JPH0733799A - Thrombin having high specific activity and its production - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain the subject compound stable in a cold place for a long period and useful as a clinical medicine by converting a prothrombin composite material into to thrombin. CONSTITUTION:This thrombin can be obtained by allowing thromboplastin, snake poison, etc., to act on a prothrombin composite material (preferably human-deruved plasma protein-containing material, etc.) in a composite material state in the presence of about 0.0001 to 0.01M benzamidine (e.g. p- aminobenzamidine) and Ca<+2> and further treating it with a cation-exchanger (e.g. sufloethyl type such as sulfoethyl-dextran). The specific activity is >=1000 unit/A280.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、高比活性を有するトロ
ンビンおよびその製造方法に関する。詳細には、高い比
活性を有しかつ安定なトロンビンであり、およびその製
造方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to thrombin having a high specific activity and a method for producing the same. In particular, it relates to thrombin having a high specific activity and stability, and a method for producing the same.

【０００２】[0002]

【従来の技術】トロンビンは分子量約３４０００、等電
点約７．１のセリンプロテアーゼであり、血液凝固過程
の最終段階に働く蛋白分解酵素である。すなわち、フィ
ブリノゲンに作用してフィブリンを生成することにより
血液凝固作用を生じる。このため、トロンビンは臨床的
には外科領域における局所止血剤として、また内科領域
における上部消化管出血などの止血剤として用いられて
いる。BACKGROUND OF THE INVENTION Thrombin is a serine protease having a molecular weight of about 34,000 and an isoelectric point of about 7.1, and is a proteolytic enzyme that acts at the final stage of the blood coagulation process. That is, it acts on fibrinogen to produce fibrin, which causes a blood coagulation action. Therefore, thrombin is clinically used as a local hemostatic agent in the surgical field and as a hemostatic agent for upper gastrointestinal bleeding in the medical field.

【０００３】トロンビンは、生体内においては前駆物質
であるプロトロンビンの形で存在しており、活性化Ｘ因
子などによって限定分解を受けて生成される。従来、ト
ロンビンの製造は、ヒトなどの血漿を原料として、まず
プロトロンビンを抽出、精製し、得られた精製プロトロ
ンビンにトロンボプラスチンなどを作用させて行われて
いる。すなわち、トロンビンへの変換は精製されたプロ
トロンビンを対象にして行われているのである。このよ
うに、トロンビンの製造は、まず上記の如く(1) プロト
ロンビンの精製からはじまり、(2) プロトロンビンから
トロンビンへの変換、(3) トロンビンの精製などの各種
の数工程を経て製造されているのが現状である。[0003] Thrombin exists in the form of prothrombin which is a precursor in the living body, and is produced by limited decomposition by activated factor X and the like. BACKGROUND ART Conventionally, thrombin has been produced by using human blood plasma as a raw material to first extract and purify prothrombin, and then allowing the obtained purified prothrombin to act on thromboplastin and the like. That is, the conversion to thrombin is performed on the purified prothrombin. As described above, the production of thrombin is carried out through various steps such as (1) purification of prothrombin, (2) conversion of prothrombin to thrombin, and (3) purification of thrombin as described above. is the current situation.

【０００４】また、この方法を基本として各種の改良方
法が報告されている。例えば、クエン酸処理した血漿を
陰イオン交換体に接触させ、吸着したプロトロンビンを
当該交換体上でトロンビンに変換した後に溶出・回収す
る方法（米国特許第５１４３８３８９号）、血漿を低温
エタノール処理後、陰イオン交換体処理することにより
精製したプロトロンビンをトロンビンに変換し、更に陽
イオン交換体処理により精製する方法（特開平３−１２
８３９８号）などが知られている。Various improvements have been reported based on this method. For example, a method in which citric acid-treated plasma is brought into contact with an anion exchanger, adsorbed prothrombin is converted to thrombin on the exchanger, and then eluted and recovered (US Pat. No. 5,138,389), plasma is treated with low temperature ethanol, A method in which prothrombin purified by treatment with an anion exchanger is converted into thrombin and further purified by treatment with a cation exchanger (JP-A-3-12).
8398) and the like are known.

【０００５】しかし、これらの方法で取得されたトロン
ビンは、比活性が低くかつ極めて不安定であるという問
題があった。特に安定性に関しては、製剤化のためには
欠かせない条件であるため、従来よりトロンビンの安定
性を確保するための方法が様々講じられている。However, the thrombin obtained by these methods has a problem that it has a low specific activity and is extremely unstable. Particularly, since stability is an essential condition for formulation, various methods have been conventionally taken to ensure the stability of thrombin.

