JPH07313191A

JPH07313191A - ほ乳類の***細胞の受精能力を評価する方法および装置

Info

Publication number: JPH07313191A
Application number: JP7078400A
Authority: JP
Inventors: Jorge G Tezon; ホルヘ・ギジェルモ・テソン; Adriano Brandelli; アドリアノ・ブランデェリ
Original assignee: FUND INST DE BIO Y MEDEXP; FUND INST DE BIOLOGIA Y MEDICINA EXPERIMENTAL; FUNDASUION INST DE BIOROHIA I MEDEISUINA ESUPURIMENTARU
Current assignee: FUND INST DE BIO Y MEDEXP; FUND INST DE BIOLOGIA Y MEDICINA EXPERIMENTAL; FUNDASUION INST DE BIOROHIA I MEDEISUINA ESUPURIMENTARU
Priority date: 1994-03-14
Filing date: 1995-03-10
Publication date: 1995-12-05
Also published as: AU1342095A; EP0672905A1; US5736346A; CA2143053A1

Abstract

(57)【要約】【目的】所定の***サンプルの生体外または生体内受精
能力を評価する方法および装置を提供する。【構成】本発明の方法においては、ほ乳類の***細胞の
サンプルに能力を与え、次いで、能力が与えられた***
を、ネオグリコプロテインまたはグリコデンドリマのよ
うな所定量のグリコシド−高分子抱合体とともに、***
において先体反応を誘起するのに十分な条件の下で所定
の時間培養する工程を含む。この工程は、***と卵子と
の間で生体内で生ずる生理学的反応に有効に擬態する。
サンプルにおける非生理学的にかつ自然に先体反応を行
なう***のパーセントを占める、正の対照および負の対
照に対する***細胞における抱合体誘起先体反応の程度
を、次に計算する。次いで、***の受精能力がこの計算
の関数として評価される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、***サンプルの生体外
または生体内受精能力を評価する方法および装置に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】生体外受精(in vitro fertilization)
（ＩＶＦ）の出現は、かかるＩＶＦ処置において使用さ
れるべき***の***受精能力を予測する方法の価値を高
めている。***の濃縮、自動性および形態をはじめとす
る代表的な***分析は、雄の受精力の主たるインジケー
タとして広く使用されてきた。しかしながら、これらの
結果は、生体内または生体外の人の受精能力の正確な診
断または予後情報を提供することができない。標準的な
***分析は、受精能力を予測するための制限された臨床
値を有するように示されるので、人の***機能の数多く
の他の試験が出現している。これらの試験には、自動性
の客観的な評価、浸透圧減退膨潤、***核の成熟度の試
験、先体状態、先体反応およびアクシン活性度の測定、
ハムスターの帯層のない卵母細胞の侵入並びに人の***
−帯層の結合と侵入が含まれる。

【０００３】生きている人の卵母細胞を使用して人の精
子機能の試験を行なうことは、試験物質の量が限られて
いるので、実質上不可能であることがわかった。現時点
で最も普及している試験である、帯層のないハムスター
の卵細胞***侵入検定ＳＰＡは、人の***の能力、先体
反応能力、卵黄膜との融合の能力および細胞質において
脱凝縮を行なう能力を評価するものである。「バイオロ
ジカル・リプロダクション」(Biol. Reprod.) 第１５
巻、第４７１−７６頁（１９７６年）に掲載のアール・
ヤナギマチ(R. Yanagimachi)の論文を参照されたい。し
かしながら、この試験は、***が透明帯（ＺＰ）と結合
しかつＺＰを通過することができる能力を測定するもの
ではないので、幾つかの制限がある。この試験はまた、
***集団全体の挙動を反映しないという欠点をもってい
る。例えば、先体反応を行なった***の小部分は、検定
において使用される卵母細胞の全てとの融合に寄与す
る。更に、この試験は、***がＺＰを通過しないことに
よる不妊を予測することができない。ハムスターの卵母
細胞に対する***の通過と、人の卵母細胞に対する***
の通過との相関関係が比較的乏しいことを示す証拠に基
づいて、この試験を批評している論文がある。例えば、
「フェルティライザ・ステライザ」(Feltil. Steril.)
第５７（４）巻、第８８９−８９４頁（１９９２年）に
掲載の論文を参照されたい。

