JPH07500721A - Novel integrin β subunits and their uses - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 新規なインテグリンβサブユニッ１〜及びその使用本研究は、米国国立衛生研究 所からの研究登録番号ＨＬ／ＡＬ３３２５９、ＣＡ−４７５４１及びＣＡ−４７ ８５８によって一部支援された。合衆国政府がこの発明についての権利を有する 。[Detailed description of the invention] Novel integrin β subunit 1~ and its use This research was supported by the US National Institutes of Health. Research registration numbers HL/AL33259, CA-47541 and CA-47 from Partly supported by 858. The United States Government has rights to this invention. .

技術分野 この発明は、接着ペプチドとしてのりセブターに関し、特に細胞外マトリクス分 子に対して親和性を有する新規なりセブターサブユニットに関する。Technical field This invention relates to glue septar as an adhesion peptide, particularly for extracellular matrix components. This invention relates to a novel septer subunit that has affinity for children.

従来の技術 ヒトのような多細胞生物は、最低でも５０の、例えば血液細胞及び神経細胞のよ うな、異なるタイプに***され得る１０１４個の細胞を有する。成長及び発達の 過程において、細胞は他の細胞又は細胞外物質と、特定の又は通常の方法で接着 する。Conventional technology Multicellular organisms such as humans have at least 50 cells, such as blood cells and nerve cells. It has 1014 cells that can be divided into different types. growth and development In the process, cells adhere to other cells or extracellular substances in a specific or regular way. do.

この様な細胞接着機構は、細胞成長、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）及び分化の仲 介様式において重要であるように思われ、これによって細胞は、例えば筋肉細胞 又は肝細胞として作用するように特定の性質へ発達する。細胞接着機構は、分化 及び浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、特に細胞がその特定の形態を失い転移性の癌細 胞となる場合に、関連している。Such cell adhesion mechanisms mediate cell growth, migration, and differentiation. appears to be important in the mediated manner in which cells, e.g. muscle cells, or develop into specific properties to act as hepatocytes. Cell adhesion mechanism is differentiated and invasion, particularly in metastatic cancer cells where cells lose their specific morphology. Related to cells.

細胞と他の細胞及び細胞外マトリクスとの相互作用を基礎となす機構は十分に理 解されていないが、これらは、細胞表面上の又は細胞外マトリクス内の同類のり ガントを特異的に認識及び結合する細胞表面リセブターによって仲介されると考 えられている。The mechanisms underlying the interactions of cells with other cells and the extracellular matrix are well understood. Although not understood, these are similar glues on the cell surface or within the extracellular matrix. thought to be mediated by cell surface receptors that specifically recognize and bind to Gant. is being given.

細胞外でトリクスへの細胞の接着及びマトリクスにおける移動は、多くの場合、 ルオンユラテイ（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ）とピルシュバッカー（Ｐｉｅｒｓｃｈｂ ａｃｈｅｒ）の５ｃｉｅｎｃｅ、　２３８゜４９１（＋９８７）にまとめられて いるように、マトリクスタンパク質においてＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有配列に 対する細胞表面リセブターの結合によって仲介される。Extracellular adhesion of cells to Trix and migration in the matrix is often Ruoslahti and Pierschb acher)'s 5science, summarized in 238°491 (+987) Arg-Gly-Asp-containing sequences in matrix proteins, as shown in mediated by the binding of cell surface receptors to

二のＡｒｇ−Ｇａｙ−Ａｓｐ配列は、少なくともファイブロネクンチン、しトロ 不りナ゛ノ、フ吋：／・つ゛イレフ゛ラントのフィブリノーゲン、ｉ・ロンホボ ンデイン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｎｄｉｎ）　、オステオボンティン（ｏｓｔｅｏ ｐｏｎｔｉｎ）及び、可能性としては多くのコラーゲン、ラミニン及びテナスチ ン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）における細胞接触部位である。これらの細胞接触部位の 類似性に拘らず、それらのタンパク質は、特定のりセブターとの相互作用により 、個々に認識され得る。The second Arg-Gay-Asp sequence is at least fibronectin, No need for fibrinogen: /・Silverant fibrinogen, i・ronhobo thrombopondin, osteobondin pontin) and possibly many collagens, laminins and tenasti This is the cell contact site in tenascin. of these cell contact sites. Despite their similarities, these proteins are , can be individually recognized.

インテグリンは、細胞−細胞及び細胞−マトリクス接着を仲介する細胞表面筒タ ンパク質の大きなファミリーであり、例えば上記のルオシュラティ及びピルシュ バッカーの論文に記載されている。この接着リセブターファミリーの既知のメン バー全ては、非共有結合的で互いに結合されたα及びβサブユニットからなるヘ テロダイマーである。インテグリンファミリーが最初に同定されたとき、インテ グリンは、最初に認識された３種のサブユニット（β３、β２及びβ２）に基づ いて３つのサブファミリーにグループ分けされた。過去数年にわたって、哺乳類 細胞からの３種及びショウジヨウバエから１種のβサブユニットの一次構造が、 ｃＤＮＡから推定された。Integrins are cell surface tubular proteins that mediate cell-cell and cell-matrix adhesion. It is a large family of proteins, such as the Ruoshrati and Pirsula mentioned above. Described in Bakker's paper. Known members of this adhesive receptor family All bars consist of α and β subunits non-covalently linked to each other. It is a telodimer. When the integrin family was first identified, the integrin family Glin is based on three subunits (β3, β2, and β2) that were first recognized. were grouped into three subfamilies. Over the past few years, mammals The primary structures of three β subunits from cells and one from Drosophila are Estimated from cDNA.

各αサブユニットは、単一のβサブユニットと独特に会合していると考えられた 。ＩＩの異なるαサブユニットが、これまでに記述されてきた。しかし、新しい インテグリンが同定されると３種以上のβサブユニットが明らかにあるので、ま た、例えば′ブー不ンバーグ（Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ）らのＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｍ、、２６５＋　１４０３０−１４０３８（＋９８８）に記述されたように、 あるαサブユニットが１以上のβサブユニットと会合し得るので、このグループ 分けか全く満足するものではないことが明らかとなった。Each α subunit was thought to be uniquely associated with a single β subunit. . Different α subunits of II have been previously described. But new Once integrin has been identified, it is clear that there are three or more types of β subunits, so For example, 'Sonnenberg et al., J. Biol, Ch. em,, 265+ 14030-14038 (+988), Since a given α subunit can associate with more than one β subunit, this group It became clear that the division was not entirely satisfactory.

通常及び非通常細胞プロセスの両方の、仲介の重要な側面におけるインテグリン の重要性から、異なるインテグリンの同定及び特性決定が要求されている。本発 明は、この要求を満足し、その上、関連する利点を提供する。Integrins in important aspects of mediating both normal and non-normal cellular processes Due to their importance, identification and characterization of different integrins is required. Main departure Ming meets this need and, moreover, provides related advantages.

発明の概要 本発明は、β６として表されるインテグリン細胞表面すセブターの実質的に精製 されたβザブユニットに関する。β６のアミノ酸配列は図３に挙げられている。Summary of the invention The present invention provides for the substantial purification of integrin cell surface receptors, expressed as β6. Regarding the β subunit. The amino acid sequence of β6 is listed in FIG.

本発明は、また、様々な使用法を存するβ１こ特異的なアミノ酸フラグメントに 関する。本発明は、更に、この、ようなフラグメントをコー１−する遺伝子を有 するベクターに関する。このようなベクターを含む宿主細胞も、また提供される 。The present invention also provides β1-specific amino acid fragments that have a variety of uses. related. The present invention further provides a gene encoding a fragment such as Concerning vectors. Host cells containing such vectors are also provided. .

β、配列をコードする核酸及びβ、をコードする核酸と特異的にハイブリダイズ する核酸も同様に、本発明の他の態様である。specifically hybridizes with the nucleic acid encoding the sequence β and the nucleic acid encoding the sequence β. Nucleic acids that contain nucleotides are also another aspect of the invention.

更に他の態様では、本発明は、αサブユニット、特にα、又はα、に結合された β、を含む実質的に精製されたインテグリンに関する。そのリガンドに対するβ ６含有インテグリンの接触をブロッキングする方法及び、そのリガンドに対する このようなインテグリンの結合を検出する方法も、また提供される。In yet another aspect, the present invention provides an α subunit, in particular α, or The present invention relates to a substantially purified integrin comprising β. β for its ligand Method for blocking contact of 6-containing integrin and its ligand Also provided are methods of detecting such integrin binding.

本発明は、また、インテグリンの過剰発現による、又はビロトネクチンのような リガンドとインテグリンとの結合による、β６含有インテグリンを発現する細胞 における細胞接着を増加又は減少させる方法に関する。The present invention also provides for the use of integrins such as virotonectin or by overexpression of integrins. Cells expressing β6-containing integrin due to binding of ligand and integrin The present invention relates to a method of increasing or decreasing cell adhesion in a cell.

図面の簡単な説明 図１は、ＰＣＲプライマーのデザインを示している。Brief description of the drawing Figure 1 shows the design of PCR primers.

図２は、配列決定ストラテジーのマツプを示している。Figure 2 shows a map of the sequencing strategy.

図３は、ヒト（Ｈ）及びモルモット（ＧＰ）のβ、における、ヌクレオチド配列 及びアミノ酸翻訳を示している。Figure 3 shows the nucleotide sequences of human (H) and guinea pig (GP) β. and amino acid translation are shown.

図４は、既に報告されている４種のインテグリンβサブユニットのアライメント を示している。Figure 4 shows the alignment of four previously reported integrin β subunits. It shows.

図５は、８３Ｆプライマーからすぐ下流の部位における、ヒト（Ｈ）及びモルモ ット（Ｇ　Ｐ）のβ３、β７、β、及びβ、からの、部分的ヌクレオチド及びア ミノ酸配列のアライメントを示している。Figure 5 shows human (H) and guinea pigs at the site immediately downstream from the 83F primer. Partial nucleotides and nucleotides from β3, β7, β, and β of (GP) Alignment of amino acid sequences is shown.

サブユニットに関する物質の成分を提供する。β、のアミノ酸配列も、また提供 され、図３に示されている。Provides a component of the substance related to the subunit. The amino acid sequence of β is also provided. and is shown in Figure 3.

［実質的に精製された」とは、生来環境又は自然環境に普通に関連した夾雑物を 、実質的に含まないことを意味する。[Substantially purified] means free of contaminants normally associated with the native or natural environment. , means substantially free.

「β６」とは、ヒト及びモルモットのβ、において、図３に説明されている配列 によりコードされるポリペプチドの、実質的に同一なアミノ酸配列及び結合機能 を存するポリペプチドを意味する。従って、実質的にその機能を破壊されてなく 、β、の必須配列を保持する修飾アミノ酸配列は、β、の定義内に含まれる。"β6" is the sequence illustrated in Figure 3 in human and guinea pig β. Substantially identical amino acid sequences and binding functions of polypeptides encoded by means a polypeptide that contains Therefore, its functionality is not substantially destroyed. Modified amino acid sequences that retain the essential sequences of , β, are included within the definition of β.

