JPH07316244A - (poly)oxyalkylene derivative and microsphere - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain microspheres for immobolizing a functional substance, which can immobilize the substance stably by covalent bonds on their surfaces, are excellent in dispersion stability in water, and hardly allow the nonspecific adsorption of protein, etc., to occur. CONSTITUTION:Microspheres each having a structure comprising a core consisting of accumulated polystyrene and a shell consisting of accumulated polyoxyalkylene chains are obtd. by polymerizing styrene and a polyoxyalkylene deriv. represented by CH2=C(R)C(=O)(AO)nC(=O)CH2CH2COOH [wherein R is H or CH3; AO is 2-4C oxyalkylene; and n is 1-1,000], e.g. in a solvent mixture comprising an alcohol and water.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は新規かつ有用な（ポリ）
オキシアルキレン誘導体、この化合物をマクロモノマー
成分とするミクロスフェア（マイクロスフェア）、この
ミクロスフェアに機能性物質が固定化された機能性物質
固定化ミクロスフェア、およびこれらの製造方法に関す
る。さらに詳しくは、診断薬、固定化酵素、薬物運搬
体、医療用材料または塗料用高分子の原料として、また
医薬、農薬、染料、界面活性剤などの原料として有用な
（ポリ）オキシアルキレン誘導体、この誘導体とスチレ
ンとからなり、診断薬、薬物運搬体、機能性塗料、機能
性染料、機能性インクなどとして利用することができる
ミクロスフェアおよび機能性物質固定化ミクロスフェ
ア、ならびにこれらの製造方法に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention is novel and useful (poly).
The present invention relates to an oxyalkylene derivative, microspheres (microspheres) containing the compound as a macromonomer component, functional substance-immobilized microspheres having a functional substance immobilized on the microspheres, and methods for producing the same. More specifically, a (poly) oxyalkylene derivative useful as a raw material for a diagnostic agent, an immobilized enzyme, a drug carrier, a medical material or a polymer for a coating, and a raw material for a drug, an agricultural chemical, a dye, a surfactant, or the like, The present invention relates to microspheres and microspheres on which functional substances are immobilized, which are composed of this derivative and styrene and can be used as diagnostic agents, drug carriers, functional paints, functional dyes, functional inks, etc., and methods for producing these. .

【０００２】[0002]

【従来の技術】特開昭５７−９２３３２号には、片末端
に重合性二重結合、他方の片末端に官能基を有するポリ
オキシアルキレン誘導体が開示され、感光性樹脂組成物
のモノマー成分として利用している。しかし、この化合
物を、タンパク質等の機能性物質固定用の高分子を製造
するためのマクロモノマーとして利用することは示唆さ
れていない。2. Description of the Related Art JP-A-57-92332 discloses a polyoxyalkylene derivative having a polymerizable double bond at one end and a functional group at the other end, which is used as a monomer component of a photosensitive resin composition. We are using. However, it has not been suggested to utilize this compound as a macromonomer for producing a polymer for immobilizing a functional substance such as a protein.

【０００３】ところで、塗料または診断薬の分野におい
て、ポリスチレンラテックスまたはミクロスフェアが広
く用いられている。しかし、ポリスチレンのみからなる
ラテックスまたはミクロスフェアは、溶媒中、特に水中
での分散安定性が悪くて沈降しやすいため、これらを水
系媒体中で単独で使用することは難しく、界面活性剤な
どとの併用が必要である。また、特に診断薬用の担体と
してポリスチレンラテックスを用いる場合、ポリスチレ
ンラテックス中にはタンパク質と反応する官能基が存在
していないので、抗体の担持方法は吸着平衡によるもの
となり、このため吸着担持される抗体量が制限された
り、あるいは吸着担持した抗体が脱離しやすいという問
題点がある。さらに、検体中に共存する他のタンパク質
などが非特異的に吸着し、検出感度や信頼性を低下させ
るなどの問題点もある。By the way, polystyrene latex or microspheres are widely used in the field of paints or diagnostic agents. However, latex or microspheres composed only of polystyrene are poor in dispersion stability in a solvent, especially in water and easily settle, so that it is difficult to use them alone in an aqueous medium, and it is difficult to use them with a surfactant or the like. Combination is required. Further, particularly when polystyrene latex is used as a carrier for a diagnostic agent, since a functional group that reacts with a protein does not exist in the polystyrene latex, the method for carrying the antibody is by adsorption equilibrium, and therefore the antibody carried by adsorption is carried out. There is a problem that the amount is limited or the adsorbed and supported antibody is easily desorbed. In addition, there is a problem that other proteins coexisting in the sample are non-specifically adsorbed and the detection sensitivity and reliability are lowered.

【０００４】このためスチレンなどと共重合させること
により、得られたポリスチレンラテックスまたはミクロ
スフェアに水分散安定性を付与することができるモノマ
ー、あるいは診断薬用高分子のモノマーとして使用する
ことにより、タンパク質などの機能性物質と容易に共有
結合する官能基を有するモノマーが要望されるが、この
ような要望を十分に満足させる化合物は知られていな
い。従って、塗料または診断薬の分野における要望を十
分に満足させるような水中での分散安定性に優れたミク
ロスフェアは得られていない。またミクロスフェア表面
にタンパク質などの機能性物質を化学結合により容易に
固定化することができるミクロスフェアも得られていな
い。Therefore, by copolymerizing it with styrene or the like, the obtained polystyrene latex or microspheres can be provided with water dispersion stability as a monomer, or by being used as a monomer of a polymer for diagnostics, proteins and the like can be obtained. There is a demand for a monomer having a functional group capable of easily covalently bonding with the functional substance (1), but a compound that sufficiently satisfies such a demand is not known. Therefore, microspheres having excellent dispersion stability in water that sufficiently satisfy the needs in the field of paints or diagnostic agents have not been obtained. Further, microspheres that can easily immobilize a functional substance such as a protein on the surface of the microspheres by a chemical bond have not been obtained.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、（ポ
リ）オキシアルキレン鎖の片末端に重合性の二重結合、
もう一方の片末端にカルボキシル基を有する後記一般式
（１）で表される新規かつ有用な（ポリ）オキシアルキ
レン誘導体を提供することである。本発明の他の目的
は、後記一般式（１）で表される（ポリ）オキシアルキ
レン誘導体とスチレンとの共重合体からなり、水または
有機媒体中での分散安定性に優れ、しかもタンパク質な
どの機能性物質を容易に化学結合により安定に固定化す
ることが可能で、かつタンパク質などの非特異的吸着が
起こりにくいミクロスフェアおよびその製造方法を提供
することである。本発明の別の目的は、上記ミクロスフ
ェアにタンパク質などの機能性物質が化学結合により固
定され、しかも固定化された物質の活性が十分に発揮さ
れる機能性物質固定化ミクロスフェアおよびその製造方
法を提供することである。An object of the present invention is to provide a polymerizable double bond at one end of a (poly) oxyalkylene chain,
Another object is to provide a new and useful (poly) oxyalkylene derivative represented by the following general formula (1) having a carboxyl group at the other end. Another object of the present invention is a copolymer of a (poly) oxyalkylene derivative represented by the following general formula (1) and styrene, which is excellent in dispersion stability in water or an organic medium, and is a protein or the like. (EN) Provided are a microsphere capable of easily and stably immobilizing a functional substance of (3) by a chemical bond and less likely to cause non-specific adsorption of a protein and the like, and a method for producing the same. Another object of the present invention is a functional substance-immobilized microsphere in which a functional substance such as a protein is immobilized on the above-mentioned microsphere by a chemical bond, and the activity of the immobilized substance is sufficiently exerted, and a method for producing the same. Is to provide.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明は次の（ポリ）オ
キシアルキレン誘導体、この誘導体をマクロモノマー成
分とするミクロスフェア、このミクロスフェアに機能性
物質が固定化された機能性物質固定化ミクロスフェア、
およびこれらの製造方法である。 （１）下記一般式（１）で表される（ポリ）オキシアル
キレン誘導体。The present invention provides the following (poly) oxyalkylene derivative, microspheres containing the derivative as a macromonomer component, and functional substance-immobilized microspheres having a functional substance immobilized on the microspheres. Fair,
And the manufacturing methods thereof. (1) A (poly) oxyalkylene derivative represented by the following general formula (1).