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、比活
性の高いトロンビンを提供することである。また、本発
明のもう一つの目的は、比活性が高くかつ安定性の高い
トロンビンの製造方法を提供することである。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide thrombin having a high specific activity. Another object of the present invention is to provide a method for producing thrombin having high specific activity and high stability.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、トロンビンに変換
する出発原料としてプロトロンビン複合体を用いること
により、比活性の高いトロンビンが簡便に製造できるこ
とを見出した。さらに本発明者らは、かかる方法で得ら
れたトロンビンが溶液状態においても冷所で長時間安定
であることを見出した。本発明者らは、本発明方法で得
られたトロンビンが、従来のトロンビンに比し極めて比
活性の高いものであることを確認して本発明を完成し
た。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have found that a thrombin having a high specific activity can be easily obtained by using a prothrombin complex as a starting material for converting into thrombin. It was found that it can be manufactured. Furthermore, the present inventors have found that the thrombin obtained by such a method is stable in a cold state for a long time even in a solution state. The present inventors have completed the present invention by confirming that thrombin obtained by the method of the present invention has extremely high specific activity as compared with conventional thrombin.

【０００８】すなわち、本発明は１０００単位／Ａ₂₈₀
以上もの高い比活性を有するトロンビンである。さら
に、本発明はプロトロンビン複合体の状態にて、プロト
ロンビンをトロンビンに変換する処理に付することを特
徴とするトロンビンの製造方法である。That is, the present invention is 1000 units / A ₂₈₀
It is thrombin having a high specific activity as described above. Furthermore, the present invention is a method for producing thrombin, which comprises subjecting prothrombin to conversion into thrombin in a prothrombin complex state.

【０００９】本発明の方法において、プロトロンビンを
トロンビンに変換する処理に付す対象物は、プロトロン
ビン複合体である。ここで用いられるプロトロンビン複
合体は、血液凝固因子の１つであるプロトロンビン（血
液凝固第II因子）と共にその他の血液凝固に関係する因
子を含んだものである。プロトロンビンと共に含まれる
成分としては、例えば血液凝固第VII因子、第IX因子、
第Ｘ因子などが挙げられる。またこれは、高純度精製品
である必要はなく粗製品であってもよい。In the method of the present invention, the object to be treated for converting prothrombin into thrombin is the prothrombin complex. The prothrombin complex used herein contains prothrombin (blood coagulation factor II), which is one of the blood coagulation factors, and other factors related to blood coagulation. The components contained together with prothrombin include, for example, blood coagulation factor VII, factor IX,
Factor X and the like can be mentioned. Further, it does not have to be a high-purity refined product and may be a crude product.

【００１０】また、プロトロンビン複合体の由来および
その取得方法は特に制限されない。本発明方法は、プロ
トロンビン複合体自体またはプロトロンビン複合体を含
有するもの全てを変換処理の出発原料とすることができ
る。プロトロンビン複合体を含有するものとして、好ま
しくは血漿蛋白含有物が例示される。この場合、例えば
血漿そのもの、好ましくは血漿を当該複合体が含まれる
程度に適当な精製処理を施したものを、変換処理の原料
として使用することができる。血漿の由来も特に問わ
ず、例えばウシ由来のもの，ヒト由来のもの等が挙げら
れるが、好ましくはヒト由来のものである。The origin of the prothrombin complex and the method for obtaining the same are not particularly limited. In the method of the present invention, the prothrombin complex itself or all those containing the prothrombin complex can be used as the starting material for the conversion treatment. As the one containing a prothrombin complex, a plasma protein-containing material is preferably exemplified. In this case, for example, plasma itself, preferably plasma that has been appropriately purified to the extent that the complex is contained, can be used as a raw material for the conversion treatment. The origin of plasma is not particularly limited, and examples thereof include bovine origin and human origin, but human origin is preferable.

【００１１】血漿を精製処理して変換処理の原料である
プロトロンビン複合体とする場合において、血漿の精製
処理方法としては、公知の手段が用いられる。例えば、
特開昭６２−１００１９号公報および特開平３−１２８
３９８号公報に記載の方法が使用できる。具体的には、
血漿を陰イオン交換体で処理してプロトロンビン複合体
を調製する方法，血漿からクリオプレシピテートを除い
た脱クリオ血漿を用いてプロトロンビン複合体を調製す
る方法等が挙げられる。陰イオン交換体としては、ＤＥ
ＡＥ系（例えばＤＥＡＥ−アガロース，ＤＥＡＥ−デキ
ストラン，ＤＥＡＥ−セルロースなど）、ＱＡＥ系（例
えば、ＱＡＥ−アガロース，ＱＡＥ−デキストランな
ど）等が挙げられる。In the case of purifying plasma to obtain a prothrombin complex which is a raw material for the conversion treatment, known methods are used as a method for purifying plasma. For example,
JP-A-62-10019 and JP-A-3-128
The method described in Japanese Patent No. 398 can be used. In particular,
Examples thereof include a method of preparing a prothrombin complex by treating plasma with an anion exchanger, and a method of preparing a prothrombin complex using decryoplasma obtained by removing cryoprecipitate from plasma. As an anion exchanger, DE
Examples thereof include AE systems (eg DEAE-agarose, DEAE-dextran, DEAE-cellulose etc.), QAE systems (eg QAE-agarose, QAE-dextran etc.) and the like.