【０００４】ヘミ帯層検定（ＨＺＡ）のような、人の卵
母細胞からの帯層の一部を利用する他の試験がある。
「フェルティライザ・ステライザ」第４９巻、第６８８
−９７頁（１９８８年）に掲載のバークマン(Burkman)
等の論文を参照されたい。ＨＺＡにより得られる***ー
ＺＰ結合率とＩＶＦとの明確な相関関係が報告されてい
る。「ジャーナル・オブ・ジ・インビトロ・・フェルテ
ィライザ・エンブリオ・トランスフォーメイション」
(J. In Vitro Fert. Embryo Transf.)第６巻、第４４−
５０（１９８９年）に掲載のフランケン(Franken) 等の
論文および「フェルティライザ・ステライザ」第５１
巻、第６６５−７０頁（１９８９年）に掲載のオーニン
ガ(Oehninger) 等の論文を参照されたい。しかしなが
ら、ＨＺＡは、結果の大きな変動により、試験が全ての
不妊の男性の評価において日常的に使用するのに適さな
いものとなるので、批判を受けている。「フェルティラ
イザ・ステライザ」第５８（３）巻、第４６５−４８４
頁（１９９２年）に掲載のリウ(Liu) 等の論文を参照さ
れたい。

【０００５】新鮮な成熟した人の卵母細胞のＺＰの部分
を必要とするＨＺＡのような試験は、ＩＶＦプログラム
の副生成物である卵母細胞からの新鮮なまたは保存した
人のＺＰを十分な量入手することができるかどうかによ
るので、更に非実用的である。この物質が使用される場
合には、行なうことができる試験はごくわずかとなり、
しかもＩＶＦプログラムに関連して実験室におけるもの
のみに限定される。更にまた、死体から得る卵母細胞は
量が不明である。これらのファクタは、本質的に制御し
にくいので、ＺＰの***結合部位をまねた規定された化
学化合物をこの生物学的物質の代わりに使用することに
ついての関心が高まっている。「フェルティライザ・ス
テライザ」第６０（２）巻、第３４４−３５０頁（１９
９３年）に掲載のテサリク(Tesarik) 等の論文を参照さ
れたい。

【０００６】先体反応は、受精にとって臨界的であるこ
とが知られており、この機能を試験する幾つかの検定法
が開発されている。しかしながら、先体反応だけの測定
は信頼性がない。例えば、「ジャーナル・オブ・アンド
ロロジア」(J. Androl) 第１２（２）巻、第９８−１０
３頁（１９９１年）に掲載のクミンズ(Cummins) 等の論
文には、カルシウムイオノフォアのチャレンジ後の、人
の***の先体反応の試験が開示されている。しかしなが
ら、この方法は、生きている***を死んだ***と区別す
ることができないとともに、露出された卵母細胞の表面
と融合する***の能力に関する情報を提供することがで
きない。***の受精能力を予測するために生体外の先体
反応の速度論を検討することが更に提案されている。
「アンドロロジア」(Andrologia)第１７巻、第２２４−
２７頁（１９８５年）に掲載のトファー・ピーターセン
(Topfer-Petersen) 等の論文を参照されたい。任意の先
体エキソサイトーシスとＩＶＦとの間の明確な相互関係
が、「ヒューマン・リプロダクション」(Hum. Reprod.)
第８（１２）巻、第２１５５−２１６６頁（１９９３
年）に掲載のベノフ(Benoff)等の論文に報告されてい
る。しかしながら、他の研究の結果は、人の***が培地
において先体反応を行なう能力と生体外で卵母細胞と受
精を行なう能力との相互関係を明らかにしていない。
「フェルティライザ・ステライザ」第５０巻、第９４９
−５３頁（１９８８年）に掲載のデジョンジ(DeJonge)
等の論文を参照されたい。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】明らかなことである
が、従来の***分析は、受精能力について限られた情報
を提供しているだけであるので、生体外または生体内の
受精能力の一層正確な予測を提供するためには、***機
能試験を別途追加しなければならない。これらの努力
は、***の特性についての不完全な情報と受精のプロセ
スに対する関係とにより妨害されてきた。かくして、著
しく正確な***の受精能力試験を行なう必要があるだけ
でなく、臨床実験においてかかる試験を低コストで日常
的に行なうことができることが必要である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、所定の
***サンプルの生体外または生体内受精能力を評価する
方法が、開示されている。この方法は、ほ乳類の***細
胞のサンプルに能力を与え(capacitate)、次いで、能力
が与えられた***を、ネオグリコプロテインまたはグリ
コデンドリマ(glycodendrimer)のような所定量のグリコ
シド−高分子抱合体とともに、***において先体反応を
誘起するのに十分な条件の下で所定の時間培養する工程
を含む。この工程は、***と卵子との間で生体内で生ず
る生理学的反応に有効に擬態する。サンプルにおける非
生理学的にかつ自然に先体反応を行なう***のパーセン
トを占める、正の対照および負の対照に対する***細胞
における抱合体誘起先体反応(conjugate-induced acros
ome reaction) の程度を、次に計算する。次いで、***
の受精能力がこの計算の関数として評価される。

