JPH07500972A

JPH07500972A - 非放出性ヘルペスウイルス生ワクチン

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Publication number: JPH07500972A
Application number: JP6504922A
Authority: JP
Inventors: ビツセル，ニコラース; フアン・ウエンセル，ペトルス・アルフオンスス・マリア; メツテンレイテル，トーマス・クリストフ
Original assignee: アクゾ・ノベル・エヌ・ベー
Priority date: 1992-07-30
Filing date: 1993-06-28
Publication date: 1995-02-02
Also published as: WO1994003595A1; DE69333751T2; DE69333751D1; EP0606437B1; ATE288483T1; AU4560693A; EP0606437A1; US5626850A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】９、前記ヘルペスウィルスが、ｇＤ相同体をコードする遺伝子中に欠失及び／または挿入を与えた結果として機能性ｇＤ相同体を産生ずる能力のないことを特徴とする請求項８に記載の非相補性細胞系。

１０、前記ヘルペスウィルスが偏性狂犬病ウィルスであることを特徴とする請求項８または９に記載の非相補性細胞系。

１１、前記ヘルペスウィルスがｇＩ−及び／またはｔｋ−であることを特徴とする請求項８からｌＯのいずれか一項に記載の非相補性細胞系。

１２、前記ヘルペスウィルスのゲノムが、病原体の抗原をコードする異種ＤＮＡ配列を含むことを特徴とする請求項８から１１のいずれか一項に記載の非相補性細胞系。

１３、請求項８から１２のいずれか一項に記載の非相補性細胞系から誘導される細胞を含むヘルペスウィルス生ワクチン。

明　細　書非放出性ヘルペスウィルス生ワクチン本発明は、ヘルペスウィルス生ワクチンに係わる。

現在、数種のヘルペスウィルスワクチン、即ち不活化ウィルスワクチン、サブユニットワクチン及び変性生ウィルス（ＭＬＶ）ワクチンが施用されている。

不活化ウィルスワクチンは、感染性生ウイルス物質を含まず、ウィルスの毒性状態への復帰の可能性が排除されているという利点を有する。

しかしながら、不活化ウィルスワクチン及びサブユニットワクチンは大量のワクチン有効成分を製造する必要があり、製造するのに高価である。更にこれらのタイプのワクチンは、有効で且つ長期持続性のある免疫を与えるためには、アジュバントの存在下にワクチンを数回接種する必要がある。

ＭＬｖワクチンは、大量の有効成分を必要とせず、アジュバントの不在下に、体液性及び細胞性の両方の、迅速で且つ長期持続性のある免疫応答を誘導するという重要な利点を有する。

しかしながら、かかるワクチンは、生ワクチンが自然経路によって、例えば鼻腔内に投与される場合には特に、ワクチンウイルスが被接種動物によって環境内に放出されるという危険性を担っている。

ＭＬＶワクチンは安全で且つ効果的であることが立証されているが、ワクチンウィルスがより毒性の状態に復帰したり、ＭＬＶが、ＭＬＶワクチンウィルスにより感受性の他の動物特に、遺伝子操作によって変性された微生物、とりわけ外来遺伝子を発現する生きた微生物をベースとするワクチンに関する規制機関による危険性評価において、かかる微生物の環境への放出の可能性の局面は極めて重要である。

従って、生ウイルス接種の利点を示すが、被接種動物に限定されるヘルペスウィルスワクチンが極めて望ましいことが理解される。

ヘルペスウィルスのエンベロープ糖タンパク質は、ヘルペスウィルス感染に対する免疫応答の主要ターゲットである。更にかかる糖タンパク質は、ウィルスとその宿主細胞との相互作用に重要である。

偽性狂犬病ウィルス（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ　ｖｉｒｕｓ、　ＰＲＹ）は、ブタにおいてアウジエスキー病と称される経済的に重要な疾患を惹起するヘルペスウィルスである。ＰＲＹの糖タンパク質Ｄ　（ｇＤ）相同体（糖タンパク質５０．　ｇｐ５０）は、感染宿主動物において感染防御免疫を誘導するための最も強力なＰＲＶの主要免疫原であると明記されている（Ｅｌｏｉｔ、　Ｍ、ｅＭｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ、　Ｔ、　Ｃ，、Ｃａｍｐ、ｒｍｍｕｎｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｎｆｅｃｔ。

８９４〜９０５．１９９２）は、ｇｐ５０を発現する細胞系において増殖させた結果、表現型がｇｐ５０陽性であるｇｐ５ｏ陰性（ｇｐ５０−）あるが、ウィルスの細胞−細胞拡散には必要でないと結論されている。

本発明の目的は、感染防御免疫応答を誘導することにおいて有効であると共に、生ウィルスを環境中に放出するレベルが低減されることから安全であり、従って肛Ｖワクチンの効力と不活化ワクチンの安全性を合わせ持つヘルペスウィルス生ワクチンを提供することである。

本発明は、ヘルペスウィルス生ワクチンが、ヘルペスウィルスがｇＤ相同体で相補化され機能性ｇＤ相同体を産生ずる能力のない生きたヘルペスウィルスを含むことを特徴とする。

本明細書においてｇＤ相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）とは、十分に特性分析されている単純ヘルペスウィルス（Ｈ３Ｖ）の糖タンパク質りに有意な相同性を示す特定のヘルペスウィルスの糖タンパク質を意味する。数種のヘルペスウィルスｇＤ相同体及びかかる相同体をコードする遺伝子が従来技術において既に記載されており、例えばＰＲＹのｇＤ相同体、即ちｇｐ５０　（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ、　Ｅ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５９．２１６〜２２３゜１９８６）　、ウシヘルペスウィルス−１、即ちｇＩＶ　（Ｔｉｋｏｏ、　Ｓ。

Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６４．５１３２〜５１４２．１９９０）及びウマヘルペスウィルス−１（Ｆｌｏｗｅｒｓ、　Ｃ，Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　出、１７５〜１８４．１９９１）が記載されている。

本発明によれば、第１の特性に従って感染動物において機能性ｇＤ相同体を産生ずる能力のない生きたヘルペスウィルスを含む生ワクチンは、被接種宿主動物において感染防御免疫応答を驚くほど誘導するが、予防接種した動物からウィルス放出されることはない。

機能性ｇＤ相同体を産生ずる能力のないウィルスとは以下のように説明される：宿主動物内でのウィルスの複製において、ｇＤ遺伝子が機能性遺伝子産物を発現しない。

機能性ｇＤ遺伝子産物は、精製ヘルペスウィルスが適当な宿主細胞に感染することを可能にするｇＤ遺伝子産物である。

このことは、ｇＤ相同体をコードする遺伝子内または前記糖タンパク質の発現を制御する領域内に、好ましくは組換えＤＮＡ技術を使用して突然変異を導入することにより行ない得る。

