JPH07330797A - New cell adhesion-active peptide - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain the subject new peptide found in the propolypeptide of the von Willebrand's disease factor, having a specific amino acid sequence, having an activity to specifically adhere to a myeloma cell, and useful for medicines effective for inhibiting cancer metastasis, etc. CONSTITUTION:This new cell adhesion-active peptide is found in the propolypeptide of the von Willebrand's disease factor (pp-vWF), has an amino acid sequence of the formula or the sequence wherein one or more amino acids are added to, deleted from or substituted for thr amino acid sequence, has a cell adhesion activity specially to myeloma cells, and is useful for medicines effective in the inhibition of cancer metastasis, etc. The peptide is obtained by digesting the pp-vWF purified and isolated from bovine platelet by immunoaffinity chromatography with an enzyme, and subsequently separating and purifying the digestion product by reverse-phase high performance liquid chromatography.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は新規な細胞接着活性ペプ
チドに関する。本発明の細胞接着活性ペプチドは特にメ
ラノーマ細胞に対する顕著な細胞接着活性を示し、癌転
移の阻止などの医薬用途に応用しうる。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel cell adhesion active peptide. The cell-adhesive active peptide of the present invention exhibits a remarkable cell-adhesive activity particularly to melanoma cells, and can be applied to pharmaceutical applications such as the prevention of cancer metastasis.

【０００２】[0002]

【従来技術】組織を構築する細胞は、細胞外マトリック
ス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ：ＥＣ
Ｍ）とよばれるおもにフィブロネクチン、ラミニン、コ
ラーゲン、プロテオグリカンなどからなる網目状の構造
体に取り囲まれて存在している。このＥＣＭへの細胞接
着が、細胞の形態調節、増殖、分化、および細胞の移動
などにおおいに関与している。このプロセスは特定の細
胞表面レセプターと特定のマトリックスタンパク質との
相互作用によって媒介される。表面レセプターの発現が
異なるために、異なる細胞は異なるタンパク質と接着す
る。2. Description of the Related Art Cells that make up tissue are extracellular matrix (EC).
It is surrounded by a mesh-like structure mainly composed of fibronectin, laminin, collagen, proteoglycan, etc. called M). The cell adhesion to the ECM is largely involved in cell morphology control, proliferation, differentiation, cell migration and the like. This process is mediated by the interaction of specific cell surface receptors with specific matrix proteins. Different cells adhere to different proteins due to different expression of surface receptors.

【０００３】ところで多くの細胞が各種インテグリンを
含む１以上のクラスのレセプターを介してフィブロネク
チン、ラミニンおよびコラーゲンに接着することが知ら
れている（Ｂｕｃｋ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ
ｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１７９−２０
５，１９８７；Ａｋｉｙａｍａ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ．，
１０３１：９１−１１０，１９９０）。これらの３つの
タンパク質はＥＣＭ中に多量に存在し、生理的条件下で
の組織の維持に重要であるが、この他にもインビトロで
の細胞接着活性をもち、より特定された段階で重要な役
割を果たすと考えられる多数のタンパク質が存在する。
トロンボスポンジン（Ｓｕｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１８：６９３−７０１，１９９
２）、テナシン（Ｓｐｒｉｎｇ，Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｃｅ
ｌｌ ５９：３２５−３３４，１９８９）、フィブリノ
ーゲン（Ｄｅｊａｎａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１０４：１４０３−１４１１，１９８
７）、ビトロネクチン（Ｐｙｔｅｌａ，Ｒ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：５７６６−５７７０，１９８５）およびフォン
ビルブラント因子（Ｄｅｊａｎａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０９：３６７−３７５，１
９８９）がこれに含まれる。最近になって、これらの接
着性糖タンパク質が、胚形成や形態発生に重要な役割を
果たしており（Ｓａｇｅ，Ｅ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４８３１−１４８３
４，１９９１）、あるいは血管障害後の創傷治癒に関与
している（Ｐｌｏｗ，Ｅ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：５３８８−５３９１，１９８
４）ことを示す膨大な証拠が提出されている。By the way, it is known that many cells adhere to fibronectin, laminin and collagen through one or more classes of receptors including various integrins (Buck, CA et al., Ann).
u. Rev. Cell. Biol. 3: 179-20
5, 1987; Akiyama, S .; K. et a
l. , Biochem. Biophy. Acta. ，
1031: 91-110, 1990). These three proteins are abundant in ECM and are important for tissue maintenance under physiological conditions, but they also have in vitro cell adhesion activity and are important at more specific stages. There are numerous proteins that are thought to play a role.
Thrombospondin (Sun, X. et al., J.
Cell. Biol. 118: 693-701,199
2), Tenascin (Spring, J. et al., Ce
ll 59: 325-334, 1989), fibrinogen (Dejana, E. et al., J. Cel.
l. Biol. 104: 1403-1411, 198
7), vitronectin (Pytela, R. et a.
l. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82: 5766-5770, 1985) and von Willebrand factor (Dejana, E. et al.,
J. Cell. Biol. 109: 367-375, 1
989) is included in this. Recently, these adhesive glycoproteins play an important role in embryogenesis and morphogenesis (Sage, EH et al., J. et al.
Biol. Chem. 266: 14831-1483
4, 1991) or involved in wound healing after vascular injury (Plow, EF et al., J. Bi.
ol. Chem. 259: 5388-5391,198.
4) A huge amount of evidence has been submitted.

【０００４】成熟フォンビルブラント因子（ｖｏｎ Ｗ
ｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ：以下ｖＷＦと略す
ことがある）は血液凝固ＶＩＩＩ因子（抗血友病因子）
と複合体を形成している糖タンパク質である。ｖＷＦは
血漿中を循環し、血小板およびコラーゲンの双方への結
合を介して、内皮下層への血小板の接着を媒介すると考
えられている（Ｈｏｕｄｉｊｋ，Ｗ．Ｐ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５：５３１−５
４０，１９８５；Ｆｒｅｓｓｉｎａｕｄ，Ｅ．ｅｔａ
ｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７０：１２１４−１２１７，１９８
７）。Mature von Willebrand factor (von W
illbrand factor: hereinafter sometimes abbreviated as vWF) is blood coagulation factor VIII (antihemophilic factor)
It is a glycoprotein that forms a complex with. vWF circulates in plasma and is thought to mediate platelet adhesion to the subendothelial layer through binding to both platelets and collagen (Houdijk, WP et a.
l. J. Clin. Invest. 75: 531-5
40, 1985; Fressinaud, E .; eta
l. , Blood 70: 1214-1217, 198.
7).

【０００５】ｖＷＦの大きな前駆体であるプレプロ−ｖ
ＷＦがプロセシングされてプロ−ｖＷＦとなり、これが
さらに２つの分子：ｖＷＦのプロポリペプチド（ｐｐ−
ｖＷＦ）および成熟ｖＷＦに開裂する（Ｗａｇｎｅｒ，
Ｄ．Ｄ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
６：２１７−２４６，１９９０）。ｐｐ−ｖＷＦは非常
に大きなプロポリペプチド（約１００ｋＤａ）であっ
て、フォンビルブラント抗原ＩＩとも呼ばれている（Ｆ
ａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
２：９９５−９９８，１９８６）。本発明者らは、成熟
ｖＷＦとは異なり、ｐｐ−ｖＷＦがコラーゲンに結合
し、かつコラーゲン誘導の血小板凝集を阻害することを
発見した（Ｔａｋａｇｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６０１７−６０２０，１９８
９；Ｔａｋａｇｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６４：１０４２５−１０４３０，１９８
９）。本発明者らはさらに、血小板および内皮細胞を刺
激した際にこれらから放出されるタンパク質であるｐｐ
−ｖＷＦの生物学的機能を研究した。このタンパク質の
コラーゲンへの結合性、ならびに血小板凝集の阻害作用
から、本発明者らは該タンパク質がうっ血性血栓形成の
負のフィードバック機構に関与することを推定した（Ｔ
ａｋａｇｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６４：６０１７−６０２０，１９８９）。最近に
なって、本発明者らは、ｐｐ−ｖＷＦがトランスグルタ
ミナーゼである血液凝固第ＸＩＩＩ因子の基質として作
用し、またラミニンと特異的にクロスリンクすることを
見いだした（Ｕｓｕｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２３１１−１２３１６，１９
９３）。これらの知見は、ｐｐ−ｖＷＦが内皮下層ＥＣ
Ｍ中に取り込まれて、細胞とＥＣＭとの相互作用に影響
を及ぼすことを示唆する。Prepro-v, a large precursor of vWF
WF is processed into pro-vWF, which has two additional molecules: the vWF propolypeptide (pp-
vWF) and mature vWF (Wagner,
D. D. , Annu. Rev. Cell. Biol.
6: 217-246, 1990). pp-vWF is a very large propolypeptide (about 100 kDa) and is also called von Willebrand antigen II (F
ay, P.A. J. et al. , Science 23
2: 995-998, 1986). The present inventors have discovered that, unlike mature vWF, pp-vWF binds to collagen and inhibits collagen-induced platelet aggregation (Takagi, J. et al., J. Bi.
ol. Chem. 264: 6017-6020, 198.
9; Takagi, J .; et al. J. Biol.
Chem. 264: 10425-10430, 198.
9). The inventors have further shown that pp, a protein released from platelets and endothelial cells when they are stimulated.
-The biological function of vWF was studied. From the binding property of this protein to collagen and the inhibitory effect on platelet aggregation, the present inventors presumed that the protein is involved in the negative feedback mechanism of congestive thrombus formation (T
akagi, J .; et al. J. Biol. Che
m. 264: 6017-6020, 1989). Recently, we found that pp-vWF acts as a substrate for the transglutaminase, blood coagulation factor XIII, and also specifically crosslinks with laminin (Usui, T. et al. ., J. Bio
l. Chem. 268: 12311-12316, 19
93). These findings indicate that pp-vWF
It is taken up in M, suggesting that it influences the interaction of cells with ECM.

【０００６】さらに本発明者らは、ｐｐ−ｖＷＦの細胞
接着活性を検討し、ｐｐ−ｖＷＦがヒトメラノーマ細胞
などの一定の細胞に対しての接着活性をもつことを見い
だし、またこの細胞接着活性はｐｐ−ｖＷＦ分子の中央
付近ドメインを認識する抗体によって抑制されることを
発表した（第６６回日本生化学会講演要旨集、１９９３
年８月２５日）。Furthermore, the present inventors have examined the cell adhesion activity of pp-vWF and found that pp-vWF has an adhesion activity to certain cells such as human melanoma cells, and also this cell adhesion activity. Announced that it is suppressed by an antibody that recognizes the domain near the center of the pp-vWF molecule (Proceedings of the 66th Annual Meeting of the Biochemical Society of Japan, 1993).
August 25, 2014).

【０００７】しかしながら、ｐｐ−ｖＷＦの詳しい生物
学的機能ならびにｐｐ−ｖＷＦ中のどの部分が接着に関
与しているのか、については依然として不明なままであ
った。However, the detailed biological function of pp-vWF and which part of pp-vWF is involved in adhesion remained unclear.

【０００８】[0008]

【発明が解決すべき課題】したがって、本願発明の目的
は、ｐｐ−ｖＷＦの細胞接着活性を同定し、かつｐｐ−
ｖＷＦ中の細胞接着活性部位を特定してその生物学的機
能を解明し、併せてその医学的用途を検討することにあ
る。Therefore, the object of the present invention is to identify the cell adhesion activity of pp-vWF, and
The purpose is to identify the cell adhesion active site in vWF, elucidate its biological function, and study its medical use.

【０００９】[0009]

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成するために鋭意研究した結果、ｐｐ−ｖＷＦの中心
付近から得られた８ｋＤａ断片がメラノーマ細胞に対し
て極めて特異的に接着することを発見して本発明を完成
した。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies conducted by the present inventors in order to achieve the above object, the 8 kDa fragment obtained from the vicinity of the center of pp-vWF adheres to melanoma cells extremely specifically. The present invention was completed by discovering this.