【化４】 〔式中、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎ
はオキシアルキレン基の繰返し単位数で、１〜１０００
の正数を表わす。Ｒは水素原子またはメチル基を表わ
す。〕 （２）前記一般式（１）で表される（ポリ）オキシアル
キレン誘導体とスチレンとの共重合体からなることを特
徴とするミクロスフェア。 （３）前記一般式（１）で表される（ポリ）オキシアル
キレン誘導体とスチレンとを、アルコールと水との混合
溶媒中で重合させることを特徴とするミクロスフェアの
製造方法。 （４）上記（２）記載のミクロスフェアに機能性物質が
固定されたことを特徴とする機能性物質固定化ミクロス
フェア。 （５）脱水縮合剤の存在下に、上記（２）記載のミクロ
スフェアと機能性物質とを接触させることを特徴とする
機能性物質固定化ミクロスフェアの製造方法。[Chemical 4] [In formula, AO is a C2-C4 oxyalkylene group, n
Is the number of repeating units of the oxyalkylene group, and is 1 to 1000
Represents a positive number. R represents a hydrogen atom or a methyl group. (2) A microsphere comprising a copolymer of a (poly) oxyalkylene derivative represented by the general formula (1) and styrene. (3) A method for producing microspheres, which comprises polymerizing the (poly) oxyalkylene derivative represented by the general formula (1) and styrene in a mixed solvent of alcohol and water. (4) A functional substance-immobilized microsphere, wherein the functional substance is immobilized on the microsphere according to (2) above. (5) A method for producing a functional substance-immobilized microsphere, which comprises contacting the microsphere with the functional substance described in (2) above in the presence of a dehydration condensation agent.

【０００７】本発明において、「（ポリ）オキシアルキ
レン」は、ｎが１のオキシアルキレンまたはｎが２以上
のポリオキシアルキレンを意味する。また「（ポリ）ア
ルキレン」は、同様にｎが１のアルキレンまたはｎが２
以上のポリアルキレンを意味する。In the present invention, "(poly) oxyalkylene" means oxyalkylene in which n is 1 or polyoxyalkylene in which n is 2 or more. Similarly, "(poly) alkylene" means alkylene in which n is 1 or n is 2.
The above-mentioned polyalkylene is meant.

【０００８】一般式（１）のＡＯで表わされるオキシア
ルキレン基は、炭素数２〜４のオキシアルキレン基であ
り、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシト
リメチレン基、オキシ−１−エチルエチレン基、オキシ
−１，２−ジメチルエチレン基、オキシテトラメチレン
基などがあげられる。これらのオキシアルキレン基は、
エチレンオキシド、プロピレンオキシド、オキセタン、
１−ブテンオキシド、２−ブテンオキシド、テトラヒド
ロフランなどのアルキレンオキシドを付加重合させた基
である。The oxyalkylene group represented by AO in the general formula (1) is an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, and is an oxyethylene group, an oxypropylene group, an oxytrimethylene group or an oxy-1-ethylethylene group. , Oxy-1,2-dimethylethylene group, oxytetramethylene group and the like. These oxyalkylene groups are
Ethylene oxide, propylene oxide, oxetane,
It is a group obtained by addition-polymerizing an alkylene oxide such as 1-butene oxide, 2-butene oxide or tetrahydrofuran.

【０００９】一般式（１）のｎは１〜１０００、好まし
くは２〜５００、さらに好ましくは５〜３００の正数で
ある。ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基の種類は
同一のものでも、異なるものでもよい。後者の場合、ラ
ンダムに付加していても、ブロック状に付加していても
よい。In the general formula (1), n is a positive number of 1-1000, preferably 2-500, more preferably 5-300. When n is 2 or more, the oxyalkylene groups may be the same or different. In the latter case, they may be added randomly or in blocks.

【００１０】オキシアルキレン基の種類の異なるものと
しては、例えばオキシエチレン基とオキシプロピレン基
とがランダムに付加したもの、ポリオキシエチレン／ポ
リオキシプロピレンのようにブロック状に付加したも
の、またはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン
／ポリオキシエチレンのようにブロック状に付加したも
のなどがあげられる。Examples of different oxyalkylene groups include, for example, random addition of oxyethylene groups and oxypropylene groups, block addition such as polyoxyethylene / polyoxypropylene, or polyoxy. Examples thereof include those added in blocks such as ethylene / polyoxypropylene / polyoxyethylene.

【００１１】一般式（１）で表わされる（ポリ）オキシ
アルキレン誘導体は、例えば（ポリ）アルキレングリコ
ールのモノメタクリル酸エステルまたはモノアクリル酸
エステル、具体的にはα−メタクリロイル−ω−ヒドロ
キシポリ（オキシエチレン）などとコハク酸無水物と
を、無溶媒であるいはベンゼン、トルエン、クロロホル
ム、アセトニトリルなどの有機溶媒中で、触媒としてピ
リジン、トリエチルアミン、ナトリウムメトキシドなど
を用いて、０〜１５０℃、好ましくは４０〜１００℃
で、３０分間〜１００時間、好ましくは１〜２４時間反
応させることにより容易に製造することができる。The (poly) oxyalkylene derivative represented by the general formula (1) is, for example, a monomethacrylic acid ester or a monoacrylic acid ester of (poly) alkylene glycol, specifically α-methacryloyl-ω-hydroxypoly (oxy). Ethylene) and succinic anhydride in the absence of solvent or in an organic solvent such as benzene, toluene, chloroform and acetonitrile, using pyridine, triethylamine, sodium methoxide and the like as a catalyst, at 0 to 150 ° C., preferably 40-100 ° C
Then, it can be easily produced by reacting for 30 minutes to 100 hours, preferably for 1 to 24 hours.

【００１２】（ポリ）アルキレングリコールのモノメタ
クリル酸エステルとしてα−メタクリロイル−ω−ヒド
ロキシポリ（オキシエチレン）を用いた場合の反応式を
次式（２）に示す。式中、ｎは前記と同じものを示す。The reaction formula when α-methacryloyl-ω-hydroxypoly (oxyethylene) is used as the monomethacrylic acid ester of (poly) alkylene glycol is shown in the following formula (2). In the formula, n represents the same as above.

【化５】 [Chemical 5]

【００１３】反応終了後は、抽出、蒸留、再結晶、再沈
殿、透析、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換樹脂処理、
吸着剤処理などの方法により、容易に単離・精製するこ
とができる。得られた（ポリ）オキシアルキレン誘導体
は、診断薬、固定化酵素、薬物運搬体、医療用材料また
は塗料用高分子などの原料として、あるいは医薬、農
薬、染料または界面活性剤などの原料として利用するこ
とができる。After completion of the reaction, extraction, distillation, recrystallization, reprecipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, ion exchange resin treatment,
It can be easily isolated and purified by a method such as treatment with an adsorbent. The obtained (poly) oxyalkylene derivative is used as a raw material for diagnostic agents, immobilized enzymes, drug carriers, medical materials or polymers for paints, or as raw materials for drugs, agricultural chemicals, dyes or surfactants. can do.

