JPH07501712A - Single-stage RNA and combined single-stage RNA and DNA polymerase chain reactions for detection of trace amounts of RNA or RNA and DNA - Google Patents

Single-stage RNA and combined single-stage RNA and DNA polymerase chain reactions for detection of trace amounts of RNA or RNA and DNA

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JPH07501712A
JPH07501712A JP6509262A JP50926294A JPH07501712A JP H07501712 A JPH07501712 A JP H07501712A JP 6509262 A JP6509262 A JP 6509262A JP 50926294 A JP50926294 A JP 50926294A JP H07501712 A JPH07501712 A JP H07501712A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 微量ＲＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡ検出用の一段ＲＮＡおよび結合一段ＲＮＡ およびＤＮＡポリメラーゼ・チェイン・リアクンヨン背景 ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）はＤＮＡの増幅のためによく 使用される技術である。この技術は、細菌またはＤＮＡウィルスに起因する疾病 に伴うような、特定のＤＮＡ配列の検出用の種々の検定に使用されている。さ　 ′らに、ＲＮＡからＤＮＡの逆転写と組み合わせて、ＰＣＲはＲＮＡの検出にも 使用できる。ＰＣＲの感度から、特に、微量ＲＮＡまたはＤＮＡの検出に適して いる。[Detailed description of the invention] Single-stage RNA and combined single-stage RNA for trace RNA or RNA and DNA detection and DNA polymerase chain reaction background Polymerase chain reaction (PCR) is commonly used to amplify DNA. The technology used. This technology is used to treat diseases caused by bacteria or DNA viruses. It has been used in a variety of assays for the detection of specific DNA sequences, such as those associated with difference Furthermore, in combination with reverse transcription of DNA from RNA, PCR can also be used to detect RNA. Can be used. Due to the sensitivity of PCR, it is particularly suitable for detecting trace amounts of RNA or DNA. There is.

ノンＡ１ノンＢ肝炎の主要因子として認識されている肝炎Ｃウィルス（ＨＣＶ） （Ｃｈｏｏ、　Ｑ、　−Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　；　Ａｌｔｅｒ、　！（、Ｊ、　 ｅｔ　ａｌ、）はヒト・フラビウイルスおよび動物ペスチウイルスに関連するプ ラス鎖ＲＮＡウィルスである（Ｃｈｏｏ、　Ｑ、　−Ｌ。Hepatitis C virus (HCV) is recognized as a major factor in non-A1 non-B hepatitis. (Choo, Q, -L, et al,; Alter,!(, J, et al.) have identified proteins related to human flaviviruses and animal pestiviruses. It is a last-strand RNA virus (Choo, Q, -L).

ｅｔ　ａｌ、　：　Ｈａｕｇｈｔａｎ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　）　。ＨＣＶ　 ＲＮＡゲノムは約１０，０００ヌクレオチド（ｎｔ）の長さであり、個々の構造 および非構造蛋白質の３．１００アミノ酸前駆体をコードできる単一のオーブン ・リーディング・フレームを含む。et al, : Houghtan, M, et al, ). HCV RNA genomes are approximately 10,000 nucleotides (nt) long, with individual structures and a single oven capable of encoding 3.100 amino acid precursors of nonstructural proteins. ・Includes reading frame.

約３２４〜３４１ｎｔの５′非翻訳領域（５’ＵＴＲ）は、異なるＨＣＶ株の間 で高度に保存され、診断的ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲおよびＨＣＶ　ＲＮＡハイブ リダイゼーションの両方に有利である（）ｌｏｕｇｈｔｏｎ、　Ｍ、　ｅｔ　ａ ｌ、　；Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅｔ　ａｌ。The 5' untranslated region (5'UTR) of approximately 324-341 nt is unique between different HCV strains. Highly conserved and diagnostic HCV RNA PCR and HCV RNA hive ()lowton, M, et a l, ; Hu, K, -Q, et al.

（１９９１）　：Ｂｕｋｈ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、；Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅ ｔ　ａｌ、　（１９９２）　）。(1991): Bukh, J, et al; Hu, K, -Q, e tal, (1992)).

循環抗ＨＣＶ抗体の検出まｆ：はＨｃＶ　ＲＮＡ（７）ＰＣＲ増！１ＭｆｆＨｃ Ｖ　ＲＮＡＰＣＲＪ）は現在、ＨＣＶ感染の診断に使用されている２つの主な技 術である。Detection of circulating anti-HCV antibodies: Increased HcV RNA (7) PCR! 1MffHc V RNA PCRJ) are currently the two main techniques used to diagnose HCV infection. It is a technique.

逆転写ＰＣＲによるＨＣＶ　ＲＮＡの検出は抗ＨＣＶテストよりも、より直接的 であり、感度が良いので、急性および慢性ＨＣＶ感染両方の診断スタンダードと なってきた（Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）　；Ｂｕｋｈ 、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　；）Ｉｏｕｇｈｔｏｎ、　Ｍ。Detection of HCV RNA by reverse transcription PCR is more direct than anti-HCV testing. and has good sensitivity, making it the diagnostic standard for both acute and chronic HCV infection. (Hu, K, -Q, et al. (1991); Bukh , J, et al;) Ioughton, M.

ｅｔａｌ、）。ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲは感度が良く、特異的な技術であるが、 その労働密度、反応時間、汚染可能性および、技術および教科書の差異による試 験室間の本質的に異なる結果により、十分な臨床的適用が妨げられてきた。逆転 写（ＲＴ）のための別々の工程、それに続＜ＰＣＲ試薬の添加が労働密度および 汚染可能性の両方に関与している。したがって、ＲＴおよびＰＣＲ増幅の両方を 一段（１工程）で行える技術を持つことが有利である。etal, ). HCV RNA PCR is a sensitive and specific technique, but testing due to labor density, reaction times, contamination potential, and differences in techniques and textbooks. Substantial disparate results between laboratories have prevented adequate clinical application. Reversal Separate steps for transcription (RT), followed by addition of PCR reagents to reduce labor density and Contamination potential is involved in both. Therefore, both RT and PCR amplification It would be advantageous to have a technique that can be performed in one step.

一段ＰＣＲ検定は、細菌リポソームＲＮＡのような豊富なＲＮＡについては成功 裏に実施されている。（ｆａｎｇ、　Ｒ，−Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、）　ｏしがし 、微量ＲＮＡにツいての一段ＲＮＡ　ＰＣＲ検定に対して、先行技術は、重大な 障害を記載している。One-step PCR assays are successful for abundant RNAs such as bacterial liposomal RNA. It is carried out behind the scenes. (fang, R, -F,, et al,) o Shigashi , for one-step RNA PCR assays for trace amounts of RNA, the prior art Describes the failure.

５ｅｌｌｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、はＲＴアーゼがＴａｑポリメラーゼを激しく阻害 することを報告している。ＨＣＶはしばしば、非常に低いコピー数で存在するた め、ＰＣＲ前に、いずれかのＨＣＶ　ＲＮＡがＤＮＡ形にコピーされることを保 証するために大量のＲＴアーゼが必要である。がくして、先行技術は、ＨＣＶＲ ＮＡのような微量ＲＮＡの検出用に、一段検定が非常に正確ではないと教示して いる。5ellner et al. showed that RTase severely inhibits Taq polymerase. It is reported that HCV often exists in very low copy numbers To ensure that any HCV RNA is copied into DNA form before PCR, A large amount of RTase is required to demonstrate this. Finally, the prior art is HCVR teaches that one-stage assays are not very accurate for detection of trace amounts of RNA such as NA. There is.

肝炎Ｂウィルス（ｒＨＢＶＪ　）感染は、急性および慢性肝炎を起こす世界的な ヒトの健康問題であり、肝細胞癌の進行に伴う。ＨＢＶ感染の臨床的診断は循環 ＨＢＶ抗原、ＨＢＶウィルス・ペプチドに対する抗体の検出に基づいてきた。最 近、分子ハイブリダイゼーションにょるＨＢＶ　ＤＮＡの検出および定量が熱心 に検討されている。（Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ　Ｊ、　Ｈｌｅｔａｌ、）、ＨＢＶ　 ＤＮＡ　ＰＣＲは、たとえ痕跡量のＨＢＶ　ＤＮＡでも、その検出に最も感度の 良好な技術であることが示されている。（Ｍｏｎｊａｒｄｉｏｎ　Ｊ、　ｅｔ　 ａｌ、およびＫａｎｅｋｏ　Ｓ、ｅｔ　ａｌ、　）、しかし、ＨＣＶ　ＲＮＡ　 ＰＣＲと同様、労働密度、汚染の危険性および分析に要する時間がその臨床的適 用を妨げている。Hepatitis B virus (rHBVJ) infection is a worldwide cause of acute and chronic hepatitis. It is a human health problem and is associated with the progression of hepatocellular carcinoma. Clinical diagnosis of HBV infection is cyclical It has been based on the detection of antibodies against HBV antigens, HBV viral peptides. most Detection and quantification of HBV DNA using molecular hybridization has recently become a hot topic. is being considered. (Hoofnagle J, Hletal,), HBV DNA PCR is the most sensitive method for detecting even trace amounts of HBV DNA. It has been shown to be a good technique. (Monjardion J, etc. al, and Kaneko S, et al, ), but HCV RNA As with PCR, the labor density, risk of contamination, and time required for analysis are critical to its clinical suitability. impeding use.

Ｍｏｏｎ、　１．　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、はＨＢＶおよびＨＣＶ感染の同時検出法 を開示している。Moon, 1. G, et al. is a method for simultaneous detection of HBV and HCV infection. is disclosed.

しかし、このＭｏｏｎ　ｅｔ　ａｌ、の開示した方法は試料からのＤＮＡおよび ＲＮＡの抽出方法において相違する。また、Ｍｏｏｎ　ｅｔ　ａｌ、は、抽出し たＤＮＡおよびＲＮＡを逆転写に付し、ついで、ＰＣＲ増幅および、ＨＣＶに特 異的なネスト状（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーの第２対を添加後に、第２のＰＣＲ に付すべきであることを特に教示している。However, the method disclosed by Moon et al. They differ in the RNA extraction method. Also, Moon et al. The obtained DNA and RNA were subjected to reverse transcription, followed by PCR amplification and HCV-specific After adding a second pair of different nested primers, a second PCR It specifically teaches that the

これらの欠点を克服するため、ＨＣＶ　ＲＮＡおよびＨＢＶ　ＤＮＡの同時検出 ようの結合一段ＰＣＲを持つことが有利である。To overcome these drawbacks, simultaneous detection of HCV RNA and HBV DNA It would be advantageous to have such a combined one-stage PCR.