【００１０】すなわち、本願発明は、配列表の配列番号
２に示すアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列におい
て１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失または置換さ
れたアミノ酸配列をもち、かつ細胞接着活性を有するペ
プチドを提供する。That is, the present invention has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing, or an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted or substituted in the amino acid sequence, and has cell adhesion activity. Provide a peptide.

【００１１】本発明の細胞接着活性を有するペプチドは
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列によって例示さ
れるが、これのみでなく、該アミノ酸配列において１も
しくは複数のアミノ酸が付加、欠失または置換されたア
ミノ酸をもつものであっても、細胞接着活性を有する限
り本発明に含まれる。例えば、３アミノ酸配列ＲＧＤ
（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）はフィブロネクチンの細胞
接着活性を示す最小アミノ酸配列として同定され、ほと
んどすべての細胞により認識される細胞接着シグナルで
あることが知られている（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅ
ｒ，Ｍ．Ｄ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０９：３０
−３３，１９８４）。この他にもＬＤＶ（Ｌｅｕ−Ａｓ
ｐ−Ｖａｌ）ペプチドなどの接着シグナルが同定されて
いる。したがって、配列番号２に示す配列の一部をもつ
短いペプチドであってもそれが細胞接着活性を有する限
り、本発明に含まれる。さらに、アミノ酸配列内の１も
しくは複数のアミノ酸を他のアミノ酸、例えば置換すべ
きアミノ酸と類似の性質をもつアミノ酸で置換されたペ
プチドも細胞接着活性を保持する限り本発明に含まれ
る。また、配列番号２に示す配列、またはその一部の配
列に１または複数のアミノ酸が付加したペプチドも細胞
接着活性を有する限り本発明に含まれる。例えば、本発
明では配列番号２に示すアミノ酸を含み、このＮ末端お
よびＣ末端に複数のアミノ酸が付加した配列番号３に示
す配列を有するペプチドを遺伝子組換え法により製造し
たが、このペプチドにも以下の実施例に示すように細胞
接着活性が確認された。The cell-adhesive peptide of the present invention is exemplified by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. Not only this but also one or more amino acids in the amino acid sequence are added, deleted or substituted. Even those having the specified amino acid are included in the present invention as long as they have cell adhesion activity. For example, the 3 amino acid sequence RGD
(Arg-Gly-Asp) was identified as the minimal amino acid sequence showing the cell adhesion activity of fibronectin, and is known to be a cell adhesion signal recognized by almost all cells (Pierschbache).
r, M. D. et al. , Nature 309: 30
33, 1984). In addition to this, LDV (Leu-As
Adhesion signals such as p-Val) peptides have been identified. Therefore, even a short peptide having a part of the sequence shown in SEQ ID NO: 2 is included in the present invention as long as it has cell adhesion activity. Furthermore, a peptide in which one or more amino acids in the amino acid sequence is replaced with another amino acid, for example, an amino acid having similar properties to the amino acid to be replaced, is also included in the present invention as long as it retains cell adhesion activity. Further, a peptide obtained by adding one or more amino acids to the sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a part of the sequence thereof is also included in the present invention as long as it has cell adhesion activity. For example, in the present invention, a peptide containing the amino acid shown in SEQ ID NO: 2 and having the sequence shown in SEQ ID NO: 3 with a plurality of amino acids added to the N-terminal and C-terminal was produced by gene recombination method. Cell adhesion activity was confirmed as shown in the following examples.

【００１２】本発明のペプチドは、それ自身が細胞接着
活性を有することにより種々の生物学的機能を果たすの
みでなく、その細胞接着活性のために、メラノーマなど
の細胞接着活性を介して転移すると考えられている腫瘍
細胞の細胞接着と競合する結果、該腫瘍の転移を阻害す
るなどの間接的な生物学的作用をも有する。したがっ
て、本発明にいう細胞接着活性には上記両方の意味を含
む。[0012] The peptide of the present invention not only fulfills various biological functions by itself having cell adhesion activity, but also when transferred through cell adhesion activity such as melanoma due to its cell adhesion activity. It also has indirect biological effects, such as inhibiting metastasis of the tumor, as a result of competing with the thought cell adhesion of tumor cells. Therefore, the cell adhesion activity referred to in the present invention includes both of the above meanings.

【００１３】本発明のペプチドが含まれるｐｐ−ｖＷＦ
と、正常組織および腫瘍組織由来の細胞株１４種との接
着性を検討したところ、ｐｐ−ｖＷＦはこれらの細胞の
うち、メラノーマ由来の細胞（Ｂ１６、Ｇ−３６１）と
のみ顕著に接着した。また、ＲＧＤ配列を含むペプチド
ＧＲＧＤＳＰ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅ
ｒ−Ｐｒｏ）が成熟ｖＷＦの接着を阻害したのに対し、
同ペプチドはｐｐ−ｖＷＦの接着に影響を与えなかっ
た。したがって、ｐｐ−ｖＷＦへの接着は、成熟ｖＷＦ
への接着に用いられるビトロネクチンレセプター（αＶ
β３）のようなＲＧＤ依存性インテグリンを介するもの
ではなく、ＲＧＤ非依存性インテグリンまたは非インテ
グリンタイプのレセプターを介しているものと推定され
る。Pp-vWF containing the peptide of the present invention
And the adhesion to 14 types of cell lines derived from normal tissues and tumor tissues was examined, and pp-vWF was significantly adhered only to melanoma-derived cells (B16, G-361) among these cells. In addition, a peptide GRGDDSP (Gly-Arg-Gly-Asp-Se containing an RGD sequence is used.
r-Pro) inhibited the adhesion of mature vWF, whereas
The peptide did not affect pp-vWF adhesion. Therefore, adhesion to pp-vWF is associated with mature vWF
Vitronectin receptor (αV
It is presumed that it is not through RGD-dependent integrins such as β3) but through RGD-independent integrins or non-integrin type receptors.

【００１４】さらに、Ｂ１６細胞のｐｐ−ｖＷＦへの接
着活性はＭｇ^２＋の濃度に依存して増加し、またＭｇ
^２＋存在下でのＢ１６のｐｐ−ｖＷＦへの接着は、Ｃａ
^２＋の添加により濃度依存的に阻害された。このＭｇ
^２＋依存性かつＣａ^２＋阻害可能な接着活性は、コラー
ゲンに対するα２β１媒介性接着などのβ１インテグリ
ン媒介性接着と極めてよく似ている。そこでヒトメラノ
ーマ細胞を用いてｐｐ−ｖＷＦへの接着に対する抗イン
テグリンモノクローナル抗体の影響を試験したところ、
抗β１抗体（４Ｂ４）の存在下でＧ−３６１細胞のｐｐ
−ｖＷＦへの接着は完全に阻害されたこと、また抗α２
抗体（６Ｆ１）はｐｐ−ｖＷＦの接着に何ら影響を与え
なかったことから、ｐｐ−ｖＷＦのレセプターはα２β
１ではなく、他のβ１インテグリンであることが示され
た。Furthermore, the adhesive activity of B16 cells to pp-vWF increases depending on the concentration of Mg ²⁺ , and
Adhesion of B16 to pp-vWF in the presence of ²⁺ is Ca
It was inhibited by the addition of ^{2+ in} a concentration-dependent manner. This Mg
^{The 2 +} -dependent and Ca2 ⁺ -inhibitable adhesive activity is very similar to β1-integrin-mediated adhesion, such as α2β1-mediated adhesion to collagen. Therefore, when the effect of anti-integrin monoclonal antibody on the adhesion to pp-vWF was tested using human melanoma cells,
Pp of G-361 cells in the presence of anti-β1 antibody (4B4)
-Adhesion to vWF was completely inhibited, and anti-α2
Since the antibody (6F1) had no effect on pp-vWF adhesion, the pp-vWF receptor was α2β.
It was shown to be another β1 integrin, but not 1.

【００１５】ｐｐ−ｖＷＦに対する各種モノクローナル
抗体を用いて、ウシｐｐ−ｖＷＦとＢ１６細胞との接着
活性の影響を調べた試験から、ｐｐ−ｖＷＦのＳｅｒ３
７６から始まる８ｋＤａ断片にｐｐ−ｖＷＦの接着部位
があることが示唆された。From a test in which the effect of the adhesion activity between bovine pp-vWF and B16 cells was investigated using various monoclonal antibodies against pp-vWF, Ser3 of pp-vWF was examined.
It was suggested that there is an adhesion site for pp-vWF in the 8 kDa fragment starting at 76.

【００１６】本発明者らは次いで８ｋＤａ断片をウシｐ
ｐ−ｖＷＦから単離し、その接着活性を直接検討した。
その結果、８ｋＤａ断片が濃度依存的にＢ１６細胞の接
着を促進することが確かめられた。We then used the 8 kDa fragment to transform bovine p
It was isolated from p-vWF and its adhesive activity was investigated directly.
As a result, it was confirmed that the 8 kDa fragment promotes adhesion of B16 cells in a concentration-dependent manner.

【００１７】本発明者らはさらに、該８ｋＤａ断片領域
を含むペプチドを組換えＤＮＡ法によって大腸菌で発現
させ、得られたペプチドの細胞接着活性を試験したとこ
ろ、この組換えペプチドはｐｐ−ｖＷＦと同様にヒトメ
ラノーマ細胞（Ｇ−３６１）に対する細胞接着活性を示
した。The present inventors further expressed a peptide containing the 8 kDa fragment region in Escherichia coli by the recombinant DNA method, and tested the cell adhesion activity of the obtained peptide. The recombinant peptide was identified as pp-vWF. Similarly, it showed cell adhesion activity to human melanoma cells (G-361).

【００１８】以上のことから、本発明の細胞接着活性ペ
プチドがｐｐ−ｖＷＦ中の細胞接着ドメインを構成し、
従来公知のＲＧＤペプチドなどとは異なる新規な細胞接
着活性ペプチドであることが明らかとなった。From the above, the cell adhesion active peptide of the present invention constitutes the cell adhesion domain in pp-vWF,
It was revealed that the peptide is a novel cell adhesion active peptide different from the conventionally known RGD peptide and the like.

【００１９】本発明のペプチドを製造するには、実施例
９で記載するように、牛ｐｐ−ｖＷＦを酵素消化したも
のを逆相高性能液体クロマトグラフィーなどにより分離
精製して得ることができる。The peptide of the present invention can be obtained by separating and purifying a product obtained by enzymatically digesting bovine pp-vWF by reverse phase high performance liquid chromatography or the like, as described in Example 9.

【００２０】また、本発明のペプチドは、配列表の配列
番号２に示す配列にしたがって、固相法、フラグメント
凝縮または古典的溶液合成法によって合成することがで
きる。好ましくは、固相ペプチド合成法（Ａｔｈｅｒｔ
ｏｎ ｅｔ ａｌ，，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐ
ｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ，１９８９）を用いて段階的に合成する。固相合成
法は通常、αアミノ基が保護された（側鎖が保護され
た）アミノ酸を適当な固体支持体に結合させることによ
ってカルボキシル基末端から実施される。Further, the peptide of the present invention can be synthesized by the solid phase method, fragment condensation or classical solution synthesis method according to the sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Preferably, the solid phase peptide synthesis method (Athert
on et al ,, Solid Phase Pep
side Synthesis: A Practica
l Approach, IRL Press, Oxfo
rd, 1989). Solid phase synthesis methods are usually performed from the carboxyl terminus by attaching an α-amino group protected (side chain protected) amino acid to a suitable solid support.

【００２１】さらに、組換えＤＮＡ法によって本発明の
ペプチドを製造することもできる。一般的手法について
は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈｏｒｂｏ
ｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈｏｒｂｏ
ｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。本発明者らは、
本発明ペプチドのアミノ酸配列の情報をもとにプライマ
ーを合成し、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクショ
ン）法を用いてｐｐ−ｖＷＦの８ｋＤａ領域を含むｃＤ
ＮＡを増幅した。Furthermore, the peptide of the present invention can be produced by the recombinant DNA method. For general methods, see, for example, Sambrook et al. , Mole
color Cloning: A Laborator
y Manual, ColdSpring Horbo
r Press, Cold Spring Horbo
r, New York. We have
A primer was synthesized based on the information of the amino acid sequence of the peptide of the present invention, and a cDNA containing the 8 kDa region of pp-vWF was prepared by PCR (polymerase chain reaction).
NA was amplified.

