JPH07327685A - 超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子 - Google Patents
超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子Info
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- JPH07327685A JPH07327685A JP15435694A JP15435694A JPH07327685A JP H07327685 A JPH07327685 A JP H07327685A JP 15435694 A JP15435694 A JP 15435694A JP 15435694 A JP15435694 A JP 15435694A JP H07327685 A JPH07327685 A JP H07327685A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
- C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 より好熱性でかつ、耐熱性に優れ、更に界面
活性剤に耐性を持つβ−ガラクトシダーゼをコードする
遺伝子を単離し、該遺伝子を用いた超耐熱性のβ−ガラ
クトシダーゼの工業的製造方法を提供する。 【構成】 単離されたＳＤＳ耐性を有するピロコッカス
フリオサス由来の超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝
子。その例には配列表の配列番号１又は２で表される遺
伝子、該配列番号１で表される遺伝子にハイブリダイズ
可能な遺伝子がある。これら例示の遺伝子又はその一部
をプローブ又はプライマーとして用いる該遺伝子のクロ
ーニング方法。該遺伝子を用い、プラスミドを導入させ
た形質転換体を培養する超耐熱性β−ガラクトシダーゼ
の製法。
活性剤に耐性を持つβ−ガラクトシダーゼをコードする
遺伝子を単離し、該遺伝子を用いた超耐熱性のβ−ガラ
クトシダーゼの工業的製造方法を提供する。 【構成】 単離されたＳＤＳ耐性を有するピロコッカス
フリオサス由来の超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝
子。その例には配列表の配列番号１又は２で表される遺
伝子、該配列番号１で表される遺伝子にハイブリダイズ
可能な遺伝子がある。これら例示の遺伝子又はその一部
をプローブ又はプライマーとして用いる該遺伝子のクロ
ーニング方法。該遺伝子を用い、プラスミドを導入させ
た形質転換体を培養する超耐熱性β−ガラクトシダーゼ
の製法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＳＤＳ耐性を有する超
耐熱性β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、該遺
伝子又はその一部を利用する該ガラクトシダーゼ遺伝子
のクローニング方法及び食品工業、糖質工学等の分野に
おいて有用な該酵素の遺伝子工学的な製造方法に関す
る。
耐熱性β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、該遺
伝子又はその一部を利用する該ガラクトシダーゼ遺伝子
のクローニング方法及び食品工業、糖質工学等の分野に
おいて有用な該酵素の遺伝子工学的な製造方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】β−ガラクトシダーゼは、β−ガラクト
シドを分解する酵素で、動物、植物、微生物より見出さ
れ、特に細菌では、大腸菌（ Escherichia coli ) をは
じめとして、ストレプトコッカス ラクティス（ Strep
tococcus lactis ) 、バチルスズブチリス（ Bacillus
subtilis )、ストレプトコッカス サーモフィラス（St
reptococcus thermophilus )、スルホロバス ソルファ
タリカス（ Sulfolobus solfataricus )などに存在して
いることが知られている。このβ−ガラクトシダーゼ
は、そのラクトースのガラクトースとグルコースへの加
水分解能を利用して、低乳糖牛乳の製造に使用されてい
る。また、チーズ製造の際大量に生成する乳清中のラク
トースからガラクトース、又はグルコースを製造するた
めにも用いられている。このようにβ−ガラクトシダー
ゼを食品加工に利用する際には、加工中の微生物汚染を
防ぐという点から、更には、基質となるラクトースの溶
解性を向上させるといった点からも高温使用に耐える酵
素が求められている。また近年β−ガラクトシダーゼの
糖転移反応を利用した糖化合物の製造も種々行われてお
り（特開平６−２５２７５号、同６−１４７７４号）、
熱安定性に優れた酵素の開発が望まれている。例えば、
スルホロバス ソルファタリカスのβ−ガラクトシダー
ゼ〔ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミスト
リー（ European Journal of Biochemistry ) 、第１８
７巻、第３２１〜３２８頁（１９９０）〕は、９０℃で
活性を有しており、好熱性の酵素であるが、８５℃で１
８０分間処理した後の活性は約５０％に低下する。超好
熱菌のピロコッカス フリオサス（ Pyrococcus furios
us )のβ−ガラクトシダーゼが高温下で活性を示し、熱
安定性が高いことはヨーロピアン ジャーナル オブ
バイオケミストリー、第２１３巻、第３０５〜３１２頁
（１９９３）にも記載され、本発明者らも９０℃で１２
０分間処理したとき約８０％の残存活性を示す超耐熱性
β−ガラクトシダーゼを見出し、３種類のβ−ガラクト
シダーゼの単離に成功している（欧州特許公開第０５９
２１５８Ａ２号）。これらの３種のβ−ガラクトシダー
ゼはいずれも超耐熱性であるが、その中の１つは１％Ｓ
ＤＳの存在下でも活性を示し、極めて安定性の高いβ−
ガラクトシダーゼである。
シドを分解する酵素で、動物、植物、微生物より見出さ
れ、特に細菌では、大腸菌（ Escherichia coli ) をは
じめとして、ストレプトコッカス ラクティス（ Strep
tococcus lactis ) 、バチルスズブチリス（ Bacillus
subtilis )、ストレプトコッカス サーモフィラス（St
reptococcus thermophilus )、スルホロバス ソルファ
タリカス（ Sulfolobus solfataricus )などに存在して
いることが知られている。このβ−ガラクトシダーゼ
は、そのラクトースのガラクトースとグルコースへの加
水分解能を利用して、低乳糖牛乳の製造に使用されてい
る。また、チーズ製造の際大量に生成する乳清中のラク
トースからガラクトース、又はグルコースを製造するた
めにも用いられている。このようにβ−ガラクトシダー
ゼを食品加工に利用する際には、加工中の微生物汚染を
防ぐという点から、更には、基質となるラクトースの溶
解性を向上させるといった点からも高温使用に耐える酵
素が求められている。また近年β−ガラクトシダーゼの
糖転移反応を利用した糖化合物の製造も種々行われてお
り（特開平６−２５２７５号、同６−１４７７４号）、
熱安定性に優れた酵素の開発が望まれている。例えば、
スルホロバス ソルファタリカスのβ−ガラクトシダー
ゼ〔ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミスト
リー（ European Journal of Biochemistry ) 、第１８
７巻、第３２１〜３２８頁（１９９０）〕は、９０℃で
活性を有しており、好熱性の酵素であるが、８５℃で１
８０分間処理した後の活性は約５０％に低下する。超好
熱菌のピロコッカス フリオサス（ Pyrococcus furios
us )のβ−ガラクトシダーゼが高温下で活性を示し、熱
安定性が高いことはヨーロピアン ジャーナル オブ
バイオケミストリー、第２１３巻、第３０５〜３１２頁
（１９９３）にも記載され、本発明者らも９０℃で１２
０分間処理したとき約８０％の残存活性を示す超耐熱性
β−ガラクトシダーゼを見出し、３種類のβ−ガラクト
シダーゼの単離に成功している（欧州特許公開第０５９
２１５８Ａ２号）。これらの３種のβ−ガラクトシダー
ゼはいずれも超耐熱性であるが、その中の１つは１％Ｓ
ＤＳの存在下でも活性を示し、極めて安定性の高いβ−
ガラクトシダーゼである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上述のように高温にお
ける食品加工や糖化合物の製造には、好熱性でかつ、耐
熱性の酵素が求められる。更に強力な界面活性剤である
ＳＤＳ存在下でも酵素活性を維持する酵素は、応用範囲
が広がる。本発明の目的は、より好熱性でかつ、耐熱性
に優れ、更に界面活性剤に耐性を持つβ−ガラクトシダ
ーゼをコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を用いた超
耐熱性のβ−ガラクトシダーゼの工業的製造方法を提供
することにある。
ける食品加工や糖化合物の製造には、好熱性でかつ、耐
熱性の酵素が求められる。更に強力な界面活性剤である
ＳＤＳ存在下でも酵素活性を維持する酵素は、応用範囲
が広がる。本発明の目的は、より好熱性でかつ、耐熱性
に優れ、更に界面活性剤に耐性を持つβ−ガラクトシダ
ーゼをコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を用いた超
耐熱性のβ−ガラクトシダーゼの工業的製造方法を提供
することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は単離されたＳＤＳ耐性を有するピロ
コッカス フリオサス由来の超耐熱性β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子に関する。本発明の第２の発明は、配列表の
配列番号１で表されるアミノ酸配列、又はその一部であ
って、かつ、超耐熱性β−ガラクトシダーゼ酵素活性を
有する部分をコードする第１の発明の遺伝子に関する。
本発明の第３の発明は、配列表の配列番号２で表される
塩基配列を有することを特徴とする第１の発明の遺伝子
に関する。本発明の第４の発明は、上記第２の発明の遺
伝子にハイブリダイズ可能なＳＤＳ耐性を有する超耐熱
性β−ガラクトシダーゼ遺伝子に関する。本発明の第５
の発明は、上記した第２〜第４の発明のいずれかの遺伝
子又はその一部を、プローブ又はプライマーとして用い
ることを特徴とする超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝
子のクローニング方法に関する。そして本発明の第６の
発明は、前記第１の発明の超耐熱性β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子を含有させた組換えプラスミドを導入させた形
質転換体を培養し、該培養物から超耐熱性β−ガラクト
シダーゼを採取することを特徴とする超耐熱性β−ガラ
クトシダーゼの製造方法に関する。
発明の第１の発明は単離されたＳＤＳ耐性を有するピロ
コッカス フリオサス由来の超耐熱性β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子に関する。本発明の第２の発明は、配列表の
配列番号１で表されるアミノ酸配列、又はその一部であ
って、かつ、超耐熱性β−ガラクトシダーゼ酵素活性を
有する部分をコードする第１の発明の遺伝子に関する。
本発明の第３の発明は、配列表の配列番号２で表される
塩基配列を有することを特徴とする第１の発明の遺伝子
に関する。本発明の第４の発明は、上記第２の発明の遺
伝子にハイブリダイズ可能なＳＤＳ耐性を有する超耐熱
性β−ガラクトシダーゼ遺伝子に関する。本発明の第５
の発明は、上記した第２〜第４の発明のいずれかの遺伝
子又はその一部を、プローブ又はプライマーとして用い
ることを特徴とする超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝
子のクローニング方法に関する。そして本発明の第６の
発明は、前記第１の発明の超耐熱性β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子を含有させた組換えプラスミドを導入させた形
質転換体を培養し、該培養物から超耐熱性β−ガラクト
シダーゼを採取することを特徴とする超耐熱性β−ガラ
クトシダーゼの製造方法に関する。
【０００５】本発明の超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺
伝子は、例えばコスミドベクターを用いる発現クローニ
ング法によりスクリーニングを行い、得ることができ
る。発現クローニング法は例えば、目的とする酵素の一
次構造に関する情報なしに酵素遺伝子をクローニングす
る際に用いることができ、例えばピロコッカス ボウゼ
イ（ Pyrococcus woesei )由来のプルナーゼ遺伝子（国
際公開 ９２／０２６１４号）はこの方法により取得さ
れている。一般に発現クローニング法にはプラスミドベ
クターが使用されるが、この場合には目的遺伝子がその
内部で切断されることなく、かつプラスミドベクターに
挿入可能な程度の比較的小さなＤＮＡ断片に切断される
ような制限酵素を用いなければならず、必ずしもすべて
の酵素遺伝子のクローニングに適用可能ではない。更
に、数多くのクローンについて酵素活性の発現を調べる
必要があり、操作が繁雑である。
伝子は、例えばコスミドベクターを用いる発現クローニ
ング法によりスクリーニングを行い、得ることができ
る。発現クローニング法は例えば、目的とする酵素の一
次構造に関する情報なしに酵素遺伝子をクローニングす
る際に用いることができ、例えばピロコッカス ボウゼ
イ（ Pyrococcus woesei )由来のプルナーゼ遺伝子（国
際公開 ９２／０２６１４号）はこの方法により取得さ
れている。一般に発現クローニング法にはプラスミドベ
クターが使用されるが、この場合には目的遺伝子がその
内部で切断されることなく、かつプラスミドベクターに
挿入可能な程度の比較的小さなＤＮＡ断片に切断される
ような制限酵素を用いなければならず、必ずしもすべて
の酵素遺伝子のクローニングに適用可能ではない。更
に、数多くのクローンについて酵素活性の発現を調べる
必要があり、操作が繁雑である。
【０００６】本発明者らはプラスミドベクターに代え
て、より大きなＤＮＡ断片（３５〜５０ｋｂｐ）を保持
できるコスミドベクターを用いてピロコッカス フリオ
サスゲノムのコスミドライブラリーを作製し、該ライブ
ラリー中にβ−ガラクトシダーゼ活性を発現するコスミ
ドクローンを検索することにより、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子を単離することを試みた。コスミドベクターを
用いることにより、酵素遺伝子内部が切断されるおそれ
が減ると共に、スクリーニングする形質転換体の数を減
らすことができる。その反面、コスミドベクターはプラ
スミドベクターほど宿主内でのコピー数が高くないた
め、酵素の発現量が低く、活性を検出できない可能性が
ある。
て、より大きなＤＮＡ断片（３５〜５０ｋｂｐ）を保持
できるコスミドベクターを用いてピロコッカス フリオ
サスゲノムのコスミドライブラリーを作製し、該ライブ
ラリー中にβ−ガラクトシダーゼ活性を発現するコスミ
ドクローンを検索することにより、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子を単離することを試みた。コスミドベクターを
用いることにより、酵素遺伝子内部が切断されるおそれ
が減ると共に、スクリーニングする形質転換体の数を減
らすことができる。その反面、コスミドベクターはプラ
スミドベクターほど宿主内でのコピー数が高くないた
め、酵素の発現量が低く、活性を検出できない可能性が
ある。
【０００７】本発明者らは目的とする酵素が高い耐熱性
を有する点に着目し、コスミドライブラリー中の形質転
換体を個別に培養し、得られた菌体から耐熱性のタンパ
クのみを含むライゼートを調製する工程を組合せた。こ
の一群のライゼートは、コスミドプロテインライブラリ
ーと命名され、該コスミドプロテインライブラリーを酵
素活性の検出に用いることにより、形質転換体のコロニ
ーを用いる方法よりも検出感度が上がると共に、宿主由
来のタンパク等によるバックグラウンドや酵素活性の阻
害といった悪影響を除去することができる。
を有する点に着目し、コスミドライブラリー中の形質転
換体を個別に培養し、得られた菌体から耐熱性のタンパ
クのみを含むライゼートを調製する工程を組合せた。こ
の一群のライゼートは、コスミドプロテインライブラリ
ーと命名され、該コスミドプロテインライブラリーを酵
素活性の検出に用いることにより、形質転換体のコロニ
ーを用いる方法よりも検出感度が上がると共に、宿主由
来のタンパク等によるバックグラウンドや酵素活性の阻
害といった悪影響を除去することができる。
【０００８】本発明者らは、ピロコッカス フリオサス
由来のコスミドプロテインライブラリーを検索し、１％
ＳＤＳ存在下、β−ガラクトシダーゼ活性を微弱ながら
示すコスミドクローンを１個取得した。
由来のコスミドプロテインライブラリーを検索し、１％
ＳＤＳ存在下、β−ガラクトシダーゼ活性を微弱ながら
示すコスミドクローンを１個取得した。
【０００９】更に本発明者らはこれらのクローン中に含
まれる挿入ＤＮＡ断片より、種々の遺伝子工学的手法を
駆使して超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子の単離を
行い、該遺伝子の塩基配列を決定した。更に、該遺伝子