β、の配列と５０％以下のホモロジーを有するβ１、β、及びβ、の配列のよう なアミノ酸配列は、実質的に同一の配列ではな（、従って、β、の定義内に入る ことはない。ここで説明されるアミノ酸配列を前提として、追加物、欠損物又は 置換物は作成されることができ、β、の機能に対するそれらの効果を決定するた めに試験されることができる。更に、例えば保存されたシスティンのような特定 アミノ酸がβ６の結合機能を変えるために修飾され得ることは、当業者に認識さ れるであろう。Like the sequences of β1, β, and β, which have less than 50% homology with the sequence of β, amino acid sequences that are not substantially identical (and therefore fall within the definition of β) Never. Given the amino acid sequences described herein, additions, deletions or Substitutions can be made and used to determine their effect on the function of β. can be tested. Furthermore, specifics such as conserved cysteine It will be appreciated by those skilled in the art that amino acids can be modified to alter the binding function of β6. It will be.

アミノ酸は、ここで下記の通常の１文字表記によって同定される；そのアミノ酸 配列に基づいて、本発明のβサブユニットは、β５、βいβ。Amino acids are identified herein by the conventional one-letter designation; the amino acid Based on the sequence, the β subunits of the present invention include β5, β and β.

及び最近発見された他のβサブユニットと明らかに異なる。例えば、β、におけ る１１アミノ酸カルボキシル末端伸長は、β０、β、及びβ２と異なる。βいβ ２及びβ、の短い細胞質尾部は、細胞骨格との相互作用部位及びリガンドとの長 い細胞外ドメインの相互作用により始められるシグナルの伝達領域であると考え られている。これらの細胞質尾部は、またインテグリン機能の制御のための標的 となり得る。β、の特徴的な１１アミノ酸細胞質尾部は、シグナル伝達における 制御又は経路がβ３、β２及びβ、のものと異なり得ることを示している。and is clearly different from other recently discovered β subunits. For example, in β, The 11 amino acid carboxyl terminal extension differs from β0, β, and β2. β β The short cytoplasmic tails of 2 and β serve as interaction sites with the cytoskeleton and long lengths with ligands. It is thought to be a signal transduction region initiated by the interaction of the extracellular domain. It is being These cytoplasmic tails are also targets for control of integrin function It can be. The characteristic 11-amino acid cytoplasmic tail of β plays a role in signal transduction. It is shown that the regulation or pathway may be different from that of β3, β2 and β.

β１、β２及びβ、に加えて、最近の研究は、５種程の他のインテグリンβサブ ユニットの存在を示唆している。約２１０．０００の分子量を有するβサブユニ ット（β４）は、結腸癌細胞及び、例えばカジジ（Ｋａｊｉｊｉ）らのＥＭＢＯ Ｊ、、８：６７３−６８０（１９８９）に記載されているような上皮起源の多く の他の腫瘍細胞において、インテグリンαサブユニット”α、”と会合している ことが発見された。対象の新規タンパク質の１０６．０００の予想されたサイズ と比較して、２１０．０００の高い分子量に基づいて、及び明らかに異なるアミ ノ末端配列に基づいて、β、は、対象ポリペプチドと同一でないことは明らかで ある。In addition to β1, β2, and β, recent studies have shown that as many as five other integrin β subsubtypes This suggests the existence of a unit. β subunit with a molecular weight of approximately 210.000 (β4) in colon cancer cells and, for example, in EMBO of Kajiji et al. Many of epithelial origin, such as those described in J. J., 8:673-680 (1989). In other tumor cells, it is associated with the integrin α subunit “α.” It was discovered that. 106.000 predicted size of novel protein of interest Based on the higher molecular weight of 210.000 and clearly different amino acids compared to Based on the terminal sequence, β is clearly not identical to the polypeptide of interest. be.

元々β、と称されている他のβサブユニットは、例えばツエリッシュ（Ｃｈｅｒ ｅｓｈ）らのＣｅ１１．５７：５９−６９　（２９８９）に記載されているよう に、インテグリンαサブユニットα９と会合している上皮誘導腫瘍細胞において 同定された。このβサブユニットは、特徴的なアミノ末端配列を有し、最近新た にβ、と名付けられた。精製調製の最近の研究に基づいて、β、は、本発明のβ サブユニットと明らかに異なる。本報告において記載されているβサブユニット は、配列情報が有効である５種の各βサブユニットと異なるので、β、とじて表 される。Other β subunits, originally called β, are e.g. As described in Ce11.57:59-69 (2989) in epithelial-derived tumor cells associated with integrin α subunit α9. Identified. This β subunit has a characteristic amino-terminal sequence and has recently been newly developed. was named β. Based on recent studies of purified preparations, β is the β of the present invention. clearly different from subunits. β subunit described in this report is different from each of the five β subunits for which sequence information is available, so it is expressed as β. be done.

２つの他のインテグリンβサブユニットの存在は、既知のαサブユニットに対す る抗体による表面標識化細胞溶解物の免疫沈降後の、特徴的なタンパク質の同定 から推測されている。これらの新規なタンパク質の１つは、β３と称され、ヒト の骨肉腫細胞株ＭＧ−６３、繊維芽細胞株ＡＦ　１５２３及び、例えばフリート （Ｆｒｅｅｄ）らのＥＭＢＯＪ、、８：２９５５−２９６５　（１９８９）に記 載されているようなヒトの内皮細胞において、α９と会合することが認められた 。表１に示されるようにこれらの細胞においてβ、か発現していないが、ＭＧ− ６３細胞においてβ、が発現しているので、このサブユニットは、また、β、と 異なる。The presence of two other integrin β subunits is in contrast to the known α subunit. Identification of characteristic proteins after immunoprecipitation of surface-labeled cell lysates with antibodies It is estimated from. One of these novel proteins, termed β3, is human osteosarcoma cell line MG-63, fibroblast cell line AF 1523 and, for example, Fleet (Freed) et al., EMBOJ, 8:2955-2965 (1989). It was observed that it associates with α9 in human endothelial cells as described above. . As shown in Table 1, these cells do not express β, but MG- Since β is expressed in 63 cells, this subunit also different.

既知のαサブユニットの同時免疫沈降により同定された他の新規なインチグリに 発見されたαサブユニットである。表１に示されたように、リンパ球においてβ ６が発現していないがβ、がリンパ球で発現しているので、このサブユニットは 、また、β、と異なる。Other novel inchilis identified by co-immunoprecipitation of known alpha subunits. This is the discovered α subunit. As shown in Table 1, β 6 is not expressed, but β is expressed in lymphocytes, so this subunit , is also different from β.

表１ β、の分布 タイプ　結果　入手光 細胞株： ＦＣ−２膵臓　＋　カジジら ＥＭＢＯＪ　３：６７３−８０　（１９８９）Ｐａｎｃ　Ｉ　膵臓　−メツツガ −博士デューク大学、Ｎ、　Ｃ。Table 1 Distribution of β Type Result Obtained Light Cell line: FC-2 pancreas + Kajiji et al. EMBOJ 3:673-80 (1989) Panc I Pancreas - Mettsuga -Dr. N.C., Duke University.

Ｈｅ１ａ　子宮頚部　−ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２Ｊａｒ　膜ＣＡ　＋　ＡＴＣＣ＃ ＨＴＢ３６ＨＴ　１０８０　繊維肉腫　−ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ　１２１Ｕ　９３７ 　単球様　−ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５９３ＭＧ６３　骨肉腫　−ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ 　１４２７本発明は、また、αサブユニットに結合されるβ、を含むインテグリ ンを提供する。β、は、他のβサブユニットの最近の発見と矛盾なく、機能的イ ンテグリンを形成するため多くのαサブユニットと会合し得る。ある実施例では 、β、はＣ９と会合する。他の実施例においては、β、は、ここでα、と呼ばれ る他のαサブユニットと会合する。このα、β、インテグリンは、β、を含む他 のインテグリンと同様に、例えば細胞外マトリクス分子のような分子を結合する ことができる。このような分子は、ここでは、リガンドと呼ばれる。特定実施例 において、あるβ、含含有インダグリン、ビトロネクチン又はファイプロネクチ ンのようなＡｒｇ−Ｇａｙ−Ａｓｐ含有ポリペプチドと結合することができる。He1a Cervix - ATCC#CCL-2Jar Membrane CA + ATCC# HTB36HT 1080 Fibrosarcoma-ATCC#CCL 121U 937 Monocytoid-ATCC#CRL1593MG63 Osteosarcoma-ATCC#CRL 1427 The present invention also provides an integrin comprising β bound to an α subunit. provide services. β, consistent with recent discoveries of other β subunits, has a functional It can associate with many α subunits to form integrins. In some embodiments , β, associates with C9. In other embodiments, β is referred to herein as α. It associates with other α subunits. This α, β, integrin contains β, and others. Similar to integrins, they bind molecules such as extracellular matrix molecules. be able to. Such molecules are referred to herein as ligands. Specific examples In, a certain β, containing indagrin, vitronectin or phipronectin Arg-Gay-Asp-containing polypeptides such as Arg-Gay-Asp-containing polypeptides.

β。含有インテグリンの多種のリガンドとの結合は、当業において知られ、例え ばルオシュラティ＆ビルツユバッカーの５ｃｉｅｎｃｅ、２３８：４９１−４９ ７　（１９８７）に記載されているような手順に従って、確認され得る。β. Binding of containing integrins to a wide variety of ligands is known in the art, e.g. Baruoshrati & Virtschübacher 5science, 238:491-49. 7 (1987).

本発明は、また、β、に対して特異的なアミノ酸フラグメントを提供する。β６ は新規な分子であるので、このβサブユニットに特異的な多くのフラグメントが 含まれる。β、に対して特異的なフラグメントは、他の既知のインテグリンβサ ブユニットフラグメントの配列と５０％以下のホモロジーを有する配列を含む。The present invention also provides amino acid fragments specific for β. β6 Since it is a novel molecule, many fragments specific to this β subunit are available. included. Fragments specific for β, Contains sequences that have 50% or less homology with the sequence of the buunit fragment.

これらのフラグメントは、既知のフラグメントと区別されるには、十分な長さが 必要であり、従って、”β６に特異的”である。このようなフラグメントのアミ ノ酸配列は、β、アミノ酸配列を同定する図を参照することによって、たやすく 決定することができる。これらのフラグメントは、また、β、サブユニットの結 合機能を保持し、従って、例えばβ、に特異的な試薬を調製するための免疫原と して、又は本発明の新規なβ６含有インテグリンを検出するためのインディケー タとして、用いられ得る。当業者は、このようなフラグメントの他の使用につい ても知るところであろう。These fragments are long enough to be distinguished from known fragments. and is therefore "β6-specific". Amino of such fragments The amino acid sequence can be easily determined by referring to the diagram that identifies the β, amino acid sequence. can be determined. These fragments also combine β, subunits. immunogen to prepare reagents that retain binding function and are therefore specific for e.g. or an indicator for detecting the novel β6-containing integrin of the present invention. It can be used as a data. Those skilled in the art will appreciate other uses of such fragments. You probably know that.

本発明は、また、β、に特異的なアミノ酸配列に特異性を有する試薬を提供する 。／３．が関連するβサブユニットに関して少なくとも５０％のアミノ酸相違を 有する新規なタンパク質であるので、当業者は、例えばβ、に特異的なアミノ酸 配列に特異的に反応し、これにより、β、を他の分子と免疫学的に区別する抗体 のような試薬をたやすく作成することができる。このような抗体を作成する多く の方法は、十分に確立され、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｅ、　バーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）及びり、レーン（ Ｌａｎｅ）、コールド・スプリング・ハーバ−研究所、＋９８８．　ｐｐ、　１ ３９−２８３、並びにヒユーズ（Ｈｕｓｅ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４：１２ ７５−１２８０（１９８８）に記載されている。The present invention also provides a reagent having specificity for an amino acid sequence specific to β. . /3. have at least 50% amino acid differences with respect to related β subunits Since the protein is a novel protein with An antibody that reacts specifically with the sequence and thereby immunologically distinguishes β from other molecules. Reagents like these can be easily created. Many such antibodies are created The methods of tory Manual, E, Harlow and Lane ( Lane), Cold Spring Harbor Laboratory, +988. pp, 1 39-283 and Huse et al., 5science, 24:12 75-1280 (1988).