【００２２】このようにして得られたｃＤＮＡを適当な
ベクター中に組み込むことによって、原核細胞（大腸
菌、バシルス・ズブチリス、バシルス・サーモフィルス
など）または真核細胞（真核微生物としてはサッカロミ
セス・セレビシエなど、哺乳動物由来のものとしてはＣ
ＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、Ｈ
ｅｌａ細胞、ＢＨＫ細胞など）の宿主細胞を形質転換さ
せることができる。By incorporating the thus obtained cDNA into an appropriate vector, a prokaryotic cell (E. coli, Bacillus subtilis, Bacillus thermophilus, etc.) or a eukaryotic cell (e.g., Saccharomyces cerevisiae as a eukaryotic microorganism) can be obtained. , C derived from mammals
OS cells, CHO cells, C127 cells, 3T3 cells, H
host cells such as ela cells, BHK cells, etc.) can be transformed.

【００２３】さらに、これらのベクターに適当なプロモ
ーターおよび形質発現に係わる配列を導入することによ
って、それぞれの宿主において遺伝子を発現することが
可能である。Furthermore, it is possible to express the gene in each host by introducing an appropriate promoter and a sequence involved in expression into these vectors.

【００２４】以上のようにして目的とする細胞接着活性
ペプチドをコードする遺伝子で形質転換した形質転換体
を培養し、産生した細胞接着活性ペプチドを細胞内また
は細胞外から分離し均一にまで精製することができる。As described above, the transformant transformed with the gene encoding the desired cell adhesively active peptide is cultured, and the produced cell adhesively active peptide is separated from the inside or outside of the cell and purified to homogeneity. be able to.

【００２５】なお、本発明の細胞接着活性ペプチドの分
離、精製は、通常のペプチドで用いられる分離、精製方
法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例
えば、各種クロマトグラフィー、限外濾過、透析、塩析
などを適宜選択、組み合わせて使用することができる。The separation and purification of the cell-adhesive active peptide of the present invention may be carried out by the usual separation and purification methods used for peptides, and is not limited in any way. For example, various kinds of chromatography, ultrafiltration, dialysis, salting out, etc. can be appropriately selected and used in combination.

【００２６】細胞接着分子は、細胞の形態調節、増殖、
分化、および細胞の移動などにおおいに関与しており、
また癌転移に関与することが示されている。細胞上の接
着分子は接着を通じて細胞内へに情報伝達を行うことで
細胞機能を調節し、転移のカスケードに関与していると
考えられている。フィブロネクチン由来の合成ＧＲＧＤ
Ｓペプチドをマウスのメラノーマ細胞と同時にメラノー
マの静脈内に投与することにより肺への転移が阻害され
たことが報告されている（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｍ．ｅ
ｔａａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４６７，１９８
６）。したがって、本発明の細胞接着活性ペプチドは上
記細胞の形態調節、増殖、分化などの過程を調節する薬
剤として、また癌の転移抑制剤としての医薬用途に利用
できる可能性を有している。Cell adhesion molecules are used to regulate cell morphology, proliferation,
It is heavily involved in differentiation and cell migration,
It has also been shown to be involved in cancer metastasis. Adhesion molecules on cells are thought to be involved in the cascade of metastasis by regulating cell function by transducing information into cells through adhesion. Fibronectin derived synthetic GRGD
It has been reported that pulmonary metastasis was inhibited by intravenous administration of S peptide to melanoma cells of mice simultaneously with melanoma cells (Humphries, Me.
taal. , Science 233: 467, 198.
6). Therefore, the cell-adhesive active peptide of the present invention has the possibility of being used as a drug for controlling the processes such as morphological regulation, proliferation, and differentiation of the above-mentioned cells, and for pharmaceutical use as a cancer metastasis inhibitor.

【００２７】なお、参考のため、ｐｐ−ｖＷＦおよび成
熟ｖＷＦを含むプレプロ−ｖＷＦの構造模式図を図１０
に示す。また、ヒトｐｐ−ｖＷＦのアミノ酸配列を配列
表の配列番号１に示し、本発明の細胞接着活性ペプチド
部分を下線で示す。For reference, a structural schematic diagram of prepro-vWF containing pp-vWF and mature vWF is shown in FIG.
Shown in. In addition, the amino acid sequence of human pp-vWF is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the cell adhesion active peptide portion of the present invention is underlined.

【００２８】以下の実施例において本願発明をさらに詳
しく説明するが、本願発明はこれら実施例の記載によっ
て限定されるものではない。The present invention will be described in more detail in the following examples, but the present invention is not limited by the description of these examples.

【００２９】[0029]

【実施例】【Example】

実施例１：使用材料および細胞培養、細胞アッセイ法使用材料 ｐｐ−ｖＷＦは先に報告されたイムノアフィニティーク
ロマトグラフィー（Ｕｓｕｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：３６３−３６７，１
９９２）により牛血小板から精製した。Example 1: Materials used and cell culture, cell assay materials Materials used pp-vWF was immunoaffinity chromatography as previously reported (Usui, T. et al., Eu.
r. J. Biochem. 205: 363-367,1
Purified from bovine platelets according to 992).

【００３０】ｖＷＦは文献記載の方法（Ｋｉｒｂｙ，
Ｅ．Ｐ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１００：９
６３−９７６，１９８２）に準じ新鮮な牛血漿から精製
した。VWF is a method described in the literature (Kirby,
E. P. J. Lab. Clin. Med. 100: 9
63-976, 1982) and purified from fresh bovine plasma.

【００３１】牛血漿フィブロネクチンは伊藤ハム食品
（株）から供給を受けた。マウスラミニン、抗マウスラ
ミニンポリクローナル抗体、およびペプチド：ＧＲＧＤ
ＳＰ、ＧＲＧＥＳＰは岩城ガラスより購入した。牛ｐｐ
−ｖＷＦに対するポリクローナル抗体、成熟ｖＷＦは本
発明者らの研究室で調製した（Ｔａｋａｇｉ，Ｊ．ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１０４２
５−１０４３０，１９８９）。Bovine plasma fibronectin was supplied by Ito Ham Foods Co., Ltd. Mouse laminin, anti-mouse laminin polyclonal antibody, and peptide: GRGD
SP and GRGESP were purchased from Iwaki Glass. Cow pp
-A polyclonal antibody against vWF, mature vWF, was prepared in our laboratory (Takagi, J. et.
al. J. Biol. Chem. 264: 1042
5-10430, 1989).

【００３２】牛ｐｐ−ｖＷＦに対するモノクローナル抗
体（クローンＴＣ１、ＴＣ２、ＴＣ４、ＴＣ６、ＴＣ
７、およびＴＣ８）の作成および性状の確認は文献記載
の方法（Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６：６７３−６７７，１
９９１）により行った。抗−インテグリンモノクローナ
ル抗体４Ｂ４（抗−ヒトβ１サブユニット）および６Ｆ
１（抗−ヒトα２サブユニット）はＣ．Ｍｏｒｉｍｏｔ
ｏ博士（Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）およびＢ．Ｓ．
Ｃｏｌｌｅｒ博士（Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆＮｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｓｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋ，Ｎ
Ｙ）からそれぞれ恵与された。細胞培養 牛大動脈内皮細胞は牛大動脈から分離し、１０％牛胎児
血清（ＦＢＳ）を含むＥａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ
ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）にて培
養した（Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒ
ｏｍｂｏｓ．Ｒｅｓ．３３：３６３−３７０，１９８
４）。他の細胞株は財団法人がん研究振興財団の細胞バ
ンク（東京）から入手し、１０％ ＦＢＳを含むＭＥＭ
または１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で培養し
た。細胞はコンフルエント近くまで培養しリン酸緩衝液
（ｐＨ ７．４：２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍｌ
牛血清アルブミンを含む）で３７℃にて３０分間インキ
ュベートした。その後、細胞は３回洗浄し血清を含まな
いＭＥＭ培地に懸濁して接着アッセイを行った。細胞接着アッセイ 細胞接着アッセイは以下のように行った。即ち、試料の
蛋白質は２０μｇ／ｍｌの濃度に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４（Ｔｒｉ
ｓ／ＮａＣｌ）で調整し６ｍｍ角プラスティックプレー
トに４℃にて１６時間吸着させた。１％ ＢＳＡを含む
Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌを室温で１時間処理し、非特異的な
タンパク質の結合をブロックした。プレートを４８−ウ
エル培養ディシュ（コースター３５４８）に置き２×１
０^５個／０．３ｍｌ ＭＥＭの細胞を蒔いた。３７℃で
９０分インキュベーションした後、プレートをつまみ上
げ冷却したＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒ
ｅｄ ｓａｌｉｎｅ）にて非接着細胞を除き１％グルタ
ルアルデヒドで固定した。次いで２０％メタノールに溶
解した０．５％クリスタルバイオレットで染色した。接
着細胞は顕微鏡にて細胞数を計測した。Monoclonal antibody against bovine pp-vWF (clones TC1, TC2, TC4, TC6, TC
7 and TC8) and confirmation of the properties thereof are described in the literature (Fujisawa, T. et al., Eu).
r. J. Biochem. 196: 673-677, 1
991). Anti-integrin monoclonal antibodies 4B4 (anti-human β1 subunit) and 6F
1 (anti-human α2 subunit) is C.I. Morimot
Dr. O (Dana Farber Cancer In
status, Boston, MA) and B.I. S.
Dr. Coller (State University)
ofNew York, Stone Brook, N
Y) respectively. Cell culture Bovine aortic endothelial cells were isolated from bovine aorta and contained Eagle's minimum containing 10% fetal bovine serum (FBS).
Cultured in essential medium (MEM) (Hagiwara, H. et al., Thr.
ombos. Res. 33: 363-370, 198.
4). Other cell lines were obtained from the Cancer Research Foundation Cell Bank (Tokyo) and included in MEM containing 10% FBS.
Alternatively, the cells were cultured in RPMI1640 containing 10% FBS. Cells were cultivated to near confluency and phosphate buffer (pH 7.4: 2.5 mM EDTA, 2 mg / ml
Incubated with bovine serum albumin) for 30 minutes at 37 ° C. Then, the cells were washed three times and suspended in MEM medium containing no serum to perform an adhesion assay. Cell Adhesion Assay The cell adhesion assay was performed as follows. That is, the protein of the sample was 10 mM Tris- at a concentration of 20 μg / ml.
HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4 (Tri
s / NaCl) and adsorbed on a 6 mm square plastic plate at 4 ° C. for 16 hours. Tris / NaCl containing 1% BSA was treated for 1 hour at room temperature to block non-specific protein binding. Place the plate on a 48-well culture dish (Coaster 3548) 2 x 1
0 were plated ^five /0.3ml MEM cells. After incubating at 37 ° C for 90 minutes, the plate was picked up and cooled (Phosphate-buffer).
Non-adherent cells were removed by ed saline) and fixed with 1% glutaraldehyde. Then, it was stained with 0.5% crystal violet dissolved in 20% methanol. The number of adherent cells was measured with a microscope.

