JPH07502337A - 免疫学的検出装置および方法 - Google Patents
免疫学的検出装置および方法Info
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- JPH07502337A JPH07502337A JP4500417A JP50041792A JPH07502337A JP H07502337 A JPH07502337 A JP H07502337A JP 4500417 A JP4500417 A JP 4500417A JP 50041792 A JP50041792 A JP 50041792A JP H07502337 A JPH07502337 A JP H07502337A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
免疫学的検出装置および方法
本発明は、流体中におけるリガンドの、迅速な定性的および定量的測定の装置お
よび方法に関する。より詳しくは、本発明は、生物学的流体中における抗原また
は抗体の存在の検出、なんらかの流体(水、農産物加工業の流体物質、産業流出
物、生物学的流体等)中における毒性物質、ウィルス、または細菌の検出、(特
に生物学的)流体中に存在する物質(例えばホルモン、ビタミン、酵素、医薬等
)の化学的計量等に適用されるが、これらの適用は限定的なものではない。
生物学的流体中の抗原物質の存在または濃度の免疫学的測定方法は、現在ではよ
く知られている。これらの方法は、測定される抗原物質と、1つまたは複数の抗
体とのあいだでの複合体(complexe)の形成に基づいている。この複合
体の成分の1つは、放射性元素(例えばヨウ素125)でマークして、複合され
たマーク抗原または抗体を、複合されていないマーク抗原または抗体から分離し
たあとで、これの検出および/またはこれの定量分析ができるようにしてもよい
。競争による免疫学的測定方法において、分析される液体の試料中に含まれてい
る抗原物質は、限定量の抗体の固定部位に対して既知量のマーク抗原と、競争関
係に入る。抗体に結合したマーク抗原の量は、逆に、試料中に含まれている抗原
の量に比例する。
免疫計量テストには、マーク抗原を用いる。複合体と結び付いたマーク抗体の量
は、試料中に含まれている抗原物質の量に比例する。
多価抗原、すなわち同時に少なくとも2つの抗体と複合しうる抗原物質の検出に
特に適した免疫計量テストは、分析される液体中に不溶な固体支持体(supp
ort)と結合した、多量の非マーク抗体、および指示薬を有する多量の可溶性
抗体を用いることからなる。この指示薬は、例えば放射性アイソトープであり、
これによって固体相の抗体、抗原およびマーク抗体のあいだに形成された3成分
複合体の検出または定量的測定が可能になる。これらの方法は、まず最初に、固
体相と結合した抗体と、分析される試料とを接触させて、固体相抗体と抗原との
あいだに2成分複合体を形成することによって、試料から抗原を抽出することか
らなる。ある期間のインキュベーション後、固体支持体を洗浄して、ここから液
体試料の残渣を除去するが、これには場合によっては反応しなかった抗体が含ま
れている。
ついで既知量のマーク抗体を含む溶液と接触させる。非マーク抗体を介して、マ
ーク抗体が、固体支持体と結合した抗原と複合化できるようにするために、ある
期間の二番目のインキュベーション後、固体支持体を二回目に洗浄して、反応し
なかったマーク抗体を除去する。ついで洗浄固体支持体上のマーク抗体の存在が
、(例えば指示薬が放射線であるならば、発せられた放射線の測定によって)検
出され、場合によっては定量的測定プロセスに付される。
これらの方法は、抗原が、2つの異なる部位においてその表面と結合している2
つの抗体を備えていることから、「サンドイッチ」または「2部位」方法という
名称で知られている。これらの方法は、’Radioimmunoassay
Methods’においてWIDEによって記載されている( Ki rkha
mおよびHunter、EおよびS、 Livingstone 、 Edin
bourg版、1970年、199〜206頁)。
特殊な適用法(肝炎の抗原の検出テスト)が、米国特許第3.867゜517号
に記載されている。これらの方法の(「同時」または「逆の」)変形方法が、「
ヒト甲状腺刺激ホルモン(HTSH)の測定に適用される、単回インキュベーシ
ョン2部位免疫放射アッセイ(IRMA)でのRIAの比較J 、Bio−Ra
d Laboratories、 1979年;米国特許第4.174.384
号(螢光(フルオロセイン)発光団による、およびフルオロセインによって発せ
られた光を吸収する発光団による2つの抗体のマーキング):米国特許第4.0
98.876号において、JBONGらによって記載されている。これらの方法
は、当初、ポリクローン抗体を利用していた。これの感度は、他の抗原と交差し
た反応性が存在するために不十分である。Hybridtechのフランス特許
第8115030号は、第2、487.983号として公開されているが、これ
は、これらの免疫計量テストにおいて、ポリクローン抗体をモノクローン抗体と
代えて、これらの方法の感度を大巾に増すことを提案している。
公開番号第2.514.511号のLIOTTAのフランス特許第821697
3号は、BLISA方法による、生物学的流体中の抗原の存在を測定する装置お
よび方法であって、これに必要な洗浄および希釈操作を排除し、インキュベーシ
ョン時間を減らすものについて記載している。提案された装置はマトリックスを
含む。このマトリックスは、ニトロセルロースまたはジアゾベンジルオキシメチ
ル(DBM)のペーパー、および多孔質ゲル、例えばポリアクリルアミド、アガ
ロースまたはコラーゲンでできているリボンからなり、これの細孔内に、抗原が
トラップされていてもよく、あるいはリガンドのアミン基およびマトリックスが
存するカルボキシル基を介して、ゲルと架橋されていてもよい。あるいはこのマ
トリックスは、セルロースまたはプラスチック材料の繊維のリボンからなる。こ
れの内部には、リガンドを含む粒子または球がトラップされている。このLIO
TTA特許によれば、この装置は、
・酵素と結合した抗原および抗体を含む第一帯域であって、これらの抗体は、こ
の第一帯域を通る、テストされる試料中に含まれている、非結合抗体と反応した
ときに、この第一帯域から除去されるようにであるが、これらの抗原の不存在下
には、ここから除去されないように、前記第一帯域内に位置しているような帯域
、および・前記抗体の存在を暴く、着色反応を生じるように、酵素と結合した前
記抗体と反応することができる物質が入っている第二帯域、を備える。
特定すれば、LIOTTA特許によって記載されている免疫的計量装置は、多孔
質マトリックスの3つの層を有するラミネートを含んでいる。これの第一層は、
酵素と結合した特殊な抗体で含浸されており、第二多孔質層は(結合)固定化対
照抗原を含んでおり、第三層は、色を生じる基質を含んでいる。これは抗体と結
合した酵素と反応する。
分析される試料中に存在する、計量される遊離抗原は、第一層と接触させられ、
第二層に拡散し、ついで第三層に拡散する。試料中に存在する遊離抗原は、第二
層で固定化された結合対照抗原と競争関係に入り、酵素と結合した抗体と組み合
わされる。酵素と結合した抗体が遊離抗原と組み合わされると、これは第三層の
方へ自由に拡散し、着色反応を生じる。これに対して、分析される試料が抗原を
含まないならば、酵素と結合した抗体はすべて、自由結合部位を有し、第二層に
存在する固定化抗原と組み合わされる。第二層で固定化された抗原と組み合わさ
れる、酵素と結合した抗体は、第三層中で拡散されず、着色反応はまったく生じ
ない。公開番号第2、599.845号のLIOTTAのフランス特許第870
8007号は、この装置の変形例を記載している。この装置は2つの層しか含ま
ない。この上部層は2つの反応性抗体とともに抗原を有し、下部層はクロモゲン
基質を有し、2つの帯域(トラップ帯域と基質帯域)はまた、並置されてもよい
。
HYBRIDTEICI(7)米国特許第4.632.901号(および対応す
るPCT国際出願第85105451号)は、イムノアッセイの実施方法および
装置について記載しているが、これらは何回かの洗浄と結び付いた、長時間のイ