本発明は、また、β６をコードする核酸を提供する。このような配列の例は、図 ３に説明されている。例えば、マニアティスらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇ、コールド・スプリング・ハーバ−（１９８２）に記載されているような 、後述される標準的な方法によって、核酸配列は、適当な発現ベクターにクロー ン化され得る。このベクターは、それから組換えタンパク質を発現することがで きる宿主に挿入され得る。従って、本発明は、また、このような配列をコードす る核酸を含むベクター及びこれらのベクターを含む宿主に関する。The invention also provides nucleic acids encoding β6. An example of such an array is shown in figure It is explained in 3. For example, Molecular Clon by Maniatis et al. ing, Cold Spring Harbor (1982). The nucleic acid sequence is cloned into an appropriate expression vector by standard methods described below. can be converted into This vector can then express recombinant proteins. can be inserted into a compatible host. Accordingly, the present invention also provides coding for such sequences. and hosts containing these vectors.

図３に説明される配列は、また、診断を目的とするプローブとして用いらること かできる核酸を提供する。このような核酸は、β、に特異的なヌクレオチド配列 を有する核酸とハイブリダイズすることができるが、非β６タンパク質、特に他 の細胞表面リセブターをコードする核酸とハイブリダイズしない。これらの核酸 は、β６の配列からたやすく決定されることができ、標準的な核酸シンセサイザ ーを用いて合成され得る。β、のコード又は非コードＤＮＡの両方に対して特異 的にハイブリダイズする核酸も、また、提供される。The sequence illustrated in Figure 3 may also be used as a probe for diagnostic purposes. We provide nucleic acids that can be used to Such a nucleic acid is a nucleotide sequence specific for β However, non-β6 proteins, especially other does not hybridize with nucleic acids encoding cell surface receptors. These nucleic acids can be easily determined from the sequence of β6 and can be easily determined using a standard nucleic acid synthesizer. can be synthesized using Specific for both coding or non-coding DNA of β Also provided are nucleic acids that hybridize with each other.

インテグリン細胞表面すセブターは、細胞外マトリクス分子のようなリガンドと 結合する。しかし、リガンドに対するインテグリンの結合は、多くの手段によっ てブロックされ得る。例えば、β、含含有インダグリン結合は、β、サブユニッ ト又はβ、含含有インダグリン結合する試薬によって、ブロックされ得る。この ような試薬の例には、例えばＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチド及びポリペプ チド、インテグリン結合部位を含むリガンドフラグメント、並びに、β、又はβ 、含含有インダグリン特異的に反応する抗体も同様に、含まれる。或いは、この ブロッキングは、リガンドのインテグリンとの結合を阻害する部位において、β 、含宥インテグリンにより認識されるリガンド又はそのフラグメントとリガンド に特異的な試薬との結合によって行われ得る。リガンドに対するβ１含有インテ グリンの結合が細胞外マトリクス分子に対する細胞接着を仲介するので、二の結 合の阻害は、細胞接着を阻害することができる。或いは、細胞接着は、細胞によ るβ、含含有インダグリン発現を増加することによって、促進され得る。Integrin cell surface receptors interact with ligands such as extracellular matrix molecules. Join. However, integrin binding to ligands can be achieved by many means. can be blocked. For example, an indagrin bond containing β, subunit can be blocked by indagrin-binding reagents containing indagrin. this Examples of such reagents include, for example, Arg-Gly-Asp containing peptides and polypeptides. a ligand fragment containing the integrin binding site, and β, or β Also included are antibodies that specifically react with indagrin-containing indagrin. Or this Blocking involves blocking the β , a ligand recognized by a contained integrin or a fragment thereof and a ligand This can be done by conjugation with reagents specific for. β1-containing protein for ligand Because glin binding mediates cell adhesion to extracellular matrix molecules, the second Inhibition of cell adhesion can inhibit cell adhesion. Alternatively, cell adhesion may be caused by β, containing indagrin, can be promoted by increasing expression.

最後に、本発明は、β、含存インテグリンを結合するリガンドの検出方法を提供 する。この方法は、β６含有インテグリンとβ６含有インテグリンに結合すると 思われるリガンドを含有する溶液との接触を含む。その後、β、含存インテグリ ンと結合するリガンドの存在が検出される。Finally, the present invention provides a method for detecting ligands that bind β, containing integrins. do. This method shows that when binding to β6-containing integrins and β6-containing integrins, involving contact with a solution containing the suspected ligand. Then β, the included integrity The presence of a ligand that binds to the compound is detected.

まとめると、本発明は、以下を請求する：１、β６を含む、実質的に精製された インテグリン細胞表面すセブターサブユニット。In summary, the present invention claims: 1. a substantially purified protein comprising β6; Integrin cell surface septa subunit.

２、ヒトにおいて、図３に説明されたアミノ酸配列を有する、請求の範囲ｌの実 質的に精製されたインテグリン細胞表面すセブターサブユニット。2. In humans, the fruit of claim 1 having the amino acid sequence illustrated in FIG. Qualitatively purified integrin cell surface septa subunit.

３、αサブユニットに結合されたβ、を含む、実質的に精製されたインテグリン 。3. Substantially purified integrin comprising β bound to an α subunit .

４、前記サブユニットがα、である、請求の範囲３のインテグリン。4. The integrin of claim 3, wherein the subunit is α.

５、前記サブユニットがα、である、請求の範囲３のインテグリン。5. The integrin of claim 3, wherein the subunit is α.

６、β・に対して特異的な、実質的に精製されたアミノ酸フラグメント。6. A substantially purified amino acid fragment specific for β.

７、請求の範囲６のアミノ酸フラグメントとしてコートする遺伝子を含むベクタ ー。7. Vector containing the gene coated as an amino acid fragment according to claim 6 -.

８、請求の範囲７のベクターを含む宿主。8. A host comprising the vector of claim 7.

９、β、に特異的なアミノ酸配列に特異性を有する試薬。9. A reagent having specificity for an amino acid sequence specific to β.

ｌＯ２前記試薬が抗体である、請求の範囲９の試薬。10. The reagent of claim 9, wherein said reagent is an antibody.

１１、β６をコートする、実質的に精製された核酸。11, a substantially purified nucleic acid encoding β6.

１２、請求の範囲１１の核酸のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする 、実質的に精製された核酸。12. Specifically hybridizes with the nucleotide sequence of the nucleic acid of claim 11. , a substantially purified nucleic acid.

１３、請求の範囲１２の核酸と特異的にハイブリダイズし、且つ非β６ポリペブ チトをコートする核酸とハイブリダイズしない、実質的に精製された核酸。13. a non-β6 polypeb that specifically hybridizes with the nucleic acid of claim 12; A substantially purified nucleic acid that does not hybridize with the nucleic acid that coats cytoplasm.

１４、β６含有インテグリンを発現している細胞の、該β６含有インテグリンに 結合することがてきるリガントに対する結合阻害方法であって、該β６含有イン テグリンと該リガントとの結合をブロッキングすることを含む、細胞の結合を阻 害する方法。14. To β6-containing integrin of cells expressing β6-containing integrin A method for inhibiting binding to a ligand capable of binding, the method comprising: inhibiting cell binding, including blocking binding of tegrin to the ligand; How to harm.

１５、前記ブロッキングが、前記β６含存インテグリンとそれに対して特異的な 試薬との結合によって遂行される、請求の範囲１４の方法。15. The blocking is performed on the β6-containing integrin and its specific 15. The method of claim 14, carried out by association with a reagent.

１６、前記ブロッキングが、前記β６含有インテグリンのリガンドと該リガンド に特異的な試薬との結合によって遂行される、請求の範囲１４に記載の方法。16. The blocking involves the use of the β6-containing integrin ligand and the ligand. 15. The method according to claim 14, which is carried out by binding with a reagent specific for.

１７、前記試薬がＲＧＤ含有ペプチド又はポリペプチドである、請求の範囲１５ の方法。17. Claim 15, wherein the reagent is an RGD-containing peptide or polypeptide. the method of.

１８、前記試薬がインテグリン結合部位を含むリガンドフラグメントである、請 求の範囲１５の方法。18, wherein the reagent is a ligand fragment containing an integrin binding site; 15 methods of seeking scope.

＋９．　β６含存インテグリンを結合するリガンドの検出方法であって、該β。+9. A method for detecting a ligand that binds β6-containing integrin, the β.

含有インテグリンと該β６含有インテグリンと結合すると思われる該リガンドを 含む溶液とを接触すること、及び該β、含含有インダグリン結合された該リガン ドの存在を検出することを含む、リガンドの検出方法。containing integrin and the ligand that is thought to bind to the β6-containing integrin. contacting a solution containing the β-containing indagrin-conjugated ligand; A method of detecting a ligand, the method comprising detecting the presence of a ligand.

２０、β、含含有インダグリン発現する細胞における細胞接着を増加させる方法 であって、細胞において、該β１含有インテグリンの過剰発現を含む、細胞接着 を増加させる方法。Method for increasing cell adhesion in cells expressing 20,β,containing indagrin cell adhesion comprising overexpression of the β1-containing integrin in the cell. How to increase.

２１、β。含有インテグリンを発現している細胞における細胞接着を減少させる 方法であって、該β、含含有インダグリンリガンドとの結合を含む、細胞接着を 減少させる方法。21, β. Reduces cell adhesion in cells expressing containing integrins A method for promoting cell adhesion comprising binding to said β-containing indagrin ligand. How to reduce it.

下記の実施例は、説明することを意図したもので、本発明を制限するものではな い。The following examples are intended to be illustrative and not to limit the invention. stomach.

新規なβサブユニットの同定 ポリメラーゼ連鎖反応によるｃＤＮＡフラグメントの生成オスのハートレイ系（ Ｈａｒｔｌｅｙ　ｏｕｔｂｒｅｄ）モルモット（チャールズ・リバー・ブリーデ ィング・ラボラトリーズ、ハーバ−バー、メイン州）からハーベストされた気管 上皮細胞は、コースタ−から市販されているコラーゲン含浸微多孔質フィルター 上に１０−１４日間にわたって、コンフレンド状に成長させられた。ＲＮＡは、 これらの初代培養物からハーベストされ、ｍＲＮＡはファストトラックｍＲＮＡ 単離キット（インビトロゲン、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いてオリ ゴ（ｄＴ）セルロースカラムを通して精製された。２〜５μｇのｍＲＮＡは、２ ０〜４０μｌの反応容量において、モロニーマウス白血病ウィルスのリバーズト ランスクリブターゼ（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ゲイザースバーグ 、メリーランド州）２００ユニツトによる触媒作用で得られたｃＤＮＡ合成の鋳 型として用いられた。１〜５μｍの結果物ｃＤＮＡが、ポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）の鋳型として用いられた。ＰＣＲは、２５〜２００μｌの反応容量にお いて行われた。Identification of a novel β subunit Generation of cDNA fragments by polymerase chain reaction Male Hartley strain ( Hartley outbred) guinea pig (Charles River Breede) Harvested trachea from the Biochemistry Laboratories, Harbor, ME) Epithelial cells were collected using a collagen-impregnated microporous filter commercially available from Coaster. Confriends were allowed to grow on top for 10-14 days. RNA is Harvested from these primary cultures, the mRNA is fast-track mRNA. Origen using an isolation kit (Invitrogen, San Diego, CA). It was purified through a Go(dT) cellulose column. 2-5 μg of mRNA is 2 Moloney murine leukemia virus reversal in reaction volumes of 0-40 μl. Lancecribtase (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg) cDNA synthesis template obtained by catalysis by 200 units of It was used as a mold. The resulting cDNA of 1-5 μm was subjected to polymerase chain reaction ( PCR) was used as a template. PCR is performed in a reaction volume of 25-200 μl. It was held.