突然変異とは、上記領域内の遺伝情報が、天然ヘルペスウィルスのゲノムの当該領域内、に存在する遺伝情報とは変更されていることと理解されたい。突然変異は例えば、機能性ｇＤ相同体を産生できないヘルペスウィルスを生じる結果となる核酸の置換、欠失、挿入もしくは逆位、またはこれらの組合せである。

欠失は例えば、ベクター中に挿入されたｇＤ相同体遺伝子を、ｇＤ相同体遺伝子の１箇所以上の適当な制限によって切断し、次いでベクターＤＮＡを連結することにより生成し得る。

或いは、前記遺伝子を１つの部位で切断し、次いで末端ヌクレオチドを除去すべくエンドヌクレアーゼ処理して遺伝子を全部または一部除去し、ベクターＤＮ＾を連結してもよい。この処理の結果、例えば機能性遺伝子産物のコーディングに必要なりＮＡ配列の読み枠の変性または除去によって機能性ｇＤ相同体遺伝子産物がもはや発現し得な０よう、ヘルペスウィルスＤＮＡが修飾される。

本発明の好ましい実施態様においては、全ｇＤ相同体遺伝子を内包するゲノム内に欠失を含むウィルスを含むヘルペスウィルス生ワクチンが使用される。

ヘルペスウィルスのｇＤ相同体遺伝子内に異種ＤＮＡを挿入すると、ウィルスの機能性ｇＤ相同体を発現すること力（できな（なり得る。

異種ＤＮＡの挿入は、１つ以上の制限酵素部位を含む二重鎖リンカ−を使用したり、ホモポリマーテーリング法（ｈ。

ｍｏｐｏｌｙｍｅｒ　ｔａｉｌｉｎｇ）によるなどのよく知られた方法１こよって行ない得る。“異種ＤＮＡ”なる用語は、ポリペプチドをコードしないか、または不活化すべき遺伝子と同じ由来のｇＤ相同体遺伝子以外のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を意味する。

非コーディング異種ＤＮＡの長さ及び配列は限定的ではないが、好ましくは長さ８〜５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む。適当な二重鎖オリゴヌクレオチドは、適当な制限酵素切断部位に加えて、３つの翻訳終結コドンを両方向において考え得る読み枠の各々に含む。

例えばｉｎ　ｖｉｖｏ相同組相同法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ″、第２版、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８９　；　Ｒｏｉｚｍａｎ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｊｅｎｋｉｎｓ、　Ｆ、Ｊ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２発明に必要なｇＤ相同体遺伝子内の欠失及び／または挿入を生成し得る。

簡単に述べると、ｇＤ相同体遺伝子を含むＤＮＡフラグメントをヘルペスウィルスゲノムＤＮＡから単離する。

次いでこのフラグメントをベクター中にクローニングすることができる。選択可能なマーカーを含む任意の細菌プラスミドまたはバクテリオファージベクターを使用し得る。

かかるクローニングベクターの例としては、プラスミドｐＢＲ３２２またはその誘導体、種々のｐＵＣ及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド並びにバクテリオファージλ及びＭ１３が挙げられる。

ｇＤ相同体遺伝子欠失体及び／または異種ＤＮＡ挿入体の全部または一部を含む組換えベクターは、上述のごとく使用することができる。

次いで所望の突然変異を有する組換えベクターを選択し、標準形質転換方法を使用して宿主細胞中で増殖させ得る。

ベクターを増殖させ得る任意の宿主細胞を使用し得る。例えばＥ、　ｃｏｌｉはｐＢＲ３２２の増殖に適した宿主である。

各ｇＤ相同体陰性ヘルペスウィルスがその中で複製し得る適当な宿主が、組換えベクターとへルペスウイルスゲノムとの対応領域間で組換えが生じる標準的な同時トランスフェクション方法に適用される。

そうして、細胞培養液中に組換えウィルス子孫が産生されたら、それを、例えばハイブリダイゼーションや、ｇＤ相同体遺伝子内の突然変異に伴なって導入された遺伝子によってコードされる酵素活性または抗原活性を検出することにより、遺伝子型及び表現型によって選択し得る。次いで所望のヘルペスウィルスを適当な細胞培養液において大規模に培養し、細胞培養液から該ウィルスを回収し得る。

感染動物において機能性ｇＤ相同体を産生ずる能力のない生きたヘルペスウィルスを得る別の方法は、ｇＤ相同体遺伝子を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞培養液中ではｇＤ相同体を発現するが、接種宿主動物においては発現しないようにｇＤ相同体の発現を制御し得る特定のヌクレオチド配列の制御下に置くことによるものである。このような発現制御配列の例はプロモーター及びエンハンサ−である。

好ましくは、ｇＤ相同体遺伝子を誘導性調節ヌクレオチド配列の制御下に置く。

この種の誘導性調節ヌクレオチド配列は、例えば、ホルモン、医薬、金属イオンなどの特定の物理的または化学的刺激の作用下にのみ働（調節ヌクレオチド配列である。かかる誘導性調節ヌクレオチド配列の適当な例としてはメタロチオネインプロモーター及び熱シヨツクプロモーターが挙げられる。

本発明のワクチン中に存在する生きたヘルペスウィルスの好ましい第２の特性は、該ヘルペスウィルスがｇＤ相同体タンパク質で相補化されることである。このようなウィルスは、適当な宿主系、即ち要求されるｇＤ相同体を発現し得る相補性細胞系において遺伝子型がｇＤ−のヘルペスウイルスを増殖させることにより得られる。

かかる相補性細胞系は、それぞれの親ヘルペスウィルスに感受性を示す細胞系を、ｇＤ相同体遺伝子を含むプラスミドを用いて、トランスフェクションまたは電気穿孔法のごとき標準方法によって形質転換することにより得られる。

ｇＤ相同体を含む細胞を与える別の方法は、細胞を、ｇＤ相同体遺伝子をもつ組換えレトロウィルスまたは非組込み型組換えウィルス、例えばｇＤ相同体遺伝子をもつワクシニアウィルスに感染させることである。

