JPH07501208A - α−グルコシド及びα−グルコシドエステルの酵素的製造方法並びにこのようにして得られた生成物の使用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 α−グルコシド及びα−グルコシドエステルの酵素的製造方法並びにこのように して得られた生成物の使用本発明は安価で多量に入手可能な原料（特に澱粉及び マルトデキストリン）から、またこれらを含み得る農産物原料（例えば小麦粉又 はカタクリ粉）から直接α−グルコシドを酵素によって立体特異的に製造する方 法に関する。本発明は更に、このようにして得られたα−グルコシドのエステル 化方法に関する。

澱粉は自然界に非常に広く分布している。実際、澱粉は植物の重要な栄養物とな り、冬眠中の茎又は塊茎の生命を維持し、また発芽中に胚芽を生長させるために 植物体によって多量に蓄えられている。

この物質が豊富であることを考慮して、工業的価値付けの試みが数多く行われて きた。大半の試みは加水分解反応を必要としていた。澱粉を希酸で加水分解し、 酸による完全な加水分解でＤ−グルコースを生成した。酸による加水分解を調整 して、温度を作用させれば、より高分子量のフラグメントであるデキストリンが 得られる。澱粉を酵素（アミラーゼ）で加水分解することもできる。

澱粉の加水分解生成物はグルコシドの製造に使用することができる。これらの化 合物、特にアルキル−グルコシドは、非イオン性で生分解性の界面活性剤及び洗 剤として有用である。これらは、医薬品、化粧品及び食品の乳化剤として使用す ることができる。

グルコースからのアルキルグルコシドの化学合成は既に開示されている（例えば ヨーロッパ特許出願公開第０３０１２９８号）。しかしながらこの種の化学的方 法は、非常に多くの異なる段階からなり得、常にα／β−アルキルモノグルコシ ドとα／β−アルキルポリグルコシドとのアノマー混合物を生成する。的確な物 理化学的特性をもたないこれらの混合物は、この物理化学的特性に関連してあら ゆる欠点を示し、特に正確な融点を持たないか、部位選択性がないか又は二次反 応が生起し得る。

マルトースからのアルキルグルコシドの酵素的製造も提案されている（Ｓ、Ｃ， Ｐａｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｖｏｗ、　９．　ｎ’８，１９７０． Ｉ）ｐ１８３３−１８３８及びＩｔａｎｏ　Ｋ、等、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　８７．　１９９０゜２７−３４）　。ＰａｎはＡｓｐｅ ｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇ供与体として用いたアルコール（例えばブタノール）の トランスグルコシル化を説明している。上清に含まれ、トランスグルコシル化に 作用する酵素は同定されていない。得られたアルキルグルコシドのアノマー配Ｗ （α又はβ）は確認されていない。ＩｔａｎＯは、マルトースをグルコース供与 体として、トランス−１，２−シクロヘキサンジオールをグルコース受容体とし て使用するシクロヘキサンジオールからのα−グルコシドの酵素的製造を説明し ている。

この反応は農産食品工業で使用される種々の酵素の未精製混合物を使用している 。これらの酵素の大半はヒドロラーゼである。これらの調製物は更に同定されて いない酵素を含んでいる。

これらの酵素的方法で得られる収率は低く、アルキルグルコシドを工業規模で合 成することはできない。更には、反応中に多数の酵素が存在するために、特に同 定されていないβ−グルコシダーゼ活性のために、得られた生成物のアノマー配 置を予測できないことがある。

最後に、Ｆｏｇａ　ｒ　ｔｙ等（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ 、　ｖｏｌ、　４．　１．６１〜６４゜１９８２）は、α−メチルグルコシドを グルコース供与体として用いたグリセロールの酵素的トランスグルコシル化によ るα−グリセロールグルコシドの生成を説明している。

この反応で使用されている酵素は、Ａ、　ｎｉｇｅｒの精製トランスグルコシダ ーゼである。記載の条件下では、グリセロールは非常に限定された数の基質に対 してしかグルコース受容体として作用し得ない。これらの結果は、トランスグル コシダーゼが多数の転移酵素と同様に比較的多数の受容体に作用し得るが、これ に対してトランスグルコシダーゼが使用できる基質、即ち供与体の数は非常に限 定されていることを示している。

本発明の目的は、工業規模での利用に適した高い収率が得られ、澱粉又はマルト デキストリン及び澱粉含量の多い農産物原料（例えば小麦粉又はカタクリ粉）を 原料として使用することのできるα−グルコシドの立体特異的製造方法を提供す ることである。探求する方法は単純で、直接的で、低コストでなければならない 。本発明の他の目的は、高付加価値化合物（例えばα−グルコシドエステル）の 生成を可能とする未精製の澱粉性材料（例えば澱粉又はマルトデキストリン）の 処理方法を提供することである。

驚くべきことに本発明者等は、澱粉又はマルトデキストリンを基質、即ち“グル コース供与体”として、アルコールを補助基質、即ち“グルコース受容体”とし て使用して酵素的にα−トランスグルコシル化することによってα−ゲルコンド を工業規模で製造できることを証明した。

ポリマー分子（例えば澱粉又はα−マルトデキストリン）がこの反応でグルコー ス供与体として作用し得るとは全く予想外であった。前述した如く、α−トラン スグルコシダーゼは比較的多数の受容体（この場合はアルコール）上にグルコシ ル残留物を転移させることができるが、基質としてはごく僅かの分子しか使用す ることができない。

本発明は特に、１個以上の官能基だけがヒドロキシル基である少なくとも１種の アルコールを、α−トランスグルコツル化活性を有する精製酵素調製物の存在下 で澱粉、マルトデキストリン又はマルトースと接触させることを特徴とする（α −グルコピラノシドの名称でも知られている）α−ゲルコンドの酵素的製造方法 に関する。

この方法によって得られる生成物は、少なくとも１個のグルコース分子とアルコ ールとからなるα−ゲルコンドであり、その炭素鎖の長さ及び構造は、反応に関 与したアルコールの種類によって異なる。生成物はβ−グルコシドを含まない。