発明の概要 本発明は、血清または組織中のＨＣＶ　ＲＮＡのような微量ＲＮＡ検出用の一段 ＲＮＡ　ＰＣＲ法および、血清または組織中のＨＣＶ　ＲＮＡのような微量ＲＮ ＡおよびＨＢＶ　ＤＮＡの同時検出用の結合一段ＨｃＶ　ＲＮＡ　ＰｃＲおよび ＨＢＶ　ＤＮＡ　ＰＣＲ法（ｒ結合−４ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲＪ）を提供する ものである。これらの技術は、両方とも感度良好で、特異的であり、従来の方法 を本質的に単純化し、検出に要する時間を減じ、汚染の危険性を減じる。これら の技術は、ＨＣＶゲノムの高度に保存された５°ＵＴＲからのプライマーを用い るＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲのような微量ＲＮＡの検出の従来の方法およびＨＢＶ 　ＤＮＡおよびＨＣＶ　ＲＮＡの検出に従前必要とされていた別々の工程に対す る改良である。これらの技術は、ウィルスＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＨＣＶ　 ＲＮＡまたはＨＢＶ　ＤＮＡのみならず、いずれの源からのＲＮＡおよびＤＮＡ の検出にも好適である。Summary of the invention The present invention provides a single stage for detection of trace RNA such as HCV RNA in serum or tissues. RNA PCR method and trace amounts of RNA such as HCV RNA in serum or tissues Combined single-stage HcV RNA PcR and Provides HBV DNA PCR method (r-linked-4HBV-HCV PCRJ) It is something. Both of these techniques are sensitive, specific, and superior to traditional methods. essentially simplifying the process, reducing the time required for detection and reducing the risk of contamination. these The technique uses primers from the highly conserved 5°UTR of the HCV genome. Conventional methods of detecting trace amounts of RNA such as HCV RNA PCR and HBV Compared to the separate steps previously required for the detection of DNA and HCV RNA This is an improvement. These techniques can be used to detect viral RNA or DNA or HCV RNA or HBV DNA as well as RNA and DNA from any source It is also suitable for detection.

この−投法は高度に特異的な方法である。この−投法の特異性は、陽性および陰 性対照を含む、５０血清試料における従来のＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲと１００％ 一致することにより確認された。This method is highly specific. The specificity of this dosage is that it is positive and negative. 100% with conventional HCV RNA PCR in 50 serum samples, including sex controls Confirmed by matching.

この−投法は、分析に要する時間を実質的に減じる。この−投法は、従来の２工 程ＲＴアーゼ、プラスＰＣＲ操作よりも、少なくとも３倍速い。This method substantially reduces the time required for analysis. This method is similar to the conventional two-way method. It is at least 3 times faster than RTase, plus the PCR procedure.

ＨＣＶ感染肝から抽出された系列希釈された肝ＲＮＡの検出感度は従来のＨＣＶ 　ＲＮＡ　ＰＣＲに匹敵する。さらに、この−投法は、ＨＣＶ検出用の従来のＰ ＣＲ法よりも感度が良好である。プラス鎖およびマイナス鎖の両方のＨＣＶ　Ｒ ＮＡを含有する血清試料において、該−投法は一貫して従来のＰＣＲよりも強い ＰＣＲ生成物シグナルを生じた。これらの結果は両方の鎖が、この−投法で逆転 写されたことを示した。The detection sensitivity of serially diluted liver RNA extracted from HCV-infected liver was higher than that of conventional HCV Comparable to RNA PCR. Furthermore, this method is similar to conventional P for HCV detection. It has better sensitivity than the CR method. Both positive and negative strand HCV R In serum samples containing NA, the method is consistently more powerful than conventional PCR. A PCR product signal was generated. These results indicate that both strands are reversed with this -casting method. It showed that it was photographed.

結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法は高度に特異的な方法である。結合一段ＨＢ Ｖ−ＨＣＶ　ＰＣＲ方法の特異性は、２８血清試料における従来のＨＢＶＤＮＡ 　ＰＣＲおよＵＨＣＶ　ＤＮＡ’　ＰＣＲと１００％一致す６．：：とにより確 認された。（以降の実施例１５の表参照）。加えて、結合ＨＢＶおよびＨＣＶ感 染患者の血清において、期待した４５６ｂｐＨＢＶ　ＤＮＡおよび２４１ＨｃＶ ｃＤＮＡバンドが同定された。また、正常ヒト血清では全くバンドが同定されな かった。最後に、サザーン・プロットで、該バンドのＨＢＶまたはＨＣＶ特異性 を確認した。The combined one-step HBV-HCV PCR method is a highly specific method. Combined single-stage HB The specificity of the V-HCV PCR method shows that conventional HBV DNA in 28 serum samples PCR and UHCV DNA’ 100% match with PCR6. ::More certain It has been certified. (See the table in Example 15 below). In addition, combined HBV and HCV sensitivity In the serum of infected patients, the expected 456bpHBV DNA and 241HcV A cDNA band was identified. In addition, no bands were identified in normal human serum. won. Finally, a Southern plot shows the HBV or HCV specificity of the band. It was confirmed.

結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法は、また、試料の分析に要する時間を実質的 ニ減シ、ＨＢＶ　ＤＮＡ検出用＋７）結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法の感度 は、広く使用されているＨＢＶ　ＤＮＡスロット・ハイブリダイゼーション診断 技術より高い。これは、ＨＢＶ陽性血清における結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣ Ｒ法とＨＢＶ　ＤＮＡスロット・ハイブリダイゼーションの間の１００％一致に より証明された。しかし、ＨＢＶ　ＤＮＡスロット・ハイブリダイゼーション検 定陰性の１２名の患者において、３名の患者が、結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣ Ｒ法においてＨＢＶ　ＤＮＡ陽性であった。The combined one-step HBV-HCV PCR method also substantially reduces the time required for sample analysis. For HBV DNA detection +7) Sensitivity of combined one-stage HBV-HCV PCR method is a widely used HBV DNA slot hybridization diagnosis. Higher than technology. This is a combination of one-step HBV-HCV PC in HBV-positive serum. 100% concordance between R method and HBV DNA slot hybridization more proven. However, HBV DNA slot hybridization test Among the 12 patients with definite negative results, 3 patients had a combined single-stage HBV-HCV PC. HBV DNA was positive by R method.

汚染の危険性の実質的な減少は、これらの方法を複数の臨床試料のテスト用に適 したものとする。試薬をたった１回しが添加しない故、反応に不純物が混入する 機会が少ない。Substantial reduction in the risk of contamination makes these methods applicable for testing multiple clinical samples. It shall be assumed that Since reagents are not added only once, impurities are mixed into the reaction. There are few opportunities.

本発明は、工程の多くが自動化できる故に、従来利用されていた方法よりもより 均一な結果を与える。The present invention is more efficient than previously used methods because many of the steps can be automated. Gives uniform results.

図面の簡単な説明 図１は、一段ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲでのＲＴＮアーゼ縮効果を示す。２．５Ｕ 　Ｔａｑポリメラーゼおよび５．１０．２５．５０および１００Ｕ　ＲＴ７−ゼ の反応から、各々、２４１ｂｐＨＣＶ　ｃＤＮＡ生成物（ライン１および１゜か ら５および５°）を得た。ＭＷ（分子量）：１２３ｂｐラダー（ｌａｄｄｅｒ） 　Ｄ　Ｎ　Ａマーカー。Brief description of the drawing Figure 1 shows the RTNase reduction effect in one-step HCV RNA PCR. 2.5U Taq polymerase and 5.10.25.50 and 100U RT7-ase 241 bp HCV cDNA products (lines 1 and 1° or 5 and 5°) were obtained. MW (molecular weight): 123bp ladder D N A marker.

図２は、系列希釈され、従来法（Ａ）および一段ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲ法（Ｂ ）の両方でテストしたＨＣＶ陽性陽性血清１ハｌ抽出したＲＮＡを示す。ＭＷ： １２３ｂｐ　ラ’ｊ−ＤＮＡ？−カー。ライン１〜５は、各々、１ｏ−１，１０ −２，１０−３，１０−４および１０−５希釈した検体についてのＨｃｖ　Ｐｃ ＲのｃＤＮＡ（２４１ｂｐ）生成物を含有するアガロース・ゲルを示す。Figure 2 shows serially diluted, conventional (A) and one-step HCV RNA PCR methods (B). ) shows the RNA extracted from one volume of HCV-positive serum tested in both cases. MW: 123bp La’j-DNA? -Car. Lines 1 to 5 are 1o-1, 10, respectively. Hcv Pc for -2, 10-3, 10-4 and 10-5 diluted samples An agarose gel containing the R cDNA (241 bp) product is shown.

図３は、結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法、一段ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲ法お よび従来のＨＢｖ　ＤＮＡ　ＰＣＲの結果を示す。ライン１および２ニ一段ＨＣ ｖ　ＲＮＡ　ＰＣＲ；ライン３および４：従来（１’）ＨＢＶ　ＤＮＡ　ＰＣＲ 。Figure 3 shows the combined one-step HBV-HCV PCR method, one-step HCV RNA PCR method, and and conventional HBv DNA PCR results are shown. Lines 1 and 2 single stage HC v RNA PCR; Lines 3 and 4: Conventional (1’) HBV DNA PCR .

ライン５および６：結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ；５イン７：陰性対照。Ｍ Ｗ：　１２３ｂｐラダーＤＮＡマーカー。ＨＢＶ　ＤＮＡ　ＰＣＲ生成物＝４５ ６ｂｐおよびＨＣＶ　ｃＤＮＡ　ＰＣＲ生成物＝２４１ｂｐ、パネルＡは電気泳 動ＰＣＲ生成物の臭化エチジウム染色アガロース・ゲルである。パネルＢはＨＢ ＶＤＮＡに特異的なプローブを用いたサザーン・プロット・ハイブリダイゼーシ ョンである。パネルＣはＨＣＶ　ｃＤＮＡに特異的なプローブを用いたサザーン ・プロット・ハイブリダイゼーションである。Lines 5 and 6: Combined one-step HBV-HCV PCR; 5 in 7: Negative control. M W: 123bp ladder DNA marker. HBV DNA PCR product = 45 6bp and HCV cDNA PCR product = 241bp, panel A is electrophoresis Ethidium bromide stained agarose gel of dynamic PCR products. Panel B is HB Southern plot hybridization using VDNA-specific probes It is a version. Panel C is a Southern method using a probe specific to HCV cDNA. - Plot hybridization.

発明の詳細な説明 本発明は、ＲＴＮアーゼよびＰＣＲ反応を結合させた一段操作を用いて試料中の 微量ＲＮＡを迅速に、正確に、感度良く検出する方法および手段を提供するもの である。微量ＲＮＡ検定に付される試料は、標準的な緩衝剤塩溶液中でＲＮＡを ＤＮＡに変換するＲＴＮアーゼよびＰＣＲを行う熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの 両方、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）　、所望により、微量ＲＮＡ の分解を防ぐためのＲＮアーゼ阻害剤、およびＰＣＲ反応用の適当なプライマー と一緒にされる。反応は逐次進行する。一段反応の性質から、第１の反応を停止 し、ＤＮＡを除去し、緩衝条件を変え、新らたな酵素を添加する必要性が除かれ る。これら除かれた各工程は時間を必要とし、試料汚染の機会を導く。Detailed description of the invention The present invention uses a one-step procedure that combines RTNase and PCR reactions to Provides a method and means for rapidly, accurately, and sensitively detecting trace amounts of RNA It is. Samples subjected to trace RNA assays are prepared by arranging RNA in standard buffer salt solutions. RTNase, which converts to DNA, and thermostable DNA polymerase, which performs PCR. Both, deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), optionally trace RNA RNase inhibitors to prevent degradation of , and suitable primers for PCR reactions. be combined with The reaction proceeds sequentially. Due to the nature of the one-step reaction, the first reaction is stopped. eliminates the need to remove DNA, change buffer conditions, and add new enzymes. Ru. Each of these eliminated steps requires time and introduces opportunities for sample contamination.