ｇＤ相同体産生細胞系は、ｇＤ相同体遺伝子をもつウィルスとｇＤ合成において欠陥のあるヘルペスウィルスとに同時感染（即ち共感染）させることにより得られる。

次いで、免疫学的スクリーニングよって細胞のｇＤ相同体発現を試験し得る。

本発明のワクチンウィルスは、ｇＤ相同体遺伝子を含む相補性細胞系によって遺伝子型がｇＤ−のヘルペスウィルスが救済されることを防ぐため、突然変異へルペスウイルスゲノム内のＤＮＡ配列と相同なヘルペスウィルスＤＮＡ配列を含まない相補性細胞系において生成されるのが好ましい。

ウィルスに欠損している遺伝子産物を相補する細胞において欠損ウィルスを増殖させることは、潜在的な“救済（ｒｅｓｃｕｉｎｇ）”の危険性を有する。救済とは、この場合には細胞とウィルスとの間で遺伝情報を交換すること、特に適正な細胞遺伝情報と欠損ウィルスゲノムとの間で交換することにより、失われた遺伝情報を再取得することを意味する。そうして、失われた遺伝情報が救済されたことによりそれらの“親の”特性を保持するウィルスが形成される。

この方法は”復帰（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）ｍとも称され、例えば救済によって失われた情報を保持したウィルスは“復帰体（ｒｅｖｅｒｔａｎｔｓ）”とも称される。この特定のケースにおいて、救済されたウィルスは表現型でも遺伝子型でもｇＤ相同体陽性であり、従って完全に感染性である。これは勿論、極めて起こりにくい状況ではある。

救済の主な原因は、所謂相同組換えによる遺伝情報の交換である。この現象は、頻度は低いが、（例えば細胞及びウィルスＤＮＡ内の）異なる位置に存在する相同ＤＮＡ領域（即ち同一または極めて近縁のＤＮＡ配列を有する領域）が相互に交換するときに起こる。このプロセスは、“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ″　（Ｓｔｅｒｎｅｒ、第３版、　１９８８．　ｐ６８８〜６９３）に記載されている。

細胞の親ｇＤ相同体の左右のフランキング配列と、ウィルスゲノムの欠損ｇＤ相同体のフランキング配列とが同じ細胞内に存在すると、これは原則として相同組換えをもたらし、従って野生型ウィルスが形成されることは明らかである。このようなプロセスはＣａｉら（Ｊ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ、；６２／８　：　２５９６〜２６０４　（１９８８）　）によって記載されている。相同組換えの別の例は、ｖａｎ　Ｚｉｊｌら（Ｊ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ、；　６２／６：　２１９１〜２１９５　（１９８８）　）によって記載されており、彼らは、重複相同部分を有するフラグメントからヘルペスウィルスを再構成するために相同組換えを使用している。

相補性細胞がウィルスＤＮＡと相同な配列を含まないならば、相同組換えの危険性は回避され得る。このことは例えば、ウィルスからはフランキング配列由来の１つ以上のヌクレオチドを含むｇＤ相同体の遺伝情報を欠失させ、一方で相補性細胞には、フランキング配列を含まないｇＤ相同体のみの遺伝情報を与えることにより達成し得る。

極めて稀に、即ち極端に低い頻度で、非相同配列間の組換えが起こる。これは例えばＭｅｙｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ　；　３４１　：　４１９（１９８９）　）によって記載されている。この異種組換えは、ＤＮＡ複製に固有のものであるが故に、完全には回避し得ない。しかしながら、ｇＤ相同体遺伝子の右側または左側のフランキング配列しか除去しないと、他の部位が相同組換えする傾向は維持される。該部位における相同組換えがｇＤ相同体遺伝子の他の部位におけるランダムな異種組換えと同時に起こると、これは不本意な救済事象をもたらす。

従って、本発明のワクチンの好ましい形態においては、ｇＤ相同体相補性を与えるＤＮＡフラグメントは、左右両方のフランキング領域にあるウィルスＤＮＡ配列と相同な配列を含まない。

また、遺伝子型がｇＤ−である生きたヘルペスウィルスは、ワクチンが該ヘルペスウィルスを細胞随伴形態、例えば感染細胞の懸濁物として含んでいるのであれば、相補性細胞系において増殖する必要なしに、本発明のワクチンの調製に使用し得る。

複製型ウィルスを含む複製細胞系をｇＤ相同体不在下に維持することは可能である。この細胞系の細胞を、同じまたは適合性の細胞系のウィルス非含有細胞と混合すると、細胞と細胞の接触によって、培養液中の全ての細胞が感染し、ウィルスを付随的に増殖することにより、表現型及び遺伝子型の両方でｇＤ相同体を含まないウィルスを含む細胞が与えられる。

上記細胞系は、ｇＤ相同体をコードする遺伝子における欠失及び／または挿入の結果として機能性ｇＤ相同体を産生ずる能力のないヘルペスウィルスを含み得る。該細胞系は更に、ｔｋ−もしくはｇＩ−のごとき追加欠失及び／または前述もしくは後述の異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝子が与え本発明のヘルペスウィルス生ワクチンは、偏性狂犬病ウィルス、ウシヘルペスウィルス、ネコヘルペスウィルス、マレック病ウィルス及びウマヘルペスウィルスからなる群から誘導し得る。

本発明の好ましい実施態様においては、ヘルペスウィルスが偏性狂犬病ウィルスであるヘルペスウィルス生ワクチンが提供される。

ＰＲＹのｇＤ相同体をコードする遺伝子（ｇｐ５０）は、Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓら（前出）によって位置及び配列が決定されている。

ｇｐ５ｏ相補性細胞系は、任意の感受性細胞系、例えばＲａｕｈ及びＭｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ　（前出）によって記載されているようなＭＤＢＫまたはＢＩＩＫ細胞から誘導し得る。

ＢＨＶ−１ノｇＤ相同体遺伝子（ｇｐ■■）ハ、Ｔｉｋｏｏ、　Ｓ、に、う（前出）によって記載されている。ＢＨＶ　ｇｐｒｖ相補性細胞系は例えばＭＤＢＫ細胞（Ｆｅｈｌｅｒ、　Ｆ、ら、前出）から誘導し得る。

ＥＨＶ−１のｇＤ相同体遺伝子は、Ｆｌｏｗｅｒｓ、　Ｃ，Ｃ，ら（前出）によって特性分析されている。相補性細胞系を誘導し得るＥＨＶ−１感受性細胞は例えばＢＨＫまたはＶｅｒｏ細胞である。