鋳型ｃＤＮＡに加えて、各ＰＣＲ反応は、５０ｍ　ＭのＫＣｌ５１０ｍＭのＴｒ ｉｓ−ＨＣＩ（２５℃においてｐＨ９，０）、１．５　ｍＭのＭｇＣＬ　、０． ０１％のゼラチン、０．１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、各々０．２ｍＭのｄ ＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、並びに０．０５ユニット／μｍのＴ ａｑＤＮＡポリメラーゼ（ユナイテッド・スティン・バイオケミカル・コーポレ イション、クリーブランド、オハイオ州、又は、プロメガ、マジソン、ウィスコ ンシン州から入手）を含んだ。In addition to the template cDNA, each PCR reaction included 50 mM KCl, 10 mM Tr. is-HCI (pH 9.0 at 25°C), 1.5 mM MgCL, 0. 01% gelatin, 0.1% Triton X-100, 0.2mM each ATP, dGTP, dCTP and dTTP, and 0.05 units/μm of T aq DNA polymerase (United Stain Biochemical Corporation) Ishon, Cleveland, OH or Promega, Madison, Wisco (obtained from Nsin State).

各反応において、２つのオリゴヌクレオチドブライマーも、また、各々ｌμＭの 最終濃度になるように添加された。このプライマー・ベアは、下記のように同定 される。各反応混合物は、ミネラルオイルを上乗せされ、サーマルサイクラ−（ エリコンブ（Ｅｒｉｃｏｍｐ）　、サンディエゴ、カリフォルニア州）において ９５℃で４分間加熱され、それから３０サイクルのＰＣＲに付される。各サイク ルは、９５°Ｃ４５秒、５３℃４５秒及び７２°Ｃ１分からなる。最終サイクル 後すみやかに、試料は、ｌＯ分間７２°Ｃて維持される。In each reaction, two oligonucleotide primers were also added each at lμM. Added to final concentration. This primer bear is identified as follows: be done. Each reaction mixture was topped up with mineral oil and placed in a thermal cycler ( Ericcomp (San Diego, California) Heat at 95° C. for 4 minutes and then undergo 30 cycles of PCR. Each cycle The temperature consisted of 45 seconds at 95°C, 45 seconds at 53°C and 1 minute at 72°C. final cycle Immediately thereafter, the sample is maintained at 72°C for 10 minutes.

各ＰＣＲ反応の結果物は、１．５％アガロースのゲル電気泳動によって解析され た。予想サイズのフラグメントを生成した反応物は、１．５％の低温度溶解アガ ロース（バイオラド・ラボラトリーズ、リッチモンド、カリフォルニア州）にお いて電気泳動された。適切なサイズのバンドが摘出され、６８°Ｃにおいて溶解 され、ＤＮＡは、フェノール／クロロフォルムによる抽出並びにエタノール及び 酢酸アンモニア中ての沈殿によって精製された。The results of each PCR reaction were analyzed by 1.5% agarose gel electrophoresis. Ta. Reactions that produced fragments of the expected size were treated with 1.5% cold melt agar. loin (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California). and electrophoresed. Bands of appropriate size were extracted and lysed at 68°C. The DNA was extracted with phenol/chloroform and ethanol and Purified by precipitation in ammonia acetate.

ＰＣＲプライマー ここに記載される新規なβサブユニットｃＤＮＡの開始フラグメントを得るため に、ＰＣＲプライマーの縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）混合物を用いた。オリゴ ヌクレオチドは、標準手順によるＤＮＡシンセサイザーを用いたカリフォルニア 大学サンフランシスコ・バイオモレキュラー・リソース・センターにより、合成 され、トリチル付与され、Ｎｅｎ−吸着カートリッジ（デュ・ボン一二二一・イ ングランド・ヌークリアー（ＤｕＰｏｎｔ−Ｎｅｗ　Ｉｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌ ｅａｒ）、ボストン、マサチューセッツ州）を通して精製された。これらの共通 プライマー混合物は、現在までに配列決定されたインテグリンβサブユニットの 各アミノ末端から約１３０アミノ酸で始まり、約３００ヌクレオチド領域を挟ん だ、高い保存性を有する配列をコードするヌクレオチドであるＡｓｐ−Ｌｅｕ− Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ（ブライｖ−ＢＩＦ）及びＧ ｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−１ｉｅ−Ｍｅｔ−Ｇｉｎ（プライマー Ｂ２Ｒ）と、アニールするようにデザインされた。PCR primer To obtain the starting fragment of the novel β subunit cDNA described here. A degenerate mixture of PCR primers was used. oligo Nucleotides were synthesized using a DNA synthesizer according to standard procedures. Synthesized by the University of San Francisco Biomolecular Resource Center and trityl added, Nen-adsorption cartridge (Du Bont 1221-I). England Nucl (DuPont-New England Nucl) (ear), Boston, MA). These common The primer mixture is suitable for all of the integrin β subunits sequenced to date. It begins approximately 130 amino acids from each amino terminus and is flanked by a region of approximately 300 nucleotides. Asp-Leu- is a nucleotide encoding a highly conserved sequence. Tyr-Tyr-Leu-Met-Asp-Leu (Bly v-BIF) and G lu-Gly-Gly-Asp-Ala-1ie-Met-Gin (primer B2R) and was designed to be annealed.

ここで同定されたプライマーの配列は、図１に描かれている。The sequences of the primers identified here are depicted in FIG.

得られた最初の配列を基にして、特異的な正方向プライマーは、我々が配列決定 した領域の３′末端から約４９ヌクレオチドで終わるアミノ酸Ｐｒｏ−Ｌｅｕ− Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ　（ブライ７−ＢＴＥ２Ｆ） をコードする配列とアニールするようにデザインされた。また、我々は、更に正 方向プライマー（Ｂ　３　Ｆ）及び２つの逆方向プライマー（Ｂ３Ｒ及びＢ４Ｒ ）を、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ　（ Ｂ３領域）及び、Ｉｃｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ− １１ｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ　（Ｂ４領域）の配列をコードする高く保存された共通 領域を認識するようにデザインした。ヒトβ５、β２及びβ、並びにチキンβ、 のすでに報告された配列とのこれらのプライマーのアライメントは、図１に示さ れている。Based on the initial sequence obtained, specific forward primers were used to sequence The amino acids Pro-Leu- end approximately 49 nucleotides from the 3' end of the Thr-Asn-Asp-Ala-Glu-Arg (Bly7-BTE2F) was designed to anneal with a sequence encoding . In addition, we further Directional primer (B3F) and two reverse primers (B3R and B4R ), Gly-Glu-Cys-Val-Cys-Gly-Gln-Cys ( B3 region) and Ice-Gly-Leu-Ala-Leu-Leu-Leu- A highly conserved common sequence encoding the 11e-Trp-Lys (B4 region) Designed to recognize areas. human β5, β2 and β, and chicken β, The alignment of these primers with previously reported sequences of It is.

上述されたＰＣＲは、モルモットの気管上皮細胞からのｃＤＮＡとＢＴＥ２Ｆ／ Ｂ３Ｒ及びＢ　３　Ｆ／Ｂ　４　Ｒのプライマー・ベアとによって実施された。The PCR described above was performed using cDNA from guinea pig tracheal epithelial cells and BTE2F/ B3R and B3F/B4R primer bare.

ＢＴＥ　２　Ｆ／Ｂ　３　Ｒのプライマー・ベアは、１０９５の新しい配列の更 なる塩基対を産出した。この配列を基にして、他の特異的プライマー（ＢＴＥ３ Ｆ）は、この配列の３′末端に近いＶａｌ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ− Ｖａｌの配列を認識するようにデザインされ、このプライマーとプライマーＢ４ Ｒとを組み合わせて、ＰＣＲが実施された。The BTE2F/B3R primer bear contains 1095 new sequence updates. It produced a base pair. Based on this sequence, other specific primers (BTE3 F) Val-3er-Glu-Asp-Gly- near the 3' end of this sequence This primer and primer B4 were designed to recognize the Val sequence. PCR was performed in combination with R.

図１は、ＰＣＲプライマーのデザインを示している。βサブユニツト共通プライ マー混合物は、ヒトβ１、β２、β３及びチキンβ、の報告された配列のアライ メントを基にしてデザインされた。正方向プライマー（ＢＩＦ及び８３Ｆ）にお いて、各コドンの各々最初の２つのヌクレオチドに対して可能なときはいつでも 、プライマー配列は■ヌクレオチドを含み、通常、メチオニン以外のアミノ酸に 対するコドンにおいて、第３の塩基としては、縮重している又はデオキシイノノ ン含有であった。逆方向プライマー（Ｂ２Ｒ，Ｂ３Ｒ及びＢ４Ｒ）は、相補的Ｄ ＮＡ鎖に対して同じようにデザインされた。２つの特異的正方向プライマーはβ ６を認識するようにデザインされた。第１のもの（ＢＴＥ２Ｆ）は、種を越えて 働くようにデザインされ、従って、第３のコドン位置において、縮重している又 はデオキシイノシン含有であった。第２のＢＴＥ３Ｆは、縮重せず、モルモット β、のみを認識するようにデザインされた。Figure 1 shows the design of PCR primers. β subunit common ply The mer mixture is an alignment of the reported sequences of human β1, β2, β3 and chicken β. Designed based on ment. Forward primers (BIF and 83F) and for each first two nucleotides of each codon whenever possible. , the primer sequence contains ■ nucleotides and usually contains amino acids other than methionine. In the opposite codon, the third base is degenerate or deoxyinonon It contained Reverse primers (B2R, B3R and B4R) are complementary D A similar design was made for the NA strand. The two specific forward primers are β It was designed to recognize 6. The first one (BTE2F) is a cross-species is designed to function and is therefore degenerate at the third codon position. contained deoxyinosine. The second BTE3F is non-degenerate and guinea pig It was designed to recognize only β.

ン、サンディエゴ、カリフォルニア州）においてクローニングされた。精製フラ グメントは、デオキシヌクレオチド含有蒸留水に再懸濁され、ＰＣＲの最終サイ クル後に残された、全ての３′が引っ込んだ末端を充満するように、２，５ユニ ツトのＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント（プロメガ）によって処理され た。It was cloned in San Diego, California). Refined fura The fragments were resuspended in distilled water containing deoxynucleotides for the final stage of PCR. 2,5 units to fill all 3' recessed ends left behind. DNA polymerase I large fragment (Promega) Ta.

５′末端は、５ユニツトのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（二ニー・イングラン ド・バイオラブ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　、ピバリー、メ イン州）によッテ、リン酸化された。約１００〜２００１ｇのＤＮＡを含有する 上記の反応混合物を少量、Ｅｃ。The 5' end is a 5-unit T4 polynucleotide kinase (two-unit protein). New England Biolabs, Pibarry, Messrs. In state), it was phosphorylated. Contains approximately 100-2001g of DNA A small amount of the above reaction mixture was added to Ec.

