JPH0731455A

JPH0731455A - 細胞融合方法および細胞融合装置

Info

Publication number: JPH0731455A
Application number: JP5183630A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Suzuki; 弘之鈴木; Toshio Yasunaka; 敏男安中; Makoto Aoki; 真青木
Original assignee: Tokimec Inc
Current assignee: Tokimec Inc
Priority date: 1993-07-26
Filing date: 1993-07-26
Publication date: 1995-02-03

Abstract

(57)【要約】【構成】光を照射し、光トラッピング現象を用いて細
胞を捕捉するための光照射器と、上記光照射器を移動さ
せることにより上記捕捉された細胞を搬送する細胞搬送
手段とを設け、上記電極に、高周波電圧を印加し、細胞
を会合させる機能を備える細胞融合装置。光を細胞に照
射し、該光の照射位置を変位させることで、光トラッピ
ング現象により細胞を移動させる工程と、細胞の周辺に
高周波電圧を印加し、誘電泳動現象により細胞を会合さ
せる工程とを有する細胞融合方法。【効果】細胞に損傷を与えることなく確実に細胞を融
合させることができ、また、レーザー光源の位置決め
に、高い精度が要求されない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バイオテクノロジーの
分野において、細胞を融合させるための細胞融合方法お
よび細胞融合装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、細胞融合方法としては、直流パル
スを印加し、細胞を融合させる方法や、センダイウイル
スなどの生物を用いる生物学的な方法、ポリエチレング
リコールなどの細胞集合能を有する物質を用いる化学的
細胞融合法、紫外域パルスレーザーを、あらかじめ接触
させておいた２つの細胞の接触面に照射するレーザー細
胞融合法などもある。

【０００３】このような従来の細胞融合方法を用いた細
胞融合装置は、懸濁液中の細胞をあらかじめ会合させて
おき、融合させるものである。そこで、特開平３−２９
７３８５号公報や特開平４−８２９１号公報に記載され
ているように、光トラッピングを利用して、融合する細
胞を一つずつ選択的に搬送し、会合させる方法が採られ
ている。該方法は、大弓正志らが報告しているように
（日本レーザー医学会誌第１０巻第４号２７〜３０頁
（１９９０年３月））、光が境界面（周囲溶媒と細胞）
で屈折する際に、光子のもつ運動量の向きが変化するた
め、反射、屈折のいずれの場合にも、光と物体の運動量
が保存されるような方向に力が発生することによるもの
である。この力は、レーザー光線の強度が強い方向への
成分を有するため、細胞をレーザー光線の光軸付近に捕
促できる。このため、レーザー光線に捕捉した細胞を、
レーザー光源を移動させることにより搬送し、会合させ
ることができる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上記のように
光トラッピングを利用した搬送方法により会合させる場
合、確実に細胞を捕捉した状態のまま、レーザー光源を
比較的長距離移動させなければならないため、レーザー
光の出力を大きくしなければならない。細胞と細胞の周
囲の培養液との屈折率の差は、あまり大きくないため、
確実に搬送するには、強い光が必要だからである。この
ような場合、細胞が光のエネルギーにより高温となり、
死んでしまうことがある。また、細胞に影響を与えない
ような弱い光では、確実に細胞を会合させる位置に搬送
することは難しい。

【０００５】さらに、光トラッピングを利用した搬送方
法により細胞を会合させる場合は、レーザー光源の位置
決めに、非常に高い精度が要求される。細胞の直径を、
ほぼ３０μｍ程度であると考えると、光源の位置決めに
は、±３μｍ以下の精度が必要であると考えられる。こ
のような高い精度で２つの光源の移動を制御すること
は、困難であり、光源の移動のための機構が高価なもの
となってしまう。

【０００６】そこで、本発明は、細胞に損傷を与えるこ
となく確実に細胞を融合させることができ、また、レー
ザー光源の位置決めに、高い精度が要求されない細胞融
合方法および細胞融合装置を提供することを目的とす
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明では、融合に供するための細胞を保持する、
少なくとも１つの懸濁液チャンバと、細胞を融合するた
めの融合チャンバと、融合処理後の細胞を回収するため
の回収チャンバと、直流パルスを印加する一対の対向す
る電極とを有し、上記融合チャンバは、上記対向する電
極の間隙に設けられている細胞融合装置に、光を照射
し、光トラッピング現象を用いて細胞を捕捉するための
光照射器と、上記光照射器を移動させることにより上記
捕捉された細胞を搬送する細胞搬送手段とを設け、上記
電極に、高周波電圧を印加し、細胞を会合させる機能を
備える。