【００１４】本発明のミクロスフェアは上記のような
（ポリ）オキシアルキレン誘導体とスチレンとの共重合
体からなるものであり、コアにポリスチレンが集積し、
シェルに（ポリ）オキシアルキレン鎖が集積した構造を
有する粒子である。粒径は特に限定されないが、平均粒
径１〜１０００ｎｍ、好ましくは１００〜５００ｎｍの
ものが望ましい。The microspheres of the present invention are composed of a copolymer of the above (poly) oxyalkylene derivative and styrene, and polystyrene is accumulated in the core,
It is a particle having a structure in which a (poly) oxyalkylene chain is accumulated in a shell. The particle size is not particularly limited, but an average particle size of 1 to 1000 nm, preferably 100 to 500 nm is desirable.

【００１５】本発明のミクロスフェアを模式的に示すと
次式（３）のように表すことができる。The microspheres of the present invention can be schematically represented by the following formula (3).

【化６】 [Chemical 6]

【００１６】本発明のミクロスフェアに親水性を付与す
る場合、一般式（１）で表される（ポリ）オキシアルキ
レン誘導体としてはＡＯがエチレンオキシドの単独付加
であるものを使用するのが好ましく、特にｎが３以上の
ものを使用するのが好ましい。オキシアルキレン基の種
類が異なる場合、エチレンオキシドが２０モル％以上、
好ましくは５０モル％以上付加しているポリオキシアル
キレン誘導体を使用するのが好ましい。このようなポリ
オキシアルキレン誘導体を用いることにより、前記式
（３）に示したように、親水性のポリオキシアルキレン
鎖がミクロスフェアの表面に集積するので、水分散安定
性に優れたミクロスフェアが得られる。またこのような
ミクロスフェアは、ポリオキシエチレン鎖またはエチレ
ンオキシドの付加モル数の多いポリオキシアルキレン鎖
が両親媒性を示すので、酢酸エチル、エタノール、メタ
ノール、プロパノール、ブタノールなどの有機溶媒中に
おいても分散安定性に優れている。ミクロスフェアに親
油性を付与する場合、エチレンオキシド以外のアルキレ
ンオキシドの付加モル数が多い（ポリ）オキシアルキレ
ン誘導体を使用する。When imparting hydrophilicity to the microspheres of the present invention, it is preferable to use, as the (poly) oxyalkylene derivative represented by the general formula (1), one in which AO is a single addition of ethylene oxide, and particularly It is preferable to use one in which n is 3 or more. When the types of oxyalkylene groups are different, ethylene oxide is 20 mol% or more,
It is preferable to use a polyoxyalkylene derivative added with 50 mol% or more. By using such a polyoxyalkylene derivative, as shown in the above formula (3), hydrophilic polyoxyalkylene chains are accumulated on the surface of the microspheres, so that microspheres excellent in water dispersion stability can be obtained. can get. In addition, since such a microsphere has amphiphilicity in a polyoxyethylene chain or a polyoxyalkylene chain having a large number of added moles of ethylene oxide, it is dispersed even in an organic solvent such as ethyl acetate, ethanol, methanol, propanol, butanol. It has excellent stability. When imparting lipophilicity to the microspheres, a (poly) oxyalkylene derivative having a large number of added alkylene oxides other than ethylene oxide is used.

【００１７】本発明のミクロスフェアは、一般式（１）
で表される（ポリ）オキシアルキレン誘導体とスチレン
とを、アルコールと水との混合溶媒中で重合させること
により製造することができる。上記アルコールとしては
低級アルコールを使用することができ、メタノール、エ
タノール、プロパノールなどの炭素数１〜３のアルコー
ルが好ましく使用できる。これらの中では、特にエタノ
ールが好ましい。アルコールと水との混合割合は、アル
コール：水の体積比で５：９５〜９９：１（５〜９９体
積％）、好ましくは５０：５０〜９５：５（５０〜９５
体積％）とするのが望ましい。反応溶媒として水単独ま
たはアルコール単独で用いても、ミクロスフェアは形成
されない。The microspheres of the present invention have the general formula (1)
It can be produced by polymerizing a (poly) oxyalkylene derivative represented by and styrene in a mixed solvent of alcohol and water. As the alcohol, a lower alcohol can be used, and an alcohol having 1 to 3 carbon atoms such as methanol, ethanol and propanol can be preferably used. Of these, ethanol is particularly preferable. The mixing ratio of alcohol and water is 5:95 to 99: 1 (5 to 99% by volume), preferably 50:50 to 95: 5 (50 to 95) by volume ratio of alcohol: water.
Volume%) is desirable. No microspheres are formed when water alone or alcohol alone is used as the reaction solvent.

【００１８】（ポリ）オキシアルキレン誘導体とスチレ
ンとの配合割合は、（ポリ）オキシアルキレン誘導体：
スチレンのモル比で０．０１：９９．９〜５０：５０、
好ましくは０．５：９９．５〜３０：７０とするのが望
ましい。上記範囲外になるとミクロスフェアが形成され
にくくなる傾向にある。混合溶媒中の総モノマー濃度は
０．００１〜１００ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．１〜１
０ｍｏｌ／ｌとするのが望ましい。この範囲外になると
ミクロスフェアが形成されにくくなる傾向にある。The mixing ratio of the (poly) oxyalkylene derivative and styrene is as follows:
0.01: 99.9 to 50:50 in a molar ratio of styrene,
It is desirable to set it to 0.5: 99.5 to 30:70. If the amount is out of the above range, microspheres tend not to be easily formed. The total monomer concentration in the mixed solvent is 0.001 to 100 mol / l, preferably 0.1 to 1
It is preferably 0 mol / l. Outside this range, microspheres tend to be less likely to be formed.

【００１９】反応はラジカル重合開始剤の存在下に行う
のが好ましい。ラジカル重合開始剤としては、１０時間
半減期温度が１０〜１５０℃の過酸化物またはアゾ系化
合物が好ましい。例えば、過硫酸アンモニウム等の無機
過酸化物；過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルヒドロペルオ
キシド、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ
−ブチルペルオキシ（２−エチルヘキサノエート）等の
有機過酸化物；２，２′−アゾビス〔２−（５−メチル
−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン〕二塩酸塩、
２，２′−アゾビス〔２−（２−イミダゾリン−２−イ
ル）プロパン〕二塩酸塩、２，２′−アゾビス〔２−
（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン〕、２，２′
−アゾビスイソブチロニトリル、２，２′−アゾビス
（２−アミジノプロパン）二塩酸塩、２，２′−アゾビ
ス（２−メチルブチロニトリル）、４，４′−アゾビス
（４−シアノ吉草酸）等のアゾ系化合物などがあげられ
る。ラジカル重合開始剤の使用割合は、総モノマーモル
数に対して０．００１〜１０ｍｏｌ％、好ましくは０．
１〜５ｍｏｌ％とするのが望ましい。The reaction is preferably carried out in the presence of a radical polymerization initiator. The radical polymerization initiator is preferably a peroxide or an azo compound having a 10-hour half-life temperature of 10 to 150 ° C. For example, inorganic peroxides such as ammonium persulfate; benzoyl peroxide, t-butyl hydroperoxide, diisopropyl peroxydicarbonate, t
-Organic peroxides such as butylperoxy (2-ethylhexanoate); 2,2'-azobis [2- (5-methyl-2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride,
2,2'-azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride, 2,2'-azobis [2-
(2-Imidazolin-2-yl) propane], 2,2 '
-Azobisisobutyronitrile, 2,2'-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride, 2,2'-azobis (2-methylbutyronitrile), 4,4'-azobis (4-cyanokyl) Examples thereof include azo compounds such as herb acid). The proportion of the radical polymerization initiator used is 0.001 to 10 mol%, preferably 0.
It is desirable to be 1 to 5 mol%.