ンキュベーション工程に頼る必要がな(、これらは単純であることから、医師が
使用すること、あるいは医師と相談して、患者が自宅で使用することさえできる
。この装置は、同定したいと思う抗原を認識するモノクローンまたはポリクロー
ン抗体が結合している膜またはフィルタからなる第一多孔質要素と、その上部お
よび下部表面に垂直な毛管通路を備えた、吸収性のある第二要素とを備える。
この第二要素は、この装置の第一要素をなす多孔質膜または同等な膜と毛管連絡
しており、孔の大きさは、外部手段を用いずに、第一要素を通る液体の通過を誘
発するようなものである。濾過膜は、NO3基を有するナイロンであってもよい
。これらの基には、抗体が、グルタルアルデヒドによるカップリングによって、
共有結合されている。吸収要素は、繊維質濾過材料、例えば酢酸セルロース、ポ
リエステル、ポリオレフィンの繊維等でできていてもよい。これらの2つの要素
は、もう1つの多孔質要素(例えばポリエチレン)によって、互いに離されてい
てもよい。この要素は、非特定的に抗体を固定せず、マーク抗体が吸収要素の上
部表面上に非特定的に固定されるのを妨げる。
同様に、ABBOTT Laboratoriesの欧州特許出願第18610
0号は、テストされる試料中の物質の存在またはその量を測定することを目的と
する装置について記載しており、この装置は、例えばガラスのような非吸収性多
孔質繊維マトリックスを含む。このマトリックスは、疎水性ポリマーで含浸され
ており、このポリマーは、マトリックスの少な(とも一部の上に表面被覆を形成
し、このポリマーには反応体、例えば試料中で探しめられている基質と反応しう
る、抗体または抗原が固定されている。この装置は、表面にでない吸収材料層、
および/または繊維質材料、例えばガラス繊維またはセルロース濾過ベーパーの
層と結び付けられてもよい。この層は、繊維質マトリックスを覆っており、予備
フィルターの役割を果たすことができる。
MURBX Corp、の欧州特許出願第206.561号はまた、診断装置に
ついても教示している。この装置は、少な(とも1つの周辺帯域と結び付いた少
なくとも1つの反応帯域を備える濾過要素、第一要素の周辺帯域とのみ結び付け
られた吸収要素、およびフィルタの適切な位置への維持要素を備える。反応帯域
内に生じる「反応」は、濾過による分離であることも、免疫学的カップリングで
あることもある。
反応の読取り信号が生じるのは同じ帯域においてである。液体試料は、漏斗によ
りフィルタ上に達する。この漏斗の排出オリフィスは、漏斗内の液体の圧力と組
み合わされて、液体がフィルタの上部表面上に排水されるが、ここを横断しない
のに十分な直径になるように計算される。静水圧は、その後、液体が重力によっ
てフィルタに入り、毛管作用によってフィルタを通って拡散されるが、端から端
まで垂直にフィルタを通らないように調節される。
Uniliver PLCの特許第[(P−A−274198号は、クロマトグ
ラフィ型のカラムである。ここを通って試料の流体が流れる。このカラムは、探
しめられている抗原と同一な抗原と結び付けられて、この抗原に特有な抗体をト
ラップするようにされた抗酵素抗体の固定化支持体からなる。抗体は、実際はカ
ドロームである。Fab部位は抗原を認識するが、一方残存Fab部位は酵素を
認識する。これは実際、独創的なマーキング手段であるが、この方法は実際、前
記特許と同一である。カラム内の固定化抗原は、試料中の抗原に会わなかったマ
ーク抗体をトラップする。
KONICA Carp、の特許第HP−A−328106号は同様に、本発明
の対象となる特許におけるものと同じ機能を有する3つの区画の積み重ねである
。しかしながらここではさらに、真ん中の区画において固定化された対応抗原に
よる、遊離マーク抗原のトラップに関している。
これらの装置はすべて、テストされる液体試料が流れる濾過要素を共有している
。濾過は、このレベルに、探しめられているリガンドと同一なリガンドが、固定
化されて存在することによって選択的にされる。
Mattiasson、 Danielson 、 Hermanssonおよ
びMo5back (FBBSLetters、85.203頁、1978年)
は、タンパク質がもはやこれらの生理学的条件下にないときに、タンパク質の構
造中に生じる変化を明らかにし、一連の興味深い解決法をすべて提案している。
これとは逆に、免疫グロブリンの抵抗性、保存および安定性が高い品質に関して
は、文献が豊富である。このために、本発明の対象の方法は、免疫グロブリンを
用いることにしている。これらの免疫グロブリンは、マーク抗体が抗原飽和して
いないときに、このマーク抗体をストップし、これが抗原飽和しているときに、
基質の方へこれを下降させるために適切に調製され、かつ選ばれている。同様に
免疫グロブリンは、試料中で抗体に出会わなかったマーク抗原をストップし、試
料のマーク抗原+抗体複合体を通過させる。選択的濾過要素上に固定されたこれ
らの免疫グロブリンは、第一層上に置かれた抗体(または抗原)をマークする酵
素に対して、あるいはまた(例えばそのフリーなままのFab部位上に固定され
て)マーク抗体それ自体に対して、あるいはこれら2つに対して作用することに
よって、この使命を果たす。免疫グロブリンは、(抗原+抗体複合体の不存在下
)マーキング酵素、およびこのマーキングを支持している(対応リガンドによっ
て不飽和のままの)抗体(または抗原)を固定する。
これらの条件下、前記のすべての方法とは異なって、選択的濾過要素は、もはや
探しめられているリガンドに特別にはよらない普遍的な性質を獲得する。例えば
、装置の上部層に、ヒトPSH(リンパ小節刺激ホルモン)に特有で、かつペル
オキシダーゼによってなんらかの方法でマークされた、マウスのIgG1型のマ
ーク抗体を置くことによってである。選択的濾過要素は、適切に選択され、かつ
調製された抗ペルオキシダーゼ免疫グロブリンを、固定化されて含む。
試料がFSHを含まないならば、PSH抗原飽和していない、ペルオキシダーゼ
でマークされたマウスのIgG1は、ある方法で調製された抗ペルオキシダーゼ
免疫グロブリンによって、(読取り帯域の方への)その移動中にストップされる
であろう。これに対して、試料がPSHを含むならば、ペルオキシダーゼでマー
クされたIgG1 + FSH複合体の形成がある。これらの複合体は、抗ペル
オキシダーゼ免疫グロブリンによって認識されない。その理由は、あとで詳細に
記載する種々の調製技術が、次のような結果を生むからである。すなわち、選択
的濾過要素上に固定化された抗ペルオキシダーゼ免疫グロブリンによって認識さ
れた免疫原性の部位のように、マークされたIgG1と結合したFSHが、予め
選ばれた(ペルオキシダーゼの)部位を隠すのである。
選択的濾過要素のレベルでのマーク1gG1の停止は、特にFSHの不存在によ
るものではな(、むしろFSHを認識する[gGlの不飽和によるものである。
したがって選択的濾過要素上に固定化された免疫グロブリンは、それらの固有の
抗原によって飽和されていない、ペルオキシダーゼでマークされたすべてのIg
G1を認識し、かつストップする。したがってこれらの同じ固定化免疫グロブリ
ンは、抗原がどんなものであれ作用する。したがってこれは普遍的な選択相であ
る。
これはもはや以前のように、探しめられているリガンドと同一である必要はない
。例えば、FSHの計量において、FSHをこの選択相上に固定しなければなら
なかった。第一層上に置かれた抗FSHマーク抗体は、試料中においてFSHと
出会わず、この選択相のPSHによってストップされた。したがってFSHをこ
の選択相上に固定化しなければならなかった。
ところで本発明の対象の方法は、「プレスクリーニング」戦略において、同時に
複数の物質を検出することにする。探しめられている物質のうちの少なくとも1
つが試料中に存在するならば、よりターゲットを定めた計量を行なうのがよい。
例えば、消化領域の腫瘍マーカーの計量(肝臓の場合アルファfoetoタンパ
ク、膵臓の場合CA−19−9、結腸の場合癌胎児性抗原等)である。これらの
マーカーの少なくとも1つが過剰であるならば(あとで詳細に記載する半定量的
オプション)、この方法はこれをも暴き、医師が消化領域に、より詳細な検査を
行なうように導かれる。
