｏｓｅｐｈｓ　Ｓ、Ｆ、、　Ｒａｂｓｏｎ　Ａ、Ｂ、、　Ｓｍ１ｔｈ　Ｔ、Ｆ、、　Ｗｏｎｇ　５ｔａａｌ　Ｆ、ヒトレトロウィルスおよびエイズ中、　Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　＝ニーメキシコ州ロス７５　％　ス、　１９８８）はＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−ＩＩ間の抗原交差反応性を示唆し、事実上、いずれの血清学的アッセイも今日までこれら２種の感染を確実には区別し得ない（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ＤＪ、、　ｌ？ｐｓｔｅｌｎ　Ｊ、Ｓ、、　Ｌｅｅ　Ｔ、Ｈｏ等。

健康な血液および血漿供給者におけるヒトＴリンパ球ウィルスｌ型感染の血清学的感染、　Ｂｌｏｏｄ　１９８９；７４：２５８５−９１）；　Ｌｅｅ　Ｔ、Ｈ，Ｃｏｌｉｇａｎ　Ｊ、Ｂ、、　ＭｃＬａｎｅ　Ｍ、Ｆ、等、夏型および■型ヒトＴ細胞白血病ウィルスのエンベロープ遺伝子産物間の血清学的交差反応性、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ。

ＵＳＡ１９８４；８１ニア５７９）。ウィルス単離および遺伝子増幅技術（Ｌｅｅ　Ｈ，Ｓｗａｎｓｏｎ　Ｐ、　５ｈｏｒｔｙ　Ｖ、Ｓ、、　Ｚａｃｋ　Ｊ、Ａ、、　Ｒｏｓｅｎｂｌａｌｔ　Ｊ、Ｄ、、　Ｃｈｅｎ　１．ニューオルレアンでの血清陽性■薬剤乱用者における高率のＨＴＬＶ−ｎ感染、　５ｃｉｅｎｃｅ１９８９；２４４：４７１−５；口ｅ　Ｂ、　５ｒｉｎｆｖａ　Ａ、ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩ　Ｖ）およびヒト向リンパ球ウィルスｌ型または■型二重感染のポリメラーゼ鎖反応による検出、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１９８９；４：１５３３−５）はＨＴＬＶ−１感染をＨＴＬ　Ｖ−Ｉｔ感染と区別することを可能にするが、これらの操作は集約的な労働であり、そしてリンパ球の収集と処理を必要とする。２つの感染を区別するであろう血清学的アッセイは非常に望ましい。そのようなアッセイは、２つのウィルスを区別できなかったことによりずっと阻止されてきた血清病因学的研究のため、および血液供給者や血清陽性を試験するその他の人のカウンセリングのために非常に有用であろう（Ｃｈｅｎ　［ＳＹ、　Ｒｏｓｅｎｂｌａｔ　ＪＤ、　ＢｌａｃｋＡＣ，Ａｒｒｉｇｏ　ＳＪ、　Ｇｒｅｅｎ　ＰＬ、　１９９０．　ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ｎの流行および遺伝子発現の制御：　ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ　）Ｉｕｍ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ６：１３４−５）。

保存された「免疫決定」エピトープを表現する合成ペプチドは低コストおよび正確に再び製造され得る性質の点でウィルス誘導抗原に対する興味深い代替物を提供す、　る。予め決められたアミノ酸配列と反応性の抗体の合成は（Ｌｅｒｎｅｒ　Ｒ，Ａ、生物学および医学における予め決定された特異性の抗体Ａｄｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１９８４；３６：１−４４）、互いに感染性である関連レトロウィルスを区別するための感度がよく、特異的な手段であることが従来示されていた（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｄ、Ｗ、、　Ｂｐｓｔｅｉｎ　Ｊ、Ｓ、、　Ｌｅｅ　Ｔ、Ｈ，等、健康な血液および血漿供給者におけるヒトＴリンパ球ウィルス夏型感染の血清学的感染、　Ｂｌｏｏｄ　１９８９；７４：２５８５−９１）；　ＬｅｅＴ、Ｈ，Ｃｏｌｉｇａｎ　Ｊ、Ｅｌ、、　ＭｃＬａｎｅ　Ｍ、Ｐ、等、夏型および■型ヒトＴ細胞白血病ウィルスのエンベロープ遺伝子産物間の血清学的交差反応性、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　１９８４；８１ニア５７９）。構造タンパク質、例えばＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ −ｎからのｅｎｖ　、　ｇａｇおよびｐｏＬは自然感染の条件下で主な免疫決定タンパク質であるから（Ｌｅｅ　Ｔ。

Ｃｏｌｊｇａｎ　Ｊ、Ｂ、、　Ｈｏｍｍａ　Ｔ、　！ＪｃＬａｎｅ　Ｍ、Ｆ、、　Ｔａｃｈｉｂａｎａ　Ｎ、　Ｂｓ５ｅｘ　Ｍ、　ヒトＴ細胞白血病ウィルス結合膜抗原（ＨＴＬＶ−ＭＡ）：ウイルス感染に続いて認識される主要抗原、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　１９８４；８１：３８５６−６０；　Ｋａｎｎｅｒ　Ｓ、Ｂ、、　Ｍａｙｅｒ　Ｃ，Ｃ，、Ｇｅｆｆｆｎ　Ｒ，Ｂ、等ヒトレトロウィルスのｅｎｖおよびｇａｇポリペプチド；感染を測定するための血清学的アッセイ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１９８６；１３７：３７４−８）、本発明者等は、アミノ酸配列においてかなりの相違を示したＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−ＩＩのｅｎｖ　、　ｇａｇおよびｐａｌの領域の血清学的反応性を分析した（Ｓｏｄｒｏｓｋｉ　Ｊ。

、　ｐａｔａｒｃａ　Ｒ，、Ｐｅｒｋｉｎｓ　ｎ、等、ヒト向リンパ球つィルス ■型のエンベロープ糖タンパク質遺伝子の配列、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８４；２２５：４２１−４）。

米国特許第４８３８７０１号１ｔＨＴＬＶ−１に対スル抗体への特異的免疫反応性を有するペプチド組成物を開示している。

発明の要約本発明の１つの目的は、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染個体からの血清試料と交差反応性を示さないＨＴＬＶタンパク質の主要免疫決定エピトープを明らかにすることである。

従って、本発明の一つの態様は、Ｂｎｖ−１（ＨＴＬＶ−１；ａ、ａ、１９１−２１５）　ＬＰＨＳＮＬＤＨＩＬＢＰＳ［ＰＷＫＳＫＬＬＴＬＶ。

Ｅｎ　ｖ−２（ＨＴＬＶ−［［；ａ、　ａ、　１８７−２１０）ＶＨＤＳＤＬＥ！ＨＶＬＴＰＳＴＳＷＴＴＫ　ＩＬＫＰ　ｔ。

Ｅｌｎｖ５　（）！ＴＬＶ−１；ａ、ａ、２４２−２５７）　５ＰＮＶＳＶＰＳＳＳＳＴＰＬＬＹ。

Ｇａｇｌａ（ＨＴＬＶ−１；ａ、ａ、１０２−１１７）　ＰＰ５ＳＰＴＨＤＰＰＤＳＤＰＱＩ。

Ｐａｌ−３（ＨＴＬＶ−［；ａ、ａ、４８７−５０２）　ＫＱＩＬＳＱＲＳＦＰＬＰＰＰＨＫ。

Ｅｎｖ−２０（ＨＴＬＶ−＋　１　；ａ、　ａ、　８５−１０２）ＫＫＰＮＲＱＧＬＧＹＹＳＰＳＹＮＤＰ。

Ｂｎｖ−２３（ＨＴＬＶ−［；ａ、　ａ、　２７４−２８９）　ＱＰＲＬＱ＾［ＴＴＤＮＣＮＮＳｒ。

Ｇａｇ−１０（ＨＴＬＶ−１／Ｉ　Ｉ　；ａ、ａ、３６４−３８５）ＧＨＷＳＲＤＣＴＱＰＲＰＰＰＧＰＣＰＬＣＱＤＰ。

Ｂｒｓ　（内因性レトロウィルス配列）ＰＲＩＰＰＫＰＣＰ　ＩＣｖＣＰＮＷＫＳＤＣＰＴ、おヨヒそれらの類似体（上記配列中のアミノ酸は、その配列の三次元コンホメーションから誘導されるＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−■に対する抗体への免疫反応性が実質的に保存される限りにおいて置換されていてもよい）からなる群から選択されるペプチドを含む、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩまたはそれらの組合せに対する抗体への特異的免疫活性を有するペプチドに関する。

本発明はさらに、ＨＴＬＶ−１，ＨＴＬＶ−１またはそれらの組合せに対する抗体を検出するためのイムノアッセイ方法、該抗体を検出するための試験キット、該ペプチドを含むペプチド組成物およびワクチンに関する。

図面の簡単な説明図ＩＡおよびＩＢは、ＨＴＬＶ−１ゲノム（上側パネル）およびＨＴＬＶ−Ｉ［（下側パネル）における合成ペプチドの配置を示す。各ペプチドの相対位置はボックスにより示されている。

図２Ａおよび２Ｂは、ＨＴＬＶ−１感染（ＨＴＬＶ−１）、ＰＣＲ４：より確認されたＨＴＬＶ−１感染（ＨＴＬＶ−Ｔ　ＰＣＲ）　、およびＰＣＲ確認されたＨＴＬＶ−■感染（ＨＴＬＶ−Ｉ［ＰＣＲ）　の患者における精製ＨＴＬＶ−１タンパク質（上側パネル）およびＢｎｖ−５（下側パネル）に対する抗体を示す。影を付した領域は健常人２１人の応答の平均値＋８　３Ｄを示す。

図３は、ＨＴＬＶ−１感染個体における抗Ｅｎｖ−５抗体のＥｎｖ−５（・−釦、ＨＴＬＶ−１（〇−０）またはＨＴＬＶ−１（Δ−Δ）精製タンパク質による競合を示す。１０ｕｇ／ｍｌペプチドまたはＨＴＬＶタンパク質溶液の連続的１：２希釈液が試験血清の１：１Ｇ希釈液と１＝１混合される。混合物を４℃で一晩保温する。各々をエリザにより抗Ｅｎｖ−５活性に対してアッセイする。結果を４つのＨＴＬＶ−１感染血清の平均阻害％として表現する。

図４Ａおよび４Ｂは、ＨＴＬＶ−１感染（○）、ＨＴＬＶ−Ｉｔ　（ロ）感染および正常対照（Δ）の患者におけるＧａｇ　ｌａ（上側パネル）またはＰｏｔ− ８（下側パネル）ペプチドに対するＩｇＧ抗体を示す。ＨＴＬＶ−■感染群における塗りつぶした記号はＲＡＭ／ＴＳＰまたはＡＴＬの個体の抗体応答性を示す。

図５人および５Ｂは、抗原インデックスを付加したＨＴＬＶ−１（上）およびＨＴＩ、Ｖ−ＩＩ　（下）のｇａｇコード化タンパク質の二次構造のコンピュータ予想を示す。

残基上の円の半径は該残基と次の５個の残基に対して計算される平均抗原インデックスに比例している。親水性、柔軟性および表面現出性に対するパラメータは、親水性に対して０．７、柔軟性に対して１．０４および表面現出性に対して５．０を限度として５個のアミノ酸残基で平均される。

図６は）：　ｎｖ２　Ｑ　＠ｈ−１１！、ｇｎｖ−２０２’マド！■およびＢｎｖ２　Ｑ　３　！ｌＳ−１１Ｉの相当するＨＴＬＶ−１配列との並列を示す。ＨＴＬＶ−ＩＩとＨＴＬＶ−１との間の同一アミノ酸残基は四角で囲んでいる。アミノ酸残基番号付与は各タンパク質のＮ末端からである。

図７はＨＴＬＶ−ＩＩ　（ＨＴ−Ｉｔ）およびＨＴＬＶ−１（ＨＴ−１）に感染した血液供給者からの血清試料中のＥｎｖ−２０・トｉ・！、Ｅｎｖ−２０２１１−！ｅｌおよびＥｎｖ−２０３″ｌｌ−１ｌｌに対する抗体を示す。影を付した応答は健常血液供給者２２人の応答の平均＋２ＳＤを意味する。

図８Ａおよび８Ｂは、ＨＴＬＶ””およびＨＴＬＶ”４試料とＨＴＬＶのｅｎｖ　（Ａ）　ｇａｇ　（Ｂ）領域および内因性レトロウィルス配列（Ｂ）からの合成ペプチドとの血清反応性を示す。データはＨＴＬＶ口°　（ｐ１９および／またはｐ２４＋ｇｐ４８／６１　；ｎ＝３０）およびＨＴＬＶ”’　（ｐｌ’９＋ｐ２４＋ｒ２１＋、ｎ＝１’２；ｐ１９＋ｐ２４＋、ｎ＝１０；ｐ１９’＋、ｎ＝４３；ｐ２４＋、ｎ＝６．ｒ＝２１＋、ｎ＝９）試料の％反応性として表現される。Ａ：合成ＨＴＬＶ−１特異的Ｅｎｖ１１８１−１目　０口）およびＥｎｙ　ｌ　１４ト１ｍｍ’　（ｚ）　。

ＨＴＬ・Ｖ−Ｉｔ特異的Ｅ　ｎ　ｖ　−１””−”’　（［２１）およびＥｎ、ｖ＝２０″ｓ、−＋＠＊（ロ）に対する％反応性；　Ｂ　：　ＨＴＬＶ−１特異的Ｑ　ａｇ　１　ａＩＩト１１７　、　（ロ）、ＨＴＬＶ、−１／’Ｉ［特Ｊ％的Ｇ　ａ　ｇ　−１０”！’−”’　（ｒｚＪ’）および内因性レトロウィルス配列ＲＴＶＬ””　（ＩＩＳａ）との％反応性。

図９は、ＲＴＶＬ領域がその他のレトロウィルスに見出されるものと類似の位置に保存配列の２つの不完全コピーを含むことを示す。図９におけるピリオドは配列並置のために加えられた配列中の空隙を示す。

発明の詳細な説明本発明は合成ペプチドの使用による体液中にＨＴＬＶ−■またはＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体を検出するための感度の高い方法に関する。ペプチドはまた、ヒトを含む健康な哺乳動物（こおけるＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−■による感染に対して保護を与えるためにＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−ＩＩの抗体の産生を刺激することによるワクチンとして有用である。ペプチドはエンベロープタンパク買上のセグメントに相当するアミノ酸配列を有する。検出方法は酵素結合イムノソルベントアッセイ（エリザ）、イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）およびイムノアッセイ法のその他の形態、例えばニトロセルロース紙上での酵素免疫プロッティングアッセイおよび抗原としてペプチドを用いる血球凝集アッセイを包含する。

開発されるべきＨＴＬＶに対するイムノアッセイは、２つの主な基準を満たすことが必要である。試験は、ＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−ＩＩの両方のウィルスが特有である場所においてそれらを区別しなければならない。全体のウィルス溶菌物が抗原の源として使用される酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）はこれらのウィルスのコアおよびポリメラーゼタンパク質の高度に保存された領域において配列相同性であるためにＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−ＩＩを効率よく区別できない。高感度で特異的である２種のイムノアッセイは血液スクリーニングが行われる実験室で利用可能でなければならない。現在の研究において、発明者は、ＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−ＩＩ（７）ウィルスタンハク質の免疫反応性ドメインからの合成ペプチドがＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−ＩＩを区別するであろうイムノアッセイを設計する試みを提供することを籟告する。発明者等はまた、ＨＴＬＶ−１のポリメラーゼ領域から誘導された合成ペプチドが多くの感染個体において血清抗体を検出するという証拠を提供する。

本明細書において使用されるアミノ酸の略号は下記のように慣用的に示される。

アミノ酸　３文字略号　１文字略号アラニン　Ａｌａ　＾アルギニン　Ａｒｇ　Ｒアスパラギン　Ａｓｎ　Ｎアスパラギン酸　＾ｓｐ　ロアスパラギンもしくはアスパラギン酸　Ａｓｎ　Ｂシスティン　Ｃｙｓ　Ｃグルタミン　Ｇｉｎ　Ｑグルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅグルタミンもしくはグルタミン酸　Ｇｌｘ　Ｚグリシン　Ｇｌｙ　Ｇヒスチジン　１（ｉｓ　Ｈロイシン　Ｌｅｕ　Ｌリジン　Ｌｙｓ　にメチオニン　Ｍｅｔ　Ｈフェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｐプロリン　Ｐｒｏ　Ｐセリン　Ｓｅｒ　Ｓトレオニン　Ｔｈｒ　Ｔトリプトファン　Ｔｒｐ　Ｗチロシン　Ｔｙｒ　Ｙバリン　Ｖａｌ　Ｖ本発明によれば、ＨＴＬＶ−１また１ｉＨＴＬＶ−Ｉｌｌ：対する抗体の検出に有用なペプチドは、Ｅｎｖ−１（ＨＴＬＶ−１；ａ、ａ、１９１−２１５）　ＬＰ）ＩＳＮＬＤＨＩＬＢＰＳ［ＰＷＫＳＫＬＬＴＬＶ。

Ｒｎｖ−２（ＨＴＬＶ−１１；ａ、ａ、１８７−２１０）ＶＨＤＳＤＬＢ）ＩＶＬＴＰｓＴｓＷＴＴＫＩＬＫＰＩ。

Ｂｎｖ５　（ＨＴＬＶ−１；ａ、ａ、２４２−２５７）　５ＰＮＶＳＶＰＳＳＳＳＴＰＬＬＹ。

Ｇａｇｌａ（ＨＴＬＶ−１；ａ、ａ、１０２−１１７）　ＰＰ５ＳＰＴＨＤＰＰＤＳＤＰＱ［。

Ｐａｌ−３（）ＩＴＬＶ−１；ａ、ａ、４８７−５０２）　ＫＱ［ＬＳＱＲＳＰＰＬＰＰＰＨＫ。

Ｂｎ　ｖ−２０（ＨＴＬＶ−１１；ａ、　ａ、　８５−１０２）ＫＫＰＮＲＱＧＬＧＹＹＳＰＳＹＮＤＰ。

Ｂｎｖ−２３（ＨＴＬＶ−１；ａ、　ａ、　２７４−２８９）ＱＰＲＬＱＡ　ＩＴＴＤＮＣＮＮＳ　Ｉ。

Ｇａｇ−１０（ＨＴＬＶ−１／　Ｉ　Ｉ　；ａ、　ａ、　３６４−３８５）ＧＨＷＳＲＤＣＴＱＰＲＰＰＰＧＰＣＰＬＣＱＤＰ。

Ｂｒｓ　（内因性レトロウィルス配列）ＰＲＩＰＰＫＰＣＰ　ＩＣＶＣＰＮＷＫＳＤＣＰＴ、およびそれらの類似体（上記配列中のアミノ酸は、その配列の三次元コンホメーションから誘導されるＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−■に対する抗体への免疫反応性が実質的に保存される限りにおいて置換されていてもよい）からなる群から選択される。