あまり攻撃的でない反応条件下において、平均温度（２０°Ｃ〜７０℃、例えば ３０°Ｃ〜６０℃）に、３〜７、好ましくは４〜６のｐ　Ｈで生合成を実施する 。グルコースの分解物質の生成はこのようにして回避される。

本発明の明細書中の“α−トランスグルコシル化活性を有する”酵素調製物とは 、（澱粉からなるか、澱粉を含むか、澱粉氷解物からなるか又は澱粉氷解物を含 む原料から）アルコールにグルコース分子を転移させることのできる任意の酵素 調製物を意味する。

精製とは、 一酵素調製物が、使用条件下でα−グルコシド以外の物質の生成を触媒し得る他 の酵素活性をもたないこと、−酵素調製物が二次生成物の生成を回避するような ものであること −酵素調製物が特にβ−グルコシダーゼ活性をもたないこと を包含しなければならない。

酵素調製物は、α−トランスグルコシル化活性を有する単一の酵素からなり得る 。

酵素調製物は、各々がα−トランスグルコシル化活性を有するか又は前記酵素調 製物にα−トランスグルコシル化活性を与えるような共通の酵素活性を有する複 数の酵素からなってもよい。

“α−トランスグルコシラーゼとしても知られている“正真正銘の（ａｕｔｈｅ ｎｔｉｑｕｅ）　”α−トランスグルコシダーゼ、即ち転移酵素型の酵素が問題 となり得る。この型の酵素は通常、オリゴ糖を希培地（例えば１００ｇ／Ｌのマ ルトース）で合成できるとして認められている。

α−トランスグルコシダーゼとしては、菌性α−トランるα−トランスグルコシ ダーゼ）を挙げることができる。

が特に好ましい。これらの酵素を精製形態で使用することが有利であり、従って 調製物はβ−グルコシダーゼ活性をもたない。酵素調製物中にβ−グルコシダー ゼが存在すれば実際、α−ゲルコンドの立体特異的合成が妨げられる。

ＴＲＡＮＳＧＬＵＣＯ３ＩＤＡＳＥ−Ｌ　（Ａｍａｎ。

Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎＬｔｄ、　Ｊａｐｏｎ ）の商品名で市販されているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒのα−トラン スグルコシダーゼは通常β−グルコシダーゼを含まないので、本発明の方法では 更に精製せずに使用することができる。これに対して、（１，４−α−Ｄ−グル カンー６−α−Ｄ−グルコシダーゼは、追加の精製段階でイオン交換処理して、 β−グルコシダーゼを除去することが有利であるが、熱安定性が大きいという利 点を有する。この酵素はヨーロッパ特許出願公開第０２１９６７３号に開示され ている。

精製酵素混合物、例えば様々な型のきのこのα−トランスグルコシダーゼを使用 することも可能である。但し、他の酵素が存在せず、種々の酵素が同一条件で作 用する場合に限る。

α−トランスグルコシル化活性を有する酵素は、α−トランスグルコシル化反応 し得ることを“副次的”特性とする精製ヒドロラーゼであってもよい。この型の 酵素は一般に、グルコースを希培地（例えば１００ｇ／Ｌのマルトース）で生成 できるとして認識することができる。この型の酵素の例としてはヒドロラーゼ（ 例えばα−グルコシダーゼ）を挙げることができる。

これらの酵素はα−トランスグルコシル化以外の型の反応を生起し得るが、単に 澱粉、マルトデキストリン又はマルトースとアルコールとからなる反応媒体がα −グルコシドの生成を助ける。

本発明によれば、澱粉、マルトデキストリン若しくはマルトース又はこれらの物 質の混合物及びこれらの物質を含み得る農産物原料を基質、即ち“グルコース供 与体”として使用することが可能である。

マルトースは、基質として使用するときには、澱粉含有材料から得られた他の物 質との混合物の形態で存在し得る。

例えば基質が澱粉部分水解物のときに、マルトースはマルトデキストリンと一緒 に存在し得る。マルトースは単独でも使用できる。マルトースから得られるα− グルコシドの収率は時折、他の型の基質から得られるα−グルコシドの収率より も低く、例えば（以下の実施例１のように計算して）約１０〜１５％である。

マルトデキストリンは本発明の方法で特に好ましい基質、即ち“グルコース供与 体”となる。マルトデキストリンは、分子量が異なるオリゴ糖の混合物からなり 、グルコース単位間にα−１，４結合のみを有する澱粉部分水解物である。

マルトデキストリンは、澱粉の酸による部分加水分解によって又は澱粉の熱処理 若しくは酵素処理によって生成し得る。

この型の物質は市場でも入手可能であり、また高純度であるために、生成したα −グルコシドを医薬品工業で使用するときに特に好ましい。

本発明の方法の他の変形例によれば、基質、即ち“グルコース供与体”は可溶性 澱粉であってもよい。マルトデキストリンと同等のこの物質は、例えばリンドナ ー法に基づいて、酸による予備加水分解（ｐｒ６ｈｙｄｒｏｌｙｓｅ）で可溶化 した澱粉からなる。

本発明の特に好ましい他の実施態様によれば、基質は天然澱粉からなる。天然澱 粉源としては、穀物、塊茎及びマメ科植物並びに他のあらゆる植物を挙げること ができる。

好ましい穀物の中では、小麦、トウモロコシ、大麦、オート麦、米、ライ麦、ラ イ小麦（ライ麦と小麦との雑種）、そげ及びもろこしを挙げることができる。好 ましい塊茎はじゃがいも及びキャラサバである。えんどう及びたちなたまめはマ メ科植物の澱粉供給源である。穀物は全粒、（例えば粒を酵素処理、化学処理、 熱処理若しくは機械処理して得られた）細分粒、又は粒を粉砕して得られた他の 任意の物質（例えば小麦粉若しくはカタクリ粉）の形態で使用することができる 。