したがってこの装置の上部層に置かれたマーク抗体をストップするために、同じ
選択相上にこれらのマーカー全部を固定化することは不可能である。マーカーの
各々は固有のpK、 pl等を有しており、固定技術はタンパク質毎に異なる。
あるいくつかのマーカーは、リジン残渣を有していない。この場合、同じブロッ
キングは利用できない。
これに対して、この装置の上部層上に、ペルオキシダーゼでマークされた抗体の
結合物を置(ことも可能である。この結合の各々は、ある一定のマーカーに特有
である。マーカーがまったく存在しないならば、これらはすべて、同じ抗ペルオ
キシダーゼ免疫グロブリンによってストップされるであろう。したがって少なく
とも1つのマーカーが存在するならば、この特定の抗体は飽和され、選択的濾過
要素上に固定化された抗ペルオキシダーゼ免疫グロブリンによって認識されない
であろうし、暴露帯域の方へ移動するであろう。
したがって本発明は、流体中における反応性リガンドの存在の、迅速な定性的か
つ定量的測定のための装置および方法を供給することを目的とする。この装置お
よび方法は、先行技術において提案された、同じ目的を目指す装置および方法の
やり方に必要なものによりよく応える。とりわけ、直接かつ特定的に、探しめら
れているリガンドを介入させずに、抗原+抗体複合体と、複合されていないリガ
ンドのうちの1つだけとの選択手段が、より単純かつ容易であるという点におい
てそうである。このことは、この方法に、普遍的な特徴を与える。
本発明は、流体中における反応性リガンドの存在の、迅速な定性的かつ定量的測
定のための装置であって、探しめられているリガンドと反応するための、マーク
反応体、特にマーク抗体または抗原を含む第一反応帯域、試料中に存在しないリ
ガンドによって飽和されていないなら、第一帯域に置かれたマーク反応体を中和
するための、いわゆる選択的第二帯域、およびいわゆる暴露第三帯域を備える型
の装置に関する。前記装置は、下記のものを組み合わせて備えることを特徴とす
る:
・テストされる流体の試料を受け取るため備えられ、かつ場合によっては試料中
に含まれている1つまたは複数の探しめられているリガンドを認識するのに適し
た、適切にマークされた少な(とも1つの反応体と結び付けられるための、透過
性多孔膜を備える第一反応帯域、
・第一帯域とは完全に異なって、これとは別れた第二反応帯域であって、(第一
帯域に置かれた)1つまたは複数のマーク反応体を認識するのに適した、非マー
ク対照反応体を含む透過性多孔質固体相を備えるが、この1つまたは複数のマー
ク反応体がそのリガンドによって飽和されているときだけ、この対照反応体が完
全にリガンドから独立する帯域、
・第二帯域とは完全に異なって、これとは別かれた、同様に多孔かつ不透過性第
三反応帯域であって、場合によっては第一反応帯域または第二反応帯域で生じた
反応の暴露手段を備える帯域。
本発明に合致する装置のもう1つの有利な実施態様によれば、第一反応帯域は、
有利には第−膜によって支持された固体相を受け入れるのに適しており、これは
、適切な方法で、特に酵素、ラジオアイソトープ、螢光または化学ルミネセンス
発光団化学物質によってマークされた少な(とも1つの反応体を含む。このマー
ク反応体は、有利には抗体または抗原である。
本発明に合致する装置のもう1つの有利な実施態様によれば、第二反応帯域にあ
る非マーク反応体を含む固体相は、非マーク(特に免疫グロブリン)前記反応体
が固定されている不溶性支持体からなる。これは第一帯域の反応体のマーキング
酵素、あるいは前記第一反応帯域の1つまたは複数の反応体それ自体に相当する
。前記不溶性支持体は、微小球、マイクロプレート(microplaque)
、ゲル(ポリアクリルアミド、アガロース等)、またはよく知られたその他の
支持体から選ばれる。
本発明に合致した装置のもう1つの有利な実施態様によれば、反応の読取りが色
度測定によってなされなければならないことが予想されるとき、第三反応帯域は
、クロモゲン基質を含んでいる。
本発明に合致する装置のもう1つの有利な実施態様によれば、この装置は第一反
応帯域の上に、ある量だけの探しめられているリガンドを中和するための追加帯
域を備える。この量は、試料中でノーマルとみなされる限界閾値に相当する。過
剰量のリガンドがあるときには、これはこの追加帯域を通り、前記の第一帯域で
マーク反応体と反応し、もっとあとで装置の残りのものと反応する。これによっ
て半定量的な計量が可能になる。
この実施態様のもう1つの有利な配置によれば、追加帯域は、有利には反応体(
特に抗体)と結び付けられた膜である。この反応体は、ある量だけの探しめられ
ているリガンドを固定しうる(したがって中和しうる)。この量は、試料中でノ
ーマルとみなされる限界閾値に相当する。これによつて半定量的な計量が可能に
なる。
この実施態様のもう1つの有利な配置によれば、ある量だけのリガンドを中和す
るための非マーク反応体は、第一反応帯域または第二反応帯域と結び付けられ、
固定され、かつ固定化されうる。
発明によれば、第三反応帯域を、それ自体知られた量子化装置、例えばRIA、
分光光度計等と結び付けて、定量的計量を実施することも可能である。
本発明に合致した装置の有利な実施態様によれば、前記反応帯域は、積み重ねら
れて、上から下へ次のものを形成する。すなわち、第一反応帯域を含む上部階、
第二反応帯域を含む中間階、および第三反応帯域を含む上部階、および場合によ
っては半定量的計量装置の場合、追加反応帯域のための、上部階の上にある追加
層である。
本発明はまた、流体中における反応性リガンドの存在の、迅速な定性的および定
量的測定方法において、第一工程のあいだに、分析される流体の試料を、第一反
応帯域において、マーク反応体、例えばマーク抗体または抗原と接触させること
、特に第二工程のあいだに、この第一反応生成物が、第二反応帯域において、非
マーク第二反応体と接触し、この第二反応体は、第一帯域のマーク反応体が、探
しめられているリガンド飽和しているか、あるいはしていないかを認識する特性
を有しており、この認識は、探しめられているリガンドとはまったく無関係であ
るが、この理由は、試料中の探しめられているリガンドがどんなものであれ、こ
の第二帯域のこの反応体は同じものであるからであることを特徴とする方法であ
って、最後に、第三工程のあいだ、第一または第二反応の生成物が、第三反応帯
域において、検出しようとしているリガンドの存在または不存在の暴露手段と接
触することを特徴とする方法をも対象とする。
本発明に合致した方法の実施態様によれば、流体の試料を、前記方法の第一工程
の前に、非マーク反応体と接触させる。この反応体は、ある量だけの探しめられ
ているリガンドを中和または固定するためのものである。この量は、試料中にお
いてノーマルとみなされる限界閾値に相当する。したがって過剰量のリガンドが
存在するとすれば、これは、前記の異なる連続帯域の反応体と接触する。
図1(本発明に合致する装置の実施態様の直交断面図としての図式的表示)に示
されている、本発明に合致した装置は、下から上へ、支持体(A)を備え、これ
は大きな多孔度を有し、かつクロモゲン基質スポット(B)で含浸された、セル
ロースまたはその他のマトリックスのペースト(pastille)を有し、こ
の上には、非マーク対照反応体で含浸された、はるかに密な多孔度の!I (C
)が配置されている。大きな多孔度の膜(D)は、マーク反応体で含浸されてお
り、これは、場合によっては試料中に存在するリガンドを認識するであろう。こ
のリガンドは、(A)と同一なプレート(F)のオリフィス(B)内に置かれ、
このプレートはこのようにしてペーストの積み重ねを取り囲む。
この装置によって検出しようとするリガンドは、抗原または抗体であるが、あら
ゆる種類の化学または生物物質でもある。使用法は非常に多い。使用法としては
、癌の早期検診、酵素的計量、ウィルスまたは微生物疾患の診断、自己免疫疾患
の検診、成長因子、例えばEGP (表皮成長因子) 、PGP (繊維芽細胞
成長因子) 、TGF (変形成長因子−およびβ)、TNF(腫瘍壊死因子)
、IGF (インシュリン様成長因子) 、PDGF (血小板派生GF)
、C3P (コロニー刺激因子)等でありて、すべて多少なりとも、新生物プロ
セスに含まれるものの計量、サイドキン(cytokines) (インターロ