【００１２】上記の手段で得られたプロトロンビン複合
体は、その複合体の状態でトロンビンへの変換処理に付
すことができる。変換処理として、プロトロンビンをト
ロンビンに変換する公知の方法を用いることができる。
例えば、プロトロンビンにＣａ⁺²の存在下にトロンボプ
ラスチン，ヘビ毒などを作用させる方法、高濃度クエン
酸塩による自然転化法等を用いることができる。The prothrombin complex obtained by the above means can be subjected to a conversion treatment into thrombin in the state of the complex. As the conversion treatment, a known method for converting prothrombin into thrombin can be used.
For example, a method of causing thromboplastin, snake venom, etc. to act on prothrombin in the presence of Ca ⁺² , a natural conversion method using high-concentration citrate, and the like can be used.

【００１３】本発明においては、特に当該変換処理の際
にベンズアミジン類（ベンズアミジン，ｐ−アミノベン
ズアミジンなど）を共存させておくことが好ましい。ベ
ンズアミジン類を共存させておくことにより、プロトロ
ンビンからトロンビンへの変換を安定な状態で実施で
き、収率よくトロンビンが取得できる。ベンズアミジン
類の添加量としては０．０００１〜０．１Ｍ程度、好ま
しくは０．０００１〜０．０１Ｍ程度が例示される。In the present invention, it is particularly preferable that benzamidines (benzamidine, p-aminobenzamidine, etc.) are allowed to coexist during the conversion treatment. By allowing benzamidines to coexist, the conversion of prothrombin to thrombin can be carried out in a stable state, and thrombin can be obtained in good yield. The addition amount of benzamidines is, for example, about 0.0001 to 0.1M, preferably about 0.0001 to 0.01M.

【００１４】上記変換処理により得られた処理物は、次
にトロンビンの精製工程に付される。かかる精製方法と
しては、複合体の状態で変換したトロンビンを当該複合
体から単離しうる方法であるならいかなる方法をも使用
することができ、例えば陽イオン交換体による処理、硫
安分画処理、アフィニティクロマトグラフィー処理（リ
ガンドとして、例えばアルギニルメチルエステルあるい
はヘパリンナトリウムなどを用いることが好ましい。）
方法などが使用できる。好ましくは、陽イオン交換体処
理（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０（１３），ｐ２５
０１，１９７１年に記載の方法など）である。使用され
る陽イオン交換体としては、例えば、スルホエチル型
（スルホエチル−デキストラン，スルホエチル−アガロ
ース等），スルホプロピル型（スルホプロピル−デキス
トラン，スルホプロピル−アガロース等），カルボキシ
メチル型（カルボキシメチル−デキストラン，カルボキ
シメチル−アガロース等），アンバーライトＩＲＣ５０
等が挙げられる。The treated product obtained by the above conversion treatment is then subjected to a thrombin purification step. As such a purification method, any method can be used as long as it is a method capable of isolating thrombin converted in a complex state from the complex, for example, treatment with a cation exchanger, ammonium sulfate fractionation treatment, affinity Chromatographic treatment (for example, it is preferable to use arginyl methyl ester or heparin sodium as a ligand.)
The method etc. can be used. Preferably, it is treated with a cation exchanger (for example, Biochem., 10 (13), p25.
01, 1971, etc.). Examples of the cation exchanger used include sulfoethyl type (sulfoethyl-dextran, sulfoethyl-agarose etc.), sulfopropyl type (sulfopropyl-dextran, sulfopropyl-agarose etc.), carboxymethyl type (carboxymethyl-dextran, Carboxymethyl-agarose), Amberlite IRC50
Etc.

【００１５】陽イオン交換体処理は、トロンビンが他の
夾雑物から精製物として単離される条件のもとで行われ
る。具体的には、陽イオン交換体への吸着および洗浄
は、好ましくは０．０１〜０．１Ｍの塩化ナトリウムを
含有する０．０１〜０．０５Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ
６〜８程度）、あるいは０．０１〜０．１Ｍの塩化ナト
リウムを含有する０．０１〜０．２Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ６〜８程度）を用いることによって行われる。ま
た、溶出には０．０５〜０．３Ｍ、ｐＨ６〜８程度のク
エン酸緩衝液を用いることが好ましい。The cation exchanger treatment is carried out under the condition that thrombin is isolated as a purified product from other contaminants. Specifically, adsorption to a cation exchanger and washing are preferably carried out in a citrate buffer solution (pH: 0.01 to 0.05M) containing 0.01 to 0.1M sodium chloride.
6 to 8), or 0.01 to 0.2 M phosphate buffer (pH 6 to 8) containing 0.01 to 0.1 M sodium chloride. For elution, it is preferable to use a citrate buffer solution having a pH of about 6 to 8 at 0.05 to 0.3M.

【００１６】なお、透析、限外濾過、ゲル濾過などの公
知の手段により、さらに精製を行うこともできる。Further purification can be carried out by known means such as dialysis, ultrafiltration and gel filtration.