本発明のワクチンの調製に使用される他の適当な細胞系は例えばＣＲＦＫ細胞（ＦＨＶ）またｉ；ｔＱＴ３５細胞（ＭＤＶ）　−ｒある。

本発明のヘルペスウィルス生ワクチンのヘルペスウィルス突然変異体は、ヘルペスウィルスを弱毒化したり、または血清学的に同定可能なマーカーを導入する結果となる別の突然変異を含むのが好ましい。これは、毒性関連遺伝子またはヘルペスウィルスの非必須糖タンパク質をコードする遺伝子内にそれぞれ欠失または挿入を組換えＤＮＡ技術によって導入することにより行ない得る。チミジン−キナーゼ（ｔｋ）遺伝子の全部または一部を欠失することにより数種のヘルペスウィルスか弱毒化されることは当分野においてヨ＜知うレテイル（ＰＲｖ：米国特許第４．６０９．５４８号；ＢＨｖ−１：欧州特許出願第０２２６０２９号、　ＦＨＶ　：　ＰＣＴ出願第９０１０１５４７号、　ＥＨＶ−４：　ＰＣＴ出願第９２１０１０４５号）。ヘルペスウィルスの毒性の弱毒化は、プロティンキナーゼをコードする遺伝子内に欠失を導入することによっても行ない得る（　ＰＣＴ出願第９０１００１１９号）。

更に、血清学的に同定可能なマーカーとなるヘルペスウィルス糖タンパク質の遺伝子の欠失も記載されている（ＰＲｖ：ｇＩ、欧州特許出願第０１４１４５８号；ｇＸ、欧州特許出願第０２６３２０７号、　ＢＨＶ−１：　ｇ　ＩＩＩ、欧州特許出願第０３１６６５８号）。

本発明の好ましいワクチンは、ｇｐ５０−である上に遺伝子型がｇｌ−及び／またはｔｋ−である生ＰＲＹを含む。

本発明は更に、動物においてヘルペスウィルスに対する感染防御免疫応答を誘導し得、上述のごとく放出性が低下されたことを特徴とし、更に、好ましくは病原体に対する感染防御免疫応答を惹起し得る病原体の抗原である所望のタンパク質を発現する能力があるヘルペスウィルス生ワクチンを提供する。

かかるベクターワクチンにおいては、通常は各ヘルペスウィルスと無関係のポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列が、挿入領域、即ちヘルペスウィルスの実質的な機能、例えばｇＤ相同体遺伝子を含む感染または複製に必要なものを破壊することなく該異種ＤＮＡ配列の組込みに使用し得る領域内に挿入される。

ヘルペスウィルスのゲノム中に挿入すべき病原体の抗原をコードする特定の異種ＤＮＡ配列は限定的ではなく、宿主動物に対する上述のヘルペスウィルス突然変異体の特異性に従う。例えば、本発明のＰＲＹ生ワクチンに挿入される異種ＤＮＡ配列は、ブタコレラウィルス、バルボウイルス、インフルエンザウィルス、Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａＳＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　５ｕｉｓまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのごときブタ病原体の抗原をコードし得る。

上述のヘルペスウィルス突然変異体による異種ＤＮＡ配列の発現の必須要件は、異種ＤＮＡ配列に操作的に結合される適当なプロモーターである。プロモーターの選択が、５Ｖ−４０プロモーター（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２２．５２４〜５２７．１９８３）　、または、例えばメタロチオネインプロモーター（Ｎａｔｕｒｅ、　２９６゜３９〜４２．１９８２）　、熱シヨツクプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙ、　ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．４９４９〜５３．１９８５）、ヒトサイトメガロウィルスＩＥプロモーターもしくはヘルペスウィルスゲノム中に存在する他のプロモーターといった、ヘルペスウィルス突然変異体に感染した細胞において遺伝子転写を誘導し得る任意の真核性、原核性またはウィルス性プロモーターに及ぶことは当業者には明らかである。

ヘルペスウィルスから誘導されるベクターウィルスワク〜４９３８．１９９０及び欧州特許出願第３８９．０３４号に記載のごと免疫原としての有効量の上記生きたヘルペスウィルス突然変異体のほかに、本発明のワクチンは、医薬的に容認可能な担体または希釈剤を含み得る。

本発明に有効な医薬的に容認可能な担体または希釈剤の例としては、ＳＰＧ＾のごとき安定化剤、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、グルコース、デキストラン）、アルブミンもしくはカゼインといったタンパク質、ウシ血清もしくはスキムミルクといったタンパク質含有剤、及び緩衝液（例えばリン酸緩衝液）が挙げられる。

場合によっては、アジュバント活性を有する１種以上の化合物をワクチンに加えることもできる。適当なアジュバントとしては例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムもしくは酸化アルミニウム、油性エマルジョン（例えばＢａｙｏｌ　Ｆ　（登録商標）またはＭａｒｃｏｌ　５２　（登録商標）、サポニンまたはビタミンＥ溶解物（５ｏｌｕｂｉｌｉｓａｔｅ）が挙げられる。

有効な投与量は、予防接種される哺乳動物の年齢、体重、投与形態、並びに予防接種対象の病原体のタイプに応じて変化する。

適当な用量は例えば約１０４〜１０’ｐｆｕ／動物の範囲である。

動物に投与するために、本発明のワクチンは特に鼻腔内、皮内、皮下または筋肉内に与え得る。

実施例１：Ａ）遺伝子型ｇｐ５０−表現型ｇｐ５０”　ＰＲＹ突然変異体の構築この実験においてはＰＲＹ株ＮＩ＾−３を親株として使用した。

Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎（ＭＤＢＫ）細胞においてウィルスを増殖させた。

ｇｐ５０−発現細胞系の構築には、ＰＲＹゲノムＢａｍＨＩ　−Ｓａｌ　Ｉ　ＤＮＡフラグメント（Ｂａａ＋ＨＩ−７Ｂ）を含むプラスミドを、ｇｐ５０遺伝子を推定上の５゛末端プロモーターエレメントから分離するＢｓｔＸＩを用いて切断した。Ｔ４ポリメラーゼを用いてプラント末端化した後、Ｂａｎ旧リンカ−（ＢＲＬ、　Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ、***）を挿入し、プラスミドを再連結した。