イキン1〜7、インターフェロン−1βおよびガンマ、エリトロポエチン等)の
計量、これらの成長因子およびこれらのサイトキンの膜(membranair
e)レセプタの計量であって、これらの膜レセプタの率は、多くの癌において1
00または1.000倍されるもの、ホルモンの計量、特にこれらのホルモンの
レセプタの計量であるが、この理由は、これらのホルモンのレセプタの率といく
つかの癌(テストステロンの場合前立腺、エストロゲンの場合***)とのあいだ
に関係があること、および成長因子のあるレセプタの過剰+エストロゲンのレセ
プタの崩壊の組み合わせは、例えば乳癌の悪い徴候であり、イオン化および外科
治療の外に、ホルモン治療にもつながることがご(最近になって明らかになった
からであり、また重大な炎症プロセスにおけるリューコトリエンおよびプロスタ
グランジンの計量、これらのレセプタの計量、アレルギーの検診(IgEI)
、神経化学伝達物質、これらの神経化学伝達物質のレセプタ(大脳の老化現象の
多(の病理学において崩壊しているもの)の計量、これは特に重い精神病質にお
いて、治療されるべき本当のターゲットであることがわかっているドーノくミン
の第三レセプタ(D3)の発見以来のものであり、一方以前の治療は、レセプタ
(Dl)および(D2)を遮断することを目的としているが、レセプタ(D3)
を遮断する時には存在しない、重大な二次作用(筋拘縮、酩酊等)というよく知
られた付随作用を伴なうもの、医薬の計量等が挙げられる。このような列挙は網
羅的でも、限定的でもない。
これは、以前は複雑で高価であった多(の検査を単に明らかにするだけである。
これらの検査は、本発明の対象の方法によつて容易にされ、かつ実施できるもの
になり、重大な疾患の系統的かつ早期検診のためのものである。
図2は、この方法の種々の反応体を示している:・検出されるリガンドを認識す
るマーク反応体(1)は、主として抗体または抗原であり、これらは上部階のJ
[!(D)上に置かれ、マーキング材料の保存および安定を目的とする、後で記
載される複合混合物中溶液である(特に、例えば光および空気の酸素に敏感な酵
素、あるいは螢光物質、ラジオアイソトープであって、すべて適切な基質で着色
された反応を生じうる化学物質である)。
・中間階(C)の反応体(2)は、好ましくは免疫グロブリンであるが、これだ
けではない。これらの免疫グロブリンは、複数の種々のまたは組み合わされた方
法で、上部階のマーク反応体をトラップするが、もっばら試料中にリガンドが不
存在なときだけである。
・あるいはこの酵素に特有な抗酵素免疫グロブリンを介して、常にリガンドの不
存在下に、(比色定量方法における)マーキング酵素をトラップすることによっ
て。
・あるいは抗体であるとき、上部階のマーク抗体のNH2部位、すなわち試料中
にリガンドがないので遊離部位に特有な抗酵素免疫グロブリンを介して、マーク
反応体をトラップすることによって。
これに対して、もし試料中にリガンドがあるならば、上部階のマーク抗体のFa
b部位は、リガンド飽和しており、抗酵素免疫グロブリンによって認識されない
であろう。
・あるいはマーキング酵素とマーク抗体の両方をトラップすることによって。こ
れは常に試料中にリガンドが不存在なときであり、抗酵素と抗Fabの免疫グロ
ブリンの結合を介してである。リガンドの不存在によって、これら2つの後者の
部位は、これらに逆らって進む免疫グロブリンに近付きやすくなる。一方リガン
トの存在は、酵素を隠すことになり(だからといって酵素を阻害することはない
)、上部階のマーク抗体のPab位置を占める。
したがって中間階のこれらの免疫グロブリンは、最も重要な役割を果たす。リガ
ンドが何であってもである。このことはこれらの性格を普遍的なものにする。し
かしながら(抗原の計量の場合)上部階のマーク抗体が、下記のものであること
を明確にしなければならない:
・中間階の免疫グロブリン(例えばマウスの[gGlの抗Pab)が、計量され
るリガンドが何であれ、無差別にこれらを認識するために、同じ起源のもの(マ
ウスのigGl)であること;・探しもとめられている抗原が、ペルオキシダー
ゼ分子を隠すことになり、したがって抗ペルオキシダーゼ免疫グロブリンが、マ
ーク抗体が有するペルオキシダーゼを認識するのを妨げるのでなければ、中間階
の免疫グロブリン(例えば抗ペルオキシダーゼ)がこれらをすべて認識し、これ
らをトラップするため、同じマーキング(例えばペルオキシダーゼ)を有する。
したがってこれらのマーク抗体は、この選択相を横断し、(B)の基質を着色す
るようになること;
・ある方法でマークされること。酵素が、上部階の抗体のFab部位から、可能
なかぎり近いところに固定される必要がある。したがって例えば膜レセプタ(4
00kD)のように、容積が大きいリガンドの存在は、酵素を完全に隠す(それ
でもこれを阻害しない)。したがってマーク抗体F(ab)’ 2の使用は、全
体の抗体にとって好ましい。
これら3つの要件は中間階(C)において、HYBRIDE!Sと呼ばれる免疫
グロブリンに頼るならば、同時に満たしうる。NH2部位はマーキング酸素を認
識し、もう1つのNH2部位は、上部階のマーク抗体フリーな反歩(Fab)を
認識する。このようにして、同じ免疫グロブリンが試料中で抗原と出会わなかっ
たマーク抗体を、2つの異なる部位によって、しっかりとトラップすることがで
きる。
中間階のこれらの免疫グロブリンは、有利には、微小球(ラテックス、アガロー
ス、ポリスチレン、ポリアリルアミド、種々のゲル等)によって支持されてもよ
い。これらの微小球は、上部階にフリーなままのマーク反応体を保持するための
反応体を有する。
これらの条件下、プラスの反応の場合、1滴の生物学的流体中に抗原を探しめる
ならば、流体中に存在する抗原は、ペースト(D)に含まれているマーク抗体と
結合している。前記のマーク抗原−抗体複合体は、(C)に置かれた微小球層を
通過するが、微小球に保持されることなく、ついで基質を含む暴露Kl(B)上
に達し、この基質はしたがって調べられた流体との接触によって着色される。
マイナスの反応の場合、すなわち調べられる試料が抗原を含まないならば、上部
階のマーク抗体は、(C)の微小球上に固定された非マーク反応体によって保持
され、(B)の基質を着色することにならない。
流体中で探しめられるのが抗体であるならば、当然の相違点は別として、やり方
は同じである。
半定量的計量を得たいならば(図3)、ペースト(D)の上に置かれた、(CO
)と呼ばれる追加ペーストは、適切な反応体(3)を介して、ある量だけの探し
められているリガンドを固定化および中和する。
この量は、流体中でノーマルとみなされている量に相当する。過剰量のリガンド
があるとすれば、これはこの(CO)膜を通過して、普通なら、前記帯域の反応
体と反応する。
図4は、プラスの結果が得られた、抗原の定性的計量を示している。ここでは、
形成されたマーク抗原−抗体複合体(5)が、保持されずに中間階を通過し、暴
露帯域(B)の方へ行き、一方抗原飽和していない残存抗体(6)は、(C)で
トラップされる。
図5は、プラスの結果が得られた、抗体の定性的計量を示してぃ開所を通過し、
一方、フリーのままのマーク抗原(8)は(C)でトラップされる。
実施例1 : EGP−R(表皮成長因子のレセプタ)の計量(1)支持体
(B)では:デュリウー(Durieux)ペーパー魔122(C)では;Pa
1lポール(Nylon Pa1l)、多孔度0.45μ、厚さ100ミクロン
(D)では=5%脱脂乳で予め処理されたワットマンペーパー(2)反応体
(B)では:下記溶液の2μmのスポット;* 1 mg/mlの3−3’ −
5−5’ テトラメチルベンジジン本シトラード緩衝液0.01M
(C)では:ヤギ抗ペルオキシダーゼシグマ、Ref、 5774抗体(D)で
は:モノクローン抗日GF−レセプタ:クローン魚29.1.1゜マウス[gG
l
ペルオキシダーゼマークされているもの(Yardenら、J。
BIOL、 CHEM、、、 260.315(1985年))。
PBS中D−グルコース0.1M溶液になされているもの。
(3)厳密な操作方法
(3a)ペーストの製造および抗体のマーキング技術−(1) : 1mlのエ
タノール中にPBQ (p−ベンゾキノン) 30mgを溶解する。
−(2) +pH6(7)緩衝フォスフェートI M O,05m1を含む0.