基質が天然澱粉のときには、α−トランスグルコシル化を生起し得る酵素の作用 をヒドロラーゼの作用と結合して、澱粉をα−トランスグルコシル化させ易くす る。ヒドロラーゼは媒質中で天然澱粉からマルトデキストリン及びマルトースを 解離する。媒質中に存在するアルコールをグルコシル化するα−トランスグルコ シダーゼはこれらの基質をグルコース供与体として使用する。ヒドロラーゼをα −トランスグルコシダーゼと同時に使用することが好ましい。

アミラーゼ［例えばα−アミラーゼ（Ｅ、Ｃ：３．２．１゜１）］を使用するこ とが好ましい。エンド−アミラーゼは、低分子量の分子（即ちグルコース）を解 離せずに、澱粉分子内で″エンド“切断するという利点を有する。実際にはα− トランスグルコシダーゼはグルコースを基質として使用することができない。従 って、アミラーゼでグルコースを生成すると、後でα−グルコシドを製造するこ とができない。マルトースはα−トランスグルコシダーゼの基質として作用し得 るが、このようにして得られたアルキルグルコシドの収率は、マルトデキストリ ン又は澱粉を使用する場合よりも低い。転移性グルコース対米使用のグルコース の比率は、マルトースの場合よりもマルトデキストリンの場合の方が高い。

アミラーゼとα−トランスグルコシダーゼとを同時に使用することが好ましく、 これら２種の酵素間で可溶性分子に対する競合が生じる。２種の酵素的方法を同 時に展開すると、収率が改善される。

澱粉に対するアミラーゼの作用は澱粉供給源の植物及びアミラーゼの種類によっ て異なる。

基質、酵素及びアルコールの相対濃度を以下に示すニー基質は約１０ｇ／ｌ〜約 ８００ｇ／］、特に約ｌｏｎｇ／ｌ〜約４００ｇ／ｌ −アルコールは約１０　ｇ／　１〜約８００　ｇ　／　Ｉ　’、特に約５０ｇ／ ｌ〜約４００ｇ／ｌ −酵素は約５Ｕ／ｍｌ〜約１ｏｏｏＵ／ｍｌ、特に約５゜Ｕ／ｍｌ〜約２００Ｕ ／ｍ１０ 本発明のグルコース受容体は一官能価のアルコール、即ちヒドロキシル基以外の 官能基をもたないアルコールである。異なるアルコールの混合物を使用すること ができる。

反応でグルコース受容体として作用し得、酵素活性を阻害しない全てのアルコー ルを使用することができる。

好ましいアルコールはアルカノール、エチレン系アルコール、アセチレン系アル コール、環状アルコール又はフェノールである。特に非環状アルコール、とりわ け例えば２〜２４個の炭素原子を有する飽和アルカノール及び飽和ポリオールが 好ましい。本発明の方法によれば、アルコールはｍ個アルコールであってもよい し、ポリオール（例えばジオール又はトリオール）であってもよい。ジオール（ 例えばプロパンジオール及びブタンジオール）が特に好ましい。第一アルコール 、第三アルコール及び第三アルコールを本発明の反応で使用することができ、第 一アルコール及び第三アルコールが特に有利である。

混和性又は少なくとも一部分が水溶性のアルコールが問題となり得る。この場合 、アルコールが２０℃で少なくとも２．７％ｖ　／　ｖの溶解度を示せば有利で ある。大抵の場合、これらのアルコールは１〜６個、しばしば１〜５個の炭素原 子を有する。

好ましい可溶性アルコールの例としては、イソプロパツール、ｎ−ブタノール、 イソ−ブタノール、イソ−ペンタノール、プロパツール、ペンタン−ジオール、 ヘキサン−ジオール、ブテン−１−オール−３、ブチン−１−オール−３、シク ロヘキサノール又はこれらのアルコールのうちの少なくとも２種の混合物を挙げ ることができる。反応は水性媒質中で継続され、アルコールはしばしばその限界 の溶解度で使用する。

アルコールが一部分水溶性のときには、本発明の方法を二相媒質（即ちアルコー ルがその限界溶解度より低い濃度で溶ける水性相、及び水性相と平衡状態にあっ て、緩衝液で飽和したアルコールからなる有機相）中で実施することができる。

二相媒質を使用するとα−グルコシドの収率に有利に作用する。この系は、α− トランスグルコシル化反応によって得られたα−グルコシドが一定の濃度以上で 酵素の基質となり得るときに特に有利である。例えばα−ブチルゲルコンドはα −トランスグルコシダーゼの基質として作用し得る。この場合反応は水性相で進 行し、α−グルコシドは水性相から有機相の方に抽出されるので、酵素によるグ ルコシドの破壊は避けられる。

エチレン系アルコール（例えばブテン−１−オール−３）を使用すると、グルコ シド内に不飽和結合が生じる。このため後でグルコシドを使用して、医薬用又は 化学用のキラルシントン（５ｙｎｔｈｏｎｓ）　（中間分子）を重合反応させる か又は調製することができる。

特に有利な実施態様によれば、可溶性アルコールは１〜５個の炭素原子を有する 一価アルカノールである。これらのアルコールは、アルキル鎖が１〜５個の炭素 原子を有するα−アルキルゲルコンドを生成する。

水不溶性アルコール（例えば６個以上の炭素原子、特に１２〜１８個の炭素原子 を有するアルカノール）又は脂肪アルコール（例えばドデシルアルコール、テト ラデシルアルコール、ヘキサデンルアルコール、オクタデシルアルコール、デシ ルアルコール、ウンデシルアルコール、トリデシルアルコール等のような第一脂 肪族アルコール）を使用することもできる。水不溶性アルコールとしてはステロ イドを挙げることもできる。脂肪アルコールを、脂肪アルコールの溶媒及びグル コース受容体として作用する部分的に水溶性の低級アルコール（１〜６個の炭素 原子）と−緒に使用することが有利である。

前述したような疎水性アルコールは、二相系（即ち水及び有機溶媒）を使用する 酵素的α−トランスグルコシル化反応に関与し得る。従って、疎水性アルコール はニトロベンゼンのような溶媒に溶解し、基質及び酵素は水溶液に溶解する。次 いで２種の溶液を混合して、撹拌する。中間相でα−トランスグルコシル化が生 じる。酵素活性が影響を受けない限り、他の有機溶媒（例えばアセトン）を使用 することも可能である。

