JPH07313199A - Detection of target substance in specimen - Google Patents
Detection of target substance in specimenInfo
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- JPH07313199A JPH07313199A JP11262694A JP11262694A JPH07313199A JP H07313199 A JPH07313199 A JP H07313199A JP 11262694 A JP11262694 A JP 11262694A JP 11262694 A JP11262694 A JP 11262694A JP H07313199 A JPH07313199 A JP H07313199A
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、検出対象としての標的
物質の存在下で、該標的物質を介在する相互作用に基づ
く変化を起す反応系を形成し得る複数の試薬を用いて標
的物質を検出する方法に関し、例えば、ウイルス、微生
物、動植物、ヒトなどの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の
所望の塩基配列の検出、同定、もしくは各種塩基配列に
おける変異の有無の検出に有用な方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to the use of a plurality of reagents capable of forming a reaction system in the presence of a target substance as a detection target, which undergoes a change based on an interaction mediated by the target substance. The present invention relates to a method for detecting, for example, a method useful for detecting and identifying a desired base sequence of a nucleic acid (DNA or RNA) of virus, microorganism, animal or plant, human or the like, or detecting presence or absence of mutation in various base sequences.
【０００２】[0002]
【従来の技術】核酸の分析技術の発達により種々の変異
遺伝子が数多く見つけ出され、遺伝子の変異に基づく各
種遺伝病の解明も進みつつある。そのなかには、遺伝子
中の塩基が部分的に欠失したものや、塩基が点突然変異
を起したものがあり、それによって蛋白質に変異が生
じ、さまざまな症状を引き起こすものがあることが明か
にされてきている。現在のところ、これらの遺伝病は、
症状が現れてから、酵素によるアッセイや、抗体を用い
た免疫的な方法により発見されることが主流であるが、
早期治療という観点から、重篤な症状が現れる前に遺伝
子上で変異の有無を早期に発見することの重要性が指摘
されている。2. Description of the Related Art A large number of various mutant genes have been found out by the development of nucleic acid analysis techniques, and various genetic diseases based on gene mutations are being elucidated. Among them, it was revealed that some of the bases in the gene were partially deleted and some of the bases had point mutations, which caused mutations in the protein and caused various symptoms. Is coming. At present, these genetic diseases are
After the symptom appears, it is usually found by an enzyme assay or an immunological method using an antibody.
From the viewpoint of early treatment, it has been pointed out that it is important to detect the presence or absence of a mutation in a gene early before a serious symptom appears.
【０００３】また、ＤＮＡ診断は、必ずしもヒトの遺伝
子に用いられるだけでなく、感染した細菌の同定におい
ても利用できる。DNA diagnosis is not only used for human genes, but can also be used for identifying infected bacteria.
【０００４】従来は、分離した細菌の形態学的性状およ
び生化学的性状から、類似性に基づいて菌種を同定する
方法が取られていた。この方法では、培養に時間がかか
る上に、検査法の違いによって性状の判定が異なった
り、どの性状に重点を置くかによって同定の結果が異な
る等の問題があった。Conventionally, a method of identifying bacterial species based on similarity based on the morphological and biochemical properties of the isolated bacteria has been used. In this method, there are problems that it takes a long time for culturing, the determination of the properties is different depending on the test method, and the identification result is different depending on which property is emphasized.
【０００５】そこで近年、特に、細菌感染症における原
因細菌の検出や同定の分野において、、ＤＮＡ−ＤＮＡ
ハイブリダイゼーション法、あるいはＤＮＡ−ＲＮＡハ
イブリダイゼーション法を用いる試みがなされている。
この方法は、細菌から核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を抽
出し、細菌由来の核酸のうち特定部分に着目して、その
部分の塩基配列とホモロジーの高い塩基配列が、対象と
する被検核酸サンプル中に存在するか否かをハイブリダ
イゼーション法によって調べ、サンプル中に問題となる
細菌が存在するか否かを判定する方法である。Therefore, in recent years, especially in the field of detection and identification of causative bacteria in bacterial infections, DNA-DNA
Attempts have been made to use the hybridization method or the DNA-RNA hybridization method.
This method extracts a nucleic acid (DNA or RNA) from bacteria, focuses on a specific portion of the nucleic acid derived from the bacterium, and a base sequence having a high homology with the base sequence of the portion is detected in the target test nucleic acid sample. It is a method of determining whether or not the problem bacteria are present in the sample by examining the presence or absence of the bacterium in the sample by a hybridization method.
【０００６】また、近年、核酸の特定配列の新しい検出
方法として、ＰＣＲ法も用いられるようになってきてい
る。この方法は、検出対象としての標的核酸中の特定配
列を選定し、この特定配列の増幅に必要なプライマーを
用意し、標的核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、増幅され
た特定配列の有無を検出することで、標的核酸の検出が
可能となる。ＰＣＲ法を用いることで核酸の検出感度は
向上し、ハイブリダイゼーション法を用いる核酸検出法
に代わって種々の分野での核酸の検出に利用されてい
る。[0006] In recent years, the PCR method has also been used as a new method for detecting a specific sequence of a nucleic acid. This method selects a specific sequence in a target nucleic acid as a detection target, prepares a primer necessary for amplification of this specific sequence, performs PCR using the target nucleic acid as a template, and detects the presence or absence of the amplified specific sequence. As a result, the target nucleic acid can be detected. The detection sensitivity of nucleic acids is improved by using the PCR method, and is used for detecting nucleic acids in various fields in place of the nucleic acid detection method using the hybridization method.
【０００７】しかし、ＰＣＲ法では調べたい特定塩基配
列が明かな場合に、その増幅に最適なプライマーを選定
することにより、初めて特定配列の有無を調べることが
できるもので、プライマーが非特異的に標的核酸に結合
したり、本来なら増幅されない配列が形成されることが
多々ある。また、ある標的核酸中の欠損のような遺伝子
異常は、その長さを解析することにより情報を得ること
ができるが、点突然変異のような長さに変化が現れない
ような異常に対しては知る術もないという欠点を持つ。However, in the PCR method, when the specific base sequence to be investigated is clear, the presence or absence of the specific sequence can be investigated for the first time by selecting the optimum primer for the amplification. Often, a sequence is formed that binds to the target nucleic acid or is otherwise not amplified. In addition, a gene abnormality such as a deficiency in a target nucleic acid can be obtained by analyzing its length, but it can be obtained from an abnormality such as a point mutation in which the length does not change. Has the drawback of not knowing.
【０００８】したがって、ハイブリダイゼーション法が
完全にＰＣＲ法に置き換えられるというわけではなく、
ハイブリダイゼーション法による簡便な遺伝子検出法も
やはり必要とされる。Therefore, the hybridization method is not completely replaced by the PCR method,
A simple gene detection method by the hybridization method is also required.
【０００９】ハイブリダイゼーション反応では、プロー
ブＤＮＡと標的ＤＮＡとがお互いの相補的な配列部分で
水素結合によりハイブリッド体を形成する。ハイブリダ
イゼーション反応において、相補的な配列間で正確にハ
イブリッド体を形成させるためには、反応の温度、イオ
ン強度を最適に選ぶ必要がある。つまり、温度が高すぎ
ると、プローブと相補的配列をもつ核酸とが結合でき
ず、逆に低すぎると、プローブが非特異的に核酸に結合
してしまう。さらに、より正確さを期すために、溶液の
塩濃度を下げて、あるいは、溶液の温度を上げて、不安
定な水素結合を除き、非特異的に結合したプローブやミ
スマッチしているプローブを洗い流すことが重要とな
る。従って、適当な反応条件、洗浄条件の設定には、か
なりの試行錯誤が必要になる。In the hybridization reaction, the probe DNA and the target DNA form a hybrid by hydrogen bonding at their complementary sequence portions. In the hybridization reaction, it is necessary to optimally select the reaction temperature and ionic strength in order to form a hybrid accurately between complementary sequences. That is, if the temperature is too high, the probe cannot bind to the nucleic acid having a complementary sequence, and if the temperature is too low, the probe nonspecifically binds to the nucleic acid. Furthermore, for more accuracy, lower the salt concentration of the solution or raise the temperature of the solution to remove unstable hydrogen bonds and wash away nonspecifically bound probes or mismatched probes. Is important. Therefore, a considerable amount of trial and error is required to set appropriate reaction conditions and washing conditions.
【００１０】遺伝子診断では、ハイブリッド体形成反
応、及び、洗いの条件設定に、一塩基対レベルのミスマ
ッチをも除去する精度が更に要求される。In the gene diagnosis, the hybridization reaction and the washing conditions are required to be more accurate in removing the mismatch at the single base pair level.
【００１１】ハイブリダイゼーション反応は、従来は標
的核酸をニトロセルロースのような担体に固定させた状
態で行われてきた。しかし、この方法は極めて操作が煩
雑であるため、溶液中でのハイブリダイゼーションのよ
うな簡便な方法の開発が期待されてきた。従来のような
核酸の固定化を行わない方法における最大の課題は、標
的核酸に結合しているプローブと、結合していない過剰
なプローブをどのようにして区別するか（Ｂ／Ｆ分離）
というところにある。さらに、この場合にも、上述の固
定化核酸を用いたハイブリダイゼーション反応と同様
に、プローブの非特異的吸着やミスマッチを除くための
適当な反応条件、洗浄条件設定が重要な課題となる。The hybridization reaction has conventionally been carried out with the target nucleic acid immobilized on a carrier such as nitrocellulose. However, since this method is extremely complicated in operation, development of a simple method such as hybridization in a solution has been expected. The biggest problem in the conventional method of not immobilizing nucleic acid is how to distinguish the probe bound to the target nucleic acid from the excess probe not bound (B / F separation).
There is. Further, also in this case, similarly to the above-mentioned hybridization reaction using immobilized nucleic acid, setting of appropriate reaction conditions and washing conditions for removing nonspecific adsorption of probe and mismatch is an important issue.
【００１２】Ｂ／Ｆ分離を行わずに標的核酸とプローブ
とのハイブリッド体を検出するための方法としては、蛍
光偏光解消法を用いた検出方法がいくつか提案されてい
る（特開平２−２９５４９６号公報、特開平２−７５９
５８号公報等参照）。これらの方法は、蛍光標識された
一本鎖ＤＮＡプローブを、分析検体中のＤＮＡと接触さ
せて二本鎖ＤＮＡを形成させ、二本鎖形成前の蛍光偏光
と二本鎖形成後の蛍光偏光との変異を測定して検体中の
ＤＮＡに、プローブの塩基配列に対応する塩基配列が存
在するかどうかを検出する方法である。この方法は、一
本鎖のプローブに結合させた蛍光物質が、二本鎖になっ
たことによって動きにくくなり、蛍光異方性が増大する
ことがその検出の原理となっている。As a method for detecting a hybrid of a target nucleic acid and a probe without performing B / F separation, some detection methods using a fluorescence depolarization method have been proposed (JP-A-2-295496). Japanese Patent Laid-Open No. 2-759
58, etc.). In these methods, a fluorescent-labeled single-stranded DNA probe is brought into contact with DNA in an analysis sample to form double-stranded DNA, and fluorescence polarization before double-strand formation and fluorescence polarization after double-strand formation are performed. Is a method for detecting whether or not a base sequence corresponding to the base sequence of the probe is present in the DNA in the sample by measuring the mutation. In this method, the principle of detection is that the fluorescent substance bound to the single-stranded probe becomes difficult to move due to the double-stranded structure and fluorescence anisotropy increases.
【００１３】ところが、これらの方法では、検体中に蛋
白質等の夾雑物が含まれていて、それがプローブＤＮＡ
に非特異的に吸着すると、ハイブリッド体検出のバック
グランドを上昇させる原因となるため、あらかじめこれ
らの夾雑物を完全に除去するという煩雑な作業が必要と
なる。また、プローブＤＮＡの非特異的吸着、及び、塩
基のミスマッチによる擬ハイブリッド体は他の溶液系の
場合、それをあらかじめ除去する操作が必要である。さ
らに、確かにＢ／Ｆ分離は必要ないもののプローブ濃度
が標的ＤＮＡ濃度と同程度であることが蛍光の変異を測
定する上で必要となる。However, in these methods, the sample contains contaminants such as proteins, which is the probe DNA.
Non-specifically adsorbing onto the syrup causes an increase in the background for detection of hybrids, and therefore a complicated work of completely removing these contaminants in advance is required. Further, in the case of other solution systems, the pseudo-hybrid body due to nonspecific adsorption of probe DNA and base mismatch requires an operation to remove it in advance. Furthermore, although it is true that B / F separation is not necessary, it is necessary for measuring the mutation of fluorescence that the probe concentration is approximately the same as the target DNA concentration.
【００１４】エネルギー移動を利用したハイブリッド体
検出方法として、Ｇａｒｄｕｌｌｏらは３通りの方法を
提案している（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５， ８７９０−８７９４）。
これらはいずれもエネルギー供与体としてフルオレセイ
ン、アクリジンオレンジ、エネルギー受容体としてロー
ダミンを用いたもので、（ｉ）５’をフルオレセインで
標識したオリゴヌクレオチドとそれに相補的で５’をロ
ーダミンで標識したオリゴヌクレオチドとのハイブリダ
イゼーション、（ｉｉ）５’をフルオレセインで標識し
たオリゴヌクレオチドのそれぞれ相補的ＤＮＡとのハイ
ブリダイゼーション、（ｉｉｉ）５’をローダミンで標
識したオリゴヌクレオチドのアクリジンオレンジ存在下
での相補的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションである。
この方法は、近接する蛍光発色団の励起光と蛍光が重な
り合っている場合に、供与体の励起状態エネルギーが近
接する受容体に転移される現象であり、その結果として
供与体の寿命の減少、供与体の蛍光のクエンチング及び
受容体の蛍光強度の増強などが見られる。ハイブリダイ
ゼーションの有無を溶液のまま判定できるという点では
一連の煩雑な操作を一挙に省ける点で画期的な方法とい
えるが、感度的に既存のハイブリダイゼーンに比べて数
オーダー低く、実用化のためには蛍光団の改良や検出系
の飛躍的な進歩が望まれていた。As a hybrid detection method using energy transfer, Gardullo et al. Have proposed three methods (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 85 , 8790-8794).
Each of these uses fluorescein, acridine orange as an energy donor, and rhodamine as an energy acceptor. (I) 5'-oligonucleotide labeled with fluorescein and 5'-rhodamine-complementary oligonucleotide complementary thereto Hybridization of (ii) 5'with fluorescein-labeled oligonucleotides respectively complementary DNAs, (iii) 5'-rhodamine-labeled oligonucleotides with complementary DNAs in the presence of acridine orange Hybridization.
This method is a phenomenon in which excited state energy of a donor is transferred to an adjacent acceptor when the excitation light and fluorescence of an adjacent fluorescent chromophore are overlapped, and as a result, the lifetime of the donor is reduced, Quenching of the fluorescence of the donor and enhancement of the fluorescence intensity of the acceptor are observed. It can be said that it is an epoch-making method in that it is possible to omit a series of complicated operations at once in that it can judge the presence or absence of hybridization as a solution, but the sensitivity is several orders of magnitude lower than that of the existing hybridase and it can be put to practical use. Therefore, improvements in fluorophores and breakthroughs in detection systems were desired.