15m1ノNa C10,15M中に、ヤギ抗レセプタモノクローン抗体1mg
を希釈する。
−(3) :(1)のPBQ溶液0.05m1を、(2)の抗体の希釈液に添加
する。1時間暗闇で、周囲温度でインキュベートする。
−(4) :完全透析によって過剰のPBQを除去する(1晩)。
−(5) :ベルオキシダーゼ4mgを添加する。数分間、渦巻き攪拌する。
−(6):NaHCO31MpH9炭酸塩緩衝液0.1mlを添加し、48時間
、4℃でインキュベートする。
−(7) :0.22μミリポアフィルタ−を通す、PBSに対する長時間透析
(1晩)。暗闇で4℃で保存する。
ワットマンペーストを、5%脱脂乳洛中に浸し、ついで濯ぎ洗いし、乾燥する。
各ペーストの上に、PBS中に171000に希釈された、得られたマーク抗体
溶液5μmを置く。強い真空下の乾燥、ついで真空下、暗闇で4℃で貯蔵する。
(3b) :選択相:
0.45.czの多孔度のImmunodyne Pa1lナイロンのペースト
を、下記等液浴に、1時間浸す:
・1マイクログラム/mlのヤギ抗ペルオキシダーゼ抗体・PBS。
1時間後、冷PBSで濯ぎ洗いをし、ついで1時間、下記溶液中温によるブロッ
キングを行なう:
・ウシ血清アルブミン2%
・冷PBS 。
ついで下記溶液で、数回濯ぎ洗いをするニー Thimerosal O,01
%・トリス緩衝食塩液(TBS) pH7,4下記品質管理のため、2つのペー
スト以外は、真空下に乾燥および保存する:
品質管理:図6
・選択相のペーストを取り、これをペルオキシダーゼでマークされた抗E!GF
−R抗体溶液中に浸す二ペースト(T−)。
・選択相の第二ペーストを取り、EICF−R(BGPレセプタ)および抗BG
P−R抗体の過剰溶液中にこれを浸す:ペースト(T+)。
15分のこの浴のあいだ、対照ペーストを調製する:・抗ペルオキシダーゼ抗体
がないことを除き、2つのナイロンペーストを、選択相と正確に同じ方法で調製
する。普通はこれらは何も保持してはならない:ペースト(TT)。
ペースト(TT)の1つは、抗EGF−Rマーク抗体の溶液中に、ペースト(T
−)と−緒に浸す。もう1つを、BCF−R飽和の抗EGF−Rマーク抗体の溶
液中に浸す。
濯ぎ洗いと乾燥をし、ついで各ペーストの上に、下記クロモゲン溶液5μmを置
く:
(TMB 1+ng/ml 、 H2020,01容、シトラード緩衝液0.1
M)。
図6は得られた結果を示している:
・抗BGF−Rマーク抗体の溶液の洛中において、ペースト(T−)は、ペルオ
キシダーゼでマークされた抗EGF−R抗体を固定した。これは置かれたクロモ
ゲン溶液をブルーに着色する。ペースト(TT)は無色のままである。すなわち
これはまった(何も固定しなかったのである。そこに固定されている、ペルオキ
シダーゼでマークされた抗BGP−R抗体はなく、したがって寄生保持はない。
・BGF−R飽和された、抗EGF−Rマーク抗体の溶液中において、ペースト
(T+)はこれらの抗体を固定することはできなかった。これらに結合した抗原
のために、これらのペルオキシダーゼは、選択相ペースト上に予め固定された抗
ペルオキシダーゼ抗体に接近できなくなっており、これらは濯ぎ洗いで除去され
た。クロモゲン溶液を除いて(depose)何も着色しなかった。対照ペース
ト(TT)も同様に、何も固定しなかった。
(4)実施態様
1++lのPBSを、ポリプロピレン製の、(0)と(1)という番号が付けら
れた2本の管に注ぐ。
管(1)に、***上皮腫の細胞膜の処理(洗浄剤、核や膜等を除去するための連
続遠心分離、ついで24時間の長時間透析および5ephadexカラムの通過
)によって得られたBGFの膜レセプタ溶液2μmを加える。
管(0)の50μmを、装置(DO)のオリフィス(B)に置(。
管(1)の50μmを、装置(Dl)のオリフィスに置く。
結果:
30秒間後、装置を逆さにする。(DI)のTMBスポットはブルーであるが、
(DO)のは無色のままである。図7゜支持体、(B)の反応体(TMBスポッ
ト)、および(C)の反応体(抗ペルオキシダーゼ抗体の選択相)は、実施例1
と同じである。
ペースト(D)だけが異なる。これは、これらの抗体5ナノグラムを含む、5μ
lの1スポツトの割合で、サブ単位β−HCGに特有な、ペルオキシダーゼでマ
ークされたマウスのIgG1抗体を含む。実施方法
(0)〜(4)という番号が付けられた5本の管には、次の国際単位で示された
漸増濃度のPBS中HCG溶液が入っている:0−12.5−25−50−10
0 U、 1. /PBSリットル。
5本のHCG定性計量装置は、次のような番号が付けられている:DO−012
.5−D25−D50−0100゜装置(D)の上に管(0)の50μlを、装
置(012,5)の上に管(1)の50μmを、装置(D25)の上に管(2)
の50μmを、装置(050)の上に管(3)の50μmを、装置(0100)
の上に管(4)の50μmを置く。
30秒間、流体が全部流れるのを待ち、TMBの着色信号の読取りのために装置
を逆さにする。信号はθ〜+++に評価される。
結果
実施例3:インターロイキン1の半定量的計量支持体は実施例1と同じである。
(B)の反応体(TMBスポット)、および(C)の反応体(抗ペルオキシダー
ゼ抗体)も同じである。
(D)では:ペルオキシダーゼでマークされた、Genzyme Carp。
(Koch Light Ltd、イギリス)から入手した、「ウサギ抗ヒトイ
ンターロイキン1β」抗体。
(CO)では:多孔度0.45ミクロン、厚さ100ミクロンのPa1lナイロ
ン膜であって、前記抗[L−1β抗体でよく希釈された(0.1Mg/ml)溶
液の浴によって処理され、ついで濯ぎ洗いされ、BSA 5%および冷PBSに
よって飽和され、さらに濯ぎ洗いして過剰のBSAが除去されたもの。乾燥し、
4°Cで保存する。この膜(CO)は、1mlあたり505ピコグラムの高さの
、分析される試料中に含まれたルー1βをトラップしようとする。すなわち5L
l[のルーlβ/mlである。過剰量のIL−1βが存在するならば、これは(
CO)を横断し、(D)のマーク抗体と結合し、ついで抗ペルオキシダーゼ抗体
と結合せずに、(C)を横断し、最後に暴露のために(B)に到着する。すなわ
ちTMBの着色である。
一方ルー1β率が、試料中で5011011であるか、それ以下であるならば、
(CO)において固定化された非マーク抗体は、【し−1βをトラップし、一方
(D)に存在する抗IL−1βマ一ク抗体は、【L−1βを受け取らず、試料の
流体とともに、下方すなわち(C)の方へ移動する。この(C)では、これらは
、抗ペルオキシダーゼ抗体によってトラップされる。(B)にはペルオキシダー
ゼマークされた抗体がなく、したがって着色がないであろう。
図8は、右がマイナス(IL−1β−5Ll[/ml) 、左がプラス(ルー
173 5 [11/ml)のIL−1βの半定量的計量を示している。
実施例4:癌胎児性抗原の半定量的計量同じ支持体。(B)では同じ反応体(ク
ロモゲン基質)反応体ニ
ー (C)では:ヤギ抗マウス[gG Pab 5pecific Ref M
6898シグマ・(D)では:ベルオキシダーゼでマークされた、マウス抗A
CBモノクローン抗体: Miles Lab、のRef 69.186.1・
(CO)では:ナイロン上に固定化された、非マーク抗へ〇B抗体。
操作方法:
膜(CO)の調製
抗ACE抗体の強く希釈された溶液(0,1μg/ml)は、Pa1lプロトコ
ルにしたがって、多孔度0.45μ、厚さ100μの1mmunodyne型の
ナイロン製膜を飽和する。1時間の穏やかな攪拌後、濯ぎ洗いとブロッキング浴
(BSA5%、PBS ) 、ついで冷PBSでの3回の濯ぎ洗いおよび乾燥を
行なう。暗闇で、真空下、乾燥保存。
このように調製されたこのベレット(CO)はACBをトラップする(2.5ナ
ノグラム1011)。これは正常な成人(非喫煙者、妊娠していない女性)の血
液中では限界閾値とみなされる。II(D)の調製(マーク抗体)
ペルオキシダーゼでマークされた、マウス抗ACB抗体の溶液を、PBSと5%
D−グルコース溶液中に、1μg/mlに希釈する。この溶液5μmを、5%脱
脂乳によって予め飽和されたワットマンペーパーのペースト上に置く。膜(C)
の調製(選択相)Pallナイロンのペースト: [mmunodyneを、l
μg/mlのPBSで希釈された、ヤギ抗マウス[gG Fab抗体の溶液中に
、1時間、周囲温度で浸す。ついで前記のように濯ぎ洗いとブロッキングをし、
ついで最終濯ぎ洗いをして、暗闇で真空下、4℃に保存する。この膜は、マウス
抗ACIEマーク抗体をトラップするが、これは、抗ACBマーク抗体がマウス
からのもので、この選択相の抗体が、マウスの抗体のFab部分、すなわちあら
ゆるACBを含まないマウス抗ACEI t、か認識しないので、これらがAC