を用いて超耐熱性β−ガラクトシダーゼを遺伝子工学的
に生産させることに成功し、本発明を完成した。なお、
このコスミドプロテインライブラリーを利用した発現ク
ローニング法は必ずしもあらゆる耐熱性酵素に応用でき
るわけではなく、目的とする遺伝子によりその成否は左
右される。例えば、本発明者らは該方法を用いてピロコ
ッカスフリオサス由来のα−グルコシダーゼ〔ジャーナ
ル オブ バクテリオロジー（Journal of Bacteriolog
y ) 、第１７２巻、第３６５４〜３６６０頁（１９９
０）〕についても該α−グルコシダーゼをコードする遺
伝子の単離を試みたが、該遺伝子の単離には至っていな
い。
まれる挿入ＤＮＡ断片より、種々の遺伝子工学的手法を
駆使して超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子の単離を
行い、該遺伝子の塩基配列を決定した。更に、該遺伝子
を用いて超耐熱性β−ガラクトシダーゼを遺伝子工学的
に生産させることに成功し、本発明を完成した。なお、
このコスミドプロテインライブラリーを利用した発現ク
ローニング法は必ずしもあらゆる耐熱性酵素に応用でき
るわけではなく、目的とする遺伝子によりその成否は左
右される。例えば、本発明者らは該方法を用いてピロコ
ッカスフリオサス由来のα−グルコシダーゼ〔ジャーナ
ル オブ バクテリオロジー（Journal of Bacteriolog
y ) 、第１７２巻、第３６５４〜３６６０頁（１９９
０）〕についても該α−グルコシダーゼをコードする遺
伝子の単離を試みたが、該遺伝子の単離には至っていな
い。
【００１０】以下、本発明をより詳細に説明する。本発
明に用いられる微生物は、超耐熱性β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子を産生する微生物であれば特に限定されない
が、例えば超耐熱細菌であるピロコッカス属に属する菌
株を用いることができ、例えばピロコッカス フリオサ
スＤＳＭ ３６３８やピロコッカス ボウゼイＤＳＭ
３７７３を用いることができる。なお、該両菌株はドイ
ッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン
ウントツェルクルチュウレンＧｍｂＨ（ Deutsche Samm
lung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH )よ
り入手可能な菌株である。例えば、ピロコッカス フリ
オサスゲノム遺伝子のコスミドライブラリーは、ピロコ
ッカス フリオサスＤＳＭ ３６３８のゲノム遺伝子を
適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）を
用いて部分分解し、３５〜５０ｋｂｐにサイズ分画して
得られた各ＤＮＡ断片と適当なコスミドベクター、例え
ばトリプルヘリックスコスミドベクター（ストラタジー
ン社製）をライゲーションした後、インビトロパッケー
ジング法で一旦ラムダファージ粒子中にピロコッカス
フリオサスのゲノムＤＮＡ断片をパッケージし、得られ
るファージ溶液を用いて適当な大腸菌、例えば大腸菌Ｄ
Ｈ５αＭＣＲ（ＢＲＬ社製）を形質転換し調製すること
ができる。次に形質転換体のコロニー数個よりコスミド
ＤＮＡを調製し、３５〜５０ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片
の挿入を確認する。培養するコロニー数としては、通常
３００〜７００個で良い。
明に用いられる微生物は、超耐熱性β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子を産生する微生物であれば特に限定されない
が、例えば超耐熱細菌であるピロコッカス属に属する菌
株を用いることができ、例えばピロコッカス フリオサ
スＤＳＭ ３６３８やピロコッカス ボウゼイＤＳＭ
３７７３を用いることができる。なお、該両菌株はドイ
ッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン
ウントツェルクルチュウレンＧｍｂＨ（ Deutsche Samm
lung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH )よ
り入手可能な菌株である。例えば、ピロコッカス フリ
オサスゲノム遺伝子のコスミドライブラリーは、ピロコ
ッカス フリオサスＤＳＭ ３６３８のゲノム遺伝子を
適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）を
用いて部分分解し、３５〜５０ｋｂｐにサイズ分画して
得られた各ＤＮＡ断片と適当なコスミドベクター、例え
ばトリプルヘリックスコスミドベクター（ストラタジー
ン社製）をライゲーションした後、インビトロパッケー
ジング法で一旦ラムダファージ粒子中にピロコッカス
フリオサスのゲノムＤＮＡ断片をパッケージし、得られ
るファージ溶液を用いて適当な大腸菌、例えば大腸菌Ｄ
Ｈ５αＭＣＲ（ＢＲＬ社製）を形質転換し調製すること
ができる。次に形質転換体のコロニー数個よりコスミド
ＤＮＡを調製し、３５〜５０ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片
の挿入を確認する。培養するコロニー数としては、通常
３００〜７００個で良い。
【００１１】各コロニーの培養終了後、培養菌体を集菌
し、熱処理（１００℃、１０分間）、超音波処理、再熱
処理（１００℃、１０分間）して、コスミドプロテイン
ライブラリーとして、得られたライゼート中のβ−ガラ
クトシダーゼ活性を１％ＳＤＳ存在下で測定することに
よって、上記の熱処理にも安定な、超耐熱性β−ガラク
トシダーゼを発現しているコロニーをスクリーニングす
ることができる。β−ガラクトシダーゼ活性は例えばｏ
−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ラク
トース（すべてナカライテスク社製）等を基質として、
例えば反応温度９５℃で測定を行う。続いて活性を示し
た形質転換体中のコスミドＤＮＡ中の挿入断片の解析を
行う。本発明者らが調製した５００個の形質転換体中、
活性を示した１個の形質転換体中のコスミドＤＮＡ中の
挿入断片について、種々の制限酵素で切断し、その断片
群を適当なベクターに挿入する。例えば、前述のコスミ
ドクローンから調製したコスミドＤＮＡをＨｉｎｄIII
（宝酒造社製）消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミ
ドベクターｐＵＣ１８（宝酒造社製）のＨｉｎｄIII サ
イトに導入した組換えプラスミドを得ることができる。
し、熱処理（１００℃、１０分間）、超音波処理、再熱
処理（１００℃、１０分間）して、コスミドプロテイン
ライブラリーとして、得られたライゼート中のβ−ガラ
クトシダーゼ活性を１％ＳＤＳ存在下で測定することに
よって、上記の熱処理にも安定な、超耐熱性β−ガラク
トシダーゼを発現しているコロニーをスクリーニングす
ることができる。β−ガラクトシダーゼ活性は例えばｏ
−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ラク
トース（すべてナカライテスク社製）等を基質として、
例えば反応温度９５℃で測定を行う。続いて活性を示し
た形質転換体中のコスミドＤＮＡ中の挿入断片の解析を
行う。本発明者らが調製した５００個の形質転換体中、
活性を示した１個の形質転換体中のコスミドＤＮＡ中の
挿入断片について、種々の制限酵素で切断し、その断片
群を適当なベクターに挿入する。例えば、前述のコスミ
ドクローンから調製したコスミドＤＮＡをＨｉｎｄIII
（宝酒造社製）消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミ
ドベクターｐＵＣ１８（宝酒造社製）のＨｉｎｄIII サ
イトに導入した組換えプラスミドを得ることができる。
【００１２】次にこの組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１
０９（宝酒造社製）に導入して得られた形質転換体を培
養し、集菌した後、菌体中に発現されているタンパク質
のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定する。活性測定は菌
体及び菌体破壊物の１００℃、１０分間２回の熱処理物
を用い、１％ＳＤＳの存在下で基質しとては、前出のｏ
−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを用い
る。反応温度は９５℃で３０分間反応させることにより
活性を測定することができる。上記の形質転換体のライ
ゼートに活性は見られなかった。次に、制限酵素Ａｃｃ
Ｉ、ＢｇｌII、ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩ又はＨｉｎｃII
（すべて宝酒造社製）についても同様な方法で活性の検
索を行ったが、活性は見られなかった。
０９（宝酒造社製）に導入して得られた形質転換体を培
養し、集菌した後、菌体中に発現されているタンパク質
のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定する。活性測定は菌
体及び菌体破壊物の１００℃、１０分間２回の熱処理物
を用い、１％ＳＤＳの存在下で基質しとては、前出のｏ
−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを用い
る。反応温度は９５℃で３０分間反応させることにより
活性を測定することができる。上記の形質転換体のライ
ゼートに活性は見られなかった。次に、制限酵素Ａｃｃ
Ｉ、ＢｇｌII、ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩ又はＨｉｎｃII
（すべて宝酒造社製）についても同様な方法で活性の検
索を行ったが、活性は見られなかった。
【００１３】そこで、前述の制限酵素よりも長いＤＮＡ
断片が得られる制限酵素、例えばＣｌａＩ（宝酒造社
製）で同様の検索を行ったが、プラスミドに挿入される
段階で挿入断片に欠失が見られ、活性も見られなかっ
た。次にＳｍａＩ（宝酒造社製）について同様の方法で
検索したところ、約４ｋｂｐのＤＮＡ断片を挿入したプ
ラスミドに活性が見られた。このプラスミドは本発明者
らによってプラスミドｐＴＧ２Ｓ−１１２と命名され
た。また該プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換す
ることにより、本発明者らが Escherichia coli JM109/
pTG2S-112 と命名した形質転換体を得ることができる。
該形質転換体を培養し、培養終了後に集菌して得られる
菌体中に発現しているβ−ガラクトシダーゼは、１％Ｓ
ＤＳの存在下１００℃、１０分間２回の熱処理にも安定
であり、目的の超耐熱性β−ガラクトシダーゼが発現さ
れている。
断片が得られる制限酵素、例えばＣｌａＩ（宝酒造社
製）で同様の検索を行ったが、プラスミドに挿入される
段階で挿入断片に欠失が見られ、活性も見られなかっ
た。次にＳｍａＩ（宝酒造社製）について同様の方法で
検索したところ、約４ｋｂｐのＤＮＡ断片を挿入したプ
ラスミドに活性が見られた。このプラスミドは本発明者
らによってプラスミドｐＴＧ２Ｓ−１１２と命名され
た。また該プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換す
ることにより、本発明者らが Escherichia coli JM109/
pTG2S-112 と命名した形質転換体を得ることができる。
該形質転換体を培養し、培養終了後に集菌して得られる
菌体中に発現しているβ−ガラクトシダーゼは、１％Ｓ
ＤＳの存在下１００℃、１０分間２回の熱処理にも安定
であり、目的の超耐熱性β−ガラクトシダーゼが発現さ
れている。
【００１４】更に、プラスミドｐＴＧ２Ｓ−１１２を数
種類の制限酵素で切断しその断片を適当なベクターに挿
入する。得られた組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９
に導入して得られた形質転換体を培養し、集菌した後菌
体中に発現されているタンパク質のβ−ガラクトシダー
ゼ活性を測定し、超耐熱性β−ガラクトシダーゼを発現
しているプラスミドを検索することができる。例えば、
プラスミドｐＴＧ２Ｓ−１１２を制限酵素Ｅｃｏ８１Ｉ
（宝酒造社製）及びＳｍａＩ消化して得られる約２．０
ｋｂｐのＥｃｏ８１Ｉ−ＳｍａＩＤＮＡ断片を精製し、
ｐＵＣ１８に導入し、組換えプラスミドを得ることがで
きる。又は、ｐＴＧ２Ｓ−１１２のベクター（ｐＵＣ１
８）部分のマルチクローニングサイトを利用し、ｐＴＧ
２Ｓ−１１２を制限酵素Ｅｃｏ８１Ｉ及びＫｐｎＩ
（（宝酒造社製）消化して得られる約４．７ｋｂｐのＥ
ｃｏ８１Ｉ−ＫｐｎＩＤＮＡ断片を精製し、平滑末端化
後、セルフライゲーションを行い、上述の約２．０ｋｂ
ｐのＥｃｏ８１Ｉ−ＳｍａＩＤＮＡ断片を含む組換えプ
ラスミドを得ることができる。
種類の制限酵素で切断しその断片を適当なベクターに挿
入する。得られた組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９
に導入して得られた形質転換体を培養し、集菌した後菌
体中に発現されているタンパク質のβ−ガラクトシダー
ゼ活性を測定し、超耐熱性β−ガラクトシダーゼを発現
しているプラスミドを検索することができる。例えば、
プラスミドｐＴＧ２Ｓ−１１２を制限酵素Ｅｃｏ８１Ｉ
（宝酒造社製）及びＳｍａＩ消化して得られる約２．０
ｋｂｐのＥｃｏ８１Ｉ−ＳｍａＩＤＮＡ断片を精製し、
ｐＵＣ１８に導入し、組換えプラスミドを得ることがで
きる。又は、ｐＴＧ２Ｓ−１１２のベクター（ｐＵＣ１
８）部分のマルチクローニングサイトを利用し、ｐＴＧ
２Ｓ−１１２を制限酵素Ｅｃｏ８１Ｉ及びＫｐｎＩ
（（宝酒造社製）消化して得られる約４．７ｋｂｐのＥ
ｃｏ８１Ｉ−ＫｐｎＩＤＮＡ断片を精製し、平滑末端化
後、セルフライゲーションを行い、上述の約２．０ｋｂ
ｐのＥｃｏ８１Ｉ−ＳｍａＩＤＮＡ断片を含む組換えプ
ラスミドを得ることができる。
【００１５】該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入
し、得られたコロニーの超耐熱性β−ガラクトシダーゼ
活性を測定し、活性を示したコロニーよりプラスミドを
調製する。該後者のプラスミドはプラスミドｐＴＧ２Ｅ
Ｓ−１０５と命名され、該プラスミドで形質転換された
大腸菌ＪＭ１０９は Escherichia coli JM109/pTG2ES-1
05と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術研究
所にＦＥＲＭ Ｐ−１４２８０として寄託されている。
図１にプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５の制限酵素地図
を示す。図中、太実線がプラスミドｐＵＣ１８への挿入
断片である。
し、得られたコロニーの超耐熱性β−ガラクトシダーゼ
活性を測定し、活性を示したコロニーよりプラスミドを
調製する。該後者のプラスミドはプラスミドｐＴＧ２Ｅ
Ｓ−１０５と命名され、該プラスミドで形質転換された
大腸菌ＪＭ１０９は Escherichia coli JM109/pTG2ES-1
05と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術研究
所にＦＥＲＭ Ｐ−１４２８０として寄託されている。
図１にプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５の制限酵素地図
を示す。図中、太実線がプラスミドｐＵＣ１８への挿入
断片である。
【００１６】図２にプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５に
挿入されたピロコッカス フリオサス由来のＤＮＡ断片
の制限酵素地図を示す。すなわち図２は、本発明により
得られる超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子の１例の
制限酵素地図を示す図である。 Escherichia coli JM10
9/pTG2ES-105と命名した形質転換体を培養し、培養終了
後に集菌して得られる菌体中に発現しているβ−ガラク
トシダーゼは１％ＳＤＳ存在下１００℃、１０分間、２
回の熱処理にも安定であり、目的の超耐熱性β−ガラク
トシダーゼが発現されている。
挿入されたピロコッカス フリオサス由来のＤＮＡ断片
の制限酵素地図を示す。すなわち図２は、本発明により
得られる超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子の１例の
制限酵素地図を示す図である。 Escherichia coli JM10
9/pTG2ES-105と命名した形質転換体を培養し、培養終了
後に集菌して得られる菌体中に発現しているβ−ガラク
トシダーゼは１％ＳＤＳ存在下１００℃、１０分間、２
回の熱処理にも安定であり、目的の超耐熱性β−ガラク
トシダーゼが発現されている。
【００１７】超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含
有させた組換えプラスミドを導入させた形質転換体、例
えば Escherichia coli JM109/pTG2S-112 、 Escherich
ia coli JM109/pTG2ES-105をそれぞれ培養することによ
り、培養物中に超耐熱性β−ガラクトシダーゼが蓄積さ
れる。該培養物から超耐熱性β−ガラクトシダーゼを精
製する場合は例えば菌体を集菌した後、超音波処理によ