【００１５】また、最近、ＤＮＡの二本鎖に二種類の色
素を遊離の状態で混合した時に、これらの色素間でＤＮ
Ａを介した電荷移動が検出されたという報告がある
（Ｊ．Ａｍｅ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｏ．，１９９２，１１
４，３６５６−３６６０）。それは、蛍光を持つ電子供
与体（エチジウムブロマイドあるいはアクリジンオレン
ジ）にそれぞれの励起波長に対応する波長の光を照射す
ると、もうひとつの色素（電子受容体：Ｎ，Ｎ−ｄｉｍ
ｅｔｈｙｌ−２，７−ｄｉａｚａｐｙｒｅｎｉｕｍｄｉ
ｃｈｌｏｒｉｄｅ）存在下では、その蛍光強度が減少す
るというもので、両色素がインターカレーターと考えら
れていることから電子がＤＮＡの二重らせんを介して電
子供与体から電子受容体の方へ流れているというもので
ある。しかし、その変化の程度は非常に小さいものであ
り、ハイブリッド体の検出に利用しうるほどの感度では
ない。Further, recently, when two kinds of dyes were mixed in a double strand of DNA in a free state, DN was generated between these dyes.
There is a report that charge transfer through A was detected (J. Ame. Chem. Sco., 1992, 11).
4 , 3656-3660). When a fluorescent electron donor (ethidium bromide or acridine orange) is irradiated with light having a wavelength corresponding to each excitation wavelength, another dye (electron acceptor: N, N-dim) is irradiated.
Ethyl-2,7-diazapyreniumdi
In the presence of chlorode), its fluorescence intensity decreases, and since both dyes are considered to be intercalators, electrons flow from the electron donor to the electron acceptor through the double helix of DNA. It is that there is. However, the degree of the change is very small, and the sensitivity is not sufficient to detect the hybrid.
【００１６】[0016]
【発明が解決しようとする課題】従来のような標的核酸
を固定したハイブリダイゼーション法はもちろん、Ｂ／
Ｆ分離を必要としない蛍光偏光解消のような方法におい
ても、プローブの非特異的吸着やミスマッチの発生を防
止する、あるいは発生した非特異的吸着やミスマッチを
除去するための煩雑な処理が必要である場合が多い。し
かも、これらの操作の最適条件はプローブの長さ、ある
いはそれぞれの塩基配列によって異なるため、それぞれ
の場合で条件を検討し、設定していく必要がある。特
に、ミスマッチしている塩基のプローブ上の位置もハイ
ブリッド体の安定性に影響を与える重要な因子となり、
その位置によってはミスマッチしているハイブリッド体
を除去できない場合も生じるため、ミスマッチの可能性
を考慮して、ハイブリダイゼーション反応の条件を個々
のケースに応じて設定するという更に煩雑な作業が必要
となる。The conventional hybridization method in which a target nucleic acid is immobilized is, of course, B /
Even in a method such as fluorescence depolarization that does not require F separation, complicated processing is required to prevent nonspecific adsorption or mismatch of the probe or to remove the generated nonspecific adsorption or mismatch. Often there is. Moreover, since the optimum conditions for these operations differ depending on the length of the probe or each base sequence, it is necessary to examine and set the conditions in each case. In particular, the position of the mismatched base on the probe is also an important factor affecting the stability of the hybrid,
Depending on the position, it may not be possible to remove the mismatched hybrid, so it is necessary to set the conditions of the hybridization reaction according to each case, considering the possibility of mismatch, which requires more complicated work. .
【００１７】電荷移動、エネルギー移動を利用する溶液
中の検出系は、標的核酸を固定する場合や、Ｂ／Ｆ分離
を必要とする系に比べて簡便な方法ではあるものの、そ
の感度は非常に低く、実用に供せられるほどのものでは
ない。さらに、従来例で用いられている色素は遊離の状
態でも蛍光を有し、蛍光強度の変化を検出しても、それ
がエネルギー供与体とエネルギー受容体（または、電子
供与体と電子受容体）とのＤＮＡを介した相互作用なの
か、溶液による単なるクエンチングなのか、あるいは夾
雑物の存在による影響なのか判定することは困難であ
る。Although a detection system in a solution utilizing charge transfer or energy transfer is a simple method as compared with a system for immobilizing a target nucleic acid or a system requiring B / F separation, its sensitivity is very high. It is too low to be put to practical use. Furthermore, the dye used in the conventional example has fluorescence even in a free state, and even if a change in fluorescence intensity is detected, it is an energy donor and an energy acceptor (or an electron donor and an electron acceptor). It is difficult to determine whether it is a DNA-mediated interaction with DNA, mere quenching by a solution, or an effect due to the presence of impurities.
【００１８】本発明は、以上のような従来技術における
問題に鑑みなされたものであり、ハイブリッド体の検出
においてＢ／Ｆ分離の必要がなく、より簡易化された工
程からなり、良好な測定感度を得ることができる標的核
酸の検出に好適な方法を提供することにある。本発明の
他の目的は、ミスマッチしているハイブリッド体が存在
する場合でも所望のハイブリッド体のみを正確に検出で
きる標的核酸の検出に好適な方法を提供することにあ
る。The present invention has been made in view of the problems in the prior art as described above, does not require B / F separation in the detection of hybrids, has a simpler process, and has good measurement sensitivity. Another object of the present invention is to provide a method suitable for detecting a target nucleic acid capable of obtaining Another object of the present invention is to provide a method suitable for detecting a target nucleic acid, which can accurately detect only a desired hybrid even when there is a mismatched hybrid.
【００１９】本発明は、更に、イムノアッセイ等の免疫
反応を利用した各種物質の検出に有用な検出系を提供す
ることにある。The present invention further provides a detection system useful for detecting various substances utilizing an immunoreaction such as an immunoassay.
【００２０】[0020]
【課題を解決するための手段】本発明の標的物質の検出
方法は、標的物質を介在した相互作用に基づく変化を生
じる反応系を構成し得る少なくとも２種の試薬を、試料
と反応させ、試料中に前記標的物質が存在する場合に生
じる前記相互作用に基づく変化を測定することによって
該試料中の標的物質を検出する方法において、前記反応
系を構成する試薬の少なくとも１つがピリリウム化合物
及びピリリウム類似化合物から選ばれたものであること
を特徴とする。The method for detecting a target substance according to the present invention comprises reacting a sample with at least two kinds of reagents capable of forming a reaction system which causes a change based on an interaction mediated by the target substance. In the method for detecting a target substance in the sample by measuring a change based on the interaction that occurs when the target substance is present in the sample, at least one of the reagents constituting the reaction system is a pyrylium compound and a pyrylium analogue. It is characterized by being selected from compounds.
【００２１】本発明で利用する相互作用とは、標的物質
を含む反応系を介して２つの物質が起す相互作用をい
う。この相互作用としては、例えば、電荷の授受（電荷
移動）やエネルギーの授受（エネルギー移動）が利用で
きる。電荷移動の場合は、相互作用を起す２つの物質の
一方は電子供与体であり、他方は電子受容体となる。ま
た、エネルギー移動の場合は、一方がエネルギー供与体
で、他方がエネルギー受容体となる。本発明において
は、このような相互作用を起す２つの物質を含む試薬群
を用いて、標的物質の存在下で相互作用を起させ、それ
によって生じる変化を測定して標的物質を検出するもの
であり、この相互作用を行う反応系を構成する試薬の少
なくとも１つにピリリウム化合物またはピリリウム類似
化合物（以下ピリリウム系化合物と総称する）を用いる
ものである。The interaction used in the present invention means an interaction caused by two substances via a reaction system containing a target substance. As this interaction, for example, charge transfer (charge transfer) or energy transfer (energy transfer) can be used. In the case of charge transfer, one of the two interacting substances is an electron donor and the other is an electron acceptor. In the case of energy transfer, one is an energy donor and the other is an energy acceptor. In the present invention, a reagent group containing two substances that cause such an interaction is used to cause the interaction in the presence of the target substance, and the resulting change is measured to detect the target substance. In some cases, a pyrylium compound or a pyrylium-like compound (hereinafter collectively referred to as a pyrylium-based compound) is used as at least one of the reagents constituting the reaction system for performing this interaction.
【００２２】更に、本発明における試薬間の相互作用
を、イムノアッセイ等の免疫反応における検出対象物質
への第１次反応体と第２次反応体の反応の際のこれらの
複合体の生成に伴って生じるようにすれば、上記の試薬
による反応系を免疫反応の検出に利用できる。例えば、
イムノアッセイにおいて、第１次反応体及び第２次反応
体の一方がエネルギー供与体あるいは電子供与体である
ような試薬で標識されており、他方がこれと相補的なア
クセプター（例えばエネルギー受容体あるいは電子受容
体）のような試薬で標識されており、これらの免疫反応
が起り、第１次反応体と第２次反応体とが結合した結果
生じるドナーとアクセプターとの近接によるエネルギー
の転移や電荷の移動が検出可能なシグナルを生じ、この
シグナルを検出することで、免疫反応の有無を検出でき
る。この標識試薬の少なくとも一方としてピリリウム系
化合物を用いることができる。Further, the interaction between the reagents in the present invention is accompanied by the formation of these complexes during the reaction of the primary and secondary reactants with the substance to be detected in the immunoreaction such as immunoassay. Then, the reaction system using the above-mentioned reagents can be used for detecting an immune reaction. For example,
In the immunoassay, one of the primary reactant and the secondary reactant is labeled with a reagent that is an energy donor or an electron donor, and the other is labeled with a complementary acceptor (eg, energy acceptor or electron donor). Are labeled with a reagent such as an acceptor), these immune reactions occur, and energy transfer and charge transfer due to the proximity of the donor and acceptor resulting from the binding of the primary and secondary reactants. The migration produces a detectable signal, and the presence or absence of an immune response can be detected by detecting this signal. A pyrylium compound can be used as at least one of the labeling reagents.
【００２３】以下、標的物質として核酸二重らせん構造
を検出する場合を代表例として本発明を説明するが、同
様の作用により検出できるものであれば、本願発明はこ
れに限定されない。The present invention will be described below by taking the case of detecting a nucleic acid double helix structure as a target substance as a representative example, but the present invention is not limited to this as long as it can be detected by the same action.
【００２４】図１及び２に、本発明で利用する相互作用
を起こす反応系のモデルを電荷移動の場合を例として模
式的に示す。図１のものは、標的物質３（核酸二重らせ
ん構造）と相互作用を起す２つの試薬１、２から構成さ
れる最も単純な反応系であり、この反応系では電子供与
体となる試薬１から標的物質３を介して電子受容体とな
る試薬２まで矢印方向に電荷移動が行われる。図２の反
応系は、相互作用を起す試薬４、５に加えて、反応経路
中で電荷移動を媒体する試薬６、７が更に追加されいる
もので、矢印方向に電荷の移動が行われる。図示した場
合を例にとれば、試薬１、２、４〜７の少なくとも１つ
にピリリウム系化合物が使用される。なお、試薬の数は
少なくとも２種とされるが、検出における操作効率や検
出感度などを考慮してその数を設定することができる。
試薬６、７はいわゆるメディエーターまたはセンシタイ
ザー等として機能するものが利用できる。更に、図２で
示される反応経路の各反応物質間、例えば試薬４と６の
間、試薬６と標的物質３の間などに、反応を仲介する１
以上の物質が必要に応じて更に関与しても良い。従っ
て、ピリリウム系化合物は、相互作用の反応経路を構成
する試薬の少なくとも１つとして利用され、その利用す
る反応系での役割に応じた機能を有するものが選択さ
れ、例えば電子供与体、電子受容体、メディエーターま
たはセンシタイザー等として利用される。FIGS. 1 and 2 schematically show a model of a reaction system which causes an interaction used in the present invention, taking the case of charge transfer as an example. The one shown in FIG. 1 is the simplest reaction system composed of two reagents 1 and 2 that interact with a target substance 3 (nucleic acid double-helix structure). In this reaction system, the reagent 1 which serves as an electron donor. Through the target substance 3 to the reagent 2 serving as an electron acceptor in the arrow direction. In the reaction system of FIG. 2, in addition to reagents 4 and 5 that cause interaction, reagents 6 and 7 that mediate charge transfer in the reaction path are further added, and charges are transferred in the arrow direction. Taking the illustrated case as an example, a pyrylium compound is used for at least one of the reagents 1, 2, 4 to 7. The number of reagents is at least two, but the number can be set in consideration of the operation efficiency and detection sensitivity in detection.
As the reagents 6 and 7, those functioning as so-called mediators or sensitizers can be used. In addition, the reaction mediation is performed between the respective reaction substances in the reaction path shown in FIG. 2, for example, between the reagents 4 and 6, or between the reagent 6 and the target substance 3.
The above substances may be further involved as necessary. Therefore, the pyrylium compound is used as at least one of the reagents constituting the reaction pathway of the interaction, and one having a function depending on the role in the reaction system to be used is selected, for example, an electron donor, an electron acceptor. It is used as a body, mediator or sensitizer.
【００２５】二重らせん構造と直接反応させる目的で使
用する試薬、例えば図１及び２の試薬１、２、６、７は
これが二重らせん構造と特異的に結合するインターカレ
ーター等としての性質を有するものが好ましい。この場
合の試薬としては、例えば、二重らせん構造を構成して
いる核酸等の物質と反応して、それ自身が、あるいは核
酸の構成成分側が化学変化や構造的変異を起すことで、
あるいは反応系に加えた第３の物質と二重らせん構造の
存在下で反応して変化を起すことで検出可能な相互作用
に基づく変化を引き起こすものが利用できる。Reagents used for the purpose of directly reacting with the double helix structure, for example, Reagents 1, 2, 6, and 7 in FIGS. 1 and 2 have the property as an intercalator that specifically binds to the double helix structure. Those having are preferred. As the reagent in this case, for example, by reacting with a substance such as a nucleic acid that constitutes a double-helix structure to cause a chemical change or structural mutation on its own or on the component side of the nucleic acid,
Alternatively, a substance that reacts with a third substance added to the reaction system in the presence of a double helix structure to cause a change and thereby causes a change based on a detectable interaction can be used.
【００２６】この直接反応としては、例えば、二重らせ
ん構造をとる核酸の構成成分と試薬物質との間の電荷移
動あるいはエネルギー移動を引き起す反応などが利用で
きる。電荷移動を利用する場合には、試薬物質として
は、二重らせん構造特異的に挿入され核酸の構成成分に
対して電子供与体または電子受容体となり得る物質が利
用される。As the direct reaction, for example, a reaction which causes a charge transfer or an energy transfer between a component of a nucleic acid having a double helix structure and a reagent substance can be used. When charge transfer is used, the reagent substance used is a substance that can be inserted into the double-helix structure in a specific manner to serve as an electron donor or an electron acceptor with respect to the components of the nucleic acid.
【００２７】この電荷移動に基づく反応としては、いわ
ゆるｔｈｒｏｕｇｈ ｓｐａｃｅの場合と、ｔｈｒｏｕ
ｇｈ ｂｏｎｄの場合とが考えられる。前者の場合に
は、例えば、核酸塩基対のスタッキングを介して電子供
与体と電子受容体が相互作用するような場合と、二重ら
せん構造への変化に伴う電子供与体と電子受容体の近接
効果に基づくような場合とが含まれる。後者（ｔｈｏｕ
ｇｈ ｂｏｎｄ）では核酸を構成する塩基、リン酸部
分、或は、糖の部分をも含めた電荷の移動が考えられ
る。いずれの場合もこの直接反応が、二重らせんを形成
したことに由来するものであればその形態はなんら限定
されない。Reactions based on this charge transfer include so-called through space and through.
The case of gh bond is considered. In the former case, for example, the electron donor and the electron acceptor interact through the stacking of nucleobase pairs, and the proximity of the electron donor and the electron acceptor accompanying the change to the double helix structure. Cases based on effects are included. The latter (thou
In gh bond), the transfer of charges including the base, the phosphate moiety or the sugar moiety constituting the nucleic acid is considered. In any case, the form is not limited as long as the direct reaction is derived from the formation of a double helix.