【００２０】重合反応は、脱気封管中で、または窒素、
アルゴン、二酸化炭素などの不活性ガス雰囲気下で、反
応温度０〜１５０℃、好ましくは３０〜８０℃、反応時
間３０分間〜１００時間、好ましくは１〜２４時間の条
件で行うことができる。The polymerization reaction is carried out in a degassed sealed tube or with nitrogen,
The reaction can be performed under an atmosphere of an inert gas such as argon or carbon dioxide at a reaction temperature of 0 to 150 ° C., preferably 30 to 80 ° C., and a reaction time of 30 minutes to 100 hours, preferably 1 to 24 hours.

【００２１】また別の方法として、紫外線、電子線、γ
線などの照射による光・放射線重合法などの方法によっ
ても同様にミクロスフェアを得ることができる。このよ
うにして、重合時のモノマー濃度、溶媒組成、モノマー
組成などの諸条件を選択することにより、平均粒径１〜
１０００ｎｍ、ＣＶ値５〜３０％程度の単分散性に優れ
たミクロスフェアを得ることができる。得られたミクロ
スフェアはそのままで、あるいは遠心分離、透析、限外
濾過、ゲル濾過、イオン交換樹脂処理、吸着剤処理など
の方法により精製した後、使用することができる。As another method, ultraviolet rays, electron beams, γ
Microspheres can be similarly obtained by a method such as a photo-radiation polymerization method by irradiation with rays. In this way, by selecting various conditions such as the monomer concentration at the time of polymerization, the solvent composition, and the monomer composition, the average particle size of 1 to
It is possible to obtain microspheres having a monodispersity of 1000 nm and a CV value of about 5 to 30%. The obtained microspheres can be used as they are, or after being purified by a method such as centrifugation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, treatment with an ion exchange resin, treatment with an adsorbent.

【００２２】本発明のミクロスフェアは前記式（３）に
示すように、コアにポリスチレンが集積し、シェルに
（ポリ）オキシアルキレン鎖が集積した構造のものであ
り、水や有機溶媒中での分散安定性に優れている。さら
に、（ポリ）オキシアルキレン鎖の先端に反応性に優れ
たカルボキシル基が存在し、これが機能性物質固定用の
リガンドとなるため、種々の機能性物質を化学的結合に
より固定化することが可能である。このため、機能性物
質を固定する基材（担体）として好適に使用することが
できる。またその他にも、コア部に染料や顔料を滲込ま
せて機能性染料として使用できるほか、機能性インク、
機能性塗料などとしても使用することができる。The microspheres of the present invention have a structure in which polystyrene is accumulated in the core and (poly) oxyalkylene chains are accumulated in the shell, as shown in the above formula (3). Excellent dispersion stability. Furthermore, a highly reactive carboxyl group exists at the tip of the (poly) oxyalkylene chain, and this serves as a ligand for immobilizing functional substances, so various functional substances can be immobilized by chemical bonding. Is. Therefore, it can be suitably used as a base material (carrier) for fixing a functional substance. Other than that, it can be used as a functional dye by allowing dyes and pigments to soak into the core part, as well as functional ink,
It can also be used as a functional paint.

【００２３】本発明の機能性物質固定化ミクロスフェア
は、前記ミクロスフェアに機能性物質が化学結合（共有
結合）により固定されたミクロスフェアである。固定化
する機能性物質は特に限定されないが、例えば色素、染
料、放射線ラベル化合物、蛍光化合物、化学発光化合
物、電極感応性化合物等の標識物質；光応答性化合物、
ｐＨ応答性化合物、熱応答性化合物等の外部刺激応答性
化合物；酵素、抗体、抗原、その他のタンパク質、糖、
脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホルモン等の生理活性物
質；医薬などがあげられる。これらの中では、分子中に
アミノ基、水酸基またはチオール基を有するものが好ま
しく、特にカルボキシル基と容易に反応する第１級アミ
ノ基を有するものが好ましい。The functional substance-immobilized microsphere of the present invention is a microsphere in which a functional substance is immobilized on the microsphere by a chemical bond (covalent bond). The functional substance to be immobilized is not particularly limited, but for example, a labeling substance such as a dye, a dye, a radiation labeling compound, a fluorescent compound, a chemiluminescent compound, an electrode-sensitive compound; a photoresponsive compound,
External stimuli-responsive compounds such as pH-responsive compounds and heat-responsive compounds; enzymes, antibodies, antigens, other proteins, sugars,
Examples include physiologically active substances such as lipids, glycoproteins, glycolipids, and hormones; drugs. Among these, those having an amino group, a hydroxyl group or a thiol group in the molecule are preferable, and those having a primary amino group that easily reacts with a carboxyl group are particularly preferable.

【００２４】上記抗体の具体的なものとしては、ポリク
ローナル抗体、モノクローナル抗体、これらの一部ユニ
ットなどがあげられる。これらの抗体はヒト、ヤギ、ヒ
ツジ、ウサギ、ニワトリなど、いかなる動物種由来のも
のであっても、またいかなるハイブリドーマに由来する
ものであってもよい。また上記抗原の具体的なものとし
ては、タンパク質、オリゴ糖、高分子糖、低分子ハプテ
ン、コレステロールなどがあげられる。ただしハプテン
の場合には、固定化のために、その分子内にアミノ基、
水酸基またはチオール基のいずれかの官能基を有するこ
とが必要である。このような抗体または抗原が固定化さ
れたミクロスフェアは、診断薬として好適に利用され
る。Specific examples of the above-mentioned antibody include a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a part of these units, and the like. These antibodies may be derived from any animal species such as human, goat, sheep, rabbit and chicken, and may be derived from any hybridoma. Specific examples of the above-mentioned antigens include proteins, oligosaccharides, high molecular sugars, low molecular haptens, and cholesterol. However, in the case of a hapten, for immobilization, an amino group in the molecule,
It is necessary to have a functional group, either a hydroxyl group or a thiol group. Microspheres having such an antibody or antigen immobilized thereon are suitably used as a diagnostic agent.

【００２５】機能性物質の固定化はミクロスフェアのカ
ルボキシル基と、機能性物質のアミノ基、水酸基または
チオール基などの官能基との間で、アミド結合、エステ
ル結合またはチオールエステル結合などの共有結合を形
成することにより行われる。The functional substance is immobilized by covalent bond such as amide bond, ester bond or thiol ester bond between the carboxyl group of the microsphere and the functional group such as amino group, hydroxyl group or thiol group of the functional substance. Is formed by forming.

【００２６】本発明の機能性物質固定化ミクロスフェア
は、脱水縮合剤の存在下に、前記ミクロスフェアと機能
性物質とを接触させることにより容易に行うことができ
る。接触方法としては、反応溶媒中で攪拌するなどの方
法が採用できる。上記脱水縮合剤としては、Ｎ−シクロ
ヘキシル−Ｎ′−（２−モルホリノエチル）カルボジイ
ミド＝メソ−ｐ−トルエンスルホネート、１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩
酸塩等の水溶性脱水縮合剤；ジシクロヘキシルカルボジ
イミド、１，１′−カルボニルジイミダゾール等の非水
溶性脱水縮合剤などがあげられる。このらの中では水溶
性脱水縮合剤を使用するのが好ましい。The functional substance-immobilized microspheres of the present invention can be easily prepared by bringing the microspheres into contact with the functional substance in the presence of a dehydration condensation agent. As the contact method, a method of stirring in a reaction solvent can be adopted. Examples of the dehydration condensing agent include N-cyclohexyl-N '-(2-morpholinoethyl) carbodiimide = meso-p-toluenesulfonate, 1-ethyl-
Examples thereof include water-soluble dehydration condensation agents such as 3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride; water-insoluble dehydration condensation agents such as dicyclohexylcarbodiimide and 1,1′-carbonyldiimidazole. Among these, it is preferable to use a water-soluble dehydrating condensing agent.