これらのペプチドは類似体または断片、すなわち上記配列の末端アミノ酸にさらに付加されたアミノ酸を有するか、またはいずれかの末端からのより少ない末端アミノ酸を有するより短いペプチド鎖またはより長いペプチド鎖からなっていてもよい。ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬｖ−■に対するドミナント抗体により認識され得る三次元コンホメーションが保存される限り、合成ペプチドの類似体はまた、上記配列の列記アミノ酸の置換および／または欠失を含んでいてもよい。

ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−Ｉ［に対する抗体の免疫反応における、本発明に係るペプチドの高度な感度および特異性に基づいて、該ペプチドはワクチンとして（例えばＡＴＬおよびＨＡＭ／ＴＳＰ用）、ヒトを含む哺乳動物におけるＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−Ｉ［に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の開発のための免疫源として有用である。タンパク質またはポリマー担体に結合されるか、またはホモ−もしくはヘテロ多官能性架橋剤の使用によりホモ −もしくはヘテロ−ダイマーもしくは高級オリゴマーに重合化された場合のペプチドは、正常な対象に誘導されて、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体の産生を刺激し、そして健康な哺乳動物での感染に対する保護を提供する。

本発明に係るペプチドはウィルスから生化学的に誘導されたものではないので、疾病に対してワクチン化されるべき正常な対象を危険に晒すことがない。

本発明に係るペプチドを使用する利点は多い。ペプチドは化学的に合成される。

これは、試験試薬またはワクチンを製造工程中を通じてＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−ｍとの接触がないことを意味する。ワクチンの製造またはワクチン化過程の間、健康状態にある製造者や個人が危険に晒されることがない。同様に、上記ペプチドの使用または哺乳動物におけるＨＴＬＶ−１またはＨＴＬ■−■に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の開発において、ＨＴＬＶ−１またはＨＴ　Ｌ　Ｖ　−■に晒される危険がない。さらに、試験試薬が血清または体液の試料に晒される場合、ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−Ｉ［に対する抗体を検出する試験の最後の段階まで、実験作業者がＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ− Ｉｌｌ：晒される危険がない。この最後の段階における暴露のあらゆる危険は、６０℃で３０分、被試験血清試料を加熱し、それによりウィルスを不活性化する予防工程を行うことによりさらに避けられる。

本発明により回避されるその他の問題は、ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−１またはＨＴＬＶ− ＩＩウィルス調製物と一緒に精製される宿主細胞または発現されたウィルスフラグメントと一緒に精製されるＥ、　ｃｏｌｉ誘導化タンパク質からの抗原材料中の存在により引き起こされる偽陽性結果の可能性である。ある種の正常な個体は、宿主細胞からの抗原材料と交差反応するＥ、　Ｃ０１ｉまたはヒト白血球抗原例えば■（ＬＡに対する抗体を有する。これらの正常個体からの血清試料はそれらがＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−１［に暴露された場合でさえも、エリザまたはＩＲＭＡ試験において陽性応答を示し得る。

ある人がこのタイプの偽陽性応答に基づいてＨＴＬＶ−■または■に感染されている可能性があるという診断はその人またはその家族に対して重大な不安を引き起こし得る。これらの問題の全てが本発明のペプチドを試験試薬として使用することにより回避され得る。

さらに、適当なアミノ酸類似体置換を用いれば、上記アミノ酸配列に基づく種々のペプチド類似体がより低いバックグランド値またはＨＴＬＶ−１もしくは■抗体スクリーニングアブセイに有用な固相に対してよりよい吸着が生じるような特性をもつように合成され得る。

さらに、本発明のペプチドは合成により製造されるので、品質は制御され得、そしてその結果、試験結果の再現性が保証され得る。また、非常に少量のペプチドが各試験操作に必要とされ、そしてペプチドの製造する費用が比較的安いので、ＨＴＬＶ−１または■に対する抗体のために体液をスクリーニングする経費およびワクチン製造コストは比較的低い。

体液中４：：ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬ、Ｖ−ＩＩまたはそれらの組合せを検出方法は、少な（とも１種の上記ペプチド、類似体またはそれらの混合物を調製し、そしてイムノアッセイ操作における少なくとも１種のペプチドを、ｐＨ約７．５ないし１０、好ましくは約９．４ないし９．８の緩衝液中で試験あたり約０．１ｍｇないし約２θｍｇ、好ましくは約１．０ｍｇないし約１０ｍｇ用いることからなる。

本発明に従って製造されたペプチドは試験試薬としてイムノアッセイ、例えば酵素結合イムノアッセイソルベントアッセイ（エリザ）、酵素イムノドツトアッセイ、血球凝集アッセイ、ラジオイムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）またはあらゆる別の競合結合アッセイの形態で使用することによりＨＴＬＶ−１およびＨＴＬ。

■−■感染を検出するために使用され得る。

本発明はさらに、（ｉ）検出すべき抗体−ペプチド複合体を製造するのニ十分す量テ、ＨＴＬＶ− ｌ５ＨＴＬＶ−ＩＩまたｉｉソれらの組合せと反応させるための本発明のペプチドの存効量で固体支持体またはその他の標識材料を被覆し、（ｉｉ）緩衝液で希釈された試験血清を添加し、そこで該試験血清中のＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ −Ｉｔに対する抗体が前記ペプチドとでペプチド−抗体複合体を形成し、（ｎｒ）混合物を保温し、そして（汁）ペプチド−抗体複合体の存在を検出する、ことからなるＨＴＬＶ−１，ＨＴＬＶ−Ｉｔまたはそれらの組合せに対する抗体を検出するためのイムノアッセイ法に関する。段階（ｉｖ）において、酵素で標識された第２の公知抗体および該酵素と反応して着色物質を形成する基質が導入される。また、段階（ｉｖ）において、放射性元素で標識された第２の公知抗体が導入される。また、段階（ｉｖ）において、ペプチド抗体複合体は凝集として検出されてもよい。固体支持体は少なくとも１種の前記ペプチドでマルチドツト配列に被覆されてもよい。ペプチドの量はドツトあたり１ｍｇないし１０ｍｇの範囲が好ましい。検出段階（ｉｔ）はまた、複合体と競合する標識または非標識抗原または抗体を用いて競合的に行われてもよい。段階（ｉ）の抗原は、抗体−抗原複合体が例えばポリエチレングリコール沈殿またはクームス試薬により検出され得るようになっていれば、結合されている必要はない。

本発明はまた、固体支持体またはそれに付着したその他の適当な標識材料；本発明の少な（とも１種のペプチドからなる免疫吸着剤または単に少なくとも１種核ペプチドのみ、陰性対照としての正常血清の試料、陽性対照としてのＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体を含む血清の試料、および血清試料を希釈するための緩衝液からなるＨＴＬＶ−Ｌ　ＨＴＬＶ−ＩＩまたはそれら）組合せに対する抗体を検出するための試験キットに関する。

さらに本発明は、本発明のペプチドを少なくとも１種含むペプチド組成物に関する。１種以上のべ組成物中に存在する場合、各々は互いに１：１の比率で存在する。

例えば、混合物中に数種のペプチドが存在する場合、それらは１：ｉ：１の比率にある。各ペプチドは０．５ｍｇないし５ｍｇの量で存在することが好ましい。

−緒に混合されるべき２種以上のペプチドの例はＥｎｖ−１とＥｎｖ−５の組合せを包含する。ペプチドの該混合物はＨＴＬＶ−１検出の感度の向上のために提供され得る。

同様に、Ｅｎｖ’−２とＥｎｖ−２０はＨＴＬＶ−ＩＩ検出を向上させるために組合せられ得る。必要ならば、ペプチドは適当な担体、例えば食塩水または食塩水中のリン酸緩衝液中に混合されてもよい。

本発明はまた、本発明のペプチドを少なくとも１種含むワクチンに関し、そして抗体およびその他の細胞および免疫応答物を生成するために使用される。あらゆるペプチドが単独または組合せで、慣用の公知担体タンパク質に結合され得、そして動物はＨＴＬＶ−１／ｎ感染前に免疫化され得る。高い免疫応答（Ｂ−およびＴ−細胞応答）を生成するペプチドは慣用の方法でワクチンを開発するために使用され得る。

Ｂｎｖ５　（ＨＴＬＹ−１ａ、ａ、２４２−２５７）は最高の免疫決定エピトープであり、ＨＴＬＶ−１に感染した患者からの血清の全てと反応し、ＨＴＬＶ− Ｉ［に感染した３５人の患者とは交差反応しない。本研究において試験された試料の数は少ないけれども、それらは種々の臨床群ならびに種々の風土病領域からのＨＴＬＶ−１／ｎ感染患者を示し、そして血液供給者中の現在の見積ＨＴＬＶ −Ｉ／ｎ血清流行率（０，０２％）４：基づいて、ＨＴＬＶ−１陽性対象の数（ｎ＝５２）は２６００００の人口に対して予測される同様の感染者の数を表すであろう。

ＨＴＬＶ−１のエンベロープタンパク質は異なるウィルス単離体に対して変異性を示すことが知られており（Ｄａｅｎｋａ　Ｓ、、　Ｎｉｇｈｔｉｎｇａｌｅ　Ｓ、、　Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ　Ｊ、に、、　Ｂａｎｇｈａｍｃ、Ｒ，Ｍ、、熱帯痙性不全対麻痺および成人Ｔ細胞白血病患者からヒト向Ｔリンパ球つィルスＩ型の配列変種は白血病単離体から神経学的に区別しない。Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　１９９０；６４：１２７Ｂ−８２）、そしてこれは試験の感度に影響を及ぼさない。Ｅｎｖ−５領域（ＳｅｒＰｒｏＡｓｎＶａｌＳｅｒＶａｌＰｒｏＳｅｒＳｅｒＳｅｒＳｅｒＴｈｒＰｒｏＬｅｕＬｅｕＴｙｒ）のアミノ酸配列とその他のウィルス単離体との比較は１６中１３のアミノ酸（８１％）が保存されていることを示す。Ｅｎｖ−５のエピトープ地図に関するこれまでのデータはエピトープの重要部分が変異性を示す３つのアミノ酸部位（２４７，２５０および２５１）に見出されないことを示唆する。

Ｂｎｖ−１（ＨＴＬＶ−１；ａ、　ａ、　１９１−２１５）はＨＴＩ、Ｖ−１感染に高い感度（９２％）を示すが、低い割合のＨＴＬＶ−ＩＩ感染対象（８，６％）もまたこのペプチドと反応する。これはおそらくある程度の構造的相同性を反映している。

一方、Ｂｎｖ−２（ＨＴＬＶ−［１；ａ、　ａ、　１８７−２１０）はＨＴＬＶ −１（９４％）およびＨＴＬＶ−ＩＩ　（７７％）血清試料の両方と反応する。

従って、ＨＴＬＶ−１配列からのアミノ酸配列中にかなりの相違を有するＨＴＬＶ−ＩＩ配列内の領域からペプチドが選択されているけれども、実際は、エピトープがＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−ＩＦ（７）両方ニ感染した血清試料中の抗体により認識されるように類似しており、そしてＨＴＬＶ−１／ｎ感染の血清学的決定のその他のペプチドアッセイに包含され得る。

その他の研究者は組換えタンパク質を使用しくＳａｎ＋ｕｅｌＫＰ、　Ｌａｕｔｅｎｂｅｒｇｅｒ　ＪＡ、　Ｊｏｒｃｙｋ　ＣＬ、　Ｊｏｓｅｐｈ　Ｓ、　Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ　Ｐ、　ｐａｐａｓ　’ｒｓ、バクテリア産生ＨＴＬＶ−１ｚンベローブタンパク質のヒト悪性の診断性Ｓｃ霊ｅｎｃｅ　１９８４；２２６：１０９４−７ＨＴａｃｈｉｂａｎａ　Ｎ、　Ｍｉｙｏｓｈｊ　Ｉ、　Ｐａｐａｓ　ＴＳ、　Ｂｓ５ｅｘ　Ｍ。

感染者におけるヒトＴ細胞白血病ウィルスｌ型の異なる領域に対する抗体反応性、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　１９８９；６３：４９５２−７）、またエンベロープ上の抗原部位を同定するための合成ペプチドを使用した（Ｐａｌｋｅｒ　ＴＪ、　Ｔａｎｎｅｒ　ＭＢ、　５ｃｅａｒｃｅ　ＲＭ、　５ｔｒｅｉｌｅｉｎ　ＲＤ、　Ｃ１ｅｒｋ　ＭＢ、　Ｈａｙｎｅｓ　ＢＦ、Ｅ　ｎ　ｖコード化合成ペプチドを用いたヒトＴ細胞白血病ウィルスｌ型（ＨＴＬＶ−１）ｇｐ４６およびｇｐ２１エンベロープ糖タンパク質の免疫原性領域の地図作成およびｇｐ４６に対するモノクローナル抗体、　Ｊ、　ＩｍｗｔｕｎｏＬ、　１９８９；１４２：９７１−８；　Ｃｏｐｅｌａｎｄ　ＴＤ、　Ｔｓａｉ　ＷＰ、　Ｋｉｎ　ＹＤ、　０ｒｏｓｚｌａｎ　Ｓ、　ヒトＴ細胞白血病ウィルスｌ型のエンベロープタンパク質：合成ペプチドに対する抗血清の特徴および天然エピトープの同定、　Ｊ、　Ｊｎｍｕｎｏｌ　１９８６；１３７：２９４５−５１）　、例えば我々のペプチドの１種（Ｂｎｖ（、ａ、ａ、１９１−２１５）はＴ細胞およびＢ−細胞エピトープの両方を含むｇｐ４６の領域（ａ、　８．１９０−２０９）と重なる（Ｐａｌｋｅｒ　ＴＪ、　Ｔａｎｎｅｒ　ＭＥ、　５ｃｅａｒｃｅ　ＲＭ、　５ｔｒｅｉｌｅｉｎ　ＲＤ、　Ｃ１ｅｒｋ　ＭＢ、　Ｈａｙｎｅｓ　ＢＦ、　Ｅ　ｎ　Ｖ　：１一ド化合成ペプチドを用いたヒトＴ細胞白血病ウィルスｌ型（ＨＴＬＶ− １）ｇｐ４６およびｇｐ２１エンベロープ糖タンパク質の免疫原性領域の地図作成およびｇｐ４６に対するモノクローナル抗体、　Ｊ、　１ｙｕｎｏＬ、　１９８９；１４２：９７１−８；　Ｃｏｐｅｌａｎｄ　ＴＤ、　Ｔｓａｉ　ＷＰ、にｉｍ　ＹＤ、　０ｒｏｓｚｌａｎ　Ｓ、ヒトＴ細胞白血病ウィルスｌ型のエンベロープタンパク質：合成ペプチドに対する抗血清の特徴および天然エピトープの同定、　Ｊ、　ＩｔｍａｔｕｎｏＬ、　１９８６；１３７：２９４５−５１；　Ｋｕｒａｔａ　Ａ、　Ｐａ１ｋｅｒ　ＴＪ、　５ｔｒｅｉｌｅｉｎ　ＲＤ、　５ｃｅａｒｃｅ　ＲＭ、　ＨａｙｎｅｓＢＰ、　Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ　ＪＡ、ネズミヘルパーＴ細胞のヒト向Ｔ　ＩＪンバ球ウィルスＩ型エンベロープタンパク質の免疫決定部位、　Ｊ、　ＩｍｒｒｒｕｎｏＬ、　１９８９；１４３：２０２０ −３０）　、さらに最近、ヒトモノクローナル抗体と反応する組換え融合タンパク質（ＭＴＡ−４；　４２　ａ、ａ、）はＨＴＬＶ−１感染血清試料のみと特異的に反応する（Ｆｏｕｎｇ　ＳＫＨ，Ｌｉｐｋａ　ＪＪ、　Ｂｕｉ　Ｋ、ＨＴＬＶ−１の特有の免疫決定部位の確定：第８回レトロウィルス学会、ハワイに提出（要旨））。このモノクローナル抗体のエピトープはアミノ酸１８５−１９６に地図決定され（Ｒａｌｓｔｏｎ　Ｓ、　Ｈｏｅｐｒｉｃｈ　Ｐ、　Ａｋｉｔａ　Ｒ，ヒトＴ細胞白血病／向すンパ球つィルスＩ型を中和し得るヒトモノクローナル抗体に対するエピトープの同定および合成、Ｊ。

ＢｉｏＬ、　Ｃｈｅｔｔｒ、　１９８９；２６４二１６３４−６）　、我々のＥｎｖ−１ペプチドと重なる。ＨＴＬＶ−１ｇｐ４６ブラスミドｐＫＳ　３００．アミノ酸２００−３０６に相当する配列を含むプラスミド（Ｓａｍｕｅｌ　ＫＰ、　Ｌａｕｔｅｎｂｅｒｇｅｒ　ＪＡ＋　ＪｏｒｃｙｋＣＬ、　Ｊｏｓｅｐｈ　Ｓ、　ｌｌｏｎｇ−３ｔａａｌ　Ｐ、　Ｐａｐａｓ　ＴＳ、バクテリア産生ＨＴＬＶ−１エンベロープタンパク質のヒト悪性の診断性５ｃｉｅｎｃｅ　１９８４；２２６：１０９４−７）およびプラスミドＲＰ−Ｃ、アミノ酸２２９−３０８　（Ｔａｃｈｉｂａｎａ　Ｎ、　Ｍｉｙｏｓｈｉ　［。