【００２８】核酸塩基対間のスタッキングを介する場合
とは、二重らせん構造と反応できる位置に置かれた電子
供与体と電子受容体（例えば図１の試薬１、２）の距離
が本来相互作用できないほど離れている時、電子供与体
から放出された電子が、核酸塩基対上に広がる電子雲を
介して、電子を次々隣接する核酸塩基対に受け渡され、
最終的に電子受容体にまで電子を到達させるというもの
である。また、逆に、電子受容体が核酸塩基対から電子
を引き抜き、それが連鎖的に行われて最終的に電子供与
体から電子が奪い取られるという機構も成り立つ。つま
り、電荷移動におけるメディエーターが、核酸塩基対と
いうことになる。In the case of via stacking between nucleobase pairs, the distance between the electron donor and the electron acceptor (for example, the reagents 1 and 2 in FIG. 1) placed at a position capable of reacting with the double helix structure essentially interacts. When the electrons are far enough apart, the electrons emitted from the electron donor are transferred to the adjacent nucleobase pairs one after another through the electron cloud spreading over the nucleobase pairs.
Eventually, the electrons reach the electron acceptor. On the contrary, a mechanism is also established in which the electron acceptor pulls out an electron from the nucleic acid base pair, which is carried out in a chained manner, and finally the electron is taken from the electron donor. In other words, the mediator in charge transfer is nucleic acid base pair.
【００２９】これに対し、電子供与体と電子受容体の近
接効果に基づく場合とは、二重らせん構造の形成によっ
て電子供与体と電子受容体の距離がこれらの相互作用が
可能な程度に近くなる場合である。例えば、電子供与体
と電子受容体の両方が存在しても、溶液中でこれらの化
合物の距離が十分に離れているような一本鎖の状態のと
きには、これらが相互作用を起さず、標的核酸とハイブ
リダイズして二重らせん構造を形成して電子供与体と電
子受容体が近接した場合に、これらの相互作用が生じる
ように設定すれば、二重らせん構造の形成をこれらの相
互作用が生じたかどうかによって検出できる。なお、二
重らせん構造と試薬物質での電荷移動が起りにくい場合
には、先に述べたように、これらの間に電荷移動を仲介
するようなメディエーター、あるいはセンシタイザーと
称させる物質を介在させてもよい。On the other hand, in the case of being based on the proximity effect of the electron donor and the electron acceptor, the distance between the electron donor and the electron acceptor is close enough to allow the interaction between them due to the formation of the double helix structure. That is the case. For example, even if both an electron donor and an electron acceptor are present, when they are in a single-stranded state where the distance between these compounds is sufficiently large in solution, they do not interact with each other, The formation of a double helix structure can be controlled by the interaction of the electron donor and the electron acceptor when they hybridize with the target nucleic acid to form a double helix structure and the electron donor and the electron acceptor are brought into close proximity to each other. It can be detected depending on whether an action has occurred. When charge transfer between the double-helix structure and the reagent substance is difficult to occur, a mediator that mediates charge transfer, or a substance called a sensitizer, is interposed between them as described above. May be.
【００３０】このように二重らせん構造と反応する位置
に用いる試薬には、これが二重らせん構造と反応できる
位置に配置されて、これらの反応が生じる必要がある。
このような試薬が二重らせん構造と反応可能な位置に配
置される方式としては、インターカレーターのように核
酸塩基対の間に入り込む場合、二重らせん構造の溝に埋
め込まれる場合、更に、二重らせん構造に寄り添う形で
配置される場合等が利用できる。いずれの場合も、ハイ
ブリッド体の二重らせん構造に試薬が特異的に配置され
ることが本発明にとって本質的に必要なことである。As described above, the reagent used at the position where it reacts with the double helix structure needs to be placed at a position where it can react with the double helix structure to cause these reactions.
As a method of arranging such a reagent at a position where it can react with a double helix structure, when it enters between nucleobase pairs like an intercalator, when it is embedded in the groove of a double helix structure, It can be used when it is arranged so as to be close to the heavy spiral structure. In either case, it is essential for the present invention that the reagent be specifically located in the double helix structure of the hybrid.
【００３１】これらの中では、インターカレーターは、
スタッキングを介する電荷移動を利用する場合に最も有
利である。つまり、インターカレーターは、一般には、
電子の広がりを持つ平面状の化合物で、核酸塩基対の積
み重なりの延長線上に、核酸塩基対間の距離と同じよう
な距離で、核酸塩基対と平行な位置に配向する。例え
ば、電子供与体としてインターカレーターを用い、二重
らせん構造の反対側に電子受容体を配置すれば、電子供
与体から放出された電子が、隣接する核酸塩基対に送ら
れ、それがそれぞれの核酸塩基対の電子雲を経由して、
一直線に電子受容体に向って流れ得る。あるいは、この
逆に、電子受容体としてインターカレーターを用い、二
重らせんを挟んだ反対側に電子受容体を配置すれば、電
子受容体上の電子孔により隣接する核酸塩基対から電子
を引き抜き、この電子の引抜きが他の核酸塩基対間に次
々と生じて最終的に電子供与体から電子を引き抜き、電
荷移動が行われる場合もある。これらの点を考慮する
と、スタッキングを介する電荷移動の場合には、電子供
与体、電子受容体のうち、少なくともひとつがインター
カレーターであることが好ましく、両者が共にインター
カレーターである場合には、さらに電荷移動効率を上げ
ることが可能であるのでより好ましい。インターカレー
ターは二重らせん構造を安定化させ、その融解温度を上
昇させることが知られており、電子供与体や電子受容体
がインターカレーターであることは、プローブと標的核
酸間のハイブリッド体を安定化させるという点でも有利
である。Among these, the intercalator is
Most advantageous when utilizing charge transfer via stacking. So the intercalator is generally
It is a planar compound having an electron spread, and is oriented in a position parallel to the nucleic acid base pairs at the same distance as the distance between the nucleic acid base pairs on the extension line of the stacking of the nucleic acid base pairs. For example, if an intercalator is used as an electron donor and an electron acceptor is placed on the opposite side of the double helix structure, the electron released from the electron donor is sent to an adjacent nucleobase pair, which then Via the electron cloud of nucleobase pairs,
It can flow in a straight line towards the electron acceptor. Alternatively, on the contrary, if an intercalator is used as an electron acceptor and the electron acceptor is arranged on the opposite side across the double helix, an electron is drawn from an adjacent nucleic acid base pair by an electron hole on the electron acceptor, In some cases, this electron withdrawal occurs between other nucleic acid base pairs one after another, and finally the electron is withdrawn from the electron donor, and charge transfer is performed. Considering these points, in the case of charge transfer through stacking, at least one of an electron donor and an electron acceptor is preferably an intercalator, and when both are intercalators, further, It is more preferable because the charge transfer efficiency can be increased. Intercalators are known to stabilize the double-helix structure and increase its melting temperature, and the fact that electron donors and electron acceptors are intercalators stabilizes the hybrid between the probe and target nucleic acid. It is also advantageous in that it is made into a material.
【００３２】本発明においては、標的物質を介した相互
作用に基づいた変化を測定することで標的物質の検出が
行われる。この変化は、標的物質及びその検出に用いら
れる試薬から構成される相互作用を起す反応系の種類に
より異なり、その変化の検出方法も反応系の構成によっ
て個々に異なる。例えば、相互作用を行う試薬（例えば
図１及び２の試薬１、２、４、５）に電荷移動に基づく
相互作用を行うものを用いた場合、二重らせん構造を介
したこれら試薬の相互作用を電子受容体側の変化として
とらえて、その変化に適した手段で測定することができ
る。例えば、電荷移動吸収帯のように、新しい吸収スペ
クトルの出現、あるいは、変化としてとらえることがで
きる。また、電荷移動の結果溶液が着色あるいは変色す
るような系は、直接その変化を目でとらえることがで
き、簡便な系として、さらに有効である。蛍光やリン光
のような発光系も利用できる。この場合、蛍光やリン光
が新たに生じる反応や、発光していたものが相互作用の
結果消失する反応を利用できる。また、電子受容体が電
子移動の結果、別の物質に化学変化し、それを検出する
という方法も利用できる。この時、変化した物質に、後
から第３の物質を加え、両者の化学反応により化学発光
を起し検出することも可能である。第３の物質として酵
素や抗体のような蛋白質を利用する場合には生物発光に
よる検出方法が利用できる。また、標的物質自体が検出
可能な変化を起す場合は、これを検出することができ
る。In the present invention, the target substance is detected by measuring the change based on the interaction via the target substance. This change differs depending on the type of reaction system that causes an interaction and is composed of the target substance and the reagent used for its detection, and the method of detecting the change also differs depending on the configuration of the reaction system. For example, when reagents that interact with each other (for example, reagents 1, 2, 4, and 5 in FIGS. 1 and 2) that interact with each other based on charge transfer are used, the interaction of these reagents through the double helix structure is used. Can be regarded as a change on the electron acceptor side, and can be measured by a means suitable for the change. For example, like a charge transfer absorption band, it can be considered as the appearance or change of a new absorption spectrum. Further, a system in which the solution is colored or discolored as a result of charge transfer can be directly observed by the eye, and is more effective as a simple system. A light emitting system such as fluorescence or phosphorescence can also be used. In this case, it is possible to use a reaction in which fluorescence or phosphorescence is newly generated or a reaction in which a light-emitting substance disappears as a result of an interaction. In addition, a method in which an electron acceptor chemically changes to another substance as a result of electron transfer and is detected can also be used. At this time, it is also possible to add a third substance to the changed substance afterwards and cause chemiluminescence due to a chemical reaction between the two substances for detection. When a protein such as an enzyme or an antibody is used as the third substance, a bioluminescence detection method can be used. Moreover, when the target substance itself causes a detectable change, this can be detected.
【００３３】検出方法として、電子受容体の変化の他
に、電子供与体側での変化で反応を検出しても良い。そ
して、それは基本的には、電子受容体の場合に用いられ
る方法のほとんどがそのまま適応できる。蛍光物質を電
子供与体して用いる場合には、電荷移動に伴って蛍光の
量子収率が減少するものを用いて、蛍光消失のような直
接の変化を検出することもできるし、生じた変化をさら
にいくつかの反応と組み合せて可視化する方法も利用で
きる。As a detection method, the reaction may be detected by a change on the electron donor side in addition to the change on the electron acceptor. And, basically, most of the methods used in the case of electron acceptors can be directly applied. When a fluorescent substance is used as an electron donor, it is possible to detect a direct change such as the disappearance of fluorescence by using a substance in which the quantum yield of fluorescence decreases with the charge transfer. Can be used in combination with several reactions for visualization.
【００３４】このように、本発明において検出される相
互作用に基づく変化は、相互作用を起す反応系を構成す
る各試薬や標的物質のいずれにおける変化であっても良
く、その変化を直接あるいは、他の検出用の試薬を用い
て間接的に測定してもよい。As described above, the change based on the interaction detected in the present invention may be a change in each reagent or target substance constituting the reaction system causing the interaction, and the change may be directly or directly. The measurement may be performed indirectly using another detection reagent.
【００３５】一方、本発明では、電子供与体が光によっ
て活性化されて電子を放出して電荷移動が開始されるも
のでもよく、更に、第３の物質として、電子供与体を刺
激して電子を発生させるような物質が存在してもよい。
さらに、電子受容体の方を活性化して、それに誘起され
て電子が電子供与体から引き抜かれてもよい。そして、
その開始剤としては、電子供与体の時と同様、光の他、
なんらかの開始剤であってもよい。On the other hand, in the present invention, the electron donor may be activated by light to emit electrons to start charge transfer, and further, as the third substance, the electron donor may be stimulated to emit electrons. There may be a substance that produces
Further, the electron acceptor may be activated and the electron may be extracted from the electron donor by being activated. And
As the initiator, in addition to light, as in the case of the electron donor,
It can be any initiator.
【００３６】また、先に述べたように、電子供与体、電
子受容体の他に、第３の物質として、電荷移動を仲介す
るようなメディエーター、あるいはセンシタイザーと称
させる物質が仲介してもよい。そして、これらの物質が
二重らせんと相互作用し、直接二重らせんとは結合して
いない電子供与体、電子受容体に電荷移動を促しても良
い。Further, as described above, in addition to the electron donor and the electron acceptor, as a third substance, a mediator that mediates charge transfer or a substance called a sensitizer intervenes. Good. Then, these substances may interact with the double helix to promote charge transfer to the electron donor and electron acceptor which are not directly bound to the double helix.
【００３７】プローブ核酸とのハイブリダイゼーション
による標的核酸の検出の場合には、相互作用に基づく変
化は、例えば、所望のハイブリッド体形成前後における
試薬を構成するピリリウム系化合物やピリリウム系化合
物以外の化合物、あるいは標的物質である核酸の構成成
分の化学構造や特性の変化、電子状態の変化、或いはま
た、この相互作用により変化した物質に由来する信号の
変化として測定、検出される。In the case of detecting a target nucleic acid by hybridization with a probe nucleic acid, a change due to the interaction may be, for example, a pyrylium compound or a compound other than the pyrylium compound which constitutes the reagent before and after formation of a desired hybrid, Alternatively, it is measured and detected as a change in the chemical structure or property of the constituent component of the nucleic acid that is the target substance, a change in the electronic state, or a change in the signal derived from the substance changed by this interaction.
【００３８】電子供与体と電子受容体を用いる形態とし
ては、例えば以下のものを挙げることができる。 （ｉ）これらの両方を、プローブと標的核酸とのハイブ
リダイゼーションによる二重らせん構造の形成時に反応
系に存在させる。 （ｉｉ）これらの両方を、プローブと標的核酸とのハイ
ブリダイゼーションによる二重らせん構造の形成後に反
応系に添加する。 （ｉｉｉ）これらの一方を、プローブと標的核酸とのハ
イブリダイゼーションによる二重らせん構造の形成時に
反応系に存在させておき、その後に他方を添加する。Examples of the form using the electron donor and the electron acceptor include the following. (I) Both of them are present in the reaction system when the double helix structure is formed by the hybridization of the probe and the target nucleic acid. (Ii) Both of them are added to the reaction system after the double helix structure is formed by the hybridization of the probe and the target nucleic acid. (Iii) One of these is allowed to exist in the reaction system when the double helix structure is formed by the hybridization of the probe and the target nucleic acid, and then the other is added.
【００３９】相互作用としてエネルギー移動を利用する
場合には試薬には、少なくともエネルギー供与体とエネ
ルギー受容体のセットが含まれる。そして、両者の相互
作用は、例えばハイブリッド体形成前後におけるエネル
ギー受容体、エネルギー供与体、または、これらの物質
と相互作用しうる第３の物質の化学構造の変化、電子状
態の変化、あるいはまた、変化した物質に由来する信号
の変化として検出される。例えば、エネルギー供与体の
蛍光強度の減少、エネルギー受容体の蛍光強度の増大に
よりハイブリッド体を検出することができる。このよう
な場合には、ハイブリッド体の二本鎖部分にエネルギー
供与体とエネルギー受容体がインターカレート等の様式
により入り込み、溶液中の場合に比べて両者が近接し、
相互作用が可能になってエネルギー移動が起こると考え
られる。When utilizing energy transfer as an interaction, the reagent contains at least a set of energy donor and energy acceptor. The interaction between the two includes, for example, a change in the chemical structure of the energy acceptor, the energy donor, or the third substance capable of interacting with these substances before and after the formation of the hybrid, a change in the electronic state, or, It is detected as a change in the signal derived from the changed substance. For example, the hybrid can be detected by decreasing the fluorescence intensity of the energy donor and increasing the fluorescence intensity of the energy acceptor. In such a case, the energy donor and the energy acceptor enter the double-stranded portion of the hybrid by a mode such as intercalation, and the two are closer than in the solution,
It is considered that the interaction becomes possible and energy transfer occurs.