B飽和していないときである。試料中の過剰なACE (2,5ng /血清m
1以上)は、マウス抗ACB ?−り抗体のFab部位と結合するようになり、
これらのPab部位は、ACHによって隠されるようになり、したがって!i
(C)内に固定された抗マウスFab抗体によって認識されないであろう。膜(
Co)から溢れた、抗ACBマーク抗体十過剰ACB複合体は、この選択相(C
)を通って、試料の流体とともに、暴露帯域(B)の方へ移動する。
一方、すべてのAC[Eフリーなままのマウス抗ACEマーク抗体は、抗マウス
Fab抗体によって、(C)でトラップされるであろう。
実施態様:
6本のポリプロピレン管に、(0)−(1)−(2)−(3)−(5)−(10
)という番号を付ける。
これらには、下記濃度で、PBS中のACBが入っている。
管(0) :ACIl!を含まない対照。
管(1) : lngのACE /ml ;管(2) : 2ng/ml ;管
(3) : 3ng/ml;管(5) + 5ng/ml ;管(10) :
10ng/m16つの半定量的装置に、(Do)−(DI)−(D2)−(D3
)−(D5)−(DIO)という番号を付ける。
管(0)の50マイクロリツトルを、装置(DO)に入れる。管(1)の50μ
mを装置(Dl)に、管(2)の50μmを装置(D2)に、管(3)の50μ
mを装置(D3)に、管(5)の50μmを装置(D5)に、管(10)の50
μlを装置(010)に入れる。
30秒間、試料の流体が完全に流れるのを待ち、ついでTIJBスポットの着色
を読み取るために、装置を逆さにする。
結果
管の番号 0 1 2 3 5 10
(ACIE率(ng/ml) )
信号 0 0 0 + ++ +++
θ〜++十で記される
実施例5 : GA 125の放射性定量的計量:図9CA 125は、婦人科
の癌、特に卵巣上皮腫の診断および追跡調査のための独特な腫瘍マーカーである
。これは、高分子量の糖タンパク質と組み合わされる。糖タンパク質は、正常な
卵巣には存在せず、卵巣腺癌に多量に見出だされる。
正常な被験者のCA 125の血清または血漿濃度の率は、8.7±8.9単位
/mlである。正常集団の99%は、濃度がCA 125 35U/mlである
。この単位は、抗原決定基CA 125を有する、糖タンパク質のある決定され
た重量に相当する(約1ナノグラム)。
使用される装置は、上から下へ下記のものを備えるであろう二図・試料を入れる
ためのオリフィス(B)を備えたプレート(F)・放射能マークされた抗CA
125マウス1gG1抗体(Pab片)を有する膜(D)
・抗マウスIgGI Fab片抗体を有する膜(C)・物質を保持しないように
5%カゼインで飽和され、かつ選択相(C)と読取りIf!(B)との分離を行
なうための、セルロースの、分厚い多孔質透過M (M)。これによって、(B
)の下に配置された計器が、(C)でトラップされた放射性抗体と接触せず、し
たがって間違ったプラスが回避できる。
・読取り相(B):(C)および(D)の反応生成物を吸収するカイロン製の膜
。すなわち放射能でマークされた抗体士探しめられている抗原の場合によって存
在する複合体を吸収する膜。この膜(B)は、放射能の読取り器または計器のセ
ンサと、緊密な接触関係に入り、(B)に来るこれらの抗原と複合された、放射
性マーク抗体の数に応じて、信号の強度を評価するのに適している。
・透明プレート(A)の方は、直径5mのオリフィスが開けられている。このオ
リフィスに、放射能計器のセンサが嵌まる。
操作方法
膜(D):脱イオン水中の、5%脱脂乳溶液中に数時間浸され、ついでPBSで
濯ぎ洗いされ、乾燥された、Durieux NlL122ベーパー製で直径1
0mmのもの。
翌日、黒い鉛筆の小さい線で、これらの膜の取り外し面(face dedep
ose)に印を付け、下記溶液5μlを置く:・インジウム111でマークされ
た抗CA−125vウス[gGI F (ab’ )2抗体:1mlあたり1マ
イクログラム
(Ref QC125、CI 5aclay )・スクロース5%
4himerosal O,01%
−NaC10,9%
・アセテート緩衝液0.1 M pH5(試料50μmは、これらの緩衝液5μ
mを0.01Mに希釈する。
強い真空下、冷乾燥、そしてその他の膜どまとまるのを待って、冷貯蔵する)
膜(C)二数時間、下記溶液中に浸された、多孔度0.45μ、厚さ100μ、
直径10m+nのPa1lナイロン製:・PBSlmlあたり1マイクログラム
まで希釈された、ヤギ抗マウス[gGI F(ab’) 5pecific (
Refシグマ6898)。ツいでPBS中B5A3%浴で1時間37℃での濯ぎ
洗いおよびブロッキング、ついで冷PBSでの最終濯ぎ洗い、そして種々の膜が
まとまるのを待って、乾燥および冷貯蔵。
膜(M):好ましいのは、厚さ0.25mmのワットマンガラス繊維である。こ
れは3時間、トリスpH6中5%のカゼイン中に浸され、ついで数回PBSで濯
ぎ洗いされたものである。これはこのように調製されて、(C)と(B)との間
の優れた隔てになる。それでも、これを通過する、場合によって存在する複合体
を、異常に保持することはない。
膜(B)ニなんの調製も行なわれていない、5chletcherおよび5ch
ullのNYTRANナイロン。これは(C)から洩れて、(M)を通過した、
場合によって存在する放射性抗体を吸収する。これは、1分あたりの回数(co
ups)を計る放射能計器と接触するのに適している(図9におけるcpm )
。
実施聾様:透明なプレート(A)のオリフィスの正面に、下記のものを順番に配
置する:
・膜(B)
・ガラス繊維のペースト(M)
・膜(C)
・膜(D)
・(D)に向かい合って、プレート(P)は、これ全体に溶接されており、オリ
フィス(llりが開けられており、ここに試料が置かれる。
(1)〜(8)の番号が付けられた8本の管を用いる。これらには、卵巣のう腫
瘍が発見された、同じ患者からの血清が入っている。これらはCA−125の推
移を示す。
・管(1):診断日
・管(2)、(3)、(4) : 5ケ月の化学療法の間・管(5):放射線治
療の終了時
・管(6):放射線治療2ケ月後
・管(7):放射線治療3ケ月後
・管(8):放射線治療6ケ月後
CA 125の8つの放射線計量装置を用い、これらに(Dl)〜(D8)の番
号を付ける。
このようにして、管(1)の50μmを装置(Dl)上へ、管(2)の50μm
を装flit (D2)上へ、管(3)の50μmを装置(D3)上へ配置する
、等々。
どの回も30秒間待ち、この装置を、放射能読取り装置のスリットに挿入する。
この読取り装置は、このために目盛り定めがされている(IUのCA 125は
、1分あたりのあるいくつかの回数に相当する)。
装置の挿入は、磁気テレフォンカードまたは銀行カードと同様に、膜(B)が計
器のセンサと緊密接触するように行なわれなければならない。
結果を記し、曲線に移し換える二図10゜管の番号 下記に対応 信号(U/n
+1)(1) 癌の発見 390
(2)3ケ月の化学療法 80
(3)4ケ月の化学療法 31
(4)5ケ月の化学療法 7
(5)4ケ月の放射線療法 2
(6)2ケ月の無治療 37
(7)3ケ月の無治療 59
(8)6ケ月の無治療:ぶり返し 495実施例6:同じ試料滴での複数の腫瘍
マーカーの半定量的計量:cA19−9 十〇A 15−3 +ACB原理ニブ
レスクリーニング:マーカーの少な(とも1つが非常に増加すると、テストはブ
ルーに変色する。したがって研究の方向を、実施例4のように個別にとられたマ
ーカーの1つの方へ向けるのがよいであろう。
この計量は、転移を早期に防ぐために、手術を受けた癌患者の検診および追跡調
査に非常に重要である。ACEIまたはCA 19−9の率は、腫瘍の手術およ
び照射後、数カ月後に正常に戻る。これに対して再発は、高度な技術の検査でさ
えも無症状で、目に見えないことがある(消化器ファイバースコープは、再発性
の微小腫瘍を突き止めることはできず、これらが大きいときには手遅れの場合が
多い。一方、結合されたマーカーの計量は、このような再発をもっと早く検診す
ることができる)。
CA 15−3は、乳癌と結び付けられ、かつ次の2つのモノクローン抗体によ
って定義される抗原であるとして、文献に記載されている: 11508 (M
ilkensら、Int、J、 Cancer (1984年)34巻=197
〜206頁)およびDP3 (Kufeら、Hybridoma (1984年
) 3:223〜232年)。
正常な被験者の血清または血漿におけるCA 15−3の濃度の率は、13.7
±5.2単位/mlである。正常集団の99.5%は、濃度がCA 15−33
0U/fi11である。
CA 19−9は、膵臓腫瘍と結び付けられた抗原決定基である。これは、LE
’lll[S A血液型の五糖類のシアリル誘導体である(ラクト−N−フコペ