次いでＢａｍＨＩ及び５ａｉｌで切断し、ｇｐ５０遺伝子の５′末端を含む５５２ｂｐのフラグメントを取り出し、これをｐＢＲ３２２中にクローニングした。

３、３４６ｂｐ　Ｓａｌ　Ｉ　−３ｐｈ　ｌフラグメントをＳａｌ１部位に挿入することにより完全なｇｐ５０遺伝子を組み立てた。続いてＢａｍＨＩ及びＤｒａ　Ｉを用いて切断し、２．４３３ｂｐフラグメントを切り出した。このフラグメントは、ｇｐ５０及びｇｐ６３をコードする遺伝子（ｇｐ５０−６３）と３′ 末端ｍＲＮ＾プロセシングシグナルとを内包する完全発現単位を含んでいた。次いでこのフラグメントをマウスメタロチオネインプロモーター（Ｂｒ１ｎｓｔｅｒ、　Ｒ，Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅｌ　２７．２２３〜２３１．１９８１）の後ろにクローニングし、プラスミドｐＭＴ５０−６３を得た。安定に形質転換されたｇｐ５０発現細胞系を樹立するため、ＭＤＢＫ細胞を、リン酸カルシウム沈降法（Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、Ｌ、　、　ｅｔ　ａｌ、、　ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２．４５６〜４６７、１９７３；　５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｐ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　１ｉｏｌ。

Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、１．３２７〜３４１．１９８２）によって、プラスミドｐＭＴ５０−６３及びｐｓＶ２−ｎｅｏを用いて同時トランスフェクトした。

Ｒａｕｈ、Ｉ５．　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６５．６２１〜６３１．　１９９１に記載のごと＜　、Ｇ４１８耐性コロニーを選択した。１００μｍのＺｎＳＯ４を用いてプロモーターを誘導した後、ｇｐ５０発現を蛍光免疫法によって検証した。更なる調査のため、細胞系ＭＴ５０−３を選択した。

ｇｐ５０陰性ＰＲＹ突然変異体を単離するため、ＰＲＹ糖タンパク質ｇＸプロモーターの制御下にある大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む３．５ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−Ｂａｍ■■発現カセット（Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ、　Ｔ、　Ｃ，ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３０．５５〜６６、１９９０）を、ｇｐ５０遺伝子のなかにあるＳａｌ１部位内に挿入し、プラスミドＴＴ１３３／ＩＩＩを作製した。一時的発現アッセイは、このクローンが機能性β−ガラクトシダーゼを発現する能力があることを示した。

プラスミドＴＴ１３３／ＩＩＩをＰＲＶ野生型ＮＩＡ−３ＤＮＡと共１．：ＭＴ５０−３細胞中に同時トランスフェクトした。完全な細胞変性効果を誘導した後、上清を回収し、清澄化させ、ウィルス子孫（ｖｉｒｕｓ　ｐｒｏｇｅｎｙ）を、連続希釈系列のＭＴ５０−３細胞上に塗り広げた。２日後、プラークが目視可能になったとき、細胞上に、ｌｌ１１１当たり３００ｕｇのＢｌｕｏ−Ｇａｌ　（ＢＲＬ）を含むアガローズ培地を重層した。Ｂｌｕｏ　−Ｇａ１層下で全てのプラークが染色されるまで、ＭＴ５０−３細胞上で３回、青色に染色されたプラークを採取し、精製した。この突然変異体を更なる実験に使用した。

Ｂ）マウスにおける予防接種実験種々の突然変異体の毒性を分析するため、６週齢雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、ｇＸ −または表現型相補化ｇＤ５０−ＰＲＶのいずれかを１０’　ＰＦＵ含むウィルス懸濁液１０μｍを用いて鼻腔内感染させた。この感染用量は、ｇ）（−ＰＲＹ感染動物において１００％致死率をもたらすと確定されているが、接種材料中に有意であった。少なくとも８時間ごとに、マウスのＰＲＹ感染症状を観察した。

死亡寸前の動物を犠牲にし、その脳ホモジネートにおける感染ウィルスの存在を、野生型且つｇＸ−ＰＲｖ１表現型相補化ｇｐ５０−ＰＲＹ、及び全ての推定上救済されたピリオンがプラークを形成するはずであるｇｌＩ発現ＭＴ−３細胞上で滴定することにより分析した。このためには、脳を取り出し、液体窒素中で急速凍結し、ｌａ＋１当たり１００μｇのゲンタマイシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、***）を補充した最少必須培地中でホモジナイズし、ＭＴ−３単層上に塗り広げた。１時間吸着させた後、単層をリン酸緩衝塩水溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）でよく洗浄し、ゲンタマイシンを補充したメチルセルロース培地を重層した。感染後（ｐ、ｉ、）　２〜３日たってから、プラークを数えた。組織検査用の器官は、顕微鏡分析のために感染細胞の数を増加すべく５０μｍ中に１０’ＰＦ［＋を用いて鼻腔内感染させた死亡寸前のマウスから取り出した。

マウスにおけるＰＲＹの毒性に及ぼす非機能性ｇｐ５０の作用ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、−次感染後の表現型相補化（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ、ｅｄ）　ｇｐ５０−ＰＲＹは、細胞−細胞直接伝染によって拡散し得る。このｉｎ　ｖｉｔｒｏ表現型がｉｎ　ｖｉｖｏ特性においてどのように変換されるか分析するため、マウスを、ＮＩＡ−３及びＫａの雨林のｇＸ　−ＰＲＹ　（これは正常野生型と同様に挙動する）または表現型相補化ｇｐ５０−突然変異体のいずれかを１０’ＰＦＵ用いて鼻腔内感染させた。表現型相補化の後のｇｐ５０−突然変異体は、同種同系の（ｉｓｏｇｅｎｉｃ）　ｇＸ−突然変異体と同様に、全ての動物において症状を誘導し且つ死を招き得ると見られた。更に、野生型ウィルス感染とｇｐ５０−突然変異株ウィルス感染とで、発症及び死亡までの平均時間に有意な差はなかった。非相補化ｇｐ５０−ピリオンでは推定通り疾患の徴候は全く認められず、これは、ターゲット細胞に感染する能力のないことを反映している。かかる結果は、−次感染後、ｇｐ５０がマウス鼻腔内感染後のＰＲＶの毒性に必ずしも必要ではないことを示している。

マウスの表現型相補化ｇｐｓｏ−ｐＲｖ感染後の遊離感染性ウィルスの検出ｇｐ５ｏは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでピリオンがターゲット細胞中に侵入するのに必要である。従って、非相補性細胞の一次感染後に表現型相補化ウィルス突然変異体により放出されるピリオンは非感染性である。ｉｎ　ｖｉｖｏでも同様の結果が認められるか試験するため、疾患の徴候を全く示さなかった死亡寸前のｇＸ− またはｇｌ）５０−ＰＲＹ感染マウスを同時に殺し、その脳ホモジネートを、ｇＩＩ発現ＭＴ−３細胞におけるウィルスの再単離に使用した（表１）。かかる細胞において、全ての推定上は感染性のピリオン、即ちｇＸ−もしくは表現型相補化または救済ｇｐ５０−ＰＲＹはプラークを形成するはずであった。