【００４０】エネルギー供与体、エネルギー受容体を用
いる様式としては、電子供与体、電子受容体と同様な
（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の様式がそのまま利用
できる。エネルギー移動開始剤としては主に光が利用さ
れる。As the mode using the energy donor and the energy acceptor, the same modes (i), (ii) and (iii) as those for the electron donor and the electron acceptor can be used as they are. Light is mainly used as the energy transfer initiator.
【００４１】ハイブリダイゼーションによる標的核酸の
検出に本発明の方法を利用する場合のプローブの長さ
は、標的核酸との良好なハイブリダイゼーションが可能
で、安定した二重らせん構造が得られる長さが個々のケ
ースにおいて適宜選択される。電子供与体、あるいは電
子受容体、またはエネルギー供与体、あるいはエネルギ
ー受容体等としての試薬（例えば図１、２における試薬
１、２、６、７）が核酸塩基と直接相互作用するために
必要な安定した二重らせん構造が可能な長さであれば良
く、その長さは、例えば、８塩基以上、好ましくは１２
塩基以上とされる。When the method of the present invention is used for detection of a target nucleic acid by hybridization, the length of the probe is such that good hybridization with the target nucleic acid is possible and a stable double helix structure is obtained. It is appropriately selected in each case. An electron donor, an electron acceptor, an energy donor, or a reagent as an energy acceptor (eg, reagents 1, 2, 6, and 7 in FIGS. 1 and 2) is necessary for direct interaction with a nucleobase. Any length is possible as long as a stable double helix structure is possible, and the length is, for example, 8 bases or more, preferably 12 bases.
More than base.
【００４２】しかしながら、二重らせん構造の安定化に
は、プローブ長の他に、塩基配列自体、反応系の塩濃度
やイオン強度も大きく影響する。Ｇ−Ｃ塩基対は、Ａ−
Ｔ塩基対よりも水素結合数が多いため、ＧＣが多い配列
ではより安定な二重らせん構造が形成される。また、Ｋ
Ｃｌのモル濃度を０．０１Ｍから１Ｍに上昇させるとＤ
ＮＡの融点温度は３０℃上昇するといわれている。ま
た、インターカレーターの存在も安定に大きく寄与す
る。従って、これらの安定化因子を適宜利用することに
よって、８塩基長未満のプローブを用いることも可能で
ある。However, in addition to the probe length, the base sequence itself, the salt concentration and the ionic strength of the reaction system greatly influence the stabilization of the double helix structure. G-C base pairs are A-
Due to the higher number of hydrogen bonds than T base pairs, a more stable double helix structure is formed in sequences with a high GC. Also, K
When the molar concentration of Cl is increased from 0.01M to 1M, D
The melting point temperature of NA is said to rise by 30 ° C. The presence of the intercalator also greatly contributes to stability. Therefore, a probe having a length of less than 8 bases can be used by appropriately using these stabilizing factors.
【００４３】また、電子供与体、電子受容体、あるいは
エネルギー供与体、エネルギー受容体の性質もプローブ
選定上考慮しなければならない因子である。これらの試
薬物質が二重らせんのどの配列にも同じ確立で入り込む
という保証はない。Ｇ−Ｃ塩基対を好むものと、Ａ−Ｔ
塩基対を好むもの等それぞれの試薬によりその性質は異
なる。したがって、プローブの配列選定にはプローブと
標的核酸とで構成される二重らせんの安定性のほかに、
このような試薬の性質を加味することが重要である。The properties of the electron donor, the electron acceptor, the energy donor, and the energy acceptor are also factors to be considered in selecting the probe. There is no guarantee that these reagent substances will enter the same sequence in any sequence of the double helix. Those who prefer G-C base pairs and AT
The properties differ depending on each reagent such as those that prefer base pairs. Therefore, in addition to the stability of the double helix composed of the probe and the target nucleic acid,
It is important to consider the properties of such reagents.
【００４４】電子供与体と電子受容体の相互作用に基づ
く変化は、不可逆的なものであることが好ましい。すな
わち、検出に供せられる電子供与体、あるいは、電子受
容体が不可逆的に変化するものであれば、変化を蓄積し
て検出することも可能であり、その場合感度の点で有利
である。The change based on the interaction between the electron donor and the electron acceptor is preferably irreversible. That is, if the electron donor or the electron acceptor used for detection changes irreversibly, the change can be accumulated and detected, which is advantageous in terms of sensitivity.
【００４５】本発明に用いられるピリリウム系化合物と
しては、例えば、下記一般式［Ｉ］で表わされる化合物
を用いることができる。As the pyrylium compound used in the present invention, for example, a compound represented by the following general formula [I] can be used.
【００４６】[0046]
【化３】 上記一般式［Ｉ］において、[Chemical 3] In the above general formula [I],
【００４７】[0047]
【化４】 は、複素環を示し、ＸはＯ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅであ
る。該複素環としては、ピリリウム環もしくはピリリウ
ム類似環のような５員環及び６員環のものを挙げること
ができる。[Chemical 4] Represents a heterocycle, and X is O, S, Se or Te. Examples of the heterocycle include 5- and 6-membered rings such as a pyrylium ring and a pyrylium-like ring.
【００４８】Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して水素原
子、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリ
ル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シ
アノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もし
くは未置換アリール基、置換もしくは未置換低級アルア
ルキル基または置換もしくは未置換シクロアルキル基を
示す。R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, halogen atom, sulfonate group, amino group, styryl group, nitro group, hydroxyl group, carboxyl group, cyano group, substituted or unsubstituted lower alkyl group, substituted Alternatively, it represents an unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted lower aralkyl group, or a substituted or unsubstituted cycloalkyl group.
【００４９】Ｒ3は、−Ａまたは−Ｌ−Ａである。Ｌ
は、−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−Ｌ 4−Ｌ5−Ｌ6−で
あり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝ＣＨ）
−、置換もしくは未置換アリール基から誘導される２価
の基、置換もしくは未置換低級アルキレン基または−Ｃ
Ｈ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ基を有する環構造を示す）を表
わす。置換もしくは未置換アリール基から誘導される２
価の基としては、例えばフェニレン基等を挙げることが
でき、オルト、メタ、パラのいずれの位置で結合するも
のでもよい。低級アルキレン基としては、炭素数が１〜
４の直鎖状もしくは分岐状のアルキレン基を挙げること
ができ、その置換基としては、例えば−Ｌ−Ａで示され
る基を挙げることができる。オキソ基を有する環構造と
しては、複素環、芳香環、脂肪族環等で少なくともオキ
ソ基を有するものを挙げることができる。R3Is -A or -LA. L
Is -L1-, -L2-L3-Or-L Four-LFive-L6-In
Yes, L1~ L6Are each independently-(CH = CH)
-, Divalent derived from a substituted or unsubstituted aryl group
Group, a substituted or unsubstituted lower alkylene group or -C
H = RFour-(RFourRepresents a ring structure having an oxo group)
Forget 2 derived from a substituted or unsubstituted aryl group
Examples of the valent group include a phenylene group and the like.
Yes, it can be attached at any of the ortho, meta, or para
May be The lower alkylene group has a carbon number of 1 to
To list 4 straight or branched alkylene groups
And a substituent thereof is, for example, represented by -LA.
Groups may be mentioned. Ring structure with oxo group
A heterocyclic ring, an aromatic ring, an aliphatic ring, etc.
Examples thereof include those having a so group.
【００５０】−Ｌ−としては、下記一般式［ＩＩ］、
［ＩＩＩ］、［ＩＶ］、［Ｖ］または［ＶＩ］で表わさ
れる基を好ましいものとして挙げることができる。As -L-, the following general formula [II],
The groups represented by [III], [IV], [V] or [VI] can be mentioned as preferable ones.
【００５１】[0051]
【化５】 （上記一般式［ＩＩ］中、Ｚは水素原子または置換もし
くは未置換低級アルキル基を表し、ｎは０、１または２
である。）なお、Ｚがアルキル基である場合のその置換
基としては、例えば上述の−Ｌ−Ａで定義される基を挙
げることができる。[Chemical 5] (In the above general formula [II], Z represents a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted lower alkyl group, and n is 0, 1 or 2
Is. In addition, as the substituent when Z is an alkyl group, the group defined by the above-mentioned -LA can be mentioned, for example.
【００５２】[0052]
【化６】 （上記一般式［ＩＩＩ］中、ｎは０、１または２であ
り、Φは置換もしくは未置換ｏ−、ｍ−またはｐ−フェ
ニレン基を表わす。）[Chemical 6] (In the above general formula [III], n is 0, 1 or 2, and Φ represents a substituted or unsubstituted o-, m- or p-phenylene group.)
【００５３】[0053]
【化７】 （上記一般式［ＩＶ］中、Φは置換もしくは未置換ｏ
−、ｍ−またはｐ−フェニレン基を表わす。）[Chemical 7] (In the above general formula [IV], Φ is a substituted or unsubstituted o
Represents a-, m- or p-phenylene group. )
【００５４】[0054]
【化８】 [Chemical 8]
【００５５】[0055]
【化９】 上記一般式中のフェニレン基の置換基としては先に例示
したものを挙げることができる。[Chemical 9] As the substituent of the phenylene group in the above general formula, those exemplified above can be mentioned.
【００５６】一般式［Ｉ］のＲ3におけるＡは、置換も
しくは未置換アリール基、−ＣＨ＝Ｒ5（Ｒ5は、置換も
しくは未置換複素環、置換もしくは未置換のシクロアル
キル基または置換もしくは未置換芳香環を示す）を表わ
す。Ｒ5の複素環としては、A in R 3 of the general formula [I] is a substituted or unsubstituted aryl group, —CH═R 5 (R 5 is a substituted or unsubstituted heterocycle, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group or a substituted or unsubstituted Represents an unsubstituted aromatic ring). As the heterocycle of R 5 ,
【００５７】[0057]
【化１０】 （Ｍ及びＮは、それぞれ独立して酸素原子、イオウ原子
または窒素原子を、Ｙ-はアニオンを表わす）等から誘
導された基を挙げることができ、その置換基としては、
例えば、置換もしくは未置換アリール基などを挙げるこ
とができる。また、置換もしくは未置換シクロアルキル
基とは、飽和のものでも、不飽和のものでもよく、例え
ば[Chemical 10] (M and N each independently represent an oxygen atom, a sulfur atom or a nitrogen atom, and Y − represents an anion) and the like.
For example, a substituted or unsubstituted aryl group etc. can be mentioned. The substituted or unsubstituted cycloalkyl group may be saturated or unsaturated, for example,
【００５８】[0058]
【化１１】 等の共鳴系を構成し得るものから誘導された基を挙げる
ことができる。また、置換もしくは未置換芳香環として
はアズレン環を挙げることができる。これらの基の置換
基としては低級アルキル基、置換もしくは未置換アリー
ル基等を挙げることができる。[Chemical 11] Groups derived from those capable of forming a resonance system such as Moreover, an azulene ring can be mentioned as a substituted or unsubstituted aromatic ring. Examples of the substituent of these groups include a lower alkyl group and a substituted or unsubstituted aryl group.
【００５９】Ｘを含むピリリウム環もしくはその類似環
のＲ1、Ｒ2、Ｒ3が結合していない炭素原子に結合して
いる水素原子は、ハロゲン原子、スルホネート基、アミ
ノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロシル基、カルボキ
シル基、シアノ基、置換もしくは未置換低級アルキル
基、置換もしくは未置換アリール基または置換もしくは
未置換低級アルアルキル基で置換されていても良い。The hydrogen atom bonded to the carbon atom to which R 1 , R 2 and R 3 of the pyrylium ring containing X or its analogous ring is not bonded is a halogen atom, a sulfonate group, an amino group, a styryl group or a nitro group. It may be substituted with a group, a hydrosil group, a carboxyl group, a cyano group, a substituted or unsubstituted lower alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group or a substituted or unsubstituted lower aralkyl group.
【００６０】Ｙ-はアニオンを示し、該アニオンとして
は、例えばＢＦ4 -、過塩素酸イオン、ＨＯ3ＳＣＨ2ＣＯ
Ｏ-、あるいは塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオ
ン、フッ素イオン等のハロゲンイオン、又は、脂肪族炭
化水素や芳香族スルホネート等のようなアニオン機能を
有する化合物、更には、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｃ
ｏ、Ｐｄ等の遷移金属の錯体イオンなどを挙げることが
できる。Y − represents an anion, and examples of the anion include BF 4 − , perchlorate ion, HO 3 SCH 2 CO
O − , or halogen ion such as chlorine ion, bromine ion, iodine ion, or fluorine ion, or a compound having an anion function such as aliphatic hydrocarbon or aromatic sulfonate, and further Zn, Ni, Cu, Pt , C
Examples thereof include complex ions of transition metals such as o and Pd.
【００６１】以上挙げた各種の置換基に更に置換される
基がハロゲン原子の場合には、該ハロゲン原子として
は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等を挙げることができる。また、低
級アルキル基は、直鎖状でも分岐状のものでもよく、そ
の炭素数としては１〜４程度のものが好ましい。When the group further substituted by the various substituents mentioned above is a halogen atom, examples of the halogen atom include Cl, Br and I. The lower alkyl group may be linear or branched, and the carbon number thereof is preferably about 1 to 4.
【００６２】一般式［Ｉ］の化合物の中では、Ｘを含む
複素環が、置換もしくは未置換アリール基の２以上で置
換されたものが好ましい。例えばＸを含む複素環が６員
環の場合のそのような化合物としては、（１）Ｘを含む
６員環の２位と４位が置換もしくは未置換アリール基で
置換され、３位、５位及び６位のいずれかがＲ3で置換
されているもの、（２）該６員環の３位と５位が置換も
しくは未置換アリール基で置換され、２位、４位及６位
のいずれかがＲ3で置換されているもの、（３）該６員
環の２位と６位が置換もしくは未置換アリール基で置換
され、３位、４位及び５位のいずれかがＲ3で置換され
ているもの、などを挙げることができる。このような位
置に置換もしくは未置換アリール基を導入することは、
このピリリウム系化合物を核酸の二重らせん構造の検出
に利用する場合に核酸塩基対へのインターカレーターと
して良好な性質を得る上で好ましい。更に、Ｘを含む複
素環が、置換もしくは未置換アリール基の２以上に、こ
れらの置換位置が隣合わないように置換されたものがよ
り好ましい。Among the compounds of general formula [I], those in which the heterocycle containing X is substituted with two or more substituted or unsubstituted aryl groups are preferred. For example, when the heterocycle containing X is a 6-membered ring, such compounds include (1) the 2-position and 4-position of the 6-membered ring containing X are substituted with a substituted or unsubstituted aryl group, and the 3-position, 5 that one of the position and 6-position is substituted by R 3, (2) 3-position and 5-position of the 6-membered ring is substituted with a substituted or unsubstituted aryl group, 2-position, 4-position及6-position of One of which is substituted with R 3 , (3) the 2- and 6-positions of the 6-membered ring are substituted with a substituted or unsubstituted aryl group, and any of the 3-, 4- and 5-positions is R 3 And the like, and the like. Introducing a substituted or unsubstituted aryl group at such a position is
When this pyrylium compound is used for detecting the double helix structure of a nucleic acid, it is preferable for obtaining good properties as an intercalator for a nucleic acid base pair. Furthermore, it is more preferable that the heterocycle containing X is substituted with two or more of the substituted or unsubstituted aryl groups so that these substitution positions are not adjacent to each other.
【００６３】標的物質を介在した相互作用に基づく変化
を生じる反応系を構成し得る少なくとも２種の試薬の一
方または両方を一般式［Ｉ］の化合物から選択して利用
することができる。核酸の検出においては、一般式
［Ｉ］の化合物として、インターカレーターとして核酸
の二重らせん構造に挿入されるものが好ましい。One or both of at least two reagents capable of forming a reaction system which causes a change based on the interaction mediated by the target substance can be selected from the compounds of the general formula [I] and utilized. In the detection of nucleic acid, the compound of the general formula [I] is preferably one which is inserted into the double helix structure of the nucleic acid as an intercalator.