さらに、全ての成分を一旦試料に添加したら自動化できる。従来ＰＣＲに使用さ れているようなサーマル・サイクラ−（ｔｈｅｒｌＩｌａｌ　ｃｙｃｌｅｒ）の ような制御された温度ブロックを採用して、試料を、まず、３７〜４２℃のよう なＲＴＮアーゼ適当な温度でインキュベートし、ついで、９４℃、３分間のよう な、ＲＴＮアーゼ変性させるに十分な温度および時間インキュベートすることが できる。これに続き・温度ブロックをＰＣＲにとって標準的な温度で循環させる 。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号参照。Additionally, it can be automated once all components are added to the sample. Conventionally used for PCR Thermal cycler (therlIlal cycler) By employing a controlled temperature block such as RTNase incubate at appropriate temperature, then incubate at 94°C for 3 min. be incubated at a temperature and time sufficient to allow RTNase denaturation. can. Following this, cycle the temperature block at a standard temperature for PCR. . See, eg, US Pat. No. 4,683,195.

結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法は上記のＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲの利点と共 に、ＨＣＶ　ＲＮＡおよびＨＢＶ　ＤＮＡ検出の両方が同時に行え、ＨＢＶおよ びＨＣＶのより効率的なスクーニングをもたらす利点も包含する。The combined one-step HBV-HCV PCR method has the same advantages as the HCV RNA PCR described above. In addition, both HCV RNA and HBV DNA detection can be performed simultaneously, and HBV and HBV DNA detection can be performed simultaneously. It also encompasses the benefits of providing more efficient screening of HCV and HCV.

試料の調製 一段ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲ法において、検定すべき試料は、まず、グアニジウ ム・イソシアネート抽出（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｔ、　；Ｃｈｏ ｍｃｚｙｎｓｋｉ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、　）のような標準的な技術のいずれ かによって、ＲＮＡを抽出することにより調製される。結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ 　ＰＣＲ法についての必要条件はＤＮＡおよびＲＮＡの両方を、それらの血清試 料中における相対量を反映する量で効率よく抽出することである。この抽出技術 はその源に関係なく、いずれのＲＮＡまたはＤＮＡ種に対しても実施できる。グ アニジウム・イソシアネートまたはブロティナーゼに法のような、ＤＮアーゼお よびＲＮアーゼを包含する蛋白質を分解または失活させる方法は、結合一段ＨＢ Ｖ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法での使用に適している。Sample preparation In the one-stage HCV RNA PCR method, the sample to be assayed is Mu isocyanate extraction (Sambrook, J. et at; Cho Any of the standard techniques such as Mczynski, P., et al. Depending on the case, it is prepared by extracting RNA. Combined single-stage HBV-HCV The requirements for the PCR method are to use both DNA and RNA in their serum samples. The aim is to extract efficiently in an amount that reflects the relative amount in the food. This extraction technique can be performed on any RNA or DNA species, regardless of its source. Group DNase or brotinase, such as anidium isocyanate or brotinase. A method for degrading or inactivating proteins including RNase and Suitable for use in V-HCV PCR method.

血清試料中のＲＮＡおよびＤＮＡの両方の同時抽出のため、反復フェノール抽出 法が開発された。血清１５０μｌをプロティナーゼＫ　（１０ｍｇ／ｍ１）１０ 〜１５μｍで５０℃にて２時間消化する。フェノール／クロロホルム抽出を、ま ず、酸性雰囲気下（ｐＨ４，０）で行い、ＲＮＡを単離し、フェノール相のｐＨ をｐＨ８，０に調整後、繰り返してＤＮＡを単離する。この酸性度および塩基性 度は３．０〜５．０および７．１〜９．０の範囲で変動できる。別法として、フ ェノール／クロロホルム抽出を、塩基性ｐＨで行ってＤＮＡを抽出し、ついで、 ｐＨを酸性雰囲気に調整し、ＲＮＡを抽出することにより行うこともできる。Repeated phenol extraction for simultaneous extraction of both RNA and DNA in serum samples A law was developed. Proteinase K (10mg/ml) 10 Digest at ~15 μm for 2 hours at 50°C. Phenol/chloroform extraction First, RNA was isolated under an acidic atmosphere (pH 4,0), and the pH of the phenol phase was adjusted. After adjusting the pH to 8.0, DNA is isolated repeatedly. This acidity and basicity The degree can vary from 3.0 to 5.0 and from 7.1 to 9.0. Alternatively, the file An phenol/chloroform extraction was performed at basic pH to extract the DNA, followed by It can also be carried out by adjusting the pH to an acidic atmosphere and extracting RNA.

ｐＨの調整は、当業者に公知のごとく、例えば、トリス−ＥＤＴＡのような、Ｄ ＮＡおよびＲＮＡ抽出に適当な、適正なｐＨの緩衝液の添加により行われる。Adjustment of the pH can be carried out using, for example, D This is done by adding a buffer of appropriate pH suitable for NA and RNA extraction.

両方の抽出物をプールし、酵母ｔＲＮＡ１０μｇを加え、該核酸をイソプロパツ ールで共沈させる。抽出した核酸のベレットを水で処理したジエチルポリカーボ ネート（ＤＥＰＣ）１０μｍに再懸濁させ、使用前、−７０℃で保存する。Both extracts were pooled, 10 μg of yeast tRNA was added, and the nucleic acid was Co-precipitate with a tool. Diethyl polycarbonate prepared by treating the extracted nucleic acid pellet with water. Resuspend in DEPC 10 μm and store at −70° C. before use.

Ａ、一段ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲ 微量ＲＮＡの一段ＰＣＲ検出のための反応条件は従来のＰＣＲ反応で使用された 反応条件と同じである。個々のＲＮＡ検出について、最適な塩および酵素条件は 容易に決定できる。ＲＮＮアシン商標：　Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏ、　、　Ｍａｄ ｉｓｏｎ、！■より入手）のようなりボヌクレアーゼ阻害剤はＲＴＮアーゼ応の 収率を増加させる。この反応のためのＲＮアーゼ阻害剤条件は従来のＲＴＮアー ゼよびＰＣＲ反応における条件と同じである。ＨＣＶ　ＲＮＡについて、最も好 適と判断された反応条件は実施例３に見られる。A. One-stage HCV RNA PCR The reaction conditions for one-step PCR detection of trace RNA were those used in conventional PCR reactions. Same as reaction conditions. For individual RNA detection, the optimal salt and enzyme conditions are Easy to determine. RNN Asin Trademark: Promega Co, Mad ison,! Bonuclease inhibitors such as Increase yield. RNase inhibitor conditions for this reaction are conventional RTNase inhibitor conditions. The conditions are the same as those for PCR and PCR reactions. Regarding HCV RNA, the most preferred Reaction conditions found to be suitable are found in Example 3.

Ｂ　結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法血清ＤＮＡおよびＲＮＡの抽出物（上記 試料の調製Ｂ参照）をウィルス鋳型として使用する。反応条件は、反応にＨＢＶ 　ＤＮＡおよびＨＣＶ　ＤＮＡ用の２対のオリゴヌクレオチド・プライマーを添 加する以外は一段ＨＣＶ　ＲＮＡＰＣＲの条件と同じである。B Combined one-step HBV-HCV PCR method Serum DNA and RNA extract (above Sample preparation B) is used as the virus template. The reaction conditions were as follows: Two pairs of oligonucleotide primers for DNA and HCV DNA are included. The conditions are the same as the one-stage HCV RNA PCR except that

酵素 反応に使用する酵素は、相対的に純粋であるべきである。種々のＲＴＮアーゼい ずれか１つが使用できる。モロニーネズミ白血病つィルスＲＴアーゼ（ＭＭＬＶ ）、Ｍ−ＭＬＶ　ＲＮアーゼ　Ｈ−ＲＴＮアーゼＭ−ＭＬＶ　Ｈ−）およびニワ トリ骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）ＲＴＮアーゼ成功裏にテストされた。ＲＴＮ アーゼＰＣＲのための）反応は多（の商業的販路（例えば、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ 　ＬｉｆｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、 　ＭＤ　；　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｃｏｒｐｏｒ≠狽奄盾 氏B Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ　：　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕ ｓ、　Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、　ＣＡ）から購入できる。enzyme The enzyme used in the reaction should be relatively pure. Various RTNases Either one can be used. Moloney Murine Leukemia RTase (MMLV) ), M-MLV RNase H-RTNase M-MLV H-) and chicken Avian myeloblastosis virus (AMV) RTNase was successfully tested. RTN Reactions for PCRase PCR are commercially available from many commercial outlets (e.g. GIBCO/BRL). 　Lift Technologies, Inc., Gaithersburg, MD; Boehringer Mannheim Corpor Mr. B Indianapolis, IN: Perkin Elmer Cetu Available from Amazon.com, Emeryville, CA).

Ｔａｑ　Ｉのような、従来のＰＣＲ反応で使用されていたと同様な、熱安定性Ｄ ＮＡポリメラーゼが該一段反応において増幅に使用される。かかる熱安定性ＤＮ Ａポリメラーゼは、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、　Ｅｍｅｒｙｖｉ ｌｌｅ、　ＣＡおよびＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、、　 Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、　ＣＡ）を包含する多くの源から入手できる。Thermal stability D, similar to that used in conventional PCR reactions, such as Taq I NA polymerase is used for amplification in the one-step reaction. Such thermal stability DN A polymerase is Perkin Elmer Cetus, Emeryvi lle, CA and Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA).

ｄＮＴＰ ｄＮＴＰはＲＴＮアーゼよび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの両方に使用される。dNTP dNTPs are used in both RTNases and thermostable DNA polymerases.

ｄＮＴＰの濃度は従来ＲＴアーセ反応とＰＣＲ反応とては異なるが、反応の逆転 写およびＰＣＲ部分両方で同じ濃度のｄＮＴＰを使用できることが判明した。The concentration of dNTP is different between conventional RTase reaction and PCR reaction, but the reaction is reversed. It was found that the same concentration of dNTPs could be used in both the transcription and PCR parts.

ｄＮＴＰは個々の源からのものを混合でき、または、４つのｄＮＴＰの予備混合 した溶液を使用できる（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、。dNTPs can be mixed from individual sources or a premix of four dNTPs can be used. (e.g., Pharmacia LKB Biotech nology Inc.

Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）。Piscataway, NJ).

