JPH07501689A

JPH07501689A - Method for producing 14α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione

Info

Publication number: JPH07501689A
Application number: JP5504864A
Authority: JP
Inventors: ヴェーバー，アルフレート; ケネッケ，マリオ
Original assignee: シエーリング　アクチエンゲゼルシヤフト
Priority date: 1991-08-28
Filing date: 1992-08-07
Publication date: 1995-02-23
Also published as: DE4129005A1; WO1993005170A1; EP0600946A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンの製造方法本発明は、カルプラリアルナータ（（：ｕｒｖｕｌａｒｉａ　１ｕｎａｔａ　）の培養菌を用いて４−アンドロステン−３，１７−ジオンを発酵させることにより１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを製造する方法において、４−アンドロステン−３，１７−ジオンを水中に懸濁させ、得られた＠／Ｒ液を発酵させることを特徴とする、１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンの製造方法に関する。[Detailed description of the invention] Method for producing 14α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione The present invention relates to carpularia lunata ((:urvularia 1unata) by fermenting 4-androstene-3,17-dione using cultured bacteria. Method for producing 14α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione , 4-androstene-3,17-dione was suspended in water, and the obtained 14α-hydroxy-4-andros, characterized by fermenting @/R liquid The present invention relates to a method for producing ten-3,17-dione.

ソ連特許第８０１５１７号明細書（Ｃ，Ａ、１１０゜１３３６９７ｕ参照）には、カルブラリアルナータの培養菌を用いて４−アンドロステン−３，１７−ジオンを発酵させることによる、１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンの製造方法が記載されている。しかしながら該特許明細書には、該微生物がどの公開菌株寄託機関からのものであるか、及びどの番号下にあるのかという指示が含まれていないので、記載された方法を追試することができない。該明細書の技術的手段によれば４−アンドロステン−３゜１７−ジオンをメタノール又はジメチルフォルムアミド中に溶解させ、基質０．５〜１．５ｇ／ｌを４０〜６６時間発酵させて、明らかに著しく強度に不純化された１４α−ヒドロキシ −４−アンドロステン−３，１７−ジオン粗製生成物３５〜７０％が得られる。In Soviet Patent No. 801517 (see C, A, 110゜133697u) 4-androstene-3,17-dio 14α-hydroxy-4-androstene-3,1 by fermenting A method for producing 7-dione is described. However, the patent specification does not include the Which public strain depository does the organism come from and under what number? Since there are no instructions included, it is not possible to retry the method described. Applicable According to the technical means in the specification, 4-androstene-3゜17-dione is converted into methanol. 0.5-1.5 g/l of substrate dissolved in dimethylformamide or dimethylformamide at 40% After ~66 hours of fermentation, the 14α-hydroxy was apparently severely contaminated. 35-70% of -4-androstene-3,17-dione crude product is obtained.

（そのことは、後処理方法から明白である、すなわち発酵バッチをクロロホルムで抽出し、クロロホルム相を濃縮し、残留物をヘキサンとともに煮沸する。(This is evident from the work-up method, i.e. the fermentation batch is chloroformed. The chloroform phase is concentrated and the residue is boiled with hexane.

従って、このようにして得られた生成物はすべて抽出可能であり、ヘキサン中に不溶な物質を含有しなければならない。該生成物は、発酵パッチ中に含有されるすべてのステロイドだけでなく、相応するカルブラリア含有物質及び媒体成分でもある）。Therefore, all the products obtained in this way are extractable and in hexane Must contain insoluble substances. The product is contained in a fermentation patch With all steroids as well as corresponding calbularia-containing substances and vehicle components ).

これとは異なり、本発明の方法により１リットル当り５ｇより多い４−アンドロステン−３，１７−ジオンを約１２時間以内で再現可能で１４α−ヒドロキシ− ４−アンドロステン−３，１７−ジオンに転化することができる。該処理生成物の収率は、純粋生成物約６０％である。In contrast, the method according to the invention provides more than 5 g of 4-andro per liter. Stene-3,17-dione can be reproduced within about 12 hours and 14α-hydroxy- It can be converted to 4-androstene-3,17-dione. the processed product The yield is about 60% pure product.