【０００８】また、本発明では、細胞を所定の位置に搬
送する細胞搬送工程と、細胞を融合する細胞融合工程と
を有する細胞融合方法において、上記細胞搬送工程は、
光を細胞に照射し、該光の照射位置を変位させること
で、光トラッピング現象により細胞を移動させる工程
と、細胞の周辺に高周波電圧を印加し、誘電泳動現象に
より細胞を会合させる工程とを有することを特徴とする
細胞融合方法が提供される。

【０００９】

【作用】本発明の細胞融合方法および細胞融合装置は、
融合に供する細胞を光トラッピング現象を利用して１つ
だけ捕促し、レーザー光源を移動することで、捕促した
細胞を電極近傍まで選択的に搬送する。その後、電極に
高周波電圧を印加し、誘電泳動現象を起こさせ、電極近
傍に存在する細胞を会合させる。このようにすれば、次
に上記のような融合方法を実行することで、所望する細
胞を選択的に融合させることができる。

【００１０】なお、誘電泳動現象は、高周波交番電界中
で電気的中性粒子に生ずる分極によって中性粒子どうし
が電界方向につながったり、中性粒子が電界強度の強い
方へひかれたりする現象である。細胞は電気的中性粒子
なので、誘電泳動により移動させ、会合させることがで
きる。

【００１１】

【実施例】以下に、本発明の実施例を、図を用いて説明
する。なお、以下の各実施例では、細胞融合方法の例と
して、直流パルスの印加による方法を採っているが、本
発明は、これに限られない。

【００１２】（実施例１）本発明の一実施例を、図２を
用いて説明する。本実施例の細胞融合装置は、細胞の状
態を観察するための観察部１６と、細胞を保持する各チ
ャンバと該チャンバ間の流路とを備える細胞保持部１７
と、細胞を搬送するためのレーザー光を発生するレーザ
ー光発生部１８と、上記各部を制御する制御装置１９と
を備える。

【００１３】観察部１６は、細胞の状態を観察するため
の顕微鏡１２と、ＴＶモニタなどの画像出力装置１４
と、顕微鏡により得られた画像を画像出力装置１４に画
像データとして送信するための、ＣＣＤカメラなどのモ
ニタカメラ１３と、顕微鏡１２の視野を照らすための照
明１５とを有する。なお、顕微鏡１２は、融合に供する
細胞の大きさによっては、拡大鏡であってもよい。ま
た、モニタカメラ１３と画像出力装置１４とを用いず、
顕微鏡１２を介して肉眼で観察することもできる。この
場合には、顕微鏡１２の角度を調節して、レーザー光が
直接対物レンズに入射しないようにしなければならな
い。誤ってレーザー光が直接目に入ることを避けるた
め、上記のようなモニタカメラ１３と画像出力装置１４
とを有する構成を用い、画像出力装置に出力される画像
を観察することが望ましい。

【００１４】細胞保持部１７は、保持する液体が流動し
ないように、水平に保たれているチャンバ台７と、該チ
ャンバ台７を、水平を保ったまま移動させるための移動
機構であるチャンバ台用ＸＹＺステージ８とを備える。
チャンバ台用ＸＹＺステージ８は、図示しない駆動装置
を有する。

【００１５】チャンバ台７には、細胞を会合、融合させ
るための１対の対向電極１と、細胞の懸濁液を保持する
懸濁液チャンバ３と、細胞融合を行うための融合チャン
バ２と、融合した細胞を回収するための回収チャンバ４
と、融合に失敗した細胞を回収するための廃棄チャンバ
５とを備える。また、各チャンバ間には、幅５０μｍ、
長さ５ｍｍの流路が設けられている。各流路の長さは、
電極１に高周波電圧を印加した際に、懸濁液チャンバ
３、回収チャンバ４、および廃棄チャンバ５に保持され
ている細胞が、該高周波電圧による誘電泳動を起こし
て、融合チャンバ２に引き込まれない程度に長くなけれ
ばならない。