オリゴヌクレオチド・プライマー 従来のＰＣＲ用の標準的プライマーを該−投法で使用できる。それらはインキュ ベーション前の初めのミックスに添加される。ＨＣＶについては、先に報告され た１対のＨＣＶオリゴヌクレオチド・ブライ７−　（ｎｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅ ｔ　ａｌ、　（１９９１）、　Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９９ ２）　）を使用した。それらは、ＨＣＶ　５°　ＵＴＲから誘導された：　５’ −ＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴＣＡＴＣＣＣ−３’、７−２６ｎｔ、センス、 ５°−ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴ−３°、２２９−２４８ｎ　 ｔ、アンチセンス。oligonucleotide primer Standard primers for conventional PCR can be used in this procedure. They are incubators added to the initial mix before vation. Regarding HCV, it was reported earlier. A pair of HCV oligonucleotides 7-(nu, K, -Q, e t al, (1991), Hu, K, -Q, et al, (199 2)) was used. They were derived from HCV 5° UTR: 5' -ACTCCACCATAGATCCATCCC-3', 7-26nt, sense, 5°-AACACTACTCGGCTAGCAGT-3°, 229-248n t, antisense.

ＨＢＶについては、ＨＢＶブレーＳ／Ｓオーブン・リーディング・フレームから 誘導された１対のオリゴヌクレオチド・プライマーを使用した。５’　−ＧＴＣ ＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴ−３°、１１９−１３９ｎｔ、センス；５ ’−ＡＡＣＣＡＣＴＧＴＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣ−３’、５５５−５７５ｎｔ。For HBV, see HBV Brea S/S Oven Reading Frame. A pair of derived oligonucleotide primers was used. 5’-GTC TAGACTCGTGGTGGACT-3°, 119-139nt, sense; 5 '-AACCACTGTACAAATGGCAC-3', 555-575nt.

アンチセンス。antisense.

以下は微量ＲＮＡの一段検定の実施例である。しばしば患者試料中で低濃度で出 現するＨＣＶ　ＲＮＡをテストＲＮＡとして使用した。しかし、当業者は、適当 なプライマーの使用のような工程により検定されるいずれのＲＮＡの検定にも該 検定を採用できるであろう。The following is an example of a one-step assay of trace RNA. Often found in low concentrations in patient samples The expressed HCV RNA was used as test RNA. However, a person skilled in the art can This applies to the assay of any RNA assayed by a process such as the use of specific primers. A test could be adopted.

実施例ｌ ＲＮＡ抽出 グアニンニウム・イソシアネート−酸−フエノール法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ 、　Ｐ、、　ｅｔａｌ、）を用いて、血清０１ｍｌまたは肝臓組織からＲＮＡを 抽出した。先に報告されているように（Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、、　ｅｔ　ａｌ、 　（１９９２）　）　、正常ヒト血清およびα−１−抗トリプシン欠失患者から の肝臓組織を陰性対照として使用した。ＨＣＶ感染血清から抽出したＲＮＡを陽 性対照として使用した。５０名の患者（３３名は慢性ＨＣＶ感染、１７名は他の 病因の急性または慢性肝臓疾患）を、従来法および一段ＲＮＡ　ＰＣＲ法の両方 を用いてテストした。Example l RNA extraction Guaninium isocyanate-acid-phenol method (Chomczynski , P, etal) to extract RNA from 01 ml of serum or liver tissue. Extracted. As previously reported (Hu, K, -Q, et al. (1992)) from normal human serum and α-1-antitrypsin-deficient patients. liver tissue was used as a negative control. RNA extracted from HCV-infected serum was Used as sex control. 50 patients (33 with chronic HCV infection, 17 with other acute or chronic liver disease) using both conventional and one-step RNA PCR methods. Tested using.

実施例２ 従来のＰＣＲ 先の報告にしたがって（Ｉ（ｕ、　Ｋ、　−Ｑ、、　ｅｔ　ａｔ、　（１９９１ ）　、Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、、　ｅｔａｔ、（１９９２））　、従来のＨＣＶ　 ＲＮＡ　ＰＣＲを行った。要約すると、血清０．１ｍｌから抽出したＲＮＡを、 １０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，３）、５０ｍＭ　ＫＣＩ、５ｍＭ　Ｍｇ ｃ１２．５００μＭ　ｄＮＴＰ、２０Ｕ　ＲＮアシン、１μＭ　アンチセンス・ プライマーおよび２５Ｕ　ＲＴＮアーゼ含有する２０μ】容量で逆転写した。Ｐ ＣＲは、ｌＱｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，３）　、５０ｍＭ　ＫＣＩ、２ ｍＭＭｇＣＩ２．２００μＭ　ｄＮＴＰ。Example 2 Conventional PCR According to the previous report (I(u, K, -Q, , et at, (1991 ), Hu, K, -Q, etat, (1992)), conventional HCV RNA PCR was performed. In summary, RNA extracted from 0.1 ml of serum was 10mM Tris-HCl (pH 8,3), 50mM KCI, 5mM Mg c12.500μM dNTP, 20U RNasein, 1μM antisense Reverse transcription was performed in a volume of 20μ containing primers and 25U RTNase. P CR is 1QmM Tris-HCl (pH 8,3), 50mM KCI, 2 mMMgCI2.200 μM dNTP.

領　５μＭの各プライマーおよび２．５Ｕ　Ｔａｑポリメラーゼを含有する５０ μｌ容量中で行った。従来法では、ＲＴを４２℃にて１時間行い、ＰＣＲは、− 末鎖ｃＤＮＡを変性し、９４℃にて５分間ＲＴアーゼを不活化し、ＰＣＲ増幅を ３０サイクル行った（９４℃、１分；５５℃、１分ニア２℃、２分）。50 μM of each primer and 2.5 U Taq polymerase. Performed in μl volume. In the conventional method, RT was performed at 42°C for 1 hour, and PCR was performed at - Denature the end-strand cDNA, inactivate RTase at 94°C for 5 minutes, and perform PCR amplification. Thirty cycles were performed (94°C, 1 minute; 55°C, 1 minute near 2°C, 2 minutes).

実施例３ 一段検定 一４ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＩは、１工程てＲＴおよびＰＣＲの両方を逐次行う。Example 3 1st Dan Certification -4HCV RNA PCI sequentially performs both RT and PCR in one step.

反応は、ｌＱｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，３）　、５０ｍＭ　ＫＣＩ、２ ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０５μＭの各プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２０Ｕ 　ＲＮＮアシン２５Ｕ　ＲＴアーセおよび２．５Ｕ　Ｔａｑポリメラーゼを含有 する５０μｍ容量中で行った。ＲＴＮアーゼよるＴａｑポリメラーゼの阻害を評 価し、結果を最適化するため、両酵素の異なる濃度を用いて一段ＨＣＶ　ＲＮ、 へ　ＰＣＲを行った。従来のＲＴ　ＰＣＲは、ＲＴおよびＰＣＲに異なった濃度 のＭｇＣ＋２を使用するので、−投法で種々のＭｇＣＩＪ１度についてテストし た。The reaction was performed using 1QmM Tris-HCl (pH 8,3), 50mM KCI, 2 mM MgCl2.05μM of each primer, 200μM of each dNTP, 20U Contains RNN Asin 25U RTase and 2.5U Taq polymerase The test was carried out in a 50 μm volume. Evaluation of Taq polymerase inhibition by RTNase To evaluate and optimize the results, one-step HCV RN, using different concentrations of both enzymes, PCR was performed. Conventional RT PCR requires different concentrations for RT and PCR. Since we use MgC+2 of Ta.

−投法では、インキュベーションをつぎのように、プログラムしたＯＲＴ反応（ ４２℃、１時間）；ＲＴＮアーゼ活化およぎＤＮＡ変性（９４℃、３分）：ＰＣ Ｒ増幅３０サイクル（９４℃、１分；５５℃、１分、７２℃、２分）〇−一段Ｃ Ｈに要する最少時間を決めるため、異なったインキュベーション期間でＲＴおよ びＰＣＲの両方をテストした。- In the injection method, the incubation is carried out in the programmed ORT reaction ( 42°C, 1 hour); RTNase activation and DNA denaturation (94°C, 3 minutes): PC R amplification 30 cycles (94℃, 1 minute; 55℃, 1 minute, 72℃, 2 minutes) 〇-1 stage C RT and H at different incubation periods to determine the minimum time required for H. Both PCR and PCR were tested.

実施例４ ＨＣＶ　ＲＮＡＰＣＲ結果の評価 各ＰＣＲ生成物１０μｍを１５％アガロース・ゲルで電気泳動し、臭化エチジウ ムで染色し、ＵＶ先光下写真を撮った。ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからの１２３ｂｐラ ダーＤＮＡマーカーで分子量を測定した。ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲ生成物の特異 性をサザーン・プロット・ハイブリダイゼーション（Ｈｕ、　Ｋ、−リ、ｅｔａ １．（１９９１）、ｎｕ、　Ｋ、　−Ｑ、、　ｅｔ　ａｌ、　（１９９２）　） で証明した。Example 4 Evaluation of HCV RNA PCR results 10 μm of each PCR product was electrophoresed on a 15% agarose gel and The specimens were stained with UV light and photographed under UV light. 123bp la from GIBCO/BRL The molecular weight was measured using a DNA marker. Specificity of HCV RNA PCR product Southern plot hybridization (Hu, K, -li, eta) 1. (1991), nu, K, -Q,, et al, (1992)) It was proven.

実施例５ 酵素タイプおよび源の変動 一段ＲＮＡ　ＰＣＲで３種のＲＴＮアーゼ比較したところ、Ｍ−ＭＬＶ　ＲＴＮ アーゼＧＩＢＣＯ／ＢＩ？Ｌ）およびＡＭＶ　ＲＴＮアーゼＢｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ）は匹敵する結果を生じた。Ｍ−ＭＬＶＨ−ＲＴＮアーゼＧＩＢＣＯ７ＢＲＬ ）はより弱いＰＣＲ生成物を生じた。匹敵する結果は、２つのＴａｑポリメラー ゼのいずれか（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ　ＣｅｔｕｓまたはＢｅｃｋｍａｎ）の いずれかを使用して得られた。便宜上、以下の研究にはＭ−ＭＬＶ　ＲＴＮアー ゼＧ■ＢＣＯ／ＢＲＬ）　２５　ＵおよびＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　 Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）　２．　５Ｕを使用した。Example 5 Variation in enzyme type and source When comparing three types of RTNase using one-stage RNA PCR, M-MLV RTN Aze GIBCO/BI? L) and AMV RTNase Boehringe r) produced comparable results. M-MLVH-RTNase GIBCO7BRL ) gave a weaker PCR product. Comparable results were obtained with two Taq polymers. (PerkinElmer Cetus or Beckman) obtained using either. For convenience, the following research uses M-MLV RTN architecture. ZeG BCO/BRL) 25 U and Taq polymerase (Perkin Elmer Cetus) 2. 5U was used.

実施例６ ＭｇＣ１２濃度の変動 従来のＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲではＲＴおよびＰＣＲ工程に異なる濃度のＭｇＣ ｌ２を使用しているので、１．１５．２．５および８ｍＭの濃度のＭｇＣ１□を 用いて一段ＲＮＡ　ＰＣＲを行った。一段ＨＣＶ　ＲＮＡＰＣＲでは、反応生成 物は、１．５．２．５および８ｍＭのＭｇＣ＋２で匹敵した。Example 6 Variation in MgC12 concentration In conventional HCV RNA PCR, different concentrations of MgC are used in the RT and PCR steps. Since we are using MgC1□ at concentrations of 1.15.2.5 and 8mM. One-step RNA PCR was performed using In one-stage HCV RNA PCR, reaction generation The results were comparable at 1.5, 2.5 and 8mM MgC+2.