【００３３】実施例２：各種タンパク質へのウシ大動脈
血管内皮細胞およびＢ１６メラノーマ細胞の接着性 ２０μｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ｐｐ
−ｖＷＦ、ｖＷＦまたはフィブロネクチン各４０μｌを
６ｍｍ角のプラスティックプレートにのせて４℃で一晩
静置し、ＢＳＡ、ｐｐ−ｖＷＦ、ｖＷＦまたはフィブロ
ネクチンをプレートに吸着させた後、余分な溶液を除去
した。さらに、非特異的なタンパク吸着をブロックする
目的で、このプレートに１％のウシ血清アルブミンをの
せ、室温で１時間以上静置し、余分な溶液を除去した。
このようにして調製したＢＳＡコーティングプレート、
ｐｐ−ｖＷＦコーティングプレート、ｖＷＦコーティン
グプレートまたはフィブロネクチンコーティングプレー
トを４８ウエル細胞培養用ディシュ（コースター社製）
の底に置き、ＭＥＭに懸濁したウシ動脈血管内皮細胞
（ＢＡＥＣ：２×１０^５個／ｍｌ）０．３ｍｌまたはＢ
１６メラノーマ細胞（２×１０^５個／ｍｌ）０．３ｍｌ
を各ウエルに添加し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７
℃で９０分保温した。これらのプレートをＰＢＳで洗浄
した後、１％グルタルアルデヒドで５分間固定した。さ
らに０．５％クリスタルバイオレット・２０％メタノー
ル中にこのプレートを浸すことにより、細胞を染色しＰ
ＢＳで洗浄した。Example 2: Adhesion of bovine aortic endothelial cells and B16 melanoma cells to various proteins 20 μg / ml BSA (bovine serum albumin), pp
40 μl each of vWF, vWF or fibronectin was placed on a 6 mm square plastic plate and allowed to stand overnight at 4 ° C. to adsorb BSA, pp-vWF, vWF or fibronectin on the plate, and then the excess solution was removed. Further, for the purpose of blocking non-specific protein adsorption, 1% bovine serum albumin was placed on this plate and allowed to stand at room temperature for 1 hour or more to remove the excess solution.
BSA coated plate prepared in this way,
pp-vWF coated plate, vWF coated plate or fibronectin coated plate is a 48-well cell culture dish (manufactured by Coaster)
0.3 ml of bovine arterial vascular endothelial cells (BAEC: 2 × 10 ⁵ cells / ml) or B
16 melanoma cells (2 × 10 ⁵ cells / ml) 0.3 ml
Was added to each well, and was added to a CO ₂ incubator at 37
The temperature was kept at 90 ° C for 90 minutes. These plates were washed with PBS and then fixed with 1% glutaraldehyde for 5 minutes. Further, by immersing the plate in 0.5% crystal violet / 20% methanol, the cells are stained with P
Washed with BS.

【００３４】得られた結果を図１に示す。図１から明ら
かなように、ウシ動脈血管内皮細胞（ＢＡＥＣ）がｖＷ
Ｆおよびフィブロネクチンと強く接着したのに比較し
て、ｐｐ−ｖＷＦおよびＢＳＡとの接着はあまり顕著で
はなかった。成熟ｖＷＦがＲＧＤ依存的に内皮細胞と接
着することはよく知られたことである。一方、Ｂ１６メ
ラノーマ細胞との接着を試験したところ、牛ｐｐ−ｖＷ
Ｆをコートしたプラスティック表面上にＢ１６細胞は接
着して伸展しており、ｐｐ−ｖＷＦが細胞接着を促進す
ることが確認された。これらの転移性の高いＢ１６細胞
は以前に報告されたように牛フィブロネクチンともよく
接着した。フィブロネクチンに接着した細胞は細胞が偏
平であることが観察され、これは細胞表面の大きな面積
がタンパク質と接触していることを示唆する。これとは
対照的に、ｐｐ−ｖＷＦに接着した細胞は伸長し、いく
らかの細胞は広がらずに接着していた。ｐｐ−ｖＷＦに
接着した細胞の数はフィブロネクチンに接着した細胞数
よりも少なく、ｐｐ−ｖＷＦでは接着した細胞数は蒔い
た細胞数のおよそ６０％であったが、フィブロネクチン
では蒔いた細胞のほとんど全てが接着した。しかしなが
ら、成熟ｖＷＦに対する細胞接着の程度はｐｐ−ｖＷＦ
よりもはるかに低く、広がりも少ないことが明かになっ
た。The obtained results are shown in FIG. As is clear from FIG. 1, bovine arterial vascular endothelial cells (BAEC) showed vW
Adhesion to pp-vWF and BSA was less pronounced compared to strong adhesion to F and fibronectin. It is well known that mature vWF adheres to endothelial cells in an RGD-dependent manner. On the other hand, when adhesion with B16 melanoma cells was tested, bovine pp-vW
B16 cells adhered and spread on the F-coated plastic surface, and it was confirmed that pp-vWF promotes cell adhesion. These highly metastatic B16 cells also adhered well to bovine fibronectin as previously reported. Cells that adhered to fibronectin were observed to be flat, suggesting that a large area of the cell surface was in contact with the protein. In contrast, cells that adhered to pp-vWF were elongated and some cells adhered without spreading. The number of cells adhered to pp-vWF was smaller than the number of cells adhered to fibronectin, and the number of adhered cells in pp-vWF was about 60% of the number of seeded cells, but almost all the seeded cells in fibronectin. Adhered. However, the degree of cell adhesion to mature vWF is pp-vWF.
It was much lower than that and spread less.

【００３５】実施例３：各種タンパク質へのＢ１６細胞
の接着に対する抗体の効果 Ｂ１６細胞とｐｐ−ｖＷＦとの相互作用を検討するため
に、各種タンパク質に対する特異的ポリクローナル抗体
の存在下に接着性を試験した。Example 3 Effect of Antibodies on Adhesion of B16 Cells to Various Proteins In order to examine the interaction between B16 cells and pp-vWF, adhesion was tested in the presence of specific polyclonal antibodies against various proteins. did.

【００３６】各種接着タンパク質でコーティングしたプ
ラスティックプレートを、各種接着タンパク質に対する
ポリクローナル抗体（１００μｇ／ｍｌ）で３７℃で３
０分間プレインキュベーションした後、細胞懸濁液を添
加した。ｐｐ−ｖＷＦ、ｖＷＦおよびラミニンに対する
抗体は固定化抗原上を用いたクロマトグラフィーにより
精製した特異的抗体であり、抗フィブロネクチン抗体は
抗血清から得たＩｇＧ分画であった。接着した１ｍｍ^２
当たりの細胞数を計数して、平均±ＳＥで表した。得ら
れた結果を以下の表１に示す。なお、ＮＴは測定してい
ないことを示す。Plastic plates coated with various adhesive proteins were treated with polyclonal antibodies (100 μg / ml) against various adhesive proteins at 37 ° C. for 3 days.
After a 0 minute pre-incubation, the cell suspension was added. Antibodies against pp-vWF, vWF and laminin were specific antibodies purified by chromatography on immobilized antigen and anti-fibronectin antibody was an IgG fraction obtained from antiserum. 1 mm ² glued
The number of cells per well was counted and expressed as mean ± SE. The results obtained are shown in Table 1 below. In addition, NT shows not measuring.

【００３７】 表１から明らかなように、抗ｐｐ−ｖＷＦ抗体はｐｐ−
ｖＷＦに対する接着を完全に阻害した。一方、フィブロ
ネクチン、ラミニン、ｖＷＦに対する抗体はｐｐ−ｖＷ
Ｆに対する接着をほとんど阻害しなかったが、それぞれ
の抗原に対するＢ１６細胞の接着については効果的であ
った。これらの結果から、ｐｐ−ｖＷＦを介する細胞接
着は非常に特異的で他の接着タンパク質の混在の結果で
はないことが示された。[0037] As is clear from Table 1, the anti-pp-vWF antibody was pp-
Completely inhibited adhesion to vWF. On the other hand, antibodies against fibronectin, laminin and vWF are pp-vW
Although it hardly inhibited the adhesion to F, it was effective for the adhesion of B16 cells to each antigen. These results indicate that pp-vWF-mediated cell adhesion is highly specific and not the result of the inclusion of other adhesion proteins.

【００３８】実施例４：ｐｐ−ｖＷＦと接着する細胞 他の各種細胞とｐｐ−ｖＷＦ、ｖＷＦおよびフィブロネ
クチンとの接着性をさらに検討した。正常組織と腫瘍組
織の両方の細胞株１４種について検討した。得られた結
果を以下の表２に示す。 Example 4 Cells Adhering to pp-vWF The adhesiveness between various other cells and pp-vWF, vWF and fibronectin was further investigated. 14 cell lines of both normal and tumor tissues were examined. The results obtained are shown in Table 2 below.

【００３９】ｐｐ−ｖＷＦが接着活性を示した２つの細
胞株はメラノーマ由来であり、ｐｐ−ｖＷＦはカルシノ
ーマ、肉腫、神経芽細胞腫、白血病などの腫瘍細胞や正
常細胞に対しては接着活性を示さなかった。一方、成熟
ｖＷＦの細胞認識の特異性はｐｐ−ｖＷＦとは全く異な
る。例えば、Ｇ−３６１細胞はｐｐ−ｖＷＦとは接着し
たが、成熟ｖＷＦに対しては有意に接着しなかった。ま
たＨＴ−１０８０細胞は成熟ｖＷＦとはかなり接着した
が、ｐｐ−ｖＷＦとは全く接着しなかった。試験したす
べての細胞はフィブロネクチンに対するレセプターをも
っており、フィブロネクチンが各種細胞に共通の接着タ
ンパク質であることを示す。ｐｐ−ｖＷＦに対する特異
的レセプターは明らかにＢ１６細胞やＧ−３６１細胞な
どの特定細胞系でのみ発現している。The two cell lines in which pp-vWF showed adhesive activity were derived from melanoma, and pp-vWF showed adhesive activity in tumor cells such as carcinoma, sarcoma, neuroblastoma, leukemia and normal cells. Not shown. On the other hand, the specificity of cell recognition of mature vWF is completely different from that of pp-vWF. For example, G-361 cells adhered to pp-vWF but not significantly to mature vWF. Moreover, HT-1080 cells adhered to mature vWF considerably, but did not adhere to pp-vWF at all. All cells tested have receptors for fibronectin, indicating that fibronectin is an adhesion protein common to various cells. Specific receptors for pp-vWF are clearly expressed only in specific cell lines such as B16 cells and G-361 cells.

【００４０】実施例５：ｐｐ−ｖＷＦのレセプター分子
の検討 ２０μｇ／ｍｌのｐｐ−ｖＷＦまたはｖＷＦ各４０μｌ
を６ｍｍ角のプラスティックプレートにのせて４℃で一
晩静置し、ｐｐ−ｖＷＦまたはｖＷＦをプレートに吸着
させた後、余分な溶液を除去した。さらに、非特異的な
タンパク吸着をブロックする目的で、このプレートに１
％のウシ血清アルブミンをのせ、室温で１時間以上静置
し、余分な溶液を除去した。このようにして調製したｐ
ｐ−ｖＷＦコーティングプレートまたはｖＷＦコーティ
ングプレートを４８ウエル細胞培養用ディシュ（コース
ター社製）の底に置き、ＭＥＭに懸濁したＢ１６細胞
（２×１０^５個／ｍｌ）０．３ｍｌまたは１ｍＭ ＲＧ
Ｄ配列を含むＧＲＧＤＳＰペプチド（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、岩城ガラス社製）を
含むＭＥＭに懸濁したＢ１６細胞（２×１０^５個／ｍ
ｌ）０．３ｍｌを各ウエルに添加し、ＣＯ_２インキュベ
ーター中、３７℃で９０分保温した。これらのプレート
をＰＢＳで洗浄した後、１％グルタルアルデヒドで５分
間固定した。さらに０．５％クリスタルバイオレット・
２０％メタノール中にこのプレートを浸すことにより、
細胞を染色しＰＢＳで洗浄した。Example 5: Examination of pp-vWF receptor molecule 40 μl each of 20 μg / ml pp-vWF or vWF
Was placed on a 6 mm square plastic plate and left at 4 ° C. overnight to adsorb pp-vWF or vWF to the plate, and then an excess solution was removed. In addition, 1 is added to this plate to block non-specific protein adsorption.
% Bovine serum albumin was placed on the plate, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour or more to remove excess solution. P prepared in this way
The p-vWF-coated plate or vWF-coated plate was placed on the bottom of a 48-well cell culture dish (manufactured by Coaster) and 0.3 ml or 1 mM RG of B16 cells (2 × 10 ⁵ cells / ml) suspended in MEM.
GRGDSP peptide containing a D sequence (Gly-Arg-
B16 cells (2 × 10 ⁵ cells / m 2) suspended in MEM containing Gly-Asp-Ser-Pro, manufactured by Iwaki Glass Co., Ltd.
l) 0.3 ml was added to each well and incubated at 37 ° C. for 90 minutes in a CO ₂ incubator. These plates were washed with PBS and then fixed with 1% glutaraldehyde for 5 minutes. 0.5% crystal violet
By soaking this plate in 20% methanol,
The cells were stained and washed with PBS.