アルキル鎖が１２〜１８個の炭素原子を有するα−アルキルグルコシドには界面 活性があるので、脂肪アルコールをアルコールとして使用することが特に好まし い。

本発明の方法で得られるα−グルコシドの収率はグルコース供与体及び抽出方法 によって異なる。例えば基質としてマルトデキストリン又は澱粉を、生成物を抽 出するために二相有機溶媒系を使用すると、収率は２０〜３０％に達し得る。マ ルトースでは収率は１０〜１５％になる。収率は以下のように計算する： α−グルコシド生成物（モル） α−グルコシド生成物＋グルコース生成物（モル）本発明の方法によって得られ る生成物は立体特異的（α）であり、通常はモノグルコシドである。例えば反応 媒質にα−アルキルゲルコンドを“補足的“基質として加えて、ジグルコシド、 即ちマルトシドを生成することが可能である。これらのマルトシドはグルコシド と非常に類似した特性を有する。

αアノマーにしか作用し得ない酵素、例えばα−グルコシダーゼで試料を加水分 解して、生成物の立体特異性を確認することができる。マルターゼはこの検査に 適しｔこα−グルコシダーゼの一例である。

本発明の生成物中にはβアノマーが存在しないので、し）くつかの物理的特性（ 例えばグルコシドの融点及び溶解度）が非常に厳密に定義される。一般に医薬品 工業、化粧品工業及び化学工業で使用するにはこのように厳密であれ１ｉ有利で ある。

更には、α−トランスグルコシル化する時に使用する酵素は精製状態である。従 って、本発明の生成物は、二次酵素反応によって生じる汚染物質がない。従って 、反応生成物を多数の段階で精製する必要はない。

本発明は更に、本発明の方法によって得られるα−グルコシド、特にα−アルキ ルグルコシドに関する。従って、これらの生成物は、通常化学的方法又は酵素混 合物を使用する酵素的方法によって生成するグルコシドには伴う汚染物質が存在 しないことを特徴とする。α−ブチルグルコシドは本発明の特に好ましい生成物 である。特に本発明のα−グルコシドは、二次酵素反応によって生じるβアノマ ーも汚染物質も含まない。

従って、反応媒質が生成物の他に、過剰アルコール、残留するグルコース供与体 及び反応中に生成したグルコースだけを含んでいればますます反応媒質からの生 成物の抽出は簡単になる。生成物の溶解度に応じて選択した適切な有機溶媒中に 抽出することができる。好ましい実施態様によれば、α−グルコシド（例えばα −ブチルグルコシド）の抽出は、抽出溶媒（例えばブタノール）の液体カラムを 用いて連続的に行う。この変形例によれば、まず反応媒質を固定化トランスグル コシダーゼを含む第１のカラムに通し、次いで液体抽出カラムに通す。アルコー ル化反応及び生成物の抽出は連続的に行われる。ブタノールの蒸発後にシロツブ 形態のα−ブチルグルコシドを回収する。ブタノールは再循環させて、基質とし て使用する。この型の二相抽出を使用すると、生成物の収率は３５〜４０％に達 する。

本発明に従って生成したグルコシドの用途は多い。

アルキルグルコシド、特にアルキル鎖が６個までの炭素原子を有するアルキルグ ルコシド（例えばα−ブチルグルコシド）を、相分離を生じないで粘度を変える ための液体洗剤及びエマルション用添加剤、とじて又はミクロエマルション中の 補助界面活性剤として使用することができる。実際、これらの分子内に疎水基と 親水基とが存在すれば、エマルション（例えば化粧クリーム及び薬用クリーム） でこれらの分子を使用してエマルションを不安定化させずにその特性を変えるこ とができる。本発明のグルコシドは天然材料から生合成によって製造する。これ らのグルコシドは前述の型の化粧品及び医薬品用途に特に適している。

アルキルグルコシド、特にα−ブチルゲルコンドは、例えばプラスチック、ゴム 及びＰｖＣ工業の添加剤として、またメラミン樹脂の柔軟剤として使用すること もできる。

α−ブチルグルコシドを使用すると、樹脂が壊れに（くなる。アルキルゲルコン ドは、工業用及び家庭用洗浄剤組成物又は保守製品組成物の添加剤として使用す ることもできる。

アルキル鎖が少なくとも８個の炭素原子を有するアルキルグルコシドは、起泡性 、潤滑性、乳化性及び水和性を示す非イオン性で生分解性の界面活性剤及び洗剤 として有用である。

アルキルグルコシドは立体特異的であり、植物原料から酵素的合成方法によって 得られるので、本発明の生成物は医薬品、化粧品又は食品で、例えば無毒性で非 刺激性の乳化剤として使用するのに特に適している。

本発明のグルコシドは、ポリエーテルポリオール（例えばポリウレタンを主成分 とする硬質フオーム）の製造でも優れた原料となる。このようにして得られた生 成物は、改善された熱安定性と、優れた物理的特性とを示す。グルコシド、特に アルキルグルコシドはアルキド樹脂及びポリエステルの製造ではポリオールとし て、重合反応で使用可能なモノマーの合成では化学的中間物質として使用するこ ともできる。

アルキル鎖が短い（Ｃ＋〜Ｃ６）本発明のアルキルゲルコンドは、例えばこのア ルキル鎖を少なくとも８個、好ましくは少なくとも１２個の炭素原子を有するア ルキル鎖に置換することによって界面活性剤の製造原料として使用することがで きる。アルキル鎖が長いこれらのアルキルグルコシドは優れた乳化性、起泡性を 示し、かつ生分解性である。

本発明の低級アルキルグルコシドを好ましくはＣ２位及び０６位でエステル化し て、他の型の界面活性剤を生成することができる。このようにして得られた乳化 剤は水和性を示し、生分解性でもある。