【００２７】ミクロスフェアへの機能性物質の固定化
は、上記脱水縮合剤の存在下に、反応溶媒中でミクロス
フェアと機能性物質とを反応させることにより行うこと
ができる。反応溶媒としては、水、生理的食塩水、また
はｐＨ＝３〜１０、好ましくは５〜９のリン酸緩衝液、
炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液；こ
れらの水系溶媒とエタノール、メタノール、アセトニト
リル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホル
ムアミド、ジメチルアセタミド、ジメチルスルホキシド
等の有機溶媒との混合溶媒などを使用することができ
る。The immobilization of the functional substance on the microspheres can be carried out by reacting the microspheres with the functional substance in a reaction solvent in the presence of the dehydration condensation agent. As the reaction solvent, water, physiological saline, or a phosphate buffer of pH = 3 to 10, preferably 5 to 9,
Buffer solutions such as carbonate buffer solution, Tris buffer solution, acetate buffer solution; mixed solvents of these aqueous solvents and organic solvents such as ethanol, methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran, dioxane, dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethylsulfoxide, etc. Can be used.

【００２８】反応溶液中のミクロスフェアの濃度は、
０．００１〜５０重量％、好ましくは０．０１〜３０重
量％、機能性物質の濃度は１ｎｍｏｌ／ｌ〜１ｍｏｌ／
ｌ、好ましくは１μｍｏｌ／ｌ〜１００ｍｍｏｌ／ｌ、
脱水縮合剤の濃度は１μｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｏｌ／ｌ、
好ましくは１〜１００ｍｍｏｌ／ｌとするのが望まし
い。The concentration of microspheres in the reaction solution is
0.001 to 50% by weight, preferably 0.01 to 30% by weight, and the concentration of the functional substance is 1 nmol / l to 1 mol /
1, preferably 1 μmol / l to 100 mmol / l,
The concentration of the dehydration condensing agent is 1 μmol / l to 10 mol / l,
It is preferably 1 to 100 mmol / l.

【００２９】反応温度は−１０〜＋１２０℃、好ましく
はアミノ基との反応の場合は０〜５０℃、水酸基または
チオール基との反応の場合は３０〜８０℃、反応時間は
１０分間〜３００時間、好ましくは３０分間〜２４時間
とするのが望ましい。このような条件の範囲外になると
ミクロスフェアの安定性が悪くなる傾向にある。機能性
物質を固定したミクロスフェアを診断薬として利用する
場合は、ミクロスフェアとしては平均粒径が１００〜５
００ｎｍのものを使用するのが好ましい。The reaction temperature is -10 to + 120 ° C, preferably 0 to 50 ° C for the reaction with an amino group, 30 to 80 ° C for the reaction with a hydroxyl group or a thiol group, and the reaction time is 10 minutes to 300 hours. It is desirable that the time is 30 minutes to 24 hours. Outside the range of such conditions, the stability of the microspheres tends to deteriorate. When microspheres having a fixed functional substance are used as a diagnostic agent, the microspheres have an average particle size of 100 to 5
It is preferable to use the one of 00 nm.

【００３０】ミクロスフェアとアミノ基を有する機能性
物質との固定化反応を模式的に示すと次式（４）または
（５）のようになる。式中、ＰＳはポリスチレン、Ｐは
タンパク質または機能性物質を示す。ｎは前記と同じも
のを示す。The immobilization reaction between the microspheres and the functional substance having an amino group is schematically represented by the following formula (4) or (5). In the formula, PS represents polystyrene and P represents a protein or a functional substance. n shows the same thing as the above.

【化７】 [Chemical 7]

【００３１】[0031]

【化８】 [Chemical 8]

【００３２】反応終了後の混合物は、遠心分離、ゲルろ
過、限外ろ過、透析、イオン交換樹脂処理、吸着剤処理
などの方法により精製することができる。このようにし
て得られた機能性物質固定化ミクロスフェアは、機能性
物質が共有結合により固定されているので、機能性物質
の脱離は起こらず、安定に固定化されたものとなる。ま
た表面に（ポリ）オキシアルキレン鎖が集積しているの
でタンパク質などの非特異的な吸着も起こりにくく、こ
のため機能性物質固定化ミクロスフェアを診断薬として
用いた場合でも、検出感度や信頼性の高いものとなる。
さらに固定化された機能性物質の活性も十分に発揮され
る。本発明の機能性物質固定化ミクロスフェアは、診断
薬の他にも固定化酵素、薬物運搬体などとしても利用す
ることができる。The mixture after the reaction can be purified by a method such as centrifugation, gel filtration, ultrafiltration, dialysis, ion exchange resin treatment, adsorbent treatment and the like. Since the functional substance-immobilized microspheres thus obtained are immobilized by a covalent bond, the functional substance is not desorbed and is stably immobilized. In addition, since (poly) oxyalkylene chains are accumulated on the surface, nonspecific adsorption of proteins etc. does not occur easily. Therefore, even when using functional substance-immobilized microspheres as a diagnostic agent, detection sensitivity and reliability are high. Will be high.
Furthermore, the activity of the immobilized functional substance is sufficiently exerted. The functional substance-immobilized microspheres of the present invention can be used as immobilized enzymes, drug carriers, etc., as well as diagnostic agents.

【００３３】[0033]

【発明の効果】本発明によれば、（ポリ）オキシアルキ
レン鎖の片末端に重合性の二重結合、もう一方の片末端
にカルボキシル基を有する新規かつ有用な（ポリ）オキ
シアルキレン誘導体が得られる。According to the present invention, a novel and useful (poly) oxyalkylene derivative having a polymerizable double bond at one end of a (poly) oxyalkylene chain and a carboxyl group at the other end is obtained. To be

【００３４】本発明のミクロスフェアは、一般式（１）
で表される（ポリ）オキシアルキレン誘導体とスチレン
との共重合体から構成されているので、水または有機溶
媒中での分散安定性に優れるとともに、機能性物質を容
易に化学結合により安定に固定化することができる。ま
たミクロスフェアにはタンパク質などの非特異的吸着が
起こりにくい。本発明のミクロスフェアの製造方法で
は、アルコールと水との混合溶媒中でモノマーを重合し
ているので、上記ミクロスフェアを簡単に効率よく製造
することができる。The microspheres of the present invention have the general formula (1)
As it is composed of a copolymer of (poly) oxyalkylene derivative and styrene, it has excellent dispersion stability in water or organic solvent, and functional substances can be easily fixed by chemical bond. Can be converted. In addition, nonspecific adsorption of proteins and the like is unlikely to occur on the microspheres. In the method for producing microspheres of the present invention, the monomers are polymerized in a mixed solvent of alcohol and water, so that the above microspheres can be easily and efficiently produced.

【００３５】本発明の機能性物質固定化ミクロスフェア
は、上記ミクロスフェアに機能性物質が化学結合により
固定されているので、機能性物質の脱離は起こらず、し
かも活性が十分に発揮される。本発明の機能性物質固定
化ミクロスフェアの製造方法では、脱水縮合剤の存在下
に上記ミクロスフェアと機能性物質とを接触させている
ので、上記機能性物質固定化ミクロスフェアを簡単に効
率よく製造することができる。In the functional substance-immobilized microsphere of the present invention, the functional substance is fixed to the microsphere by a chemical bond, so that the functional substance is not detached and the activity is sufficiently exhibited. . In the method for producing a functional substance-immobilized microsphere of the present invention, since the microsphere and the functional substance are contacted in the presence of a dehydration condensing agent, the functional substance-immobilized microsphere can be simply and efficiently prepared. It can be manufactured.