ンタオース−Iり。繰り返されるこの抗原決定基は、ガングリオシドによって細
胞膜の表面に置かれるか、あるいはムチン型のタンパク質によって血清中に置か
れる。1単位は、CA 19−9抗原決定基を有するムチン型の糖タンパク質(
?)0.8ナノグラムである。
正常な被験者の血清または血漿におけるCA 19−9の濃度の率は、8.4単
位/ml±7.4単位/mlである。正常集団の99.5%は、濃度がCA 1
9−9 a37単位/mlである。
腫瘍マーカーは、大きな欠点がある。これらは、癌患者でないある人々の場合に
増加することがあり、癌患者の場合、正常な率であることもある。それに対して
、組み合わせて用いられると、これらの特殊性はよりはっきりする。
例:胃癌+ (H,J、Staab−Tubingen−ドイツ)・CA 19
−9の増加:これらのケースの76%・ACEの増加:これらのケースの59%
・Act! +CA 19−9の増加:これらのケースの94%別の例:***の
腺癌
(May−Levinら、1987年9月6〜11日、西ドイツ、ハンブルグ、
第3回国際ホルモン癌学会: [乳癌の種々の段階における比較研究」)・転移
を伴なわないもの:これらのケースの30〜50%において、CA 15−3の
増加
これらのケースの90%において、 CA 15−3およびACIIIの増加・
転移を伴なうもの:これらのケースの75%において、CA 15−3の増加
これらのケースの95%において、CA 15−3およびACEの増加検出しよ
うとしているものと同一な抗原のすべてを、(C)(選択相)に固定して(先行
特許)、抗原が飽和していない、(D)から来るマーク抗体をトラップすること
は、次のいくつかの理由で不可能である:
・(C)に固定された、GA 15−3 、CA 19−9およびAceの組み
合わせは、(B)から来るマーク抗体による、これらの抗原部位の認識にとって
存寄な、立体配置のかさぼりを引き起こす。したがってこれらは、トラップされ
ない恐れがあり、また(B)を間違ったプラスへ着色する恐れがある。
・この遺伝子は、種々の免疫グロブリンと一緒には存在しない。
その理由は、免疫グロブリンがこれらの端部(Pc)によって固定され、かつ探
しめられている抗原の方へ適切に向けられるからである(このことによって、予
め決められた抗原の量を中和するための、(CO)でのこれらの使用が可能にな
る)。
・抗原は数が少なく、かつ高価であるのに、これらの抗体はそうでない。
・これらの選択相への保持は、偶然に左右されるものである。これは、これらの
第三構造が変化する一方、一般に免疫グロブリンは、乾燥していても異常な安定
能力を有するからである。
操作方法:
支持体、膜(B) (TMB)は、実施例1と同じである。
膜(D)は、探しめられている各抗原に特有な、種々のベルオキシダーゼでマー
クされた、モノクローン抗体を支持する:・抗CA 15−3抗体DF3 (C
ie 0ris Industrie社)・抗ACE抗体(Abbott C8
A ERA Monoclonal)・抗CA 19−9抗体NS 116 (
International Cl5)・すべてはマウスから来るもので、免疫
グロブリン11iG1のカテゴリーに属する
・すべてはこれらのセグメントFab上に、ペルオキシダーゼでマークされてい
る。
・すべては、PBS 、 thimerosal O,01%およびD−グルコ
ース5%中に、1mlあたり1マイクログラムに希釈されている。
膜(C)(選択相)は、実施例4において前記された2つの免疫グロブリンの型
を支持する(ACB計量)。
・ヤギのマウスIgG1の抗Pab
・ヤギの抗ペルオキシダーゼ
この組み合わせは、はるかに効率的であるので、非常に興味深いことがわかった
。すなわち抗原(例えばマーカー)飽和していない、11(D)から来るマーク
抗体は、フリーのままのこれらのFab片によりて、および抗原によって隠され
ていない、これらが支持している酵素によって、はるかに効率的に固定される。
一方、抗原がマーク抗体と結合するとき、抗原は、酵素とFab部位を隠す。
膜(C)は、PBS中の前記2つの抗体の溶液中に2時間浸され、ついで冷PB
S中で濯ぎ洗いされ、前記のようにブロッキング飽和される(BSA 5%の浴
、ついで濯ぎ洗いおよび乾燥);光を避けて冷貯蔵。
・M (CO)は、3つのマーカーに逆らって進む非マーク抗体を含む溶液であ
って、各抗体について1mlあたり0.1マイクログラムに希釈された溶液中に
浸される。この膜は、次のものになるまでトラップする:
・30U/mlのCA 15−3
・37U/+olのCA 19−9
−19−9−7nのACB
これらのマーカーの1つの率がこれらの限度を越えるならば、マーカーの過剰量
が、膜(CO)を通過し、(D)のマーク抗体と結合し、(C)を通って、その
後に(B)を着色する。
装置の製作
透明なプレート(A)の上に、下記のものを載せる:・基質のペースト:(B)
・選択相のペースト=(C)
・混合マーク抗体のペースト:(D)
・ある量だけの3つのマーカーに逆らって進む抗体の予備選択相のペースト(C
o)。
これ全体の上に、ペーストに向かい合ってオリフィス(E)が開けられたプレー
ト(F)を置き、溶接する。このオリフィスには試料が入れられる。
実施態様
(0)〜(3)の番号が付けられた4本の管を用いる。これらは下記のものを含
む:
・管(0):正常な量の3つのマーカー;−CA15−3 : 30単位/ml
(Oris)−CA 19−9 : 37単位/ml (Int cis)・
ACB(Ref C)292ジグv) : 7ng/ml・管(1) :ACE
のみが> 7ng/mlである。
・管(2) : CA 19−9のみが〉37単位/mlである。
・管(3) : CA 15−3のみが〉30単位/mlである。
同じ滴での、3つの腫瘍マーカーの4つの半定量的計量装置を用い、これらに(
DO)〜(D3)の番号を付ける。
装置(DO)に管(0)の50μmを、装置(Dl)に管(1)の50μmを、
装置(D2)に管(2)の50μmを、装置(D3)に管(3)の50μmを入
れる。
(II (CO)のため、先行装置の30秒の代わりに)45秒間待って、装置
を逆さにする。
結果
管の番号 過剰のマーカー 信号
(0) 無 0
(1) ACB ++
(2) CA 19−9 ++
(3) CA 15−3 ++
この実施例は限定的なものではない。(CO)の非マーク抗体または(11)で
用いられるマーク抗体が少量なので(各々5ナノグラム)、いくつかのマーカー
に特有のいくつかの型の抗体を組み合わせることが可能であることがわかった。
このことによって、最も普及した癌のマーカーを用いるならば、普遍的テスト、
従って集団検診に到達できる。
マーカーの抗体を互いに組み合わせるだけでなく、いくつかの成長因子の抗体と
、またマーカーの抗体と成長因子の抗体、あるし)はレセプタの抗体とを組み合
わせること、あるいは結局は、次の3つの要素:
マーカーの抗体+成長因子またはこれらの成長因子のレセプタの抗体
の組み合わせも可能であることがわかった。
装置の実施例:
(1)−消化器癌
EGF (表皮成長因子) +TGF (変形成長因子)+ (ACE +AF
P +CA 19−9のマーカー)
試料滴中のこれらのマーカーの1つが過剰だと、(B)で着色を引き起こし、消
化器へ、よりターゲットを定めた検査の方へ方向付けられるはずである。
(2)−乳癌
EGP−R(BCFのレセプタ)+PR(プロゲステロンのレセプタ)+〇R(
エストロゲンレセプタ) +CA 15−3 +ACBホルモンレセプタの率の
増加は、悪い徴候である。
(3) 置による新規治療プロトコルの追跡調査(1!瘍浸潤リンパ細胞)イン
ターロイキン−2が添加されたもの:最良のレスポンスは、次のものの上昇であ
る:
IL−1(インターロイキン1) +TNP (ll!瘍壊死因子)この実施例
で、有利なのは、半定量的プラス信号である(ある閾値以上の[L−1とTNF
)。
同様に、病的であるのは、あるいくつかのリガンドの不足であるようなすべての
半定量的軽量において:・ビタミン複合体
・等々
これらの実施例すべてについて用いられた装置は、この方法の様々の膜を締め付
けている図という様相で示されているが、これらの連続した膜は、他の構造、例
えばELISAプレートの井戸の底部に挿入されてもかまわず、あるいはこの連
続した膜は、水平に形成されてもよい。すなわち試料の流体の移動は、もはや上
から下へではなく、例えば細い帯の1端からもう1つの端へと行なわれてもよい
。
これらの計量例すべて、および一般的にはこの同じテストにおける計量の組み合
わせは、本発明の対象となっている方法によってもたらされる便宜を例示するい
くつかの例でしかない。組み合わせは無限であろうし、実際、将来の様々な装置