り該菌体を破砕し、遠心分離により得た上清について、
例えばゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の方法を組合
せて、酵素の精製を行うことができる。特に、本発明に
おいて超耐熱性β−ガラクトシダーゼを精製する際に
は、超音波処理の前後に熱処理を行うと、夾雑タンパク
質を変性させ、精製を容易に行うことができ、有効であ
る。
有させた組換えプラスミドを導入させた形質転換体、例
えば Escherichia coli JM109/pTG2S-112 、 Escherich
ia coli JM109/pTG2ES-105をそれぞれ培養することによ
り、培養物中に超耐熱性β−ガラクトシダーゼが蓄積さ
れる。該培養物から超耐熱性β−ガラクトシダーゼを精
製する場合は例えば菌体を集菌した後、超音波処理によ
り該菌体を破砕し、遠心分離により得た上清について、
例えばゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の方法を組合
せて、酵素の精製を行うことができる。特に、本発明に
おいて超耐熱性β−ガラクトシダーゼを精製する際に
は、超音波処理の前後に熱処理を行うと、夾雑タンパク
質を変性させ、精製を容易に行うことができ、有効であ
る。
【００１８】本発明の超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺
伝子、例えば、プラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５に組込
まれた遺伝子を発現させることにより得られる超耐熱性
β−ガラクトシダーゼの理化学的性質は下記のとおりで
ある。
伝子、例えば、プラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５に組込
まれた遺伝子を発現させることにより得られる超耐熱性
β−ガラクトシダーゼの理化学的性質は下記のとおりで
ある。
【００１９】（１）作用：ラクトースをガラクトースと
グルコースに加水分解する作用を有する。また、ｏ−ニ
トロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドをニトロフ
ェノールとガラクトースに加水分解する作用を有する。
また１％ＳＤＳを含む５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）条件下においてもｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドをニトロフェノールとガラクトー
スに加水分解する作用を有する。
グルコースに加水分解する作用を有する。また、ｏ−ニ
トロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドをニトロフ
ェノールとガラクトースに加水分解する作用を有する。
また１％ＳＤＳを含む５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）条件下においてもｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドをニトロフェノールとガラクトー
スに加水分解する作用を有する。
【００２０】（２）酵素活性測定方法： 〔（２）−ａ〕酵素活性の測定において、酵素のｏ−ニ
トロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド加水分解活
性は、加水分解で生成するｏ−ニトロフェノールを分光
学的に追跡することによって測定できる。すなわち、本
発明の酵素液５μｌを１１２ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール、１ｍＭ 塩化マグネシウム、１％ＳＤＳを含む
１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１９９μｌに
加えた後、０．４Ｍのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシドを含むジメチルスルホキシド溶液を１
μｌ加え、９５℃、３０分間反応させる。反応は、１０
０μｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウムを加えて停止し、４１
０ｎｍにおける吸光度を測定し、ｏ−ニトロフェノール
の生成量を求める。本発明で得られる酵素は１％ＳＤＳ
存在下ｐＨ７．０、９５℃においてｏ−ニトロフェニル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド加水分解活性を有してい
る。 〔（２）−ｂ〕ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド加水分解活性は、下記の方法によっても測定
することができる。すなわち、分光光度計のキュベット
中に、酵素を含むマッキールバイン（McIlvain) 緩衝液
１４８５μｌ、及び１Ｍのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドを含むジメチルスルホキシド溶液
を１５μｌ加えてｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシドの最終濃度を１０ｍＭとして反応を開始さ
せる。反応の進行は４１０ｎｍにおける吸収の変化を時
間に対して連続的に追跡することにより測定する。４１
０ｎｍにおける１分間当りの吸光度の変化を求め、あら
かじめ求めておいてｏ−ニトロフェノールの吸光係数よ
り、１分間に遊離されたｏ−ニトロフェノール量を求め
る。１酵素単位は、１分間に１μｍｏｌのｏ−ニトロフ
ェノールを遊離する酵素量として定義する。酵素タンパ
ク質の定量は、プロテインアッセイキット（バイオラッ
ド社製）を用いて行った。
トロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド加水分解活
性は、加水分解で生成するｏ−ニトロフェノールを分光
学的に追跡することによって測定できる。すなわち、本
発明の酵素液５μｌを１１２ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール、１ｍＭ 塩化マグネシウム、１％ＳＤＳを含む
１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１９９μｌに
加えた後、０．４Ｍのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシドを含むジメチルスルホキシド溶液を１
μｌ加え、９５℃、３０分間反応させる。反応は、１０
０μｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウムを加えて停止し、４１
０ｎｍにおける吸光度を測定し、ｏ−ニトロフェノール
の生成量を求める。本発明で得られる酵素は１％ＳＤＳ
存在下ｐＨ７．０、９５℃においてｏ−ニトロフェニル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド加水分解活性を有してい
る。 〔（２）−ｂ〕ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド加水分解活性は、下記の方法によっても測定
することができる。すなわち、分光光度計のキュベット
中に、酵素を含むマッキールバイン（McIlvain) 緩衝液
１４８５μｌ、及び１Ｍのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドを含むジメチルスルホキシド溶液
を１５μｌ加えてｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシドの最終濃度を１０ｍＭとして反応を開始さ
せる。反応の進行は４１０ｎｍにおける吸収の変化を時
間に対して連続的に追跡することにより測定する。４１
０ｎｍにおける１分間当りの吸光度の変化を求め、あら
かじめ求めておいてｏ−ニトロフェノールの吸光係数よ
り、１分間に遊離されたｏ−ニトロフェノール量を求め
る。１酵素単位は、１分間に１μｍｏｌのｏ−ニトロフ
ェノールを遊離する酵素量として定義する。酵素タンパ
ク質の定量は、プロテインアッセイキット（バイオラッ
ド社製）を用いて行った。
【００２１】（３）熱安定性： 〔（２）−ｂ〕記載の方法に準じ、下記の方法で熱安定
性の測定を行った。酵素を含むマッキールバイン緩衝液
（ｐＨ５．０）１．５ｍｌを９０℃で所定時間加熱した
後、１４８５μｌを抜き取る。分光光度計のキュベット
中で９０℃で５分間加熱した後１Ｍのｏ−ニトロフェニ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むジメチルスルホ
キシド溶液１５μｌを添加し、反応を開始する。反応の
進行は、４１０ｎｍにおける１分間当りの吸光度の変化
を算出し、あらかじめ求めておいたｏ−ニトロフェノー
ルの吸光係数より、１分間に遊離されたｏ−ニトロフェ
ノール量を求める。本発明の酵素は、図３に示すごと
く、９０℃で１８０分間処理してもほぼ１００％の残存
活性率を有している。すなわち図３は、酵素の熱安定性
を示す図であり、縦軸は、残存活性率（％）、横軸は、
９０℃での酵素の処理時間（分）を示す。
性の測定を行った。酵素を含むマッキールバイン緩衝液
（ｐＨ５．０）１．５ｍｌを９０℃で所定時間加熱した
後、１４８５μｌを抜き取る。分光光度計のキュベット
中で９０℃で５分間加熱した後１Ｍのｏ−ニトロフェニ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むジメチルスルホ
キシド溶液１５μｌを添加し、反応を開始する。反応の
進行は、４１０ｎｍにおける１分間当りの吸光度の変化
を算出し、あらかじめ求めておいたｏ−ニトロフェノー
ルの吸光係数より、１分間に遊離されたｏ−ニトロフェ
ノール量を求める。本発明の酵素は、図３に示すごと
く、９０℃で１８０分間処理してもほぼ１００％の残存
活性率を有している。すなわち図３は、酵素の熱安定性
を示す図であり、縦軸は、残存活性率（％）、横軸は、
９０℃での酵素の処理時間（分）を示す。
【００２２】（４）各種界面活性剤の影響： 〔（２）−ｂ〕記載の方法に準じ、下記の方法で各種界
面活性剤存在下での熱安定性の測定を行った。界面活性
剤は陰イオン性としてドデシル硫酸ナトリウム（ナカラ
イテスク社製）、陽イオン性として臭化ヘキサデシルト
リメチルアンモニウム（ナカライテスク社製）、非イオ
ン性としてポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノ
ラウレート（和光純薬社製）、コール酸系としてコール
酸ナトリウム（ナカライテスク社製）を用いた。
面活性剤存在下での熱安定性の測定を行った。界面活性
剤は陰イオン性としてドデシル硫酸ナトリウム（ナカラ
イテスク社製）、陽イオン性として臭化ヘキサデシルト
リメチルアンモニウム（ナカライテスク社製）、非イオ
ン性としてポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノ
ラウレート（和光純薬社製）、コール酸系としてコール
酸ナトリウム（ナカライテスク社製）を用いた。
【００２３】反応液は、上記界面活性剤を１％になるよ
うに調整した、酵素を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）１．５ｍｌを９０℃で所定時間加熱した後、１
４８５μｌを抜き取る。分光光度計のキュベット中で９
０℃で５分間加熱した後、１Ｍのｏ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むジメチルスルホキシ
ド溶液１５μｌを添加し、反応を開始する。反応の進行
は、４１０ｎｍにおける１分間当りの吸光度の変化を算
出し、あらかじめ求めておいたｏ−ニトロフェノールの
吸光係数より、１分間に遊離されたｏ−ニトロフェノー
ル量を求める。本発明の酵素は図４に示すごとく臭化ヘ
キサデシルトリメチルアンモニウムを除いて、いずれの
界面活性剤の存在下、９０℃で１２０分間処理してもほ
ぼ８０％の残存活性率を有している。特にタンパク質変
性用に使われているドデシル硫酸ナトリウム存在下、９
０℃、１２０分間処理してもほぼ９０％の残存活性率を
有している。すなわち、図４は、各種界面活性剤存在下
での酵素の熱安定性を示す図であり、縦軸は、残存活性
率（％）、横軸は、９０℃での酵素の処理時間（分）を
示す。また、図中白四角印は臭化ヘキサデシルトリメチ
ルアンモニウム、黒四角印はドデシル硫酸ナトリウム、
白丸印はポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラ
ウレート、黒丸印はコール酸ナトリウムを示す。
うに調整した、酵素を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）１．５ｍｌを９０℃で所定時間加熱した後、１
４８５μｌを抜き取る。分光光度計のキュベット中で９
０℃で５分間加熱した後、１Ｍのｏ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むジメチルスルホキシ
ド溶液１５μｌを添加し、反応を開始する。反応の進行
は、４１０ｎｍにおける１分間当りの吸光度の変化を算
出し、あらかじめ求めておいたｏ−ニトロフェノールの
吸光係数より、１分間に遊離されたｏ−ニトロフェノー
ル量を求める。本発明の酵素は図４に示すごとく臭化ヘ
キサデシルトリメチルアンモニウムを除いて、いずれの
界面活性剤の存在下、９０℃で１２０分間処理してもほ
ぼ８０％の残存活性率を有している。特にタンパク質変
性用に使われているドデシル硫酸ナトリウム存在下、９
０℃、１２０分間処理してもほぼ９０％の残存活性率を
有している。すなわち、図４は、各種界面活性剤存在下
での酵素の熱安定性を示す図であり、縦軸は、残存活性
率（％）、横軸は、９０℃での酵素の処理時間（分）を
示す。また、図中白四角印は臭化ヘキサデシルトリメチ
ルアンモニウム、黒四角印はドデシル硫酸ナトリウム、
白丸印はポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラ
ウレート、黒丸印はコール酸ナトリウムを示す。
【００２４】（５）基質特異性：本発明の酵素の基質特
異性は、下記表１に示すようなｐ−ニトロフェニル化合
物を用いて、以下の方法で測定できる。すなわち、酵素
を含む１５０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５．０）１４８５μｌを分光々度計用のキュベットに入
れ、表１に示す０．１Ｍの基質溶液１５μｌを加え、混
合し、反応は直ちに４０５ｎｍの吸収の変化を追跡する
ことで測定した。対照として、酵素を含まない１５０ｍ
Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）１４８５
μｌを用いて、上記の測定を行った。反応は、９０℃で
行った。酵素１単位は１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロ
フェノールを遊離させるのに必要な酵素量とした。上記
の方法に従い、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシド（ＧｌｃｐβＮｐ）、ｐ−ニトロフェニル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＧａｌｐβＮｐ）、ｐ−ニ
トロフェニル−β−Ｄ−マンノピラノシド（Ｍａｎｐβ
Ｎｐ）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシ
ド（ＸｙｌｐβＮｐ）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−
フコピラノシド（ＦｕｃｐβＮｐ）、ｐ−ニトロフェニ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＧａｌｐαＮｐ）
（すべてナカライテスク社製）に対する加水分解活性を
測定した。結果を表１に示す。すなわち表１は、上記の
基質に対する比活性（Ｕ／ｍｇ）と相対活性（％）を示
す。
異性は、下記表１に示すようなｐ−ニトロフェニル化合
物を用いて、以下の方法で測定できる。すなわち、酵素
を含む１５０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５．０）１４８５μｌを分光々度計用のキュベットに入
れ、表１に示す０．１Ｍの基質溶液１５μｌを加え、混
合し、反応は直ちに４０５ｎｍの吸収の変化を追跡する
ことで測定した。対照として、酵素を含まない１５０ｍ
Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）１４８５
μｌを用いて、上記の測定を行った。反応は、９０℃で
行った。酵素１単位は１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロ
フェノールを遊離させるのに必要な酵素量とした。上記
の方法に従い、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシド（ＧｌｃｐβＮｐ）、ｐ−ニトロフェニル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＧａｌｐβＮｐ）、ｐ−ニ
トロフェニル−β−Ｄ−マンノピラノシド（Ｍａｎｐβ
Ｎｐ）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシ
ド（ＸｙｌｐβＮｐ）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−
フコピラノシド（ＦｕｃｐβＮｐ）、ｐ−ニトロフェニ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＧａｌｐαＮｐ）
（すべてナカライテスク社製）に対する加水分解活性を
測定した。結果を表１に示す。すなわち表１は、上記の
基質に対する比活性（Ｕ／ｍｇ）と相対活性（％）を示
す。
【００２５】
【表１】 表 １ 基 質 特 異 性 ────────────────────────────────── 基 質 比 活 性 相 対 活 性 （Ｕ／ｍｇ） （％） ────────────────────────────────── ＧａｌｐβＮｐ １９２ １００ ＧｌｕｐβＮｐ ５１２ ２６７ ＭａｎｐβＮｐ １２．８ ６．７ ＸｙｌｐβＮｐ ５１．２ ２６．７ ＦｕｃｐβＮｐ ０ ０ ＧａｌｐαＮｐ ０ ０ ──────────────────────────────────
【００２６】更に下記に示すような天然基質を用いて分
解活性を調べた。すなわち、ラクトース、セロビオー
ス、メチル−β−Ｄ−グルコース、サリシン、アルブチ
ン、スクロース、マルトース（すべてナカライテスク社
製）については、各々の基質を１５０ｍＭ クエン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．０）１ｍｌ中に最終濃度が５
０ｍＭとなるように溶解した。カルボキシメチルセルロ
ース（和光純薬社製）、アビセル（フナコシ薬品社
製）、ラミナリン（ナカライテスク社製）については最
終濃度が１７ｇ／リットル相当になるように溶解した。
上記基質溶液を９０℃に加熱した後、リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に溶解した酵素液１５μｌ（約４５ｍＵ）を
添加して、９０℃で３０分間反応させた。反応は氷冷す
ることにより停止させ、グルコースＢテストワコー（和
光純薬社製）を用いて反応液中の遊離されたグルコース
量を測定した。ラクトース分解活性を１００％とした時
の他の基質の相対活性（％）を表２に示す。
解活性を調べた。すなわち、ラクトース、セロビオー
ス、メチル−β−Ｄ−グルコース、サリシン、アルブチ
ン、スクロース、マルトース（すべてナカライテスク社
製）については、各々の基質を１５０ｍＭ クエン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．０）１ｍｌ中に最終濃度が５
０ｍＭとなるように溶解した。カルボキシメチルセルロ
ース（和光純薬社製）、アビセル（フナコシ薬品社
製）、ラミナリン（ナカライテスク社製）については最
終濃度が１７ｇ／リットル相当になるように溶解した。
上記基質溶液を９０℃に加熱した後、リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に溶解した酵素液１５μｌ（約４５ｍＵ）を
添加して、９０℃で３０分間反応させた。反応は氷冷す
ることにより停止させ、グルコースＢテストワコー（和
光純薬社製）を用いて反応液中の遊離されたグルコース
量を測定した。ラクトース分解活性を１００％とした時
の他の基質の相対活性（％）を表２に示す。
【００２７】
【表２】 表 ２ 基 質 特 異 性 ──────────────────────────────── 基 質 相 対 活 性（％） ──────────────────────────────── ラクトース １００ セロビオース １３６ メチル−β−Ｄ−グルコース １０．２ サリシン ６９．６ アルブチン ６．１ スクロース １．９ マルトース １．９ カルボキシメチルセルロース ０ アビセル ０ ラミナリン １．３ ────────────────────────────────
【００２８】（６）アミノ酸配列の特徴：プラスミドｐ
ＴＧ２ＥＳ−１０５中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が
コードするアミノ酸配列（配列表配列番号１）につい
て、アミノ酸配列ホモロジー検索をＤＮＡＳＩＳ（日立
ソフトウェアエンジニアリング社製）のＮＢＲＦ−ＰＩ
Ｒを用いて行った。当該酵素、及びピロコッカス フリ
オサスが生産する他の超耐熱性β−ガラクトシダーゼ
（配列表配列番号３）のアミノ酸配列を、耐熱性β−ガ
ラクトシダーゼであるスルホロバス ソルファタリカス
に存在する２種のβ−ガラクトシダーゼ（配列表配列番
号４、５）と比較したところ、驚くべきことに、２種の
耐熱性酵素の間で相同性のある配列のいくつかは、超耐
熱性酵素においても保存されていることが初めて明らか
になった。図５及び図６は配列表の配列番号１、３〜５
でそれぞれ表されるアミノ酸配列を比較した図であり、
図中に示す本発明者らがボックス（ Box )配列と命名し
た１０種類の配列 (Box-１〜１０）は、この保存配列を
示している。これに基づいて、例えば配列表の配列番号
６〜８でそれぞれ示される Box７、８、１０のアミノ酸
配列より作製したプライマー若しくはプローブを使用す
ることにより、他の超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝
子をクローニングすることができる。なお、図５及び図
６における４段の塩基配列は、上段から下段に向って順
番に、それぞれ配列表の配列番号３（最上段）、配列番
号１（第２段）、配列番号４（第３段）、配列番号５
（最下段）に相当する。
ＴＧ２ＥＳ−１０５中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が
コードするアミノ酸配列（配列表配列番号１）につい
て、アミノ酸配列ホモロジー検索をＤＮＡＳＩＳ（日立
ソフトウェアエンジニアリング社製）のＮＢＲＦ−ＰＩ
Ｒを用いて行った。当該酵素、及びピロコッカス フリ
オサスが生産する他の超耐熱性β−ガラクトシダーゼ
（配列表配列番号３）のアミノ酸配列を、耐熱性β−ガ
ラクトシダーゼであるスルホロバス ソルファタリカス
に存在する２種のβ−ガラクトシダーゼ（配列表配列番
号４、５）と比較したところ、驚くべきことに、２種の
耐熱性酵素の間で相同性のある配列のいくつかは、超耐
熱性酵素においても保存されていることが初めて明らか
になった。図５及び図６は配列表の配列番号１、３〜５
でそれぞれ表されるアミノ酸配列を比較した図であり、
図中に示す本発明者らがボックス（ Box )配列と命名し
た１０種類の配列 (Box-１〜１０）は、この保存配列を
示している。これに基づいて、例えば配列表の配列番号
６〜８でそれぞれ示される Box７、８、１０のアミノ酸
配列より作製したプライマー若しくはプローブを使用す
ることにより、他の超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝
子をクローニングすることができる。なお、図５及び図
６における４段の塩基配列は、上段から下段に向って順
番に、それぞれ配列表の配列番号３（最上段）、配列番
号１（第２段）、配列番号４（第３段）、配列番号５
（最下段）に相当する。
【００２９】以上、詳細に説明したように、本発明によ
り超耐熱性β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を
提供され、該遺伝子を用いた超耐熱性β−ガラクトシダ
ーゼの工業的製造方法が提供される。該酵素は高度の耐
熱性及びＳＤＳ耐性を有し、高温下での食品加工や糖質
工学処理において特に有用である。更に、本発明により
単離された遺伝子若しくはその一部の遺伝子はスクリー
ニング用のプローブ、プライマーとしても有用である。
得られたこれらの遺伝子をプローブとして厳密な条件下
でハイブリダイゼーションを行えば、本酵素と配列は少
し異なるが同様の酵素活性を持つと期待されるすべての
本酵素類似の遺伝子を得ることが期待できる。ここで言
う厳密な条件下とは、以下の条件下のことを言う。すな
わち、ＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１
×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリ
ウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１
％ラウリル硫酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌのサケ精
子ＤＮＡ、５×デンハルツ（ Denhardt's ) （ウシ血清
アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールをそれ
ぞれ０．１％の濃度で含む）を含む溶液中で６５℃で２
０時間プローブとハイブリダイゼーションを行うことを
言う。
り超耐熱性β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を
提供され、該遺伝子を用いた超耐熱性β−ガラクトシダ
ーゼの工業的製造方法が提供される。該酵素は高度の耐
熱性及びＳＤＳ耐性を有し、高温下での食品加工や糖質
工学処理において特に有用である。更に、本発明により
単離された遺伝子若しくはその一部の遺伝子はスクリー
ニング用のプローブ、プライマーとしても有用である。
得られたこれらの遺伝子をプローブとして厳密な条件下
でハイブリダイゼーションを行えば、本酵素と配列は少
し異なるが同様の酵素活性を持つと期待されるすべての
本酵素類似の遺伝子を得ることが期待できる。ここで言
う厳密な条件下とは、以下の条件下のことを言う。すな
わち、ＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１
×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリ
ウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１
％ラウリル硫酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌのサケ精
子ＤＮＡ、５×デンハルツ（ Denhardt's ) （ウシ血清
アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールをそれ
ぞれ０．１％の濃度で含む）を含む溶液中で６５℃で２
０時間プローブとハイブリダイゼーションを行うことを
言う。
【００３０】また、得られたこれらの遺伝子をプライマ
ーとして用い、遺伝子増幅を行えば、本酵素と配列は少
し異なるが同様の酵素活性を持つと期待されるすべての
本酵素類似の遺伝子を得ることが期待できる。更に、前
述の耐熱性β−ガラクトシダーゼ、及び超耐熱性β−ガ
ラクトシダーゼの間で保存されているアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を有するオリゴマーをプローブとして
用いて、スクリーニングすることも可能である。すなわ
ち上記の組成と同じハイブリダイゼーションの溶液中
で、各オリゴマーがターゲットＤＮＡと相補鎖を形成す
る際のＴｍ値より５℃低い温度でハイブリダイゼーショ
ンを行うことによって、好熱菌、及び超好熱菌より、そ
れぞれ耐熱性、及び超耐熱性の本酵素と同様の酵素活性
を持つと期待されるすべての本酵素類似の遺伝子を得る
ことが期待できる。また上記のオリゴマーをプライマー
として用いて遺伝子増幅によりスクリーニングすること
も可能である。
ーとして用い、遺伝子増幅を行えば、本酵素と配列は少
し異なるが同様の酵素活性を持つと期待されるすべての
本酵素類似の遺伝子を得ることが期待できる。更に、前
述の耐熱性β−ガラクトシダーゼ、及び超耐熱性β−ガ
ラクトシダーゼの間で保存されているアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を有するオリゴマーをプローブとして
用いて、スクリーニングすることも可能である。すなわ
ち上記の組成と同じハイブリダイゼーションの溶液中
で、各オリゴマーがターゲットＤＮＡと相補鎖を形成す
る際のＴｍ値より５℃低い温度でハイブリダイゼーショ
ンを行うことによって、好熱菌、及び超好熱菌より、そ
れぞれ耐熱性、及び超耐熱性の本酵素と同様の酵素活性
を持つと期待されるすべての本酵素類似の遺伝子を得る
ことが期待できる。また上記のオリゴマーをプライマー
として用いて遺伝子増幅によりスクリーニングすること
も可能である。
【００３１】なお、本発明の超耐熱性β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子を発現させることにより得られる超耐熱性β
−ガラクトシダーゼは、ピロコッカス属に属する菌株、
例えばピロコッカス フリオサスＤＳＭ ３６３８やピ
ロコッカス ボウゼイＤＳＭ３７７３を適当な増殖培地
中で培養し、その菌体及び培養液より精製して得ること
もできる。ピロコッカス属の菌体の培養に当っては、通
常、超耐熱菌の培養に用いられる方法が利用でき、培地
に加える栄養源は使用する菌株が利用し得るものであれ
ばよい。炭素源としては、例えばデンプン等が利用で
き、窒素源としては、例えばトリプトン、ペプトン等が
利用でき、他の栄養源としては、例えば、酵母エキス等
が利用できる。培地中には、マグネシウム塩、ナトリウ
ム塩、鉄塩などの金属塩を微量元素として加えてもよ
い。また例えば、培地の調製に人工海水を用いることが
有利である。また培地は固形の硫黄を含んでいない透明
な培地が望ましく、該培地を用いれば、菌体の増殖は光
学密度を測定することにより容易に監視することができ
る。培養に当っては、静置培養又はかくはん培養で行う
ことができるが、例えば特表平４−５０３７５７号公報
に記載のごとく、通気培養を行ってもよいし、例えばア
プライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバ
イオロジー（ Applied and Environmental Microbiolog
y ) 、第５５巻、第２０８６〜２０８８頁（１９９２）
に記載のように、透析培養法を用いてもよい。一般に培
養温度は、９５℃前後が好ましく、通常１６時間程度で
超耐熱性β−ガラクトシダーゼが培養物中に著量蓄積す
る。培養条件は、使用する菌体、培地組成に応じ超耐熱
性β−ガラクトシダーゼの生産量が最大になるように設
定するのは当然である。
ーゼ遺伝子を発現させることにより得られる超耐熱性β
−ガラクトシダーゼは、ピロコッカス属に属する菌株、
例えばピロコッカス フリオサスＤＳＭ ３６３８やピ
ロコッカス ボウゼイＤＳＭ３７７３を適当な増殖培地
中で培養し、その菌体及び培養液より精製して得ること
もできる。ピロコッカス属の菌体の培養に当っては、通
常、超耐熱菌の培養に用いられる方法が利用でき、培地
に加える栄養源は使用する菌株が利用し得るものであれ
ばよい。炭素源としては、例えばデンプン等が利用で
き、窒素源としては、例えばトリプトン、ペプトン等が
利用でき、他の栄養源としては、例えば、酵母エキス等
が利用できる。培地中には、マグネシウム塩、ナトリウ
ム塩、鉄塩などの金属塩を微量元素として加えてもよ
い。また例えば、培地の調製に人工海水を用いることが
有利である。また培地は固形の硫黄を含んでいない透明
な培地が望ましく、該培地を用いれば、菌体の増殖は光
学密度を測定することにより容易に監視することができ
る。培養に当っては、静置培養又はかくはん培養で行う
ことができるが、例えば特表平４−５０３７５７号公報
に記載のごとく、通気培養を行ってもよいし、例えばア
プライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバ
イオロジー（ Applied and Environmental Microbiolog
y ) 、第５５巻、第２０８６〜２０８８頁（１９９２）
に記載のように、透析培養法を用いてもよい。一般に培
養温度は、９５℃前後が好ましく、通常１６時間程度で
超耐熱性β−ガラクトシダーゼが培養物中に著量蓄積す
る。培養条件は、使用する菌体、培地組成に応じ超耐熱
性β−ガラクトシダーゼの生産量が最大になるように設
定するのは当然である。
【００３２】超耐熱性β−ガラクトシダーゼを採取する
に当っては、例えば培養液から遠心分離、ろ過などによ
って菌体を集め、次いで菌体を破砕すればよく、菌体の
破砕方法としては、超音波破砕、ビーズ破砕、溶菌酵素
処理等があり、これらの方法を利用して菌体中より超耐
熱性β−ガラクトシダーゼを抽出することができる。な
お、酵素の抽出は使用する菌体によって最も抽出効果の
高い方法を採用して粗酵素液を調製するばよい。かくし
て得られた粗酵素液から超耐熱性β−ガラクトシダーゼ
を単離するに当っては、通常の酵素の精製に用いられる
方法を使用できる。例えば、硫安塩析処理、イオン交換
クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ
過クロマトグラフィー等の方法を組合せて使用できる。
例えば、ピロコッカス フリオサスＤＳＭ ３６３８の
培養菌体より調製される粗酵素液をＤＥＡＥ−トヨパー
ルＭ６５０イオン交換体（東ソー社製）にかけ、活性画
分を溶出させる。得られた活性画分をＨＩＣ−カートリ
ッジカラム（バイオラッド社製）にかけ、活性画分を溶
出させる。溶出した活性画分をスーパーローズ１２カラ
ム（ファルマシア社製）にかけ、活性画分を溶出させ
る。溶出した活性画分をハイドロキシアパタイトカラム
（バイオラッド社製）にかけ、活性画分を溶出させる。
このような処理によって超耐熱性β−ガラクトシダーゼ
を得ることができる。
に当っては、例えば培養液から遠心分離、ろ過などによ
って菌体を集め、次いで菌体を破砕すればよく、菌体の
破砕方法としては、超音波破砕、ビーズ破砕、溶菌酵素