【００６４】電荷移動による変化を検出する場合におい
ては、例えば、一般式［Ｉ］の化合物の中で電子供与性
基を有するものが電子供与体として利用できる。そのよ
うな化合物としては、ピリリウム環またはピリリウム類
似環の置換基を構成するアリール基として、低級アルキ
ル基で置換されたアミノ基（低級アルキルアミノ基）等
で置換されたアリール基を有するもの等を挙げることが
でき、この低級アルキルアミノ基としては、ジメチルア
ミノ基、ジエチルアミノ基等がパラ位で置換しているも
のが好ましい。この置換アリール基は、ピリリウム環あ
るいはピリリウム類似環に直接置換されていてもよい
し、例えば低級アルキル基を置換して、低級アルアルキ
ル基を構成するものでもよい。この電子供与体として利
用できる化合物の一例を、後述の表１に示す。これらの
化合物の中では、特に２−メチル−４，６−ビス−（４
−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム塩、ま
たは２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアミノフェニル）チオピリリウム塩を好ましいものと
して挙げることができる。In the case of detecting the change due to charge transfer, for example, the compound having the electron-donating group among the compounds of the general formula [I] can be used as the electron donor. Examples of such a compound include those having an aryl group substituted with a lower alkyl group (lower alkylamino group) or the like as an aryl group constituting a substituent of the pyrylium ring or the pyrylium-like ring. As the lower alkylamino group, those in which a dimethylamino group, a diethylamino group and the like are substituted at the para position are preferable. This substituted aryl group may be directly substituted on the pyrylium ring or the pyrylium-like ring, or may be substituted with, for example, a lower alkyl group to form a lower aralkyl group. An example of the compound that can be used as the electron donor is shown in Table 1 below. Among these compounds, 2-methyl-4,6-bis- (4
Preferable one is -N, N-dimethylaminophenyl) pyrylium salt or 2-methyl-4,6-bis- (4-N, N-dimethylaminophenyl) thiopyrylium salt.
【００６５】表１の化合物に対して電子受容体となり得
る化合物としては、例えば後述の表２に示す化合物を挙
げることができる。Examples of the compound that can serve as an electron acceptor with respect to the compounds shown in Table 1 include the compounds shown in Table 2 below.
【００６６】しかしながら、表１の化合物が電子供与体
で、表２の化合物が電子受容体と規定されるものではな
い。電子供与体と電子受容体はそれぞれの酸化還元電位
等により相対的に決まるものであり、一義的には決めら
れない。したがって、例えば、表１の化合物群の中から
電子供与体と電子受容体の両方を、あるいは表２の化合
物群の中から電子供与体と電子受容体の両方が選ばれる
ことも十分に有り得る。更に、表１の化合物の性質を示
すピリリウム系化合物と他の試薬という組合せで電子供
与体と電子受容体のセットを、表２の性質を示すピリリ
ウム系化合物と他の試薬という組合せで電子供与体と電
子受容体のセットを設定することも可能である。However, the compounds in Table 1 are not defined as electron donors and the compounds in Table 2 are not defined as electron acceptors. The electron donor and the electron acceptor are relatively determined by their respective redox potentials, and cannot be uniquely determined. Therefore, for example, it is quite possible that both an electron donor and an electron acceptor are selected from the compound group of Table 1, or both an electron donor and an electron acceptor are selected from the compound group of Table 2. Furthermore, a set of an electron donor and an electron acceptor is formed by combining a pyrylium compound having the properties of the compound shown in Table 1 and another reagent, and an electron donor is prepared by combining a pyrylium compound having the properties of Table 2 and another reagent. It is also possible to set a set of and electron acceptors.
【００６７】エネルギー移動の場合は、エネルギー供与
体とエネルギー受容体のエネルギーレベルが近いことが
最も重要である。両者が標的物質、例えば核酸二重らせ
ん構造に挿入される結果、エネルギー供与体とエネルギ
ー受容体が近接することがエネルギー移動を引き起こす
と考えられる。例えば、表１のピリリウム系化合物のな
かで二本鎖核酸に挿入された時に蛍光強度が高くなり、
励起状態が安定であると考えられるものはエネルギー供
与体として利用可能である。それぞれの蛍光エネルギー
レベルにあったエネルギー受容体を選ぶことが好まし
い。また、エネルギー移動の場合も電荷移動の場合と同
様、エネルギー供与体とエネルギー受容体の両方をピリ
リウム系化合物から選んでもよいし、ピリリウム系化合
物とピリリウム系化合物以外の試薬物質のセットを選ぶ
こともできる。In the case of energy transfer, it is most important that the energy levels of the energy donor and energy acceptor are close. As a result of both being inserted into a target substance, for example, a nucleic acid double helix structure, it is considered that the proximity of the energy donor and the energy acceptor causes energy transfer. For example, among the pyrylium compounds shown in Table 1, the fluorescence intensity increases when the compound is inserted into a double-stranded nucleic acid,
Those whose excited state is considered to be stable can be used as an energy donor. It is preferable to select an energy acceptor suitable for each fluorescence energy level. Also in the case of energy transfer, as in the case of charge transfer, both the energy donor and the energy acceptor may be selected from the pyrylium compounds, or a set of the pyrilium compound and the reagent substance other than the pyrylium compound may be selected. it can.
【００６８】ピリリウム系化合物以外のものを試薬とし
て用いる場合、本発明で目的とする検出が行えるもので
あれば特に制限なく利用できるが、電荷移動を利用する
場合の電子受容体としては、例えばスピンラベル化剤と
しての、４，４−ジメチルオキサゾリジン−Ｎ−オキシ
ル（ＤＯＸＸＬ：4,4-Dimethyloxazolidine-N-oxyl）、
２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−Ｎ−オキシ
ル（ＰＲＯＸＬ：2,2,5,5-Tetramethylpyrrolidine-N-o
xyl）、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−Ｎ
−オキシル（2,2,6,6-Tetramethylpiperidine-N-oxyl）
及びこれらの誘導体などを挙げることができる。また、
リボフラビン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，７−ジアザピレ
ニウム イオン（N,N-Dimethyl-2,7-diazapyrenium io
n）及びこれらの誘導体も利用可能である。When a substance other than a pyrylium-based compound is used as a reagent, it can be used without particular limitation as long as the target detection of the present invention can be carried out. 4,4-dimethyloxazolidine-N-oxyl (DOXXL: 4,4-Dimethyloxazolidine-N-oxyl) as a labeling agent,
2,2,5,5-Tetramethylpyrrolidine-N-oxyl (PROXL: 2,2,5,5-Tetramethylpyrrolidine-No
xyl), 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N
-Oxyl (2,2,6,6-Tetramethylpiperidine-N-oxyl)
And derivatives thereof. Also,
Riboflavin, N, N-Dimethyl-2,7-diazapyrenium ion (N, N-Dimethyl-2,7-diazapyrenium io
n) and their derivatives are also available.
【００６９】電子供与体として利用できるピリリウム化
合物以外の化合物としては、例えば蛍光性インターカレ
ーターとしての、アクリジン、アントラセン、ピレン、
エチジウムブロマイド、プロフラビン、ポリフィリン、
チアゾールオレンジダイマー（ＴＯＴＯ）、オキサゾー
ルイエロー（ＹＯＹＯ）、４，６−ジアミノ−２−フェ
ニルインドール ジハイドロクロライド（ＤＡＰＩ：4,
6-Diamino-2-phenylindole dihydrochloride）、プロピ
ジウム アイオダイド（ＰＩ：Propidium iodide）等を
挙げることができる。Examples of compounds other than the pyrylium compound that can be used as the electron donor include, for example, acridine, anthracene, pyrene, as a fluorescent intercalator,
Ethidium bromide, proflavin, porphyrin,
Thiazole orange dimer (TOTO), oxazole yellow (YOYO), 4,6-diamino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI: 4,
6-Diamino-2-phenylindole dihydrochloride), propidium iodide (PI) and the like.
【００７０】また、一般的な試薬として用いられてい
る、シアニン、アズレン、ダンシル、フルオレセイン、
エオシン、ローダミン及びこれらの誘導体等の蛍光色素
も利用できる。Further, cyanine, azulene, dansyl, fluorescein, which are used as general reagents,
Fluorescent dyes such as eosin, rhodamine and their derivatives can also be used.
【００７１】以上挙げたピリリウム系化合物以外の化合
物も、電子供与体、電子受容体等として規定されるもの
ではなく、同時に用いられる他の試薬との相対的関係か
ら、例えば酸化還元電位等を相対的に評価して、電子供
与体、電子受容体、メディエーター、センシタイザー等
として適宜使用することができる。Compounds other than the above-mentioned pyrylium compounds are not defined as electron donors, electron acceptors, etc., but the redox potential and the like are determined from the relative relationship with other reagents used at the same time. It can be appropriately used as an electron donor, an electron acceptor, a mediator, a sensitizer, etc.
【００７２】[0072]
【実施例】以下参考例及び実施例により本発明を更に詳
細に説明する。 参考例１ 無水酢酸１００ｍｌと濃硫酸３０ｍｌとを冷却しながら
混合し、得られた混合液をウォーターバスで８０℃に保
ちながら３時間加温した。そこに無水酢酸２０ｍｌ、ｐ
−ジメチルアミノアセトフェノン３０ｍｌを室温下で加
え、その後４５℃に温度を上昇させて２４時間攪拌し反
応させた。この反応液に等量のエタノールを加え、冷却
し、更にヨウ化カリウム水溶液を加えると粗結晶が析出
した。この粗結晶を濾過により回収し、エタノール／エ
ーテルの混合系（容量比、１：４）で再結晶させて、２
−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミ
ノフェニル）ピリリウム アイオダイド（表１の化合物
１（ただしＹはＩである））の緑色の結晶を得た。 得られた化合物１（Ｙ：Ｉ）の分析結果 融点：２５４〜２５７℃ ＵＶ／可視（ＣＨ3ＣＮ ε×１０-4）λmax ：４４４
ｎｍ（２．４３）、５５０ｎｍ（８．２４） ＮＭＲ（1Ｈ、DMSO）δｐｐｍ：８．３７３７（１Ｈ、
ｓ）、８．２７２９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、
８．１７９５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、７．８８
６４（１Ｈ、ｓ）、６．９１１７（４Ｈ、ｔ、ＪAB＝Ｊ
BC＝９．７７）、３．１８２９（６Ｈ、ｓ）、３．１３
４０（６Ｈ、ｓ）、２．６８０９（３Ｈ、ｓ） ＦＡＢ ｍａｓｓ ｍ／ｚ ３３３ ＩＲ（ＫＢｒ）νｃｍ-1：１６４５、１６１０（ｓ
ｈ）、１５８０（ｓ）、１４９０（ｓ）、１２７０、１
２００、１１６０ 更に、ヨウ化カリウム水溶液の代わりに過塩素酸水溶液
を用いる以外は上記と同様にして２−メチル−４，６−
ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリ
ウムの過塩素酸塩（化合物１（Ｙ：ＣＩＯ4））を得
た。The present invention will be described in more detail with reference to the following Reference Examples and Examples. Reference Example 1 100 ml of acetic anhydride and 30 ml of concentrated sulfuric acid were mixed while being cooled, and the obtained mixed liquid was heated for 3 hours while being kept at 80 ° C. in a water bath. 20 ml of acetic anhydride, p
-Dimethylaminoacetophenone (30 ml) was added at room temperature, the temperature was then raised to 45 ° C, and the mixture was stirred for 24 hours for reaction. To this reaction solution, an equal amount of ethanol was added, cooled, and an aqueous potassium iodide solution was further added to precipitate crude crystals. The crude crystals were collected by filtration and recrystallized from a mixed system of ethanol / ether (volume ratio, 1: 4) to give 2
Green crystals of -methyl-4,6-bis- (4-N, N-dimethylaminophenyl) pyrylium iodide (Compound 1 in Table 1 (where Y is I)) were obtained. Analysis result of the obtained compound 1 (Y: I) Melting point: 254-257 ° C. UV / visible (CH 3 CN ε × 10 −4 ) λ max: 444
nm (2.43), 550 nm (8.24) NMR ( 1 H, DMSO) δ ppm: 8.3737 (1 H,
s), 8.2729 (1H, d, J = 9.0 Hz),
8.1795 (1H, d, J = 9.0Hz), 7.88
64 (1H, s), 6.9117 (4H, t, J AB = J
BC = 9.77), 3.1829 (6H, s), 3.13
40 (6H, s), 2.6809 (3H, s) FAB mass m / z 333 IR (KBr) νcm -1 : 1645, 1610 (s
h), 1580 (s), 1490 (s), 1270, 1
200,1160 Further, 2-methyl-4,6-as described above except that an aqueous solution of perchloric acid is used instead of the aqueous solution of potassium iodide.
A perchlorate salt of bis- (4-N, N-dimethylaminophenyl) pyrylium (Compound 1 (Y: CIO 4 )) was obtained.
【００７３】参考例２ 硫化ナトリウム９水和物２０ｇをイオン交換水に溶解さ
せ全量を５０ｍｌとした。この溶液に炭酸水素ナトリウ
ム７ｇを加え溶解させた後、氷冷下、５０ｍｌのエタノ
ールを更に加えてから、室温で３０分間攪拌した。析出
した炭酸ナトリウムを濾別し、２５ｍｌのエタノールで
洗浄し、濾液と洗液を合わせ、約１２５ｍｌの水硫化ナ
トリウムの水・エタノール溶液を得た。Reference Example 2 20 g of sodium sulfide nonahydrate was dissolved in deionized water to make the total amount 50 ml. After 7 g of sodium hydrogen carbonate was added to and dissolved in this solution, 50 ml of ethanol was further added under ice cooling, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. Precipitated sodium carbonate was filtered off, washed with 25 ml of ethanol, and the filtrate and the washing solution were combined to obtain about 125 ml of a solution of sodium hydrosulfide in water and ethanol.
【００７４】次に、参考例１で得た２−メチル−４，６
−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリ
リウム アイオダイドの０．９２ｇを２０ｍｌのＤＭＳ
Ｏに溶解させ、得られた溶液に先に調製した水硫化ナト
リウムの水・エタノール溶液の５ｍｌを加え、室温下で
５分間攪拌した。攪拌後、ヨウ化水素酸０．７５ｍｌを
加え、更に５分間攪拌した。以下、常法に従って、ジク
ロロメタン抽出、シリカゲルカラム精製を行った後、エ
タノール／エーテル混合液（容量比、１：４）で再結晶
させて、０．７ｇの２−メチル−４，６−ビス−（４−
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）チオピリリウム ア
イオダイドの結晶（表１の化合物２（ただし、ＹはＩで
ある））を得た。 得られた化合物２（Ｙ：Ｉ）の分析結果 融点：２４６〜２４８℃ ＵＶ／可視（ＣＨ3ＣＮ ε×１０-4）λmax ：４９５
ｎｍ（２．５０）、５８７ｎｍ（４．９５） ＮＭＲ（1Ｈ、DMSO）δｐｐｍ：８．５６７９（１Ｈ、
ｓ）、８．４３２３（１Ｈ、ｓ）、８．２４３６（２
Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２７Ｈｚ）、７．９７８６（２Ｈ、
ｄ、Ｊ＝９．２８）、６．８９５９（４Ｈ、ｔ、ＪAB＝
ＪBC＝９．２８）、３．１７５６（６Ｈ、ｓ）、３．１
１５７（６Ｈ、ｓ）、２．８３２３（３Ｈ、ｓ） ＦＡＢ ｍａｓｓ ｍ／ｚ ３４９ ＩＲ（ＫＢｒ）νｃｍ-1：１６００（ｓ）、１５６０
（ｓ）、１４６０（ｓ）、１４３０（ｓ）、１３７０
（ｓ）、１２６０（ｓ）、１１６０（ｓ） 更に、ヨウ化水素酸の代わりに過塩素酸水溶液を用いる
以外は上記と同様にして２−メチル−４，６−ビス−
（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）チオピリリウ
ムの過塩素酸塩（化合物２（Ｙ：ＣＩＯ4））を得た。 参考例３ 表１に示す化合物３〜５５をそれぞれ用意した。表１に
おいて、Φはｐ−フェニレン基：Next, 2-methyl-4,6 obtained in Reference Example 1
-Bis- (4-N, N-dimethylaminophenyl) pyrylium iodide 0.92 g was added to 20 ml DMS.