【００１７】本発明においては、上記陽イオン交換体処
理の前に予め、プロトロンビン複合体変換処理物を炭素
原子数１〜１０個、特に２〜１０個のアルキル基を有す
るジアルキルホスフェートまたはトリアルキルホスフェ
ートと、特に好ましくは更に界面活性剤との共存下に接
触してウイルスを不活化（以下、ＳＤ処理という。）し
ておくほうがより好ましい。ＳＤ処理は公知の方法（特
開昭６０−５１１１６号公報、特開平３−２１８３２２
号公報）に準じて行うことができる。また、特に好まし
くはＳＤ処理時に安定化剤として、ベンズアミジン類
（ベンズアミジン、ｐ−アミノベンズアミジン等）、塩
基性アミノ酸（アルギニン、リジン等）あるいはε−ア
ミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）を添加し、共存状態で行う
方法である。添加量としては、ベンズアミジン類で０．
０００１〜０．１Ｍ程度、塩基性アミノ酸で０．１〜１
Ｍ程度、ＥＡＣＡで１〜１０％（ｗ／ｖ）程度（いずれ
も最終濃度）が例示される。In the present invention, a prothrombin complex-converted product is previously treated with a dialkyl phosphate or trialkyl phosphate having an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, particularly 2 to 10 carbon atoms, before the cation exchanger treatment. It is more preferable that the virus is inactivated (hereinafter referred to as SD treatment) by contact in the presence of a surfactant. SD processing is a known method (Japanese Patent Laid-Open No. 60-51116, Japanese Patent Laid-Open No. 3-218322).
No. publication). Further, particularly preferably, benzamidines (benzamidine, p-aminobenzamidine, etc.), basic amino acids (arginine, lysine, etc.) or ε-aminocaproic acid (EACA) are added as a stabilizer during SD treatment in a coexisting state. Is the way to do it. The amount of benzamidines added was 0.
0001-0.1M, 0.1-1 for basic amino acids
For example, about M, about 1 to 10% (w / v) in EACA (all are final concentrations).

【００１８】上記ＳＤ処理時に用いられる界面活性剤と
して、好ましくは非イオン性界面活性剤であり、ポリオ
ール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル（Ｓｐ
ａｎ系）、ポリオキシエチレン・ソルビタン脂肪酸エス
テル（Ｔｗｅｅｎ系）、ポリオキシエチレン・アルキル
フェノールエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系）、ポリオキシエ
チレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン高級アルキ
ルエーテル等が挙げられる。具体的にはＴｗｅｅｎ８０
（別名ポリソルベート８０）、トリトンＸ１００、スル
ホベタイン等が例示される。The surfactant used during the SD treatment is preferably a nonionic surfactant such as a polyol fatty acid ester and a sorbitan fatty acid ester (Sp.
an), polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (Tween type), polyoxyethylene alkylphenol ether (Triton type), polyoxyethylene fatty acid ester, polyoxyethylene higher alkyl ether and the like. Specifically, Tween80
(Also known as polysorbate 80), Triton X100, sulfobetaine and the like are exemplified.

【００１９】上記の処理により、夾雑する各種蛋白（例
えば、フィブリノゲン、フィブリン、α₁ グロブリン、
α₂ グロブリン、βグロブリン、γグロブリン、プロテ
アーゼなど）から単離された精製トロンビンを得ること
ができる。かかるトロンビンの比活性は、少なくとも１
０００単位／Ａ₂₈₀ 程度であることが好ましい。ここで
１単位／Ａ₂₈₀ は１単位／ｍｇ蛋白に相当する。なお、
トロンビンの比活性は通常の測定方法により求めること
ができる。好ましくはヒト血漿をフィブリノーゲン源と
して、ＢＢＬフィブロメーターなどにより凝固時間を測
定することにより求める方法である。具体的には、生理
食塩液にて様々な割合で希釈された検体０．１ｍｌを３
７℃に２分間保ち、次いで３７℃に保たれていた血漿
０．２ｍｌを加え、凝固時間を測定することによって求
めることができる。By the above treatment, various proteins that are contaminated (for example, fibrinogen, fibrin, α ₁ globulin,
Purified thrombin isolated from α ₂ globulin, β globulin, γ globulin, protease, etc.) can be obtained. The specific activity of such thrombin is at least 1.
It is preferably about 000 units / A ₂₈₀ . Here, 1 unit / A ₂₈₀ corresponds to 1 unit / mg protein. In addition,
The specific activity of thrombin can be determined by a usual measuring method. The method is preferably a method in which human plasma is used as a fibrinogen source and the coagulation time is measured by a BBL fibrometer or the like. Specifically, 0.1 ml of the sample diluted with physiological saline at various ratios was added to 3
It can be determined by keeping at 7 ° C. for 2 minutes, then adding 0.2 ml of plasma kept at 37 ° C., and measuring the coagulation time.

【００２０】当該トロンビンは自体公知の手法により製
剤化することにより高比活性を有するトロンビン製剤と
することができる。この際、必要に応じて、医薬上許容
される担体，添加剤などの添加および加熱，滅菌，除菌
濾過処理，分注小分け，凍結乾燥処理などが通常の方法
に準じて行われる。The thrombin can be made into a thrombin preparation having a high specific activity by formulating it by a method known per se. At this time, if necessary, addition of a pharmaceutically acceptable carrier, additives, etc. and heating, sterilization, sterilization filtration treatment, dispensing subdivision, freeze-drying treatment and the like are carried out according to ordinary methods.