処理等があり、これらの方法を利用して菌体中より超耐
熱性β−ガラクトシダーゼを抽出することができる。な
お、酵素の抽出は使用する菌体によって最も抽出効果の
高い方法を採用して粗酵素液を調製するばよい。かくし
て得られた粗酵素液から超耐熱性β−ガラクトシダーゼ
を単離するに当っては、通常の酵素の精製に用いられる
方法を使用できる。例えば、硫安塩析処理、イオン交換
クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ
過クロマトグラフィー等の方法を組合せて使用できる。
例えば、ピロコッカス フリオサスＤＳＭ ３６３８の
培養菌体より調製される粗酵素液をＤＥＡＥ−トヨパー
ルＭ６５０イオン交換体（東ソー社製）にかけ、活性画
分を溶出させる。得られた活性画分をＨＩＣ−カートリ
ッジカラム（バイオラッド社製）にかけ、活性画分を溶
出させる。溶出した活性画分をスーパーローズ１２カラ
ム（ファルマシア社製）にかけ、活性画分を溶出させ
る。溶出した活性画分をハイドロキシアパタイトカラム
（バイオラッド社製）にかけ、活性画分を溶出させる。
このような処理によって超耐熱性β−ガラクトシダーゼ
を得ることができる。
【００３３】
【実施例】以下に本発明を実施例をもって示すが、本発
明は、以下の実施例の範囲のみに限定されるものではな
い。
明は、以下の実施例の範囲のみに限定されるものではな
い。
【００３４】実施例１ （１）ピロコッカス フリオサス ゲノム ＤＮＡの調
製 ピロコッカス フリオサスＤＳＭ ３６３８の培養は以
下のとおりに行った。トリプトン１％、酵母エキス０．
５％、可溶性デンプン１％、ジャマリンＳ・ソリッド
（ジャマリンラボラトリー社製）３．５％、ジャマリン
Ｓ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）０．５
％、ＭｇＳＯ4 ０．００３％、ＮａＣｌの０．００１
％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０００１％、ＣｏＳＯ
4 ０．０００１％、ＣａＣｌ2 ・７Ｈ2 Ｏ ０．００
０１％、ＺｎＳＯ4 ０．０００１％、ＣｕＳＯ4 ・５
Ｈ2 Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ4 ）2 ０．１ｐ
ｐｍ、Ｈ3 ＢＯ3 ０．１ｐｐｍ、Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２
Ｈ2 Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ０．２
５ｐｐｍの組成の培地２リットルを２リットル容のメデ
ィウムボトルに入れ、１２０℃、２０分間殺菌した後、
窒素ガスを吹込み溶存酸素を除去した後、これに上記菌
株を接種して９５℃、１６時間静置培養した。培養後、
遠心分離によって菌体を集めた。次に集菌体を２５％ス
クロースを含む０．０５Ｍ トリス（Tris) −ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）４ｍｌに懸濁し、この懸濁液に０．８ｍ
ｌ リゾチーム〔５ｍｇ／ｍｌ、０．２５Ｍ トリス−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕、２ｍｌ ０．２Ｍ ＥＤＴＡ
を加え、２０℃で１時間、保温した後、２４ｍｌのＳＥ
Ｔ溶液〔１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０
ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕を加え、更に５
％ＳＤＳ４ｍｌ、プロティナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）
４００μｌを加え、３７℃、１時間反応させた。反応終
了後フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール
沈殿を行い、約３．２ｍｇのゲノムＤＮＡを調製した。
製 ピロコッカス フリオサスＤＳＭ ３６３８の培養は以
下のとおりに行った。トリプトン１％、酵母エキス０．
５％、可溶性デンプン１％、ジャマリンＳ・ソリッド
（ジャマリンラボラトリー社製）３．５％、ジャマリン
Ｓ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）０．５
％、ＭｇＳＯ4 ０．００３％、ＮａＣｌの０．００１
％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０００１％、ＣｏＳＯ
4 ０．０００１％、ＣａＣｌ2 ・７Ｈ2 Ｏ ０．００
０１％、ＺｎＳＯ4 ０．０００１％、ＣｕＳＯ4 ・５
Ｈ2 Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ4 ）2 ０．１ｐ
ｐｍ、Ｈ3 ＢＯ3 ０．１ｐｐｍ、Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２
Ｈ2 Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ０．２
５ｐｐｍの組成の培地２リットルを２リットル容のメデ
ィウムボトルに入れ、１２０℃、２０分間殺菌した後、
窒素ガスを吹込み溶存酸素を除去した後、これに上記菌
株を接種して９５℃、１６時間静置培養した。培養後、
遠心分離によって菌体を集めた。次に集菌体を２５％ス
クロースを含む０．０５Ｍ トリス（Tris) −ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）４ｍｌに懸濁し、この懸濁液に０．８ｍ
ｌ リゾチーム〔５ｍｇ／ｍｌ、０．２５Ｍ トリス−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕、２ｍｌ ０．２Ｍ ＥＤＴＡ
を加え、２０℃で１時間、保温した後、２４ｍｌのＳＥ
Ｔ溶液〔１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０
ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕を加え、更に５
％ＳＤＳ４ｍｌ、プロティナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）
４００μｌを加え、３７℃、１時間反応させた。反応終
了後フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール
沈殿を行い、約３．２ｍｇのゲノムＤＮＡを調製した。
【００３５】（２）コスミドプロテインライブラリーの
作製 ピロコッカス フリオサスＤＳＭ ３６３８のゲノムＤ
ＮＡ４００μｇをＳａｕ３ＡＩ用緩衝液（５０ｍＭ ト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１
ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ＮａＣｌ）
中、Ｓａｕ３ＡＩで部分分解し、密度勾配超遠心法によ
りサイズ分画した。トリプルヘリックスコスミドベクタ
ー１μｇをＢａｍＨＩで切断し、サイズ分画された３５
〜５０ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片１４０μｇと混合し
て、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用いてライ
ゲーションを行った後、ギガバックIIゴールド（ストラ
タジーン社製）を用いてインビトロパッケージング法に
よってピロコッカスゲノムＤＮＡフラグメントをラムダ
ファージ粒子中にパッケージした。得られたファージ溶
液の一部を用いて大腸菌ＤＨ５αＭＣＲを形質転換し、
コスミドライブラリーを調製した。得られたコロニー数
個よりコスミドＤＮＡを調製し、適当な大きさの挿入断
片があることを確認した。次に新たに、上記ライブラリ
ーより５００個のコロニーを選択し、０．０１％のアン
ピシリンを含むＬ−ブロス培地２ｍｌに懸濁し、３７℃
で１６時間振とう培養した。該培養物を遠心し沈殿物と
して回収した菌体を２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）に懸濁し、１００℃で１０分間熱処理した。続
いて超音波処理を行い更に１００℃、１０分間熱処理
し、遠心後の上清をとり粗酵素液とし、５００個のコス
ミドプロテインライブラリーを調製した。
作製 ピロコッカス フリオサスＤＳＭ ３６３８のゲノムＤ
ＮＡ４００μｇをＳａｕ３ＡＩ用緩衝液（５０ｍＭ ト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１
ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ＮａＣｌ）
中、Ｓａｕ３ＡＩで部分分解し、密度勾配超遠心法によ
りサイズ分画した。トリプルヘリックスコスミドベクタ
ー１μｇをＢａｍＨＩで切断し、サイズ分画された３５
〜５０ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片１４０μｇと混合し
て、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用いてライ
ゲーションを行った後、ギガバックIIゴールド（ストラ
タジーン社製）を用いてインビトロパッケージング法に
よってピロコッカスゲノムＤＮＡフラグメントをラムダ
ファージ粒子中にパッケージした。得られたファージ溶
液の一部を用いて大腸菌ＤＨ５αＭＣＲを形質転換し、
コスミドライブラリーを調製した。得られたコロニー数
個よりコスミドＤＮＡを調製し、適当な大きさの挿入断
片があることを確認した。次に新たに、上記ライブラリ
ーより５００個のコロニーを選択し、０．０１％のアン
ピシリンを含むＬ−ブロス培地２ｍｌに懸濁し、３７℃
で１６時間振とう培養した。該培養物を遠心し沈殿物と
して回収した菌体を２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）に懸濁し、１００℃で１０分間熱処理した。続
いて超音波処理を行い更に１００℃、１０分間熱処理
し、遠心後の上清をとり粗酵素液とし、５００個のコス
ミドプロテインライブラリーを調製した。
【００３６】（３）β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む
コスミドの選択 実施例１−（２）で得られたコスミドプロテインライブ
ラリー５００個の粗酵素液について、β−ガラクトシダ
ーゼ活性を測定した。すなわち粗酵素液１０μｌを１１
２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ 塩化マグ
ネシウム、１％ＳＤＳを含む１００ｍＭ リン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）９９．５μｌに加えた後、０．４Ｍのｏ
−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含む
ジメチルスルホキシド溶液を０．５μｌ加え９５℃、３
０分反応させた。反応は、５０μｌの０．１Ｍ 炭酸ナ
トリウムを加えて停止し、４１０ｎｍにおける吸光度を
測定し、ｏ−ニトロフェノールの生成量を求めた。５０
０個のコスミドプロテインライブラリーより１個のβ−
ガラクトシダーゼ活性を有するコスミドプロテインを特
定し、該当する１個のコスミドＤＮＡを特定した。
コスミドの選択 実施例１−（２）で得られたコスミドプロテインライブ
ラリー５００個の粗酵素液について、β−ガラクトシダ
ーゼ活性を測定した。すなわち粗酵素液１０μｌを１１
２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ 塩化マグ
ネシウム、１％ＳＤＳを含む１００ｍＭ リン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）９９．５μｌに加えた後、０．４Ｍのｏ
−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含む
ジメチルスルホキシド溶液を０．５μｌ加え９５℃、３
０分反応させた。反応は、５０μｌの０．１Ｍ 炭酸ナ
トリウムを加えて停止し、４１０ｎｍにおける吸光度を
測定し、ｏ−ニトロフェノールの生成量を求めた。５０
０個のコスミドプロテインライブラリーより１個のβ−
ガラクトシダーゼ活性を有するコスミドプロテインを特
定し、該当する１個のコスミドＤＮＡを特定した。
【００３７】（４）プラスミドｐＴＧ２Ｓ−１１２の調
製及び耐熱性β−ガラクトシダーゼの製造 実施例１−（３）で得られた１個のコスミドＤＮＡを制
限酵素ＳｍａＩで完全消化した。次いでベクターとして
ｐＵＣ１８をＳｍａＩサイトで切断し、末端の脱リン酸
化を行った。該プラスミドに上記のＳｍａＩ消化ＤＮＡ
断片をライゲーションキットを用いてライゲーション
し、得られた反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転
換した。形質転換体を０．０１％のアンピシリンを含む
Ｌ−ブロス培地５ｍｌに懸濁し、３７℃で１６時間振と
う培養を行った。該培養物を遠心し回収した菌体を、１
ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に懸濁し、１００℃で１０分間熱処理した。続
いて超音波処理を行い更に１００℃、１０分間熱処理を
行い、遠心後の上清をとり粗酵素液とした。この粗酵素
液５μｌを用いた以外は実施例１−（３）の活性測定法
に準じβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。粗酵素液
中に１００℃、２０分間の熱処理に耐性の超耐熱性β−
ガラクトシダーゼ活性を認めた。この粗酵素液に相当す
るプラスミドをプラスミドｐＴＧ２Ｓ−１１２と命名し
た。またプラスミドｐＴＧ２Ｓ−１１２を大腸菌ＪＭ１
０９に導入し、形質転換体を得た。該形質転換体を Esc
herichia coli JM109/pTG2S-112 と命名した。
製及び耐熱性β−ガラクトシダーゼの製造 実施例１−（３）で得られた１個のコスミドＤＮＡを制
限酵素ＳｍａＩで完全消化した。次いでベクターとして
ｐＵＣ１８をＳｍａＩサイトで切断し、末端の脱リン酸
化を行った。該プラスミドに上記のＳｍａＩ消化ＤＮＡ
断片をライゲーションキットを用いてライゲーション
し、得られた反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転
換した。形質転換体を０．０１％のアンピシリンを含む
Ｌ−ブロス培地５ｍｌに懸濁し、３７℃で１６時間振と
う培養を行った。該培養物を遠心し回収した菌体を、１
ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に懸濁し、１００℃で１０分間熱処理した。続
いて超音波処理を行い更に１００℃、１０分間熱処理を
行い、遠心後の上清をとり粗酵素液とした。この粗酵素
液５μｌを用いた以外は実施例１−（３）の活性測定法
に準じβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。粗酵素液
中に１００℃、２０分間の熱処理に耐性の超耐熱性β−
ガラクトシダーゼ活性を認めた。この粗酵素液に相当す
るプラスミドをプラスミドｐＴＧ２Ｓ−１１２と命名し
た。またプラスミドｐＴＧ２Ｓ−１１２を大腸菌ＪＭ１
０９に導入し、形質転換体を得た。該形質転換体を Esc
herichia coli JM109/pTG2S-112 と命名した。
【００３８】（５）プラスミドｐＴＧＥＳ−１０５の調
製 実施例１−（４）で得られた約４ｋｂｐ ＳｍａＩＤＮ
Ａ断片を含むプラスミドｐＴＧ２Ｓ−１１２を制限酵素
Ｅｃｏ８１Ｉ及びＫｐｎＩで完全消化後、約４．７ｋｂ
ｐのＥｃｏ８１Ｉ−ＫｐｎＩＤＮＡ断片を精製し、平滑
末端化後、セルフライゲーションを行った。得られたプ
ラスミドをプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５と命名し、
該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、形質転換体
を得た。この形質転換体は Escherichia coli JM109/pT
G2ES-105と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技
術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４２８０として寄託されて
いる。図１にプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５の制限酵
素地図を示す。また図２にプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１
０５に挿入されたピロコッカス フリオサス由来の、本
発明により得られた約２．０ｋｂｐの超耐熱性β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す。
製 実施例１−（４）で得られた約４ｋｂｐ ＳｍａＩＤＮ
Ａ断片を含むプラスミドｐＴＧ２Ｓ−１１２を制限酵素
Ｅｃｏ８１Ｉ及びＫｐｎＩで完全消化後、約４．７ｋｂ
ｐのＥｃｏ８１Ｉ−ＫｐｎＩＤＮＡ断片を精製し、平滑
末端化後、セルフライゲーションを行った。得られたプ
ラスミドをプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５と命名し、