5 ml of the previously prepared water / ethanol solution of sodium hydrosulfide was added to the resulting solution, and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes. After stirring, 0.75 ml of hydroiodic acid was added, and the mixture was further stirred for 5 minutes. Then, after performing dichloromethane extraction and silica gel column purification according to a conventional method, recrystallization was performed with an ethanol / ether mixed solution (volume ratio, 1: 4) to obtain 0.7 g of 2-methyl-4,6-bis-. (4-
Crystals of N, N-dimethylaminophenyl) thiopyrylium iodide (Compound 2 in Table 1 (wherein Y is I)) were obtained. Analysis result of the obtained compound 2 (Y: I) Melting point: 246 to 248 ° C. UV / visible (CH 3 CN ε × 10 −4 ) λ max: 495
nm (2.50), 587 nm (4.95) NMR ( 1 H, DMSO) δ ppm: 8.5679 (1 H,
s), 8.4323 (1H, s), 8.2436 (2)
H, d, J = 9.27 Hz), 7.9786 (2H,
d, J = 9.28), 6.8959 (4H, t, J AB =
J BC = 9.28), 3.1756 (6H, s), 3.1.
157 (6H, s), 2.8323 (3H, s) FAB mass m / z 349 IR (KBr) νcm −1 : 1600 (s), 1560
(S), 1460 (s), 1430 (s), 1370
(S), 1260 (s), 1160 (s) Furthermore, 2-methyl-4,6-bis- was prepared in the same manner as above except that an aqueous solution of perchloric acid was used instead of hydroiodic acid.
A perchlorate of (4-N, N-dimethylaminophenyl) thiopyrylium (Compound 2 (Y: CIO 4 )) was obtained. Reference Example 3 Compounds 3 to 55 shown in Table 1 were prepared. In Table 1, Φ is a p-phenylene group:
【００７５】[0075]
【化１２】 またはフェニル基を表わす。[Chemical 12] Or represents a phenyl group.
【００７６】[0076]
【表１】 [Table 1]
【００７７】[0077]
【表２】 [Table 2]
【００７８】[0078]
【表３】 [Table 3]
【００７９】[0079]
【表４】 [Table 4]
【００８０】[0080]
【表５】 [Table 5]
【００８１】[0081]
【表６】 [Table 6]
【００８２】[0082]
【表７】 [Table 7]
【００８３】[0083]
【表８】 [Table 8]
【００８４】[0084]
【表９】 [Table 9]
【００８５】[0085]
【表１０】 [Table 10]
【００８６】[0086]
【表１１】 [Table 11]
【００８７】[0087]
【表１２】 [Table 12]
【００８８】[0088]
【表１３】 [Table 13]
【００８９】[0089]
【表１４】 [Table 14]
【００９０】[0090]
【表１５】 [Table 15]
【００９１】[0091]
【表１６】 [Table 16]
【００９２】[0092]
【表１７】 [Table 17]
【００９３】[0093]
【表１８】 [Table 18]
【００９４】[0094]
【表１９】 なお、これらの化合物は以下の公知の方法により合成し
た。なお、具体的な反応操作は常法に従った。[Table 19] In addition, these compounds were synthesized by the following known methods. The specific reaction procedure was in accordance with a conventional method.
【００９５】化合物７は、W.Foerstらの「New Methods
of Preparative Organic Chemistry」、Acad. Press（1
964）に記載の方法に従って、化合物［ｉ］Compound 7 is the compound described in “New Methods” by W. Foerst et al.
of Preparative Organic Chemistry ", Acad. Press (1
964) and the compound [i]
【００９６】[0096]
【化１３】 を合成した後、これと[Chemical 13] After synthesizing
【００９７】[0097]
【化１４】 （ｐ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンズアルデヒド）とを
反応させて得られた化合物に更に所望のアニオンを反応
させて得た。化合物１７は、化合物［ｉ］と[Chemical 14] The compound obtained by reacting with (p-N, N-dimethylaminobenzaldehyde) was further reacted with a desired anion. Compound 17 is the same as compound [i]
【００９８】[0098]
【化１５】 （ｐ−ジエチルアミノスチリルベンツアルデヒド）とを
反応させて得られた化合物に更に所望のアニオンを反応
させて得た。また、化合物［ｉ］を水硫化ナトリウムと
反応させることにより化合物［ｉｉ］[Chemical 15] The compound obtained by reacting with (p-diethylaminostyrylbenzaldehyde) was further reacted with a desired anion. In addition, compound [ii] is reacted with sodium hydrosulfide to give compound [ii]
【００９９】[0099]
【化１６】 を得た後、この化合物［ｉｉ］を化合物７、１７と同様
にして化合物８、１８を合成した。[Chemical 16] After obtaining, the compound [ii] was synthesized in the same manner as the compounds 7 and 17 to synthesize the compounds 8 and 18.
【０１００】R. WizingerらのHelv. chim. Acta、39、2
17 (1956)に記載の方法に従い、アセトフェノンとアセ
トアルデヒドから以下に示すルートR. Wizinger et al., Helv. Chim. Acta, 39 , 2
According to the method described in 17 (1956), the route shown below from acetophenone and acetaldehyde
【０１０１】[0101]
【化１７】 を経て、化合物［ｉｉｉ］[Chemical 17] Via compound [iii]
【０１０２】[0102]
【化１８】 を合成した。この化合物［ｉｉｉ］を原料として、ｐ−
ジメチルアミノベンズアルデヒドとの反応から得られた
化合物に更に所望のアニオンを反応させて化合物５を、
ｐ−ジエチルアミノスチリルベンツアルデヒドとの反応
から同様にして化合物１５を、ｐ−ジメチルアミノ桂皮
アルデヒドとの反応から同様にして化合物９を、[Chemical 18] Was synthesized. Using this compound [iii] as a raw material, p-
The compound obtained from the reaction with dimethylaminobenzaldehyde is further reacted with a desired anion to give compound 5.
Compound 15 was similarly prepared from the reaction with p-diethylaminostyrylbenzaldehyde, and Compound 9 was similarly prepared from the reaction with p-dimethylaminocinnamic aldehyde.
【０１０３】[0103]
【化１９】 との反応から同様にして化合物１１をそれぞれ得た。ま
た、化合物［ｉｉｉ］を水硫化ナトリウムと反応させる
ことにより化合物［ｉｖ］[Chemical 19] Compound 11 was obtained in the same manner from the reaction with. Alternatively, the compound [iv] can be obtained by reacting the compound [iii] with sodium hydrosulfide.
【０１０４】[0104]
【化２０】 を得た後、化合物［ｉｉｉ］に代えて化合物［ｉｖ］を
用いる以外は、化合物５、１５、９及び１１の合成の場
合と同様の方法で、化合物６、１６、１０及び１２をそ
れぞれ得た。[Chemical 20] Compounds 6, 16, 10 and 12 were obtained in the same manner as in the case of the synthesis of Compounds 5, 15, 9 and 11 except that the compound [iv] was used instead of the compound [iii]. It was
【０１０５】更に、原料のアセトアルデヒドをｐ−ジメ
チルアミノベンズアルデヒドに代える以外は、化合物
［ｉｉｉ］の合成の場合と同様にして、化合物３のカチ
オン部分を得た後、これに硫化ナトリウムを反応させて
得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させ、化合
物４を得た。また、同様にしてｐ−メチルベンズアルデ
ヒとアセトフェノンから化合物［ｖ］Furthermore, except that the starting acetaldehyde was replaced with p-dimethylaminobenzaldehyde, the cation moiety of the compound 3 was obtained in the same manner as in the synthesis of the compound [iii], and this was reacted with sodium sulfide. The compound thus obtained was further reacted with a desired anion to obtain a compound 4. Further, in the same manner, the compound [v] was obtained from p-methylbenzaldeh and acetophenone.
【０１０６】[0106]
【化２１】 を得た後、それを水硫化ナトリウムと反応させて化合物
［ｖｉ］[Chemical 21] And then reacting it with sodium hydrosulfide to give compound [vi]
【０１０７】[0107]
【化２２】 を得た。更に、化合物［ｖ］及び［ｖｉ］をそれぞれｐ
−ジメチルアミノベンズアルデヒドと反応させ、得られ
た化合物に更に所望のアニオンを反応させて化合物１３
及び１４を得た。[Chemical formula 22] Got Furthermore, the compounds [v] and [vi] are each
Compound 13 obtained by reacting with dimethylaminobenzaldehyde and further reacting the obtained compound with a desired anion.
And 14 were obtained.
【０１０８】化合物１９、２０及び２１は、化合物
［ｉ］または［ｉｉ］と、化合物１または２のカチオン
部分とをThe compounds 19, 20 and 21 are prepared by combining the compound [i] or [ii] with the cation moiety of the compound 1 or 2.
【０１０９】[0109]
【化２３】 と反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反
応させて得た。化合物２２、２３及び２４は、化合物
［ｉ］または［ｉｉ］と化合物１または２のカチオン部
分とを、[Chemical formula 23] Was obtained by further reacting the obtained compound with a desired anion. Compounds 22, 23 and 24 are compounds [i] or [ii] and the cation moiety of compound 1 or 2,
【０１１０】[0110]
【化２４】 と反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反
応させて得た。化合物２５及び２６は、化合物［ｉ］ま
たは［ｉｉ］を[Chemical formula 24] Was obtained by further reacting the obtained compound with a desired anion. Compounds 25 and 26 are compounds [i] or [ii]
【０１１１】[0111]
【化２５】 と反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反
応させて得た。化合物２７、２８及び２９は、化合物
［ｉ］または［ｉｉ］と化合物１または２のカチオン部
分とを、トリエトキシメタン［ＨＣ（ＯＣ2Ｈ5）3］と
反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応
させることにより合成した。化合物３０、３１及び３２
は化合物［ｉｉｉ］または［ｉｖ］と、［ｉｉｉ］と
［ｉｖ］と同様の方法によりｐ−ジメチルアミノアセト
フェノンから合成した化合物［ｉｉｉ］と［ｉｖ］のジ
メチルアミノ誘導体と、トリエトキシメタンとを反応さ
せ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させる
ことにより合成した。[Chemical 25] Was obtained by further reacting the obtained compound with a desired anion. Compounds 27, 28 and 29 are obtained by reacting compound [i] or [ii] and the cation moiety of compound 1 or 2 with triethoxymethane [HC (OC 2 H 5 ) 3 ] It was synthesized by reacting the desired anion. Compounds 30, 31 and 32
Is compound [iii] or [iv], dimethylamino derivative of compound [iii] and [iv] synthesized from p-dimethylaminoacetophenone by the same method as [iii] and [iv], and triethoxymethane. The reaction was performed, and the obtained compound was further reacted with a desired anion to synthesize the compound.
【０１１２】化合物３３〜５５は以下の各反応によりそ
れぞれ合成した。化合物３３の合成Compounds 33 to 55 were respectively synthesized by the following reactions. Synthesis of compound 33
【０１１３】[0113]
【化２６】 化合物３４の合成[Chemical formula 26] Synthesis of compound 34
【０１１４】[0114]
【化２７】 化合物３５の合成[Chemical 27] Synthesis of compound 35
【０１１５】[0115]
【化２８】 化合物３６の合成[Chemical 28] Synthesis of compound 36
【０１１６】[0116]
【化２９】 化合物３７の合成[Chemical 29] Synthesis of compound 37
【０１１７】[0117]
【化３０】 化合物３８の合成[Chemical 30] Synthesis of compound 38
【０１１８】[0118]
【化３１】 化合物３９の合成[Chemical 31] Synthesis of compound 39
【０１１９】[0119]
【化３２】 化合物４０は、化合物３６の合成で原料を[Chemical 32] Compound 40 is used as a raw material in the synthesis of Compound 36.
【０１２０】[0120]
【化３３】 から[Chemical 33] From
【０１２１】[0121]
【化３４】 に変更して合成した。[Chemical 34] It was changed to and synthesized.
【０１２２】化合物４１は、化合物３７の合成で原料をCompound 41 was used as a starting material in the synthesis of Compound 37.
【０１２３】[0123]
【化３５】 から[Chemical 35] From
【０１２４】[0124]
【化３６】 に変更して合成した。[Chemical 36] It was changed to and synthesized.
【０１２５】化合物４２は、化合物３８の合成で原料をCompound 42 was used as a starting material in the synthesis of Compound 38.
【０１２６】[0126]
【化３７】 から[Chemical 37] From
【０１２７】[0127]
【化３８】 に変更して合成した。[Chemical 38] It was changed to and synthesized.
【０１２８】化合物４３は、化合物３９の合成で原料をCompound 43 was used as a starting material in the synthesis of Compound 39.
【０１２９】[0129]
【化３９】 から[Chemical Formula 39] From
【０１３０】[0130]
【化４０】 に変更して合成した。 化合物４４の合成[Chemical 40] It was changed to and synthesized. Synthesis of compound 44
【０１３１】[0131]
【化４１】 化合物４５の合成[Chemical 41] Synthesis of compound 45
【０１３２】[0132]
【化４２】 化合物４６の合成[Chemical 42] Synthesis of compound 46
【０１３３】[0133]
【化４３】 化合物４７の合成[Chemical 43] Synthesis of compound 47
【０１３４】[0134]
【化４４】 化合物４８は、化合物４４の合成で原料を[Chemical 44] Compound 48 is used as a raw material in the synthesis of Compound 44.
【０１３５】[0135]
【化４５】 から[Chemical formula 45] From
【０１３６】[0136]
【化４６】 に変更して合成した。[Chemical formula 46] It was changed to and synthesized.
【０１３７】化合物４９は、化合物４５の合成で原料をCompound 49 was used as a starting material in the synthesis of Compound 45.
【０１３８】[0138]
【化４７】 から[Chemical 47] From
【０１３９】[0139]
【化４８】 に変更して合成した。[Chemical 48] It was changed to and synthesized.
【０１４０】化合物５０は、化合物４６の合成で原料をCompound 50 was used as a starting material in the synthesis of Compound 46.
【０１４１】[0141]
【化４９】 から[Chemical 49] From
【０１４２】[0142]
【化５０】 に変更して合成した。[Chemical 50] It was changed to and synthesized.
【０１４３】化合物５１は、化合物４７の合成で原料をCompound 51 was used as a starting material in the synthesis of compound 47.
【０１４４】[0144]
【化５１】 から[Chemical 51] From
【０１４５】[0145]
【化５２】 に変更して合成した。 化合物５２の合成[Chemical 52] It was changed to and synthesized. Synthesis of compound 52
【０１４６】[0146]
【化５３】 化合物５３の合成[Chemical 53] Synthesis of compound 53
【０１４７】[0147]
【化５４】 化合物５４の合成[Chemical 54] Synthesis of compound 54
【０１４８】[0148]
【化５５】 化合物５５の合成[Chemical 55] Synthesis of compound 55
【０１４９】[0149]
【化５６】 更に置換基導入用の化合物を種々変更して、表２に示す
化合物を得た。[Chemical 56] Further, various compounds for introducing a substituent were variously changed to obtain the compounds shown in Table 2.