【００２１】[0021]

【発明の効果】本発明により調製されたトロンビンは、
少なくとも１０００単位／Ａ₂₈₀ もの高い比活性を有す
る。従来品および市販品のトロンビン製剤の比活性が５
００〜６００単位／Ａ₂₈₀ 程度であることから、本発明
のトロンビンはトロンビン製剤として極めて有用であ
る。加えて、本発明により調製されたトロンビンは、溶
液状態においても冷所で長時間安定である。従って、本
発明の方法は、トロンビンの製造方法として極めて実用
的なものであり、しかも、調製された精製トロンビンは
有用な医薬品として臨床に提供することができる。The thrombin prepared according to the present invention is
It has a high specific activity of at least 1000 units / A ₂₈₀ . Conventional and commercial thrombin preparations have a specific activity of 5
Since it is about 00 to 600 units / A ₂₈₀ , the thrombin of the present invention is extremely useful as a thrombin preparation. In addition, the thrombin prepared by the present invention is stable in a cold place for a long time even in a solution state. Therefore, the method of the present invention is extremely practical as a method for producing thrombin, and the prepared purified thrombin can be clinically provided as a useful drug.

【００２２】[0022]

【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例を
挙げるが、本発明はこれらに何ら限定されるものではな
い。EXAMPLES Examples will be given to explain the present invention in more detail, but the present invention is not limited thereto.

【００２３】実施例１ プロトロンビン、トロンビンの
調製 ヒト血漿を凍結融解して得た脱クリオ血漿２リットル
を、０．０７５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１Ｍクエ
ン酸ナトリウムからなる緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した
ＤＥＡＥ−デキストラン（商品名ＤＥＡＥ−セファデッ
クス、Ａ−５０、ファルマシア社製）に接触させて、プ
ロトロンビン複合体を吸着させた後に、１Ｍ塩化ナトリ
ウムおよび０．０１Ｍクエン酸ナトリウムからなる緩衝
液（ｐＨ７）で溶出した。溶出液を透析後にトロンボプ
ラスチン、２．５％塩化カルシウムおよび０．０８２Ｍ
ベンズアミジンを各々１／１０量ずつ添加して２５℃で
３時間加温した。ｐＨを７に調整し、トリ−Ｎ−ブチル
ホスフェート（ＴＮＢＰ）、Ｔｗｅｅｎ８０およびＥＡ
ＣＡを各々、最終濃度で０．３％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ
／ｖ）および４％（ｗ／ｖ）となるように添加し、３０
℃で６時間加温した。次に、上記反応液をｐＨを６．７
に調整し、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．
７）で平衡化したスルホプロピル−デキストラン（商品
名ＳＰ−セファデックス Ｃ−５０、ファルマシア社
製）に接触させて、トロンビンのみを吸着させた。かか
るカラムを０．０２Ｍクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ
６．７）、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）、次
いで０．０４５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）溶液で
洗浄後、吸着させたトロンビンを０．１Ｍクエン酸ナト
リウム溶液（ｐＨ７）で溶出・単離した。溶出液をペリ
コン（分画分子量１万：ミリポア社製）にて濃縮し、除
菌濾過して精製トロンビンを調製した。各精製工程にお
いて、得られるプロトロンビン、トロンビンの精製度
（比活性、回収率）を表１に示す。Example 1 Preparation of Prothrombin and Thrombin 2 liters of decryogenic plasma obtained by freeze-thawing human plasma was equilibrated with a buffer solution (pH 7) consisting of 0.075 M sodium chloride and 0.01 M sodium citrate. After contacting with DEAE-dextran (trade name: DEAE-Sephadex, A-50, manufactured by Pharmacia) to adsorb the prothrombin complex, a buffer solution (pH 7) consisting of 1M sodium chloride and 0.01M sodium citrate. Eluted at. After dialysis of the eluate, thromboplastin, 2.5% calcium chloride and 0.082M
Benzamidine was added in an amount of 1/10 each and heated at 25 ° C. for 3 hours. Adjusted pH to 7, tri-N-butyl phosphate (TNBP), Tween 80 and EA
The final concentrations of CA were 0.3% (w / v) and 1% (w, respectively).
/ V) and 4% (w / v), and add 30
Warm at 6 ° C for 6 hours. Next, the reaction solution was adjusted to pH 6.7.
Adjusted to 0.02M sodium citrate (pH 6.
Thrombin alone was adsorbed by contacting it with sulfopropyl-dextran (trade name SP-Sephadex C-50, manufactured by Pharmacia) equilibrated in 7). The column was loaded with 0.02M sodium citrate solution (pH
6.7), washed with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5) and then with 0.045 M sodium citrate (pH 7) solution, and then adsorbed thrombin with 0.1 M sodium citrate solution (pH 7). Eluted and isolated. The eluate was concentrated with Pellicon (molecular weight cut-off 10,000: manufactured by Millipore) and sterilized by filtration to prepare purified thrombin. Table 1 shows the degree of purification (specific activity, recovery rate) of prothrombin and thrombin obtained in each purification step.