ＲＶ（プロメガ）で切断され、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ベーリンガー・ マンハイム、インディアナポリス、インディアナ州）で脱リン酸化されたｐＢｌ ｕｅｓｃｒ　ｉｐｔに組み込んだ。ライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベ セスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）で１時間２２°Ｃにおいて行った。ライゲ ーション混合物は、コンピテント大腸菌（ε５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ） 　（Ｊ　Ｍ　１０９、クローンチック、サンフランシスコ、カリフォルニア州） を形質転換するために用いられた。cleaved with RV (Promega) and calf intestinal alkaline phosphatase (Boehringer). pBl was dephosphorylated in Mannheim, Indianapolis, IN). Incorporated into uescr ipt. Ligation was performed using T4 DNA ligase (base). Sesda Research Laboratories) for 1 hour at 22°C. Reige The mixture contains competent Escherichia coli (ε5 cherichia coli). (JM 109, Kronchik, San Francisco, California) was used to transform.

挿入部を含むプラスミドは、ファルマシア・ミニブレツブ・ライシス・キット（ フアルマシアＬＫＢバイオテクノロジー・インク、ビス力タウエイ（Ｐｊｓｃａ ｔａ＊ａｙ）、ニューシャーシー州）を用いて精製され、０．３ＭのＮａＯＨに おいて変性され、更にセファクリルＳ−４００（ファルマシア）含有スピンカラ ムを通して精製され、それからシークエナーゼ１ヴアージョン２．０シークエン シング・キット（ユナイテッド・スティン・バイオケミカル・コープ、クリーブ ランド、オハイオ州）及び（３ＳＳ）ｄＡＴＰ　（アマジャム・コープ、アーリ ントン・ハイツ、イリノイ州）を用いて配列決定された。The plasmid containing the insert was prepared using the Pharmacia Minibleb Lysis Kit ( Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Pjsca ta*ay), New Chassis) and diluted to 0.3M NaOH. and a spin color containing Sephacryl S-400 (Pharmacia). purified through a Sequenase 1 Version 2.0 sequencer. Thing Kit (United Stain Biochemical Corp., Cleve) RAND, OH) and (3SS) dATP (AmarJam Corp., AR) The sequence was sequenced using a computer-aided computer (London Heights, IL).

ライブラリ・スクリーニング ＢＩＦ／Ｂ２Ｒ及びＢＴＥ　３　Ｆ／Ｂ　４　Ｒのプライマー・ベアによって生 成されたＰＣＲフラグメントは、α（”Ｐ）ｄＣＴＰによって一様にラベルされ 、ヒト膵臓癌細胞株ＦＣ−２から得られたｍＲＮＡからのプラスミドｐＴＺ１８ Ｒ−ＢｓｔＸＩ（インビトロゲン）において共に構築されたランダム・プライム ｃＤＮＡライブラリ及びオリゴｄＴプライムｃＤＮＡライブラリをスクリーニン グするためのプローブとして用いられた。プラスミドは、両方の領域にハイブリ ダイズすることがわかっているクローンから精製され、挿入部は配列決定された 。Ｉクローンからの挿入部ＤＮＡの一部は、次に標識化され、同一ライブラリを 選別するために用いられた。１４の独立した重複しているクローンは、ｐＴＺポ リリンカーの領域を認識するプライマーを用いて両端から配列決定された。新し いβサブユニットの推定される翻訳領域の３′末端側の領域は、３′末端に隣接 する配列を認識するように構築されたプライマーを用いて、３クローンから両方 向で配列決定された。従って得られた最初の配列に基づいて、更に、内部配列が 、特定の制限エンドヌクレアーゼによる消化及び再ライゲーション後に、クロー ンＴｌ０１Ｔ１１．Ｔ１２及びＴ１４から得られた（図２）。従って得られた３ つの内部フラグメントは、ｐＢＩｕｅｓｃｒ　ｉｐｔにおいてサブクローン化さ れ、両方向で、また配列決定された。報告された新しい配列の約９０％が、ＤＮ Ａの両鏡より得られ、９７％は、２以上の重複しているクローンから得られた（ 図２）。library screening Generated by BIF/B2R and BTE 3 F/B 4 R primer bare The generated PCR fragments were uniformly labeled with α(”P)dCTP. , plasmid pTZ18 from mRNA obtained from human pancreatic cancer cell line FC-2. Random prime co-constructed in R-BstXI (Invitrogen) Screening cDNA libraries and oligo-dT primed cDNA libraries It was used as a probe for monitoring. The plasmid hybridizes to both regions. It was purified from a clone known to grow in soybean, and the insert was sequenced. . A portion of the insert DNA from the I clone was then labeled and injected into the same library. used for sorting. Fourteen independent overlapping clones were found in the pTZ port. Both ends were sequenced using primers that recognize the relinker region. new The region on the 3'-end side of the predicted translated region of the new β-subunit is adjacent to the 3'-end. Using primers constructed to recognize sequences that sequenced in the direction. Therefore, based on the initial sequence obtained, furthermore, the internal sequence is , after digestion with specific restriction endonucleases and religation, cloning Tl01T11. T12 and T14 (Figure 2). Therefore, the obtained 3 Two internal fragments were subcloned in pBIuescr ipt. and was also sequenced in both directions. Approximately 90% of new sequences reported are DN were obtained from both mirrors of A, and 97% were obtained from two or more overlapping clones ( Figure 2).

図２は、配列決定ストラテジーのマツプを示している。モルモットβ、（クロー ンｉｐ、３Ｌ、３Ｎ及び３Ｙ；上）の部分的ｃＤＮＡ配列及びヒトβ、（クロー ンＴｌ−Ｔｌ　９　、下）の完全配列を得るために用いられたクローンの位置が 示されている。また、翻訳領域（タンパク質）の位置も示されている。膜通過ド メインの位置は、文字ＴＭで示されている。示されたクローンは、しばしば幾つ かの同一クローンの１つを表示する。長い挿入部を有するクローンの内部配列は 、制限エンドヌクレアーゼ消化及びリリゲーション（ｒｅｌｅｇａｔｉｏｎ）に よって、並びに、ｐＢ］ｕｅｓｃｒ　ｉｐｔへの内部フラグメントのライゲーシ ョンによって、得られた。使用された特定制限部位は示されている（Ｈｉｎｄ、 Ｈｉｎｄｌ［［；　Ｈｉｎｃ、Ｈｉｎｃ［［；Ｋｐｎ、　Ｋｐｎ　Ｉ　：　Ｐｓ ｔ、　Ｐｓｔ　Ｉ　）。配列決定の方向及び伸長は矢印で示されている。１１０ ９及び１１１０は、オリゴヌクレオチド配列決定プライマーにより認識された部 位である。Ｔ１８及びＴ１９は、各々ポリ（Ａ）尾部で停止していた。縮重ＰＣ ＲプライマーＢＩＦ　（Ｂｌ）、Ｂ２Ｒ（Ｂ２）、Ｂ３Ｒ／Ｆ（Ｂ３）及びＢ４ Ｒ（Ｂ４）並びにβ、プライマーＢＴＥ２Ｆ　（ＢＴＥ２）及びＢＴＥ３Ｆ　（ ＢＴＥ３）により認識された領域は、上記のモルモットｃ　／　Ｄ　Ｎ　Ａマツ プにおいて注記されている。ｋｂはキロ塩基を表す。Figure 2 shows a map of the sequencing strategy. Guinea pig β, (crow partial cDNA sequences of human β, ip, 3L, 3N and 3Y; The location of the clone used to obtain the complete sequence of clone Tl-Tl 9, bottom) is It is shown. Also shown are the positions of translated regions (proteins). Membrane passing The main position is indicated by the letters TM. The clones shown are often display one of the identical clones. The internal sequence of clones with long inserts is , restriction endonuclease digestion and relation Thus, and ligation of internal fragments into pB]uescr ipt obtained by the The specific restriction sites used are indicated (Hind, Hindl [[; Hinc, Hinc [[; Kpn, Kpn I: Ps t, Pst I). Sequencing direction and extension are indicated by arrows. 110 9 and 1110 are the regions recognized by the oligonucleotide sequencing primers. It is the rank. T18 and T19 were each terminated with a poly(A) tail. Degenerate PC R primer BIF (Bl), B2R (B2), B3R/F (B3) and B4 R (B4) and β, primers BTE2F (BTE2) and BTE3F ( The region recognized by BTE3) is the guinea pig c/DNA pine described above. It is noted in the section. kb represents kilobase.

新規モルモットインテグリンβサブユニットのヌクレオチド配列モルモット気道 上皮細胞からのｃＤＮＡとＢＩＦ及びＢ２Ｒ（、図１）の共通プライマー混合物 とを用いたＰＣＲは、約３５０ヌクレオチドの予想されたサイズを存するＤＮＡ フラグメントを増幅した。フラグメントＤＮＡが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにお けるクローニング後に配列決定された場合、組換えクローンは、各々２つの区別 できる配列のうちの１つを有する挿入部を含有していた。一方の配列は、ヒトβ 、の予想領域と９７％同一であり、従ってモルモットβ１であると仮定された９ ８アミノ酸の長さをコードしていた。他方の配列は、ヒトβ１に対して５３％、 ヒトβ２に対して４５％及びヒトβ、に対して５７％のみ同一である９８アミノ 酸をコードしていた（図２、クローンＩＦ）、両方のモルモット配列は、インテ グリンβサブユニット共通配列であるＳｅｒ−Ｘ−３ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｘ−Ａｓｐ −Ａｓｐ−Ｌｅｕ及びＧａｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｖａ　ｌを含 み、共に、全ての既知のインテグリンβサブユニットにおけるこの領域内に認め られる、２つのシスティン残基を含有していた。これらのデータは、我々が得た ２つの配列のうちの１つがインテグリンβサブユニットファミリーの新しいメン バーをコードしていたこと示唆している。Nucleotide sequence of novel guinea pig integrin β subunit Guinea pig airway Common primer mixture of cDNA from epithelial cells and BIF and B2R (Figure 1) PCR using The fragment was amplified. Fragment DNA is converted into pBluescript. When sequenced after cloning, each recombinant clone has two distinct It contained an insert with one of the possible sequences. One sequence is human β , which was 97% identical to the predicted region of , and was therefore assumed to be guinea pig β1. It encoded a length of 8 amino acids. The other sequence is 53% relative to human β1; 98 amino acids that are only 45% identical to human β2 and 57% identical to human β. (Fig. 2, clone IF), both guinea pig sequences encoded Ser-X-3er-Met-X-Asp, a common sequence for glin β subunits - Contains Asp-Leu and Gay-Phe-Gly-3er-Phe-Val Both are found within this region in all known integrin β subunits. It contained two cysteine residues. These data we obtained One of the two sequences represents a new member of the integrin β subunit family. This suggests that the bar was coded.

この新規な配列は、更に２つの縮重プライマーを組み合わせて（Ｂ３Ｒ及びＢ４ Ｒ１図１．２及び４を参照）、新規な配列に特異的なプライマー（ＢＴＥ　２　 Ｆ及びＢＴＥ３Ｆ）を利用して、更にＰＣＲを行うことによって伸長された。Ｂ ＴＥ　２　Ｆ／Ｂ　３　Ｒのプライマー・ペアを用いて、２つの異なるｃＤＮＡ 生成物が、２２０ヌクレオチド更に下流の部位（図２における８３′）とＢ３Ｒ プライマーとの予想しなかったハイブリダイゼーションによって得られた（図２ における３Ｌ及び３Ｎ）。これらのクローンによって決定された１７３２ヌクレ オチド配列は図３に示されている。This novel sequence was further developed by combining two degenerate primers (B3R and B4 R1 (see Figures 1.2 and 4), a primer specific for the novel sequence (BTE2 F and BTE3F) and was further extended by PCR. B Using the TE2F/B3R primer pair, two different cDNA The product is located 220 nucleotides further downstream (83' in Figure 2) and at the B3R obtained by unexpected hybridization with primers (Fig. 2 3L and 3N). 1732 nuclei determined by these clones The otid sequence is shown in Figure 3.