【０１５０】[0150]
【表２０】 [Table 20]
【０１５１】[0151]
【表２１】 [Table 21]
【０１５２】[0152]
【表２２】 [Table 22]
【０１５３】[0153]
【表２３】 [Table 23]
【０１５４】[0154]
【表２４】 [Table 24]
【０１５５】[0155]
【表２５】 [Table 25]
【０１５６】[0156]
【表２６】 [Table 26]
【０１５７】[0157]
【表２７】 [Table 27]
【０１５８】[0158]
【表２８】 [Table 28]
【０１５９】[0159]
【表２９】 [Table 29]
【０１６０】[0160]
【表３０】 [Table 30]
【０１６１】[0161]
【表３１】 [Table 31]
【０１６２】[0162]
【表３２】 [Table 32]
【０１６３】[0163]
【表３３】 [Table 33]
【０１６４】[0164]
【表３４】 [Table 34]
【０１６５】[0165]
【表３５】 [Table 35]
【０１６６】[0166]
【表３６】 実施例１（２種のピリリウム色素によるＤＮＡハイブリ
ッド体の検出） ［１］２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアミノフェニル）ピリリウム パークロレート（化
合物ａ）の合成 無水酢酸１００ｍｌと濃硫酸３０ｍｌとを冷却しながら
混合し、得られた混合液をウォーターバスで８０℃に保
ちながら３時間加温した。そこに無水酢酸２０ｍｌ、ｐ
−ジメチルアミノアセトフェノン３０ｍｌを室温下で加
え、その後４５℃に温度を上昇させて２４時間攪拌し反
応させた。この反応液に等量のエタノールを加え、冷却
し、更に７０％過塩素酸水溶液を加えると、粗結晶が析
出した。この粗結晶を瀘過により回収し、エタノール／
エーテルの混合系（容量比、１：４）から再結晶させ
て、２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアミノフェニル）ピリリウム パークロレート（化合
物ａ）を得た。[Table 36] Example 1 (Detection of DNA Hybrid with Two Pyrylium Dyes) [1] Synthesis of 2-Methyl-4,6-bis- (4-N, N-dimethylaminophenyl) pyrylium perchlorate (Compound a) Anhydrous 100 ml of acetic acid and 30 ml of concentrated sulfuric acid were mixed while being cooled, and the obtained mixed liquid was heated for 3 hours while being kept at 80 ° C. in a water bath. 20 ml of acetic anhydride, p
-Dimethylaminoacetophenone (30 ml) was added at room temperature, the temperature was then raised to 45 ° C, and the mixture was stirred for 24 hours for reaction. An equal amount of ethanol was added to this reaction solution, which was cooled, and a 70% aqueous solution of perchloric acid was further added to precipitate crude crystals. The crude crystals were recovered by filtration, and ethanol /
Recrystallization from a mixed system of ether (volume ratio, 1: 4) gave 2-methyl-4,6-bis- (4-N, N-dimethylaminophenyl) pyrylium perchlorate (compound a).
【０１６７】［２］４−メチル−２，６−ジフェニルピ
リリウムパークロレートの合成 Ａ．Ｔ．ＢａｌａｂａｎらのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，
２０，１１９（１９６４）に記載の方法に従い、４−メ
チル−２，６−ジフェニルピリリウム パークロレート
（化合物ｂ）を合成した。[2] Synthesis of 4-Methyl-2,6-diphenylpyrylium perchlorate A. T. Balaban et al., Tetrahedron,
20 , 119 (1964), 4-methyl-2,6-diphenylpyrylium perchlorate (compound b) was synthesized.
【０１６８】［３］オリゴヌクレオチドの合成 標的ＤＮＡとしてのＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（一本鎖）と
部分的に相補的な塩基配列を有する２０量体オリゴヌク
レオチドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ自動合成機を用
いて合成した。５’末端ジメトキシトリチル基は自動合
成機上で除去した。その塩基配列は以下のとおりであ
る。[3] Synthesis of Oligonucleotide A 20-mer oligonucleotide having a base sequence partially complementary to M13mp18 DNA (single strand) as a target DNA was synthesized by using 381A DNA automatic synthesizer manufactured by ABI. . The 5'-terminal dimethoxytrityl group was removed on an automatic synthesizer. The base sequence is as follows.
【０１６９】５’−ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣ
ＣＡＧＴ−３’（配列番号：１） ［４］プローブとＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡとのハイブリッ
ド体の形成反応 上記［３］項で作製されたオリゴヌクレオチドプローブ
の０．２μＭと、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（宝酒造社製）
の０．２μＭを１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）／１
４５ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＫＣｌ中で８０℃に加熱
し、その後、徐々に冷却して室温まで下げて、プローブ
・標的ＤＮＡのハイブリッド体を作製した。5'-GTTGTAAAAACGACGGC
CAGT-3 ′ (SEQ ID NO: 1) [4] Formation reaction of hybrid of probe and M13mp18DNA 0.2 μM of the oligonucleotide probe prepared in the above [3] and M13mp18DNA (Takara Shuzo)
0.2 μM of 1 mM phosphate buffer (pH 7.0) / 1
A probe / target DNA hybrid was prepared by heating to 80 ° C. in 45 mM NaCl / 5 mM KCl, and then gradually cooling to room temperature.
【０１７０】［５］二種のピリリウム色素の特性 化合物ａ及び化合物ｂの核酸との相互作用を知るため
に、それぞれの化合物を市販のＤＮＡ溶液に加えて、そ
の特性を調べた。化合物ａそのものは、水溶液中で無蛍
光であるのが、ＤＮＡ溶液中では６４０ｎｍ（５８０ｎ
ｍで励起）に強い蛍光を持つものであった。また、その
吸収ピークはＤＮＡ添加時に約４０ｎｍ長波長シフト
し、蛍光性のインターカレーターである。化合物ｂは、
化合物ａとは逆に遊離の状態で強い蛍光があるが、ＤＮ
Ａ共存下では蛍光が消失するものであった。[5] Characteristics of Two Pyrylium Dyes In order to know the interaction between compound a and compound b with nucleic acid, each compound was added to a commercially available DNA solution and its characteristics were examined. Although compound a itself is non-fluorescent in an aqueous solution, it is 640 nm (580 n in a DNA solution).
It had a strong fluorescence upon excitation with m). In addition, the absorption peak is a fluorescent intercalator that shifts to a long wavelength of about 40 nm when DNA is added. Compound b is
Contrary to compound a, there is strong fluorescence in the free state, but DN
The fluorescence disappeared in the coexistence of A.
【０１７１】［６］二種のピリリウム色素を用いた電荷
移動によるハイブリッド体の検出 上記［４］項で作製したプローブとＭ１３ｍｐ１８との
ハイブリッド体に化合物ａを最終濃度が５μＭになるよ
うに加え、更に、各種濃度の化合物ｂを加えた。この溶
液に化合物ａの吸収波長である５８０ｎｍの可視光を照
射し、その蛍光を大塚電子社製ＩＭＵＣ−７０００にて
観測した。その結果、化合物ｂを加える前に観測された
６４０ｎｍの蛍光は消失し、かわりに４５０ｎｍに新た
に蛍光が現れた。このことは、ハイブリッド体に挿入さ
れた化合物ａと化合物ｂとの間で核酸の二重らせん構造
を介した電荷移動が起こり、４５０ｎｍに蛍光が出現し
たものと考えられる。また、４５０ｎｍの蛍光は化合物
ｂが５μＭの時が最大であった。[6] Detection of Hybrid by Charge Transfer Using Two Pyrylium Dyes Compound a was added to the hybrid of the probe prepared in the above [4] and M13mp18 at a final concentration of 5 μM, Furthermore, various concentrations of compound b were added. This solution was irradiated with visible light of 580 nm, which is the absorption wavelength of compound a, and its fluorescence was observed with IMUC-7000 manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd. As a result, the fluorescence at 640 nm observed before adding the compound b disappeared, and a new fluorescence appeared at 450 nm instead. It is considered that this is because the charge transfer via the double helix structure of the nucleic acid occurred between the compound a and the compound b inserted in the hybrid, and the fluorescence appeared at 450 nm. Further, the fluorescence at 450 nm was maximum when the compound b was 5 μM.
【０１７２】実施例２（ミスマッチの検出） 下記の塩基配列のオリゴヌクレオチドをプローブとして
用いた以外は、実施例１と同様にして、プローブ・標的
ＤＮＡハイブリッド体を調製した。Example 2 (Detection of Mismatch) A probe / target DNA hybrid was prepared in the same manner as in Example 1 except that the oligonucleotide having the following base sequence was used as a probe.
【０１７３】５’−ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＧＧＡＣＧＧＣ
ＣＡＧＴ−３’（配列番号：２） なお、この塩基配列は、実施例１で用いたプローブ用塩
基配列の５’末端から１０番目のＣをＧに変換したもの
であり、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡとミスマッチするように
設計されたものである。5'-GTTGTAAAAGGACGGGC
CAGT-3 ′ (SEQ ID NO: 2) This base sequence is obtained by converting the 10th C from the 5′-end of the probe base sequence used in Example 1 to G, and is likely to mismatch with M13mp18DNA. It was designed for.
【０１７４】このハイブリッド体に実施例１と同様に２
種類のピリリウム色素を加え、５８０ｎｍの光を励起光
として、その蛍光増大、蛍光消失を観測した。実施例１
とは異なり、化合物ａ及び化合物ｂのいずれの蛍光もそ
の強度に変化は見られなかった。この結果は、ミスマッ
チしているハイブリッド体ではこれらの色素間の相互作
用が起きなかったためと考えられる。[0174] As in Example 1, 2 was added to this hybrid body.
Pyrylium dyes of various types were added, and the increase in fluorescence and the disappearance of fluorescence were observed using 580 nm light as excitation light. Example 1
Unlike the above, no change was observed in the intensity of the fluorescence of both compound a and compound b. This result is considered to be because the interaction between these dyes did not occur in the mismatched hybrid.
【０１７５】実施例３（２種のピリリウム色素によるＤ
ＮＡハイブリッド体の検出） 実施例１と同様な方法によりプローブ・標的ＤＮＡのハ
イブリッド体を作製した。これに、化合物ａを加え、そ
の後、２，６−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニ
ル）−４−フェニルピリリウム アイオダイド（化合物
ｃ）を加えた。Example 3 (D with Two Pyrylium Dyes)
Detection of NA hybrid) A hybrid of probe / target DNA was prepared in the same manner as in Example 1. To this, compound a was added, and then 2,6-bis (N, N-dimethylaminophenyl) -4-phenylpyrylium iodide (compound c) was added.
【０１７６】あらかじめ化合物ｃとＤＮＡとの相互作用
を調べた。その結果、化合物ｃは６００ｎｍ付近に吸収
があり、化合物ａと同様、ＤＮＡ添加に伴って吸収スペ
クトルのシフトが見られ（６４０ｎｍ）、インターカレ
ーターと思われるが、その蛍光はＤＮＡ溶液中でも小さ
かった。The interaction between compound c and DNA was examined beforehand. As a result, the compound c had an absorption around 600 nm, and like the compound a, a shift of the absorption spectrum was observed with the addition of DNA (640 nm), which seems to be an intercalator, but its fluorescence was small even in the DNA solution.
【０１７７】プローブ・標的ＤＮＡのハイブリッド体に
これら２種類のピリリウム色素を加え、化合物ａの励起
波長である５８０ｎｍの光を照射したところ、本来、化
合物ｃがなかった時にＤＮＡ共存下で観測された化合物
ａの強い吸収は消失し、代わりに７２０ｎｍにあらたに
蛍光が出現した。このことは、化合物ａから化合物ｃへ
エネルギー移動が起きたためと考えられる。化合物ｃの
量をいろいろ変えて実験したところ、供与体の蛍光の減
少と受容体の蛍光の増大はそれぞれが同じモル数の時に
最も効果的であった。When these two kinds of pyrylium dyes were added to the probe / target DNA hybrid and irradiated with light having an excitation wavelength of 580 nm of compound a, it was originally observed in the presence of DNA when compound c was absent. The strong absorption of the compound a disappeared, and a new fluorescence appeared at 720 nm instead. It is considered that this is because energy transfer occurred from compound a to compound c. Experiments with various amounts of compound c showed that the decrease in the fluorescence of the donor and the increase in the fluorescence of the acceptor were most effective at the same molar number.
【０１７８】実施例４（標識抗体と電荷移動によるハイ
ブリッド体の検出） ［１］標識抗体の作製 （１）４−メチル−２，６−ジフェニルピリリウム パ
ークロレートの合成 Ａ．Ｔ．ＢａｌａｂａｎらのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，
２０，１１９（１９６４）に記載の方法に従い、４−メ
チル−２，６−ジフェニルピリリウムパークロレート
（化合物ｂ）を合成した。Example 4 (Detection of hybrid body by labeled antibody and charge transfer) [1] Preparation of labeled antibody (1) Synthesis of 4-methyl-2,6-diphenylpyrylium perchlorate A. Preparation of labeled antibody T. Balaban et al., Tetrahedron,
20 , 119 (1964), 4-methyl-2,6-diphenylpyrylium perchlorate (compound b) was synthesized.
【０１７９】（２）抗体の標識 化合物ｂの４．３ｇ、カルボキシベンツアルヒド２ｇ、
７０％過塩素酸１滴、酢酸１０ｍｌの混合液を１時間還
流した後、析出した沈澱を集め、上記エタノール／エー
テルの混合系から再結晶させて、４−（４−カルボキシ
スチリル）−２，６−ジフェニルピリリウム パークロ
レート（化合物ｄ）を得た。(2) Labeling of antibody 4.3 g of compound b, 2 g of carboxybenzaldehyde,
After refluxing a mixed solution of 1 drop of 70% perchloric acid and 10 ml of acetic acid for 1 hour, the precipitated precipitate was collected and recrystallized from the above ethanol / ether mixed system to give 4- (4-carboxystyryl) -2, 6-Diphenylpyrylium perchlorate (compound d) was obtained.
【０１８０】化合物ｄの１７０ｍｇを５ｍｌの乾燥ＤＭ
Ｆに溶解し、乾燥ピリジン５０μｌを加えた。ＤＳＣ
（ジスクシイミジルカーボネート）１２８ｍｇを加えた
後、暗所、室温で２０時間攪拌した。反応混液にジエチ
ルエーテル１５０ｍｌを加え析出した沈澱を集め、ジエ
チルエーテルで洗った後乾燥させた。得られた活性エス
テル体［化合物ｅ］を抗体のアミノ基と反応させて、標
識抗体を作製した。170 mg of compound d was added to 5 ml of dry DM
Dissolve in F and add 50 μl of dry pyridine. DSC
After adding 128 mg of (disuccinimidyl carbonate), the mixture was stirred at room temperature in the dark for 20 hours. 150 ml of diethyl ether was added to the reaction mixture, and the deposited precipitates were collected, washed with diethyl ether and dried. The obtained active ester compound [compound e] was reacted with the amino group of the antibody to prepare a labeled antibody.
【０１８１】［２］ＦＩＴＣ標識２次抗体による検出 抗原と、上記［２］項で作製した一次抗体を常法により
反応させて、その後、二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗マ
ウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を反応させた。[2] Detection with FITC-labeled secondary antibody The antigen was reacted with the primary antibody prepared in the above [2] by a conventional method, and then a FITC-labeled anti-mouse IgG antibody (manufactured by Sigma) was used as a secondary antibody. ) Was reacted.