該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、形質転換体
を得た。この形質転換体は Escherichia coli JM109/pT
G2ES-105と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技
術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４２８０として寄託されて
いる。図１にプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５の制限酵
素地図を示す。また図２にプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１
０５に挿入されたピロコッカス フリオサス由来の、本
発明により得られた約２．０ｋｂｐの超耐熱性β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す。
【００３９】実施例２ （超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列の決
定）上記プラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５に挿入された
超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む約２．０ｋ
ｂｐから、キロ−シークェンス用デレーションキット
（宝酒造社製）を用いてデレーションミュータントを作
製し、各断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定は
ブカベスト（ Bca Bast ) ジデオキシシークエンシング
キッド（宝酒造社製）を用いたジデオキシ法により行っ
た。配列表の配列番号２にプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１
０５に挿入された超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子
を含むＤＮＡ断片の塩基配列を示す。配列表の配列番号
１に該塩基配列がコードする超耐熱性β−ガラクトシダ
ーゼのアミノ酸配列を示す。
定）上記プラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５に挿入された
超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む約２．０ｋ
ｂｐから、キロ−シークェンス用デレーションキット
（宝酒造社製）を用いてデレーションミュータントを作
製し、各断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定は
ブカベスト（ Bca Bast ) ジデオキシシークエンシング
キッド（宝酒造社製）を用いたジデオキシ法により行っ
た。配列表の配列番号２にプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１
０５に挿入された超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子
を含むＤＮＡ断片の塩基配列を示す。配列表の配列番号
１に該塩基配列がコードする超耐熱性β−ガラクトシダ
ーゼのアミノ酸配列を示す。
【００４０】実施例３ （１）超耐熱性β−ガラクトシダーゼの製造 実施例１で得られた本発明の超耐熱性β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５
を導入した大腸菌 Escherichia coli JM109/pTG2ES-105
と（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２８０）を０．０１％のアンピ
シリンを含むＬ−ブロス培地５ｍｌに懸濁し、３７℃で
１６時間振とう培養を行った。更に該培養物を同条件の
培地１．２リットルに懸濁し、３７℃で１６時間振とう
培養を行った。該培養物を遠心し回収した菌体を１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に懸濁し、１００℃で１０分間熱処理した。続いて
超音波処理を行い更に１００℃、１０分間熱処理を行い
遠心後の上清をとり粗酵素液を得た。粗酵素液中のβ−
ガラクトシダーゼの比活性はｐＨ５．０、９０℃におい
て約７４０Ｕ／ｍｇであった。
ーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５
を導入した大腸菌 Escherichia coli JM109/pTG2ES-105
と（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２８０）を０．０１％のアンピ
シリンを含むＬ−ブロス培地５ｍｌに懸濁し、３７℃で
１６時間振とう培養を行った。更に該培養物を同条件の
培地１．２リットルに懸濁し、３７℃で１６時間振とう
培養を行った。該培養物を遠心し回収した菌体を１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に懸濁し、１００℃で１０分間熱処理した。続いて
超音波処理を行い更に１００℃、１０分間熱処理を行い
遠心後の上清をとり粗酵素液を得た。粗酵素液中のβ−
ガラクトシダーゼの比活性はｐＨ５．０、９０℃におい
て約７４０Ｕ／ｍｇであった。
【００４１】
【発明の効果】本発明の超耐熱性β−ガラクトシダーゼ
遺伝子を用いることにより、ＳＤＳ耐性で超耐熱性のβ
−ガラクトシダーゼを工業的に有利に生産することが可
能となる。また、本発明の超耐熱性β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子若しくはその一部をプローブ、プライマーとし
て用いることにより、種々の生物由来の超耐熱性β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子を得ることができる。
遺伝子を用いることにより、ＳＤＳ耐性で超耐熱性のβ
−ガラクトシダーゼを工業的に有利に生産することが可
能となる。また、本発明の超耐熱性β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子若しくはその一部をプローブ、プライマーとし
て用いることにより、種々の生物由来の超耐熱性β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子を得ることができる。
【００４２】
【００４３】配列番号：1 配列の長さ：491 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Lys Phe Pro Lys Asn Phe Met Phe Gly Tyr Ser Trp Ser Gly 1 5 10 15 Phe Gln Phe Glu Met Gly Leu Pro Gly Ser Glu Val Glu Ser Asp 20 25 30 Trp Trp Val Trp Val His Asp Lys Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu 35 40 45 Val Ser Gly Asp Leu Pro Glu Asn Gly Pro Ala Tyr Trp His Leu 50 55 60 Tyr Lys Gln Asp His Asp Ile Ala Glu Lys Leu Gly Met Asp Cys 65 70 75 Ile Arg Gly Gly Ile Glu Trp Ala Arg Ile Phe Pro Lys Pro Thr 80 85 90 Phe Asp Val Lys Val Asp Val Glu Lys Asp Glu Glu Gly Asn Ile 95 100 105 Ile Ser Val Asp Val Pro Glu Ser Thr Ile Lys Glu Leu Glu Lys 110 115 120 Ile Ala Asn Met Glu Ala Leu Glu His Tyr Arg Lys Ile Tyr Ser 125 130 135 Asp Trp Lys Glu Arg Gly Lys Thr Phe Ile Leu Asn Leu Tyr His 140 145 150 Trp Pro Leu Pro Leu Trp Ile His Asp Pro Ile Ala Val Arg Lys 155 160 165 Leu Gly Pro Asp Arg Ala Pro Ala Gly Trp Leu Asp Glu Lys Thr 170 175 180 Val Val Glu Phe Val Lys Phe Ala Ala Phe Val Ala Tyr His Leu 185 190 195 Asp Asp Leu Val Asp Met Trp Ser Thr Met Asn Glu Pro Asn Val 200 205 210 Val Tyr Asn Gln Gly Tyr Ile Asn Leu Arg Ser Gly Phe Pro Pro 215 220 225 Gly Tyr Leu Ser Phe Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Phe Asn Leu 230 235 240 Ile Gln Ala His Ile Gly Ala Tyr Asp Ala Ile Lys Glu Tyr Ser 245 250 255 Glu Lys Ser Val Gly Val Ile Tyr Ala Phe Ala Trp His Asp Pro 260 265 270 Leu Ala Glu Glu Tyr Lys Asp Glu Val Glu Glu Ile Arg Lys Lys 275 280 285 Asp Tyr Glu Phe Val Thr Ile Leu His Ser Lys Gly Lys Leu Asp 290 295 300 Trp Ile Gly Val Asn Tyr Tyr Ser Arg Leu Val Tyr Gly Ala Lys 305 310 315 Asp Gly His Leu Val Pro Leu Pro Gly Tyr Gly Phe Met Ser Glu 320 325 330 Arg Gly Gly Phe Ala Lys Ser Gly Arg Pro Ala Ser Asp Phe Gly 335 340 345 Trp Glu Met Tyr Pro Glu Gly Leu Glu Asn Leu Leu Lys Tyr Leu 350 355 360 Asn Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Met Ile Ile Thr Glu Asn Gly Met 365 370 375 Ala Asp Ala Ala Asp Arg Tyr Arg Pro His Tyr Leu Val Ser His 380 385 390 Leu Lys Ala Val Tyr Asn Ala Met Lys Glu Gly Ala Asp Val Arg 395 400 405 Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Thr Asp Asn Tyr Glu Trp Ala Gln 410 415 420 Gly Phe Arg Met Arg Phe Gly Leu Val Tyr Val Asp Phe Glu Thr 425 430 435 Lys Lys Arg Tyr Leu Arg Pro Ser Ala Leu Val Phe Arg Glu Ile 440 445 450 Ala Thr Gln Lys Glu Ile Pro Glu Glu Leu Ala His Leu Ala Asp 455 460 465 Leu Lys Phe Val Thr Lys Lys Val Ala Ile Ser Phe Phe Leu Cys 470 475 480 Phe Leu Thr His Ile Phe Gly Lys Ile Arg Ser 485 490
【００４４】配列番号：2 配列の長さ：1476 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： ATGAAGTTCC CAAAAAACTT CATGTTTGGA TATTCTTGGT CTGGTTTCCA GTTTGAGATG 60 GGACTGCCAG GAAGTGAAGT GGAAAGCGAC TGGTGGGTGT GGGTTCACGA CAAGGAGAAC 120 ATAGCATCAG GTCTAGTAAG TGGAGATCTA CCAGAGAACG GCCCAGCATA TTGGCACCTC 180 TATAAGCAAG ATCATGACAT TGCAGAAAAG CTAGGAATGG ATTGTATTAG AGGTGGCATT 240 GAGTGGGCAA GAATTTTTCC AAAGCCAACA TTTGACGTTA AAGTTGATGT GGAAAAGGAT 300 GAAGAAGGCA ACATAATTTC CGTAGACGTT CCAGAGAGTA CAATAAAAGA GCTAGAGAAA 360 ATTGCCAACA TGGAGGCCCT TGAACATTAT CGCAAGATTT ACTCAGACTG GAAGGAGAGG 420 GGCAAAACCT TCATATTAAA CCTCTACCAC TGGCCTCTTC CATTATGGAT TCATGACCCA 480 ATTGCAGTAA GGAAACTTGG CCCGGATAGG GCTCCTGCAG GATGGTTAGA TGAGAAGACA 540 GTGGTAGAGT TTGTGAAGTT TGCCGCCTTC GTTGCTTATC ACCTTGATGA CCTCGTTGAC 600 ATGTGGAGCA CAATGAACGA ACCAAACGTA GTCTACAATC AAGGTTACAT TAATCTACGT 660 TCAGGATTTC CACCAGGATA TCTAAGCTTT GAAGCAGCAG AAAAGGCAAA ATTCAACTTA 720 ATTCAGGCTC ACATCGGAGC ATATGATGCC ATAAAAGAGT ATTCAGAAAA ATCCGTGGGA 780 GTGATATACG CCTTTGCTTG GCACGATCCT CTAGCGGAGG AGTATAAGGA TGAAGTAGAG 840 GAAATCAGAA AGAAAGACTA TGAGTTTGTA ACAATTCTAC ACTCAAAAGG AAAGCTAGAC 900 TGGATCGGCG TAAACTACTA CTCCAGGCTG GTATATGGAG CCAAAGATGG ACACCTAGTT 960 CCTTTACCTG GATATGGATT TATGAGTGAG AGAGGAGGAT TTGCAAAGTC AGGAAGACCT 1020 GCTAGTGACT TTGGATGGGA AATGTACCCA GAGGGCCTTG AGAACCTTCT TAAGTATTTA 1080 AACAATGCCT ACGAGCTACC AATGATAATT ACAGAGAACG GTATGGCCGA TGCAGCAGAT 1140 AGATACAGGC CACACTATCT CGTAAGCCAT CTAAAGGCAG TTTACAATGC TATGAAAGAA 1200 GGTGCTGATG TTAGAGGGTA TCTCCACTGG TCTCTAACAG ACAACTACGA ATGGGCCCAA 1260 GGGTTCAGGA TGAGATTTGG ATTGGTTTAC GTGGATTTCG AGACAAAGAA GAGATATTTA 1320 AGGCCAAGCG CCCTGGTATT CAGAGAAATA GCCACTCAAA AAGAAATTCC AGAAGAATTA 1380 GCTCACCTCG CAGACCTCAA ATTTGTTACC AAGAAAGTAG CCATTTCATT TTTTCTTTGT 1440 TTTTTAACTC ATATTTTTGG GAAAATAAGA TCATAA 1476