【００２４】[0024]

【表１】 [Table 1]

【００２５】実施例２ プロトロンビン、トロンビン
の調製 ヒト血漿を凍結融解して得た脱クリオ血漿を、０．０７
５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１Ｍクエン酸ナトリウ
ムからなる緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ファデックス Ａ−５０に接触させ、０．１５Ｍ塩化ナ
トリウムおよび０．０１Ｍクエン酸ナトリウムからなる
緩衝液（ｐＨ７）で洗浄後、１Ｍ塩化ナトリウムおよび
０．０１Ｍクエン酸ナトリウムからなる緩衝液（ｐＨ
７）で溶出した。溶出液に２．５％塩化カルシウムおよ
びトロンボプラスチンを各々１／１０量ずつ添加して１
５℃で３時間加温した。ｐＨを７に調整し、トリ−Ｎ−
ブチルホスフェート（ＴＮＢＰ）、Ｔｗｅｅｎ８０およ
びＥＡＣＡを各々、最終濃度で０．３％（ｗ／ｖ）、１
％（ｗ／ｖ）および４％（ｗ／ｖ）となるように添加
し、３０℃で６時間加温した。次に、上記反応液をｐＨ
を６．７に調整し、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ６．７）で平衡化したスルホプロピル−デキストラン
（商品名ＳＰ−セファデックス Ｃ−５０、ファルマシ
ア社製）に接触させて、トロンビンのみを吸着させた。
かかるカラムを０．０２Ｍクエン酸ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ６．７）、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）、
次いで０．０４５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）溶液
で洗浄後、吸着させたトロンビンを０．１Ｍクエン酸ナ
トリウム溶液（ｐＨ７）で溶出・単離した。溶出液をペ
リコン（分画分子量１万：ミリポア社製）にて濃縮し、
除菌濾過して精製トロンビンを調製した。Example 2 Preparation of prothrombin and thrombin Decryoplasm obtained by freeze-thawing human plasma was 0.07
Contact with DEAE-Sephadex A-50 equilibrated with a buffer consisting of 5M sodium chloride and 0.01M sodium citrate (pH 7) to form a buffer consisting of 0.15M sodium chloride and 0.01M sodium citrate (pH 7). ), A buffer consisting of 1M sodium chloride and 0.01M sodium citrate (pH
It was eluted in 7). Add 1/5 each of 2.5% calcium chloride and thromboplastin to the eluate
It was heated at 5 ° C for 3 hours. The pH was adjusted to 7 and Tri-N-
Butyl phosphate (TNBP), Tween 80 and EACA were each 0.3% (w / v) final concentration, 1
% (W / v) and 4% (w / v) were added, and the mixture was heated at 30 ° C. for 6 hours. Next, the reaction solution is adjusted to pH.
Was adjusted to 6.7 and 0.02M sodium citrate (p
H6.7) was contacted with sulfopropyl-dextran (trade name SP-Sephadex C-50, manufactured by Pharmacia) to adsorb only thrombin.
The column was loaded with 0.02 M sodium citrate solution (p
H6.7), 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5),
Then, after washing with a 0.045 M sodium citrate (pH 7) solution, the adsorbed thrombin was eluted and isolated with a 0.1 M sodium citrate solution (pH 7). The eluate was concentrated with Pellicon (molecular weight cutoff 10,000: manufactured by Millipore),
Sterilization filtration was performed to prepare purified thrombin.

【００２６】比較例１ プトロンビン単体からのトロ
ンビンの調製 コーンの第II＋III 抽出画分から０．１Ｍ塩化ナトリウ
ム溶液でプロトロンビンを単体の形で抽出した。得られ
た抽出液をｐＨ６．７に調整した後、１％塩化カルシウ
ム（１／１０量）、トロンボプラスチン（１／１０量）
および血漿（１／４０量）を添加して２０℃で３時間加
温した。この反応液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
５）で平衡化させておいた陰イオン交換体（ＳＰ−セフ
ァデックスＣ−５０，ファルマシア製）に接触させ、
０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）にて吸着させた
トロンビンを溶出させた。溶出液に、０．３％（ｗ／
ｖ）ＴＮＢＰ、１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および４
％（ｗ／ｖ）ＥＡＣＡを添加し、３０℃で６時間加温し
た（ＳＤ処理）。得られた反応液を０．０２Ｍクエン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させておいたアフィニテ
ィカラム（カラム：ヘパリントーヨーパール，トーソー
社製）に付し、０．３Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
でトロンビンを溶出した。この溶出液を限外濾過膜（分
画分子量１万）にて濃縮し、除菌濾過して精製トロンビ
ンを調製した。Comparative Example 1 Preparation of thrombin from putrombin alone Prothrombin was extracted from the corn No. II + III extraction fraction with 0.1 M sodium chloride solution in the form of a simple substance. After adjusting the pH of the obtained extract to 6.7, 1% calcium chloride (1/10 amount) and thromboplastin (1/10 amount)
And plasma (1/40 volume) was added and heated at 20 ° C. for 3 hours. This reaction solution was added with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.
5) contacting with the anion exchanger (SP-Sephadex C-50, Pharmacia) equilibrated in 5),
The adsorbed thrombin was eluted with 0.1 M citrate buffer (pH 6.7). In the eluate, 0.3% (w /
v) TNBP, 1% (w / v) Tween 80 and 4
% (W / v) EACA was added, and the mixture was heated at 30 ° C. for 6 hours (SD treatment). The obtained reaction solution was applied to an affinity column (column: Heparin Toyopearl, manufactured by Tosoh Corporation) equilibrated with 0.02M citrate buffer (pH 7.0), and 0.3M citrate buffer ( pH 6.0)
The thrombin was eluted at. This eluate was concentrated with an ultrafiltration membrane (molecular weight cutoff of 10,000) and sterilized by filtration to prepare purified thrombin.