全てのｇＸ−ＰＲＹ感染動物由来のウィルスの再単離はうまく行ったが、表現型相補化ｇｐ５０−ＰＲＶによる感染後は、被検動物は重度の症状を表わし、死亡寸前であったにも拘わらず、遊離感染性ウィルスは検出されなかった。ｇ　ＩＩ −ＰＲＹ感染動物から感染性ウィルスは回収されなかった。

Ｃ）ブタにおける予防接種実験６週齢の同腹子（１グループ当たり３頭の被検動物）を、ＮＩＡ−３株から誘導したｇＸ−βｇａｌ　（ｇＸ−）またはｇｐ５ｏ−βｇａｌ　（ｇｐ５０−）　ＰＲＹ突然変異体１０’ＰＦＵを用いて鼻腔内感染させた。被検動物に、呼吸系または神経系の症状及び発熱といった疾患の徴候が認められた。鼻孔スワブを毎日採取し、Ｍ丁＝３細胞において滴定し、感染性ウィルスの放出を検出した。

感染の２７日後、この実験の生存動物（１頭のｇＸ　−ＰＲＶ感染動物は死亡した）から採血し、中和抗体力価及び抗ｇｐ５０抗体の存在を判定した。相補体依存性及び非依存性中和力価はプラーク減少アッセイ（ｐｌａｑｕｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）を用いて測定した。示された力価は、５０％プラーク減少を与える血清希釈を示す。感染８週間後、被検動物に３Ｘ　１０”ＰＦＵの野生型株ＮＩＡ−３を鼻腔内攻撃感染した。再び疾患の徴候が認められ、体温を記録し、鼻孔スワブのウィルス放出を分析した。

ブタにおけるｇｌ）５０−ＰＲＹ毒性の測定ＰＲＹ天然宿主におけるウィルス突然変異体の挙動を確定するため、６週齢のブタ３頭を、高度に毒性のＮＩＡ−３株から誘導したｇＸ−またはｇｐ５ｏ−突然変異体１０’　ＰＦＵを用いて鼻腔内感染させた。被検動物にＡＤの徴候が認められ、鼻孔スワブを分析することによりウィルスの放出をモニターした。表２（実験Ａ）から判るように、ｇＸ−突然変異体に感染したブタは重度の呼吸系及び神経系の症状を示した。

１頭の死亡寸前の被検動物を犠牲にした。全ての被検動物が長期間の発熱及び鼻孔スワブ中のウィルス分泌を示した。

これとは対照的に、表現型相補化ｇｌ）５０−ＰＲＹによる感染後は、軽度の主に呼吸系の症状が起きただけであった。唯一の他の疾患の徴候は後足の僅かな虚弱であった。発熱期間はずっと短（、鼻孔スワブから感染性ウィルスは回収されなかった。

株ＮＩＡ−３からｇｐ５０を欠失すると、ブタにおいてはその毒性が低下するが、ウィルスは明らかに尚も呼吸窮迫及び発熱を惹起し得ると結論し得る。感染の２７日後に生存動物から採取した血清から、ｇＸ−及びｇｐ５０−　ＰＲＹ感染グループにおいて中和抗体の存在が示された（表２）。

マウスにおいてはｇｐ５０の欠失はＰＲＹの毒性にほとんどまたは全（影響しないが（実施例ＩＢ参照）、天然宿主であるブタにおいては毒性が高度に低下されることは全く驚くべきである。

ｇｐ５０−ＰＲＹによる感染後の毒性攻撃に対する防御の測定ｇＸ−または表現型相補化ｇｌ）５０−ＰＲＹによる前感染後の動物が、毒性ウィルスによる攻撃から防御されているか調査するため、−次感染の８週間後に、全てのブタを３　Ｘ　１０”ＰＦＵの高度毒性ＮＩＡ−３株を用いて鼻腔内攻撃した。結果は表２の反応を示し、僅かな発熱を伴なっただけで、攻撃ウィルスの放出はなかった。

ｇｐ５０−ＰＲＹ感染ブタは極めて軽度のＡＤ痒症状示し、発熱は少なかったが、幾分かのウィルス放出が起こった。要約すると、上記結果は、ブタの表現型相補化ｇｌ）５０−ＰＲＹ突然変異体の感染は、有意な感染防御免疫応答を誘導することを示している。

実施例２　：　ＰＲＹ四重突然変異体（ｑｕａｄｒｕｐ１６　ＰＲＹ　ｍｕｔａｎｔ）の構築復帰体の形成を完全に排除するため、四重突然変異体を作製した。この突然変異体は、ＰＲＹ由来のｇＸ、　ｇｐ５０、ｇｐ６３及びｇＩ遺伝子にまたがるＵＳ領域内に欠失を有する。この突然変異体においては、ｇｐ５０遺伝子の両側にあるｇｐ５０発現細胞系と重複するＰＲＹ配列は存在しなかった。従って、該細胞系のｇｐｓａと突然変異ＰＲＹとの相同組換えは不可能となっている（Ｃａｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６２．２５９６〜２６０４　［１９８ｇ］　；　Ｐｅｅｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６６、　８９４〜９０５　［１９９２］；　Ｐｅｅｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６６、　３３８８〜３８９２　［１９９２］　）。ｇｌ遺伝子は該根絶プログラムにおいてワクチンウィルスと野生型ウィルスとを区別するために使用されるが故に、ｇｌ遺伝子はワクチン点から欠失する必要がある。更に、かかる全ての欠失により、四重突然変異体は、病原性が極めて低く、使用するに安全とされる必要がある。