【０００９】臨床検査室においてこの方法を実施するた
めの材料を含むキット即ち装置も、本発明により提供さ
れている。

【００１０】***後は、***が卵子に受精することがで
きる前に、***に２つの重要な変化が生じなければなら
ない。第１の変化は***細胞の能力付与である。能力付
与とは、一般に、***が先体反応を行なうことができる
ようにする、***において生ずる限外構造上のおよび生
化学的変化の複合(complex) を意味するものとして当業
者には理解されている。ラベン(Raven) （ニューヨーク
州）から１９８８年に発行された、ノウビル(Knobil)等
の編集の「ザ・フィジオロジー・オブ・リプロダクショ
ン」(The Physiology of Reproduction)第１３５−１８
５頁に掲載の「ほ乳類受精」("Mammalian Fertilizatio
n") と題する論文、オックスフォード(Oxford)（ニュー
ヨーク州）から１９８９年に発行された「オックスフォ
ード・レビューズ・オブ・リプロダクティブ・バイオロ
ジー」におけるピー・セイリング(P. Saling) の「卵子
の細胞外マトリックスとのほ乳類***の相互作用」と題
する論文および「フェルティライザ・ステライザ」第５
７（４）巻、第８８９−８９４頁（１９９２年）に掲載
のタカナシ(Takanashi) 等の論文を参照されたい。例え
ば、***が透明帯に結合して受精を起こすことができな
いように、透明帯の特定のグリコ抱合体配位子を認識す
る***膜蛋白質（透明帯受容体）の発現が、新たに射出
された***においてマスクされることが示されている。
能力負よのプロセスを通じて、これらの受容体は、***
が次に透明帯に結合することができるように露出され
る。「ガム・レス」(Gam. Res.) 第２０巻、第９３−１
０９頁（１９８８年）に掲載のマセック(Macek) 等の論
文、「ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー」(J. Ce
ll Biol.) 第１０８巻、第２１６３−６８頁（１９８９
年）に掲載のレイトン(Leyton)等の論文および「ディベ
ロプメンタル・バイオロジー」(Dev. Biol.)第１５１
巻、第４８−５４頁（１９９２年）に掲載のビーブ(Bee
be) 等の論文を参照されたい。

【００１１】第２の変化は、能力が付与された***が卵
母細胞の透明帯に結合するときに生ずる、その後の先体
反応である。先体反応は、一般に、能力が付与された精
子細胞が卵子の細胞外コート(coat)、即ち、透明帯（Ｚ
Ｐ）に結合したときに生体内で誘起される多工程生理学
的プロセスを意味するものとして当業者には理解されて
いる。先体反応は、***膜でのＺＰ受容体の配位子媒介
凝集、カルシウムイオンの***への流入、外側先体膜の
***プラズマ膜への融合および融合された膜内に形成さ
れる孔を介しての先体酵素の随伴解放を特徴とする。上
記したピー・セイリング(P. Saling) の論文を参照され
たい。

【００１２】類似のプロセスが人においても生ずること
を示す報告が断片的にあるが、人の***帯層結合蛋白質
の分子的性質を最終的に解明した研究はない。更に、透
明帯の認識を媒介する人の***面の受容体を決定する方
向に向けられている研究の多くが、かかる詳細な研究に
必要とされる人の卵母細胞の入手が限定されていること
により制限を受けている。