Ｐａｐａｓ　ＴＳ、　Ｅｓ５ｅｘ　Ｍ、感染者におけるヒトＴ細胞白血病つイルスＩ型の異なる領域に対する抗体反応性＊　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　１９８９；６３：４９５２−７）　１ｉＨＴＬＶ−１感染者からの抗体により認識される。興味深いことに、Ｅｎｖ−５合成ペプチド（アミノ酸２４２−２５７）はプラスミドによりコード化された領域内に包含される。これらの研究およびここに提示されたデータはｇｐ４６のＣ末端領域がヒトにおいて高度に免疫原性であることを確認する。ＨＴＬＶ−■感染者からの血清試料がこのエピトープと反応せず、従って、ＨＴＬＶ−ｎに配分されていないＨＴＬＶ−Ｉｇｐ４６のＣ末端領域に免疫原性決定基を有しているという発見は非常に重要である。

従って、Ｅｎｖ−５ペプチドを基にしたアッセイはＨＴＬＶ−１感染とＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩ感染との識別のための単純で、低コストで、高感度で、相当に特異的な試験を提供し、そしてそれ故に、Ｈｌのウィルスを識別するために現在使用されるＰＣＲ法に容易にとって代わり得る。

発明者がペプチドを基にしたエリザにより高められた診断特異性を達成し得るという発見はＨＴＶ−１およびＨＩＶ−２感染の血清学的識別を示す初期の報告により支持される（Ｎｏｒｒｂｙ　Ｂ、　Ｂｉｂｅｒｆｅｌｄ　Ｇ、　Ｃｈｉｏｄｉ　Ｐ、等、ＨＩＶおよび関連レトロウィルスに対する抗体間の部位関連血清学を用いた識別Ｎａｔｕγｅ　、　１９８７；３２９：２４８−５０；　ＧｎａｎｎＪＷ、　ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ　ＪＢ、　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ　Ｓ、　Ｎｅ１ｓｏｎ　、ＩＡ、　ＯｌｄｓｔｏｎｅＭＢＡ、　１９８７．　ＨＩ　Ｖ　Ｉ型およびＨＩＶＺ型感染を区別する合成ペプチドイムノアッセイ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３７；１３４６−９）。ＨＴＬＶ−１の特異的免疫決定エピトープの発見は明らかな診断との関係を有するけれども、このエピトープがＴ細胞増殖またはウィルス中和抗体の誘導において有し得る潜在的役割を認識することも重要である。

ＨＴＬＶのｅｎｖ　、　ｇｔｌｇおよびｐａｌ遺伝子によりコード化されたタンパク質は感染の途上および疾病の進行の間に関連し得るウィルスの病原性および機能的特性の多くに寄与する（Ｈｏｐｐ　ＴＰ＋　Ｗｏｏｄｓ　ＫＲ＋＋　アミノ酸配列からタンパク質抗原決定基の予測Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＪＩＳＡ　１９８１；７８：３８２４−８）。保存されたアミノ酸領域からの予測された抗原エピトープを有する一連の合成ペプチドを用いて、本発明者はＢ細胞特異的抗体認識に対してＨＴＬＶ−１とＨＴ　Ｌ　Ｖ−Ｉｔ内の構造モチーフを位置決定することを試みた。ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−Ｉ［の両方のｇ（Ｘｇおよびｐａｌ領域から誘導された種々のペプチドの中で、わずかに２つがＨＴＬＶ−１／ｎ感染個体からの特異的血清と反応する。ｐ１９タンパク質のＣ末端から決定されたＧ　ａ　ｇ　−１ａ　（ＨＴＬＶ−［；ａ、　ａ、　１０２−１１７）は最高の免疫決定エピトープであり、低い割合のＨＴＬＶ −ＩＩ感染血清もまたこのペプチドと反応する（１１％）。これはＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−Ｉ［との間のある程度の抗原相同性を反映している。

さらに、Ｇａｇ−１ａに対する血清抗体反応性はＨＴＬＶ−１上に存在する立体配座的に「本来の」エピトープを示すＨＴＬＶ−１で特異的に阻害され得る。それ故に、アミ、）酸配列Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　ｌｉｅを有するＧａｇ−１ａペプチドはＨＴＬＶ−Ｉ感染者のほとんどからの血清抗体により認識されるＨＴＬＶ−１の免疫決定ドメインを示す。さらに、Ｇａｇｌａを基にしたイムノアッセイは密接に関連したＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−ＩＩ感染の血清学的識別を可能にする。

ｐ　１９　ｇａｇタンパク質のＣ末端領域の免疫決定は２つのその他の発見と結びついている。Ｐａ１ｋｅｒ等（Ｐａｌｋｅｒ　ＴＪ、　５ｃｅａｒｃｅ　ＲＭ、　Ｃｏｐｅｌａｎｄ　ＴＤ、　０ｒｏｓｚｌａｎ　Ｓ、Ｈａｙｎｅｓ　ＢＦ。

１９８６、ヒト向Ｔリンパ球つィルスＩ型（ＨＴＬＶ−１）ｐ１９コアタンパク質のＣ末端領域はヒトにおいて免疫原性であり、そしてＨＴＬＶ−１特異的エピトープを含む。Ｊ、　Ｉｒｚｒｎｕｎｏｌ、　１３６：２３９３−２３９７）は試験した８血清試料中６と反応する我々のＧａｇ　ｌａ下流のｐ１９のＣ末端にあるエピトープを記載した。彼らの研究において、８試料の２だけがＧａｇ　ｌａと重なるエピトープに反応性を示し、そして彼らの研究において使用される試験系の感度に起因し得る。さらに最近、Ｋｕｒｏｄａ等（ＫｕｒｏｄａＮ、　Ｗａｓｈｉｔａｎｉ　Ｙ、　５ｈｉｒａｋｉ　Ｈ，Ｋｉｙｏｋａｗａ　Ｈ，０ｈｎｏ　Ｍ、　５ａｔｏ　Ｈ，Ｍａｅｄａ　Ｙ、　１９９０．　合成ペプチドを用いることによるヒト向Ｔリンパ球つィルスＩ型に対する抗体の検出。

Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　４５．８６５−８６８）はＨＴＬＶ−１感染血清試料と１００％反応するＩ）１９のＣ末端のアミノ酸１００−１３０内に包含される免疫決定エピトープを報告した。ＨＴＬＶ−Ｉｔ感染血清試料に対するこのペプチドの特異性はかれらの研究では試験されていない。これらの研究およびここに提示されたデータはｐ１９のＣ末端領域が高度に免疫原性であることを確認し、そしてｐ１９のＣ末端がＨＴＬＶ−１特異的である株特異的エピトープを含むことを示す。

レトロウィルスの自然感染において、宿主は一般にｇａｇもしくはｅｎｖまたは両方の産物に対する抗体を作る（Ｓｃｈｕｐｂａｃｈ　Ｊ、　Ｋａｌｙｎａｒａｍａｎ　Ｊ、　Ｓａｒｎｇａｔｉａｒａｎ　Ｇ、　Ｂｌａｔｔｎｅｒ　Ｗ、　Ｇａ１ｌｏ　Ｒ，１９８３，成人工細胞白血病−リンホーマ患者およびカリブ人からの健康ブランクにおけるヒトＣ型レトロウィルス、ヒトＴ細胞白血病−リンホーマウィルスの３種の精製タンパク質に対する抗体、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４：ＬａＢ５−８９１；　Ｇａ１ｌｏ　Ｄ、Ｈｏｆｆｍａｎ　ＭＮ、Ｌｏｓｓｅｎ　ＣＫ、Ｄｉｇｇｓ　北。

Ｈｕｒｓｔ　ＪＷ、　Ｐｅｎｎｉｎｇ　ＬＭ、　１９８Ｂ、ヒトＴ細胞白血病ウィルス夏型に対する抗体の検出するための免疫蛍光、酵素イムノアッセイおよびウェスタンプロット（イムノプロット）法の比較、　Ｊ、　ＣＬｉｎ、　ＭｉｃｒｏｂｉｏＬ、　２６．１４８７−１４９１）。

ＨＴＬＶ−１７ＴＩ感染の間のｐａｌ遺伝子産物に対する抗体応答は記載されていない。ここに提示された結果はＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−Ｉｔに感染した個体の大部分がｐｏＬ遺伝子の中央領域から誘導されるペプチドに対する検出可能なレベルの抗体を有することを示す。ここに示された結果は、ＨＩＶ感染の間のｐａｌ遺伝子産物に対する抗体応答性と同様に、ＨＴＬＶ−１ｐｏＬ遺伝子産物ちまた、抗体応答を誘導することを明らかに示す。このペプチドに対して生起させた抗血清はｐｏＬ遺伝子産物の構造的特徴を評価する一助となるであろう。

実施例１方法全体で種々の研究群からの１８６の血清試料が本研究のために選択される（表１）。

表１：被験者の標準血清学的結果及びＰＣＲデータ血清学　ＰＣＲ確認群ＨＩＬＶ−１／ＩＩ　ＨＩＶ−１１１ＴＬＶ−Ｉ　ＨＴＬＶ−ＩＩグループ　被験者の数ＨＩＬＶ−［アメリカ居住者本　２０　＋　−＋　−日本人　３２＋Ｎ口ｎ　ＮＯｎ−１アメリカ居住者　２Ｂ　−＋　ＮＯＮＯその他本京本　５０　−　ＮＯＮＯＮ口正常者　２１　−　−　ＮＯＮＤ＊グループ中の２人はカリブ系アメリカ居住者＊＊ＮＤ−未決定＊＊＊レトロウィルスに感染していない患者からの血清ＨＴＬＶ−１／ｎに対して血清陽性である対象からの８７試料を血清から誘導する。鹿児島系のＭ、　Ｏｓａｍｅ博士により親切にも提供された３２試料を除き、全ての試料は同一人からの末梢血リンパ球を用いるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）７．（＝イによりＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−Ｉ［陽性者であることが決定されている（Ｄｅ　Ｂ、　Ｓｒ＋ｎｉνａＡ、ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）およびヒト向リンパ球つィルスＩ型または■型二重感染のポリメラーゼ鎖反応による検出、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１９８９；４：１５８３−５）　ｏ　ＰＣＲ確認された５５試料のうち２０がＨＴＬＶ−１感染者からであり、その他の３５がＨＴＬＶ−ｎ感染者由来である。ＨＴＬＶ−１感染の２０対象のうち１３がＡＴＬまたはＨＡＭ／ＴＳＰ症候群のいずれかを有し、そしてその他の７が徴候性血液供与者である。ＨＴＬＶ−■感染対象はほとんどが静脈薬剤使用者である。この群の中の２０血清試料は市販のものから得られる（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ、、ジョーシア州マリエツタ）。

比較のために、徴候性（ｎ＝１０）または後天性免疫不全症候群（エイズ）（ｎ＝１８）を表している確認されたヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩ　Ｖ）感染を有する患者２８人からの血清試料が試験される。種々のその他の症状を有する患者（ｎ＝５０）からの血清試料が特異的干渉を試験するために使用される（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ＤＷ、　Ｂｐｓｔｅｉｎ　ＪＳ、　Ｌｅｅ　ＴＨ等、健常者血液および血漿供給者におけるヒト向リンパ球ウィルスｌ型感染の血清学的確認、　Ｂｌｏ。

ｄ　！９８９；７４：２５８５−９１）。これらの試料はリュウマチ因子（ｎ＝８）、核抗体（ｎ＝８）および抗ＨＬＡ　ＤＲ抗体（ｎ＝１）を存するもの、ウィルス感染（サイトメガロウィルス、ｎ＝３；ニブシュタイン−パルウィルス、ｎ＝３；単純ヘルペスウィルス、ｎ＝３：Ｂ型肝炎ウィルス、ｎ＝４：および風疹ウィルス、ｎ＝３）を有するもの、および寄生的感染（ＰＬａｓｗｒｏｄｉｕｒｒｔ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｙｒ　、　ｎ　＝８　；　ＴｏｘｏｐＬａｓｒｒｒａ　ｇｏｎｄｉｉ　、ｎ＝　８　：　Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｃｒｕｚｉ、　ｎ　＝　５　；　５ｃｈｉｓｔｏｓｏｒｔｒａ　ｒｔｒａｎｓｏｎｉ　、ｎ　＝　５　；　ＳｔｅｒｏｎｇｙＬ。

１ｄｅｓ　５ｔｅｒｃｏｒａＬｉｓ、ｎ　＝　６　；　Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ　ｂａｎｃｒｏｆｔｉ、　ｎ＝５）を有するものを包含する。２１の正常血清供給者からの血清試料は陰性対照として作用する。

参照ＨＴＬＶおよびＨＩＶ抗体試験患者血清試料は市販の酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＨＴＬＶ−１エリザ、デュポン、プラウエア州つイリントン）を用いて製造業者の推奨に従ってＨＴＬＶ−１抗体に対して最初に試験される。繰り返し反応性である試料が以前に記載されたようにウェスタンプロットおよび放射性免疫沈殿アッセイによりさらに試験される（Ｈａｒｔｌｅｙ　ＴＭ、Ｋｈａｂｂａｚ　ＲＰ、Ｃａｎｎｏｎ　ＲＯ，Ｋａｐｌａｎ　Ｊ８．　Ｌａｉｒｍｏｒｅ　ＭＤ、イムノプロットおよび放射性免疫沈殿アッセイを用いたヒト向すンパ球つィルスＩ／ＩＦ型に対する抗体反応性の特徴、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　ＭｉｃｒｏｂｉｏＬ、　１９９０；２８，６４６−５０）。簡単にいえば、カリフォルニア州サイプレスのヒルフレスト・バイオロジカルズから入手した精製されたＨＴＬＶ−１抗原（ＭＴ−２細胞株、　Ｍｉｙｏｓｈｌ　Ｉ、にｕｂｏｔａｎｉ　１．　Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ　Ｓ等、正常ヒトコード白血球およびヒト白血球Ｔ細胞を一緒に培養することにより誘導されたコードＴ細胞系中のＣ型つ−ｆルス粒子、　Ｎａｔｕｒｅ　１９ｆｌｌ；２９６：７７０−３）がドデシル硫酸ナトリウム試料緩衝液（０，１２５Ｍ）リス塩酸、ｐＨ６，８，５％２ＭＢ、４％５ＤＳ）中に希釈され、３分間煮沸され、そして３％のスタッキングゲルを含む１０％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動される。分離されたタンパク質はニトロセルロース紙上に電気プロットされる。個々のストリップを血清の１：１００希釈物と保温し、モしてｍｌあたりビオチニル化ヤギ抗ヒト（重鎮および軽鎖）免疫グロブリンＧ（ベクター・ラボラトリーズ、カリフォルニア州バーリンゲーム）５ｍｇと１時間保温する。アビジン−ビオチン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体との反応の後に、洗浄し、免疫反応を基質としてジアミノベンジジン−塩化ニッケルー過酸化水素で可視化する。放射性免疫沈殿アプセイのために、ＭＴ−２細胞株を代謝的に標識する（　（”Ｓ）システィンおよび（”Ｓｏｌメチオニン（二ニー・イングランド・ヌクレアー、マサチューセッツ州ボストン）で各アミノ酸２００ｍＣ１／１０”細胞／ｍｌ）。

標識された細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、そして０．１％ＳＤＳと０．０２％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳ中に抽出する。界面活性剤で可溶化されたタンパク質を血清試料と反応させ、プロティンＡセファロ特表千７−５０２４８３　（１１） −スゲル上で電気泳動し、次に乾燥ゲルのオートラジオグラフィーを行う（ｔＩａｒｔｌｅｙ　ＴｉＮ、にｔ＋ａｂｂａｚ　ＲＰ、　Ｃａｎｎｏｎ　ＲＯ、Ｋａｐｌａｎ　ＪＢ、　Ｌａｉｒｍｏｒｅ　ＭＤ、イムノプロットおよび放射性免疫沈殿アッセイを用いたヒト向リンパ球つィルス■／■型に対する抗体反応性の特徴、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　ＭｉｃｒＯｂｉｏＬ、　１９９０；２８．６４６−５０）。ウェスタンプロットまたはＲＩＰＡ分析のいずれかにより抗体反応性が少なくとも２種の異なるＨＴＬＶ構造遺伝子産物Ｃｇａｇ　ｐ２４および／またはｅｎυ［１ｐ４６および／またはｇｐ６８）に対して検出されるならば、血清試料はＨＴＬＶ−１／ＩＩ陽性であると決定される。ｇａｇまたはｅｎｖ遺伝子産物だけと反応する血清試料は不明確であると考えられ、そして本研究の中に含められない。

ＨＴＶタンパク質に対する抗体はエリザおよびウェスタンプロット（デュポン）により決定され、そしてｇａｇおよびｅｎＤタンパク質の両方に対する抗体を存する試料だけが包含される。

ポリメラーゼ鎖反応アッセイポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は以前記載された反応条件を用いて患者末梢血白血球から単離された全ゲノムＤＮＡでもって行われる（ＳａｉｋＪ　Ｒ，Ｇｅ１ｆａｎｄ、　５ｔｏｆｆｅｌ　Ｓ等、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを有するＤＮＡのプライマー指示酵素増幅５ｃｉｅｎｃｅ　１９８８；２３９：４８７−９）、　ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−ＩＩののｐｏＬおよびｇｃＬｇ遺伝子からのオリゴヌクレオチドプライマー対が各ＰＣＲ増輻に対して全ゲノムＤＮＡ１ｍｇを増幅するために使用される（Ｄｅ　Ｂ、　５ｒｉｎｉｖａ　Ａ、　ヒト免疫不全症ウィル、＋、（Ｈ１■）およびヒト向すンパ球つィルスＩ型または■型二重感染のポリメラーゼ鎖反応による検出、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１９８９；４：１５３３−５）。ＰＣＲ確認された５５試料のうち２０がＨＴ：　Ｄｅ　Ｂ、　５ｒｉｎｉｖａ　Ａ、ＰＣＲによるＨＴＬＶ−１検出の多重プライマー対ＮｕｃＬｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１９８９；１７：２１４２）。増幅された生成物は５．　０％ポリアクリルアミドゲル上で分析され、そして特異的ｐｏＬおよびｇａｇヌクレオチドｓａｐ標識プローブを用いてサザンブロットハイプリダイゼーションによりさらに確認される。ＭＴ−２細胞（ＨＴＬＶ−１）　、ＭＯ− Ｔ　（ＨＴＬＶ−ＩＩ）およびＨｕｔ−７８（未感染）からのゲノムＤＮＡ調製物が対照として使用される。試料は２種の分離した遺伝子産物中のプライマー対との反応性に基づいてＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＩ４陽性として決定される。