本発明の特に好ましい変形例によれば、α−グルコシドを脂肪酸又は種々の脂肪 酸の混合物及びリパーゼ活性を有する酵素調製物と接触させてα−グルコシドを 酵素的方法でエステル化する。この型の反応はＢｊＯｒｋｌｉｎｇ等によって説 明されている（Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、。

Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｍｍ、、　１９８９．　ｐ９３４−９３５）。この酵素的エス テル化反応を本発明のアルコール化反応と組合せると、澱粉、マルトデキストリ ン又はマルトースから純粋なα−グルコシドエステルを製造することができる。

アルコール化反応後にエステル化してもよいし、アルコール化と同時にエステル 化してもよい。

本発明のこの変形例によれば、α−グルコシドは好ましくは１〜５個の炭素原子 を有するアルキルグルコシド又はこれらのα−アルキルグルコシドの混合物であ る。α−ブチルグルコシドが特に好ましい。脂肪酸は８〜２０個の炭素原子を有 することが有利である。カプリル酸（Ｃ８）、カプリン酸（Ｃ＋ｏ）、ラウリン 酸（ＣＩ２）及びバルミチン酸（Ｃ＋ｓ）が特に好ましい。複数の脂肪酸の混合 物を使用することも可能である。

この実施態様では、リパーゼ活性を有する酵素調製物から得たリパーゼ］でエス テル化を触媒する。選択した脂肪酸と反応し得る任意のリパーゼを使用すること ができる。

単一の酵素を含む精製調製物又はリパーゼ活性を有する複数の酵素の混合物が問 題となり得る。リパーゼ活性を有する酵素は固体担体上に固定化させることがで きる。

エステル化反応は室温から約８０℃までの温度で行う。

但し、選択した脂肪酸が液状で、酵素が安定する温度とする。溶媒が存在しなけ れば、経済面及び環境面で重要な利点がある。

本発明のα−グルコシドを溶媒を用いずに酵素的エステル化して得られた生成物 は、モノエステルとジエステルとの混合物である。処理条件を最適化して、モノ エステルの収率を約８０％にすることができる。反応は部位特異的であり、まず Ｃ６位でエステル化し、次いで酵素によって０２、Ｃ３又は０４位でエステル化 する。ジエステルは２．６−ジエステルと、３．６−ジエステルと、４．６−ジ エステルとの混合物であり得る。この場合、生成物はモノエステルとジエステル 混合物とを含んでいる。好ましくはジエステルは２．６−ジエステルである。モ ノエステル濃度が一定以上になると酵素がα−グルコシドよりもむしろモノエス テルを基質として認職するので、ジエステルが多量に生成することは避けられな い。エステル化で１種の脂肪酸しか使用しないときに、ジエステルは同−基を２ 個有する。これに対して、２種の脂肪酸の混合物を使用する場合、ジエステルは 混合ジエステル（例えばブチル−２−０−ラウリル−６−０−ステアリル−α− Ｄ−グルコピラノシド）である。脂肪酸の選択によって、生成したエステルの特 性、特にＨ，Ｌ、Ｂ、（親水性／新油性バランス）は異なり得る。

適切な有機溶媒（例えば酸化ジエチル又は工業規模ではヘキサン）によってエス テル化生成物を反応媒質から抽出することができる。α−グルコシドと脂肪酸と が溶解しない任意の溶媒を使用することができる。有機溶媒を加えずにエステル を回収することもできる。固定化酵素を除去した後に生成物を精製せずにそのま ま使用することができる。

このようにして生成したα−グルコシドエステルは、通常低純度のグルコシドか ら又は化学的方法にょ７て得られたエステルで生じる二次反応の生成物もβアノ マーも含まない。これらのエステルは工業用途が多数あり、この型のエステルの 従来の任意の用途で使用できる。α〜グルコシドエステル、特にα−アルキルグ ルコシドエステルは、起泡性、乳化性、溶解性、水和性、分散性、湿潤性又は潤 滑性のような特性を有する非イオン性、非刺激性、無毒性及び生分解性の界面活 性剤である。α−グルコシドエステルを化粧品、医薬品、農産食品若しくは化学 品の添加剤として又は洗剤工業で界面活性剤若しくは漂白剤前駆体として使用す ることが有利である。農業では、植物衛生製品（特に除草剤、殺菌剤、殺虫剤） の効果を増すため、一般には栽培物及び農産品の処理のためにα−グルコシドエ ステルを不活性アジュバントとして使用することができる。

図面で本発明の種々の特徴を示す。特に、図ＩはＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｄｕ ｐｏｎｔｉのα−トランスグルコンダーゼを用いたマルトデキストリンがらのグ ルコース及びα−ブチルグルコシドの生成を示し、図２はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕ ｓ　ｎｉｇｅｒのトランスグルコシダーゼを用いて不溶性澱粉がらα−ブチルグ ルコシドを合成する媒質：液相媒質のＨＰ　Ｌ　Ｃクロマトグラムａ）反応時間 ：１０分 ｂ）反応時間　２３時間 Ｃ）α−β−ブチルグルコシド混合物 ルコンダーゼを用いて不溶性澱粉からα−ブチルグルコシドを合成する媒質・２ 種の液相媒質のＨＰ　Ｌ　Ｃクロマトグラム ａ）反応時間：１０分 ｂ）反応時間ニア時間 を示している。

実施例 一トランスグルコンダーゼを用いたブタノールの存在下での可溶性澱粉含有基質 からのα−ブチルグルコシドの生成以下の媒質ニ ーマルトース’　１００ｇ／ｌ −酢酸ナトリ’７ムＪｉｌ清液ｐＨ４，５：　５０ｍＭ−α−トランスグルコシ ダーゼ’　ＩＵ／ｍｌ中にて６０℃でα−トランスグルコシダーゼ活性を測定し た。

１５〜２４時間反応させた後に、反応中に生成したパノースの分離及び検出を可 能とするＨＰＬＣ技術（Ｄ　Ｉ　０ＮＥＸ　Ｃａｒｂｏｐａｃｋカラム、電流測 定による検出）で媒質を分析した。

１単位のα−トランスグルコンダーゼ（Ｕ）とは、前述した条件下で１マイクロ モル／時のパノース（６−０−α−Ｄ−グルコビラノンルーマルトース）の生成 を触媒する酵素の量である。