【００３６】[0036]

【実施例】以下、実施例により、さらに詳細な説明を行
うが、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１−１ α−メタクリロイル−ω−ヒドロキシポリ（オキシエチ
レン）（ｎ≒７．６）１０ｇ（２３．８ｍｍｏｌ）、無
水コハク酸２．６ｇ（２６．２ｍｍｏｌ）および触媒量
のピリジンを混合し、８０℃で４時間攪拌しながら反応
させた。これに蒸留水２０ｍｌを加え、ジエチルエーテ
ルで洗浄した後、さらにクロロホルムで抽出し、クロロ
ホルムを減圧下留去し、下式（６）の目的物を得た。EXAMPLES The present invention will now be described in more detail by way of examples, which should not be construed as limiting the invention thereto. Example 1-1 10 g (23.8 mmol) of α-methacryloyl-ω-hydroxypoly (oxyethylene) (n≈7.6), 2.6 g (26.2 mmol) of succinic anhydride and a catalytic amount of pyridine were mixed. The reaction was carried out at 80 ° C. for 4 hours with stirring. 20 ml of distilled water was added thereto, washed with diethyl ether, further extracted with chloroform, and chloroform was distilled off under reduced pressure to obtain the target compound of the following formula (6).

【化９】 [Chemical 9]

【００３７】¹Ｈ−ＮＭＲおよびＩＲの分析結果は次の
通りである。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，ＴＭＳ（ｐｐ
ｍ），Ｊ（Ｈｚ）） ６．１１（ｂ；ｓ，１Ｈ） ５．５６（ａ；ｓ，１Ｈ） ４．２６（ｄ，ｆ；ｍ，４Ｈ） ３．６３（ｅ；ｍ，約２８Ｈ） ２．６５（ｇ；ｓ，４Ｈ） １．９３（ｃ；ｓ，３Ｈ） ｈ；ｕｎ ｄｅｔｅｃｔ ＩＲ（液膜法；ｃｍ^-1） ２９００（カルボン酸） １７２８（エステル結合） １６５５，８９５（ビニル基）The analysis results of ¹ H-NMR and IR are as follows. ¹ H-NMR (270 MHz, CDCl ₃ , TMS (pp
m), J (Hz)) 6.11 (b; s, 1H) 5.56 (a; s, 1H) 4.26 (d, f; m, 4H) 3.63 (e; m, about 28H) ) 2.65 (g; s, 4H) 1.93 (c; s, 3H) h; un detect IR (liquid film method; cm ^-1 ) 2900 (carboxylic acid) 1728 (ester bond) 1655,895 (vinyl) Basis)

【００３８】実施例１−２ α−メタクリロイル−ω−ヒドロキシポリ（オキシエチ
レン）（ｎ≒６８）１０ｇ（３．２ｍｍｏｌ）、無水コ
ハク酸０．５ｇ（５ｍｍｏｌ）および触媒量のピリジン
を混合し、８０℃で４時間攪拌しながら反応させた。反
応終了後は実施例１−１と同様にして下式（７）の目的
物を得た。Example 1-2 10 g (3.2 mmol) of α-methacryloyl-ω-hydroxypoly (oxyethylene) (n≉68), 0.5 g (5 mmol) of succinic anhydride and a catalytic amount of pyridine were mixed, The reaction was carried out at 80 ° C. for 4 hours with stirring. After completion of the reaction, the target compound of the following formula (7) was obtained in the same manner as in Example 1-1.

【化１０】 [Chemical 10]

【００３９】¹Ｈ−ＮＭＲおよびＩＲの分析結果は次の
通りである。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，ＴＭＳ（ｐｐ
ｍ），Ｊ（Ｈｚ）） ６．１１（ｂ；ｓ，１Ｈ） ５．５６（ａ；ｓ，１Ｈ） ３．６３（ｄ；ｍ，約２７０Ｈ） ２．６５（ｅ；ｓ，４Ｈ） １．９３（ｃ；ｓ，３Ｈ） ｆ；ｕｎ ｄｅｔｅｃｔ ＩＲ（液膜法；ｃｍ^-1） ２９００（カルボン酸） １７２８（エステル結合） １６５５，８９５（ビニル基）The analysis results of ¹ H-NMR and IR are as follows. ¹ H-NMR (270 MHz, CDCl ₃ , TMS (pp
m), J (Hz)) 6.11 (b; s, 1H) 5.56 (a; s, 1H) 3.63 (d; m, about 270H) 2.65 (e; s, 4H) 1 .93 (c; s, 3H) f; un detect IR (liquid film method; cm ^-1 ) 2900 (carboxylic acid) 1728 (ester bond) 1655,895 (vinyl group)

【００４０】実施例１−３ 片末端にメタクリロイル基を有するポリエチレングリコ
ール／ポリプロピレングリコールブロック共重合体１０
ｇ（５．９ｍｍｏｌ）、無水コハク酸１ｇ（１０ｍｍｏ
ｌ）および触媒量のピリジンを混合し、８０℃で４時間
攪拌しながら反応させた。反応終了後は実施例１−１と
同様にして下式（８）の目的物を得た。Example 1-3 Polyethylene glycol / polypropylene glycol block copolymer 10 having a methacryloyl group at one end
g (5.9 mmol), 1 g of succinic anhydride (10 mmo
1) and a catalytic amount of pyridine were mixed and reacted at 80 ° C. for 4 hours with stirring. After completion of the reaction, the target compound of the following formula (8) was obtained in the same manner as in Example 1-1.

【化１１】 [Chemical 11]

【００４１】¹Ｈ−ＮＭＲおよびＩＲの分析結果は次の
通りである。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，ＴＭＳ（ｐｐ
ｍ），Ｊ（Ｈｚ）） ６．１１（ｂ；ｓ，１Ｈ） ５．５６（ａ；ｓ，１Ｈ） ３．６０（ｄ，ｅ，ｇ；ｍ，約１３５Ｈ） ２．６５（ｈ；ｓ，４Ｈ） １．９３（ｃ；ｓ，３Ｈ） １．１２（ｆ；ｍ，１５Ｈ） ｉ；ｕｎ ｄｅｔｅｃｔ ＩＲ（液膜法；ｃｍ^-1） ２９００（カルボン酸） １７２８（エステル結合） １６５５，８９５（ビニル基）The analysis results of ¹ H-NMR and IR are as follows. ¹ H-NMR (270 MHz, CDCl ₃ , TMS (pp
m), J (Hz)) 6.11 (b; s, 1H) 5.56 (a; s, 1H) 3.60 (d, e, g; m, about 135H) 2.65 (h; s) , 4H) 1.93 (c; s, 3H) 1.12 (f; m, 15H) i; un detect IR (liquid film method; cm ^-1 ) 2900 (carboxylic acid) 1728 (ester bond) 1655, 895 (Vinyl group)

【００４２】実施例２−１ ８０体積％エタノール水溶液５ｍｌに、実施例１−１で
得たポリオキシアルキレン誘導体０．５７ｍｍｏｌ、ス
チレン２．８８ｍｍｏｌおよび重合開始剤としてＶＡ−
０６１（和光純薬（株）製、商品名）２．５ｍｇ（１０
０μｍｏｌ；全モノマーに対して１．５ｍｏｌ％）を仕
込み、脱気封管中、６０℃で４８時間緩やかに振盪させ
ながら重合を行った。次に大量の蒸留水中にて４８時間
透析し、ミクロスフェア分散液を得た。得られたミクロ
スフェアの粒径をＣＯＵＬＴＥＲＮ４型サブミクロン粒
子分析計を用いて測定した。平均粒径およびＣＶ値を表
１に示す。Example 2-1 0.5 ml of the polyoxyalkylene derivative obtained in Example 1-1, 2.88 mmol of styrene and VA-as a polymerization initiator were added to 5 ml of an 80% by volume aqueous ethanol solution.
061 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., trade name) 2.5 mg (10
0 μmol; 1.5 mol% based on all monomers) was charged, and polymerization was carried out in a degassed sealed tube at 60 ° C. for 48 hours while gently shaking. Next, it was dialyzed for 48 hours in a large amount of distilled water to obtain a microsphere dispersion liquid. The particle size of the resulting microspheres was measured using a COULTERN type 4 submicron particle analyzer. The average particle size and CV value are shown in Table 1.