ペプチド選択および合成発表されたアミノ酸配列を用いて（Ｍｙｅｒｓ　Ｇ、　Ｊｏｓｅｐｆ　ＳＦ、　Ｒａｂｓｏｎ　ＡＢ、　Ｓｍ１ｔｈ　ＴＰ、　Ｗｏｎｇ−３ｔａａｌ　Ｆ　ヒトレトロウィルスおよびエイズ中、　Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔ。

「ｙ、ニューメキシコ州ロスアラモス、　１９８８）　、発明者等はそれらのエンベロープ領域中にＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−Ｉｆ配列を並べた。４種のペプチドが、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−ＩＩが相当のアミノ酸の相違を示す領域を同定することにより合成のために選択される（図１）。システィン残基はここでは報告されていない研究のためのタンパク質との結合を促進するために各ペプチドのＮ末端に添加される。エンベロープタンパク質の二次構造特徴が「ペッププロットプログラム（Ｍ、　ＧｒｉｂｓｋＯｖ、ライスコンシン大学、ウンスコンシン州マジソン）中にアミノ酸配列を入力することにより予測され（ＣｈｏｕＰＹ、　Ｆａｓｍａｎ　ＧＤアミノ酸配列からタンパク質の二次構造の予測Ａｄｖ、　ＥｎｚｙｒｔｔｏＬ　１９８７；４７：４５）　、そして親水性はＨａｏｐおよびＷｏｏｄｓの方法により計算される（Ｈｏｏｐ　ＴＰ、　Ｗｏｏｄｓ　ＫＲ，アミノ酸配列からのタンパク質抗原決定基の予測、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ、　１９８１；７８：３８２４−８）。

合成ペプチドは９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏ　ｃ）化学を用い、ＭｉｌｌｉＧｅｎ　９０５０ペツプシンセサイザー上で製造業者の試薬および推奨された化学サイクルを使用して製造される。ペプチドは樹脂から切断され、沈殿され、そして無水エーテルで数回抽出される。最終精製はＷａｔｅｒｓ　Ｃ１８Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ　（１９ｍｍ　Ｘ　３０ｃｍ、１５ｕ粒子、８００ｕ孔径）上、出発溶媒として水、次に０．１％ＴＦＡ中の０−５０％アセトニトリルグラジェント中で調製高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりなされる。アミノ酸組成、アミノ酸配列分析および分析逆相ＨＰＬＣはペプチド配列および純度を確認するために行われる。

合成ペプチドに対する抗体の定量評価ポリビニルプレート（イムロンＬ　ダイナテックラボラドリーズ社、バージニア州アレキサンドリア）を０゜０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）中の合成ペプチド（１００μｇ／ｍ１）５０μ！で被覆し、そして４℃で一晩保温する。プレートを０．０５％ツイーン−２０含有ＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ｔ）で６回洗浄し、そして各ウェルをＰＢＳ−Ｔ中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００ｍｌと３７ ℃で１時間保温して、過剰反応部位をブロックする。ウェル洗浄後、各試験血清の１：２０希釈物を２つのウェルに添加し、そしてプレートを８７℃で９０分保温し、そしてＰＢＳ−Ｔですすぐ。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（シグマ、ミズーリ州セントルイス）を添加し、室温で９０分保温し、次いでｐ−ニトロフェニルホスフェート（シグマ）基質を添加する。プレートをエリザリーダー（ＳＬＴ　Ｌａｂインストルメント、オーストリア）により４０５ｎｍで読み取る。各血清試料はまた、ＢＳＡまたは非関連合成ペプチドで被覆されたプレート中でアッセイされ、非特異的抗体結合を制御する。血清陽性は正常対照の平均値＋３ｆｌＩＩＩ準偏差より大きい値と決定される。

競合阻害アッセイ悟性ペプチドに結合する抗体の阻害はエリザにおいて合成ペプチドまたは精１！ＨＴＬＶ−１もしくはＨＴＬＶ−■抗原（１−１０ｍｇ／ｍ１）の高まる濃度の添加により行われる。血清はそれがＥｎｖ−５ペプチド被覆プレートに添加される直前に阻害抗原と混合され、上記アッセイが行われる。結果は抗体結合の％阻害として表現スチューデントを試験が上記の統計学的評価のために使用される。

結果合成ペプチドに対するヒト抗体の定量非競合的酵素結合イムノソルベントアッセイ（エリザ）が固相として合成ペプチド（Ｅｎｖ−Ｌ　Ｂｎｖ−２およびＥｎｖ−５）を用いて開発され、ＨＴＬＶ− Ｉ／■感染対象において株特異的抗体を検出する。一連の実験において（データは示されていない）、アッセイ内およびアッセイ間変異係数（ＣＶ）はそれぞれ１５％および８％未満である。このアッセイ仕様がＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ −ｎに感染した患者からの血清試料の集まりにおいて抗体を検出するために使用される場合、ＨＴＬＶ−１群中の血清陽性の最高％（１００％）がＥｎｖ−５、Ｅｎｖ−１、Ｅｎｖ−２、Ｇａ１ｔａおよびＰｏｌ−３に対して観察される。

表２−合成ペプチドに対する血清試料の反応性陽性の数本［！ｎｖ−Ｉ　Ｅｎｖ−２［！ｎｙ−５Ｇａｇｌａ　Ｐａ１−３グループ　被験者の数Ｈルν−１５２４８（９２）木本　４９（９４）　５２（１００）　５０（９６）　５０（９６）ＨＴＬシーＩＩ　３５　３（８，５）　２７（７７）　０（０）　６（１１，５）３４（８Ｂ）ＨＩＶ−１２８０（０）　ＮＤｍ　０（０）　０（０）　０（０）その他感染　３４　０（０）　ＮＯ０（０）　０（０）　０（０）対照　２１　０（０）　０（０）　０（０）　０（０）　３（１４）本２１の正常の対照の平均値＋３Ｓ、０より大きｃｔＯ，Ｄ＋こより決定された陽性値＊＊かっこ内の数は陽性％である＊＊＊ＮＤ−未決定３５のＨＴＬＶ−ＩＩ感染血清試料はいずれもＥｎｖ−５と反応しない。

Ｅ　ｎ、　ｖ　−１はＨＴＬＶ−１感染者からの血清試料と高度の反応性を示しく４８１５２：９２％）、そしてＨＴＬ　Ｖ　−ＩＩ感染者からの試料といくらかの交差反応を示す（３／８５．８．６％）ｏＥｎｖ７はＨＴＬＶ−ＩＩ配列から誘導されたものであるけれども、ＨＴＬＶ−Ｉ感染者とも（４９１５２７９４％）　、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染者とも（２７／３５．７７％）とも強く反応する。

正常対象からの２１血清試料およびＨＩＶを含むその他の感染を存する対象からの７８試料のものは、これらのペプチドと何ら反応しない。

ＨＴＬＶ−１のｇａｇコード化タンパク質から誘導されたＧａｇ　ｌａ　（ＨＴＬＶ−１；ａ、ａ、１０２−１１７）と命名される合成ペプチドの１種はＨＴＬＶ−１感染者からの血清試料と高度の反応性を示しく４７１５２；９０％）　、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染者からの試料とい（らか交差反応するＣ４７８５　；　１１％）（表２）ａｐｏｔ：Ｉ−ド化遺伝子タンパク質から誘導された６種のペプチドの中で、ｐｏｌ−８（ＨＴＬＶ−１；ａ、ａ、４８７−５０２）だけがＨＴＬＶ−１感染血清試料（５０１５２。

９６％）およびＨＴＬＶ−Ｉｔ感染血清試料（３０／！３５；８６％）の両方と反応する。

Ｅｎｖ−５により検出された抗体の特異性ＨＴＬＶ−１およびＨＴＩ、Ｖ−Ｉ［感染患者からの血清試料の血清学的交差反応性は十分に論じられている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ＤＷ、　Ｂｐｓｔｅｉｎ　ＪＳ、　Ｌｅｅ　ＴＨ等、健常者血液および血漿供給者におけるヒト向すンパ球つィルスＩ型感染の血清学的確認、　Ｂｌｏｏｄ　１９８９；７４：２５８５−９１；　Ｌｅｅ　Ｔ、　ＣｏｌｊｇａｎＪ、Ｈ，、Ｈｏｍｍａ　Ｔ、　ＭｃＬａｎｅ　Ｍ、Ｐ、等、Ｉ型および■型ヒトＴ細胞白血病ウィルスのエンベロープタンパク質問の血清学的交差反応性Ｐｒｏｃ、　Ｍａｔｅ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　！ＪＳＡ　、　１９８４；８ｉニア５７９）。本発明者等はＥｎｖ−５に基づくアッセイで高感度（ＨＴＬＶ−１に対して１００％）および特異性（■に対する交差反応性なし）を観察したので、彼らは、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染研究集団がＨＴＬＶ−１ウイルス抗原を利用する標準血清学的アッセイにおいて交差反応する抗体を実際に含むかを確認することを希望した。Ｈ］′Ｌ　Ｖ　−ＩＩ感染対象からの全部で３５の血清試料はＨＴＬＶ−１に対する抗体のレベル（２１の正常対照の平均より＞３３Ｄ）を存し、そしてこれらのＨＴＬＶ−１感染対象およびＨＴＬＶ−ＩＩ感染した者との間に抗体レベルの存意な差がなイＣＰ　＞　０．０５　）　（図２）、ＨＴＬＶ−■感染対象からのこれらの試料がＥｎｖ−５に基づ（アッセイにおいて試験されるとき、ＨＴＬＶ−１に対する血清学的アッセイにおいて観察された交差反応性はもはや観察されない（図２）。この著しく高められたＥｎｖ−５アツセイの特異性は試験の診断感度に絶対に影響を及ぼさないであろう。ＨＴＬＶ−１に感染した無徴候性日本人患者からの３２試料およびＨＴＬＶ−１感染者（ＰＣＨにより！認された）からの２０試料のうち、全てがＥ　ｎ、　ｖ　−５アツセイで陽性である。さらに、無徴候性日本人患者とらのＰＣＨにより確認されたＨＴＬＶ−１感染者との間にＥｎｖ−５に対する抗体レベルにおける有意な差は統計学的にないＣＰ　＞　０．０５　’）。

Ｅｎｖ−５の特異性をさらに示すために、本発明者等は次に、血清試料をＥｎｖ −５ペプチドならびにＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−、ＩＩ抗原で予め沈殿させることにより、４人のＨＴＬＶ−１感染患者からの血清試料を用いて競合阻害実験を行う。Ｅｎｖ−５に対する抗体反応性は、Ｅｎｖ−５またはＨＴＬＶ−１タンパク質との予備保温により添加量に依存して特異的に阻害され得、一方、ＨＴＬＶ−ＩＩタンパク質または非関連ペプチドとの保温は何らかの阻害を示さない（図３）。

Ｇａｇ　ｌａおよびＰｏ１−３に訂る抗体の分布抗体の相対的分布を評価するために、ペプチドに対する抗体の血清レベルがＨＴＬＶ−１感染者（無徴候性およびＨＡＭ／ＴＳＰ）　、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染者（無徴候性）および正常対照において比較される。この群の中で、無徴候性およびＨＡＭ／ＴＳＰである人々においてＧａｇ　ｌａに対する抗体のレベルに有意の差はないＣＰ＞０．０５）。これに対し、Ｐａ１−３の血清反応性はＨＴＬＶ−１無徴候性個体と比較した場合、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者において有意に高かった（図４）。このペプチドと反応するＨＴＬＶ−Ｉｆからの血清試料と抗体のレベルの有意な比率は１（ＴＬＶ−１感染無徴候性個体におけるレベルと同様である。さらに、正常供給者からの３５血清試料のうち４つがＰｏ１−３に対して低レベルの反応性ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−ＩＩ両方のｇａｇおよびｐ。

Ｌタンパク質の二次構造の特徴はＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎにより開発されたコンピュータアルゴリズムを用いることにより分析される（Ｃｈｏｕ　ＰＹ、　Ｆａｓｍａｎ　ＧＤアミノ酸配列からタンパク質〕二次構造の予ｆｌｌ　Ａｄｖ、　ＥｎｚｙｍｏＬ　１９８７；４７＋４５）。図５はＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−ＩＩのｇａｇ領域に対する二次構造予測を示す。高い抗原インデックスのドメインが構造骨格上に付加されている。抗原インデックスは親水性、柔軟性および表面現出性の組合せ数値に対して表面ドメインを予測するための、ＩａｍｅｓｓｏｎおよびＷｏｌｆにより設計されたアルゴリズムである（Ｃｈｏｕ　ＰＹ、　Ｆａｓｍａｎ　ＧＤタンパク質コンファメーションの予測Ｂｉｏｃｈｅｒｒｒオｓｔγｙ１３．２２２−２４４）。高いインデックスを有する４つの領域の１つがＱａｇ　ｌａミドメインにある。その他の３つの抗原決定基はＣ末端近傍に位置している（アミノ酸番号３３７−３４２．３９０−３９５および４０２− ４０８）。ＨＴＬＶ−Ｔ１ｇａｇ内の３つの最高抗原インデックスはアミノ酸位置３４３−３４８．４０１−４０８によＵ２Ｏ５−４１１にある。ＨＴＬＶ−ＩＩ配列内ニソのような構造的モチーフの不在（図５Ａおよび５Ｂ）はＨＴＬＶ− ＩＴに感染した個体からの血清中のこのペプチドに対する抗体応答性の欠如に関連すると考えられる。

ＨＴＬＶ−１のｐｏｔタンパク質の同様の分析は高親水性および抗原インデックスの領域に位置しているＰｌｏ−３を示す。これに対して、その他のペプチド例えばＰ。

１１ａおよびＰｏ１−４は高い抗原インデックスを示すけれども、感染個体からの１０％未満の血清はこれらのペプチドと反応しない（データは示されていない）。

以下の実施例において、グルタルアルデヒド０．２５重量％がプレートまたはビーズ上へのより良好なペプチド結合を促進する被覆緩衝液中に添加されてもよい。さらに、西洋ワサビパーオキシダーゼ結合マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体が西洋ワサビパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃ）の代わりに第２抗体トレーサーとして使用され得る。

これらの方法において使用されるゼラチンはウシ皮膚ゼラチン、ブタ皮膚ゼラチン、魚ゼラチンまたはあらゆる公知の利用可能なゼラチンタンパク質を包含し、またアルブミンタンパク質と交換され得る。

実施例２酵素結合免疫吸着検定によるＨＴＬＶ−１またはＨＴｙ、　ｖ　−ｎへの抗体の検出９６ウエルのウェルを、ウェル当り１．５ｍｇの本発明の少なくとも一種のペプチド（１００ｍｌの１０ｍＭＮ　ａ　ＨＣＯｓ緩衝液、ｐＨ９，５中の混合物）を使用して４℃で一夜（または室温で３時間）被覆する。

ウェルをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、次いで３７℃で１時間にわたりＰＢＳ中の３重量％ゼラチン液の２５０μｍで保温し、非特異性タンパク質接合部位をブロックし、次いでツイーン２ｏを０．０５容量％含有するＰＢＳで３回またはそれ以上洗浄する。

試験血清（ヒト患者または正常個人から採取の血液）を、ＰＢＳ（２０容積％の正常ヤギ血清、１重量％のゼラチンおよび０．０５容積％のツイーン２ｏを含有）で１：２０と１：２００の体積比で各々希釈する。

希釈した血清の２００ｍＩを各々のウェルに添加し、３７℃で１時間反応させる。ウェルをＰＢＳ中０．０５容積％のツイーン２０で３回洗浄し結合しなかった抗体を除く。ホルセラジッシ・パーオキシダーゼが結合したヤギの抗−ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）を、陽性のウェル中で形成したＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−ＩＩと結合させるための第二の抗体トレーサーとして使用する。ＰＢＳ中の１容積％の正常ヤギ血清、゛０．０５容積％のツイーン２０中に１＋３０００で希釈したパーオキシダーゼ標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧを各々のウェルに添加し、更に１５分間３７℃で保温する。

ウェルをＰＢＳ中の０．０５容積％ツイーン２ｏで５回洗浄して未結合の抗体を除き、次いで基質混合物（クエン酸塩緩ｌｉｔ、ｐ）Ｉｓ、Ｏ中に０．０４重量％のオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）と０．０１２容積％の過酸化水素を含有する。）の１００μｌと反応させた。

この基質混合物を使用ｌ、２て、着色生成物を形成することによりパーオキシダーゼ標識体を検出する。

反応を１．０Ｍ　ＨｔＳＯｓの１００ｍ１の添加ニより中止し、４９２ｎｍ（即ち、Ａ＝ｓ＊）でのエリザ読み（ＥＬＩＺＡ　ｒｅａｄｅｒ）を使用して測定した。

検定は、陰性対照として使用したＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−ｎ感染に無関係の病気の患者からまたは正常の個人からの血清の一回の希釈（１：２０）を使用し２て２回実施する。締切値Ａ４゜＝０．１２の値より大きい吸収読、（（Ａ４ｗｔの正常血清対照平均値）の約３倍は陽性として採用される。〕実施例３実施例２の方法を、ウェルをウェル当り１ｍｇの熱不溶性化−ＮＰ４０可溶化ＨＴＬＶ−１で予備被覆する以外は、実施例２におけるのと同じ血清試料を使用して繰免疫放射測定検定（Ｉ　ＲＭＡ）によるＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−ｎの抗体の検出柔軟−ポリ塩化ビニル（ＰＶ）製９６−ウェルのウェルを、ウェル当り１．５ｍｇの本発明の少なくとも一種のペプチド（１００ｍｌの１０ｍＭＮａ１−ＩＣＯ＊緩衝液、ｐＨ９，５中の混合物）を使用して４°Ｃで一夜（または室温で３時間）被覆する。ウェルをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、次いで３７℃で１時間にわたりＰＢＳ中の３重量％ゼラチン液の２５０μｌで保温し、非特異性タンパク質接合部位をブロックし、次いでツイーン２０を０．０５容量％含有するＰＢＳで３回またはそれ以上洗浄する。