ｂ）α−ブチルグルコシドの生成： 以下の組成の水性媒質ニ ーブタノール・　９％（ｖ／ｖ） −酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４，５：　５０！ＩＭ−Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　 ｄｕｐｏｎｔｉのα−トランスグルコシダーゼ：　１００Ｕ／１１１−基質　１ ００ｇ／ｌ 中でα−ブチルグルコシドを生成した。

この媒質を５０℃の温度で７０時間インキュベートした。

採取し、水に希釈しく１／１０）、９０℃に加熱して、反応を停止させた。次い でカルシウム形態のイオン交換樹脂カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー （ＨＰＬＣ）で分析した。溶離剤は超高純度の水であった。

このような分析条件下で、α−ブチルグルコシドをβ−ブチルグルコシド、単糖 及びオリゴ糖から分離した。対応するピークの範囲によって、反応媒質中でのα −ブチルグルコシド濃度及び以下の式： ％式％（） で定義されるグルコースの転化率を計算することができる。

結果を表１に示す。

表１ニア０時間の反応後に可溶性基質から生成したα−ブチルグルコシド及び転 化率 基質　α−ブチルグルコシド（ｓＭ）　転化率（％）マルトース　２１　１０ マルトペンタオース　５０　１５ マルトデキストリン　４８　１９ 可溶性澱粉　４０　１５ 反応中にα−ブチルグルコシドとグルコースとが続いて生成した。これら２種の 生成物の濃度の推移を表１に示す。

本実施例で試験した４種の澱粉含有基質ではα−ブチルグルコシドが生成した。

マルトデキストリンの場合、α−−トランスグルコシダーゼを用いたブタノール の存在下での不溶性澱粉からのα−ブチルグルコシドの生成：反応媒質は実施例 １に記載の成分からなる。ここでは基質は不溶性澱粉である。不溶性基質の使用 を可能にするために、媒質中にＢａｃｉｌｌｕｓ　ｌｌｃｈｅｎｉｆｏｒ反応媒 質から採取したものを実施例１に記載のように処理したが、ＨＰＬＣに注入する 前に遠心分離にかけて、濾表２＝７０時間の反応後に不溶性澱粉から生成したα −ブチルグルコシド及び転化率 基質　α−ブチルグルコシド（ｍＭ）　転化率（％）不溶性澱粉＋　２８　１６ α−アミラーゼ 不溶性澱粉を反応の基質として使用することもできる。

実施例３：Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｄｕｐｏｎｔｉのα−トランスグルコシダ ーゼを用いた２種の液相媒質中での不溶性澱粉含有基質からのα−ブチルグルコ シドの生成：反応媒質は２種の液相からなり、その組成を以下に示す水性相（容 量：０．５ｍ１）ニ ーブタノール：　９％（Ｖ／Ｖ） −酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４，５二　５０＋＋Ｍ−Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　 ｄｕｐｏｎｔｉのα−トランスグルコシダーゼ：　１００Ｕ／ｍｌ−α−アミラ ーゼ　５〜５００Ｕ／ｍｌ有機相（容量二０．５又は２ｍ１） −酢酸ナトリウム緩衝液５０ｍＭ　（ｐＨ４，５）で飽和したブタノール 反応媒質を強く撹拌した後にそれぞれ採取して、実施例２に記載のように処理し た。

２通りの反応容量及び２種のα−アミラーゼ調製物を使用して複数の媒質を実験 した。媒質のα−アミラーゼ含量の影響も調べた。

反応媒質のＨＰＬＣ分析結果を表３及び表４に示す。

表３＝２種の液相媒質（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα− アミラーゼ、５Ｕ／ｍｌ）で７０時間反応させた後に生成したα−ブチルグルコ シド及び転化率 基質　α−ブチルグルコシド　転化率 反応容量（ｍｌ）　（ｍＭ）　（％） 不溶性澱粉 不溶性澱粉 ２、　５　２５　２３ 表４：２種の液相媒質（反応容量：１ｍ１）でＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｄｕｐ ｏｎｔｉのα−トランスグルコシダーゼを用いてトウモロコシ粉から生成したα −ブチルグルコシド及び転化率 α−アミラーゼの　α−ブチルグルコシド　転化率供給源及び活性　（ｓＭ）　 （％） ５Ｕ／ｍｌ　１４　２４ ５０Ｕ／鎗１　１５　１９ ５００Ｕ／ｍｌ　９　１４ ５０／ｍｌ　１０　１４ ５０Ｕ／匝１　１２　１７ ５００Ｕ／ｍｌ　９　１９ Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｄｕｐｏｎｔｉのα−トランスグルコシダーゼを用い たα−ブチルグルコシドの合成に穀物粗粉を使用することは十分に可能である。

２種の液相媒質を使用すれば、α−ブチルグルコシドの生成を改善することがで きる。１ｍｌ容量の媒質中で４６マイクロモルのα−ブチルグルコシドが合成さ れ、２．５ｍｌの媒質中では同量の基質及び酵素から６２．５マイクロモルのα −ブチルゲルコンドが合成されたことが表３で一トランスグルコシダーゼを用い たアルコール混合物の存在下での可溶性澱粉含有基質からのα−アルキルグルコ シドの生成。

３種の媒質の組成を以下に示すニ ーマルトデキストリン＋　１００ｇ／ｌ−Ｔａｌ１−Ｔａ１ａｒｏ　ｄｕｐｏｎ ｔｉのα−トランスグルコシダーゼ、　１００Ｕ／＋１−酢酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ４，５：　５０ｍＭ３種の媒質はｍ個アルコールの混合物を含んでいる。

試験１　試験２　試験３ ブタノール　９％　４５％　− ペンタノール　−　−２５％ イソプロパツール　−　２５％　４５％水　９１％　３０％　３０％ 媒質を５０℃で１２０時間インキュベートし、次いで実施例１に記載の方法で分 析した。分析結果を表５に示す。