【０１８２】このサンプルに４８０ｎｍの可視光を照射
し、その蛍光を大塚電子社製ＩＭＵＣ−７０００にて観
測した。その結果、標識抗体を反応させる前に観測され
たＦＩＴＣの５２０ｎｍの蛍光は消失し、かわりに４５
０ｎｍに新たに蛍光が現われた。このことは、一次抗体
と二次抗体とが反応した結果、標識抗体上の化合物ｂと
ＦＩＴＣとの間で電荷移動が起ったものと考えられる。This sample was irradiated with visible light of 480 nm, and its fluorescence was observed with IMUC-7000 manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd. As a result, the fluorescence of FITC at 520 nm observed before reacting the labeled antibody disappeared, and instead of 45
New fluorescence appeared at 0 nm. It is considered that this is because the reaction between the primary antibody and the secondary antibody resulted in charge transfer between the compound b on the labeled antibody and FITC.
【０１８３】[0183]
【発明の効果】本発明の検出方法によれば、標的物質の
検出をより高精度で行うことが可能となる。例えば、プ
ローブを用いたハイブリダイゼーションによって得られ
たハイブリッド体を標的物質とした場合、Ｂ／Ｆ分離が
必要ないという利点を持つ。その結果、従来法で不可決
であった過剰なプローブの除去、非特異吸着を除くため
の煩雑な処理、その条件検討等、数多くの操作が不要と
なった。更に、正確なハイブリッド体でのみ信号変化が
観測されるように試薬物質を選択することで、反応系中
にミスマッチが発生している場合でも、正確な二重らせ
ん構造を形成しているハイブリッド体のみを検出するこ
とが可能となる。According to the detection method of the present invention, it is possible to detect a target substance with higher accuracy. For example, when a hybrid substance obtained by hybridization using a probe is used as a target substance, it has an advantage that B / F separation is not necessary. As a result, many operations such as removal of excessive probe, which was inconvenient in the conventional method, complicated treatment for removing non-specific adsorption, and examination of the conditions, became unnecessary. Furthermore, by selecting the reagent substance so that the signal change is observed only in the correct hybrid, even if a mismatch occurs in the reaction system, the hybrid that forms the correct double helix structure. It becomes possible to detect only.
【０１８４】更に、本発明の方法においてピリリウム系
化合物を電子供与体として用いる場合、遊離時にはほと
んど蛍光がなく、核酸の二重らせん構造に結合した際に
その蛍光特性が大きく変化するものを利用すれば、検出
時におけるＳ／Ｎ比を上昇させることが可能になる。ま
た、ピリリウム系化合物は他の縮合環タイプのインター
カレーターに比べ、より二重らせん構造特異的に挿入さ
れ、一本鎖ＤＮＡの部分的二本鎖構造には挿入されにく
いことが特徴である。その結果、少なくとも２種の試薬
の少なくとも一つにピリリウム系化合物を用いることに
より部分的二本鎖構造による擬ハイブリッド体由来の信
号を除外することができる。Furthermore, when a pyrylium compound is used as an electron donor in the method of the present invention, a compound which has almost no fluorescence when released and whose fluorescence property is greatly changed when bound to a double helix structure of a nucleic acid may be used. For example, the S / N ratio at the time of detection can be increased. In addition, the pyrylium-based compound is characterized by being inserted more specifically in a double helix structure than in other condensed ring type intercalators, and is less likely to be inserted in a partial double-stranded structure of single-stranded DNA. As a result, by using a pyrylium compound as at least one of the at least two kinds of reagents, it is possible to exclude a signal derived from a pseudo hybrid having a partial double-stranded structure.
【０１８５】[0185]
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列の特徴：Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ検出用プローブ配列 配列 GTTGTAAAAC GACGGCCAGT 20 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid, synthetic DNA Sequence characteristics: M13mp18 DNA detection probe sequence Sequence GTTGTAAAAC GACGGCCAGT 20
【０１８６】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列の特徴：Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡとのミスマッチ用プ
ローブ配列 配列 GTTGTAAAAG GACGGCCAGT 20SEQ ID NO: 2 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid, Synthetic DNA Sequence characteristics: M13mp18 DNA mismatch probe Sequence Sequence GTTGTAAAAG GACGGCCAGT 20
【図１】本発明の検出方法で利用する標的物質を介する
相互作用を行う反応系のモデルを示す図である。FIG. 1 is a diagram showing a model of a reaction system that interacts with a target substance used in the detection method of the present invention.
【図２】本発明の検出方法で利用する標的物質を介する
相互作用を行う反応系のモデルを示す図である。FIG. 2 is a diagram showing a model of a reaction system that interacts with a target substance used in the detection method of the present invention.
１、２、４、５、６、７ 試薬 ３ 標的物質 1, 2, 4, 5, 6, 7 Reagent 3 Target substance
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｄ 409/04 ３０９ Ｃ１２Ｎ 15/09 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical display location C07D 409/04 309 C12N 15/09
Claims (31)
化を生じる反応系を構成し得る少なくとも２種の試薬
を、試料と反応させ、試料中に前記標的物質が存在する
場合に生じる前記相互作用に基づく変化を測定すること
によって該試料中の標的物質を検出する方法において、
前記反応系を構成する試薬の少なくとも１つがピリリウ
ム化合物及びピリリウム類似化合物から選ばれたもので
あることを特徴とする標的物質の検出方法。1. At least two kinds of reagents capable of forming a reaction system that causes a change based on an interaction mediated by a target substance, are reacted with a sample, and the interaction occurs when the target substance is present in the sample. In the method of detecting a target substance in the sample by measuring a change based on
A method for detecting a target substance, wherein at least one of the reagents constituting the reaction system is selected from a pyrylium compound and a pyrylium analogue compound.
る請求項１に記載の検出方法。2. The detection method according to claim 1, wherein the interaction is due to charge transfer.
類似化合物からなる試薬が、電子供与体、電子受容体、
メディエーターまたはセンシタイザーとして作用する請
求項２に記載の検出方法。3. A reagent comprising the pyrylium compound or pyrylium-like compound is an electron donor, an electron acceptor,
The detection method according to claim 2, which acts as a mediator or a sensitizer.
ものである請求項１に記載の検出方法。4. The detection method according to claim 1, wherein the interaction is based on energy transfer.
似化合物が下記一般式［Ｉ］ 【化１】 （上記一般式［Ｉ］において、 【化２】 は、複素環を示し、ＸはＯ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅであ
り、ピリリウム環もしくはピリリウム類似環を示し、 Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原
子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ
基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換
もしくは未置換低級アルキル基、置換もしくは未置換ア
リール基、置換もしくは未置換低級アルアルキル基また
は置換もしくは未置換シクロアルキル基を示し、 Ｒ3は、−Ａまたは−Ｌ−Ａであり、 Ｌは、−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−Ｌ4−Ｌ5−Ｌ6−
であり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝Ｃ
Ｈ）−、置換もしくは未置換アリール基から誘導される
２価の基、置換もしくは未置換低級アルキレン基または
−ＣＨ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ基を有する環構造を示す）
を表わし、 Ａは、置換もしくは未置換アリール基、−ＣＨ＝Ｒ
5（Ｒ5は、置換もしくは未置換複素環、置換もしくは未
置換シクロアルキル基または置換もしくは未置換芳香環
を示す）を表わし、 Ｘを含むピリリウム環もしくはその類似環のＲ1、Ｒ2、
Ｒ3が結合していない炭素原子に結合している水素原子
は、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリ
ル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シ
アノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もし
くは未置換アリール基または置換もしくは未置換低級ア
ルアルキル基で置換されていても良く、 Ｙ-はアニオンを示す。）で表わされる化合物である請
求項１〜５のいずれかに記載の検出方法。5. The pyrylium compound and pyrylium analogue compound are represented by the following general formula [I]: (In the above general formula [I], Represents a heterocycle, X is O, S, Se or Te, represents a pyrylium ring or a pyrylium-like ring, and R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, a halogen atom, a sulfonate group, an amino group, R represents a styryl group, a nitro group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a cyano group, a substituted or unsubstituted lower alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted lower aralkyl group or a substituted or unsubstituted cycloalkyl group, R 3 is -A or -L-a, L is, -L 1 -, - L 2 -L 3 - or -L 4 -L 5 -L 6 -
And L 1 to L 6 are each independently-(CH = C
H) -, 2-valent group derived from a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted lower alkylene group, or -CH = R 4 - (R 4 represents a ring structure having an oxo group)
Represents a substituted or unsubstituted aryl group, -CH = R
5 (R 5 represents a substituted or unsubstituted heterocycle, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group or a substituted or unsubstituted aromatic ring), and R 1 , R 2 of the pyrylium ring containing X or a ring similar thereto,
The hydrogen atom bonded to the carbon atom to which R 3 is not bonded is a halogen atom, a sulfonate group, an amino group, a styryl group, a nitro group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a cyano group, a substituted or unsubstituted lower alkyl group, It may be substituted with a substituted or unsubstituted aryl group or a substituted or unsubstituted lower aralkyl group, and Y − represents an anion. The detection method according to claim 1, which is a compound represented by the formula (1).
検出可能なものである請求項１〜５のいずれかに記載の
検出方法。6. The detection method according to claim 1, wherein the change caused by the interaction is optically detectable.
検出可能なものである請求項１〜５のいずれかに記載の
検出方法。7. The detection method according to claim 1, wherein the change based on the interaction is chemically detectable.
より開始される請求項１〜７のいずれかに記載の検出方
法。8. The detection method according to claim 1, wherein the change based on the interaction is initiated by light irradiation.
である請求項１〜８のいずれかに記載の検出方法。9. The detection method according to claim 1, wherein the change based on the interaction is irreversible.
作用により検出可能な変化を生じる反応系を構成し得る
少なくとも２種の試薬を、試料と反応させ、試料中に前
記二重らせん構造が存在する場合に生じる前記検出可能
な変化を測定することによって該試料中の二重らせん構
造を検出する方法において、前記反応系を構成する試薬
の少なくとも１つがピリリウム化合物及びピリリウム類
似化合物から選ばれたものであることを特徴とする核酸
二重らせん構造の検出方法。10. A sample is reacted with at least two kinds of reagents capable of forming a reaction system that produces a detectable change due to an interaction mediated by a double helix structure of a nucleic acid, In the method of detecting a double helix structure in the sample by measuring the detectable change that occurs when present, at least one of the reagents that make up the reaction system is selected from pyrylium compounds and pyrylium analog compounds. A method for detecting a double helix structure of a nucleic acid, which is characterized in that
ある請求項１０に記載の検出方法。11. The detection method according to claim 10, wherein the interaction is due to charge transfer.
ム類似化合物からなる試薬が、電子供与体、電子受容
体、メディエーターまたはセンシタイザーとして作用す
る請求項１１に記載の検出方法。12. The detection method according to claim 11, wherein the reagent comprising the pyrylium compound or the pyrylium-like compound acts as an electron donor, an electron acceptor, a mediator or a sensitizer.
成する塩基対のスタッキングを介して起る請求項１１ま
たは１２に記載の検出方法。13. The detection method according to claim 11, wherein the charge transfer occurs via stacking of base pairs forming a double helix structure.
子供与体及び電子受容体との近接効果による請求項１１
または１２に記載の検出方法。14. The charge transfer according to a proximity effect between a double helix structure and an electron donor or an electron acceptor.
Alternatively, the detection method according to 12 above.
くものである請求項１０に記載の検出方法。15. The detection method according to claim 10, wherein the interaction is based on energy transfer.
造を構成する塩基対のスタッキングを介して起る請求項
１５に記載の検出方法。16. The detection method according to claim 15, wherein the energy transfer occurs via stacking of base pairs forming a double helix structure.
造とエネルギー供与体及びエネルギー受容体との近接効
果による請求項１５に記載の検出方法。17. The detection method according to claim 15, wherein the energy transfer is due to a proximity effect of a double helix structure and an energy donor and an energy acceptor.
により開始される請求項１０〜１７のいずれかに記載の
検出方法。18. The detection method according to claim 10, wherein the change based on the interaction is initiated by light irradiation.
的である請求項１０〜１８のいずれかに記載の検出方
法。19. The detection method according to claim 10, wherein the change based on the interaction is irreversible.
類似化合物が請求項５に記載の一般式［Ｉ］で表わされ
る化合物である請求項１０〜１９のいずれかに記載の検
出方法。20. The detection method according to claim 10, wherein the pyrylium compound and the pyrylium analog compound are compounds represented by the general formula [I] according to claim 5.
ローブ核酸を反応させて得られるハイブリッド体である
請求項１０〜２０のいずれかに記載の検出方法。21. The detection method according to claim 10, wherein the double helix structure is a hybrid body obtained by reacting a target nucleic acid with a probe nucleic acid.
得る第１次反応体及び第２次反応体をこの順に反応させ
て得られる複合体の生成を測定することにより免疫反応
の有無を検出する方法において、前記第１及び第２の反
応体のそれぞれを、これら反応体が反応した際に得られ
る複合体を介在した相互作用に基づく変化を生じる反応
系を構成し得る少なくとも２種の試薬で標識し、該反応
系を構成する試薬の少なくとも１種としてピリリウム化
合物あるいはピリリウム類似化合物を用いることを特徴
とする免疫反応の検出方法。22. The presence or absence of an immune reaction is detected by measuring the production of a complex obtained by reacting a first reaction product and a second reaction product capable of producing an immune reaction with a substance to be detected in this order. In the method, at least two reagents capable of forming a reaction system in which each of the first and second reactants causes a change based on interaction mediated by a complex obtained when these reactants react with each other. And a pyrylium compound or a pyrylium-like compound is used as at least one of the reagents constituting the reaction system.
リウム類似化合物が、請求項５に記載の一般式［Ｉ］で
表わされる化合物である請求項２２に記載の検出方法。23. The detection method according to claim 22, wherein the pyrylium compound or pyrylium analog compound is a compound represented by the general formula [I] according to claim 5.
が、これら試薬間の電荷移動に基づくものである請求項
２２または２３に記載の検出方法。24. The detection method according to claim 22 or 23, wherein the interaction between the at least two reagents is based on charge transfer between the reagents.
が、これら試薬間のエネルギー移動に基づくものである
請求項２２または２３に記載の検出方法。25. The detection method according to claim 22, wherein the interaction between the at least two kinds of reagents is based on energy transfer between these reagents.
応系が少なくとも電子供与体と電子受容体を含む請求項
２４に記載の検出方法。26. The detection method according to claim 24, wherein the reaction system that causes a change based on the interaction includes at least an electron donor and an electron acceptor.
応体と第２反応体との反応に伴う電子供与体と電子受容
体の近接効果による請求項２４または２６に記載の検出
方法。27. The detection method according to claim 24 or 26, wherein the charge transfer is due to a proximity effect between an electron donor and an electron acceptor accompanying the reaction between the first reactant and the second reactant of the immune reaction.
第１反応体と第２反応体との反応に伴うエネルギー供与
体とエネルギー受容体の近接効果による請求項２５に記
載の検出方法。28. The detection method according to claim 25, wherein the energy transfer is due to a proximity effect between an energy donor and an energy acceptor accompanying the reaction between the first reactant and the second reactant of the immune reaction.
に検出可能である請求項２３〜２８のいずれかに記載の
検出方法。29. The detection method according to claim 23, wherein the change due to the interaction is optically detectable.
れる請求項２３〜２９のいずれかに記載の検出方法。30. The detection method according to claim 23, wherein the interaction is initiated by light irradiation.
項２３〜３０のいずれかに記載の検出方法。31. The detection method according to claim 23, wherein the interaction is irreversible.
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| AT95303567T ATE256119T1 (en) | 1994-05-26 | 1995-05-25 | METHOD FOR DETECTING A TARGET SUBSTANCE IN A SAMPLE USING PYRYLIUM COMPOUND |
| DE69532255T DE69532255D1 (en) | 1994-05-26 | 1995-05-25 | Method for the detection of a target substance in a sample using pyrylium compound |
| US08/825,586 US6156506A (en) | 1994-05-26 | 1997-04-01 | Method for detecting a target substance in a sample, utilizing pyrylium compound |
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