本発明による方法は、カルブラリアルナータ培養菌を用いた公知の微生物学的な基質の転化にも使用される発酵条件下で行われる。The method according to the present invention is based on the known microbiological method using cultured microorganisms of Calburial Inata. It is carried out under fermentation conditions that are also used for substrate conversion.

該微生物のために通常使用される培養条件下で、適した培地中で、通気下で液体培養菌を増殖させる。次いで、培養菌に４−アンドロステン−３，１７−ジオンの水性！１５液を加え、基質転化が最大に達するまで発酵させる。４−アンドロステン−３，１７−ジオンの水性懸濁液は容易な方法で製造することができる、例えば該基質を、２〜５倍の量の水とともに非イオン性界面活性剤を添加しながらボールミル内で、該基質が約１〜５μｍの粒度を有するまで粉砕する。適当な界面活性剤は、例えばポリグリコールの酸化エチレン付加物又は脂肪酸エステルである。適当な界面活性剤としては、例えば市販の湿潤剤、例えばＴｅｇｉｎ（Ｒ）、Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）又は５ｐａｎ　（Ｒ）が挙げられる。The liquid under aeration in a suitable medium under culture conditions normally used for the microorganism. Grow cultured bacteria. Next, the cultured bacteria were treated with 4-androstene-3,17-dione. Water-based! Add liquid 15 and ferment until maximum substrate conversion is reached. 4-Andro Aqueous suspensions of sten-3,17-dione can be prepared in a simple manner. For example, the substrate is mixed with 2 to 5 times the amount of water while adding a nonionic surfactant. The substrate is ground in a ball mill until the substrate has a particle size of approximately 1-5 μm. Appropriate Surfactants include, for example, ethylene oxide adducts of polyglycols or fatty acid esters. It is. Suitable surfactants include, for example, commercially available wetting agents such as Tegin ( R), Tween (R) or 5pan (R).

発酵を実施した後、培養菌を常法で後処理する１例えば難水溶性アルコール、ケトン又はエステルで抽出し、該抽出液を濃縮し、次いで得られた残留物をクロマトグラフィー及び／又は晶出により精製する。After fermentation, the cultured bacteria is post-treated using a conventional method. The extract was concentrated and the resulting residue was chromatographed. Purification by tography and/or crystallization.

得られた１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７〜ジオンの薬理学的に作用するステロイドへの次の処理は公知であるか、又は自体公知の方法で行う（Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓａｃ、、　９１，１９６９．１２２８以降：ヨーロッパ特許出願公開第０３０００６２号明細書、その他）。Pharmacology of the obtained 14α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione The subsequent treatments for steroids that act as (J, Amer, Chew, Sac, 91, 1969.1228 onwards) (Reference: European Patent Application Publication No. 0300062, etc.).

次に、本発明を以下の実施例につき詳細に説明する例。The invention will now be explained in detail with reference to the following examples.

ａ）コーンステイーブリーカー　１％大豆パウダー　１，２５％ｐＨ値６．２に調整を含有する無菌培地１リツトルを有する２リツトルの工−レンマイヤーに、カルブラリアルナータＮＲＲＬ２３８０培養薗の！！！濁液濁液５奢ｌ種し、３０℃ で６０時間、１分間に１８０回転で振盪させた。a) Corn staple breaker 1% Soybean powder 1.25% Adjust to pH value 6.2 In a 2 liter factory containing 1 liter of sterile medium containing Burarialnata NRRL2380 Culture Sono! ! ! Seed 5 liters of suspension, 30℃ The mixture was shaken at 180 revolutions per minute for 60 hours.