表５：アルコール混合物（反応容量＋１ｍ１）の存在下で生成したアルキルゲル コンド 試験１　試験２　試験３ α−ブチルグルコンド イツプロピルーグルコシド ペンチル−グルコシド ランスグルコンダーゼを用いた不溶性澱粉からのα−ブチルグルコシドの生成 ２種の媒質を製造し、次いで実施例３に記載のプロトコルに従ってインキュベー トした。

水性相媒質（容量＋２０ｍ１） 一ブタノール＝　９％（Ｖ／Ｖ） −酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５，５＋　５０ｍＭ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ ｉｇｅｒのα−トランスグルコンダーゼ：１００Ｕ／ｌ１ｌ−Ｂａｃｉｌｌｕｓ 　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ　５１Ｊ／ｍｌ −不溶性澱粉　１００ｇ／１ ２種の液相媒質（容量：４０ｍ１） 水性相（容量：２０ｍ１）ニ ーブタノール＝　９％ −酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５，５：　５０ｍＭ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ ｉｇｅｒのα−トランスグルコシダーゼ：　１００Ｕ／ｍ１−Ｂａｃｉｌｌｕｓ 　１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｉｉｓのα−アミラーゼ　５０７ｍ１ −不溶性澱粉　１００ｇ／ｌ 有機相（容量：２０ｍ１）’： 酢酸ナトリウム緩衝液５０ｍＭ　（ｐＨ５，５）で飽和したブタノール これらの媒質を実施例３の方法で分析した。得られたクロマトグラムを図２及び 図３に示す。α−ブチルグルコシドの濃度は液相媒質中で１２ｇ／Ｉ　（５１ｍ Ｍ）　、２種の液相媒質中で７ｇ／Ｉ　（３０ｍＭ）であった。

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒのα−トランスグルコシダーゼはα−アル キルグルコシドの合成に十分効果るα−ブチルグルコシドのバルミチン酸エステ ルの生成：媒質の組成を以下に示すニ ーパルミチン酸（ＰＲＯＬＡＢＯ、フランス）　：　１０．８５ｇ−α−Ｄ−ブ チルグルコシド　１０ｇ α−Ｄ−ブチルグルコシドを実施例１の方法に従って製造した。

この混合物をパルミチン酸の溶融温度である７５℃に加熱した。ホモジナイズし た後に、固体担体（ＮＯＶＯＩｒ　ｍ１ｅｈｅｉのリパーゼ（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ 　（登録商標））１ｇを加えた。

３日間インキュベートした後に、反応媒質を２１０ｍ１の酸化ジエチル（ＳＤＳ 、フランス）で希釈し、次いで濾過してＬｉｐｏｚｙｍｅ　（登録商標）を除去 した。濾過後に５０ｍ１のソーダ（ＮａＯＨ，０，０２Ｎ）を加えて、水性相に ナトリウム塩形態の残留パルミチン酸及び残留α−プチルグルコシドを溶解した 。

バルミチン酸エステルを含む有機相（酸化ジエチル）を真空蒸発させて、残留溶 媒の全ての痕跡を除去した。

最終的に、１６．５ｇのエステル（α−Ｄ−ブチルグルコピラノシドのモジエス テル及びジエステル：ブチル−６−〇−パルミチルーα、Ｄ−グリコピラノシド 及びブチル−２，６−ジー０−パルミチルーα、Ｄ−グルコピラノシドの混合物 ）を得た。反応生成物をＭ、Ｃ，Ｃ，並びに陽子及び”ＣＮ、Ｍ、Ｒ，で分析し た。

実施例７：α−ブチルグルコシドの酵素的エステル化によるα−ブチルグルコシ ドのラウリン酸エステルの生成：媒質の組成を以下に示すニ ーラウリン酸（ＭＥＲＣＫ、ドイツ）＋　８．５ｇ−α−Ｄ−ブチルグルコシド ：　Ｌｏｇα−Ｄ−ブチルグルコシドを実施例１の方法に従って製造した。

この混合物を、ラウリン酸の溶解温度である４５℃に加熱した。ホモジナイズし た後に、固体担体（ＮＯＶＯＩｒ　ｍ１ｅｈｅｉのリパーゼ：Ｌｉｐｏｚｙｍｅ 　（登録商標）Ｉｇを加えた。

３日間インキュベートした後に、反応媒質を２１０ｍ　ｌの酸化ジエチル（ＳＤ Ｓ、フランス）で希釈し、次いで濾過してＬｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）を除去 した。濾過後１−１−５Ｏのソーダ（ＮａＯＨ，０，０２Ｎ）　を加エテ、水性 相にナトリウム塩形態の残留ラウリン酸及び残留α−ブチルグルコシドを溶解し た。

ラウリン酸エステルを含む有機相（酸化ジエチル）を真空蒸発させて、残留溶媒 の全ての痕跡を除去した。

最終的に、１５ｇのエステル（α−Ｄ−ブチルグルコピラノシドのモジエステル 及びジエステル：ブチル−６−０−ラウリル−α、Ｄ−グルコピラノシド及びブ チル−２゜６−ジー０−ラウリル−α、Ｄ−グルコピラノシドの混合物）を得た 。反応生成物をＭ、Ｃ，Ｃ，並びに陽子及び１３Ｃ−Ｎ、Ｍ、Ｒ，で分析した。

実施例８：α−ブチルグルコシドのステアリン酸エステルの製造： 以下の材料を使用して実施例７の方法を繰り返した。

−ステアリン酸：　１．２ｇ −α−Ｄ−ブチルグルコシド　１ｇ この混合物を７８℃に加熱して、０．１５ｇのＬｉｐ。

ｚｙｍｅ（登録商標）を加えた。

ＩＢＣ−Ｎ、Ｍ、Ｒ，で生成物を分析した。この生成物は主にブチル−６−０− ステアリル−α、Ｄ−グルコピラノシド（約８０％）とブチル−２，６−ジーＯ −ステアリル−α、Ｄ−グルコピラノシド（約２０％）とからなる混合物であっ た。