ロスリバーウィルス（Ｓｅ４１ｎｅｒ、　Ｌ、　Ｎ、、　ｅｔ　ａｌ、）および 細菌リポソーム（ｆａｎｇ。Ross River virus (Se41ner, L, N, et al.) and Bacterial liposomes (fang.

Ｒ，−Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、）の増幅にライての一段ＲＮＡ　ＰＣＲ法の以前の研 究で、ＭｇＣｌ２の最適濃度が議論された。比較的狭い範囲のＭｇＣ＋□濃度し か利用できないとするｆａｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、の報告とは反対に、一段ＨＣＶ 　ＲＮＡ　ＰＣＲは１〜８ｍＭのＭｇＣｌ２ａ度範囲で反応生成物を生成した。Previous research on the one-step RNA PCR method for the amplification of R, -F,, et al. In the study, the optimal concentration of MgCl2 was discussed. MgC+□ concentration in a relatively narrow range Contrary to the report by fang, et al., that it is not available, RNA PCR produced reaction products in the MgCl2a degree range of 1-8mM.

しかし、５または８ｍＭ濃度では、時々、アガロース・ゲル上で非特異性のシグ ナルを伴い、１ｍＭのＭｇＣｌ、を使用すると、ＰＣＲは一様に強度が小さくな った。したがって、２ｍＭのＭｇＣｌ２が好ましい濃度であった。However, at 5 or 8 mM concentrations, non-specific signal sometimes appeared on the agarose gel. When using 1mM MgCl, the PCR was uniformly less intense. It was. Therefore, 2mM MgCl2 was the preferred concentration.

実施例７ ＲＴアーゼはＴａｑポリメラーゼ活性を阻害しうるので（Ｓｅｌｌｎｅｒ、　Ｌ 、　Ｎ、　、　；ＧｅｎｅＡｍｐ　ＲＮＡ　ＰＣＲキット指図書、　Ｐｅｒｋｉ ｎ　ＥＬｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　（１９９０）　）　、この有害な相互作用を一段 ＲＮＡ　ＰＣＲで鋭意研究した。ＲＴアーゼまたはＴａｑポリメラーゼのいずれ かの濃度を変えてこれら２つの酵素の比を変えた。図１に示すごとく、２．５Ｕ のＴａｑポリメラーゼと、広範なＲＴポリメラーゼ濃度範囲（５Ｕ〜１００Ｕ） を用いる反応により、検出しうるＰＣＲ生成物が生成した。結果は２５ＵのＲＴ アーゼを用いるのが最適であった。２５ＵのＲＴアーゼ、２．５〜ＩＯＵのＴａ ｑポリメラーゼ濃度を用いてＰＣＲ生成物を製造した。最適結果は２．５ＵのＴ ａｑポリメラーゼを使用して達成された。すなわち、ＲＴアーゼのＴａｑポリメ ラーゼに対する比率は１０：１もの高さで利用でき、ＲＴアーゼによるＴａｑポ リメラーゼ阻害の有害な影響は認められなかった。Example 7 Since RTase can inhibit Taq polymerase activity (Sellner, L. , N, , GeneAmp RNA PCR kit instructions, Perki n　ELmer　Cetus　(1990)　), further suppressing this harmful interaction. We conducted extensive research using RNA PCR. Either RTase or Taq polymerase The ratio of these two enzymes was varied by changing the concentration of the two enzymes. As shown in Figure 1, 2.5U of Taq polymerase and a wide RT polymerase concentration range (5U to 100U) The reaction using 100% yielded a detectable PCR product. The result is 25U RT It was optimal to use Aase. 25U RTase, 2.5-IOU Ta PCR products were produced using q polymerase concentrations. Optimum result is 2.5U T Achieved using aq polymerase. That is, the Taq polymer of RTase Ratios to RTase are available as high as 10:1, and Taq transfer by RTase is available. No deleterious effects of limerase inhibition were observed.

実施例８ ＲＴアーゼ反応条件 一段ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲにおけるＲＴをさらに研究するため、温度およびイ ンキュベーション期間を変化させた。４２℃、１時間のインキュベーションが最 適なように思えたが、１５分もの短い期間でも、より長時間のインキュベーショ ンで認められる生成物に匹敵するＰＣＲ生成物が得られた。従来のＰＣＲにおい ては、Ｔａｑポリメラーゼの不存在下、ＲＴ反応混合物を９５８Ｃにて５分間イ ンキュベートしてＲＴアーセを変性している。しかし、一段ＲＮＡ　ＰＣＲでは 、ＲＴアーゼの変性はＴａｑポリメラーゼの存在下で起こり、これはＴａｑポリ メラーゼの活性およびＰＣＲ増幅の特異性を減少させつる。一段ＲＮＡ　ＰＣＲ における２〜４分の変性は従来のＰＣＲの変性に匹敵する結果を生じた。Example 8 RTase reaction conditions To further study RT in single-stage HCV RNA PCR, temperature and The incubation period was varied. Incubation at 42°C for 1 hour is best. Although this seemed appropriate, even for periods as short as 15 minutes, longer incubation times A PCR product was obtained that was comparable to that seen in the sample. Conventional PCR smell In the absence of Taq polymerase, the RT reaction mixture was incubated at 958C for 5 min. RTase is denatured by incubation. However, in single-stage RNA PCR , denaturation of RTase occurs in the presence of Taq polymerase, which merase activity and the specificity of PCR amplification. Single stage RNA PCR Denaturation for 2 to 4 minutes at 100% yielded results comparable to conventional PCR denaturation.

反応時間 正確なＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲに要する最少時間を決定するため、変性、アニー リングおよび延長時間を変化させた。Ｒ７反応を１５分に固定した場合、ＰｃＲ プロクラムヲ、９４℃、３０秒；５５℃、３０秒：および７２℃、４５秒、３０ サイクルに短縮できた。したがって、一段ＲＮＡ　ＰＣＲは、操作の単純化およ びプログラムされたインキュベーション時間の短縮の両方でＨＣＶ検出に必要な 時間を最少にできる。reaction time To determine the minimum time required for accurate HCV RNA PCR, denaturation, annealing and Vary the ring and extension times. If the R7 reaction was fixed at 15 min, the PcR Program: 94℃, 30 seconds; 55℃, 30 seconds: and 72℃, 45 seconds, 30 It was shortened to a cycle. Therefore, single-stage RNA PCR is useful for simplification of operation and Both the shortened programmed incubation times and can minimize time.

実施例１０ 一致性および特異性 ＨＣＶ　ＲＮＡ検出１．ニー４ＲＮＡ　ＰＣＲを使用しｆニー場合、ＨＣＶ感染 患者の血清から抽出したＲＮＡ中で、期待した２４１ｂｐＨＣＶ　ｃＤＮＡを同 定した（陽性対照）。ＨＣＶ特異性はクローンしたＨＣＶ　ｃＤＮＡをプローブ として用いるサザーン・プロット検定により確認した。これに対し、正常ヒト血 清またはα−１−抗トリプシン欠失患者の肝臓から抽出したＲＮＡを用いた一段 ＲＮＡＰＣＲは陰性てあった。−散性および特異性をさらに評価するため、５ｏ 血清試料（あらかじめ陽性を確認したもの３７およびＨＣＶ　ＲＮＡ陰性１７） から抽出したＲＮＡを用い、従来のＰＣＲおよび一段ＲＮＡ　ＰＣＲを平行して 行った。一段ＲＮＡ　ＰＣＲと従来のＰＣＲの間で１００％の一致が認められ、 ｃＤＮＡの特異性はサザーン・プロッティングで確認した。Example 10 Consistency and specificity HCV RNA detection 1. Nee 4 RNA If using PCR, HCV infection The expected 241bp HCV cDNA was found in the RNA extracted from the patient's serum. (positive control). For HCV specificity, probe the cloned HCV cDNA This was confirmed by the Southern plot test used as In contrast, normal human blood One stage using RNA extracted from serum or liver of α-1-antitrypsin-deficient patients. RNA PCR was negative. -5o to further assess dispersion and specificity Serum samples (37 previously confirmed positive and 17 HCV RNA negative) Conventional PCR and single-stage RNA PCR were performed in parallel using RNA extracted from went. 100% agreement was observed between single-stage RNA PCR and conventional PCR, The specificity of the cDNA was confirmed by Southern plotting.

実施例１１ 感度 ＰＣＲは非常に感度のよい技術であるので、検定の特異性は一定関係である（Ｋ ｗｏｋ、　Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、）　。一段ＲＮＡ　ＰＣＲの相対感度を評価す るため、ＨＣＶ感染肝臓から抽出したＲＮＡを系列希釈し、従来法および一段Ｒ ＮＡ　ＰＣＲ法の両方てテストした。図２に示すように、従来のＰＣＲおよび一 段ＲＮＡＰＣＲ両方とも、ＨＣＶ　ＲＮＡの匹敵する希釈を検出した。ＨＣＶ複 製中間体（マイナス鎖）を含有する血清検体から抽出したＲＮＡを用いると、一 段ＲＮＡＰＣＲは、アガロース・ケル上て従来のＰＣＲよりも強いジエチルを一 様に生じた。このことは、最初のＲＴが一段法で両方の方向に起こり、ＰＣＲ増 幅に利用できるｃＤＮＡの量が増加したことを示唆している。マイナス鎖ＨＣＶ 　ＲＮＡは慢性感染患者の約５０％の血清に存在するので、一段ＲＮＡ　ＰＣＲ はこのサブグループの検出に従来のＰＣＲよもより高感度でありうる。Example 11 sensitivity Since PCR is a very sensitive technique, the specificity of the assay is a constant relationship (K wok, S, et al,). Evaluating the relative sensitivity of single-stage RNA PCR For this purpose, RNA extracted from HCV-infected liver was serially diluted and subjected to conventional and one-step R Both NA and PCR methods were tested. As shown in Figure 2, conventional PCR and Both stage RNA PCRs detected comparable dilutions of HCV RNA. HCV complex Using RNA extracted from a serum sample containing a production intermediate (minus strand), Stage RNA PCR uses diethyl on agarose gel, which is stronger than conventional PCR. It happened like this. This means that the first RT occurs in both directions in a one-step manner and the PCR increase This suggests that the amount of cDNA available for use has increased. negative chain HCV Since RNA is present in the serum of approximately 50% of chronically infected patients, one-step RNA PCR may be more sensitive than conventional PCR in detecting this subgroup.

ＮＳ３およびＮＳ４からのＨＣＶプライ７−　（）ｌｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅｔ 　ａｌ、（１９９１））を使用した場合、反応生成物の強度は、一段および従来 のＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲいずれでも、ＨＣＶ　５’ＵＴＲプライマーを用いて 得られた強度よりも劣る。HCV ply 7-()lu, K, -Q, et from NS3 and NS4 al, (1991)), the strength of the reaction product is HCV RNA PCR using HCV 5'UTR primer The strength obtained is inferior to that obtained.