図３は、ヒト（Ｈ）及びモルモット（Ｇ　Ｐ）のβ、におけるヌクレオチド配列 及びアミノ酸翻訳を示している。アミノ酸翻訳は、ヒトβ６の翻訳領域から、各 コドンの第２ヌクレオチドの下に１文字コードによって表した。モルモットの配 列において、ヒトの配列と異なるアミノ酸のみが示されている。右側マージンに 沿っである数字は、各列の最後に入るヌクレオチド又はアミノ酸番号を表してい る。用いられたナンバリングシステムは、示された各配列に有効な第１ヌクレオ チド又はアミノ酸により開始された。ヒトβ、の推定される細胞外ドメインにお けるＮ−グリコシレージョンの９の可能部位には、下線を付した。Figure 3 shows the nucleotide sequences in human (H) and guinea pig (GP) β. and amino acid translation are shown. Amino acid translation starts from the translated region of human β6. It is represented by a one-letter code below the second nucleotide of the codon. Guinea pig placement In the columns, only amino acids that differ from the human sequence are shown. in the right margin The numbers along the line represent the nucleotide or amino acid number that falls at the end of each column. Ru. The numbering system used is the first nucleotide valid for each sequence shown. initiated by a titanide or an amino acid. in the putative extracellular domain of human β. The 9 possible sites for N-glycosylation are underlined.

ヒトβ、ヌクレオチド配列 モルモジ１−ｃＤＮＡプローブＩＦ及び３Ｙ（図２参照）によるヒト膵臓癌細胞 株ＦＧ−２から構築されたｃＤＮＡライブラリのスクリーニング、並びにクロー ンＴ１０の部分から構築されたプローブによるその次のスクリーニングは、１４ の独立した陽性クローンを生成した。２つの最長クローン（Ｔ１８及びＴ１９） は、ポリ（Ａ）尾部まで伸長していた。アガロースゲルにおけるこれらのクロー ンの切り出された挿入部の配列情報及び移動度に基づいて構築された、これらの クローンのマツプは、図２に示されている。このマツプは、５′末端において、 少なくとも２２６ヌクレオチドの非翻訳領域、２３６４ヌクレオチドのオーブン ・リーディング・フレーム及び約２．５キロ塩基の３′非翻訳領域を含む、約５ キロ塩基のｍＲＮＡを予測し得る。この分子は、インテグリンβ、と命名された 。Human β, nucleotide sequence Human pancreatic cancer cells using Mormoji 1-cDNA probes IF and 3Y (see Figure 2) Screening and cloning of a cDNA library constructed from strain FG-2. Subsequent screening with probes constructed from portions of the protein T10 generated independent positive clones. Two longest clones (T18 and T19) extended to the poly(A) tail. These clones in agarose gel These were constructed based on the sequence information and mobility of the excised inserts of the The clone map is shown in Figure 2. This map has, at the 5′ end, Untranslated region of at least 226 nucleotides, oven of 2364 nucleotides - Approximately 5 Kilobase mRNA can be predicted. This molecule was named integrin β. .

図３は、ヒトβ、における部分的ヌクレオチド及び完全アミノ酸配列（最も３′ 側の非翻訳領域を除り）、並びにモルモット気道上皮細胞ｃＤＮＡのＰＣＲによ り得られた配列の１７３２ヌクレオチドのアライメントを示している。両種にお いて、配列決定された領域から推論される５７７アミノ酸のうち、３６残基だけ が異なる二アミノ酸配列は９４％同一である。更に、両種において配列決定され た１７３２ヌクレオチドのうち、９１％が同一である。ヒトβ、の推定細胞外ド メインに存在する９のグリコシレージョン可能部位は下線で示される。モルモッ トβ、において得られた５７７アミノ酸の内部にある７全てのこれらの部位は、 モルモットタンパク質においても存在する。このグリコシレージョン可能部位全 てが平均分子量２．５００を有するオリゴ糖によって占有される場合、ヒトβ、 の予測分子量は、１０６．０００となるであろう。Figure 3 shows the partial nucleotide and complete amino acid sequences (most 3' (excluding side untranslated regions) and by PCR of guinea pig airway epithelial cell cDNA. A 1732 nucleotide alignment of the resulting sequences is shown. In both species Of the 577 amino acids deduced from the sequenced region, only 36 residues Two different amino acid sequences are 94% identical. Furthermore, in both species, sequenced Of the 1732 nucleotides found, 91% are identical. The putative extracellular domain of human β The 9 main glycosylation possible sites are underlined. guinea pig All 7 of these sites within the 577 amino acids obtained in Also present in guinea pig proteins. All parts that can be glycosylated is occupied by an oligosaccharide with an average molecular weight of 2.500, human β, The predicted molecular weight of would be 106.000.

既に配列決定された３つのヒトβサブユニット及びショウジヨウバエのミオスフ ェロイドタンパク質に対するオーブン・リーディング・フレームから推論された ７８８アミノ酸配列の比較は、図４に示されている。Three previously sequenced human β subunits and Drosophila myosphins Inferred from the open reading frame for the yeloid protein A comparison of the 788 amino acid sequences is shown in Figure 4.

図４は、４つの既に報告されているインテグリンβサブユニットとのβ、のアラ イメントを示している。既に報告されているヒトβ１、ヒトβ７、ヒトβ３、シ ョウジヨウバエのミオスフエロイド遺伝子産物（βｍｙｏ）の配列及び（β、） として記述された新規な配列が、１文字アミノ酸コードを用いて示されている。Figure 4 shows the alignment of β with four previously reported integrin β subunits. ment. Already reported human β1, human β7, human β3, and Sequence of the Drosophila myospheroid gene product (βmyo) and (β,) The novel sequence described as is shown using the single letter amino acid code.

各列の上に、５Ｇの保存されたシスティンは★で、及び】２０の他の非変異型ア ミノ酸は；て、表している。膜通過ドメインは下線が付けられている。共通βサ ブユニツトプライマーＢＩＦ　（Ｂｌ）、Ｂ２Ｒ（Ｂ２）、８３Ｆ／Ｒ（Ｂ３） 及びＢ４Ｒ（Ｂ４）を構築するために用いた領域は、ボールド文字でアライメン トの下に標識された。右側マージンに沿った数字は、各推定シグナル配列の第１ アミノ酸から開始した各列における最後のアミノ酸番号を表している。Above each column, the conserved cysteine of 5G is marked with ★ and ]20 other non-mutated a Mino acids are represented by; Transmembrane domains are underlined. Common β service Unit primer BIF (Bl), B2R (B2), 83F/R (B3) The regions used to construct B4R (B4) and B4R (B4) are indicated with alignment in bold. Labeled below. Numbers along the right margin indicate the first of each putative signal sequence. Represents the last amino acid number in each column starting with the amino acid.

他の各βサブユニット及び５６の保存システィン残基を含むＢ６において同一で ある１７９アミノ酸残基が存在する。Ｂ６と他のヒトβサブユニットとの間で同 一なアミノ酸の総％は、β、に対して４７％、β１に対して４２％、β２に対し て３８％である。ヒトβ６は、ショウジヨウバエのβサブユニットに対しても３ ９％同一である。ヒトβ５、β、及びβ、並びにショウジヨウバエβサブユニッ トの全ては、４Ｉアミノ酸（図４において下線によって示されている推定膜通過 ドメインの後から開始する）からなる細胞質領域を有する。β、がこの細胞質領 域において１０の保存されたアミノ酸残基を各々含むが、カルボキシル末端にお ける１１アミノ酸伸長も含む。β、は、２つのＡｒ　ｇ−Ｇ　１　ｙ−Ａｓ　ｐ 配列も、一方は５１４−５１６番アミノ酸に、他方は５９４−５９６番アミノ酸 に含む。これらの領域は、インテグリンファミリーの他のリガンドにおける認識 部位として作用し得る。Identical in each of the other β subunits and B6, which contains 56 conserved cysteine residues. There are a certain 179 amino acid residues. Identical between B6 and other human β subunits The total percentage of identical amino acids is 47% for β, 42% for β1, and 42% for β2. The total is 38%. Human β6 is also 3-subunit to Drosophila β subunit. 9% identical. Human β5, β, and β, and Drosophila β subunit All of the 4I amino acids (presumed membrane passage indicated by underlining in Figure 4) It has a cytoplasmic region consisting of (starting after the domain). β, is this cytoplasmic region each contains 10 conserved amino acid residues in the carboxyl terminus. It also includes an 11 amino acid extension. β, is two Ar　g-G　1　y-As　p As for the sequence, one has amino acids 514-516 and the other has amino acids 594-596. Included in These regions are recognized by other ligands of the integrin family. Can act as a site.

プライマー・ペアＢ３Ｆ／Ｂ４Ｒ（図１参照）を用いたＰＣＲは、約７５０ヌク レオチドの予想サイズのフラグメントを増幅した。このフラグメントのクローニ ング及び配列決定は、新規なβサブユニツト配列を含む如何なる更なるクローン も生じず、ヒトβ、に該当する領域に対して９７％同一であるアミノ酸配列をコ ードする挿入部を有する幾つかのクローン及び、ヒトβ、に対して９３％同一で あるアミノ酸配列をコードする幾つかの他のクローンを生じた。これらは、恐ら く各々β１及びβ、のモルモット相同物である。モルモットのヌクレオチド配列 とヒ）・β、とは、８０％同一であり、モルモットのものとヒトβ、との場合は 、９１％同一である。PCR using primer pair B3F/B4R (see Figure 1) requires approximately 750 nuclei. A fragment of the expected size of leotide was amplified. crony of this fragment The sequencing and sequencing will be performed to identify any additional clones containing the novel β subunit sequence. Copying the amino acid sequence that does not occur and is 97% identical to the region corresponding to human β. 93% identical to human β and some clones with insertions that code for Several other clones were generated that encoded certain amino acid sequences. These are probably These are the guinea pig homologues of β1 and β, respectively. Guinea pig nucleotide sequence and h)・β are 80% identical, and in the case of guinea pig and human β, , 91% identical.

図５は、８３Ｆプライマーのすぐ下流の領域におけるヒト（Ｈ）及びモルモッ１ −（ＧＰ）のβ１、β２、β、及びＢ６からの、部分的ヌクレオチド及びアミノ 酸配列のアライメントを示している。１文字コードで表されたアミノ酸翻訳物は 、各コドンの第２ヌクレオチドの下に示されている。モルモットの配列において は、ヒトの配列と異なるアミノ酸のみが示されている。右側マージンに沿って示 されている数字は、ヒトβ、におけるヌクレオチド番号を表している。ヒトβ１ 及びβ、の配列は、既に報告されている論文からのものである。Figure 5 shows the human (H) and guinea pig 1 region immediately downstream of the 83F primer. - partial nucleotides and amino acids from β1, β2, β, and B6 of (GP) Alignment of acid sequences is shown. The amino acid translation product expressed as a one-letter code is , shown below the second nucleotide of each codon. In a guinea pig array Only amino acids that differ from the human sequence are shown. shown along the right margin. The numbers shown represent the nucleotide numbers in human β. human β1 The sequences of and β are from previously reported papers.