プラスミドＴＴ−２６４は、糖タンパク質ｇＸ遺伝子のプロモーターを内包する約３００ｂｐのＳａｔ　Ｉ　／　ＢａｍＨＩフラグメントであるプラスミドｐＵｃ１８の多重クローニング部位を有する変性ｐＢＲ３２２を含む。ｇＸ遺伝子のＢａＵａＨＩ部位に、Ｅ、ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子を融合すると、このＢａｍｌｌＩ部位を失活させる結果となった（Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ　ａｎｄＲａｕｈ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　３０．　５５〜６６、　１９９０）　。ＬａｃＺの３′部位で、ＰＲＶｇｌ遺伝子の３ ′末端、ＩＩＫ遺伝子、及び２８Ｉく遺伝子の５°末端を内包する１、　４ｋｂのＳｐｈ　Ｉ　／　ＢａｍＨＩフラグメントを、残りのＢａｍＨＩ部位に挿入した。これは、１．４ｋｂフラグメントのＢａｍＨＩ付着端をＬａｃＺ遺伝子の３ ′末端にあるＢａｍＩＩＩ部位に連結し、次いで、クレノウ／Ｔ４ポリメラーゼを用いて残りのＢａｍＨＩ／　Ｓｐｈ　Ｉ末端をプラント末端化した後、ベクターをプラント末端で連結し、この箇所でＢａａ＋ＨＩ部位を修復することにより行なった。制限消化によって正しい向きであることを検証した。得られたプラスミドは、５′部位から３′部位へ向かって、ＰＲＹ　ｇＸプロモーター、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ＰＲＶｇＩ遺伝子ノ３′部位、ＰＲＹ　ＩＩＫ遺伝子、及びＰＲＹ　２８に遺伝子の５゛末端を含んだ。次いでこのプラスミドを、リン酸カルシウム沈降法（Ｇｒａｈａｌ＋　ｅｔ　ａｌ、、　１９７３．　ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２．４５６〜４６７）によって、ＰＲＹのＫａｐｆａｎ株由来のＤＮＡと共にｇｐ５ｏ産生ＭＤＢＫ細胞中に同時トランスフェクトした。ウィルス子孫を、青色プラーク表現型の出現に関してスクリーニングした。青色プラークを採取し、精製し、サザンブロッティングによって分析した。ｇＸプロモーターから出発してｇＩ遺伝子の５′部位で終わり、ＰＲＹのｇＸ、　ｇｐ５０、ｇｐｓａ及びｇＩ遺伝子の５゛部分を除いた正しい欠失の存在を確認した（図１）。

ｇｐ５０発現細胞系において培養したウィルス子孫を更に予防接種実験に使用した。

実施例３　：　ｇｐ５０発現細胞系の構築ＰＲＹ四重突然変異体を表現型においてｇｐ５ｏタンパク質と相補性にするため、ｇｐ５０発現細胞系を作製した。

ｇｐ５０発現細胞系の構築は、Ｒａｕｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇ）ｌ　６５．５３４８〜５３５６に記載のごと〈実施した。　ＰＲＶゲノムＢａｍＨＩ−Ｓａｌ　Ｉ　ＤＮＡフラグメントを含むプラスミドを、ｇｐ５０遺伝子をその推定上の５′末端プロモーターエレメントから分離するＢｓｔＸＩを用いて切断した（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ、　１９８６．　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、　５９　：　２１６〜２２３）　、　Ｔ４ポリメラーゼを用いてプラント末端化した後、Ｂａａ＋ＨＩリンカ−（ＢＲＬ）を挿入し、プラスミドを再連結した。ＢａｍＨＩ及びＳａｔ　Ｉを用いて切断し、ｇｐ５０遺伝子の５” 部分を含む５２２ｂｐフラグメントを取り出し、これをｐＢＲ３２２中にクローニングした。３．３４６　ｂｐ　Ｓａｌ　Ｉ　−５ｐｈ　ＩフラグメントをＳａｌ１部位に挿入することにより、完全ｇｐ５０遺伝子を組み立てた。次いでＢａｍＨＩ及びＤｒａ　Ｉで切断して２、４３３ｂｐフラグメントを切り出した。このフラグメントは、ｇｐ５０及びｇｐ６３をコードする遺伝子並びに３′末端ｍＲＮＡプロセシングシグナルを内包する完全発現単位を含んでいた。

次いでこのフラグメントを、マウスメタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８１．　Ｃｅ１ｌ　２７．２２３〜２３１）の後ろにクローニングした。安定な形質転換ｇｐ５ｏ発現細胞系を樹立するため、このプラスミドを、リン酸カルシウム沈降法（Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７３．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　５２．４５６〜４５７）によって、ｐｓＶ２− ｎｅｏプラスミド（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２゜ＪｏＭｏｌ、＾ｐｐ１．Ｇｅｎｅｔ、　ｌ、　３２７〜３４１）と共にＭ［ｌＢＫ細胞中に同時トランスフェクトした。６４１８耐性コロニーを選択し、選択した細胞を更に、ｇｐ５ｏの発現について、ｇｐ５０特異的ＭＡｂを用いて選択した。

実施例４：ＰＲＶ四重突然変異体を用いたブタの予防接種ＰＲＶ四重突然変異体を用いた実験においては、７頭の４〜５週齢のブタに、１被検動物当たり１０’ のＴＣＩＤ５０を筋肉的予防接種した。予防接種の３週間後、７頭の予防接種したブタと５頭の未処置のブタとに、１０’　ＴＣＩＤ５０のＰＲＹ株７５Ｖ１９を用いて鼻腔内攻撃した。被検動物の臨床的徴候、即ち体温、体重増加及びウィルス分泌をモニターした。四重突然変異体を予防接種した後では、臨床的徴候も発熱も認められなかった。

攻撃後、５頭の対照のうち２頭は死亡し、７．７４／−０，５日間の発熱、１１日以上の成長遅滞、及び？＋／−１，４日間のウィルス分泌が認められた。ＰＲＹ四重突然変異体を予防接種したブタにおいては、全てが生存し、４．７＋／− １，２日間の発熱、５、５＋／−１日間の成長遅滞、及び５．２＋／−０，５日間のウィルス分泌が認められた。対照と比較して明らかな一次接種効果が認められ、予防接種したブタにおいては中和抗体の存在が対照よりも早く認められた上に、その力価は著しく高かった。平均体温、鼻孔スワブ中のウィルス分泌、及び相対的成長のグラフをそれぞれ図２．３及び４に示す。

上記結果は、ｇＸ−、ｇｐ５０−１ｇｐ６３−及ヒｇ　Ｉ　−ＰＲＶ突然変異体を予防接種したブタは、アウジエスキー病の臨床的徴候に対して一部防御されていることを示している。

実施例５：細胞定着四重突然変異体（ｃｅｌｌ　ｂｏｕｎｄ　ｑｕａｄｒｕｐｌｅ　ｍｕｔａｎｔ）表現型及び遺伝子型がｇｐ５０陰性のＰＲＹを発現する細胞を得るため、５μｇの四成分ＤＮＡをＶｅｒｏ細胞中にＣａＣ１ｚ法を用いてトランスフェクトした。四成分発現Ｖｅｒｏ細胞を維持及び増殖させるため、細胞を７０％ＣＰＥを示すまで維持した。