試験血清（ヒト患者または正常個人からの血液から採取）を、ＰＢＳ　（２０容積％の正常ヤギ血清、１重量％のゼラチンおよび０．０５容積％のツイーン２０を含有）でｌ：２０と１：２０００の体積比で各々希釈する。

希釈した血清の２００ｍ１を各々のウェルに添加し、３７℃で１時間反応させる。ウェルをＰＢＳ中０．０５容積％のツイーン２０で３回洗浄し結合しなかった抗体を除く。ｌ−１２５−標識アフィニティで精製したヤギの抗−ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）を、陽性のウェル中で形成した抗体−抗原複合体と結合している第二の抗体トレーサーとして使用する。

ＰＢＳ中の１容積％の正常ヤギ血清、０．０５容積％のツイーン２０中の５０，０００−２００，０００ｃｐｍの１−１２５標識ヤギ抗ヒトＩｇＧの１００μｌを各々のウェルに添加し、更に１時間３７℃で保温する。

ウェルをＰＢＳ中の０．０５容積％ツイーン２ｏで５回洗浄して結合しなかった第二の抗体を除きそして乾燥する。

ウェルを切断し、ガンマ−シンチレーションカウンターにより測定する。検定は容積比１：２０の希釈を使用して２回実施する。陰性対照としての正常の血清試料も同時に試験する。〔正常血清試料の平均読み＋４ＳＤ（標準偏差）〕より大きいｃｐｍ読みは陽性として採用さ固相の免疫吸着剤としての、本発明の少なくとも一種のペプチドで被覆した、ゼラチン粒、異なる種の動物の赤血球またはラテックス・ビーズを使用する血球凝集反応によるＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ− １［に対する抗体の検出。

充分に洗浄した赤血球、ゼラチン粒、ポリスチレンラテックスビーズを、５　ｍ　ｇ　／　ｍ　１ないし１ｍｇ／ｍ＋の範囲内の濃度で本発明のペプチドの少なくとも一種を被覆する。

次いで、ペプチド混合物で被覆した細胞、粒またはビーズを９６−ウェルのＵ型のミクロプレートのウェル中の連続的に希釈した血清試料と共に保温する。室温に約１時間放置した後、底部における凝集反応パターンを判読し、陽性の反応を示す最大の希釈度を記録する。

これは、血清または生体液を包含する標本におけるＨＴＬＶ−１またはＨＴ　Ｌ　Ｖ−ＩＩに対する抗体の存在の定性的および定員的分析の両方のために使用できる一段階の検定法である。

実施例６複数の９６−ウェルのＵ型ミクロプレートと材料を含む仕切りした封入物からなる血球凝集検定、または（１）少なくとも本発明の一種のペプチドで被覆した赤血球、ゼラチン粒またはラテックスポリスチレンビーズを含有するビン；（２）正常のヒト血清（陰性対照として）；および（３）熱不活性化した血清陽性のＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−ＩＩ血清（陽性対照として）からなる血球凝集検定を使用するＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−ＩＩ検出のための第三の試験キッキ。実施例２に記載した方法に従う。

実施例７ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−ＩＩ抗体検出のための診断試験キットを構成できる。

試験キットは、仕切られた封入物からなり、その封入物は、１００ｍ１のｐ　Ｈ９，５の１０ｍＭのＮ　ａ　ＨＣＯを緩衝液中の本発明の少なくとも一種のペプチドをウェル当り１．５ｍで使用に先立ち被覆される複数の９６−ウェル・プレートを含む。

そのキットは更に、（１）正常ヒト血清（陰性対照として）：（２）熱不活性化したＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−Ｉ［血清陽性血清（陽性対照として）；（３）正常のヤギ血清；（４）パーオキシダーゼ標識化−ヤギ抗ヒトＩｇＧ；および（５）リン酸塩クエン酸緩衝液中のオルトフェニレンジアミノ（ＯＰＤ）の変色指示薬および過酸化水素の別々の封入容器中の酵素検出のための材料からなる。

この方法は、実施例２に記載した方法に従う。

この試験では、本発明のペプチドで前被覆した９６−ウェルプレートは、同相免疫吸着体として使用するために本発明のペプチドで前被覆したポリスチレンビーズ、または調節した孔径のガラスピーズで充填した複数のミ二カラムまたはニトロセルロースストリップに換えることができる。

実施例８免疫放射線測定検定（Ｉ　ＲＭＡ）を使用する抗体を検出するための第二の試験キットは、仕切られた封入物からなり、そしてその封入物は本発明の少なくとも一種のタンパク質をウェル当りｐＨ９，５の１０ｍＭＮａＨＣＯｓ緩衝液１００ｍＭ中の１．５ｍｇのタンパク質で前被覆した複数の９６−ウェル柔軟性ポリ塩化ビニル（１）正常ヒト血清（陰性対照として）；（２）熱不活性化したＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−Ｉｆ血清陽性血清（陽性対照として）：（３）正常のヤギ血清；および（４）　Ｉ　−１２５標識化したヤギ抗ヒトＩｇＧを包含する放射性イムノアッセイのための材料からなる。

この方法は実施例４に記載の方法に従う。

この試験キットでは、本発明のペプチドで前被覆した９６−ウェルＰＶＣプレートは、固相免疫吸着体として使用するだめの本発明のペプチドで前被覆したポリスチレンビーズにより換えることができる。

ヒトＴ細胞９冫８Ｉ）と■型（ＨＴＬＶ−ＩＩ）による感染は、全世界的に検出されている（マンズとブラットナー，Ｔｒａｎｆｕｓｉｏｎ，３１：６７−１５．１９９１）。

ＨＴＬＶ−　１は成熟Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）とＨＴＬＶ−１−随伴を髄症（ＲＡＭ）を併発しているが；ＨＴＬＶ−Ｉｔはどの特定の病気を決定的に随伴するというこ細胞白血病（ｈａｉｒｙ　ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａゼンブラット他，Ｎ．Ｅｎｇｌ，Ｊ，Ｍｅｄ，、３１３：３７２−３７７、１９８６）。

ＨＴＬＶ−　１とＨＴＬＶ−ＩＩを容易に区別できる血清学的試験法の欠如は、ＨＴＬＶについての血清的陽性を試験する人に助言してＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−　ｎの臨床的相関を確立することを困難にしてきた。

ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）増幅のような分子的方法はＨＴＬＶ−　１とＨＴＬＶ−ＩＩとの間の差異を明白に区別するのに最近使用されてきた（クラオフ他．。

Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ，、１５８：１１９３−１１９７、１９８８：り一他．，５ｃｉｅｎｃｅ．２４４：４７１−４７５．１９８９）。

これらの方法を使用する研究は、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染についての高危険群としての静脈内（ＩＶ）薬使用者を限定してきた（り一他．，５ｃｉｅｎｃｅ，２４４：４７１−４７５，１９８９：ヴアニール他．，ＪＡＶＡ，２６５、５９７．１９９１）。

米国におけるＨＴＬＶＴ清陽性血液供給者の解析は、感染している個人の約半分がＨＴＬＶ−ＩＩで感染していることを示している（ＣＤＣ．ＭＭＷＲ，３　９，９　１　５、９２１−９２４．１９９０．サンドラ−他．、Ｙａｌｅ　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、６３：３５３−３８０。

１９９０、フジニレ他．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．。

１６３：４３５−４４０．１９９０）、更に、最近、ＨＴＬＶ−Ｉ［感染は、パナマのグエイミ（Ｇｕａｙｍｉ）インディアン（レールモア他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：８８４０−８８４４。

１９９０、ヘネイーン他、、Ｎ、Ｅｎｇ１．Ｊ、Ｍｅｄ、、３２４，５６５．１９９１）、ニューメキシコのナヴアジコとプエブロ族（フジニレ他、、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、、１６３：４８５−４４０．１９９１）、およびフロリダのゼミルインディアン（レビネＰＨ他９．未公開）では風土病であることが示されており、これはＨＴＬＶ−ｎ感染がアメリカインディアンの間では多年にわたり風土病であったことを示している。　ＨＴＬＶ−１のｇａ、ｐｏｌおよびｅｎｙ遺伝子によりコードされている構造タンパク質へのヒト免疫応答はよく特徴付けられているというものの（ポーカ−他、、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４２．９７１−９７８．１９８９；纂）４６１−４６７頁、プレナムシュッパン、ニューヨ１９９１）　、ＨＴＬＶ−ＩＩタンパク質に対する抗体応答に就いては殆ど知られていない。

合成ペプチドＥ　Ｎ　Ｖ　２１＠７−１１６により同定されたＨＴＬＶ−ＩＩ“ １ｖの２個の遺伝支配的エピトープ１−４６．１９９１）または組換えタンパク質ＲＰ−１１Ｂ”＠−””（チェン他、、Ｌａｎｃｅｔ、３３６．１１５３−１１５５．１９９０）ｉｔ、ＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−ＩＩの両方に感染したヒトにおける抗体との顕著な反応を示した。

ＨＴＬＶ−πエンベロープ糖タンパク質（シトロスキ他、、５ｃｉｅｎｃｅ、２２５：４２１−４２４．１９８４）の構造的モチーフを更に同定するために、ＨＴＬｖ　−ｍ　”’糖タンパク質にわたるいろいろの長さのペプチドが合成されモしてＨＴＬＶ−Ｉｔに感染した患者からの抗体により認識された直鎖状エピトープを同定した。

更に特定すると、ヒトＴリンパ球親和性つィルス■型（ＨＴＬＶ−Ｉ［）のエンベロープ糖タンパク質から誘導された一連の合成タンパク質は、エンベロープ糖タンパク質の遺伝支配的エピトープを決定するために酵素イムノアッセイに使用される。

ＨＴＬＶ−ＩＩ　（ｇｐ　５２）の外周糖タンパク質にわたる１０個の合成ペプチドおよびトランスメンツランタンパク質（ｇｐ２１）からの４個およびｇｐ５２からの３個のタンパク質（ＥＮＶ−２０”−ｌ−ＥＮＶ−２０２ＩＴＳ−１＠ＩおよびＥＮＶ−２０３”ｌｌ””　という。’Ｉ　ｉｔ、殆どのＰＣＲで確定したＨＴＬＶ−ＩＦ標本と反応した（各々、８３％、９５％および７６％）；他の全てはこれらの標本と極微に反応した。

ＥＮＶ−２０°−１８２（７３％ないし１００％）またはＥＮＶ−２０３”目− ！１１（ｓａ％ないし８３％）と比較すると、ＥＮＶ−２０２目ト！１は、静脈内薬誤用者（ｎ＝３０）　、北米インディアン（ｎ＝１３）、パナマからのグアイミインディアン（ｎ＝２２）およびルーチンの血液ドナー（ｎ＝３４）を含む異なる危険度の群からの標本についてより大きいパーセンテージ（９１％ないし１００％）で反応した。

更ｉ：ＥＮＶ−２０’″−１１２トＥ　Ｎ　Ｖ　２０２　ＩＴＳ−！＠＠　ハ、ＨＴＬＶ−１に感染した個人からの血清とは極微の反応性を持つが、ＥＮＶ−２０３””−”’　１ｉＨＴＬＶ−１標本と５８％反応した。

わレワレハ、ペプチドＥＮＶ−２０”−””とＥＮＶ−２０２”−！Ｉｌは、ＨＴＬＶ−ＩＩ外周の糖タンパク質の型特異性の遺伝支配エピトープを表すと結論した。

実施例９材料と方法ヒト血清標本１２３件のＨＴＬＶ−１／ｎ血清陽性と２２件のルーチン血液ドナーを含む、１４５件の血清標本をこの研究のために選んだ（表３）。

表３：研究された血清試料の特性ＨＴＬν＾ｂ”　ＰＣＲ分析　地域グループ　被験者の数　（ｇａｇ＆びｅｎｖ）　ＨＴＬシーＩ　ＨＴＬＶ−Ｉ＋血液提供者　５Ｂ　＋　２４　３４　混合ＩＶドラッグ使用者　３０　＋　０　３０　アメリカアメリカインデアングアイミ　２２　＋　０　２２　パナマセミノール　４　＋　０　４　フロリダナパジ！＋　４　＋　０　４　二ｌ−メキシコブエフ゛口　５　＋　０　５　ニューメキシコ正常提供者　２２　Ｎ口　ＮＯ７メリカ、２４　ｓａｗ及びｇｐ４６”’及び／もしくはｇｐ６８・ｌ′Ｉｖに対する抗体によって決定された血清陽性。

１２３件の血清陽性個人はいろいろの地理的起源と危険因子を持ち、そして５８人の血液提供者、３ｏ人の■Ｖ薬使用者、および３５人のアメリカインディアン（２２人のパナマからのグアイミインディアン、フロリダからのゼミルインディアン、およびニューメキシコからの４人のナヴアジコインディアンと５人のプエブロインディアン）を含む。これらの標本のどれもＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−Ｈの両方に感染していない個人からだった。

ポリメラーゼチェーン反応全ての血清標本は、これらの個人からの末梢血液リンパ球から誘導されたＤＮＡで実施されるポリメラーゼチェーン反応によりＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−ＩＩから転子領域はＬ立±とｔａｘ／ｒｅｘプライマーを使用して増幅され、そして各々の領域からのＩＴｐで末端を標識したオリゴプローブでハイブリッド形成した。ハイブリッド形成した生成物を以前に記述したようにして電気泳動とオートラジオグラフィーした。（クオク他、、Ｊ。

±ｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、、１５８．１１９３−１１９７゜１９８１り一他、、５ｃｉｅｎｃｅ、２４４：４７１−４７５．１９８９）標本を、Ｌ旦」とｔａｘ／ｒｅｘ領域の両方に基づく型特異性の増幅に基づいてＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ− ＩＩとし、て分類した。

参考のＨＴＬＶ抗体試験全ての患者からの血清標本を、製造者の指針に従ってＬＶ−１／Ｉ［−陽性であると決定された。

−一一一一・　赫−）ＦＦ　′６ｇ／ζノｌ１ＥＥダ」を小す領域ヲ同定された（ラボとグリッフス、印刷中、１９９１）について初めに試験した。合成ペプチドは、推薦された化学に従って９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦｍＯＣ）化学によりミルゲン９０５０・ベブシンテサイザ−（Ｍｊｌｌｇｅｎ　９０５０　Ｐｅｐｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）で合成した。

合成ペプチドに対する抗生物質の定量的検定酵素イムノアッセイ（Ｅ１人）は、以前に記述されたようにして合成ペプチドに対する抗体を検出するためにポリビニルプレート（イノ５０ン■、ダイナチック・ラボラドリース、Ｉｎｃ、（バージニア州、アレキサンドリア在））を、０．０１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９，６中の５０ｍｍ１の合成ペプチド（Ｅｎｖ−２０２、Ｅｎｖ−２０３、Ｅｎｖ−２０４、Ｅｎｖ−２０８およびＥｎｖ−２１２については５ｍｇ／ｍｌ、他の全てのペプチドは１００ｍｇ／ｍｌで被覆する。）で被覆する。そのプレートを０．０５％のツイーン２０を含有するリン酸塩緩衝液食塩水（ＰＢＳ）（０，０５％のツイーン２０を含有する：ＰＢＳ−Ｔ）で６回洗浄し、次いで各々のウェルをＰＢＳ−Ｔ中の３％のウシ血清アルブミン２００μｌで１時間にわたり３７℃で保温し、過剰の反応部位をブロックする。ウェルを洗浄した後、１：２０で希釈した各々試験血清を２つののウェルに添加し、そのプレートを一夜４℃で保温し、次いでｐ−ニトロフェニルホスペード基質（シグマ社）を添加する。プレートをＥＬＩＺＡ読みで（ＳＬＴ　ラブ　インスルメント、オーストラリア在）で４０５ｎｍで読む。各々の血清標本を、ＢＳＡ単独でまたは非特異的抗体結合に就いて対照するための関係のない合成ペプチドで被覆する。

血清陽性は、（正常の対照の平均値＋２×標準偏差）より大きい如何なる値としても定義する。

結果非競合ＥＩＡが、ＨＴＬＶ−ＩＩ　（ｎ　＝９９）またはＨＴＬＶ−１（ｎ＝２．４）で感染したヒトにおけるまたは正常の血液ドナー（ｎ−２２）中の抗体を検出するためた合成ペプチドの最初の解析は、強い反応性を持つ３個の主要ドメインを同定した（表４）。