【００２７】実験例１ 実施例１で取得された本発明のトロンビンの各性状を、
比較例１で得られたコーンの第II＋III 抽出画分から調
製したトロンビン精製品および市販のトロンビン製剤
（化血研製）と比較した。 (1)比活性 トロンビン力価および２８０ｎｍでの吸光度を測定し、
その比活性を比較した。その結果、本発明のトロンビン
は１０００単位／Ａ₂₈₀ であるのに対して、第II＋III
抽出画分由来のものは５５５単位／Ａ₂₈₀ 、市販品は５
８２単位／Ａ_{28 0} であった。 (2)分布 セルロースアセテート電気泳動の結果、本発明のトロン
ビンはβ画分が１００％であるのに対して、第II＋III
抽出画分由来のものは５５％、市販品は９２％であっ
た。 (3)分子量測定 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（ファストシステム、ファ
ルマシア社製）の結果、本発明のトロンビンは非還元下
で、分子量３万４千の単一バンドとして確認されたが、
第II＋III 抽出画分由来のものおよび市販品では分子量
３万４千のバンド以外に高分子側、低分子側にバンドが
認められた。 高速液体クロマトグラフィーによるゲル濾過分析（カ
ラム：ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ（トーソー
製），移動相：０．２Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸
緩衝液 (pH 6.8), 流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ，検出波
長：２８０ｎｍ）を行った結果、本発明のトロンビンは
保持時間１３．２分付近に単一のピークとして得られた
のに対して、第II＋III 抽出画分由来および市販品では
保持時間１３．２分付近のピークの他に夾雑ピークが出
現した。 (4)安定性 実施例１のトロンビンを５００単位／ｍｌおよび１７０
０単位／ｍｌの溶液状態で２５℃で７日間保存した場
合、トロンビン力価の低下は見られず安定であった。一
方、市販品を１０００単位／ｍｌの溶液状態で同様に保
存したところ、２０％程度力価が低下した。Experimental Example 1 Each property of the thrombin of the present invention obtained in Example 1 was
The comparison was made with a thrombin purified product prepared from the corn II + III extraction fraction obtained in Comparative Example 1 and a commercially available thrombin preparation (manufactured by KEIKAKEN). (1) Specific activity The thrombin titer and the absorbance at 280 nm were measured,
The specific activities were compared. As a result, the thrombin of the present invention is 1000 units / A ₂₈₀ , whereas the thrombin of the present invention is II + III.
555 units / A ₂₈₀ derived from the extracted fraction, 5 commercially available
82 was units / A _{28 0.} (2) Distribution As a result of cellulose acetate electrophoresis, the thrombin of the present invention has 100% β fraction, whereas
The extraction fraction was 55%, and the commercial product was 92%. (3) Molecular weight measurement As a result of SDS-PAGE electrophoresis (Fast System, manufactured by Pharmacia), the thrombin of the present invention was confirmed as a single band with a molecular weight of 34,000 under non-reducing conditions.
In addition to the band with a molecular weight of 34,000, bands derived from the II + III extracted fraction and the commercial product were observed on the high molecular side and the low molecular side. Gel filtration analysis by high performance liquid chromatography (column: TSKgel G3000SWXL (manufactured by Tosoh Corporation), mobile phase: 0.2M NaCl-containing 0.1M phosphate buffer (pH 6.8), flow rate: 0.8 ml / min, detection wavelength: 280 nm) As a result, the thrombin of the present invention was obtained as a single peak at a retention time of around 13.2 minutes, whereas the thrombin of the present invention derived from the II + III extracted fraction and a peak at a retention time of around 13.2 minutes were obtained. Besides, a contaminated peak appeared. (4) Stability 500 units / ml of thrombin of Example 1 and 170
When stored in a solution of 0 unit / ml at 25 ° C. for 7 days, the thrombin titer was stable without any decrease. On the other hand, when a commercially available product was similarly stored in a solution state of 1000 units / ml, the titer decreased by about 20%.