ｂ）ａ）に記載と同様の無菌培養液４０リツトルを有する５０リツトルの発酵槽に、カルブラリアルナータ増殖培１１リットルを接種し、３０’Ｃで１８時間、１時間に２ｍ３の通気及び１分間に２２０回転の撹拌下で温室した。b) 50 liter fermentor with 40 liters of sterile culture medium as described in a) was inoculated with 11 liters of Calburial Innata growth medium and incubated at 30'C for 18 hours. The greenhouse was kept under aeration of 2 m3 per hour and stirring at 220 revolutions per minute.

Ｃ）コーンステイーブリーカー　１％大豆パウダー　１．２５％ β−シクロデクストリン　０．３％ｐＨ値６，２に調整を含有する無菌培養液４０リツトルを有する５０リツトルの発酵槽に、カルブラリアルナータ前培養菌４リットルを接種し、１時間に２．４ｍ’の通気及び１分間に１５０回転の撹拌下で３０℃で７時間湿地した。C) Corn staple breaker 1% Soybean powder 1.25% β-cyclodextrin 0.3% Adjust to pH value 6.2 In a 50 liter fermenter containing 40 liters of sterile culture medium containing Inoculate 4 liters of Rialnata preculture, aerate 2.4 m' per hour and aerate for 1 minute. The mixture was wetted at 30° C. for 7 hours with stirring at 150 rpm.

次いで、該培養菌４−アンドロステン−３，１７−ジオン２５０ｇを粉砕物としてＴｗｅｅｎ（Ｒ）８０２５　ｇを有する水１０１００Ｏ中に加え、更に１２時間、１分間に２２０回転の撹拌及び１時間に２．４ｍ’の通気下で発酵させた。Next, 250 g of the cultured bacteria 4-androstene-3,17-dione was ground. and added to 10,100 O of water containing 8,025 g of Tween(R), and further added at 12 o'clock. Fermentation was carried out under stirring at 220 revolutions per minute and aeration of 2.4 m' per hour.

ｄ）発酵を実施した後に、該培養菌の液体をそれぞれメチルイソブチルケトン２０リツトルで３回抽出し、該抽出液を回転蒸発器中、最大５０℃で真空下で濃縮した。引続き、ヘキサン−アセトン傾斜を用いたシリカゲル上でのクロマトグラフィーによる精製を行った融点２５７〜２５９℃の１４α−ヒドロキシ−アンドロスタ−４−エン−３，１７−ジオン１５０ｇが得られた。d) After carrying out the fermentation, the liquid of the culture is treated with methyl isobutyl ketone 2 Extract 3 times with 0 liters and concentrate the extract under vacuum in a rotary evaporator at a maximum of 50 °C. did. Followed by chromatography on silica gel using a hexane-acetone gradient. 14α-hydroxy-and, melting point 257-259°C, purified by 150 g of rost-4-ene-3,17-dione were obtained.

国際調査報告　。、７１．。。５／ｎ１７゜７ＰＣＴ／ＥＰ　９２１０１７９７International search report. , 71. . . 5/n17゜7PCT/EP 92101797

Claims

【特許請求の範囲】[Claims]

１．カルブラリアルナータの培養菌を用いて４−アンドロステン−３，１７−ジオンを発酵させることによリ１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを製造する方法において、４−アンドロステン−３，１７−ジオンを水中に懸濁させ、得られた懸濁液を発酵させることを特徴とする、１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンの製造方法。1. 4-androstene-3,17-di- 14α-hydroxy-4-androstene-3,1 by fermenting In the method for producing 7-dione, 4-androstene-3,17-dione is 14α-hydrohydride, characterized in that it is suspended in water and the resulting suspension is fermented. A method for producing roxy-4-androstene-3,17-dione.

２．発酵させるために、カルブラリアルナータＮＲＲＬ２３８０の培養菌を使用する、請求項１記載の１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンの製造方法。2. For fermentation, a culture of Calbra Rialannata NRRL2380 was used. 14α-hydroxy-4-androstene-3,17-di according to claim 1, On manufacturing method.