表４：ＨＴＬシーＩＩのエンベロツブ糖タンパク質から誘導された合成ペプチドの血清反応性ペプチド　ａ、ａ　配列　血清反応性”　ｎ＝３０（版部性）ｐ４６Ｅｎｖ　４　３−１９　ＮＶＰＦＬＬＬＰＳＬＴ）ＩＰＰＩ、ＡＱ　２（７）Ｅｎｖ　７　４５−６０　ＴＷＮＬＤＬＮＳＬＴＴＤＱＲＬＨ３（１０）Ｅｎｖ　２０　８５−１０２　ＫＫＰＮＲＱＧＬ［１ＹＹＳＰＳＹＮ口Ｐ２２（７３）［！ｎｖ　２１　１２０−１３５　ＹＴＧＰν５ＳＰＳＩＩＫＰＨＳＤＶ　５　（１７）Ｅｎｖ　２０２　１７３−２０９　ＴＳＥＰＴＱＰＰＰＴＳＰＰＬνＨＤＳＤＬＥＨＶＬＴＰＳＴＳＷＴＴにＩＬＫＰ　２９（９７）Ｅｎｖ　２　１８７ −２０９　ν）ｌ［］ｓＤＬＥ）ＩＶＬＴＰＳＴＳｗＴＴＫＩＬＫＩ’　２Ｂ（９３）Ｆ、ｎｖ　２０３　２１９・−２５６ＹＳＣＭνＣν［１Ｒ８ＳＬＳＳＷＩＩＶＬ、ＹＴＰＮＩＳＩＰＱＱＴＳＳＲＴＩＬＰＰＳ　１８（６O）Ｈｎｖ　２０４　２３２−２５５　ＳＷＨνＬＹＴＰＮＩＳＩＰＱＱＴＳＳＲＴＩＬＰＰ　３（１０）已ｎｖ　２２　２６１−２７７　＾ＰＰ５ＱＰＰＰＩＩＴＨＣＹＱＰＲＬ　２（７）Ｅｎｖ　２３　２７４−２８９　ＱＰＲＩ、ＱＡＩＴＴＤＮＣＮＮＳＩ　３（１０）ｇｐ２１１Ｉｎ’ Ｅｎｖ　２４　２９６−３１２　Ｌ＾ＰＶｌ’ＰＰＡＴＲＲＲＲＡＶＰＩ　１（３）Ｅｎｖ　２０８　３６１−３６９　１（ＱＮＩＬＲＶＡＱ　３（１０）Ｅｎｖ　２５　３６９−３８４　＾ＱＹＡＡＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＩＩ　３（１０）已ｎｖ　２１２　３９７−４０８　ＣＦＬＮＩＳＮＴ）ＩＶｓν　２（７）゛血清陽性は正常対照の平均値ト２標準偏差より大きい値として決定された。

ペプチドＥｎｖ−２０’″−１＠ｆｆによって表わされる様なｇｐ５２のＮ−末端に配置されたエピトープは、ＨＴＬｖ−■感染患者から採取された検体の７３％（３０のうちの２２）と反応した。ペプチドＥ　ｎｖ−２０２１ｆｆｌ−１１１よって表わされる様なｇｐ５２の中央領域に配置された第二ＣＶＸビトーブは、ＨＴＬＶ−Ｉｎ検体の９７９６（３０のうちの２９）と反応した。Ｅｎｖ−２０２（Ｅｎｖ−２１１ｆｆ−′＠Ｉ）のＮ−末端からの１３個のアミノ酸の欠損は、活性の幾分かの損失（９３％＝３０のＨＴ　Ｌ、　Ｖ　−Ｉｔ血清のうちの２８）を起こした。ｇｐ５２のＣ−末端に配置されたペプチドＥ　ｎＶ　２０３　ｌｌｌ−１１＠よって定義される第三のエピトープは、ＨＴＬＶ−Ｉ［感染患者からの血清の６０％（１８／３０）と反応した。このエピトープの主な反応性は、より小さなペプチドＥｎｖ−２０４１１！−ＩＩＩがＨＴＬＶ−Ｉｎ検体に対する最小の反応性を有していたため、Ｎ−末端に配置されていた。ＨＴＬＶ− ｎｇｌｌ！またはＨＴＬＶ−ＩＩ””から誘導された全ての他のペプチドは、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染患者からの血清検体に対する最小の反応性を有していた（表４）。

免疫優性エピトープ（Ｅｎｖ−２０”””、Ｅｎｖ−２０２１７１−ＩＩＩ　、Ｅｎｖ２０３１＋８−１６０）に対する生物学的応答の異質性を更に研究するために、種々の地理的起源の患者の血清検体および危険因子を評価した（表５）。

表５：１ＩＴＬシ血清陽性血清中の抗体による合成１−ＩＴＬシーＩＩエンベロップペプチドの認識グループ　Ｅｎｖ−２０８ｎｖ−２０２［！ｎｖ−２０３ＨＴＬシーＩ＋感染者血液提供者　２７（７９）　３Ｈ９１）　２３（６８）ＩＶＤＩＩ（ｎ：３０）　２２（７３）　２９（９７）　２５（８３）アメリカインチ゛アンパナマ（ｎ＝２２）　２２（１００）　２２（１００）　１Ｂ（８２）アメリカ（ｎ＝１３°）　１１（８５）　１２　（９２）　９　（６９）総計（ｎ＝９９）　８２　（８３）　９４　（９５）　７５　（７６）ＨＴＬＶ−１感染者血液提供者（ｎ＝２４）　２（８）　６（２５）　１４（５８）正常提供者（ｎ＝２２）　０　０　０本　試料中の４　つはフロツクのｔミノールインデアンカＡら、　４　つ及び５　つはニヱーメキシコ　のナバジョインデアン及びプエブロイン〃ンからのもの。

Ｅ　ｎｖ−２０２１ｆｆｌ−２ｅｌは、ＨＴ　Ｌ　Ｖ−ＩＩ感染患者からの大部分の検体と反応した：献血者の９１％、■薬物使用者の９７％、グアイミインディアン（Ｇｕａｙｍｉ　Ｉｎｄｉａｎｓ）の１００％、および北アメリカインディアンの９２％。Ｂ　ｎＶ２１＠ｆｆ−！＠＊は、同様に血清反応性に関して高い比率も有していた（データは示されていない）。Ｅｎ　ｖ　２　Ｑ　ｌ　ト１６　”は、献血者の７９％、■薬物使用者の７３％、グアイミインディアンの１００％、および北アメリカインディアンの８５％と反応した：Ｅｎｖ−２０３２１−″″１は、献血者の６８％、■薬物使用者の８３％、グアイミインディアンの８２％、および北アメリカインディアンの６９％と反応した。Ｅｎｖ−２０，Ｅｎｖ−２０２およびＥｎｖ−２０３の抗体プロフィールにおける特異差は、如何なる研究グループの間でも全く認められなかった。

これらのペプチドに対するＨＴＬＶ−ｎ検体の高い血清反応性（６２％−１００％）のために、我々は次いで、それらが形式特異性エピトープを発現し得るかどうかを評価した。ＨＴＬＶ−１の相当する領域に対するＥｎｖ−２０，Ｅｎｖ− ２０２およびＥｎｖ−２０３の主なアミノ酸に関する構造分析は、相同性の変動度を示した（各々、７８％、４３％、および５７％）（図６）。ＨＴＬＶ−ｎ検体に対する血清反応性に関する別の分析（図７）は、Ｅｎｖ−２０およびＥｎｖ −２０２は低い光学密度を有する最小の反応性を有しており（各々、８％および２５％）、モしてＥｎｖ−２０３は高い光学密度を有する充分な反応性（５８％）を有していたということを示していた。２２人の健康な献血者においては、何れのペプチドとも全く反応しなかった。

議論アメリカ合衆国の献血者に関してＨＴＬＶ−１における場合と等しく流行しているウィルスであるＨＴＬＶ−■の発現〔サンドラ−（Ｓａｎｄｌｅｒ　）他、　Ｖａｌｅ　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

１Ｊｅｄ、、６３　：第３５３−３６０頁、１９９０年）は、良好な診断検査を案出することのみならず、ホスト−ウィルス相互作用を理解するために重要であり得る免疫優性エピトープを定義することを必要とした。本研究において、我々は、大部分のＨＴＬＶ−ＩＩ感染患者において血清抗体によって認識される三種のエピトープを同定した。

ＨＴＬＶ−ＩＩのＮ−末端に配置されたＥｎｖ−２０”−ＩＩ！は、ＨＴＬＶ− ＩＩ感染患者からの血清の８３％と反応した。驚くべきことに、ＨＴＬＶ−１に対するＥｎｖ−２０の充分な相同性にも係わらず、最小の反応がＨＴＬＶ−Ｉ検体に対して観察された（図６）。Ｅｎｖ−２０の詳細なマツピングは実施されなかったけれども、抗体結合部位は恐らく、Ｅｎｖ−２０とＨＴＬＶ−Ｉの相同領域との間には観察されないアミノ酸からなるということが予想される。ＨＴＬＶ −１エンベロープの相同領域からのペプチド（ａ、ａ、８９−１１０）は、ＨＴＬＶ−Ｉ陽性血清と反応するエピトープを含み〔ホーラル（Ｈｏｒａｌ　）他、ヒトのレトロウィルス学：ＨＴＬＶ（Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ：ＨＴＬＶ）　（ダブリュ、エイ、ブラットナー（Ｗ、Ａ、Ｂｌａｔｔｎｅｒ）版）、第４６１−４６７頁、ブレナム出版（Ｐ１ｅｎｕ＋ａ　Ｐｒｅｓｓ、　）　ｒ　ニューヨーク、１９９０年〕、そしてこの領域からの他のペプチド（ｓｐ２．ａ。

ａ、８６−１０７）に対して生じるポリクローナル抗体は、シンシチウム阻害分析およびＨＴＬＶ−１プソイドタイプ分析の両方に対してＨＴＬＶ−１を中性化させた〔パルカー（Ｐａｌｋｅｒ）他により、“ヒトのレトロウィルス学における流体組織：　ＨＴＬＶ　（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｌ５ｓｕｅｓ　ＩｎＨｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ：）ＩＴＬＶ）　”　ｒモンテゴ　ベイ（ＭｏｎＬｅｇｏ　Ｂａｙ　）　、ジャマイカ、２月１０日−１４日、１９９１年、に記載〕。

ＨＴＬＶ−Ｉｔ感染感染検体の９５％と反応し且っＨＴＬＶ−１検体と最小の反応をしたＥｎｖ−２０２０１−１１１は、ＨＴＬＶ−Ｉｔ外部糖蛋白質の最も主な且つ形式特異性エピトープであった。ＨＴＬＶ−Ｉ［エンベロープの中央領域の免疫優勢は、従来から報告されていた〔ラル（Ｌａｌ　）他、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１６３．第４１−４６頁。

１９９１年；チェノ（Ｃｈｅｎ）他、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６８．第４９５２−４９５７頁、１９９０年）。アミノ酸９６−２３５を含む組み換え蛋白質ＲＰ−ＩＩＢは全てのＨＴＬＶ−■血清と反応するが、しかしＨＴＬＶ−Ｉ血清の６５％とも反応する。我々は先に、ペプチドＥｎｖ−２（ａ。

ａ、１８７−２０９）は多数のＨＴＬＶ−ＩＩ血清と、幾つかの断面を用いてＨＴＬＶ−１と反応するということを報告した（ラル他、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１６３．第４１−４６頁、１９９１年）　ｏ　Ｅｎ　ｖ　−２０２””−””のＮ−末端における付加的な１３個のアミノ酸は、Ｅｎｖ−２と比べてその反応性の特異性を著しく増加させた。より大きなペプチドは、恐らくそれが最早ＨＴＬＶ−Ｉ検体を認識しない様にエピトープの配座を変換するであろう。この高い血清反応性および形式特異性の故に、ＥｎＶ−２０２はＨＴＬＶ− ＩとＨＴＬＶ−ＩＩとを血清学的に識別することができる分析を発展させるために最近成功裏に使用された〔ヴイスシディ（Ｖｉｓｃｉｄｉ　）他、　Ｊ、　Ａｃｑｕｉｒ、　Ｉｍｍｕｎｅ、　Ｄｅｆｉｃ、　５ｙｎｄｒ、　（発行中’））、ＨＴＬＶ−Ｉ糖蛋白質の中央領域も、組み換え蛋白質例えばＭＴＡ−４〔リブ力（Ｌｆｐｋａ　）他、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１６２゜第３５３−３５７頁、１９９０年〕およびＲＰ−Ｂｌ”−！０１（チェン他、　Ｌａｎｃｅｔ、３３６．第１１５３−１１５５頁、１９９０年）又は合成ペプチド例えばＳ　Ｐ　４　ａ　”卜！■　〔パルカー（Ｐａｌｋｅｒ）他、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４２　：第９７１−９７８頁、１９８９年〕およびＥｎｖ−１ ”’−ｔ＋ｉ　（ラル他、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１６３．第４１−４６頁、１９９１年）の何れかによって定義された如く、全てＨＴＬＶ−Ｉ感染患者に対して主な血清反応性を示した。加えて、３　ｐ　４　ａｌｌｌｌ− ４１＠によって定義されたエピトープは、更に中性化エピトープ〔ラルストン（Ｒａｌｓｔ。

ｎ）他、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６４．第１６３４３−１６３４６頁、１９８９年〕、ヒト細胞毒性Ｔ細胞エピトープ〔ヤコブソン（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）他＋　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４６゜第１１５５−１１６２頁、１９９１年〕、及びネズミヘルパーエピトープ〔クラタ（Ｋｕｒａｔａ）他、　Ｊ、　Ｉｍａ＋ｕｎｏ１．。

１４３：第２０２４−２０ｆｌｌＯ頁、１９８９年〕を含むことが示された。

Ｅ　ｎｙ　−２，０３２Ｉ　１２１１によって表わされる第三の特色は、ＨＴＬＶ−ｎおよびＨＴＬＶ−Ｉと殆ど等しく反応したことである。ａ、ａ、２３２− ２５５を存するより小さいペプチド（Ｅｎｖ−２０４）はＨＴＬＶ感染検体との最小の反応性を有するので、Ｅｎｖ−２０３の抗体結合性領域はＮ−末端に向かって配置すべきことは明らかである。ＨＴＬＶ−Ｉ外部糖蛋白質の形式特異性の免疫優勢エピトープは、エンベロープ蛋白質（Ｂｎｖ−５１４１−！ｉ？　）のＣ−末端に対してマツプされ、そして続いてＨＴＬＶ−１感染細胞の細胞表面上に暴露されていることが示された〔ラル他、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１６３゜第４１−４６頁、１９９１年；　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、＋　（発行中）〕。

ＨＴＬＶ−１［の半透膜蛋白質から誘導された４種の合成ペプチドは、ＨＴＬＶ −ＩＩ感染患者からの血清検体に対して充分な結合性を全（示さなかった。他方、ＨＴＬｖ−■半透膜蛋白質の免疫原性に関して僅かに知られている如く、組み換えＲＰ　ｐ＠１ｌ−４８６（チｚ”／他、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６３　、第４９５２−４９５７頁、１９８９年）、ｒｇｐ２１５ｅｔ−ｔ４＠（サミュエル（Ｓａｍｕｅｌ）　、　５ｃｉｅｎｃｅ　。

２２６．第１０９４−１０９７頁、１９８４年〕、および合成ＴＮ　１０１　Ｉ７ト４・拳　〔ヴイスシディ他、Ｊ、＾ｅｑｕｉｒ、　ｉｍｍｕｎｅ、　Ｄｅｆｉｃ、　５ｙｎｄｒ、　（発行中）〕は全て、ＨＴＬＶ−１感染患者およびＨＴＬＶ−ＩＩ感染患者の両方からの血清検体に対して反応性を示した。ＨＴＬＶ− Ｉｔ半透膜蛋白質の類似領域からの合成蛋白質に対する抗体を検出することに対して我々が無力であったのは、使用したペプチドの小さな寸法に起因させてよい。反対に、一旦固相に結合されるペプチドの配座は、それは最早血清中の抗体と反応しないというものであってよい。Ｅｎｖ−２５＠＠＠−＊＠４は、リンパ球増殖（リューズ（Ｒｕｅｇｇ　）　＋Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６３　、第３２５０−３２５６頁、１９８９年〕および免疫グロブリン分泌〔ミタニ（Ｍｉｔａｎｉ）他、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ目、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８４．第２３７−２４０頁。

１９８７年〕の両方を抑制する推定上の免疫抑制性領域を表わし、そしてリンパ球増殖を抑制するための活性部位は１０個のアミノ酸（ＡＱＮＲＲＧＬＤＬＬ）としてマツプされた（リューズｒ　Ｊ、Ｖ＋ｒｏｌ、、　６３　ｒ　第３２５０ −３２５６頁、１９８９年）。

ＨＴＬＶ−４外部糖蛋白質の免疫優勢領域に関するこれらの認識の一つの実務上の用途は、形式特異性分析の発展であろう。それ故、Ｅｎｖ−２０−−１８１およびＥｎｖ　２０２１　’　Ｉ−＊　８　＠によって定義されたこれらの特色のうちの二つは、１−Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ型−亘特異的エピトーブを表わし、そしてＨＴＬＶ−１１ｍ対する感染かうｌ−Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−ｎに対する感染を区別するだめの血清学的分析を発展させるために組み合わせて使用され得るであろう。

ＨＴＬＶＩ″−の臨床的重要性を一層良く理解するために、単離されたＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　”’反応性を有するアメリカ合衆国陸軍内の低危険度献血者の群を、ウィルス抗原並びにＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩの免疫優勢エピトープの全てを含む多数の血清学的分析によって評価した。

ゲノム中のウィルスＤＮへの存在は、ポリメラーゼチェインリクション〔これは、血液試料中の特定のウィルス配列の増幅を通してウィルスＤＮＡを迅速且つ直接的に検出する（リー（Ｌｅｅ）他＋　５ｃｉｅｎｃｅ　＋　２４４　：第４７１−４７５頁、１９８９年：クラｔ−り（にｗｏｋ）他、Ｊ。

Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１５８　、第１１９３−１１９７頁、１９８８年）〕によって分析された。実施例１０において、ＨＴＬＶ”’パターンを有する血液提供者の分析は、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩの免疫優勢エピトープを示す合成抗原を用いるＨＴＬＶ抗体酵素免疫分析に従って、並びにＰＣＲ分析によって、ＨＴＬＶ−ＩまたはＩ］ＴＬＶ−Ｉ［感染の証拠を全く示さなかった。

アメリカ合衆国陸軍の要員からの２６７６５０の献血のうちで、２７（０，０１０％）はヒトＴ−リンパ球ウィルス、タイプ−Ｉ／ｎ　（ＨＴＬＶ″″°）に対して陽性であることが血清学的に確認され、モして８７９（０゜１４％）はｇａｇ遺伝子のみによってコード化された蛋白質（ＨＴＬＶ’ｍ′）に対して限定された結合パターンを用いるウェスターンプロット（ＷＢ）不確定であった。

これらの明らかに健康なＨＴＬＶ’″−献血者がＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ− ＩＩに感染しているかどうかを決定するために、７３人の前記陸軍献血者からのコード化された検体を、ウェスターンプロット並びにＨＴＬＶ−Ｉ（ＭＴ−２）およびＨＴＬＶ−ＩＩ　（Ｍｏ−Ｔ）抗原を使用する放射免疫沈澱分析により、ＨＴＬＶの免疫優勢エピトープを示す合成ペプチドを使用する酵素免疫分析により、モしてＨＴＬＶ、ＤＮＡの配列に関してはポリメラーゼチェインリクションにより、ＨＴＬＶに対する抗体に関して検査した。