【００４５】配列番号：3 配列の長さ：510 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Phe Pro Glu Lys Phe Leu Trp Gly Val Ala Gln Ser Gly Phe 1 5 10 15 Gln Phe Glu Met Gly Asp Lys Leu Arg Arg Asn Ile Asp Thr Asn 20 25 30 Thr Asp Trp Trp His Trp Val Arg Asp Lys Thr Asn Ile Glu Lys 35 40 45 Gly Leu Val Ser Gly Asp Leu Pro Glu Glu Gly Ile Asn Asn Tyr 50 55 60 Glu Leu Tyr Glu Lys Asp His Glu Ile Ala Arg Lys Leu Gly Leu 65 70 75 Asn Ala Tyr Arg Ile Gly Ile Glu Trp Ser Arg Ile Phe Pro Trp 80 85 90 Pro Thr Thr Phe Ile Asp Val Asp Tyr Ser Tyr Asn Glu Ser Tyr 95 100 105 Asn Leu Ile Glu Asp Val Lys Ile Thr Lys Asp Thr Leu Glu Glu 110 115 120 Leu Asp Glu Ile Ala Asn Lys Arg Glu Val Ala Tyr Tyr Arg Ser 125 130 135 Val Ile Asn Ser Leu Arg Ser Lys Gly Phe Lys Val Ile Val Asn 140 145 150 Leu Asn His Phe Thr Leu Pro Tyr Trp Leu His Asp Pro Ile Glu 155 160 165 Ala Arg Glu Arg Ala Leu Thr Asn Lys Arg Asn Gly Trp Val Asn 170 175 180 Pro Arg Thr Val Ile Glu Phe Ala Lys Tyr Ala Ala Tyr Ile Ala 185 190 195 Tyr Lys Phe Gly Asp Ile Val Asp Met Trp Ser Thr Phe Asn Glu 200 205 210 Pro Met Val Val Val Glu Leu Gly Tyr Leu Ala Pro Tyr Ser Gly 215 220 225 Phe Pro Pro Gly Val Leu Asn Pro Glu Ala Ala Lys Leu Ala Ile 230 235 240 Leu His Met Ile Asn Ala His Ala Leu Ala Tyr Arg Gln Ile Lys 245 250 255 Lys Phe Asp Thr Glu Lys Ala Asp Lys Asp Ser Lys Glu Pro Ala 260 265 270 Glu Val Gly Ile Ile Tyr Asn Asn Ile Gly Val Ala Tyr Pro Lys 275 280 285 Asp Pro Asn Asp Ser Lys Asp Val Lys Ala Ala Glu Asn Asp Asn 290 295 300 Phe Phe His Ser Gly Leu Phe Phe Glu Ala Ile His Lys Gly Lys 305 310 315 Leu Asn Ile Glu Phe Asp Gly Glu Thr Phe Ile Asp Ala Pro Tyr 320 325 330 Leu Lys Gly Asn Asp Trp Ile Gly Val Asn Tyr Tyr Thr Arg Glu 335 340 345 Val Val Thr Tyr Gln Glu Pro Met Phe Pro Ser Ile Pro Leu Ile 350 355 360 Thr Phe Lys Gly Val Gln Gly Tyr Gly Tyr Ala Cys Arg Pro Gly 365 370 375 Thr Leu Ser Lys Asp Asp Arg Pro Val Ser Asp Ile Gly Trp Glu 380 385 390 Leu Tyr Pro Glu Gly Met Tyr Asp Ser Ile Val Glu Ala His Lys 395 400 405 Tyr Gly Val Pro Val Tyr Val Thr Glu Asn Gly Ile Ala Asp Ser 410 415 420 Lys Asp Ile Leu Arg Pro Tyr Tyr Ile Ala Ser His Ile Lys Met 425 430 435 Ile Glu Lys Ala Phe Glu Asp Gly Tyr Glu Val Lys Gly Tyr Phe 440 445 450 His Trp Ala Leu Thr Asp Asn Phe Glu Trp Ala Leu Gly Phe Arg 455 460 465 Met Arg Phe Gly Leu Tyr Glu Val Asn Leu Ile Thr Lys Glu Arg 470 475 480 Ile Pro Arg Glu Lys Ser Val Ser Ile Phe Arg Glu Ile Val Ala 485 490 495 Asn Asn Gly Val Thr Lys Lys Ile Glu Glu Glu Leu Leu Arg Gly 500 505 510
【００４６】配列番号：4 配列の長さ：491 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Leu Ser Phe Pro Lys Gly Phe Lys Phe Gly Trp Ser Gln Ser 1 5 10 15 Gly Phe Gln Ser Glu Met Gly Thr Pro Gly Ser Glu Asp Pro Asn 20 25 30 Ser Asp Trp His Val Trp Val His Asp Arg Glu Asn Ile Val Ser 35 40 45 Gln Val Val Ser Gly Asp Leu Pro Glu Asn Gly Pro Gly Tyr Trp 50 55 60 Gly Asn Tyr Lys Arg Phe His Asp Glu Ala Glu Lys Ile Gly Leu 65 70 75 Asn Ala Val Arg Ile Asn Val Glu Trp Ser Arg Ile Phe Pro Arg 80 85 90 Pro Leu Pro Lys Pro Glu Met Gln Thr Gly Thr Asp Lys Glu Asn 95 100 105 Ser Pro Val Ile Ser Val Asp Leu Asn Glu Ser Lys Leu Arg Glu 110 115 120 Met Asp Asn Tyr Ala Asn His Glu Ala Leu Ser His Tyr Arg His 125 130 135 Ile Leu Glu Asp Leu Arg Asn Arg Gly Phe His Ile Val Leu Asn 140 145 150 Met Tyr His Trp Thr Leu Pro Ile Trp Leu His Asp Pro Ile Arg 155 160 165 Val Arg Arg Gly Asp Phe Thr Gly Pro Thr Gly Trp Leu Asn Ser 170 175 180 Arg Thr Val Tyr Glu Phe Ala Arg Phe Ser Ala Tyr Val Ala Trp 185 190 195 Lys Leu Asp Asp Leu Ala Ser Glu Tyr Ala Thr Met Asn Glu Pro 200 205 210 Asn Val Val Trp Gly Ala Gly Tyr Ala Phe Pro Arg Ala Gly Phe 215 220 225 Pro Pro Asn Tyr Leu Ser Phe Arg Leu Ser Glu Ile Ala Lys Trp 230 235 240 Asn Ile Ile Gln Ala His Ala Arg Ala Tyr Asp Ala Ile Lys Ser 245 250 255 Val Ser Lys Lys Ser Val Gly Ile Ile Tyr Ala Asn Thr Ser Tyr 260 265 270 Tyr Pro Leu Arg Pro Gln Asp Asn Glu Ala Val Glu Ile Ala Glu 275 280 285 Arg Leu Asn Arg Trp Ser Phe Phe Asp Ser Ile Ile Lys Gly Glu 290 295 300 Ile Thr Ser Glu Gly Gln Asn Val Arg Glu Asp Leu Arg Asn Arg 305 310 315 Leu Asp Trp Ile Gly Val Asn Tyr Tyr Thr Arg Thr Val Val Thr 320 325 330 Lys Ala Glu Ser Gly Tyr Leu Thr Leu Pro Gly Tyr Gly Asp Arg 335 340 345 Cys Glu Arg Asn Ser Leu Ser Leu Ala Asn Leu Pro Thr Ser Asp 350 355 360 Phe Gly Trp Glu Phe Phe Pro Glu Gly Leu Tyr Asp Val Leu Leu 365 370 375 Lys Tyr Trp Asn Arg Tyr Gly Leu Pro Leu Tyr Val Met Glu Asn 380 385 390 Gly Ile Ala Asp Asp Ala Asp Tyr Gln Arg Pro Tyr Tyr Leu Val 395 400 405 Ser His Ile Tyr Gln Val His Arg Ala Leu Asn Glu Gly Val Asp 410 415 420 Val Arg Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Ala Asp Asn Tyr Glu Trp 425 430 435 Ser Ser Gly Phe Ser Met Arg Phe Gly Leu Leu Lys Val Asp Tyr 440 445 450 Leu Thr Lys Arg Leu Tyr Trp Arg Pro Ser Ala Leu Val Tyr Arg 455 460 465 Glu Ile Thr Arg Ser Asn Gly Ile Pro Glu Glu Leu Glu His Leu 470 475 480 Asn Arg Val Pro Pro Ile Lys Pro Leu Arg His 485 490
【００４７】配列番号：5 配列の長さ：489 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Tyr Ser Phe Pro Asn Ser Phe Arg Phe Gly Trp Ser Gln Ala 1 5 10 15 Gly Phe Gln Ser Glu Met Gly Thr Pro Gly Ser Glu Asp Pro Asn 20 25 30 Thr Asp Trp Tyr Lys Trp Val His Asp Pro Glu Asn Met Ala Ala 35 40 45 Gly Leu Val Ser Gly Asp Leu Pro Glu Asn Gly Pro Gly Tyr Trp 50 55 60 Gly Asn Tyr Lys Thr Phe His Asp Asn Ala Gln Lys Met Gly Leu 65 70 75 Lys Ile Ala Arg Leu Asn Val Glu Trp Ser Arg Ile Phe Pro Asn 80 85 90 Pro Leu Pro Arg Pro Gln Asn Phe Asp Glu Ser Lys Gln Asp Val 95 100 105 Thr Glu Val Glu Ile Asn Glu Asn Glu Leu Lys Arg Leu Asp Glu 110 115 120 Tyr Ala Asn Lys Asp Ala Leu Asn His Tyr Arg Glu Ile Phe Lys 125 130 135 Asp Leu Lys Ser Arg Gly Leu Tyr Phe Ile Leu Asn Met Tyr His 140 145 150 Trp Pro Leu Pro Leu Trp Leu His Asp Pro Ile Arg Val Arg Arg 155 160 165 Gly Asp Phe Thr Gly Pro Ser Gly Trp Leu Ser Thr Arg Thr Val 170 175 180 Tyr Glu Phe Ala Arg Phe Ser Ala Tyr Ile Ala Trp Lys Phe Asp 185 190 195 Asp Leu Val Asp Glu Tyr Ser Thr Met Asn Glu Pro Asn Val Val 200 205 210 Gly Gly Leu Gly Tyr Val Gly Val Lys Ser Gly Phe Pro Pro Gly 215 220 225 Tyr Leu Ser Phe Glu Leu Ser Arg Arg His Met Tyr Asn Ile Ile 230 235 240 Gln Ala His Ala Arg Ala Tyr Asp Gly Ile Lys Ser Val Ser Lys 245 250 255 Lys Pro Val Gly Ile Ile Tyr Ala Asn Ser Ser Phe Gln Pro Leu 260 265 270 Thr Asp Lys Asp Met Glu Ala Val Glu Met Ala Glu Asn Asp Asn 275 280 285 Arg Trp Trp Phe Phe Asp Ala Ile Ile Arg Gly Glu Ile Thr Arg 290 295 300 Gly Asn Glu Lys Ile Val Arg Asp Asp Leu Lys Gly Arg Leu Asp 305 310 315 Trp Ile Gly Val Asn Tyr Tyr Thr Arg Thr Val Val Lys Arg Thr 320 325 330 Glu Lys Gly Tyr Val Ser Leu Gly Gly Tyr Gly His Gly Cys Glu 335 340 345 Arg Asn Ser Val Ser Leu Ala Gly Leu Pro Thr Ser Asp Phe Gly 350 355 360 Trp Glu Phe Phe Pro Glu Gly Leu Tyr Asp Val Leu Thr Lys Tyr 365 370 375 Trp Asn Arg Tyr His Leu Tyr Met Tyr Val Thr Glu Asn Gly Ile 380 385 390 Ala Asp Asp Ala Asp Tyr Gln Arg Pro Tyr Tyr Leu Val Ser His 395 400 405 Val Tyr Gln Val His Arg Ala Ile Asn Ser Gly Ala Asp Val Arg 410 415 420 Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Ala Asp Asn Tyr Glu Trp Ala Ser 425 430 435 Gly Phe Ser Met Arg Phe Gly Leu Leu Lys Val Asp Tyr Asn Thr 440 445 450 Lys Arg Leu Tyr Trp Arg Pro Ser Ala Leu Val Tyr Arg Glu Ile 455 460 465 Ala Thr Asn Gly Ala Ile Thr Asp Glu Ile Glu His Leu Asn Ser 470 475 480 Val Pro Pro Val Lys Pro Leu Arg His 485
【００４８】配列番号：6 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Asp Trp Ile Gly Val Asn Tyr Tyr Ser Arg Leu Val 1 5 10
【００４９】配列番号：7 配列の長さ：13 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Pro Ala Ser Asp Phe Gly Trp Glu Met Tyr Pro Glu Gly 1 5 10
【００５０】配列番号：8 配列の長さ：23 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Thr Asp Asn Tyr Glu Trp Ala Gln 1 5 10 15 Gly Phe Arg Met Arg Phe Gly Leu 20
【図１】プラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５の制限酵素地
図を示す図である。
図を示す図である。
【図２】本発明の超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子
の１例の制限酵素地図を示す図である。
の１例の制限酵素地図を示す図である。
【図３】酵素の熱安定性を示す図である。
【図４】界面活性剤存在下での酵素の熱安定性を示す図
である。
である。
【図５】β−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列の比較を
示す図の一部（前半）である。
示す図の一部（前半）である。
【図６】β−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列の比較を
示す図の一部（後半）である。
示す図の一部（後半）である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年３月１４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入
し、得られたコロニーの超耐熱性β−ガラクトシダーゼ
活性を測定し、活性を示したコロニーよりプラスミドを
調製する。該後者のプラスミドはプラスミドｐＴＧ２Ｅ
Ｓ−１０５と命名され、該プラスミドで形質転換された
大腸菌ＪＭ１０９はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９／ｐＴＧ２ＥＳ−１０５と命名、表示され、
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５０２３として寄託されている。図１にプラ
スミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５の制限酵素地図を示す。図