は、初期の悪性の病気の定期的な集団検診のためのプレスクリーニングの必要性
を反映するものでしかないであろう。
最後に、CP(r凝結促進性癌J 、5tuart G、Gordan 、 B
arbara A。
CrossSCancer Re5earch 550 、6229−6234
頁、1990年10月1日)と呼ばれる癌の°LA”タンパク質を標識で示す必
要がある。これは癌細胞によって示されるが、正常な細胞によっては決して示さ
れないシスティン・プロテイナーゼ(多くの癌の初めに見られる異常な凝集に含
まれるもの)である。このことは、これに非常に高い(90%)特殊性を与える
が、一方、AC8の特殊性は、これが多数の正常な細胞によって分泌されるので
低い(50%)(喫煙被験者、妊婦等)。
これによって、癌の80%、特にあまり進行していない癌を検診することができ
よう。これは言わば、初期状態に特有なタンパク質であろう。したがってこれは
、本発明の対象の方法の非常に良好な感受性と、完全に対応しているであろう。
Fλgur巳 1
゛パ口
基質のスホ0−ノド
ニー c
Figurs 3
マー2#廓−1葎
該A4在 j 坊洗不在
Figpra 4
* =、&坊拌 マー7抗沸
坑lI稍6 1 坑4柿
F、igur1!! 5
Figurs 6
Figure 7
Figure 9
0A 125
国際調査報告
国際調査報告
国際調査報告
国際調査−報告
^NNEXEAURAPPORTDERECHERCHEINTERNATIO
NALERELATIFALADEMANDEINTERNにn0NALE N
O,FR9100891
Claims (8)
- (1)流体中におけるリガンドの存在の迅速な定性的および定量的測定方法にお いて、探し求められているリガンドと何の関連もない、この装置の帯域内に固定 化されている反応体は、この装置のもう1つの帯域から来るマーク抗体が、探し 求められているリガンド飽和しているか、あるいは飽和していないかを認識でき ること、すなわち、このマーク抗体が、探し求められているあらゆるリガンドを 含んでいないならば、この抗体は、固定化反応体によってトラップされ、この装 置の第三帯域においてその信号を発しえず、一方このマーク抗体が、探し求めら れているリガンド飽和しているならば、これは固定化反応体によってトラップさ れず、第三帯域においてその信号を発し、したがって、探し求められているリガ ンドとは無関係であるという理由から、「普遍的」と呼ばれる選択相に到達し、 同じ固体化反応体が、探し求められているリガンドが何であれ、すべてのマーク 抗体を認識するのに役立ちうることを特徴とする方法。
- (2)定性的計量方法の第一工程のあいだ、第一帯域において、流体の試料と、 マーク反応体(特に例えば抗体または抗原)とを接触させて、リガンドー反応体 反応が生じうるようにし、その後、第二反応のあいだ、第二反応帯域において、 反応の場合によって生じる生成物と、非マーク反応体とを接触させ、この非マー ク反応体は、探し求められているリガンドが何であれ同じであり、これが探し求 められているリガンドと複合されていないならば、マーク反応体をトラップする のに適しているか、あるいはこのマーク反応体が探し求められているリガンドと 複合されているならば、これをトラップしないのに適しており、この後、第一ま たは第二反応の生成物が、試料中の探し求められているリガンドの存在または不 存在の暴露手段との第三反応のあいだ、第三帯域において接触関係に入ることを 特徴とする、請求項1による方法。
- (3)定量的計量方法の第一工程のあいだ、第一帯域において、流体の試料と、 放射性アイソトープによってマークされた第一反応体(特に例えば抗体または抗 原)とを接触させて、マーク反応体ーリガンドの反応が生じうるようにし、その 後、第二帯域において、この第一反応の場合によって生じる生成物と、非マーク 反応体とを接触させ、この非マーク反応体は、このマーク反応体がそのリガンド と複合されていないならば、マーク反応体をトラップすることができ、このマー ク反応体がそのリガンドと複合されているならば、このマーク反応体をトラップ しないことが可能で、その後、第三帯域において、この第二反応の場合によって 生じる生成物と、放射性計数手段とを接触させ、この手段は、この特許請求の範 囲(1)の対象である選択的な膜を、そのリガンドとともに通過した、放射性マ ーク反応体の正確な定量的評価を与えるのに適しており、放射性計数手段はまた 、2つの第一帯域のレベルで、トラップされた放射能を評価して、これと、第三 帯域のレベルで他のセンサによって検出された放射能とを比較することができ、 このようにして、試料中のリガンドの正確な計数および正確な評価に到ることを 特徴とする、請求項1による方法。
- (4)第一反応帯域が、いくつかのマーク反応体を含み、反応体の各々は、テス トされる試料中に場合によって存在する、まさにそのリガンドに特有なものであ り、もしマーク反応体の少なくとも1つが、試料中においてそのリガンドを検出 するならば、マーク反応体+リガンドの検出された複合体は、第二反応帯域にお いて、この第二帯域で固定化された非マーク反応体によってトラップされず、こ の帯域を通過して、第三反応帯域において暴露手段と接触し、一方、探し求めら れているリガンドが試料中にまったく存在しないならば、マーク反応体のすべて は、第二反応帯域において、非マーク反応体によってトラップされるであろうし 、どんな信号も第三反応帯域によって発せられないであろうし、このようにして 、ただ1回の操作で、同じ試料滴を用いて、複数のリガンドのうちの少なくとも 1つの検出に到ることを特徴とする、請求項1による方法。
- (5)流体中の反応性リガンドの存在の迅速な定性的および定量的測定のための 装置において、有利には2つのプレートの間に囲まれた多孔質帯域の積み重ねを 備え、これらのプレートの上部は、そこに試料滴を置くためのオリフィスが開け られており、一方下部プレートは、比色定量信号に関するときには結果を読み取 るために孔が開けられているか、あるいは透明であることを特徴とする装置。
- (6)半定量的計量装置は、第一反応帯域の上に、探し求められているリガンド に特有な非マーク反応体を含む帯域を備え、この帯域は、試料中において正常と みなされている閾値に相当する、ある量だけのリガンドをトラップするためのも のであり、過剰量のリガンドが存在するならば、これは、請求項1に記載された 方法にしたがって、かつ請求項5に記載された装置において、第一帯域のマーク 反応体と結合し、その後に、マーク反応体+過剰リガンド複合体が、第三反応帯 域の暴露手段と接触させられる前にトラップされずに、非マーク反応体を含む第 二帯域を通過することを特徴とする、請求項5による装置。
- (7)流体中の反応性リガンドの存在の迅速な定量的測定装置において、 ・壁に固定化されて、1つまたは複数の反応体(特に、探し求められている1つ または復数のリガンドに特有な、1つまたは複数の種々の抗体)を有するELI SA96プレート井戸型の支持体であって、反応体は、これらの固定化反応体が 、試料中において探し求められているこれらのリガンドと複合化されていないな らば、マーク反応体(特に、固定化非マーク抗体のFab部位と結合しているマ ーク免疫グロブリン)を認識し、かつ固定することができ、前記マーク反応体は 、固定化反応体が、これらのリガンドと複合化されていないならば、もはや認識 せず、固定化反応体に固定されないもの、プレート上に熱溶接された保護薄膜、 を備えることを特徴とする装置。
- (8)流体中における、反応性リガンド、例えば抗原の存在の迅速な定量的測定 方法であって、試料の流体を、この方法の第一工程のあいだ、請求項9に記載さ れたプレートの井戸の1つの中に置いて、今度は井戸の壁上に固定化され、かつ 適切に配向された、探し求められている抗原に特有な抗体と、試料中に場合によ っては存在する抗原とを接触させ、この後、この方法の第二工程のあいだに井戸 を濯ぎ洗いし、この後、マーク反応体の溶液(特に、固定化非マーク抗体のFa b部位に特有なマーク免疫グロブリン)が、第三工程のあいだ井戸内に置かれ、 その後井戸を再び濯ぎ洗いして、固定化抗体と結合していないマーク反応体を除 去し、その後、暴露手段が井戸の壁上に固定化された非マーク抗体(その抗原と 複合されていないもの)と結合したマーク反応体の量を測定するようになり、暴 露手段は、マーキングが放射性であれば、放射能計器であり、マーキングが酵素 的であれば、クロモゲン溶液であり、このようにして、率が、逆に信号の強度に 比例するようになる、抗原の定量的測定に至り、このようにして、ノイズ(br uit de fond)の問題が除かれることを特徴とする方法。
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