【００１６】本実施例では、２種の細胞を融合させるた
め、２つの懸濁液チャンバ３が設けられている。しか
し、懸濁液チャンバ３は、融合させる細胞の種類に応じ
て用意され、同一の細胞のみを融合させる場合には、懸
濁液チャンバ３は１つで足りる。上記融合チャンバ２
は、上記対向する電極１の間隙に設けられている。ま
た、細胞保持部１７は、上記電極１のための駆動装置６
を有する。該駆動装置６は、電源を有し、上記電極１間
に高周波電圧および直流パルスを発生させることができ
る。また、上記駆動装置６は、高周波電圧の周波数、振
幅、継続時間および直流パルスの電圧、継続時間を調整
できる。

【００１７】対向する電極１間の間隙は、本実施例では
１ｍｍとした。また、本実施例では、高周波電圧は、周
波数５００ＫＨｚ〜１ＭＨｚ、電圧１０Ｖ／ｍｍとし、
直流パルスは、７５Ｖ／ｍｍ、５０μ秒とした。

【００１８】なお、チャンバ台、チャンバ、および、流
路の、レーザー光を照射する側の器壁は、レーザー光を
吸収、反射しない素材であることが望ましい。本実施例
では、チャンバ台の下からレーザー光を照射する。この
ため、本実施例のチャンバ台７底部はガラス製である。

【００１９】レーザー光発生部１８は、レーザー光を発
生するレーザー光源９と、該レーザー光源９を移動させ
るためのレーザー光源用ＸＹＺステージ１０と、レーザ
ー光源用駆動装置１１とを有する。上記レーザー光源９
は、レーザー光を発生し、該光を集光させるための機構
であり、本実施例では、３０ｍＷの半導体レーザーを用
いて近赤外域のレーザー光を発生させた。また、上記レ
ーザー光源９は、コリメート機構を有し、さらに、光軸
調整されており、焦点距離を変更することの可能な集光
レンズを有する。駆動装置１１は、電源を有し、上記レ
ーザー光源９によるレーザー光の発生を制御する。ま
た、上記駆動装置は、電子的なリレーを備え、このリレ
ーを制御装置１９からの信号に応じて開閉することによ
り、制御される。

【００２０】本実施例では、レーザー光発生部１８は、
照射されるレーザー光をチャンバ台７の底面に任意の角
度で入射させることができるように構成されており、レ
ーザー光源用ＸＹＺステージ１０は、図示しない駆動装
置を有し、レーザー光の入射角度を一定に維持したま
ま、チャンバ内の任意の位置にレーザー光を照射できる
よう、レーザー光源９を移動させることができる。

【００２１】なお、本実施例では、チャンバ台用ＸＹＺ
ステージ８と、レーザー光源用ＸＹＺステージ１０とを
両方備えているが、本実施例では、レーザー光源用ＸＹ
Ｚステージ１０を、レーザー光をチャンバ台７の任意の
位置に照射させるために用い、チャンバ台用ＸＹＺステ
ージ８を顕微鏡１２の視野をチャンバ台７の任意の位置
にするために用いている。しかし、本発明は、上述の移
動機構に限定されるものではない。レーザー光をチャン
バ台７の任意の位置に任意の角度で照射でき、さらに、
顕微鏡１２の視野をチャンバ台７の任意の位置にするこ
とのできる機構であれば、いかなる機構であってもよ
い。