この結果は、ＮＳ３／ＮＳ４および５“ＵＴＲプライマーを従来のＨＣＶ　ＲＮ Ａ　ＰＣＲて比較した報文（Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅｔ　ａｌ、（１９９１） ；Ｂｕｈｋ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、）と一致する。種々のＨＣ〜′単離物にお いて、ゲノムのその領域が非常に保存されており（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、　Ｍ、　 ｅｔ　ａｌ、）　、ＰＣＲ感度が最大であるのて（Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅｔ ａｌ、　（１９９１）　；Ｂｕｈｋ、　Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、）　、ＨＣＶ　５° ＵＴＲからのプライマーが好ましい。This result demonstrates that the NS3/NS4 and 5"UTR primers can be used in conventional HCV RN A. Report comparing PCR (Hu, K, -Q, et al. (1991) ; Buhk, J., et al.). In various HC~' isolates and that region of the genome is highly conserved (Houghton, M. et al, ), since the PCR sensitivity is maximum (Hu, K, -Q, et al, (1991); Buhk, J., et al.), HCV 5° Primers from UTR are preferred.

以下、結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法についての実施例を示す。Examples of the combined one-step HBV-HCV PCR method will be shown below.

実施例１２ 結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法 結合−ｆｉＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法は、一つ（Ｄ反応容Ｂで、ＨＣＶ　ＲＮＡ （７）ＲＴおよびＰＣＲと、ＨＢＶ　ＤＮＡのＰＣＲを逐次行う。核酸の抽出は 以下のとおり行う。血清１５０μｍを５０℃で２時間、プロティナーセＫ（１０ ｍｇ／ｍ＋）１０〜１５μｍで消化する。フェノール／クロロホルム抽出を、ま ず、酸性雰囲気下（ｐＨ４，０）で行い、ＲＮＡを単離し、フェノール相のｐＨ をｐＨ８，０に調整した後、抽出を繰り返し、ＤＮＡを単離する。酸性度および 塩基性度は３．０〜５０および７１〜９０の範囲で変動させることができる。別 法として、フェノール／クロロホルム抽出を塩基性ｐＨで行ってＤＮＡを抽出し 、ついて、ｐＨを酸性雰囲気に調整してＲＮＡを抽出できる。ｐＨの調整は、例 えば、トリス−ＥＤＴＡ等のような当業者に公知の、ＤＮＡおよびＲＮＡ抽出に 適した適正ｐＨの緩衝液の添加により行うことができる。両方の抽出液をプール し、酵母ｔ　ＲＮＡ　１０Ｕｇを添加し、核酸をイソプロパツールで共沈させる 。抽出された核酸のペレットを、水で処理したジエチルポリカーボネート（ＤＥ ＰＣ）１０μｍに再懸濁させ、使用前、−７０℃に保存する。Example 12 Combined one-step HBV-HCV PCR method There is only one binding-fiHBV-HCV PCR method (in reaction volume B, HCV RNA (7) Perform RT, PCR, and HBV DNA PCR sequentially. Nucleic acid extraction Do the following: 150 μm of serum was incubated at 50°C for 2 hours with proteinase K (10 mg/m+) 10-15 μm. Phenol/chloroform extraction First, RNA was isolated under an acidic atmosphere (pH 4,0), and the pH of the phenol phase was adjusted. After adjusting the pH to 8.0, the extraction is repeated to isolate the DNA. acidity and Basicity can vary between 3.0 and 50 and between 71 and 90. another As a method, DNA was extracted using phenol/chloroform extraction at basic pH. Then, RNA can be extracted by adjusting the pH to an acidic atmosphere. To adjust the pH, e.g. For DNA and RNA extraction, as known to those skilled in the art, such as Tris-EDTA, etc. This can be done by adding a suitable pH buffer. Pool both extracts Then add 10Ug of yeast tRNA and coprecipitate the nucleic acid with isopropanol. . The extracted nucleic acid pellet was treated with water-treated diethyl polycarbonate (DE PC) Resuspend at 10 μm and store at -70°C before use.

ついで、核酸抽出液を変性し、ＲＴ−ＰＣＲ反応を１０ｍＭ　トリス−ＨＣＩ（ ｐＨ８，３）＋５０ｍＭ　ＫＣＩ　；２ｍＭ　ＭｇＣｌ２ａ、５μＭのＨＢＶま たはＨＣＶ特異性オリゴヌクレオチド・プライマー；２００ＵＭの各ｄＮＴＰ； ６．２５Ｕ　ＲＴアーゼ：２０Ｕ　ＲＮアシンおよび１．２５Ｕ　Ｔａｑポリメ ラーゼを含有する２５μｍ容量中で行う。Next, the nucleic acid extract was denatured, and the RT-PCR reaction was performed using 10 mM Tris-HCI ( pH 8,3) + 50mM KCI; 2mM MgCl2a, 5μM HBV or or HCV-specific oligonucleotide primers; 200 UM of each dNTP; 6.25U RTase: 20U RNA Asin and 1.25U Taq Polymer The procedure is carried out in a 25 μm volume containing lase.

結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲについて、インキュベーションをつぎのとおち プログラムした。Ｒ７反応（４２℃、１時間）、ＲＴアーゼ不活化およびＤＮＡ 変性（９４℃、３分）；３０サイクルのＰＣＲ増幅（９４℃、１分：５５℃、１ 分ニア２℃、２分）。For combined one-step HBV-HCV PCR, incubation is performed as follows. programmed. R7 reaction (42°C, 1 hour), RTase inactivation and DNA Denaturation (94°C, 3 min); 30 cycles of PCR amplification (94°C, 1 min: 55°C, 1 min); 2°C, 2 minutes).

実施例１３ 結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ結果の評価各ＰＣＲ生成物１０μｍを１．５％ アガロース・ゲルで電気泳動させ、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ先光下写真を 撮った。分子量は（ＪＢＣＯ／ＢＲＬからの１２３ｂｐラダーＤＮＡマーカーに より測定した。ＨＢＶ　ＤＮＡおよびＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲ生成物の特異性を 、サザーン・プロット・ハイブリダイゼーション（Ｈｕ、　Ｋ、　−〇、　ｅｔ 　ａｌ、　（１９９３印刷中）；Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅｔ　ａｌ、（１９９ ２））で証明した。ＨＣＶ５°ＵＴＲ７ラグメント含有ｐＧＨｃＶＩＡ　（ｌＴ ｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅｔ　ａｌ。Example 13 Combined one-step HBV-HCV Evaluation of PCR results Each PCR product 10 μm was 1.5% Electrophoresed on agarose gel, stained with ethidium bromide, and photographed under UV light. took. The molecular weight is (123bp ladder DNA marker from JBCO/BRL) It was measured from HBV DNA and HCV RNA PCR product specificity , Southern plot hybridization (Hu, K, -　, et al, (1993 in press); Hu, K, -Q, et al, (199 2)) was proven. pGHcVIA containing HCV5°UTR7 fragment (IT u, K, -Q, etc.

（１９９２））およびＨＢＶゲノムを含有するｐＮＥＲ（ｎｕ、　Ｌ　−Ｑ、　 ｅｔ　ａｌ。(1992)) and pNER containing the HBV genome (nu, L-Q, etc.

（１９９０））の、２つのプラスミドをサザーン・プロット・ハイブリダイゼー ションのプローブ源として使用した。(1990)), the two plasmids were analyzed by Southern plot hybridization. was used as a probe source for the

実施例１４ ＨＣＶシグナルに対するＨＢＶシグナルの最適化ＨＢＶ　ＤＮＡのＨＣＶ　ｃＤ ＮＡに対する比を適当に調整しないと、ＨＢＶノグナルの強度がＨＣＶ　ｃＤＮ Ａのシグナル強度より非常に強くなり、４５６ｂｐ領域（ＨＢＶ　ＤＮＡバンド ）が不鮮明になり得、ＰＣＲ生成物の正確な分子サイズの測定が可能用なくなり 得る。２つの主要因がＨＢＶ　ＤＮＡおよび）ＩＣＶ　ｃＤＮＡシグナルの強度 の相違に関与している。第１に、ＨＢＶの力価が血清中のＨＣＶウィルスより大 きいことがＨＣＶ　ＲＮＡに比してＨＢＶＤＮＡ（７）鋳型ノ数ヲ増加すセル。Example 14 Optimization of HBV signal for HCV signal HCV DNA HCV cD If the ratio to NA is not adjusted appropriately, the intensity of HBV nognal will be lower than that of HCV cDN. The signal intensity is much stronger than that of A, and the signal intensity is much stronger than that of ) may become unclear, making it impossible to accurately measure the molecular size of the PCR product. obtain. The two main factors are the strength of the HBV DNA and ) ICV cDNA signals. are involved in the differences. First, the titer of HBV is higher than that of HCV virus in serum. The key is that cells have an increased number of HBV DNA (7) templates compared to HCV RNA.

第２に、ＨＢＶ　ＤＮＡ　ＰＣＲは、ＨＣＶで必要とされるようなＲＮＡの逆転 写を含まないので、より効率的である。Second, HBV DNA PCR is an inversion of RNA as required for HCV. It is more efficient because it does not include any images.

ＨＢＶ　ＤＮＡ：ＨＣＶ　ｃＤＮＡ比の最適化は以下のとおり行った。まず、Ｒ ＮＡをＨＢＶおよびＨＣＶ感染の患者の血清から０．１５ｍ１抽出した。ついで 、ｐＨの中和によりＤＮＡをフェノール相から抽出した。ＤＮＡを別の試験管に 集めた。ＲＮＡ抽出液を種々の量の抽出したＤＮＡと合した。ＲＮＡおよびＤＮ Ａを、１０μｇ　ｔＲＮＡと共に同じ試験管内で共沈させた。結合ＨＢＶ−ＨＣ Ｖ　ＰＣＲを上記のごとく行った。ＰＣＲ反応におけるＤＮＡ鋳型の量の減少は 、ＨＣＶ　ｃＤＮＡシグナルの強度に影響することなく、ＨＢＶ　ＤＮＡのシャ ープなバンドを生じた。ＨＢＶ　ＤＮＡおよびＨＣＶ　ＲＮＡ鋳型の種々の比の 比較は、ＤＮＡ　：ＲＮＡ抽出の比が１＋７．５〜１：１５（すなわち、プール した全ＨＣＶ　ＲＮＡ抽出液と、血清０．１５ｍ１からの抽出液の１／７５〜１ ／１５）で最適な結果が得られた。ＤＮＡ抽出液の希釈はＨＢＶ　ＤＮＡ検出の 感度を減じなかった。Optimization of the HBV DNA:HCV cDNA ratio was performed as follows. First, R NA was extracted in 0.15 ml from serum of patients with HBV and HCV infection. Then , DNA was extracted from the phenol phase by pH neutralization. DNA in another test tube collected. The RNA extract was combined with various amounts of extracted DNA. RNA and DNA A was co-precipitated with 10 μg tRNA in the same tube. Combined HBV-HC V PCR was performed as described above. The decrease in the amount of DNA template in the PCR reaction is , HBV DNA shunt without affecting the HCV cDNA signal strength. A deep band was formed. Various ratios of HBV DNA and HCV RNA templates The comparison shows that the ratio of DNA:RNA extraction is between 1+7.5 and 1:15 (i.e., pooled total HCV RNA extract and 1/75 to 1 of the extract from 0.15 ml of serum. /15) gave the best results. Dilution of DNA extract is for HBV DNA detection. Did not reduce sensitivity.