【００４１】得られた結果を図２に示す。図２から明ら
かなように、ＧＲＧＤＳＰペプチドはウシ成熟ｖＷＦへ
の接着および伸展を完全に阻害した。これとは対照的
に、ｐｐ−ｖＷＦの接着と伸展は１ｍＭ ＧＲＧＤＳＰ
の存在下においても全く影響を受けなかった。The obtained results are shown in FIG. As is apparent from FIG. 2, the GRGDSP peptide completely inhibited adhesion and extension to bovine mature vWF. In contrast, pp-vWF adhesion and extension was 1 mM GRGDSP.
Was not affected at all.

【００４２】実施例６：Ｂ１６細胞のｐｐ−ｖＷＦへの
接着性のＭｇ^２＋およびＣａ^２＋依存性 Ｂ１６細胞の
ｐｐ−ｖＷＦへの接着性のＭｇ^２＋依存性を試験するた
めに以下の実験を行った。Example 6 Mg ²⁺ and Ca ²⁺ Dependence of B16 Cell Adhesion to pp-vWF The following experiment was conducted to test the Mg ²⁺ dependency of B16 cell adhesion to pp-vWF. It was

【００４３】２０μｇ／ｍｌのｐｐ−ｖＷＦ４０μｌを
６ｍｍ角のプラスティックプレートにのせて４℃で一晩
静置し、ｐｐ−ｖＷＦをプレートに吸着させた後、余分
な溶液を除去した。さらに、非特異的なタンパク吸着を
ブロックする目的で、このプレートに１％のウシ血清ア
ルブミンをのせ、室温で１時間以上静置し、余分な溶液
を除去した。このようにして調製したｐｐ−ｖＷＦコー
ティングプレートを４８ウエル細胞培養用ディシュ（コ
ースター社製）の底に置き、０．５、１．０、２．０、
４．０、８．０および１６ｍＭのＭｇＣｌ_２を含むそれ
ぞれのトリス緩衝液に懸濁したＢ１６細胞（２×１０^５
個／ｍｌ）０．３ｍｌを各ウエルに添加し、ＣＯ_２イン
キュベーター中、３７℃で９０分保温した。これらのプ
レートをＰＢＳで洗浄した後、１％グルタルアルデヒド
で５分間固定した。さらに０．５％クリスタルバイオレ
ット・２０％メタノール中にこのプレートを浸すことに
より、細胞を染色しＰＢＳで洗浄した後、プレート上に
接着した１ｍｍ^２当たりの細胞数を計数した。40 μl of 20 μg / ml pp-vWF was placed on a 6 mm square plastic plate and allowed to stand overnight at 4 ° C. to allow pp-vWF to be adsorbed on the plate, and then the excess solution was removed. Further, for the purpose of blocking non-specific protein adsorption, 1% bovine serum albumin was placed on this plate and allowed to stand at room temperature for 1 hour or more to remove the excess solution. The pp-vWF coated plate thus prepared was placed on the bottom of a 48-well cell culture dish (manufactured by Coaster), and 0.5, 1.0, 2.0,
B16 cells (2 × 10 ⁵⁾ suspended in their respective Tris buffers containing 4.0, 8.0 and 16 mM MgCl _2.
(Ml / ml) was added to each well and incubated at 37 ° C. for 90 minutes in a CO ₂ incubator. These plates were washed with PBS and then fixed with 1% glutaraldehyde for 5 minutes. The cells were further stained by immersing the plate in 0.5% crystal violet / 20% methanol, washed with PBS, and then the number of cells per mm ² adhered to the plate was counted.

【００４４】得られた結果を図３：ａに示す。図３：ａ
から明らかなように、Ｂ１６細胞のｐｐ−ｖＷＦへの接
着はＭｇ^２＋の濃度に完全に依存しており、１ｍＭ以上
のＭｇ^２＋がこの接着活性には必要であり、１０ｍＭ以
上のＭｇ^２＋存在下ではその細胞接着活性は一定となっ
た。The results obtained are shown in FIG. 3: a. Figure 3: a
As is apparent from, adhesion to pp-vWF of B16 cells is completely dependent on the concentration of ^{Mg 2+,} 1 mM or more ^{Mg 2+} are required for this adhesive activity, 10 mM or more ^{Mg 2+} presence Then, the cell adhesion activity became constant.

【００４５】次いでＭｇ^２＋の存在下におけるＣａ^２＋
の影響を試験するために以下の実験を行った。[0045] then ^{Ca 2+} in the presence of ^{Mg 2+}
The following experiment was conducted to test the effect of.

【００４６】２０μｇ／ｍｌのｐｐ−ｖＷＦ４０μｌを
６ｍｍ角のプラスティックプレートにのせて４℃で一晩
静置し、ｐｐ−ｖＷＦをプレートに吸着させた後、余分
な溶液を除去した。さらに、非特異的なタンパク吸着を
ブロックする目的で、このプレートに１％のウシ血清ア
ルブミンをのせ、室温で１時間以上静置し、余分な溶液
を除去した。このようにして調製したｐｐ−ｖＷＦコー
ティングプレートを４８ウエル細胞培養用ディシュ（コ
ースター社製）の底に置き、５．０ｍＭのＭｇＣｌ_２お
よび０、０．０１、０．０２、０．１、０．２、１．０
および２．０ｍＭのＣａＣｌ_２を含むそれぞれのトリス
緩衝液に懸濁したＢ１６細胞（２×１０^５個／ｍｌ）
０．３ｍｌを各ウエルに添加し、ＣＯ_２インキュベータ
ー中、３７℃で９０分保温した。これらのプレートをＰ
ＢＳで洗浄した後、１％グルタルアルデヒドで５分間固
定した。さらに０．５％クリスタルバイオレット・２０
％メタノール中にこのプレートを浸すことにより、細胞
を染色しＰＢＳで洗浄した後、プレート上に接着した１
ｍｍ^２当たりの細胞数を計数し、ＣａＣｌ_２無添加での
接着細胞数に対する比率を求めた。40 μl of 20 μg / ml pp-vWF was placed on a 6 mm square plastic plate and allowed to stand overnight at 4 ° C. to adsorb pp-vWF on the plate, and then the excess solution was removed. Further, for the purpose of blocking non-specific protein adsorption, 1% bovine serum albumin was placed on this plate and allowed to stand at room temperature for 1 hour or more to remove the excess solution. The pp-vWF-coated plate thus prepared was placed on the bottom of a 48-well cell culture dish (Coaster) and 5.0 mM MgCl ₂ and 0, 0.01, 0.02, 0.1, 0 were added. .2, 1.0
And B16 cells (2 × 10 ⁵ cells / ml) suspended in each Tris buffer containing 2.0 mM CaCl ₂
0.3 ml was added to each well and incubated at 37 ° C. for 90 minutes in a CO ₂ incubator. P these plates
After washing with BS, the cells were fixed with 1% glutaraldehyde for 5 minutes. Further 0.5% crystal violet-20
The cells were stained by immersing the plate in% methanol, washed with PBS, and then adhered to the plate 1.
The number of cells per mm ² was counted, and the ratio to the number of adherent cells without CaCl ₂ was determined.

【００４７】得られた結果を図３：ｂに示す。図３：ｂ
から明らかなように、Ｍｇ^２＋存在下でのＢ１６細胞の
ｐｐ−ｖＷＦへの接着は、Ｃａ^２＋の添加により濃度依
存的に阻害され、１ｍＭのＣａ^２＋添加により約７０％
の接着活性が阻害された。The results obtained are shown in FIG. 3: b. Figure 3: b
As is clear from the above, the adhesion of B16 cells to pp-vWF in the presence of Mg ²⁺ was inhibited by the addition of Ca ^{2+ in} a concentration-dependent manner, and about 70% was increased by the addition of 1 mM Ca ^2+.
The adhesive activity of was inhibited.

【００４８】実施例７：ｐｐ−ｖＷＦへの接着に対する
抗インテグリン抗体の影響 ２０μｇ／ｍｌのｐｐ−ｖＷＦ、フィブロネクチンまた
はＩ型コラーゲン各４０μｌを６ｍｍ角のプラスティッ
クプレートにのせて４℃で一晩静置し、ｐｐ−ｖＷＦ、
フィブロネクチンまたはＩ型コラーゲンをプレートに吸
着させた後、余分な溶液を除去した。さらに、非特異的
なタンパク吸着をブロックする目的で、このプレートに
１％のウシ血清アルブミンをのせ、室温で１時間以上静
置し、余分な溶液を除去した。このようにして調製した
ｐｐ−ｖＷＦコーティングプレート、フィブロネクチン
コーティングプレートまたはＩ型コラーゲンコーティン
グプレートを４８ウエル細胞培養用ディシュ（コースタ
ー社製）の底に置いた。それぞれのタンパク質をコート
したプレートに各抗体（ＫＫ２：対照、６Ｆ１：抗α２
インテグリン抗体、４Ｂ４：抗β１インテグリン抗体）
２０μｇ／ｍｌを加えたＭＥＭに懸濁したヒトメラノー
マ由来Ｇ−３６１細胞液（２×１０^５個／ｍｌ）０．３
ｍｌを各ウエルに添加し、ＣＯ_２インキュベーター中、
３７℃で９分保温した。これらのプレートをＰＢＳで洗
浄した後、１％グルタルアルデヒドで５分間固定した。
さらに０．５％クリスタルバイオレット・２０％メタノ
ール中にこのプレートを浸すことにより、細胞を染色し
ＰＢＳで洗浄した後、プレート上に接着した１ｍｍ^２当
たりの細胞数を計数した。各抗体の存在下でのｐｐ−ｖ
ＷＦ、フィブロネクチン、Ｉ型コラーゲンへの接着細胞
数を、対照抗体ＫＫ２存在下でのｐｐ−ｖＷＦ、フィブ
ロネクチン、Ｉ型コラーゲンへの接着細胞数に対する比
率で示した。Example 7: Effect of anti-integrin antibody on adhesion to pp-vWF 40 μl each of 20 μg / ml of pp-vWF, fibronectin or type I collagen was placed on a 6 mm square plastic plate and allowed to stand overnight at 4 ° C. , Pp-vWF,
After adsorbing fibronectin or type I collagen to the plate, the excess solution was removed. Further, for the purpose of blocking non-specific protein adsorption, 1% bovine serum albumin was placed on this plate and allowed to stand at room temperature for 1 hour or more to remove the excess solution. The pp-vWF coated plate, fibronectin coated plate or type I collagen coated plate thus prepared was placed on the bottom of a 48-well cell culture dish (Coaster). Plates coated with each protein were coated with each antibody (KK2: control, 6F1: anti-α2
Integrin antibody, 4B4: anti-β1 integrin antibody)
Human melanoma-derived G-361 cell suspension (2 × 10 ⁵ cells / ml) 0.3 suspended in MEM supplemented with 20 μg / ml 0.3
Add ml to each well and in a CO ₂ incubator,
Incubated at 37 ° C for 9 minutes. These plates were washed with PBS and then fixed with 1% glutaraldehyde for 5 minutes.
The cells were further stained by immersing the plate in 0.5% crystal violet / 20% methanol, washed with PBS, and then the number of cells per mm ² adhered to the plate was counted. Pp-v in the presence of each antibody
The number of adherent cells to WF, fibronectin and type I collagen was shown as a ratio to the number of adherent cells to pp-vWF, fibronectin and type I collagen in the presence of control antibody KK2.

【００４９】得られた結果を図４に示す。図４から明ら
かなように、抗β１インテグリン抗体（４Ｂ４）の存在
下では、ｐｐ−ｖＷＦへのＧ−３６１細胞の接着は完全
にブロックされ、このことからＧ−３６１細胞がｐｐ−
ｖＷＦのレセプターとしてインテグリンのβ１クラスを
用いていることが示された。一方、フィブロネクチンと
Ｉ型コラーゲンはこの抗体によって部分的にブロックさ
れたのみであったので、異なるレセプターの関与が示唆
された。The obtained results are shown in FIG. As is clear from FIG. 4, in the presence of the anti-β1 integrin antibody (4B4), the adhesion of G-361 cells to pp-vWF was completely blocked, which indicates that G-361 cells had pp-v.
It was shown to use the β1 class of integrins as a vWF receptor. On the other hand, fibronectin and type I collagen were only partially blocked by this antibody, suggesting the involvement of different receptors.