７３人（７）ＨＴＬＶ”’提供者ノウチテ、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−Ｉｌ、ＷＢおよびＲＩＰＡによるｅｎｖ反応性の存在は全く認められなかった。最小の反応性は、ｅｎｖ蛋白質（Ｅｎｖ−１鳥−１−１１１、Ｅ　ｎｖ５　ｆｆ４２ −４１７゜Ｅｎｖ−２”’−１■、およびＥｎｖ−２０”−”″）並びにｇａｇ蛋白質（Ｑ　ａｇｌ　ａＩ＠！−１１？、およびＧａｇ−１６＊＠４−＊＊＊　）から誘導された合成免疫優勢特色を用いて観察された。ＨＴＬＶ　（類）のｇａｇ蛋白質と構造的な相同性を有する内生的レトロウィルス配列（ＲＴＶＬ　ａｓ・）は、ＨＴＬ、Ｖ’・一検体に対して抗体を発現したのみならず、通常の対照物質とも反応した。更に、７３のＨＴＬＶ”’検体は、ｐｏｌおよびｔａｘ／ｒｅｘ領域において増幅された場合に、）ＩＴＬＶ遺伝子の存在を全く示さなかった。初期の検査の時から６ないし２３箇月後に、２３の検体はまだ同様なＷＢパターンを与え、モして９の前記再検体はまだＨＴＬＶ遺伝子の存在に対して陰性であった。それ故、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−■に感染しても、ＨＴＬＶ ’″１ウェスターンプロット反応性を有するＨＴＬＶ感染に対して低い危険率の人々は稀である。

血清陽性に対する判断は、アメリカ合衆国のパブリックへルスサービスワーキングループ（Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　５ｅｒｖｉｃｅ　Ｗｏｒｋｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ）によって定義された如く、９２４０ｇおよびｇｐ４６拳烏マおよび／またはｇｐ６１／６８″ｍｙに対する反応性を示す血清検体はＨＴＬＶ−１／■ に対して血清陽性と考えることができ、そしてウェスターンプロット（ＷＢ）および放射免疫沈澱分析（ＲＩＰＡ）の組み合わせはｇａｇおよびｅｎｖに対して抗体反応性を目視化するために使用され〔アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）他、　Ｂｌｏｏｄ　、７４．第２５８５−２５９１頁。

１９８９年、　ＣＤＣ，ＭＭＷＲ，３９：　９１５．第９２１−９２４頁、１９９０年〕　；何れかの検査系によるバンドの前記の充分な配列を欠いている何れかのパターンはウェスターンプロット不確定（ＨＴＬＶ’°４）と考えられるということである。アメリカ合衆国内の血液提供者に関する前記検査は、ウェスターンプロット陽性提供０．０１％ないし０．０２５％の低い血清流行を示していた〔アンダーソン他、　Ｂｌｏｏｄ　＋　７　Ｌ　第２５８５−２５９１頁、１９８９年；サンドラ−他、　Ｖａｌｅ　Ｊ、　Ｒｉａｌ。

Ｍｅｄ、、６３　：第３５３−３６０頁、１９９０年〕。しかしながら、初期のＥ１人反応性検体の５０％よりも多（は、ＷＢ分析においてＨＴＬＶ−１″１の一つまたは二つのバンド特性に対する反応性を示した〔サンドラ−他。

Ｖａｌｅ　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ｕｅｄ、、６３　：第３５３−３６０頁、１９９０年ニハードレイ（Ｈａｒｔｌｅｙ　）他、２８：第６４６−６５０頁、１９９０年）。決定されるべ（残っている前記反応性の重要性のために、前記直溝反応性を有する血液の受容者に対する遡及的研究は、前記受容者はＨＴＬＶ−Ｉ／ｎ陰性であったということを示していた（シー（Ｓｈｉｈ）他＋　Ｂｌｏｏｄ　＋　７５　：第５４６−５４９頁、１９９０年〕。

実施例１Ｏ方　法参ＨＴＬＶ全ての血液供与者からの自涜試料を、最初に認可された酵素結合イムノソルベントアッセイ（ｉ■−ｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔｌ（）ＩＴＬＶ−Ｉ工＋Ｊザ（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）　、デュポン、ウィルミングトン、ドイツ国）により、製造者の推薦手順に従い、ＨＴＬＶ−１／ＩＩ抗体試験をした。繰り返し反応性のあった試料を、ＷＢが精製された組換えエンベロープ（ｒ２１）をＨＴＬＶ−１感染細胞ライン、ＨｕＴ−１０２（Ｃａｍｂｒｉｇｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　、ロックヴイル、メリーランド）およびＲＩＰＡから誘導された全ウィルス溶解産物に、ＭＴ− ２細胞ライン（ケンブリッジ）からの溶解産物を使用して、組み込むことにより、さらに試験をした。抗体反応性が少なくとも２つの異なるＨＴＬＶ構造遺伝子産生物（ｇａｇ　ｐ２４およびｅｎｖ　ｇｐ４６および／またはｇｐ６Ｂ）について検出されたかどうかにより、血清試料がＨＴＬＶ−陽性であるか否かを決定した。仮にＷＢが少なくとも一つのＩＩＴＬＶ−Ｉ／ＩＩのバンド特徴を示すが（ｐ１９、ｐ２４またはｇｐ４６）陽性の結果の基準に一致しないならば、供与者の分析の結果は、ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩについて不確定である（ＨＴＬｖｌ″′ ）と考えられる。ＨＴＬＶ１１パターンをモつ試料は、Ｍｏ−Ｔ細胞ラインから誘導されたＨＴＬＶ−ＩＩ抗原を含むＷＢおよびＲＩＰＡについてさらに分析をした。

証羞ＪＬＩ五１９８８年１２月から１９９１年４月までの間に、軍隊の人員からのおよそ２６７６５０ユニツトの血液を。

Ｗａｉｔｅｒ　Ｒｅｅｄ　Ａｒｍｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　、ワシントンにおいてＨＴＬＶ−１／ＩＩに対する抗体について試験をした。

２６７６５０１′ｌｌの供与物のうち、２３７６個（０，８９％）は最初から酵素イムノアッセイに反応性がありそしてこれを、ＨＴＬＶ感染の血清学的確認のためにウェスタンプロットおよびＲＩＰＡにより試験した（表６）。

表６＝　陸軍血液提供者の）ＩＴＬシー［／Ｉ　＋イムノアッセイ及びＰＣＲ結果１１Ｂ／ＲＩＰＡ結果　ＰＣＲ結果変数　初期　３−２３力月後　初期　３−２３力月後１（ＴＬＶＰ”　７２（０，０２７））ＩＴＬｖ−ｒ　４３　３０　３６／３６　２８／２８ＨＴＬＶ−４１２９２５１６／１６　１３／１３）ＩＴＬＶ”ｄ　３７９（０，１４）　２３　０／７３　０／９ｐ２１　＋ｐ１９　＋ｐ２４　＋　４　ＮＯＯ／３　Ｎ。

ｐ２１　＋ｐ１９　＋ｐ２４　＋　ｔｏ　ＮＯＯ／Ｉ　Ｎ０ｐ２１　＋ｐ１９　＋ｐ２４　＋　７”　ＮＯＯ／４　Ｎ０ｐ１９　＋ｐ２４　＋　２８　２　０／１０　０／１ｐ２４　＋　６１　５　０／１２　０／２ｐ２１　＋　１２　Ｎ口　０７５　Ｎ口ｐ１９＋　２５７’　１６　０／３８　０／６ＨＴＬＶ　”ｅ’ 　１９２５　Ｎ口　Ｏ／２６　８口１幾つかの指定されていないバンド２８ＫＯ及び２６に０１更にｐ１９バンドを持った１２８の試料２１（ＩＶ感染者からの試料これらのうち、７２個はＨＴＬＶ””であり（０，０２７％）、３７９ｆ［ｌはＨＴＬＶ”′であり、そしテ１９２５個はいかなるウィルス特異バンドをも示さなかった（ＨＴＬＶ口１）。

八　へブチドに　る　゛ＨＴＬＶ−１配列およびＨＴＬＶ−１１配列から誘導された合成ペプチドは、Ｅ　ｎ　ｖ　−１”’−”″　（ＨＴＬＶ−１、ＬＰＨ３ＮＬＤＨＩ　ＬＥＰＳ　Ｉ　ＰＷＫＳＫＬＬＴＬＶ）、Ｅｎｖ−２１＠４−１６＠（夏（ＴＬＶ−Ｉｌ、Ｖ）ＩＤＳＤＬＥＨＶＬＴＰＳＴＳＷＴＴＫ　Ｉ　ＬＫＦ）　、Ｅｎｖ−５”” ”　（ＨＴＬＶ−１，５ＰＮＶＳＶＰＳＳＳＳＴＰＬＬＹ）、Ｅｎｖ−２０１− ””（ＨＴＬＶ　−Ｉｌ、ＫＫＰＮＲＱＧＬＧＹＹＳＰＳＹＮＤＰ）、Ｇａｇ− １，ａｌｌ′”−目〒　（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＰＰ５ＳＰＴＨＤＰＰＤＳＤＰＱ１）　、　Ｇａｇ　−１０”’−”’　（）ｉＴＬ、Ｖ−ＩＩ、Ｇ　ＨＷＳＲＤＣＴＱＰＲＰＰＰＧＰＣＰＬＣＱＤＰ）と呼び、そして、ＨＴ　Ｌ　Ｖ　””タンパク質のＣ−末端と配列相同をもつヒスチジンｔＲＮＡプライマー結合サイトを含む内因性レトロウィルスを、ＦＭＯＣ化学により合成し、そしてこれら合成ペプチドに対する抗体を以前に記載したように試験した（Ｌａ１．等、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６５：　１Ｂ７（１−１８７６゜＋９９１１　、簡単に言えば、ポリビニルプレート（ＩｍｍｕｌｏｎＩｌ、　ＤｙｎａＬｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、アレキサンドリア、ヴアージニア）を０．旧μ炭酸塩緩衝液、ｐｌ＋　９．６中で合成ペプチド５０ｍ１　（１００ｕｇ／ｍｌ）で被覆しそして４℃にて一晩中培養した。該プレートをＰＢＳ含有の０．０５％Ｔｖｅｅｎ−２０（Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔ　）により６回洗浄し、過剰の反応性サイトをＰＢＳ−Ｔ中で３％ＢＳＡの添加によりブロックし、各試験血清の１＋２０希釈液の添加がこれに続き、そして該プレートを４℃にて一晩中培養した。６回の洗浄の後、ヤギ抗体をヒトＩｇＧに接合したＦｃ特異的、アルカリ性フォスフォターゼ（Ｓｉｇｍａ。

セントルイス）を加え、ｐ−ニトロフェニルフォスフェート（Ｓｉｇｍａ　）基質の添加がこれに続く、該プレートをＥＬｉＳＡリーダー（ＳＬＴ　Ｌａｂ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、オーストリア）により４０５ｎｍにて読み取った。血清陽性（ｓｅｒ。

ｐｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）は、通常対照＋２１１準偏差の平均値より大きい全ての値として定義される。

ポリメラーゼ　にＰＣＲによるＨＴＬＶ配列の増殖と検出は、ブラインド様式で、ＨＴＬＶ””供与者（ｎ＝５２）およびＨＴＬＶ”供与者（ｎ＝７３）からのＤＮＡ試料上で行なった。各患者からの二つの遺伝子領域（Ｌ９Ｌｉおよびｔａｘ−ｒｅｘ）は、ＰＣＨにより、以前に記載された条件を使用して増殖した（１．ｅｅ等、５ｃｉｅｎｃｅ　、　２４４　二４７１−４７５．１９８９　；　Ｋｗｏｋ等、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　、　１５８　：　１１９３−７　。

１９８８）　、簡単に言えば、細胞溶解産物５０ｍ１を、ＩＸＰＣＲｊｉｌ衝液（５０ｎＭ　ＫＣ１，１０ｙａＭＴｒ　ｉ　５−１１ｃ　ｌ。

ｐ）１８．３、０．１　＋ｗｇ／ｍｌゼラヂン）中にｄＮＴＰ、プライマー、および−見１ポリメラーゼ（全て２Ｘ　）を含有する試薬混合物５０ｍ１に加えた。最適濃度は次の通り決定した。ｄＮＴＰ　２００　ｔａｕ各々；ブライ７−０．５．Ｍ各々；１立ＩポリメラーゼＩＵ、およびＭｇＣ１＊　１．２５■Ｍ、増殖条件は次の通りであった。９４℃にて９０秒間の変性；５８℃にて２分間のアニーリング；７２℃にて１分間のエクステンシン、４０サイクルについて、ＰＣＢ産生物１０ミリリットルを溶液中の０Ｐ末端−ＦＩｉ！オリゴヌクレ副チドブチドブローブ５３℃および４５℃にてそれぞれハイブリッドした。プライマー対およびプローブの５°−３°配列は、ＨＴＬＶ−Ｉ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ評価Ｎｏ、　ＪＯ２０２９）およびＨＴＬＶ−ＩＩ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ評価Ｎｏ、　ＭＩＯ０６０）に基づ（もので、次の通りである。

５ＫＩＩＯ（１立ユ、ＨＴＬＶ−１””−””　、ＨＴＬＶ−ＩＩ””−””　）−ＣＣＣＴＡＣＡＡＴＣＣＡＡＣＣＡＧＣＴＣＡＧ；　５Ｋ１１１　（Ｌ９Ｌｉ、ＨＴＬＶ−Ｉ””−””　、）（ＴＬＶ−ＩＴ４１Ｏ−””’　）　−ＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＣＡＴＣＧＧＧＴＴＴＴ　、ＳＫ　１１２　（、Ｈｏ１、ＨＴＬＶ−１””−””　）　−ＧＴＡＣＴＴＴＡＣＴＧＡＣＡＡＡＣＣＣＧＡＣＣＴＡＣ：　ＳＫ　１８８　（Ａｏ　ｌ　、　ＨＴＬＶ−ＩＩ’°’−”” 　）−ＴＣＡＴＧＡＡＣＣＣＣＡＧＴＧＧＴＡＡ、ハイブリッド産生物を１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そしてオートラジオグラフィーをした。

第二の増殖は、以前に記載されたｔａｘ　ｒｅｘ領域において行なった。簡単に言えば、細胞溶解産物５０ｍ１を、５“−標識プライマー２Ｘ１０’ｃｐｍ、ｄＮＴＰ（５ｏ　＋１Ｍ　）　、　ＴＬ！Ｌポリメラーゼ（２，５ｔＪ）、およびＭ　ｇ　Ｃｌ　＊　（１，２５ｍＭ）に加えた。使用したプライマーはＴｘｌ　（ｔａｘ　ｒｅｘ、ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｉ　””−””　。

ＨＴＬＶ−ＩＩ”４ｍ−””　）−ＣＧＧＡＴＡＣＣＣＡＧＴＣＴＡＣＧＴ　：およびＴＸ２　（ｔａｘ　ｒｅｘ、ＨＴＬＶ−Ｉ　）４曹’−７４”　、ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−１１Ｔ４”−マ■″　）　−ＧＡＧＣＣＧＡＴＡＡＣＧＣＧＴＣＣＡＴＣＧであった。増殖条件は、アニーリング温度５５℃であることを除き、上記に記載したのと同様であった。増殖産生物を制限酵素工」シ且」−および５ａｕ３Ａにより消化し、そして産生物な８％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そしてオートラジオグラフィーをした。ＨＴＬＶ配列が双方のプライマー部分により検出されたならば、試料はＰＣＨにより陽性であると考えられる。もし、試料が二つ増殖物のうちの一つについて陽性であるならば、第三の増殖物が陽性かまたは陰性かを決定することを行なう、細胞が二つのプライマー部分の各々について二重に分析された場合にＨＴＬＶ配列が検出されえないならば、試料はＰＣＲによりＨＴ　Ｌ　Ｖ陰性であると考えられる。

結　果なウェスタンプロット・　パターン最も共通の不確定バンドパターンはｐ１９にて単一バンド（２５７／３７９．６８％）を示し、ｐ２４での単一バンド（６１／３７９．１６％）、＄）１９およびｐ２４でのバンド（２Ｂ／３７９．７％）、ｐ１９および／またはｐ２４での、ｒｇｐ２１との反応性を伴うバンド（２１／３７９．５．６％）、およびｒｇｐ２１での単一バンド（１２／３７９．３％）がこれに続＜、ＨＴＬｙ１ｍｇパターンをもたない試料はいずれも、ＨＴＬＶ−■溶解産物およびＨＴＬＶ−１１溶解産物の双方を使用したＨＴＬＶ−［ＷＢまたはＲＩＰＡ分析においていかなるエンヴエローブ反応性を示さなかった。

ウェスタンプロット分析を、最初の出血の後６月ないし２３月後に引き抜かれた３７９個のＩＩＴＬＶ”’試料２３組において繰り返した。２３個の標識試料のうち２１個については、バンドパターンにおいて差異が見られず、ｐ１９＋ｐ２４＋パターンをもつ試料のうち一つはｐ２４反応性を失い、そしてｐｌｅ＋試料のうち一つは再出血の際ｒ２１＋反応性を得た。