図１ 時間　時 図２Ａ 図２０ 図３Ａ 轡 和 Ｉ、−、、、−、−、、、、−ＰＣＴ／ＦＲ９２１００７８２国際調査報告　Ｆ Ｒ９２００７８２ Ｓ＾　６３８３１ １　・ ・　１

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．１個以上の官能基だけがヒドロキシル基である少なくとも１種のアルコール を、α−トランスグルコシル化活性を有する精製酵素調製物の存在下で澱粉、マ ルトデキストリン又はマルトースと接触させることを特徴とするα−グルコシド の酵素的製造方法。
2. ２．酵素調製物が、α−トランスグルコシル化活性を有する一種の酵素、又は各 々がα−トランスグルコシル化特性を有するか若しくは酵素調製物にα−トラン スグルコシル化活性を与える共通の酵素活性を有するような複数の酵素からなる ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ３．酵素が好ましくはきのこ（例えばＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓｄｕｐｏｎｔｉ又 はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）から得られるα−トランスグルコシダー ゼであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
4. ４．α−トランスグルコシダーゼがβ−グルコシダーゼ活性をもたないことを特 徴とする請求項１又は３に記載の方法。
5. ５．澱粉が天然澱粉の形態であり、α−トランスグルコシル化を生起し得る酵素 調製物の作用をヒドロラーゼ（例えばα−アミラーゼのようなエンドーアミラー ゼ）の作用と組合せることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の 方法。
6. ６．例えばエンドーアミラーゼとα−トランスグルコシダーゼとを同時に使用し て、２つの酵素反応を同時に展開させることを特徴とする請求項５に記載の方法 。
7. ７．天然澱粉が、穀物（例えば小麦、トウモロコシ、大麦、オート麦、米、ライ 麦、そば、もろこし及びライ小麦）、塊茎（例えばじゃがいも若しくはキャッサ バ）、マメ科植物（例えばえんどう若しくはたちなたまめ）又は他のあらゆる植 物から得られることを特徴とする請求項５又は６に記載の方法。
8. ８．穀物が全粒、例えば粒を酵素処理、化学処理、熟処理若しくは機械処理して 得られた細分粒、又は粒を粉砕して得られた任意の物質（例えば小麦粉若しくは カタクリ粉）の形態であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. ９．澱粉が、例えば酸又は酵素による予備加水分解で得られる可溶性澱粉の形態 であることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
10. １０．アルコールがアルカノール、エチレン系アルコール、アセチレン系アルコ ール、環状アルコール又はフェノールであることを特徴とする請求項１から９の いずれか一項に記載の方法。
11. １１．アルコールが一価アルコールであるか又はポリオール、好ましくはジオー ルであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
12. １２．１〜６個の炭素原子を有するアルコールが少なくとも部分的に水溶性であ り、好ましくは２０℃で少なくとも２．７％（ｖ／ｖ）の溶解度を示すことを特 徴とする請求項１０又は１１に記載の方法。
13. １３．アルコールを、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソーブタノール、 ｔ−ブタノール、イソーペンタノール、ヘキサン−ジオール、ブテン−１−オー ルー３、ブチン−１−オールー３又はこれらのアルコールのうちの少なくとも２ 種の混合物からなる群の中から選択することを特徴とする請求項１０から１２の いずれか一項に記載の方法。
14. １４．アルコールが１〜５個、特に４個の炭素原子を有するアルカノールであり 、前記方法の生成物がα−アルキルグルコシド、特にα−ブチルグルコシドであ ることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
15. １５．アルコールが第一脂肪族アルコール、例えば１２〜１８個の炭素原子を有 する脂肪アルコールであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
16. １６．２０〜７０℃、好ましくは２０〜５０℃に、３〜７、好ましくは４〜６の ｐＨで反応させることを特徴とする請求項１から１５のいずれか一項に記載の方 法。
17. １７．請求項１から１６のいずれか一項に記載のα−グルコシドを生成し、この ようにして得られた１種以上のα−グルコシドを少なくとも１種の脂肪酸及びリ パーゼ活性を有する酵素調製物と接触させ、このようにして得られたエステルを 回収することを特徴とする澱粉、マルトデキストリン又はマルトースからのα− グルコシドエステルの酵素的製造方法。
18. １８．脂肪酸が液体である温度でα−グルコシドを１種以上の脂肪酸及びリパー ゼと接触させ、反応媒質が溶媒を含まないことを特徴とする請求項１７に記載の 方法。
19. １９．α−グルコシドが、好ましくは１〜５個の炭素原子を有するα−アルキル グルコシドであり、脂肪酸が８〜２０個、好ましくは８〜１６個の炭素原子を有 することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
20. ２０．請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法で生成したα−グルコシド 。
21. ２１．請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法で生成したα−ブチルグル コシド。
22. ２２．請求項２０又は２１に記載のα−グルコシドの、化粧品工業、医薬品工業 若しくは農産食品工業の界面活性剤、洗剤、乳化剤としての又はプラスチック、 ゴム及びＰＶＣ工業の添加剤、例えば柔軟剤としての使用。
23. ２３．請求項２０又は２１に記載のα−グルコシド、例えばアルキル鎖が６個ま での炭素原子を有するα−アルキルグルコシドの、例えばエステル化又はトラン スグルコシル化による界面活性剤製造の原料としての又はポリエーテルポリオー ル、ポリエステル又はアルキド樹脂の製造でのポリオールとしての使用。
24. ２４．請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法で生成したα−グルコシ ドエステル。
25. ２５．請求項２４に記載のα−グルコシドエステルの、化粧品組成物、医薬品組 成物、農産食品組成物若しくは植物衛生品組成物で起泡性、乳化性、水和性、可 溶性を有する非イオン性で生分解性の界面活性剤としての又は化学組成物若しく は洗剤の界面活性剤若しくは漂白剤前駆体としての使用。
26. ２６．天然澱粉、穀物扮又はマルトデキストリンの処理方法であって、α−トラ ンスグルコシル化活性を有する精製酵素調製物の存在下で、前記基質を、１個以 上の官能基だけがヒドロキシル基であるアルコールと接触させることを特徴とす る方法。