【００２２】制御装置１９は、上記各部との信号の送受
信の制御を行うインタフェース部２０と、操作者の入力
を受け付け、処理結果などを出力する入出力装置２１
と、演算処理を行う中央処理装置２２と、データを保持
する記憶装置２３とを有する。制御装置１９は、電極１
への電圧の印加の制御、チャンバ台用ＸＹＺステージ８
の移動による顕微鏡の視野位置の移動の制御、レーザー
光源用ＸＹＺステージ１０の駆動によるレーザー光の照
射位置の移動の制御、レーザー光源９からのレーザー光
の照射の制御、およびレーザー光源９内の集光レンズの
焦点距離の移動の制御などを、操作者が入出力装置２１
を介して入力した命令に応じて行う。該命令の入力方法
は特に限定されないが、入出力装置２１がジョイスティ
ックなどを含んで構成されていれば、レーザー光の照射
位置の移動や、顕微鏡の視野位置の移動などに関する命
令を入力する際の操作性がよい。なお、上記画像出力装
置１４を入出力装置２１の出力部として用いてもよい。

【００２３】上記２つのＸＹＺステージ８、１０は、３
方向の軸についてそれぞれマイクロメータ（図示せず）
を有する。該マイクロメータを回動させることにより、
ＸＹＺステージ８、１０をＸ、Ｙ、Ｚの各方向へそれぞ
れ直動させることができる。おおまかな移動には、それ
ぞれの軸のマイクロメータを手動により回してベースあ
るいはレーザーを移動させることができるが、制御装置
により移動させてもよい。なお、各方向のステージの取
付順序は、図示した通りでなくてもよい。

【００２４】また、上記２つのＸＹＺステージ８、１０
は、上記マイクロメータ毎に上記マイクロメータを回動
させる駆動装置（図示せず）を有する。該駆動装置は、
外部からの電気的な信号（電圧値）に応じて上記マイク
ロメータを任意の回転角で回動させる。本実施例では、
該駆動装置にステッピングモータを用いたが、超音波モ
ータなどを用いてもよい。上記制御装置１９は、該駆動
装置に信号を送ることで、上記マイクロメータによる移
動を制御でき、ステージの微小な移動およびＸ、Ｙ、Ｚ
各軸以外の方向への直進的な移動、曲線に沿った移動等
を行わせることが可能となる。なお、本実施例では、鉛
直方向をＺ軸、水平方向のうち、電極１間の電気力線の
方向をＸ軸、電気力線に直交する方向をＹ軸とした。

【００２５】本実施例では、上記駆動装置に、Ａ相、Ｂ
相の２相を有する２相ステッピングモータを用い、マイ
クロステッピング方式で駆動する。例えば、１／４波長
ずらせた正弦波をデジダイズしたマイクロステップによ
り、Ａ相、Ｂ相をそれぞれ駆動する。このようにすれ
ば、マイクロステップの分解能に比例した滑らかさ、精
度、位置ぎめで、ステージを移動させることができる。
移動速度は、マイクロステップの周期あるいは時間幅で
調節できる。また、チャンバ台の位置を正確に把握でき
るため、チャンバ間の細い流路内を、レーザー光の照射
位置や、顕微鏡１２の視野位置を、チャンバ間の細い流
路内で正確に移動させることができる。例えば、チャネ
ルの長手方向をＸＹ平面（チャンバ台の底面に水平な平
面）上の直線で表し、この直線に沿って（平行して）正
確に移動させることが容易に可能である。さらに、移動
速度をコントロールできるため、常に一定速度で移動さ
せる、緩急をつけて移動させる等細胞の移動し易さに応
じて任意に移動速度を変化させることが容易にできる。

【００２６】本実施例における細胞融合は、次のように
して行われる。あらかじめ、融合チャンバ２、回収チャ
ンバ４、廃棄チャンバ５には、培養液が保持されてい
る。また、懸濁液チャンバ３には、融合に供する細胞の
懸濁液が保持されている。

【００２７】（１）制御装置１９は、操作者の命令に応
じてチャンバ台用ＸＹＺステージ８を駆動させ、チャン
バ台７を移動させて、顕微鏡１２の視野を懸濁液チャン
バ３内に設定する。ここで、操作者は、画像出力装置の
画面を観察し、視野内の任意の細胞１つを、融合に供す
る目標細胞として決定する。

【００２８】（２）制御装置１９は、操作者の命令に応
じてレーザー光源９を点灯する。さらに、レーザー光源
用ＸＹＺステージ１０を駆動させてレーザー光源９を移
動させ、同時にレーザー光源９内の集光レンズの焦点距
離を制御し、（１）で決定された目標細胞にレーザーの
光軸を合わせる。該目標細胞は、光トラッピング現象に
より、レーザー光に捕促される。