実施例１５ 結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲの一致性および特異性結合ＨＢＶ−ＨＣＶ　Ｐ ＣＲ法は非常に特異的な操作である。期待される４５６ｂｐ　ＨＢＶ　ＤＮＡお よび２４１ＨｃＶ　ＣＤＮＡ／＜：／）’をＨＢＶおよびＨＣＶ感染の患者の血 清中で同定した。また、正常ヒト血清中ではなんのバンドも同定されなかった。Example 15 Binding One-Step HBV-HCV PCR Concordance and Specificity Binding HBV-HCV P The CR method is a very specific operation. Expected 456bp HBV DNA and 241HcV cDNA/<:/)' in the blood of patients infected with HBV and HCV. Identified in the serum. Also, no bands were identified in normal human serum.

最後に、サザーン・プロットでＨＢＶまたはＨＣＶについてのバンドの特異性を 確認した。感度および特異性を評価するため、従来のＨＢＶ　ＤＮＡ　ＰＣＲ， 一段ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲおよび結合ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲを２８血清試料 で平行して行った。結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法の特異性は、２８血消試 料における従来のＨＢＶ　ＤＮＡ　ＰＣＲおよびＨＣＶ　ＤＮＡ　ＰＣＲとの１ ００％一致により確認された。Finally, Southern plots show the band specificity for HBV or HCV. confirmed. To assess sensitivity and specificity, conventional HBV DNA PCR, One-step HCV RNA PCR and combined HBV-HCV PCR for 28 serum samples I went in parallel. The specificity of the combined one-step HBV-HCV PCR method 1 with conventional HBV DNA PCR and HCV DNA PCR in Confirmed by 00% agreement.

従来法および一段）（ＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲの一散性慢性肝臓＊　結合ＨＢＶ／ ＨＣＶ　ＰＣＲ疾患群 ＨＢＶ　（＋）および　６　６　６ ＨＣＶ　（＋） ＨＢＶ　（＋）および　６　６　０ ＨＣＶ　（−） ＨＢＶ　（−）および　９　０　９ ）（ＣＶ　（＋） ＊：ＨＢＶ　ＤＮＡはＨＢＶ　ＤＮＡ　ＰＣＲで検出；ＨＣＶ　ＲＮＡは一段Ｒ ＮＡ　ＰＣＲ”ｒ検出。Conventional method and one step) (BV-HCV PCR Dispersed Chronic Liver * Combined HBV/ HCV PCR disease group HBV (+) and 6 6 6 HCV (+) HBV (+) and 6 6 0 HCV (-) HBV (-) and 9 0 9 ) (CV (+) *: HBV DNA is detected by HBV DNA PCR; HCV RNA is detected by 1-stage R NA　PCR”r detected.

実施例１６ ＨＢＶスロット・ハイブリダイゼーションと結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶＰＣＲの一 致性 ＨＢＶ　ＤＮＡスロット・ハイブリダイゼーションはＨＢＶ感染の診断に広く使 用されている。したがって、３４血清試料を用いて、ＨＢＶ　ＤＮＡスロット・ ハイブリダイゼーションと、結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法の一致性を試験 した。結合一段ＨＢＶ＝ＨＣＶ　ＰＣＲ法とＨＢＶ　ＤＮＡスロット・ハイブリ ダイゼーシヨンの間に１００％の一致性が認められた。Example 16 HBV slot hybridization and combined one-stage HBV-HCV PCR culpable HBV DNA slot hybridization is widely used in the diagnosis of HBV infection. It is used. Therefore, using 34 serum samples, HBV DNA slot Testing the consistency of hybridization and combined one-step HBV-HCV PCR method did. Combined one-stage HBV = HCV PCR method and HBV DNA slot hybrid 100% consistency was observed between the daizations.

実施例１７ 結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲの感度ＨＢＶ　ＤＮＡ検出用の結合一段ＨＢＶ −ＨＣＶ　ＰＣＲ法の感度１ま広く使用されているＨＢＶ　ＤＮＡスロット・／ ＼イブリダイゼーション君会断技術よりも大きい。これは、ＨＢＶ陽性血清にお ける結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法とＨＢＶ　ＤＮＡスロット・ノＸイブリ ダイゼーンヨンとの間の１００％一致により示された。しかし、ＨＢＶ　ＤＮＡ スロツト・ノＸイブリダイゼーション検定陰性の１２名の患者中、３名の患者が 、結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法で陽性であった。Example 17 Combined single-stage HBV-HCV PCR sensitivity HBV Combined single-stage HBV for DNA detection - HCV PCR method has a sensitivity of 1. Widely used HBV DNA slot / \It's bigger than Ibridization-kun's cutting technique. This applies to HBV-positive serum. One-stage HBV-HCV PCR method and HBV DNA slot Demonstrated by 100% agreement with Daizenyon. However, HBV DNA Of the 12 patients with negative Slot No.X hybridization assay, 3 patients , was positive by combined one-step HBV-HCV PCR method.

ｌ　１’　２２’　３３’　４４’　５５’ＭＶＩ／ＦＩＧ　／。l 1' 22' 33' 44' 55'MVI/FIG/.

ＭＷ　１　２３４　５ Ｆ／Ｇ、２ｂ、Ｂ ＭＷ１２３４５ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。MW 1 234 5 F/G, 2b, B MW12345 Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE.

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ（７２）発明者　フー、ケーークィン アメリカ合衆国９００４８カリフォルニア州、ロサンゼルス、アパートメント・ ナンバー２２、サウス・スウイーツアー・アベニュー１１０番DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE) , AU, CA, JP (72) Inventor Hu, K-Quinn Apartment, Los Angeles, California 90048, United States Number 22, 110 South Sweetours Avenue