【００５０】これとは対照的に抗α２抗体（６Ｆ１）は
ｐｐ−ｖＷＦの接着に何ら影響を与えなかったが、Ｉ型
コラーゲンへのβ１インテグリン媒介性接着の約５０％
を阻害した。これより、ｐｐ−ｖＷＦのレセプターはα
２β１ではなく、他のβ１インテグリンであることが強
く示唆された。In contrast, anti-α2 antibody (6F1) had no effect on pp-vWF adhesion, but about 50% of β1-integrin-mediated adhesion to type I collagen.
Inhibited. From this, the pp-vWF receptor is α
It was strongly suggested to be another β1 integrin rather than 2β1.

【００５１】実施例８：モノクローナル抗体との反応性 細胞接着活性に関与するｐｐ−ｖＷＦ中の構造ドメイン
を推定するために、Ｂ１６細胞上でのウシｐｐ−ｖＷＦ
に対するモノクローナル抗体の効果を試験した。Example 8: Reactivity with Monoclonal Antibodies To predict the structural domains in pp-vWF involved in cell adhesion activity, bovine pp-vWF on B16 cells.
The effect of the monoclonal antibody against was tested.

【００５２】２０μｇ／ｍｌのｐｐ−ｖＷＦ各４０μｌ
を６ｍｍ角のプラスティックプレートにのせて４℃で一
晩静置し、ｐｐ−ｖＷＦをプレートに吸着させた後、余
分な溶液を除去した。さらに、非特異的なタンパク吸着
をブロックする目的で、このプレートに１％のウシ血清
アルブミンをのせ、室温で１時間以上静置し、余分な溶
液を除去した。このようにして調製したｐｐ−ｖＷＦコ
ーティングプレートを４８ウエル細胞培養用ディシュ
（コースター社製）の底に置いた。１００μｇ／ｍｌの
各モノクローナル抗体（ＴＣ１、ＴＣ２、ＴＣ４、ＴＣ
６、ＴＣ７およびＴＣ８）のＭＥＭ溶液、ならびに抗体
ＫＫ２のＭＥＭ溶液を０．１ｍｌずつｐｐ−ｖＷＦコー
ティングプレートに添加し、３７℃で３０分保温した。
ＭＥＭに懸濁したＢ１６細胞液（３×１０^５個／ｍｌ）
０．２ｍｌを各ウエルに添加し、ＣＯ_２インキュベータ
ー中、３７℃で９０分保温した。これらのプレートをＰ
ＢＳで洗浄した後、１％グルタルアルデヒドで５分間固
定した。さらに０．５％クリスタルバイオレット・２０
％メタノール中にこのプレートを浸すことにより、細胞
を染色しＰＢＳで洗浄した後、プレート上に接着した１
ｍｍ^２当たりの細胞数を計数した。各抗体でプレインキ
ュベーションした後のｐｐ−ｖＷＦへの接着細胞数を、
抗体無添加での接着数に対する比率で示した。40 μl each of 20 μg / ml pp-vWF
Was placed on a 6 mm square plastic plate and allowed to stand overnight at 4 ° C. to allow pp-vWF to be adsorbed on the plate, and then an excess solution was removed. Further, for the purpose of blocking non-specific protein adsorption, 1% bovine serum albumin was placed on this plate and allowed to stand at room temperature for 1 hour or more to remove the excess solution. The pp-vWF-coated plate thus prepared was placed on the bottom of a 48-well cell culture dish (Coaster). 100 μg / ml of each monoclonal antibody (TC1, TC2, TC4, TC
6, TC7 and TC8) MEM solution, and antibody KK2 MEM solution were added to the pp-vWF coated plate in 0.1 ml portions and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
B16 cell suspension (3 × 10 ⁵ cells / ml) suspended in MEM
0.2 ml was added to each well and incubated at 37 ° C. for 90 minutes in a CO ₂ incubator. P these plates
After washing with BS, the cells were fixed with 1% glutaraldehyde for 5 minutes. Further 0.5% crystal violet-20
The cells were stained by immersing the plate in% methanol, washed with PBS, and then adhered to the plate 1.
The number of cells per mm ² was counted. The number of adherent cells to pp-vWF after preincubation with each antibody was
The ratio is shown as the ratio to the number of adhesions without addition of antibody.

【００５３】得られた結果を図５に示す。ＴＣ２、ＴＣ
６、ＴＣ７およびＴＣ８抗体はもともとＩ型コラーゲン
へのｐｐ−ｖＷＦの結合を阻害するモノクローナル抗体
（Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６：６７３−６７７，１９９１）
として選択された。図５から明らかなように、これらの
抗体はＢ１６細胞のｐｐーｖＷＦへの接着に対して中程
度の阻害効果を示し、その阻害率は５０％以下であっ
た。また、コラーゲンへのｐｐ−ｖＷＦの結合を阻害し
ないＴＣ１抗体はごく限られた阻害を示したのみであっ
た。これらとは対照的に、コラーゲン結合活性を阻害し
ないＴＣ４抗体はｐｐ−ｖＷＦへの接着を完全に阻害し
た。The obtained results are shown in FIG. TC2, TC
6, TC7 and TC8 antibodies are originally monoclonal antibodies that inhibit the binding of pp-vWF to type I collagen (Fujisawa, T. et al., Eur. J.
Biochem. 196: 673-677, 1991).
Was selected as. As is clear from FIG. 5, these antibodies showed a moderate inhibitory effect on the adhesion of B16 cells to pp-vWF, and the inhibition rate was 50% or less. Moreover, the TC1 antibody that does not inhibit the binding of pp-vWF to collagen showed only a very limited inhibition. In contrast to these, the TC4 antibody, which did not inhibit collagen binding activity, completely inhibited adhesion to pp-vWF.

【００５４】本発明者らは、あらかじめｐｐ−ｖＷＦの
タンパク質分解断片を用いてこれらのモノクローナル抗
体のエピトープの位置を決定していた（Ｆｕｊｉｓａｗ
ａ，Ｔ．ｅｔ ａ１．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１９６：６７３−６７７，１９９１）。ＴＣ４はｐｐ−
ｖＷＦ分子の中央領域に由来する８ｋＤａの断片と反応
し、ＴＣ２およびＴＣ８はＣ末端付近の２１ｋＤａ断片
を認識し、またＴＣ６およびＴＣ７は最初のＣｙｓに富
む領域からの１８ｋＤａ断片を認識した。ＴＣ１のエピ
トープは決定されていない。ＴＣ４による特異的阻害
は、ｐｐ−ｖＷＦの細胞接着部位がＴＣ４のエピトープ
のごく近くで、Ｓｅｒ３７６から始まる８ｋＤａ断片に
あることを強く示唆する。The present inventors previously determined the position of the epitope of these monoclonal antibodies using a proteolytic fragment of pp-vWF (Fujisaw).
a. et a1. , Eur. J. Biochem.
196: 673-677, 1991). TC4 is pp-
Reacting with an 8 kDa fragment from the central region of the vWF molecule, TC2 and TC8 recognized a 21 kDa fragment near the C-terminus and TC6 and TC7 recognized an 18 kDa fragment from the first Cys-rich region. The epitope of TC1 has not been determined. Specific inhibition by TC4 strongly suggests that the cell adhesion site of pp-vWF is in close proximity to the epitope of TC4, in the 8 kDa fragment starting at Ser376.

【００５５】実施例９：牛ｐｐ−ｖＷＦの８ｋＤａ断片
の調製 実施例１に示した方法で精製した牛ｐｐ−ｖＷＦを５Ｍ
尿素、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．５Ｍトリス緩衝液、
ｐＨ８．６に溶解し脱気した後、０．１２ｍｍｏｌのβ
−メルカプトエタノール（和光純薬社製）を添加し、４
０℃で２時間保温する。その後、０．１２ｍｍｏｌのモ
ノヨードアセトアミド（和光純薬社製）を添加し、さら
に４０℃で２時間反応させる。この反応液よりゲル濾過
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社
製））により余分な低分子物質を除去した後凍結乾燥
し、還元アルキル化ｐｐ−ｖＷＦを調製した。Example 9: Preparation of 8 kDa fragment of bovine pp-vWF Bovine pp-vWF purified by the method described in Example 1 was purified to 5M.
0.5 M Tris buffer containing urea, 5 mM EDTA,
After dissolving in pH 8.6 and degassing, 0.12 mmol β
-Add mercaptoethanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and add
Incubate at 0 ° C for 2 hours. Then, 0.12 mmol of monoiodoacetamide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added, and the mixture is further reacted at 40 ° C. for 2 hours. Extra low molecular weight substances were removed from this reaction solution by gel filtration (Sephadex G-25 (Pharmacia)) and then freeze-dried to prepare reductively alkylated pp-vWF.

【００５６】４ｍｇの還元アルキル化ｐｐ−ｖＷＦを４
Ｍ尿素を含む１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ９．０、２ｍ
ｌに溶解した後、７．５μｇのｌｙｓｙｌ Ｅｎｄｏｐ
ｅｐｔｉｄａｓｅ（和光純薬社製）を添加し３０℃で７
時間消化した。この消化反応液を直接逆相ＨＰＬＣにか
けて、数種の断片を分離分取した。この分取には、Ｂｉ
ｏｆｉｎｅ ＲＰＣ−ＳＣ１８カラム（０．４６×２５
ｃｍ；日本分光社製）を用い、０．１％トリフルオロ酢
酸中アセトニトリルの濃度勾配により溶出した。4 mg of reductively alkylated pp-vWF was added to 4
10 mM Tris buffer containing M urea, pH 9.0, 2 m
7.5 μg of lysyl Endop after dissolution in 1
Add eptidase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 7 ℃ at 7 ℃
Digested for hours. This digestion reaction solution was directly subjected to reverse phase HPLC to separate and separate several kinds of fragments. For this sorting, Bi
ofine RPC-SC18 column (0.46 x 25
cm; manufactured by JASCO Corporation) and eluted with a concentration gradient of acetonitrile in 0.1% trifluoroacetic acid.

【００５７】分取した数種の断片の内、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動で分子量８ｋＤａを示す断片
は、実施例８で用いたモノクローナル抗体ＴＣ４のみに
反応した。さらに、この８ｋＤａ断片のアミノ酸配列を
気相法によるペプチドシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、ｍｏｄｅｌ ４７７Ａ）
でＮ末端より２６残基分析した結果、Ｓ−Ｆ−Ｄ−Ｄ−
Ｒ−Ｈ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｇ−Ｖ−Ｃ−Ｑ−Ｙ−Ｌ−Ｌ−Ａ
−Ｑ−Ｄ−Ｃ−Ｑ−Ｄ−Ｈ−Ｓ−Ｆであることが判明し
た。この配列はＭａｎｃｕｓｏ，Ｄ．Ｊ．らによって開
示されている（Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２６４：１９５１４−１
９５２７，１９８９）ヒトｖＷＦゲノムのＤＮＡ配列よ
り決定されたｖＷＦ前駆体中ｐｐ−ｖＷＦのＳｅｒ（３
７６）から始まる配列と極めて高いホモロジーを示し
た。また、この断片はｌｙｓｙｌ Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉ
ｄａｓｅによる完全消化により得られたものであり、Ｃ
末端はＬｙｓ（４３５）である。以上より、牛８ｋＤａ
断片はヒトｐｐ−ｖＷＦのＳｅｒ（３７６）−Ｌｙｓ
（４３５）に相当するペプチドであると結論した。Of the several kinds of separated fragments, the fragment showing a molecular weight of 8 kDa by SDS polyacrylamide gel electrophoresis reacted only with the monoclonal antibody TC4 used in Example 8. Furthermore, the amino acid sequence of this 8 kDa fragment was used for the peptide sequencer (Applied) by the gas phase method.
(Biosystems, model 477A)
As a result of analyzing 26 residues from the N-terminal with S-FD-DD-
R-H-F-T-S-G-V-C-Q-Y-L-L-A
It was found to be -Q-D-C-Q-D-H-S-F. This sequence is described in Mancuso, D .; J. (JBC, 264: 19514-1).
9527, 1989) Ser (3 of pp-vWF in vWF precursor determined from the DNA sequence of human vWF genome.
It showed extremely high homology with the sequence starting from 76). In addition, this fragment is lysyl Endoepti
obtained by complete digestion with dase
The end is Lys (435). From the above, cow 8kDa
The fragment is Ser (376) -Lys of human pp-vWF.
It was concluded that the peptide corresponds to (435).