【００２９】（３）制御装置１９は、操作者の命令に応
じてチャンバ台７用ＸＹＺステージ１０を駆動させるこ
とによりチャンバ台７を相対的に移動させ、捕捉した目
標細胞を電極１の近傍まで光トラッピングにより搬送す
る。このようにすれば、目標細胞は常に顕微鏡１２の視
野に収まっているため、操作者は、目標細胞の捕捉状況
を確認しながら移動の操作を行うことができる。なお、
本実施例では、電極１に印加される電圧による誘電泳動
が有効に働く範囲であれば、どの位置で光トラッピング
をやめてもよく、厳密な位置決めは不要である。

【００３０】（４）融合チャンバ３毎に上記（１）〜
（３）を繰返し、融合させる全ての細胞を電極１付近に
配置する。

【００３１】（５）制御装置１９は、電極１間に高周波
電圧を印加し、誘電泳動現象を生じさせる。さらに、操
作者の指示に応じて、制御装置１９は、電極１間に直流
パルスを印加する。操作者は、画像出力装置１４の画像
により、融合させる全ての細胞が会合したことを確認し
たのち、制御装置１９に直流パルスの印加を指示するこ
とが望ましい。

【００３２】（６）画像出力装置１４の画像に基づいて
融合の結果を確認した操作者による指示に応じて、制御
装置１９は、上記（１）、（２）と同様の手順により、
光トラッピング現象を用いて細胞を回収チャンバ４また
は廃棄チャンバ５に搬送する。

【００３３】なお、制御装置１９に、モニタカメラ１３
により得られた画像データを画像認識する機能を付加
し、さらに、上記の手順中で操作者が行う判断を自ら実
行する機能を持たせれば、上記（１）〜（６）の手順を
自動化または半自動化することができる。さらに、上記
（１）〜（６）の手順を繰返し、自動的に行うことので
きる自動細胞融合装置とすることもできる。

【００３４】（実施例２）次に、実施例１の細胞融合装
置の機構を一体にした、一体型細胞融合装置の実施例
を、図１を用いて説明する。

【００３５】本実施例の細胞融合装置は、スタンド２５
を有する。該スタンド２５は、顕微鏡１２、チャンバ台
用ＸＹＺステージ８、および、レーザー光源用ＸＹＺス
テージ１０を支持している。なお、図を見やすくするた
めに図示を省略しているが、チャンバ台７は、実施例１
と同様の構成を有する。

【００３６】本実施例のＸＹＺステージ８、１０も、実
施例１と同様、ステッピングモータで駆動されるが、図
２では、それぞれ、Ｘ軸のステッピングモータを８ａ、
１０ａ、Ｙ軸のステッピングモータを８ｂ、１０ｂＺ軸
のステッピングモータを８ｃ、１０ｃとして図示してい
る。また、各ステッピングモータは、駆動装置２６によ
り任意の角度で回動され、該駆動装置２６は、制御装置
１９により制御される。

【００３７】本実施例においても、上記実施例１と同様
の手順（１）〜（６）により、細胞融合が行われる。

【００３８】（実施例３）顕微鏡の対物レンズを、レー
ザー光線の集光レンズとしても用いる細胞融合装置の例
を、図３を用いて説明する。

【００３９】本実施例の細胞融合装置は、顕微鏡１２の
鏡筒内に、ハーフミラー２４を有する。レーザー光源２
８（集光レンズなし）により発生したレーザー光２７
は、ハーフミラー２４で反射し、顕微鏡１２の対物レン
ズ１２ａにより集光される。また、チャンバ台７上の各
チャンバおよび流路内の物体の反射光は、ハーフミラー
２４を透過し、モニタカメラ１３に像を結ぶ。本実施例
においては、レーザー光線の光軸が、つねに顕微鏡１２
の視野の中心にある。なお、図を見やすくするために図
示を省略しているが、チャンバ台７は、実施例１と同様
の構成を有する。