中、太実線がプラスミドｐＵＣ１８への挿入断片であ
る。
し、得られたコロニーの超耐熱性β−ガラクトシダーゼ
活性を測定し、活性を示したコロニーよりプラスミドを
調製する。該後者のプラスミドはプラスミドｐＴＧ２Ｅ
Ｓ−１０５と命名され、該プラスミドで形質転換された
大腸菌ＪＭ１０９はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９／ｐＴＧ２ＥＳ−１０５と命名、表示され、
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５０２３として寄託されている。図１にプラ
スミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５の制限酵素地図を示す。図
中、太実線がプラスミドｐＵＣ１８への挿入断片であ
る。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３８】（５）プラスミドｐＴＧＥＳ−１０５の調
製 実施例１−（４）で得られた約４ｋｂｐ ＳｍａＩＤＮ
Ａ断片を含むプラスミドｐＴＧ２Ｓ−１１２を制限酵素
Ｅｃｏ８１Ｉ及びＫｐｎＩで完全消化後、約４．７ｋｂ
ｐのＥｃｏ８１Ｉ−ＫｐｎＩＤＮＡ断片を精製し、平滑
末端化後、セルフライゲーションを行った。得られたプ
ラスミドをプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５と命名し、
該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、形質転換体
を得た。この形質転換体はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＧ２ＥＳ−１０５と命名、表
示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
にＦＥＲＭ ＢＰ−５０２３として寄託されている。図
１にプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５の制限酵素地図を
示す。また図２にプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５に挿
入されたピロコッカス フリオサス由来の、本発明によ
り得られた約２．０ｋｂｐの超耐熱性β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す。
製 実施例１−（４）で得られた約４ｋｂｐ ＳｍａＩＤＮ
Ａ断片を含むプラスミドｐＴＧ２Ｓ−１１２を制限酵素
Ｅｃｏ８１Ｉ及びＫｐｎＩで完全消化後、約４．７ｋｂ
ｐのＥｃｏ８１Ｉ−ＫｐｎＩＤＮＡ断片を精製し、平滑
末端化後、セルフライゲーションを行った。得られたプ
ラスミドをプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５と命名し、
該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、形質転換体
を得た。この形質転換体はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＧ２ＥＳ−１０５と命名、表
示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
にＦＥＲＭ ＢＰ−５０２３として寄託されている。図
１にプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５の制限酵素地図を
示す。また図２にプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５に挿
入されたピロコッカス フリオサス由来の、本発明によ
り得られた約２．０ｋｂｐの超耐熱性β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】実施例３ （１）超耐熱性β−ガラクトシダーゼの製造 実施例１で得られた本発明の超耐熱性β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５
を導入した大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９／ｐＴＧ２ＥＳ−１０５と（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５０２３）を０．０１％のアンピシリンを含むＬ−ブ
ロス培地５ｍｌに懸濁し、３７℃で１６時間振とう培養
を行った。更に該培養物を同条件の培地１．２リットル
に懸濁し、３７℃で１６時間振とう培養を行った。該培
養物を遠心し回収した菌体を１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５
０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、１００
℃で１０分間熱処理した。続いて超音波処理を行い更に
１００℃、１０分間熱処理を行い遠心後の上清をとり粗
酵素液を得た。粗酵素液中のβ−ガラクトシダーゼの比
活性はｐＨ５．０、９０℃において約７４０Ｕ／ｍｇで
あった。
ーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＴＧ２ＥＳ−１０５
を導入した大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９／ｐＴＧ２ＥＳ−１０５と（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５０２３）を０．０１％のアンピシリンを含むＬ−ブ
ロス培地５ｍｌに懸濁し、３７℃で１６時間振とう培養
を行った。更に該培養物を同条件の培地１．２リットル
に懸濁し、３７℃で１６時間振とう培養を行った。該培
養物を遠心し回収した菌体を１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５
０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、１００
℃で１０分間熱処理した。続いて超音波処理を行い更に
１００℃、１０分間熱処理を行い遠心後の上清をとり粗
酵素液を得た。粗酵素液中のβ−ガラクトシダーゼの比
活性はｐＨ５．０、９０℃において約７４０Ｕ／ｍｇで
あった。
【書類名】 受託番号変更届
【提出日】 平成７年３月１４日
【旧寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技
術研究所
術研究所
【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１４２８０
【新寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所
工学工業技術研究所
【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−５０２３
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:00） (Ｃ１２Ｎ 9/38 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:00） (72)発明者 橋野 仁一 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 浅田 起代蔵 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 単離されたＳＤＳ耐性を有するピロコッ
カス フリオサス由来の超耐熱性β−ガラクトシダーゼ
遺伝子。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
配列、又はその一部であって、かつ、超耐熱性β−ガラ
クトシダーゼ酵素活性を有する部分をコードする請求項
１に記載の超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子。 - 【請求項３】 配列表の配列番号２で表される塩基配列
を有することを特徴とする請求項１に記載の超耐熱性β
−ガラクトシダーゼ遺伝子。 - 【請求項４】 請求項２に記載の遺伝子にハイブリダイ
ズ可能なＳＤＳ耐性を有する超耐熱性β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子。 - 【請求項５】 請求項２〜４のいずれかに記載の遺伝子
又はその一部を、プローブ又はプライマーとして用いる
ことを特徴とする超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子
のクローニング方法。 - 【請求項６】 請求項１に記載の超耐熱性β−ガラクト
シダーゼ遺伝子を含有させた組換えプラスミドを導入さ
せた形質転換体を培養し、該培養物から超耐熱性β−ガ
ラクトシダーゼを採取することを特徴とする超耐熱性β
−ガラクトシダーゼの製造方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15435694A JP3212798B2 (ja) | 1994-06-14 | 1994-06-14 | 超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子 |
| DE1995602343 DE69502343T2 (de) | 1994-06-14 | 1995-06-02 | Für ein hyperthermostabiles Beta-galaktosidase kodierendes Gen |
| EP19950303772 EP0687732B1 (en) | 1994-06-14 | 1995-06-02 | Hyperthermostable beta-galactosidase gene |
| ES95303772T ES2116683T3 (es) | 1994-06-14 | 1995-06-02 | Gen de la beta-galactosidasa hipertermoestable. |
| CN95107176A CN1056648C (zh) | 1994-06-14 | 1995-06-13 | 高热稳定性β－半乳糖苷酶基因 |
| US08/489,733 US5744345A (en) | 1992-10-05 | 1995-06-14 | Hyperthermostable β-galactosidase gene, enzyme encoded thereby, and process for production |
| US08/993,581 US5962326A (en) | 1992-10-05 | 1997-12-18 | Hyperthermostable β-galactosidase gene, enzyme encoded thereby, and process for production |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15435694A JP3212798B2 (ja) | 1994-06-14 | 1994-06-14 | 超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07327685A true JPH07327685A (ja) | 1995-12-19 |
| JP3212798B2 JP3212798B2 (ja) | 2001-09-25 |
Family
ID=15582374
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15435694A Expired - Lifetime JP3212798B2 (ja) | 1992-10-05 | 1994-06-14 | 超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0687732B1 (ja) |
| JP (1) | JP3212798B2 (ja) |
| CN (1) | CN1056648C (ja) |
| DE (1) | DE69502343T2 (ja) |
| ES (1) | ES2116683T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009273379A (ja) * | 2008-05-13 | 2009-11-26 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | セルロースの糖化方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| US6004788A (en) | 1995-07-18 | 1999-12-21 | Diversa Corporation | Enzyme kits and libraries |
| DK1469066T3 (da) * | 1996-01-11 | 2008-07-28 | Verenium Corp | Endoglucanase fra Thermotoga |
| ATE271126T1 (de) * | 1996-01-11 | 2004-07-15 | Diversa Corp | Glykosidaseenzyme |
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| US6987016B2 (en) | 1996-03-08 | 2006-01-17 | Diversa Corporation | α-galactosidases and methods for making and using them |
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| ATA37099A (de) * | 1999-03-04 | 2000-02-15 | Lactoprot Alpenlaendische Milc | Verfahren zur enzymatischen lactosespaltung, insbesondere mittels membrandiffusionsreaktoren |
| CN100398655C (zh) * | 2005-10-11 | 2008-07-02 | 山东大学 | 一种转糖基α-半乳糖苷酶基因 |
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| CN102154239B (zh) * | 2011-01-06 | 2012-12-12 | 中山大学 | 一种具有高效转糖基β-半乳糖苷酶的新基因及应用 |
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| CN111154740B (zh) * | 2020-02-07 | 2022-03-04 | 中国农业大学 | 一种沙质微泡菌β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用 |
| CN114774394A (zh) * | 2022-04-20 | 2022-07-22 | 南京工业大学 | 一种热稳定β半乳糖苷酶及其合成甘油半乳糖苷的应用 |
| CN114958893B (zh) * | 2022-06-14 | 2023-08-29 | 中农华威生物制药(湖北)有限公司 | 一种乳猪高温教槽料制备所需的乳糖酶的构建方法 |
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- 1994-06-14 JP JP15435694A patent/JP3212798B2/ja not_active Expired - Lifetime
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- 1995-06-02 DE DE1995602343 patent/DE69502343T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-02 ES ES95303772T patent/ES2116683T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-02 EP EP19950303772 patent/EP0687732B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-13 CN CN95107176A patent/CN1056648C/zh not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009273379A (ja) * | 2008-05-13 | 2009-11-26 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | セルロースの糖化方法 |
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| DE69502343D1 (de) | 1998-06-10 |
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| ES2116683T3 (es) | 1998-07-16 |
| EP0687732B1 (en) | 1998-05-06 |
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