【００５８】実施例１０：８ｋＤａ断片の細胞接着活性 実施例９で得たｐｐ−ｖＷＦから単離した８ｋＤａ断片
を用いてＢ１６細胞への細胞接着活性を試験した。Example 10: Cell Adhesion Activity of 8 kDa Fragment The 8 kDa fragment isolated from pp-vWF obtained in Example 9 was used to test cell adhesion activity to B16 cells.

【００５９】１．５、５．０、１５および５０μｇ／ｍ
ｌのｐｐ−ｖＷＦ ８ｋＤａ断片４０μｌを６ｍｍ角の
プラスティックプレートにのせて４℃で一晩静置し、ｐ
ｐ−ｖＷＦをプレートに吸着させた後、余分な溶液を除
去した。さらに、非特異的なタンパク吸着をブロックす
る目的で、このプレートに１％のウシ血清アルブミンを
のせ、室温で１時間以上静置し、余分な溶液を除去し
た。このようにして調製したｐｐ−ｖＷＦ ８ｋＤａ断
片コーティングプレートを４８ウエル細胞培養用ディシ
ュ（コースター社製）の底に置き、ＭＥＭに懸濁したＢ
１６細胞液（２×１０^５個／ｍｌ）０．３ｍｌを各ウエ
ルに添加し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で９０
分保温した。これらのプレートをＰＢＳで洗浄した後、
１％グルタルアルデヒドで５分間固定した。さらに０．
５％クリスタルバイオレット・２０％メタノール中にこ
のプレートを浸すことにより、細胞を染色しＰＢＳで洗
浄した後、プレート上に接着した１ｍｍ^２当たりの細胞
数を計数した。1.5, 5.0, 15 and 50 μg / m
40 μl of 1 pp-vWF 8 kDa fragment was placed on a 6 mm square plastic plate and allowed to stand at 4 ° C. overnight, p
After adsorbing p-vWF on the plate, the excess solution was removed. Further, for the purpose of blocking non-specific protein adsorption, 1% bovine serum albumin was placed on this plate and allowed to stand at room temperature for 1 hour or more to remove the excess solution. The pp-vWF 8 kDa fragment-coated plate thus prepared was placed on the bottom of a 48-well cell culture dish (Coaster) and suspended in MEM.
0.3 ml of 16 cell solution (2 × 10 ⁵ cells / ml) was added to each well, and the cells were incubated at 37 ° C. in a CO ₂ incubator at 90 ° C.
I kept warm for a minute. After washing these plates with PBS,
Fixed with 1% glutaraldehyde for 5 minutes. Furthermore, 0.
The cells were stained by immersing the plate in 5% crystal violet / 20% methanol and washed with PBS, and then the number of cells per mm ² adhered to the plate was counted.

【００６０】得られた結果を図６に示す。図６から明ら
かなように、８ｋＤａ断片はＢ１６メラノーマ細胞の接
着を顕著に促進した。接着の程度はコーティング段階で
使用した断片の濃度に依存して増加して最大レベルに達
するが、このレベルはｐｐ−ｖＷＦ自体を用いて試験し
たときに得られたレベルと同等であった。The obtained results are shown in FIG. As is clear from FIG. 6, the 8 kDa fragment significantly promoted the adhesion of B16 melanoma cells. The degree of adhesion increased depending on the concentration of the fragments used in the coating step to reach the maximum level, which was comparable to the level obtained when tested with pp-vWF itself.

【００６１】実施例１１：ｐｐ−ｖＷＦの８ｋＤａ領域
を含むペプチドの大腸菌での発現 ヒト胎盤より調製したＰｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡ（ＣＬＯ
ＮＴＥＣＨ社製）に、常法により合成したＤＮＡオリゴ
マー２種類（プライマー８ＫＡＥ：５’−ＧＡＡＴＴＣ
ＴＴＴＣＡＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡ；プライマ
ー８Ｋ１Ｅ：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧ
ＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣ）を添加し、Ｗａｎｇ，Ａ．Ｍ．
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
６：９７１７−９７２１，１９８９）らによって開示さ
れているＲＴ−ＰＣＲ法により、ｐｐ−ｖＷＦ遺伝子配
列（Ｍａｎｃｕｓｏ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂ．
Ｃ．２６４：１９５１４−１９５２７，１９８９）中の
エクソン１１からエクソン１２にわたる８ｋＤａ領域を
含む遺伝子配列を増幅した。Example 11: Expression of peptide containing 8 kDa region of pp-vWF in Escherichia coli Poly (A) ⁺ RNA (CLO prepared from human placenta)
2 kinds of DNA oligomers synthesized by a conventional method (primer 8KAE: 5'-GAATTC)
TTTCAGGAGGGGGAGCTGGA; primer 8K1E: 5′-GAATTCACTTCAAGAG
CTTTGACAAC) and added to Wang, A .; M.
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
6: 9717-9721, 1989) by the RT-PCR method disclosed in pp-vWF gene sequence (Mancuso, DJ et al., JB.
C. 264: 19514-19527, 1989), the gene sequence containing the 8 kDa region extending from exon 11 to exon 12 was amplified.

【００６２】この８ｋＤａ領域を含む遺伝子配列に相当
するｃＤＮＡをプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、
大腸菌に形質転換してクローニングした。このプラスミ
ドベクターを分離した後、そのＤＮＡ配列をＡ．Ｌ．
Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）
により確認した。この８ｋＤａ領域を含む遺伝子配列を
制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡社製）により切り出し、得
られたＤＮＡ断片を市販の発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に組み込み、大腸菌ＪＭ１
０９（東洋紡社製）に形質転換した（図７）。The cDNA corresponding to the gene sequence containing the 8 kDa region was transformed into the plasmid vector pBluescri.
pt II (manufactured by STRATAGENE),
It was transformed into E. coli and cloned. After isolation of this plasmid vector, its DNA sequence was labeled with A. L.
F. DNA sequencer (Pharmacia)
Confirmed by. The gene sequence containing the 8 kDa region was cut out with a restriction enzyme EcoRI (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and the obtained DNA fragment was a commercially available expression vector pGEX-2T.
(Manufactured by Pharmacia), E. coli JM1
09 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) (FIG. 7).

【００６３】この大腸菌を培養し常法（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ
ａｌ．Ｅｄｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈｏｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ）に従ってＩＰＴＧ（イソプロピル−１−
チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）により、ｐｐ−ｖ
ＷＦの８ｋＤａ領域を含みエクソン１１からエクソン１
２までにコードされている部分（Ｈｉｓ（３７３）−Ｌ
ｙｓ（４５５））をＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ）との融合タンパク質として発現誘導した。This Escherichia coli was cultured and the usual method (Molecul
ar cloning, Sambrook, J .; et
al. Eds. Cold Spring Horse
IPTG (Isopropyl-1-
Thio-β-D-galactopyranoside), pp-v
Exon 11 to exon 1 including the 8 kDa region of WF
Coded up to 2 (His (373) -L
The expression of ys (455)) was induced as a fusion protein with GST (glutathione S-transferase).

【００６４】大腸菌を凍結融解した後、超音波破砕し、
この融合タンパク質を含む画分を分離し、さらに８Ｍ尿
素を含むトリス緩衝液で平衡化したゲル濾過用カラム
（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲ（２．６×６６
ｃｍ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）により分画した。こ
の画分をウシトロンビン（Ｓｉｇｍａ社製）で消化した
後、再び同カラムを用いたゲル濾過により求めるペプチ
ドを含む画分を得た。さらに、陰イオン交換カラムクロ
マトグラフィー（ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷ
（７．５×７５ｍｍ）、東ソー社製）を用いてペプチド
を単離した。After freeze-thawing E. coli, sonication was performed,
The fraction containing this fusion protein was separated and further equilibrated with a Tris buffer containing 8M urea (Sephacryl S-200HR (2.6 × 66).
cm), manufactured by Pharmacia). This fraction was digested with bovine thrombin (manufactured by Sigma) and then again subjected to gel filtration using the same column to obtain a fraction containing the desired peptide. Furthermore, anion exchange column chromatography (TSKgel DEAE-5PW
(7.5 × 75 mm), manufactured by Tosoh Corporation) was used to isolate the peptide.

【００６５】このペプチドはＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で分子量約１０ｋＤａを示した。また、
このペプチドのアミノ酸配列を固相エドマン法を用いた
プロテインシークエンサーＭｏｄｅｌ ６６２５（Ｍｉ
ｌｌｉＧｅｎ社製）でＮ末端から３０残基分析した結
果、Ｘ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｉ−Ｈ−Ｆ−Ｋ−Ｓ−Ｆ−Ｄ−Ｎ
−Ｒ−Ｙ−Ｆ−Ｔ−Ｆ−Ｓ−Ｇ−Ｉ−Ｘ−Ｑ−Ｙ−Ｌ−
Ｌ−Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｘ−Ｑの配列であることが判明した。
上記配列のうち、Ｎ末端からの５残基は融合タンパク質
のトロンビン切断部位のＣ末端側由来の配列と一致し、
下線部以降は本来のｐｐ−ｖＷＦと、特に９残基以降は
本明細書の８ｋＤａペプチド（Ｓｅｒ（３７６）−Ｌｙ
ｓ（４３５））のＮ末端側の配列と完全に一致した。This peptide showed a molecular weight of about 10 kDa by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Also,
The amino acid sequence of this peptide was used as a protein sequencer Model 6625 (Mi
As a result of analyzing 30 residues from the N-terminal with LIGen), XS-P-G-I- H-F-K-S-F-D-N.
-R-Y-F-T-F-S-G-I-X-Q-Y-L-
It was found to be the sequence of L-A-R-D-X-Q .
Of the above sequences, 5 residues from the N-terminus match the sequence from the C-terminal side of the thrombin cleavage site of the fusion protein,
The original pp-vWF is shown below the underlined part, and particularly the 8 kDa peptide (Ser (376) -Ly of the present specification is shown after 9 residues.
It completely matched the sequence on the N-terminal side of s (435)).

【００６６】以上の結果から、本ペプチドは、８ｋＤａ
ペプチドを含む配列表の配列番号３に示す配列を有する
ペプチドであり、これをｒｅｃ ８ｋとした。From the above results, the present peptide was 8 kDa.
It was a peptide having the sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence list containing the peptide, and was designated as rec 8k.

【００６７】実施例１２：発現ペプチドの細胞接着性 実施例１１で得られた発現ペプチドｒｅｃ ８ｋのメラ
ノーマ細胞への細胞接着性をｐｐ−ｖＷＦと比較して試
験した。Example 12: Cell Adhesion of Expressed Peptide The cell adhesion of the expressed peptide rec 8k obtained in Example 11 to melanoma cells was tested in comparison with pp-vWF.