本発明の新規βサブユニットか他の既知のインテグリンと同様にα鎖と会合して いることを決定するため、β、の細胞質ドメインからのペプチドに対する抗血清 を調製した。下記のＢ６の細胞質ドメインからのアミノ酸ペプチドは調製され、 免疫化ラビッ）・に対して用いた：即ち、ＲＧＳＴＳＴＦＫＮＶＴＹＫＨＲ（７ ６３−７７７番残基）及びＹＫＨＲＥＫＱＫＶＤＬＳＴＤＣ（７７４−７８８番 残基）。この抗血清は、当業において既知の標準の手法に従って、ラビットにお いて調製された。The novel β subunit of the present invention associates with the α chain similar to other known integrins. Antiserum against peptides from the cytoplasmic domain of β, to determine that was prepared. The following amino acid peptides from the cytoplasmic domain of B6 were prepared: immunized Rabbit): i.e. RGSTSTFKNVTYKHR (7 (residues 63-777) and YKHREKQKVDLSTDC (residues 774-788) residue). This antiserum was tested in rabbits according to standard procedures known in the art. It was prepared using

簡単に示せば、ペプチドは、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｅ、　バーロウ及びり、ロウ（Ｌｏｗｅ）編集、コー ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリーズ、コールド・スプリング・ハーバ −、ニューヨーク州１１７２４に記載されているように、キーホール・リンペッ ト（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｙｍｐｅｔ）・ヘモシアニンに化学的に結合され、完全 （最初の注入のみ）又は不完全フロインドアジュバントのいずれかにおいて、ラ ビットに注入された。抗血清は、６８３０　（７６３−７７７番残基に一致する ペプチドに対する）及び６３４１　（７７４−７８８番残基に該当するペプチド に対する）と称された。Briefly, peptides are, for example, Antibodies: A Labora tory Manual, E., edited by Barlow and R. Lowe, code Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor -Keyhole Limpet, as described in New York State 11724. chemically bonded to keyhole lympet/hemocyanin and completely (first injection only) or in incomplete Freund's adjuvant. Injected into a bit. The antiserum was 6830 (corresponding to residues 763-777) peptide) and 6341 (peptide corresponding to residues 774-788) ).

得うレタポリクローナル抗体は、例えばカシジら、ＥＭＢＯＪ、３：６７３−６ ８０　（１９８９）に記載されたような当業の分野においてよく知られた手順に 従って、表面放射性ヨウ化物化された膵臓癌細胞株ＦＣ−２からのデタージエン ト溶解物を免疫沈降させるために用いられた。２つのバンドの複合体が、非還元 条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて各々１５０キロダルトン（Ｋｄ）及び９７Ｋ ｄとして沈降した。還元条件下では、２つのバンドは、拡散バンドとして移動し 、１３０Ｋｄから１１６Ｋ　ｄにわたった。これらのバンドは、前免疫血清がそ れらのいずれも沈降させず、該当する免疫原ペプチドの存在下で免疫沈降が行わ れた場合にそれらは存在しなかったので、これらのバンドは特異的であった。更 に、２つのバンドの同一複合体は、６８３０及び６８４１の抗体の両方によっ° Ｃ沈降された。これらはβ５ｃＤＮＡクローンから推論される細胞質配列からの 独立したペプチドに対して調製された。The obtained retapolyclonal antibodies are, for example, as described by Kassiji et al., EMBOJ, 3:673-6. 80 (1989), which are well known in the art. Therefore, surface radioiodized deterdiene from the pancreatic cancer cell line FC-2 was used to immunoprecipitate the cell lysate. The complex of the two bands is non-reduced. 150 kilodaltons (Kd) and 97K in 5DS-PAGE under conditions, respectively. It precipitated as d. Under reducing conditions, the two bands migrate as diffuse bands. , ranging from 130Kd to 116Kd. These bands indicate that the pre-immune serum Immunoprecipitation is performed in the presence of the relevant immunogenic peptide without precipitating any of these. These bands were specific because they were not present when tested. Change The same complex of two bands was detected by both 6830 and 6841 antibodies. C was precipitated. These are derived from cytoplasmic sequences deduced from the β5 cDNA clone. prepared for independent peptides.

２つの沈降されたバンドがβ６に該当するかを決定するために、表面放射性ヨウ 化物化されたＦＧ−２細胞からの５ＤＳ−熱変性溶解物は、６８４１抗体によっ て免疫沈降された。９７Ｋｄのバントのみが検出（非還元条件下）され、β、バ ンドとして同定された。還元条件下では、明らかなこのバンドの分子量は１１６ Ｋｄに増加し、多くの鎖内ジスルフィド結合の存在が示唆され、これは、β６及 び他のインテグリンβ鎖の一次構造によって構成されていた。To determine whether the two precipitated bands correspond to β6, surface radioactive iodine 5DS-heat-denatured lysates from conjugated FG-2 cells were purified with 6841 antibody. immunoprecipitated. Only the 97Kd band was detected (under non-reducing conditions), and β, band was identified as a Under reducing conditions, the apparent molecular weight of this band is 116 Kd increases, suggesting the presence of many intrachain disulfide bonds, which may be associated with β6 and and other integrin β chains.

非還元又は還元条件下における各々１５０Ｋｄ又は１３０Ｋｄである他方のバン ドは、溶解物の５ＤＳ−熱変性後に分離するので、αサブユニットであるらしく 、これは、β、ポリペプチドと非共有結合的に会合していることを示している。The other band is 150 Kd or 130 Kd, respectively, under non-reducing or reducing conditions. It appears to be an α subunit because it separates after 5DS-thermal denaturation of the lysate. , indicating that β is non-covalently associated with the polypeptide.

更に、ある他のインテグリンα鎖と同様に、恐らく、還元下において分離するジ スルフィド結合した小ペプチドのために、その分子量は、還元条件下において約 ２０Ｋｄ（非還元条件下における１５０Ｋｄに対して１３０Ｋｄ）程、減少する 。Furthermore, like some other integrin alpha chains, it is likely that dihydrogenases dissociate under reduction. Due to the small sulfide-linked peptide, its molecular weight is approximately It decreases by about 20 Kd (130 Kd compared to 150 Kd under non-reducing conditions). .

α鎖がβ６と会合していることを同定するために、αβ、インテグリン複合体は 、例えばカジジら、ＥＭＢＯＪ、、３：６７３−６８０　（１９８９）に記載さ れたような、当業の分野においてよく知られた手順に従って、６８４１−プロテ ィンＡ・セファロース・マトリクスにおける免疫アフィニティクロマトグラフィ によって精製された。To identify that the α chain is associated with β6, the αβ, integrin complex is , for example, in Kajiji et al., EMBOJ, 3:673-680 (1989). 6841-Protein, according to procedures well known in the art, such as Immunoaffinity chromatography on In-A Sepharose matrix refined by.

溶出物質は、ＦＧ−２細胞において発現していることが知られているα３、α７ 、α５、α６、α、及びα、に特異的な抗体によって免疫沈降された。デヴイッ ド・ツエリッシュ（Ｄａｖｉｄ　ｃｈｅｒｉｓｈ）　Ｐｈ、　Ｄ、スクリップス ・クリニック・アンド・リサーチ財団、ラホヤ、カリフォルニア州から入手され た抗α、モノクローナル抗体１４２．１９のみは、精製物質と反応した。これは 、α１がこの膵臓癌細胞株においてβ、と会合していることを示している。The eluted substances are α3 and α7, which are known to be expressed in FG-2 cells. , α5, α6, α, and α. David David Cherish Ph, D, Scripps - Obtained from Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA. Only the anti-α monoclonal antibody 142.19 reacted with the purified substance. this is , showing that α1 is associated with β in this pancreatic cancer cell line.

このデータを確認するために表面放射性ヨウ化物化ＦＣ−２溶解物において、免 疫除去実験は、カジジら、ＥＭＢＯＪ、、３：　６７３−６８０　（１９８９） に記載されたような、当業の分野においてよく知られた方法に従って行われた。To confirm this data, immunofluorescence was performed in surface radioiodized FC-2 lysates. The epidemic removal experiment is published by Kajiji et al., EMBOJ, 3: 673-680 (1989). This was done according to methods well known in the art, such as those described in .

細胞溶解物は、６８４１抗β、抗体又は、平行して対照抗血清によって除去され 、それから１４２．１９抗α９抗体によって免疫沈降された。少量のα、はβ、 除去溶解物における免疫沈降に存在し、９７Ｋｄβ、バンドは視覚的に確認され なかった。かわりに約９０Ｋｄのより小さいバンドが存在した。この小サイズバ ンドはこれらの細胞においてα、とも会合しているβ、鎖を表すことが仮定され る。正常ラビット血清により除去された対照溶解物において、３つすへてのバン ド即ち１５０Ｋｄ（αｖ）、９７Ｋｄ（βＳ）及び９０Ｋｄ（β、）は、抗α、 １４２．１９抗体による免疫沈降後に存在した。Cell lysates were depleted with 6841 anti-β, antibody or in parallel with control antiserum. , and then immunoprecipitated by 142.19 anti-α9 antibody. A small amount of α, is β, 97Kdβ present in the immunoprecipitates in the depleted lysate, the band was visually confirmed. There wasn't. Instead, a smaller band of approximately 90 Kd was present. This small size bar It is hypothesized that the chain represents the β chain that is also associated with the α chain in these cells. Ru. In control lysates depleted with normal rabbit serum, all three bands 150Kd (αv), 97Kd (βS) and 90Kd (β,) are anti-α, present after immunoprecipitation with 142.19 antibody.

他の免疫除去は、除去抗体として１４２．１９抗体又は対照抗体としてマウス抗 体を平行して用いて、実施された。抗αＶ１４２．１９抗体によるα、除去溶解 物の免疫沈降は、いずれのバンドの存在も示さず、α、含有インテグリン全てが 除かれていることを示している。しかし、６８４１抗β６抗体は２つのバンドの 複合体を更に沈降させ、１つはβ６に該当し、他はα、に近い分子量を有する。Other immunodepletions include the 142.19 antibody as the depletion antibody or the mouse anti-142.19 antibody as the control antibody. It was carried out using parallel bodies. α, removal lysis with anti-αV142.19 antibody Immunoprecipitation of the product did not show the presence of any bands, and all integrins contained indicates that it has been excluded. However, the 6841 anti-β6 antibody has two bands. The complexes are further precipitated, one corresponding to β6 and the other having a molecular weight close to α.

このα鎖は、しかし、抗α、モノクローナル抗体と非反応性であるので、α、と 異ならなければならず、ここではα、と呼ぶ。対照の除去溶解物において、６８ ４１抗β６抗体は、より強いバンドを沈降させ、ＦＧ−２細胞において２つのβ ６インテグリン、α、β、及びα、β、が存在することの可能性と矛盾しない。This α chain, however, is non-reactive with anti-α monoclonal antibodies, so must be different, and here we call it α. In the control depleted lysate, 68 41 anti-β6 antibody precipitated a more intense band, and the two β6 antibodies precipitated in FG-2 cells. This is consistent with the possibility that there are six integrins, α, β, and α, β.

本発明はここで好ましい実施例を参照して説明されてきたが、多くの修飾が本発 明の範囲から逸脱することなく行うことができるということは、理解されるべき である。従って、本発明は請求の範囲によってのみ、制限されるものではない。Although the invention has been described herein with reference to preferred embodiments, there are many modifications to the invention. It should be understood that this can be done without departing from the scope of the It is. Accordingly, the invention is not limited only by the scope of the claims.