【００２８】[0028]

【表２】 [Table 2]

【００２９】実験例２ 実施例２のトロンビンの安定性 実施例２で得られたトロンビンを用いて、６０００単位
／ｍｌ，ｐＨ６、１０００単位／ｍｌ，ｐＨ５．５およ
びｐＨ６の検体溶液を調製し、１０℃および２５℃で８
週間保存した後のトロンビン力価の残存率を調べた。そ
の結果、本発明方法で調製されたトロンビンは、溶液状
態、通常の冷蔵保存（１０℃）において、少なくとも８
週間は安定であることがわかった。Experimental Example 2 Stability of thrombin of Example 2 Using the thrombin obtained in Example 2, sample solutions of 6000 units / ml, pH 6, 1000 units / ml, pH 5.5 and pH 6 were prepared, 8 at 10 ° C and 25 ° C
The remaining rate of thrombin titer after storage for a week was examined. As a result, the thrombin prepared by the method of the present invention was at least 8% in solution and in ordinary refrigerated storage (10 ° C).
The week turned out to be stable.

【００３０】[0030]

【表３】 [Table 3]

【００３１】参考例１ トロンビンへの変換反応の条
件の検討 トロンビンへの変換反応開始１時間後に各種安定化剤
を添加し、添加後４時間経過後のトロンビン活性の残存
率から、安定化剤のトロンビンに対する安定化効果を調
べたReference Example 1 Examination of Conditions for Conversion Reaction to Thrombin Various stabilizers were added 1 hour after the start of the conversion reaction to thrombin, and from the residual rate of thrombin activity 4 hours after the addition, the stability of the stabilizer was determined. The stabilizing effect on thrombin was investigated

【００３２】[0032]

【表４】 [Table 4]

【００３３】安定化剤を最初から添加した状態でトロ
ンビンへの変換反応（２５℃，３時間）を行った。表４
に各種安定化剤のトロンビンに対する安定化効果を示
す。A conversion reaction to thrombin (25 ° C., 3 hours) was carried out with the stabilizer added from the beginning. Table 4
Shows the stabilizing effect of various stabilizers on thrombin.

【００３４】[0034]

【表５】 [Table 5]

【００３５】上記およびの結果、一番効果のあっ
たベンズアミジンの濃度をかえた場合の安定化効果につ
いて検討した。As a result of the above and above, the stabilizing effect when the concentration of benzamidine having the most effect was changed was examined.

【００３６】[0036]

【表６】 [Table 6]

【００３７】参考例２ 各種添加剤を共存させてＳＤ処理時の安定化条件を検討
した。使用した添加剤およびその濃度を表７に記載す
る。これらの添加剤の共存下に３０℃で６時間処理し
た。結果を表７に示す。Reference Example 2 Stabilizing conditions during SD treatment were examined in the presence of various additives. The additives used and their concentrations are listed in Table 7. It was treated at 30 ° C. for 6 hours in the presence of these additives. The results are shown in Table 7.

【００３８】[0038]

【表７】 [Table 7]

【００３９】安定化剤であるアルギニン（表８）およ
びＥＡＣＡ（表９）の添加濃度と安定化効果の関係を確
認した。The relationship between the stabilizing effect of arginine (Table 8) and EACA (Table 9) as stabilizers and the stabilizing effect was confirmed.

【００４０】[0040]

【表８】 [Table 8]

【００４１】[0041]

【表９】 [Table 9]

【００４２】アルギニンを添加する場合は最終濃度０．
４Ｍ以上で安定化効果が認められた。また、ＥＡＣＡの
場合は１％ｗ／ｖ以上の添加であれば安定化効果がある
ことが判明した。When arginine is added, the final concentration is 0.
A stabilizing effect was observed at 4 M or more. Further, in the case of EACA, it was found that the addition of 1% w / v or more has a stabilizing effect.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 森定 康明 大阪市都島区都島中通３−５−44 株式会 社ミドリ十字都島工場内 (72)発明者 松本 勇彦 大阪市都島区都島中通３−５−44 株式会 社ミドリ十字都島工場内 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Yasuaki Morisada 3-5-44, Miyajima Shimadori, Miyakojima-ku, Osaka City Midori Cross Miyakojima Plant (72) Inventor Yuuhiko Matsumoto Nakajima, Miyajima, Miyakojima-ku, Osaka 3-5-44 Midori Cross Miyakojima Plant Stock Company

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 比活性が１０００単位／Ａ₂₈₀ 以上であ
るトロンビン。1. Thrombin having a specific activity of 1000 units / A ₂₈₀ or more. 【請求項２】 プロトロンビン複合体をトロンビンへの
変換処理に付することを特徴とするトロンビンの製造方
法。2. A method for producing thrombin, which comprises subjecting a prothrombin complex to conversion treatment into thrombin. 【請求項３】 プロトロンビン複合体をトロンビンへの
変換処理に付し、得られた処理物を陽イオン交換体で処
理することによりトロンビンを回収することを特徴とす
るトロンビンの製造方法。3. A method for producing thrombin, which comprises recovering thrombin by subjecting a prothrombin complex to conversion treatment into thrombin, and treating the obtained treated product with a cation exchanger.