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．反応容器中に、活性逆転写酵素および活性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを一 緒に存在させ、１工程でＰＣＲ検定をおこなうことを特徴とする微量ＲＮＡの検 出方法。 ２．逆転写反応およびＤＮＡ増幅反応が逐次進行する請求項１記載の方法。 ３．ＤＮＡ増加反応開始前に、逆転写酵素を変性させる請求項２記載の方法。 ４．逆転写酵素：熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの比が２：１〜１０：１である請 求項１記載の方法。 ５．反応容器が、さらに１〜８ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含有する請求項１記載 の方法。 ６．逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼをインキュベーション開始前に試料に 添加する試料中の微量ＲＮＡ検出用の一段ＰＣＲ法。 ７．活性逆転写酵素および活性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが同時に試料と存在 する試料中の微量ＲＮＡ検出用一段ＰＣＲ法。 ８．同じ反応液を逆転写およびＤＮＡ増加の両方に使用する微量ＲＮＡ検出用の 一段ＰＣＲ法。 ９．活性逆転写酵素および活性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが反応容器中で一緒 に存在する一段ＰＣＲ検定からなることを特徴とするＨＣＶ　ＲＮＡ検出方法。 １０．逆転写反応とＰＣＲ反応が逐次進行する請求項９記載の方法。 １１．ＤＮＡ増幅反応開始前に逆転写酵素を変性させる請求項１０記載の方法。 １２．逆転写酵素：熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの比が２：１〜１０：１である 請求項１０記載の方法。 １３．反応容器がさらに１．５〜８ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含有する請求項１ ０記載の方法。 １４．逆転写反応とＰＣＲ反応を同一溶液中で行う請求項１０記載の方法。 １５．反応容器；該反応容器に２：１〜１０：１の比で添加すべき逆転写酵素お よび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを収納している別々の容器；ｄＡＴＰ、ｄＧＴ Ｐ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ；ＨＣＶ特異性のアンチセンスおよびセンス・プラ イマー；およびＰＣＲ用の標準的緩衝剤および塩からなることを特徴とする一段 ＰＣＲを使用するＨＣＶ　ＲＮＡ検出用キット。 １６．ａ）試料中の蛋白質を失活させ、ｂ）試料のｐＨを変えて酸性ｐＨとする ことにより試料中のＲＮＡ抽出を行い、ｃ）試料のｐＨを変えで塩基性ｐＨとし て試料中のＤＮＡ抽出を行う工程からなることを特徴とする水性および有機相か らなる試料中のＲＮＡおよびＤＮＡの同時抽出方法。 １７．該ＲＮＡがＲＮＡウイルスＲＮＡであり、該ＤＮＡがＤＮＡウイルスＤＮ Ａである請求項１６記載の方法。 １８．該ＲＮＡがＨＣＶ　ＲＮＡで、該ＤＮＡがＨＢＶ　ＤＮＡである請求項１ ６記載の方法。 １９．試料中の蛋白質失活を、グアニジニウム・イソチオシアネートを使用して 行う請求項１６記載の方法。 ２０．試料中の蛋白質失活を、プロティナーゼＫを使用して行う請求項１６記載 の方法。 ２１．該有機相がフェノールおよびクロロホルムからなる請求項１６記載の方法 。 ２２．ＲＮＡ抽出の間の試料のｐＨが３．０〜５．０の範囲であり、ＤＮＡ抽出 の間の試料のｐＨが７．１〜９．０である請求項１６記載の方法。 ２３．ＲＮＡ抽出の間の有機相のｐＨが４．０であり、ＤＮＡ抽出の間の有機相 のｐＨが８．０である請求項１６記載の方法。 ２４．ＲＮＡ抽出の間の試料のｐＨを、酸性ｐＨの緩衝液の添加により酸性とす る請求項１６記載の方法。 ２５．ＤＮＡ抽出の間の試料のｐＨを、塩基性ｐＨの緩衝液の添加により塩基性 とする請求項１６記載の方法。 ２６．ＲＮＡ抽出をＤＮＡ抽出前に行う請求項１６記載の方法。 ２７．ＤＮＡ抽出をＲＮＡ抽出前に行う請求項１６記載の方法。 ２８．ａ）試料中の蛋白質を失活させ、ｂ）試料のｐＨを酸性ｐＨとなるように 変えて試料中のＲＮＡ抽出を行い、ｃ）試料のｐＨを塩基性ｐＨとなるように変 えて試料中のＤＮＡ抽出を行い、ｄ）得られたＲＮＡおよびＤＮＡをプールし、 ｅ）得られたＲＮＡおよびＤＮＡ抽出物を含有する試料に、活性逆転写酵素と活 性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとを添加し、ｆ）まず、試料中で逆転写反応を行 わせてｃＤＮＡ生成物を生成させ、ついで、該活性逆転写酵素を不活化し、該活 性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを活性化し、ｇ）増幅されたｃＤＮＡ生成物を検 出し、また、増幅されて生じたＤＮＡ抽出物を検出する 工程からなることを特徴とする試料中のＲＮＡおよびＤＮＡの同時増幅および検 出方法。 ２９．逆転写酵素をＤＮＡ増幅反応の開始前に変性させる請求項２８記載の方法 。 ３０．逆転写酵素：熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの比が２：１〜１０：１である 請求項２８記載の方法。 ３１．反応容器が、さらに１〜８ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含有する請求項２８ 記載の方法。 ３２．逆転写およびＤＮＡ増幅に同じ反応液を使用する請求項３２記載の方法。 ３３．ＲＮＡがＲＮＡウイルスＲＮＡであり、ＤＮＡがＤＮＡウイルスＤＮＡで ある請求項２８記載の方法。 ３４．ＲＮＡがＨＣＶ　ＲＮＡであり、ＤＮＡがＨＢＶ　ＤＮＡである請求項２ ８記載の方法。 ３５．試料中の蛋白質の失活を、グァニジニウム・イソチオシアネートを用いて 行う請求項２８記載の方法。 ３６．試料中の蛋白質の失活を、プロティナーゼＫを用いて行う請求項２８記載 の方法。 ３７．有機相がフェノールおよびクロロホルム混合物である請求項２８記載の方 法。 ３８．ＲＮＡ抽出の間の試料ｐＨが３．０〜５．０であり、ＤＮＡ抽出の間の試 料ｐＨが７．１〜９．０である請求項２８記載の方法。 ３９．ＲＮＡ抽出の間の試料ｐＨが４．０であり、ＤＮＡ抽出の間の試料ｐＨが ８．０である請求項２８記載の方法。 ４０．ＲＮＡ抽出の間の試料ｐＨを、酸性ｐＨの緩衝液の添加により酸性とする 請求項２８記載の方法。 ４１．ＤＮＡ抽出の間の試料ｐＨを、塩基性ｐＨの緩衝液の添加により塩基性と する請求項２８記載の方法。 ４２．ＲＮＡ抽出を、ＤＮＡ抽出の前に行う請求項２８記載の方法。 ４３．ＤＮＡ抽出を、ＲＮＡ抽出の前に行う請求項２８記載の方法。 ４４．得られたＲＮＡおよびＤＮＡ抽出物をプールする工程に続いて、抽出物を 共沈させる請求項２８記載の方法。 ４５．得られたＲＮＡおよびＤＮＡ抽出物を共沈させる工程に続いて、抽出物を 、ＲＮアーゼ阻害剤を含有する溶媒中に懸濁させる請求項２８記載の方法。 ４６．蛋白質を失活させる手段を含有する容器、試料からＤＮＡおよびＲＮＡ種 を単離する手段、２：１〜１０：１の比で反応容器に添加すべき、逆転写酵素お よび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含有する別々の容器；ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、 ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ；ＨＣＶ特異性のアンチセンスおよびセンスプライマー ＨＢＶ特異性のアンチセンスおよびセンスプライマー；ＰＣＲ用の標準的な緩衝 剤および塩；まず、蛋白質の失活を行い、ついで、酸性ｐＨでＲＮＡを抽出し、 それについで、塩基性ｐＨでＤＮＡを抽出し、その後、逆転写酵素および熱安定 性ポリメラーゼを添加し、逆転写およびＰＣＲを行うことを指示する指図書から なることを特徴とする一段ＰＣＲを用いるＲＮＡおよびＤＮＡの同時増幅用キッ ト。 ４７．蛋白質を失活させる手段を含有する容器、試料からＤＮＡおよびＲＮＡ種 を単離する手段、２：１〜１０：１の比で反応容器に添加すべき、逆転写酵素お よび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含有する別々の容器；ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、 ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ；ＨＣＶ特異性のアンチセンスおよびセンスプライマー ＨＢＶ特異性のアンチセンスおよびセンスプライマー；ＰＣＲ用の標準的な緩衝 剤および塩；まず、蛋白質の失活を行い、ついで、酸性ｐＨでＲＮＡを抽出し、 それについで、塩基性ｐＨでＤＮＡを抽出し、その後、逆転写酵素および熱安定 性ポリメラーゼを添加し、逆転写およびＰＣＲを行うことを指示する指図書から なることを特徴とする一段ＰＣＲを用いるＨＣＶ　ＲＮＡおよびＨＢＶ　ＤＮＡ の同時増幅用キット。[Claims] 1. Combine active reverse transcriptase and active thermostable DNA polymerase in a reaction vessel. A method for detecting trace amounts of RNA, which is characterized in that it is present in both samples and PCR assay is performed in one step. How to get out. 2. 2. The method according to claim 1, wherein the reverse transcription reaction and the DNA amplification reaction proceed sequentially. 3. 3. The method according to claim 2, wherein the reverse transcriptase is denatured before starting the DNA increasing reaction. 4. Ensure that the ratio of reverse transcriptase: thermostable DNA polymerase is between 2:1 and 10:1. The method described in claim 1. 5. 2. The reaction vessel further contains MgCl2 at a concentration of 1 to 8 mM. the method of. 6. Add reverse transcriptase and DNA polymerase to the sample before starting the incubation. One-step PCR method for detecting trace amounts of RNA in added samples. 7. Active reverse transcriptase and active thermostable DNA polymerase present simultaneously with sample A one-step PCR method for detecting trace amounts of RNA in samples. 8. For trace RNA detection using the same reaction solution for both reverse transcription and DNA amplification. One-step PCR method. 9. Active reverse transcriptase and active thermostable DNA polymerase are combined in a reaction vessel. A HCV RNA detection method comprising a one-step PCR assay. 10. 10. The method according to claim 9, wherein the reverse transcription reaction and the PCR reaction proceed sequentially. 11. 11. The method according to claim 10, wherein the reverse transcriptase is denatured before starting the DNA amplification reaction. 12. The ratio of reverse transcriptase: thermostable DNA polymerase is between 2:1 and 10:1. The method according to claim 10. 13. Claim 1 wherein the reaction vessel further contains MgCl2 at a concentration of 1.5 to 8mM. The method described in 0. 14. 11. The method according to claim 10, wherein the reverse transcription reaction and the PCR reaction are performed in the same solution. 15. Reaction vessel; reverse transcriptase and enzymes to be added to the reaction vessel in a ratio of 2:1 to 10:1. and separate containers containing thermostable DNA polymerase; dATP, dGT P, dTTP and dCTP; HCV-specific antisense and sense proteins and standard buffers and salts for PCR. HCV RNA detection kit using PCR. 16. a) Inactivate the protein in the sample, b) Change the pH of the sample to make it acidic c) change the pH of the sample to a basic pH; Aqueous and organic phase A method for simultaneously extracting RNA and DNA from a sample. 17. The RNA is RNA virus RNA, and the DNA is DNA virus DNA. 17. The method according to claim 16, wherein A. 18. Claim 1, wherein the RNA is HCV RNA and the DNA is HBV DNA. The method described in 6. 19. Deactivation of proteins in samples using guanidinium isothiocyanate 17. The method according to claim 16, wherein the method is performed. 20. 17. The protein in the sample is inactivated using proteinase K. the method of. 21. 17. The method of claim 16, wherein the organic phase consists of phenol and chloroform. . 22. The pH of the sample during RNA extraction is in the range 3.0-5.0 and the pH of the sample during RNA extraction is in the range 3.0-5.0. 17. The method of claim 16, wherein the pH of the sample is between 7.1 and 9.0. 23. The pH of the organic phase during RNA extraction was 4.0 and the pH of the organic phase during DNA extraction was 4.0. 17. The method according to claim 16, wherein the pH of is 8.0. 24. The pH of the sample during RNA extraction is made acidic by the addition of an acidic pH buffer. 17. The method according to claim 16. 25. The pH of the sample during DNA extraction is made basic by the addition of a basic pH buffer. 17. The method according to claim 16. 26. 17. The method according to claim 16, wherein RNA extraction is performed before DNA extraction. 27. 17. The method according to claim 16, wherein the DNA extraction is performed before the RNA extraction. 28. a) Inactivate the protein in the sample, b) Adjust the pH of the sample to acidic pH. c) change the pH of the sample to basic pH; d) pool the obtained RNA and DNA, e) Add active reverse transcriptase and active reverse transcriptase to the sample containing the resulting RNA and DNA extracts. f) First, perform a reverse transcription reaction in the sample. to generate a cDNA product, and then inactivate the active reverse transcriptase and inactivate the active reverse transcriptase. and g) detecting the amplified cDNA product. and detect the amplified DNA extract. Simultaneous amplification and detection of RNA and DNA in a sample characterized by the steps How to get out. 29. The method according to claim 28, wherein the reverse transcriptase is denatured before starting the DNA amplification reaction. . 30. The ratio of reverse transcriptase: thermostable DNA polymerase is between 2:1 and 10:1. 29. The method of claim 28. 31. 28. The reaction vessel further contains MgCl2 at a concentration of 1-8mM. Method described. 32. 33. The method according to claim 32, wherein the same reaction solution is used for reverse transcription and DNA amplification. 33. RNA is RNA virus RNA, and DNA is DNA virus DNA. 29. The method of claim 28. 34. Claim 2 wherein the RNA is HCV RNA and the DNA is HBV DNA 8. The method described in 8. 35. Deactivation of proteins in samples using guanidinium isothiocyanate 29. The method according to claim 28, wherein the method is performed. 36. 29. The protein in the sample is inactivated using proteinase K. the method of. 37. 29. The method according to claim 28, wherein the organic phase is a mixture of phenol and chloroform. Law. 38. The sample pH during RNA extraction is 3.0-5.0 and the sample pH during DNA extraction is 29. The method according to claim 28, wherein the pH of the material is 7.1 to 9.0. 39. The sample pH during RNA extraction was 4.0 and the sample pH during DNA extraction was 29. The method according to claim 28, wherein the method is 8.0. 40. The sample pH during RNA extraction is made acidic by the addition of an acidic pH buffer. 29. The method of claim 28. 41. The sample pH during DNA extraction is made basic by the addition of a basic pH buffer. 29. The method of claim 28. 42. 29. The method of claim 28, wherein RNA extraction is performed before DNA extraction. 43. 29. The method of claim 28, wherein DNA extraction is performed before RNA extraction. 44. Following a step of pooling the resulting RNA and DNA extracts, the extracts are 29. The method according to claim 28, comprising co-precipitation. 45. Following a step of co-precipitating the resulting RNA and DNA extracts, the extracts are 29. The method of claim 28, wherein the method is suspended in a solvent containing an RNase inhibitor. 46. Container containing means for inactivating proteins, removing DNA and RNA species from the sample means for isolating the reverse transcriptase and and a thermostable DNA polymerase; dATP, dGTP, dTTP and dCTP; HCV-specific antisense and sense primers HBV-specific antisense and sense primers; standard buffers for PCR Agents and salts: First, protein is inactivated, then RNA is extracted at acidic pH, The DNA is then extracted at basic pH, followed by reverse transcriptase and thermostabilized from the instructions to add polymerase and perform reverse transcription and PCR. A kit for simultaneous amplification of RNA and DNA using one-stage PCR, characterized by the following: to. 47. Container containing means for inactivating proteins, removing DNA and RNA species from the sample means for isolating the reverse transcriptase and and a thermostable DNA polymerase; dATP, dGTP, dTTP and dCTP; HCV-specific antisense and sense primers HBV-specific antisense and sense primers; standard buffers for PCR Agents and salts: First, protein is inactivated, then RNA is extracted at acidic pH, The DNA is then extracted at basic pH, followed by reverse transcriptase and thermostabilized from the instructions to add polymerase and perform reverse transcription and PCR. HCV RNA and HBV DNA using one-step PCR characterized by kit for simultaneous amplification.
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