β６ヒト（Ｈ）ＴＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＣＴＧＣＴＴＴＡＣＣＴＧＴＣＣ ＡＧＧＴＡＧＣＣＴＣＴＧＴＴＴＴＣＡ丁Ｔ１３６ＨＡＧＴＧＴＡＡＧＴＡＧＴ ＡＴＴＴＡＡＡＡＴＧＴＴＡＴＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＴＴＡ ＡＣＧＦＩＧ、３Ａ 丁ＣＡＧ丁ＣＴＴＡＡＴＧＡＡＡＡＣＴＴＴＣＴＡＡＣＴＴＡＴＡＴＣＴＣＡＡ ＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＡＡＡＧＣ１００ＡＴＡＴＴＣＡＧＣＧＴＴＧＧＴＣＴＴ ＧＴＡＡＣＧＣＴＧＡＡＧＧＴＡＡＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＣＧＧＴ　２０ ２ＦＩＧ、　３Ｂ −ψ０哨い　■〜ψｌ”ｌｏ　Ｍ？さ〜口αｌρω０１＋　シｌｌｎすωψ　７ １ｍずΦｉ補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　５年　７月　 ９日 ｌ、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　９１１００２３６ ２、発明の名称 新規なインテグリンβサブユニット及びその使用５、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国、カリフォルニア州　９４６１２−３５５０、オークラ ンド、トウニンティー　セカンド　フロア、レイクサイド　ドライブ　３００ 名　称　ザ　リージェンツ　オブ　ザ　ユニヴアーシティー　オブカリフォルニ ア　（ほか１名） 国　籍　アメリカ合衆国 ４、代理人 住　所　〒１６０　東京都新宿区新宿四丁目３番１７号ＨＫ新宿ビル７階　電話 ３３５７−５１７１１９９３年　２月　３日 ６、添付書類の目録 補正書の翻訳文　１通 請求の範囲 １、β、を含む、実質的に精製されたインテグリン細胞表面すセブターサブユニ ット。β6 human (H)TAAACACAGCTTTTCTGCTTTACCTGTCC AGGTAGCCTCTGTTTTCA Ding T136HAGTGTAAGTAGT ATTTAAAATGTTATAACTTTCAAGAAAGAAAGACTTTA ACGFIG, 3A Ding CAG Ding CTTAAT GAAAACTTTTCTAACTTATATCTCCAA GTTTCTTTTCAAAGC100ATATTCAGCGTTGGTCTT GTAACGCTGAAGGTAATTCATTTTTTAATCGGT 20 2FIG, 3B -ψ0 patrol ■〜ψl”lo M?Sa~mouth αlρω01+ sillnsuωψ 7 1mzuΦi amendment translation submission form (Patent Law Article 184-8) July 1993 9th day l.Indication of patent application PCT/US 91100236 2. Name of the invention Novel Integrin β Subunit and Uses thereof 5, Patent Applicant Address: Okura, California 94612-3550, United States Lakeside Drive 300, 2nd Floor, Townin Tea Name: The Regents of the Universal City of California A (1 other person) Nationality: United States of America 4. Agent Address: 7th floor, HK Shinjuku Building, 4-3-17 Shinjuku, Shinjuku-ku, Tokyo 160 Phone number: 3357-5171 February 3, 1993 6. List of attached documents 1 translation of the written amendment The scope of the claims Substantially purified integrin cell surface septa subunits containing 1, β, t.

２、ヒトにおいて、図３に説明されたアミノ酸配列を有する、請求の範囲１の実 質的に精製されたインテグリン細胞表面すセブターサブユニット。2. In humans, the fruit of claim 1 having the amino acid sequence illustrated in FIG. Qualitatively purified integrin cell surface septa subunit.

３、αサブユニットに結合されたβ、を含む、実質的に精製されたインテグリン 。3. Substantially purified integrin comprising β bound to an α subunit .

４、前記サブユニットがα、である、請求の範囲３のインテグリン。4. The integrin of claim 3, wherein the subunit is α.

５、前記サブユニットがα、である、請求の範囲３のインテグリン。5. The integrin of claim 3, wherein the subunit is α.

６、β、に対して特異的な、実質的に精製されたアミノ酸フラグメント。A substantially purified amino acid fragment specific for 6, β.

７、請求の範囲６のアミノ酸フラグメントとしてコードする遺伝子を含むベクタ ー。7. A vector comprising a gene encoded as an amino acid fragment according to claim 6. -.

８、請求の範＠７のベクターを含む宿主。8. A host comprising the vector of claim @7.

９、β６に特異的なアミノ酸配列に特異性を有する試薬であり、この場合、他の 分子から該β、サブユニットを区別することに用いることができる、当該試薬。9. It is a reagent that has specificity for the amino acid sequence specific to β6, and in this case, other The reagent can be used to distinguish the β subunit from the molecule.

１０、前記試薬が抗体である、請求の範囲９の試薬。10. The reagent of claim 9, wherein the reagent is an antibody.

＋１．　β、をコートする、実質的に精製された核酸。+1. A substantially purified nucleic acid that coats β.

国際調査報告 １““＾１“１−　Ｐσ／ＵＳ９１　／■２３６フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　１／２１　７ ２３６−４Ｂ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０ −２Ｊ３３１５６６　９０１５−２Ｊ ／／（Ｃ１２Ｎ　１５１０９　ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ１：９１） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （７２）発明者　シェパード、ディーンアメリカ合衆国、カリフォルニア州 ９４６１０、オークランド、ヒュバート　ロード　１００６ Ｉ Ｃ１２Ｒ１：９１） （７２）発明者　クアランタ、ビト アメリカ合衆国、カリフォルニア州 ９２０３７、ラ　ホヤ、ノティングハム　ブレイス　８８６１ （７２）発明者　パイテラ、ロバート アメリカ合衆国、カリフォルニア州 ９４１１４、サン　フランシスコ、フリントストリート　２２international search report 1""^1"1-　Pσ/US91　/■236 Continuation of front page (51) Int, C1,6 identification symbol Internal office reference number C12N 1/21 7 236-4B C12P 21102 C9282-48GOIN 33153 D 8310 -2J331566 9015-2J //(C12N 15109 ZNA C12R1:91) (C12N 1/21 C12R1:19) (C12P 21102 C12R1:19) (72) Inventor Shepard, Dean, California, United States of America 1006 Hubert Road, Oakland, 94610 I C12R1:91) (72) Inventor Quaranta, Vito California, United States 92037, La Jolla, Nottingham Brace 8861 (72) Inventor: Pietera, Robert California, United States 22 Flint Street, San Francisco, 94114

Claims (21)

【特許請求の範囲】[Claims] １．β６を含む、実質的に精製されたインテグリン細胞表面リセプターサブユニ ット。1. Substantially purified integrin cell surface receptor subunits containing β6 t. ２．ヒトにおいて、図３に説明されたアミノ酸配列を有する、請求の範囲１の実 質的に精製されたインテグリン細胞表面リセプターサブユニット。2. In humans, the fruit of claim 1 having the amino acid sequence illustrated in FIG. Qualitatively purified integrin cell surface receptor subunits. ３．αサブユニットに結合されたβ６を含む、実質的に精製されたインテグリン 。3. Substantially purified integrin containing β6 bound to an α subunit . ４．前記サブユニットがα■である、請求の範囲３のインテグリン。4. 4. The integrin of claim 3, wherein said subunit is α■. ５．前記サブユニットがαＦである、請求の範囲３のインテグリン。5. 4. The integrin of claim 3, wherein said subunit is αF. ６．β６に対して特異的な、実質的に精製されたアミノ酸フラグメント。6. A substantially purified amino acid fragment specific for β6. ７．請求の範囲６のアミノ酸フラグメントとしてコードする遺伝子を含むベクタ ー。7. A vector comprising a gene encoded as an amino acid fragment according to claim 6. -. ８．請求の範囲７のベクターを含む宿主。8. A host comprising the vector of claim 7. ９．β６に特異的なアミン酸配列に特異性を有する試薬。9. A reagent that has specificity for an amino acid sequence specific to β6. １０．前記試薬が抗体である、請求の範囲９の試薬。10. 10. The reagent of claim 9, wherein said reagent is an antibody. １１．β６をコードする、実質的に精製された核酸。11. A substantially purified nucleic acid encoding β6. １２．請求の範囲１１の核酸のヌクレオチド配列と特異的にハイプリダイズする 、実質的に精製された核酸。12. specifically hybridizes with the nucleotide sequence of the nucleic acid of claim 11. , a substantially purified nucleic acid. １３．請求の範囲１２の核酸と特異的にハイプリダイズし、且つ非β６ポリペプ チドをコードする核酸とハイプリダイズしない、実質的に精製された核酸。13. specifically hybridizes with the nucleic acid of claim 12 and which is a non-β6 polypeptide. A substantially purified nucleic acid that does not hybridize with a nucleic acid encoding tide. １４．β６含有インテグリンを発現している細胞の、該β６含有インテグリンに 結合することができるリガンドに対する結合阻害方法であって、該β６含有イン テグリンと該リガンドとの結合をブロツキングすることを含む、細胞の結合を阻 害する方法。14. β6-containing integrin of cells expressing β6-containing integrin A method of inhibiting binding to a ligand capable of binding, the method comprising: Blocking cell binding, including blocking the binding of tegrin to the ligand. How to harm. １５．前記ブロツキングが、前記β６含有インテグリンとそれに対して特異的な 試薬との結合によって遂行される、請求の範囲１４の方法。15. The blocking is directed against the β6-containing integrin and its specific 15. The method of claim 14, carried out by association with a reagent. １６．前記ブロツキングが、前記β６含有インテグリンのリガンドと該リガンド に特異的な試薬との結合によって遂行される、請求の範囲１４に記載の方法。16. The blocking is performed using a ligand of the β6-containing integrin and the ligand. 15. The method according to claim 14, which is carried out by binding with a reagent specific for. １７．前記試薬がＲＧＤ含有ペプチド又はポリペプチドである、請求の範囲１５ の方法。17. Claim 15, wherein the reagent is an RGD-containing peptide or polypeptide. the method of. １８．前記試薬がインテグリン結合部位を含むリガンドフラグメントである、請 求の範囲１５の方法。18. The claim is that the reagent is a ligand fragment containing an integrin binding site. 15 methods of seeking scope. １９．β６含有インテグリンを結合するリガンドの検出方法であって、該β６含 有インテグリンと該β６含有インテグリンと結合すると思われる該リガンドを含 む溶液とを接触すること、及び該β６含有インテグリンに結合された該リガンド の存在を検出することを含む、リガンドの検出方法。19. A method for detecting a ligand that binds a β6-containing integrin, the method comprising: containing integrin and the ligand that is thought to bind to the β6-containing integrin. and the ligand bound to the β6-containing integrin. A method for detecting a ligand, the method comprising detecting the presence of a ligand. ２０．β６含有インテグリンを発現する細胞における細胞接着を増加させる方法 であって、細胞において、該β６含有インテグリンの過剰発現を含む、細胞接着 を増加させる方法。20. Method of increasing cell adhesion in cells expressing β6-containing integrins cell adhesion comprising overexpression of the β6-containing integrin in the cell. How to increase. ２１．β６含有インテグリンを発現している細胞における細胞接着を減少させる 方法であって、該β６含有インテグリンとリガンドとの結合を含む、細胞接着を 減少させる方法。21. Reduces cell adhesion in cells expressing β6-containing integrins A method for promoting cell adhesion, comprising binding of the β6-containing integrin to a ligand. How to reduce it.