【００４０】本実施例のスタンド２５は、チャンバ台用
ＸＹＺステージ８を支持する。さらに、スタンド２５
は、顕微鏡１２を、垂直方向の変位が可能な状態で支持
する。なお、本実施例では、顕微鏡１２の光軸とレーザ
ー光の光軸が同じであるため、レーザー光源用のＸＹＺ
ステージを設ける必要がなく、構成を単純にすることが
でき、コストを低くすることができる。

【００４１】本実施例における細胞融合の手順は、実施
例１とほぼ同様であるが、（１）の手順で、目標細胞を
視野の中心に捕らえておけば、手順（２）において、制
御装置１９は、レーザー光源用ＸＹＺステージを駆動さ
せてレーザー光源を移動させる必要がない。レーザー光
線の光軸が、つねに顕微鏡１２の視野の中心ににあるた
めである。目標細胞が視野の中心からずれている場合
は、チャンバ台用レーザー光源用ＸＹＺステージを駆動
させ、チャンバ台７の位置を微調整するだけで、レーザ
ー光の光軸に細胞を捕捉することができる。このよう
に、本実施例の細胞融合装置では、実施例１の装置よ
り、単純な制御で細胞を融合させることができる。

【００４２】

【発明の効果】以上説明してきたように、本発明の細胞
融合装置によれば、細胞に損傷を与えることなく確実に
細胞を融合させることができ、また、レーザー光源の位
置決めに、高い精度が要求されない。

【図面の簡単な説明】

【図１】一体型細胞融合装置の説明図。

【図２】細胞融合装置の構成例を示す説明図。

【図３】顕微鏡の対物レンズを、レーザー光線の集光レ
ンズとして用いる細胞融合装置の説明図。

【符号の説明】

１：電極、２：融合チャンバ、３：懸濁液チャン
バ、４：回収チャンバ、５：廃棄チャンバ、６：
電極用駆動装置、７：チャンバ台、８：チャンバ台
用ＸＹＺステージ、９：レーザー光源、１０：レー
ザー光源用ＸＹＺステージ、１１：レーザー光源用駆
動装置、１２：顕微鏡、１３：モニタカメラ、１
４：画像出力装置、１５：照明、１６：観察部、
１７：細胞保持部、１８：レーザー光発生部、１
９：制御装置、２０、インターフェース部、２１：
入出力装置、２２：中央処理装置、２３：記憶装
置、２４：ハーフミラー、２５：スタンド、２
６：ＸＹＺステージ用駆動装置、２７：レーザー光、
２８：レーザー光源。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】融合に供するための細胞を保持する、少な
くとも１つの懸濁液チャンバと、細胞を融合するための
融合チャンバと、融合処理後の細胞を回収するための回
収チャンバと、直流パルスを上記融合チャンバ内に印加
する一対の対向する電極と、直流電源とを有し、上記融
合チャンバは、上記対向する電極の間隙に設けられてい
る細胞融合装置において、光を照射し、光トラッピング現象を用いて細胞を捕捉す
るための光照射器と、上記光照射器を移動させることにより上記捕捉された細
胞を搬送する細胞搬送手段と、高周波電圧を発生する電源とを有し、上記電源は、上記電極に高周波電圧を印加し、細胞を会
合させる機能を有することを特徴とする細胞融合装置。
【請求項２】請求項１において、細胞を観察するための観察部をさらに有する細胞融合装
置。
【請求項３】請求項２において、前記観察部は顕微鏡を備え、上記顕微鏡は、鏡筒にハーフミラーを有し、前記光照射器は、照射した光を集光するための集光レン
ズを有し、上記集光レンズは、上記顕微鏡の対物レンズであること
を特徴とする細胞融合装置。
【請求項４】細胞を所定の位置に搬送する細胞搬送工程
と、細胞を融合する細胞融合工程とを有する細胞融合方
法において、上記細胞搬送工程は、光を細胞に照射し、該光の照射位置を変位させること
で、光トラッピング現象により細胞を移動させる工程
と、細胞の周辺に高周波電圧を印加し、誘電泳動現象により
細胞を会合させる工程とを有することを特徴とする細胞
融合方法。
【請求項５】請求項４において、前記細胞融合工程は、直流パルスにより細胞を融合させ
る工程を有することを特徴とする細胞融合方法。