た交ｌユ旦工ＬＭエピトープに　る　口血清中の抗体の親和性および結合活性は、全ウィルス溶解産物を使用した標準血清学アッセイにおける検出に影響を及ぼすことができ、抗体応答は、１（ＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩの合成免疫優性構造モチーフにより決定した。ＨＴＬＶ−Ｉ感染した者のうち９２％ないし９９％を）（ＴＬＶ−Ｉ特異的１ユヱエビトープ（Ｅｎｖ−１１１１１−ＩｌｌおよびＥ　ｎ　ｖ　−５１４”−鴬１も）と反応させる間ニ、ｊｌ小の反応性（０ないし１２％）がＨＴＬＶ”’／（ターンをもつ試料により観察された（図８）、同様に、ＨＴＬＶ−１１感染した者のうち７５％ないし９６％を、）（ＴＬＶ −ＩＩ特異的！旦ユエピトープ（Ｅ　ｎ　ｙ　−２＋ａｔ−３′′＠およびｌ：ｎｖ−２Ｑ　＠ｌ−１１１１）と反応させる間に、最小の反応性（０ないし１２％）ｈ月（Ｔ　Ｌ　Ｖ　”’試料により観察された。ｐ１９のＣ末端から（Ｇａｇ−１ａ”−ｚｔ　）、そしてｐｉｓのＮ末端から（Ｇ　ａ　ｇ−１０”’−３０）誘導された合成ペプチドの分析は、ＨＴＬＶ””試料との６５ないし９５％反応性を示した。ＨＴＬＶ”試料のうちで、ｐ１９バンドをもつもののうち２３％はＧａｇ−１ａとのみ反応し、全ての他の試料はＧａｇ−１ａまたはＧａｇ− １０と最小の反応性を有していた。

また内因性レトロウィルス遺伝子産生物の表現は、ＨＴ　Ｌ　Ｖ　ｇ”タンパク質と交差反応性のありうる抗体の産主について抗原刺激を提供する。ＨＴＬＶ− １およびＨＴＬＶ−１１（７）Ｃ−末端と６０％相同を有する（ＲＴＶＬｗａｇ　）ところのヒスチジンｔＲＮＡプライマー結合サイ）　（ＲＴＶＬ−Ｈ）を有する。内因性レトロウィルス要素から誘導されたペプチドを合成した。また、ＨＴＬＶ”’試料のうちの８８％をこのペプチドと反応させる間に、ＨＴＬＶ”’ 試料からの４２％ないし６６％の血清試料をＲＴＶＬ”’と反応させた。しかしながら、ＨＴ　Ｍ　Ｌ　”’試料のさらなる分析は、これら試料のうちの６０％はまたこのペプチドと反応することを示した。

′　のＨＴＶＬ　ＤＮＡ　の。

ＷＢ上にＨＴＬＶ１″’パターンをもつ者についてＨＴＶＬ　ＤＮＡの存在または不存在を決定するために、末梢血液リンパ球をＰＣＨにより分析した。プライマー対は２且ユおよび１１五ＺＬ旦Δ領域から選択し、その双方をＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩの中で高く保護した。ＬＡＪＬおよび１ユヱからの領域は、種々の単離した配列において内因性レトロウィルス配列および変形との　、いくらかの配列相同のため、それぞれ増殖しなか、つな。

以前の研究によれば、Ｌ旦ユおよび１１五ＺエニΔ領域からのプライマーは共に、ＨＴＬＶ””試料を同定するのに大変鋭敏であった（５２個のＨＴ　Ｌ　Ｖ　ｆ”のうちの全てが検出可能なシグナルを与えた。）、１５個のＨＴＬ　Ｖ　” ”試料はいずれも、検出可能なシグナルを与えなかった。１５個のＩＩＴＬＶ” ＠試料はいずれも、いかなるプライマー／プローブ組合せと反応せず、さらにこれらプライマーの持具性を確認するものであワた１種々のバンドパターンをもつ７３個のＨＴＬＶ”−試料のうち（表６）、いずれも、プライマー／プローブ組合せをもつ産生物を増殖しなかった。９個のＨＴ　Ｌ　Ｖ　”’試料についての当初の試験後６ないし２３か８後にひき抜かれた繰り返し試料のＰＣＲ分析は、いかなる試料においてもＨＴＬＶ遺伝子の存在を示さなかった。

討論ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬ、Ｖ−１１感染の血清学的確認はｌ！−ＪＬおよびｌ遺伝子生産物に対する抗体の反応性の存在に依存する〔アンダーソンら（ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔａｌ、）、　Ｂ１ｏユｔ　７４　：　２５８５−９１，１９８９　；ＣＤＣ，ＭＭＷＲ，３９：３１５．９２１−９２４．１９９０）。これらの評価を使用して、全体的に、ｏ、０２７％の血清有病率を与える、総計７２の提供血液（０゜０２７％）はＨＴＬＶ陽性である。特定のオリゴペプチドおよびオリゴプライマーを分類することによりこれらの七ロポジティブ検体の別の分析は、４３はＨＴＬＶ−■感染され（６０％）、従って２９はＨＴＬＶ−１１に感染された（４０％）ことを示した。これらの割合は従来の研究で一般的に認められており、無作為アメリカ人提供者はＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２の同等な分布により０．０１ないし０．０２％の七ロポジティブ割合であることを示した〔アンダーソンら（ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ。

）、Ｂｌｏｏｄ、７４：２５８５−９１．１９８９；サンドラ−ら（Ｓａｎｄｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）　、Ｊ、　Ｂ　ｉ　ｏ　１．　Ｍ１止−，６３：３５３− ６０．１９９０）。

加えて、単離された８３２反応性を持つ者はしばしば献血スクリーニング検定の間に見出され、ＨＴ　Ｌ　Ｖ不確定（ＨＴＬＶ’″６）に当てはまる。意味のある数の提供者は本研究でＨＴＬＶ’″４であった。最も一般的反応性はＰ１９’ ″１に対して向けられるが、次にＰ　２４　”’に白質とのエピトープの構造的類似性〔ラル（Ｌａｌ）らＪ、Ｖｉｒｏｌ、、６５：１８７０−７６．１９９１；マフローブリン（ＭｃＬａｕｇｌｉｎ　）ら、Ａｍｅｒ、　Ｊ。

Ｔｒｏ　、Ｍｅｄ、Ｈ」ユ、３７：２５８−６２゜１９８７）およびＰ２Ｏ３“ のＣ−末端基の免疫抗原的性質はこれらの反応性の説明となり得る〔ラルら（Ｌａｌｅｔａｌ、）Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｆｏｌ、、印刷中〕。正に、ＷＢ検定において、ｐ１９の反応性をもつ試料の２３％は、合成Ｇ　ａ　ｇ　−１ａ　”’−目７エピトープに対する抗体応答を示し、それは前もってＨＴＬＶ−１の免疫優性エピトープに特定の型を表すために示した〔ラル（Ｌａｌ）ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６５：１８７０−７６．１９９１〕。さらに、Ｐ１９’・１に対するモノクローナル抗体は正常の胸腺またはヒト胎盤の抗原との反応を示した〔ハインズ（）ｌａｙｎｅｓ）ら、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、１５７＋９０７−２Ｌ　１９８３；サン４ら（Ｓｕｎｉ　ｅｔ　ａｌ、）。

Ｉｎｔ、　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、８３：２９３−８．１９８４〕。

さらに、準周期性−次構造を表すＨＴ　Ｌ　Ｖ　””のＣ−末端は、ミニリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）の゛ｒミノ末端セグメントとの意味のある相同性を有し、および偽陽性抗体に対する潜在性を持ちつる〔リフオリ（１ｑｕａｕｏｒｉ）　＋Ｊ、Ｔｈｅｏｒ、　Ｂｉｏｌ、、１４８：２７９−８１．１９９１）。

一艷」１反応性の不在下における単離されたｌｌ玉反応性はｅｎｖ反応性の検出に利用できる電流の検定の不能性、もしくは接近の近親のレトロウィルスとの交雑反応性のどちらかに帰すことができ、あるいは早期のＨＴＬ■感染を表すことができる。膜蛋白質に対する抗体反応の欠損ハ、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ− １１抗原の両方を使用するＷＢおよびＲＩＰＡならびにＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−ＩＩ　（Ｅｎｖ−１，Ｅｎｖ−２，Ｅｎｖ−５，Ｅｎｖ−２０）の膜蛋白質から誘導された合成免疫優性モチーフに対する最小反応で検定し、さらに単の欠損は、免疫原性信号の閾値の欠損を生ずる最小のウィルス導入による可能性を無視できない。一方、単離された８３２反応性をもつ者は、膜蛋白および閾値における意味のある相違をもちおよびそのためプロト型ウィルス株に反応しないＨＴＬＶウィルスの変異型により感染され得る。ウィルスの変異型は後にバブア、ニューギニアから単離された（ヤナギハラら、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、８８：１４４６−５１）、１９９１）。

ｇａｇ抗体は、続く血清−変換で現れる最初の抗体の内にあるため（マン（Ｍａｎｎ　）ら、Ｂｌｏｏｄ、７７：８９６−９０５．１９９１）、ＨＴＬＶ”’検体中の単離した核抗体が早期の血清−変換体を表す可能性は可能性として残る。

しかし単離したｍ反応性をもつ検体からのＰＢＭＣはＰＣＲ分析により決定されたものとしてＨＴＬＶゲノムの存在を示さない。更に重要なことには、試験の開始の６ないし２３力月後に限定数の検体における再繁殖はＷＢ上に同様のバンドパタンを示し、ＲＩＰＡにおけるｅｎｖ反応性を示さず、ＰＣＲ分析による陰性を残す。ＨＴＬＶ”’バタンをもつ血液提供者の処方の回想研究は、１年間追跡した場合、ＨＴＬＶに対する血清変換の証拠を示していない〔サンドラ−（Ｓａｎｄｌｅｒ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、、６３：３５３−６０．１９９０〕。

組み換え膜輸送グリコプロティン（ｒ２．１）に対する抗体は最近早期ＨＴＬＶに対する血清変換の他のマーカーで有ることを示している〔マン（Ｍａｎｎ）ら。

Ｂｌｏｏｄ、７７：８９６−９０５．１９９１）、しかしｒ２１検出の特定性がまだ確認されていない。本研究では、Ｒ２１””およびｍ抗体をもつ検体がＰＣＲ分析によりＨＴＬＶゲノムの存在は示さない。Ｒ２１°１１ｖ反応性をもつ検体は追跡できず、それゆえ、そのような反応性が真正血清変換に存在するかどうか結論を下すことはできない。

ＨＴＬＶのｇａｇ蛋白質を持つ内因性のレトロウィルス性配列の抗原性模擬体はＬ！１反応性抗体に対して応６：１−８．１９９０〕、抗体応答は）（ＴＬＶ” ’および）ｆＴＬＶＩｓ′検体のの両方における内因性レトロウィルス性配列から誘導された合成ペプチド（ＲＴＶＬ”’、マンガー（Ｍａｎｇｅｒ）ら＋　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　、６１　：４０１３０−４０６６）に見出された。内因性レトロウィルス性配列はｇａｇのＣ−末端基において５０のアミノ酸配列と６０％相同性をもつ。高く保存されたレトロウィルスのＣＸ、ＣＸ４ＨＸ４Ｃモチーフを含むＨＴＬ、Ｖ（７）このＵ域は、他のタイプのレトロウィルスに存在し、ならびにヒト免疫不全ウィルス中に存在し、レトロウィルスゲノムへこの蛋白質の結合することに関してそれらを通して存在する。〔コーヴイ−（Ｃｏｖｅｙ）、　Ｎ　ｕ　ｃ　１　ｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、１４：６２３−３８．１９８６〕。ＲＴＶＬ域は、他のレトロウィルス中に見出されたものと非常に類似した場所において２つのこの変換された配列の完全でない複製を含有する（図９）。

さらに他のＥＲＳは内在的に２５ｋＤおよび１５ｋＤに対して暗号化している２つのオーブンリーディングフレームを含み、そしてＨＴＬＶ−１／Ｉ　Ｉのｇａｇ蛋白質と３２−３９％の相同性を示す〔ぺり（ｐｅｒｉ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、１７：６８４１−５４．１９８９）。ＥＲＳの大半が構造的な欠損であり感染性ウィルスとして表現されないが、ＥＲＳ遺伝子生産物のある部位の表現型は抗体の製造に対する抗原性刺激を提供できる。ＲＴＶＬ” ’は抗体応答ＨＴＬＶ感染したおよび感染してない者の両方に抗原を導入する、このようなエピトープの一つとして現れる。ＨＴＬＶ”’バタンをもつ者におけるＨＴＬＶゲノムに対する探究において、これらと同様に関心の焦点をあわせられたＬ見ユおよびｔａｘ／ｒｅｘ域はＨＴＩ、Ｖ−１およびＨＴＬＶ−ＩＩにおいて高（保存されている。ＨＴ　Ｌ　Ｖ　””検体はＨＴＬＶゲノムの存在を示し、ＨＴＬＶ”’をもつ検体ははＬ旦ユおよびｔａｘ／ＬＬ五プライマーを増幅しない。共培養技術による限定数の検体からのＨＴＬＶウィルスを単離する試みでは、培地上澄み中にＨＴＬＶ抗原の証拠を示さなかった（公表せず）。ＨＴＬＶの性質で組織された細胞により、ウィルス単離はＨＴＬＶを検出するための感受性のある手順ではない。これらの１１呈蛋白質に対する血清反応性の機構は未知として残るが、ＨＴＬＶ’″４検体におけるＨＴＬＶ感染の証拠を検出するためのＰＣＲの欠陥は、本発明者および他の者〔ウォック（Ｋｗｏｋ）ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｔｏｎ、３０：４９１　６　＋　ｌ　９９０　；　ハフバズ（Ｋｈａｂｂａｚ）ら、提示した）により観察されたものとして、これらの反応性がＨＴＬｖｍ蛋白質の不完全な表現型に相当するという可能性を無視できないと思われる。継続した努力はこれら典型的なＨＴＬＶ　ＷＢ結果の原因を決定するために必要とされると同時に、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−ＩＩの全ウィルス抗原または合成免疫優性の構造的モチーフを使用するｅｎｖ反応性の検出の欠陥およびこれらの個々からのＨＴＬＶ配列を増幅するための欠陥は単離された２３２反応性が真正ＨＴＬＶ完成には存在しないことを提案している。

本出順で言及した米国特許ならびに全ての米国特許出願を含めた全ての公表は、ここで参照文献に加えられる。

この様に記述した発明は、同様ものが多くの方法で変化できることは明らかであろう。この様な変法は本発明の精神および見地から逸脱するものとは見なされず、そして全ての当業者に明らかであろうとするこの様な改良を以下の請求項の範囲に含まれると意図する。

ＦＩＣ７，２ＡＦＴ（，３秋原　（ｕｇ／ｍ１）ＦＩＧ、　４ＡＦＩＧ、４Ｂ補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成５年８月１竪

Claims

【特許請求の範囲】

１．【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，Ｅｒｓ（内因性レトロウイルス配列）【配列があります】，およびそれらの類似体（上記配列中のアミノ酸は、その配列の三次元コンホメーションから誘導されるＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体への免疫活性が実質的に保存される限りにおいて置換されていてもよい）からなる群から選択されるペプチドを含む、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩまたはそれらの組合せに対する抗体への特異的免疫活性を有するペプチド。
２．【配列があります】ごある請求項１記載のペプチド。
３．【配列があります】である請求項１記載のペプチド。
４．【配列があります】である請求項１記載のペプチド。
５．【配列があります】である請求項１記載のペプチド。
６．【配列があります】である請求項１記載のペプチド。
７．【配列があります】である請求項１記載のペプチド。
８．【配列があります】である請求項１記載のペプチド
９．【配列があります】である請求項１記載のペプチド。
１０．Ｂｒｓ（内因性レトロウイルス配列）【配列があります】である請求項１記載のペプチド。
１１．（ｉ）検出すべき抗体−ペプチド複合体を製造するのに十分な量で、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩまたはそれらの組合せと反応させるための請求項１記載のペプチドの有効量を供給し、（ｉｉ）複働液で希釈された試験血清を添加し、そこで該試験血清中のＨＴＬＶ −ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体が前記ペプチドとでベプチド−抗体複合体を形成し、（ｉｉｉ）混合物を保温し、そして（ｉｖ）ペプチド−抗体複合体の存在を検出する、ことからなるＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩまたはそれらの組合せに対する抗体を検出するためのイムノアッセイ法。
１２．前記ペプチドが以下の群：【配列があります】Ｂｒｓ（内因性レトロウイルス配列）【配列があります】から選択される請求項１１記載のイムノアッセイ。
１３．段階（ｉｖ）において、酸素で原識された第２の公知抗体および該醇素と反応して着色物質を形成する基質が導入される請求項１１記載のイムノアッセイ。
１４．段階（ｉｖ）において、放射性元素で標識された第２の公知抗体が導入される請求項１１記載のイムノアッセイ。
１５．ペプチド抗体複合体が凝集として検出され得る請求項１１記載のイムノアッセイ。
１６．固体支持体が少なくとも１種の前記ペプチドで被覆されたマルチドット配列にあるストリップである請求項１１記載のイムノアッセイ。
１７．前記固体支持体上に被覆された前記ペプチドの量がウエルドットあたり１ μｇないし１０μｇの範囲である請求項１１記載のイムノアッセイ。
１８．少なくとも１種の請求項１記載のペプチドからなる免疫吸着剤、陰性対照としての正常血清の試料、陽性対照としてのＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体を含む血清の試料、および血清試料を希釈するための緩働液からなるＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩまたはそれらの組合せに対する抗体を検出するための試験キット。
１９．前記ペプチドが以下の群：【配列があります】Ｂｒｓ（内因性レトロウイルス配列）【配列があります】から選択される請求項１８記載の試験キット。
２０．請求項１記載のペプチドの少なくとも２種の混合物からなるペプチド組成物。
２１．前記ペプチドが以下の群：【配列があります】，【配列があります】，Ｂｒ８（内因性レトロウイルス配列）【配列があります】から選択される請求項２０記載のペプチド組成物。
２２．混合物中に存在する各々のペプチドが互いに１：１の比率で存在し、そして各ペプチドが０．１−１０μｇの量で存在する請求項２０記載のペプチド組成物。
２３．請求項１記載のペプチドを少なくとも１種含むワクチン。
２４．前記ペプチドが以下の群：【配列があります】Ｂｒｓ（内因性レトロウイルス配列）【配列があります】から選択される請求項２３記載のワクチン。
２５．ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩ感染の治療のために哺乳動物に授与するための薬物の調製のために、少なくとも１種の請求項１記載のペプチドを使用する方法。
２６．前記ペプチドが以下の群：【配列があります】Ｂｒｓ（内因性レトロウイルス配列）【配列があります】がら選択される請求項２５記載の使用方法。