【００４３】実施例２−２〜２−３ 実施例２−１と同様にして、ただし表１に示すようにモ
ノマーの配合を変えて、ミクロスフェアを得た。重合開
始剤は全モノマーに対して１．５ｍｏｌ％とした。得ら
れたミクロスフェアの平均粒径とＣＶ値を表１に示す。Examples 2-2 to 2-3 Microspheres were obtained in the same manner as in Example 2-1, except that the composition of the monomers was changed as shown in Table 1. The polymerization initiator was 1.5 mol% with respect to all the monomers. Table 1 shows the average particle size and CV value of the obtained microspheres.

【００４４】実施例２−４〜２−５ 実施例２−１と同様にして、ただし表１に示すように溶
媒を水とメタノールまたはプロパノールとの混合溶媒に
変えて、ミクロスフェアを得た。溶媒量は５ｍｌとし
た。得られたミクロスフェアの平均粒径とＣＶ値を表１
に示す。Examples 2-4 to 2-5 Microspheres were obtained in the same manner as in Example 2-1, except that the solvent was changed to a mixed solvent of water and methanol or propanol as shown in Table 1. The amount of solvent was 5 ml. Table 1 shows the average particle size and CV value of the obtained microspheres.
Shown in.

【００４５】実施例２−６ 実施例２−１と同様にして、ただし実施例１−３で得た
ポリオキシアルキレン誘導体を用いてミクロスフェアを
得た。重合開始剤は全モノマーに対して１．５ｍｏｌ％
とした。得られたミクロスフェアの平均粒径とＣＶ値を
表１に示す。Example 2-6 Microspheres were obtained in the same manner as in Example 2-1, except that the polyoxyalkylene derivative obtained in Example 1-3 was used. Polymerization initiator is 1.5 mol% based on all monomers
And Table 1 shows the average particle size and CV value of the obtained microspheres.

【００４６】比較例１−１ 実施例２−１と同様にして、ただしモノマーとしてスチ
レン４ｍｍｏｌのみを使用して重合を行った。重合開始
剤は全モノマーに対して１．５ｍｏｌ％とした。その結
果、塊状ポリマーが生成し、ミクロスフェアは形成でき
なかった。Comparative Example 1-1 Polymerization was carried out in the same manner as in Example 2-1 except that only 4 mmol of styrene was used as the monomer. The polymerization initiator was 1.5 mol% with respect to all the monomers. As a result, a lump polymer was formed and microspheres could not be formed.

【００４７】比較例１−２ 実施例２−１と同様にして、ただし溶媒にエタノール５
ｍｌのみを用いて重合を行った。重合開始剤は全モノマ
ーに対して１．５ｍｏｌ％とした。その結果、塊状ポリ
マーが生成し、ミクロスフェアは形成できなかった。Comparative Example 1-2 As in Example 2-1, except that ethanol 5 was used as the solvent.
Polymerization was carried out using only ml. The polymerization initiator was 1.5 mol% with respect to all the monomers. As a result, a lump polymer was formed and microspheres could not be formed.

【００４８】比較例１−３ 実施例２−１と同様にして、ただし溶媒として水５ｍｌ
のみを用いて重合を行った。重合開始剤は全モノマーに
対して１．５ｍｏｌ％とした。その結果、塊状ポリマー
が生成し、ミクロスフェアは形成できなかった。Comparative Example 1-3 As in Example 2-1, except that 5 ml of water was used as the solvent.
Polymerization was carried out using only. The polymerization initiator was 1.5 mol% with respect to all the monomers. As a result, a lump polymer was formed and microspheres could not be formed.

【００４９】[0049]

【表１】 ＊１ ポリオキシアルキレン誘導体 ＊２ ミクロスフェアの生成なし[Table 1] * 1 Polyoxyalkylene derivative * 2 No microsphere formation

【００５０】実施例３−１ 実施例２−１で得られたミクロスフェアをリン酸緩衝液
（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）を用いて固形分量２ｗｔ％
に調整し、この５ｍｌに脱水縮合剤として１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩
酸塩８ｍｇ（４２μｍｏｌ）を加え、４℃で３０分間イ
ンキュベートした。さらに、２０ｍｇ／ｍｌの牛血清ア
ルブミン（以下、ＢＳＡと略す）−０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ＝７．４）３ｍｌを加え、４℃で２４時間イン
キュベートした。反応終了後、遠心分離し（４０００ｒ
ｐｍ、１０分間）、上澄みを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝７．４）で置換する操作を３回繰り返すことにより
精製を行い、ＢＳＡ固定化ミクロスフェアを得た。Example 3-1 The microspheres obtained in Example 2-1 were treated with a phosphate buffer (0.1 M, pH = 7.4) to give a solid content of 2 wt%.
Adjusted to 5 ml and 1-ethyl-
8 mg (42 μmol) of 3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride was added, and the mixture was incubated at 4 ° C. for 30 minutes. Further, 3 ml of 20 mg / ml bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA) -0.1 M phosphate buffer (pH = 7.4) was added, and the mixture was incubated at 4 ° C. for 24 hours. After completion of the reaction, centrifuge (4000 r
pm for 10 minutes) and the supernatant was added with 0.1M phosphate buffer (p
The procedure of substituting H = 7.4) was repeated 3 times to obtain BSA-immobilized microspheres.

【００５１】得られたＢＳＡ固定化ミクロスフェアのＢ
ＳＡ固定化量を、ニンヒドリン法を用いて定量した。す
なわち、ニンヒドリン４００ｍｇ、ヒドリンダンチン６
０ｍｇをメチルセロソルブ１５ｍｌに溶解した後、酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．５）５ｍｌを加えること
によりニンヒドリン溶液を調製した。一方、上記により
得られたＢＳＡ固定化ミクロスフェア分散液１ｍｌに４
Ｎ塩酸を１ｍｌ加え、１００℃で２時間処理した後、さ
らに４Ｎ水酸化ナトリウム溶液により中和し、蒸留水を
用いて正確に５ｍｌに調整した。さらに遠心分離（４０
００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上澄み３ｍｌを計り取
り、これにニンヒドリン溶液１ｍｌを加え、１００℃で
２０分間インキュベートした。水冷した後、分光光度計
により５７０ｎｍの吸光度を測定し、あらかじめ同様の
操作で求めた検量線よりＢＳＡ固定化量を算出した結
果、２５．８μｇ／ｍｌであった。B of the obtained BSA-immobilized microspheres
The amount of SA immobilized was quantified using the ninhydrin method. That is, ninhydrin 400 mg, hydrin danthine 6
After dissolving 0 mg in 15 ml of methyl cellosolve, a ninhydrin solution was prepared by adding 5 ml of sodium acetate buffer (pH = 5.5). On the other hand, 1 ml of the BSA-immobilized microsphere dispersion solution obtained above was mixed with 4
After adding 1 ml of N hydrochloric acid and treating at 100 ° C. for 2 hours, it was further neutralized with a 4N sodium hydroxide solution and adjusted to exactly 5 ml with distilled water. Further centrifugation (40
(00 rpm, 10 minutes) was performed, 3 ml of the supernatant was weighed, 1 ml of ninhydrin solution was added thereto, and the mixture was incubated at 100 ° C. for 20 minutes. After cooling with water, the absorbance at 570 nm was measured with a spectrophotometer, and the BSA immobilization amount was calculated from the calibration curve previously obtained by the same operation, resulting in 25.8 μg / ml.