【００６８】２０μｇ／ｍｌのｐｐ−ｖＷＦまたはｒｅ
ｃ ８ｋ各４０μ１を６ｍｍ角のプラスティックプレー
トにのせて４℃で一晩静置し、ｐｐ−ｖＷＦまたはｒｅ
ｃ８ｋをプレートに吸着させた後、余分な溶液を除去し
た。さらに、非特異的なタンパク吸着をブロックする目
的で、このプレートに１％のウシ血清アルブミンをの
せ、室温で１時間以上静置し、余分な溶液を除去した。
このようにして調製したｐｐ−ｖＷＦコーティングプレ
ートまたはｒｅｃ ８ｋコーティングプレートを４８ウ
エル細胞培養用ディシュ（コースター社製）の底に置
き、ＭＥＭに懸濁したＧ−３６１細胞（２×１０^５個／
ｍｌ）０．３ｍｌを各ウエルに添加し、ＣＯ_２インキュ
ベーター中、３７℃で９０分保温した。これらのプレー
トをＰＢＳで洗浄した後、１％グルタルアルデヒドで５
分間固定した。さらに０．５％クリスタルバイオレット
・２０％メタノール中にこのプレートを浸すことによ
り、細胞を染色しＰＢＳで洗浄した。20 μg / ml pp-vWF or re
c 8k 40 μl each was placed on a 6 mm square plastic plate and allowed to stand overnight at 4 ° C., and then pp-vWF or re
After adsorbing c8k on the plate, the excess solution was removed. Further, for the purpose of blocking non-specific protein adsorption, 1% bovine serum albumin was placed on this plate and allowed to stand at room temperature for 1 hour or more to remove the excess solution.
The pp-vWF-coated plate or rec 8k-coated plate thus prepared was placed on the bottom of a 48-well cell culture dish (manufactured by Coaster), and G-361 cells (2 × 10 ⁵ cells / 2) were suspended in MEM.
0.3 ml) was added to each well and incubated at 37 ° C. for 90 minutes in a CO ₂ incubator. After washing these plates with PBS, 5% with 1% glutaraldehyde
Fixed for minutes. Further, the cells were stained by immersing the plate in 0.5% crystal violet / 20% methanol and washed with PBS.

【００６９】得られた結果を図８に示す。大腸菌で発現
させたｐｐ−ｖＷＦの８ｋＤａ領域を含むペプチドであ
るｒｅｃ ８ｋは、ｐｐ−ｖＷＦと同様にメラノーマ細
胞に対して細胞接着活性を示した。The obtained results are shown in FIG. Rec 8k, which is a peptide containing the 8 kDa region of pp-vWF expressed in Escherichia coli, showed cell adhesion activity to melanoma cells similarly to pp-vWF.

【００７０】実施例１３：発現ペプチドの細胞接着性に
対するＲＧＥ、ＲＧＤ、ヘパリンおよび抗β１インテグ
リン抗体の効果 実施例１１で得られた発現ペプチドｒｅｃ ８ｋの細胞
接着性に対するＲＧＥ、ＲＧＤ、ヘパリンおよび抗β１
インテグリン抗体（４Ｂ４）の効果を、ｐｐ−ｖＷＦと
比較して試験した。Example 13: Effect of RGE, RGD, heparin and anti-β1 integrin antibody on cell adhesion of expressed peptide RGE, RGD, heparin and anti-β1 on cell adhesion of expressed peptide rec 8k obtained in Example 11
The effect of integrin antibody (4B4) was tested in comparison with pp-vWF.

【００７１】２０μｇ／ｍｌのｐｐ−ｖＷＦまたはｒｅ
ｃ ８ｋ各４０μｌを６ｍｍ角のプラスティックプレー
トにのせて４℃で一晩静置し、ｐｐ−ｖＷＦまたはｒｅ
ｃ８ｋをプレートに吸着させた後、余分な溶液を除去し
た。さらに、非特異的なタンパク吸着をブロックする目
的で、このプレートに１％のウシ血清アルブミンをの
せ、室温で１時間以上静置し、余分な溶液を除去した。
このようにして調製したｐｐ−ｖＷＦコーティングプレ
ートまたはｒｅｃ ８ｋコーティングプレートを４８ウ
エル細胞培養用ディシュ（コースター社製）の底に置
き、ＲＧＥペプチド（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ
−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、０．５ｍＭ）、ＲＧＤペプチド（Ｇ
ｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＡＳｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、０．
５ｍＭ）、４Ｂ４（抗β１インテグリン抗体、１０μｇ
／ｍｌ）またはヘパリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加し
たＭＥＭに懸濁したヒトメラノーマ由来Ｇ−３６１細胞
液（２×１０^５個／ｍｌ）０．３ｍｌを各ウエルに添加
し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で９０分保温し
た。これらのプレートをＰＢＳで洗浄した後、１％グル
タルアルデヒドで５分間固定した。さらに０．５％クリ
スタルバイオレット・２０％メタノール中にこのプレー
トを浸すことにより、細胞を染色しＰＢＳで洗浄した
後、プレート上に接着した１ｍｍ^２当たりの細胞数を計
数した。20 μg / ml pp-vWF or re
c 8k 40 μl of each was placed on a 6 mm square plastic plate and allowed to stand at 4 ° C. overnight, followed by pp-vWF or re.
After adsorbing c8k on the plate, the excess solution was removed. Further, for the purpose of blocking non-specific protein adsorption, 1% bovine serum albumin was placed on this plate and allowed to stand at room temperature for 1 hour or more to remove the excess solution.
The pp-vWF-coated plate or rec 8k-coated plate thus prepared was placed on the bottom of a 48-well cell culture dish (manufactured by Coaster) and the RGE peptide (Gly-Arg-Gly-Glu was used.
-Ser-Pro, 0.5 mM), RGD peptide (G
ly-Arg-Gly-ASp-Ser-Pro, 0.
5 mM, 4B4 (anti-β1 integrin antibody, 10 μg)
/ Ml) or human melanoma-derived G-361 cell solution (2 × 10 ⁵ cells / ml) suspended in MEM supplemented with heparin (100 μg / ml) (0.3 ml) was added to each well, and the mixture was added to a CO ₂ incubator. Incubated at 37 ° C for 90 minutes. These plates were washed with PBS and then fixed with 1% glutaraldehyde for 5 minutes. The cells were further stained by immersing the plate in 0.5% crystal violet / 20% methanol, washed with PBS, and then the number of cells per mm ² adhered to the plate was counted.

【００７２】得られた結果を図９に示す。図９から明ら
かなように、大腸菌で発現させたｐｐ−ｖＷＦの８ｋＤ
ａ領域を含むペプチドｒｅｃ ８ｋとメラノーマ細胞と
の接着は、ＲＧＤ、ＲＧＥペプチドあるいはヘパリンで
阻害されないが、４Ｂ４（抗β１インテグリン抗体）で
完全に阻害された。これは、ｐｐ−ｖＷＦとメラノーマ
との接着と全く同じ結果であり、８ｋＤａ領域にｐｐ−
ｖＷＦのもつ細胞接着配列が含まれていることを支持す
る。The obtained results are shown in FIG. As is clear from FIG. 9, 8 kD of pp-vWF expressed in E. coli.
The adhesion between the peptide rec 8k containing the a region and melanoma cells was not inhibited by RGD, RGE peptide or heparin, but was completely inhibited by 4B4 (anti-β1 integrin antibody). This is exactly the same result as the adhesion between pp-vWF and melanoma, and pp-v in the 8 kDa region.
Supports the inclusion of cell adhesion sequences with vWF.

【００７３】[0073]

【発明の効果】本発明の細胞接着活性ペプチドは特にメ
ラノーマ細胞に対する特異的な細胞接着活性を示し、癌
転移の抑制などの医薬用途に応用しうる。INDUSTRIAL APPLICABILITY The cell-adhesive active peptide of the present invention exhibits a specific cell-adhesive activity particularly to melanoma cells and can be applied to pharmaceutical uses such as suppression of cancer metastasis.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】ウシ動脈血管内皮細胞およびＢ１６メラノーマ
細胞への各種タンパク質の接着性を示す図（生物の形態
を示す写真）である。FIG. 1 is a diagram (photograph showing the morphology of an organism) showing the adhesion of various proteins to bovine arterial vascular endothelial cells and B16 melanoma cells.

【図２】成熟ｖＷＦおよびｐｐ−ｖＷＦへのＢ１６細胞
の接着に与えるＲＧＤペプチドの効果を示す図（生物の
形態を示す写真）である。FIG. 2 shows the effect of RGD peptide on the adhesion of B16 cells to mature vWF and pp-vWF (photograph showing the morphology of the organism).

【図３】ｐｐ−ｖＷＦへのＢ１６細胞の接着に与えるＭ
ｇ^２＋の効果（ａ）およびＭｇ^２＋存在下でのＣａ^２＋
の効果（ｂ）を示す図である。FIG. 3. M on adhesion of B16 cells to pp-vWF
g ²⁺ effects (a) and ^{Mg 2+ Ca 2+} in the presence
It is a figure which shows the effect (b) of.

【図４】ｐｐ−ｖＷＦ、フィブロネクチンおよびコラー
ゲンへのＧ−３６１細胞の接着に与える抗インテグリン
モノクローナル抗体の効果を示す図である。FIG. 4 shows the effect of anti-integrin monoclonal antibody on the adhesion of G-361 cells to pp-vWF, fibronectin and collagen.

【図５】ｐｐ−ｖＷＦへのＢ１６細胞の接着に与える、
ｐｐ−ｖＷＦに対するモノクローナル抗体の効果を示す
図である。FIG. 5: Contributes to adhesion of B16 cells to pp-vWF,
It is a figure which shows the effect of the monoclonal antibody with respect to pp-vWF.

【図６】ウシｐｐ−ｖＷＦ由来の８ｋＤａ断片へのＢ１
６細胞の接着を示す図である。FIG. 6: B1 into the 8 kDa fragment from bovine pp-vWF
It is a figure which shows adhesion of 6 cells.

【図７】ｐｐ−ｖＷＦの８ｋＤａ領域を含むペプチド
（ｒｅｃ ８ｋ）を大腸菌で発現させるための発現ベク
ターの構築を示す図である。FIG. 7 is a diagram showing the construction of an expression vector for expressing a peptide containing the 8 kDa region of pp-vWF (rec 8k) in Escherichia coli.

【図８】ｐｐ−ｖＷＦおよびｒｅｃ ８ｋのメラノーマ
細胞（Ｇ−３６１細胞）への接着性を示す図（生物の形
態を示す写真）である。FIG. 8 is a diagram (photograph showing the morphology of an organism) showing the adhesiveness of pp-vWF and rec 8k to melanoma cells (G-361 cells).

【図９】ｐｐ−ｖＷＦおよびｒｅｃ ８ｋのＧ−３６１
細胞への接着に与えるＲＧＥ、ＲＧＤ、４Ｂ４およびヘ
パリンの効果を示す図である。FIG. 9. G-361 of pp-vWF and rec 8k.
FIG. 6 shows the effect of RGE, RGD, 4B4 and heparin on adhesion to cells.

【図１０】ｐｐ−ｖＷＦおよび成熟ｖＷＦを含むプレプ
ロ−ｖＷＦの構造模式図である。FIG. 10 is a structural schematic diagram of prepro-vWF containing pp-vWF and mature vWF.

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：７４１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： 配列番号：２ 配列の長さ：６０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： 配列番号：３ 配列の長さ：９４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： [Sequence Listing] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 741 Sequence type: Amino acid Number of chains: Single chain Topology: Linear Sequence type: Peptide Sequence: SEQ ID NO: 2 Sequence length: 60 Sequence type: Amino acid Number of chains: Single chain Topology: Linear Sequence type: Peptide Sequence: SEQ ID NO: 3 Sequence length: 94 Sequence type: Amino acid Number of chains: Single strand Topology: Linear Sequence type: Peptide Sequence:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 須戸 良光 神奈川県相模原市東林間８−17−３ コー ポ広美105号 (72)発明者 清水 朗 大阪府大阪市中央区北浜４丁目５番33号 住友金属工業株式会社内 (72)発明者 奥野 貢広 大阪府大阪市中央区北浜４丁目５番33号 住友金属工業株式会社内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification number Reference number within the agency FI technical display location C12R 1:19) (72) Inventor Yoshimitsu Sudo 8-17-3 Hirobayashi, Higashibayashi, Sagamihara City, Kanagawa Prefecture Hiromi Corp. No. 105 (72) Inventor Akira Shimizu 4-53-3 Kitahama, Chuo-ku, Osaka-shi, Sumitomo Metal Industry Co., Ltd. (72) Inoue Mitsuhiro Okuno 4-53-3 Kitahama, Chuo-ku, Osaka, Osaka Sumitomo Metal Industry Co., Ltd.

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配
列、あるいは該アミノ酸配列において１もしくは複数の
アミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列を
もち、かつ細胞接着活性を有するペプチド。1. A peptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing, or an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted or substituted in the amino acid sequence, and having cell adhesion activity. 【請求項２】 メラノーマ細胞に対して特異的に接着す
る請求項１記載のペプチド。2. The peptide according to claim 1, which specifically adheres to melanoma cells.