次いで細胞をトリプシン処理し、未感染Ｖｅｒｏ細胞と比ｌ：５で混合し、０．２Ｘ　１０’細胞／ｃｍ２の密度で播種した。滴定のため、細胞を培地で希釈し、未感染細胞と混合し、塗り広げた。

実施例６：細胞定着四重突然変異体を用いた予防接種細胞定着ＰＲＹ四重突然変異体を用いた実験において、７頭ずつ２グループの４〜５週齢のブタに、１０” 　’ｐｆｕ／動物及び１０’ｐｆｕ／動物を筋肉的予防接種した。予防接種の３週間後、予防接種したブタと５頭の未処置のブタとに、１０フＴＣＩＤ５０のＰＲｖ株７５　Ｖ１９を鼻腔内攻撃した。被検動物の臨床的徴候、即ち体温、体重増加、及びウィルス分泌を毎日モニターした。

細胞定着四重突然変異体を予防接種した後では、いずれのグループにおいても臨床的徴候も発熱も認められなかった。

この実験においても、表現型ｇｐ５０陽性四重突然変異体を試験したのと同じ対照を使用した。攻撃後、５頭の対照のうち２頭は死亡し、７．７＋／−０，５日間の発熱、１１日以上の成長遅滞、及び７＋／−１，４日間のウィルス分泌が認められた。

細胞定着ＰＲＹ四重突然変異体を予防接種したブタにおいては、全てが生存した。１０Ｓ”ｐｆｕを予防接種したブタにおいては、６．１＋／−１，１日間の発熱、８＋／−１，５日間の成長遅滞、及び５．４＋／−０，７日間のウィルス分泌が認められた。攻撃時、予防接種したブタのいずれもＰＲＹに対する中和抗体を持たなかった。１０’ｐｆｕを予防接種したブタにおいては、６．３＋／−２，６日間の発熱、９．２＋／−１，２日間の成長遅滞、及び６．９＋／−０゜８日間のウィルス分泌が認められた。攻撃時、予防接種したブタのいずれもＰＲＹに対する中和抗体を持たなかった。

平均体温、鼻孔スワブ中のウィルス分泌、中和抗体及び相対的成長のグラフをそれぞれ図２．３及び４に示す。

細胞定着四重突然変異体を予防接種した後、両グループの被検動物は一部防御されている。対照と比較して、発熱、ウィルス分泌及び成長遅滞はより短い期間で認められた。

成長遅滞に及ぼす作用は図４に最もよく示されている。成長遅滞の期間が対照と比較して著しく短いだけでなく、体重の絶対的低下も未処置の被検動物より著しく少ない。この実験においては、四重突然変異体が野生型ＰＲＹによる攻撃に対して防御作用を有することが示されただけでなく、細胞定着ウィルスを保有する細胞全体を用いて予防接種することによってもブタの防御が誘導され得ることが初めて示された。

図面の説明図１゜ＰＲＹ親株、四重突然変異体、及びＭＤＢＫ細胞系中に安定に形質転換されたＰＲＹ遺伝子フラグメントのＵｓ領領域ゲノムマツプを示す。

図２゜四重突然変異体を予防接種したブタ及び予防接種をしていないブタの、攻撃の２６日前から１１日後までの体温を示す。

予防接種は一２１日に実施しており、攻撃は０日に実施した。

図３、四重突然変異体を予防接種したブタ及び予防接種をしていないブタの攻撃の１日後から１ｏ日後までのウィルス分泌を示す。

図４゜四重突然変異体を予防接種したブタ及び予防接種をしていないブタの攻撃の８日前から１ｏ日後までの相対的成長を示す。

表１．ｇＸ−またはｇｐ５０−ＰＲＹ感染マウスがらのウィルス単離ｇＸ−４＋＋　２．６Ｘ１０’ ｇｐ５０−　４　、　＋＋　ＯＮＩ＾−３ｇｘ−３＋＋　１．０Ｘ１０’ フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｎ　５１０６Ｃ１２Ｒ１：９１）（Ｃ１２Ｎ　１５１０９ＣＩ２Ｒ１：９１）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＺ。

ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、５Ｄ、ＳＫ、　ＤＡ、　ＵＳＦＩ（７２）発明者　メツテンレイチル、トーマス・クリストフドイツ連邦共和国、デー−７４００・ツエビンゲン、パイスドルンベーク・１４／１７３

Claims

【特許請求の範囲】

１．感染動物において機能性ｇＤ相同体を産生する能力のない生きたヘルペスウイルスを含むヘルペスウイルス生ワクチン。
２．前記ヘルペスウイルスがｇＤ相同体で相補化されることを特徴とする請求項１に記載のヘルペスウイルス生ワクチン。
３．ウイルスＤＮＡが、ｇＤ相同体をコードするＤＮＡフラグメントの左右の末端領域に、ｇＤ相同体相補体を与える細胞中に存在するｇＤ相同体をコードするＤＮＡフラグメントの配列と相同の配列を含まないことを特徴とする請求項２に記載のヘルペスウイルス生ワクチン。
４．前記ヘルペスウイルスが、ｇＤ相同体をコードする遺伝子中に欠失及び／または挿入を与えた結果として機能性ｇＤ相同体を産生する能力のないことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のヘルペスウイルス生ワクチン。
５．前記ヘルペスウイルスが偽性狂犬病ウイルスであることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載のヘルペスウイルス生ワクチン。
６．前記ヘルペスウイルスがｇＩ−及び／またはｔｋ−であることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載のヘルペスウイルス生ワクチン。
７．前記ヘルペスウイルスのゲノムが、病原体の抗原をコードする異種ＤＮＡ配列を含むことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載のヘルペスウイルス生ワクチン。
８．請求項１に記載の生きたヘルペスウイルスを含む非相補性細胞系。
９．前記ヘルペスウイルスが、ｇＤ相同体をコードする遺伝子中に欠失及び／または挿入を与えた結果として機能性ｇＤ相同体を産生する能力のないことを特徴とする請求項８に記載の非相補性細胞系。
１０．前記ヘルペスウイルスが偽性狂犬病ウイルスであることを特徴とする請求項８または９に記載の非相補性細胞系。
１１．前記ヘルペスウイルスがｇＩ−及び／またはｔｋ−であることを特徴とする請求項８から１０のいずれか一項に記載の非相補性細胞系。
１２．前記ヘルペスウイルスのゲノムが、病原体の抗原をコードする異種ＤＮＡ配列を含むことを特徴とする請求項８から１１のいずれか一項に記載の非相補性細胞系。
１３．請求項８から１２のいずれか一項に記載の非相補性細胞系から誘導される細胞を含むヘルペスウイルス生ワクチン。