【００５２】実施例３−２ 実施例３−１と同様にして、ただしＢＳＡの代わりに１
ｍｇ／ｍｌの西洋山葵ペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰ
と略す）／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）３ｍｌ
を用いて、ＨＲＰ固定化ミクロスフェアを得た。次に得
られたＨＲＰ固定化ミクロスフェアのＨＲＰの固定化
を、ＨＲＰの酵素活性による発色法で確認した。すなわ
ち、得られたＨＲＰ固定化ミクロスフェア分散液５００
μｌにＨＲＰの基質である１，２−フェニレンジアミン
溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）１００μｌを加え、３０℃で
１０分間インキュベートし、さらに０．１Ｎ硫酸１０μ
ｌを加えたところ、褐色の呈色が見られ、ＨＲＰの固定
化が確認できた。Example 3-2 As Example 3-1 except that BSA was replaced by 1
mg / ml horseradish peroxidase (hereinafter HRP
Abbreviated) /0.1 M phosphate buffer (pH 7.5) 3 ml
Was used to obtain HRP-immobilized microspheres. Next, the immobilization of HRP in the obtained HRP-immobilized microspheres was confirmed by a coloring method based on the enzymatic activity of HRP. That is, the obtained HRP-immobilized microsphere dispersion liquid 500
100 μl of 1,2-phenylenediamine solution (10 mmol / l), which is a substrate for HRP, was added to μl, incubated at 30 ° C. for 10 minutes, and further 10 μl of 0.1N sulfuric acid
When 1 was added, a brown color was observed, and HRP immobilization was confirmed.

【００５３】実施例３−３ 実施例３−１と同様にして、ただしＢＳＡの代わりに１
０ｍｇ／ｍｌの抗ヒトヘモグロビン−ヤギＩｇＧ／０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）３ｍｌを用いて、抗体
固定化ミクロスフェアを得た。次に得られた抗体固定化
ミクロスフェアの抗体の固定化を、抗原抗体反応に基づ
く凝集反応の有無により検定した。すなわち、得られた
抗体固定化ミクロスフェア分散液５００μｌを５００μ
ｇ／ｍｌのヒトヘモグロビン−生理的食塩水１ｍｌ中に
加え、３７℃で１０分間インキュベートしたところ、反
応器の底に凝集物がみられ、抗体が固定化されたことが
確認できた。Example 3-3 As Example 3-1 except that BSA was replaced by 1
0 mg / ml anti-human hemoglobin-goat IgG / 0.
Antibody-immobilized microspheres were obtained using 3 ml of 1 M phosphate buffer (pH 7.5). Next, the antibody immobilization of the obtained antibody-immobilized microspheres was assayed by the presence or absence of the agglutination reaction based on the antigen-antibody reaction. That is, 500 μl of the obtained antibody-immobilized microsphere dispersion was added to 500 μl.
When added to 1 ml of g / ml human hemoglobin-physiological saline and incubated at 37 ° C. for 10 minutes, aggregates were observed at the bottom of the reactor, and it was confirmed that the antibody was immobilized.

【００５４】比較例２−１ 実施例３−１と同様にして、ただし水溶性脱水縮合剤の
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩を用いないでＢＳＡの固定化操作を行
った。このミクロスフェアについて、実施例３−１と同
様にしてニンヒドリン法によりＢＳＡ固定化量を定量し
たが、固定化量は０μｇ／ｍｌであり、ＢＳＡは固定化
されていないことが確認された。Comparative Example 2-1 In the same manner as in Example 3-1, except that the water-soluble dehydrating condensing agent 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride was not used, BSA was immobilized. I went. The amount of BSA immobilized on this microsphere was quantified by the ninhydrin method in the same manner as in Example 3-1, and the amount immobilized was 0 μg / ml, confirming that BSA was not immobilized.

【００５５】比較例２−２ 実施例３−２と同様にして、ただし水溶性脱水縮合剤の
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩を用いないでＨＲＰの固定化操作を行
った。このミクロスフェアについて、実施例３−２と同
様にしてＨＲＰの酵素活性による発色試験を行ったが、
発色は認められず、ＨＲＰは固定化されていないことが
確認された。Comparative Example 2-2 In the same manner as in Example 3-2, except that the water-soluble dehydrating condensing agent 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride was not used, HRP immobilization operation was carried out. I went. This microsphere was subjected to a color development test by the enzyme activity of HRP in the same manner as in Example 3-2.
No color development was observed, confirming that HRP was not immobilized.

【００５６】比較例２−３ 実施例３−３と同様にして、ただし水溶性脱水縮合剤の
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩を用いないで抗体の固定化操作を行っ
た。このミクロスフェアについて、実施例３−３と同様
にして抗原抗体反応を行ったが、凝集は認められず、抗
体は固定化されていないことが確認された。Comparative Example 2-3 An antibody immobilization procedure was carried out in the same manner as in Example 3-3, except that 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride which was a water-soluble dehydrating condensing agent was not used. I went. An antigen-antibody reaction was performed on this microsphere in the same manner as in Example 3-3, but no aggregation was observed, and it was confirmed that the antibody was not immobilized.

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 下記一般式（１）で表される（ポリ）オ
キシアルキレン誘導体。 【化１】 〔式中、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎ
はオキシアルキレン基の繰返し単位数で、１〜１０００
の正数を表わす。Ｒは水素原子またはメチル基を表わ
す。〕1. A (poly) oxyalkylene derivative represented by the following general formula (1). [Chemical 1] [In formula, AO is a C2-C4 oxyalkylene group, n
Is the number of repeating units of the oxyalkylene group, and is 1 to 1000
Represents a positive number. R represents a hydrogen atom or a methyl group. ] 【請求項２】 一般式（１） 【化２】 〔式中、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎ
はオキシアルキレン基の繰返し単位数で、１〜１０００
の正数を表わす。Ｒは水素原子またはメチル基を表わ
す。〕で表わされる（ポリ）オキシアルキレン誘導体と
スチレンとの共重合体からなることを特徴とするミクロ
スフェア。2. A compound represented by the general formula (1): [In formula, AO is a C2-C4 oxyalkylene group, n
Is the number of repeating units of the oxyalkylene group, and is 1 to 1000
Represents a positive number. R represents a hydrogen atom or a methyl group. ] The microsphere which consists of a copolymer of the (poly) oxyalkylene derivative represented by these, and styrene. 【請求項３】 一般式（１） 【化３】 〔式中、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎ
はオキシアルキレン基の繰返し単位数で、１〜１０００
の正数を表わす。Ｒは水素原子またはメチル基を表わ
す。〕で表わされる（ポリ）オキシアルキレン誘導体と
スチレンとを、アルコールと水との混合溶媒中で重合さ
せることを特徴とするミクロスフェアの製造方法。3. A compound represented by the general formula (1): [In formula, AO is a C2-C4 oxyalkylene group, n
Is the number of repeating units of the oxyalkylene group, and is 1 to 1000
Represents a positive number. R represents a hydrogen atom or a methyl group. ] The (poly) oxyalkylene derivative represented by these, and styrene are polymerized in the mixed solvent of alcohol and water, The manufacturing method of the microsphere characterized by the above-mentioned. 【請求項４】 請求項２記載のミクロスフェアに機能性
物質が固定されたことを特徴とする機能性物質固定化ミ
クロスフェア。4. A functional substance-immobilized microsphere, wherein the functional substance is immobilized on the microsphere according to claim 2. 【請求項５】 脱水縮合剤の存在下に、請求項２記載の
ミクロスフェアと機能性物質とを接触させることを特徴
とする機能性物質固定化ミクロスフェアの製造方法。5. A method for producing a functional substance-immobilized microsphere, which comprises contacting the microsphere according to claim 2 with the functional substance in the presence of a dehydration condensation agent.