【００１３】人の配偶子間の先体反応の性質に関しては
確定および予測が不可能であるにも拘らず、本発明者
は、能力を付与された***および卵母細胞が生体内で互
いに接触したときに生ずる配位子媒介の先体反応を、所
定の能力を付与された***細胞のサンプルを糖のグリコ
シド誘導体と高分子との抱合体（以下、「グリコシド−
高分子抱合体("glycoside-macromolecule conjugate")
」という）とともに培養することにより、卵母細胞、
ＺＰその他の自然に生ずる先体誘導生物学的物質を使用
することなく生体外で有効に再生産することができると
いう驚異的なかつ予期し得ない発見を行なった。所定の
***サンプルにおける抱合体誘起先体反応の程度が測定
され、次いで、正および負の対照の結果に対して発現ま
たは計算が行なわれる。次に、この相対値を使用して、
サンプルを得た男の***の生体内または生体外受精能力
を正確に評価する。即ち、本発明の方法は、生体外受精
（ＩＶＦ）プログラムに登録されている所定の男性患者
の生体外受精能力を正確に予測するとともに、不妊の病
因を定めるのに使用することができる。

【００１４】ネオグリコプロテインＦＩＴＣ−マンノー
ス−ＢＳＡ（フルオレセインイソシチオシアネートマン
ノースウシ血清アルブミン）と結合インヒビターマンノ
ース−ＢＳＡとを使用して、***に対するマンノース受
容体の存在と生体外の受精可能性との間の確実な相互関
係が示されている。「ヒューマン・リプロダクション」
(Hum. Reprod.)第８（１２）巻、第２１５５−６６頁
（１９９３年）に掲載のベノフ(Benoff)等の論文を参照
されたい。しかしながら、これらの結合検定は、受精能
力に関して本発明の方法と比べて正確度が有意に低い。
標識抱合体が、単にマンノース結合部位を識別するため
に使用され、***に先体反応を誘起しないように使用さ
れているので、これらの検定は先体反応に関連する全て
の細胞機構の機能性または生存能力を試験することがで
きない。例えば、ＺＰに対する***受容体の結合は先体
反応における第１の工程であり、これ自体は、卵子の先
体反応および受精が生ずるかどうかを決定するものでは
ない。

【００１５】７５ｍＭの遊離のマンノースによる先体反
応のいわゆる「誘起」("induction") が、上記したベノ
フ(Benoff)等の論文および「ヒューマン・リプロダクシ
ョン」第８（１２）巻、第２１４１−２１５４頁（１９
９３年）に報告されている。しかしながら、本発明の方
法とは著しく異なり、７５ｍＭのマンノオースで***を
処理すると、***に対して激しい非生理学的、例えば、
薬学的な作用を誘起する。これにより、先体エキソサイ
トーシスが増大するが、これは生理学的に誘起されるの
ではなく、即ち、***膜のＺＰ受容体の配位子媒介凝集
により媒介されるのではない（上記したピー・セイリン
グ(P. Sling)の論文を参照されたい）。このような違い
は、７５ｍＭのマンノースは、生体内で生ずる先体反応
に関連する細胞機構の機能性の試験を全く行なわないと
いう点で上記した理由により特に有意である。かくし
て、本発明がなされる以前は、先行技術は、検定の一部
として能力を付与された***に先体反応を誘起させて男
性の受精能力を正確に予測するのに、種々のネオプロテ
インを使用することができることを完全に考慮しあるい
は理解し得なかった。

【００１６】本発明の方法を実施するためには、***の
サンプルを得ることが先づ必要である。***サンプルを
集め、容積、濃度、平均速度および自動細胞の割合のよ
うなパラメータに関して標準的な手順に従って日常分析
に供することができる。例えば、ケンブリッジ(Cambrid
ge) から１９９２年に発行された世界保険機構(WorldHe
alth Organization) の「人間の***と***−頸管粘膜
との相互作用の検査に関するＷＨＯ実験室マニュアル」
(WHO Laboratory Manual for the Examinationof Human
Semen and Semen-Cervical Mucus Interaction) 第３
版［以下、「ＷＨＯ実験室マニュアル」 (The WHO Labo
ratory Manual") という］を参照されたい。

【００１７】次に、このようにして得られた***のサン
プルに、本技術分野において公知の方法に従って能力付
与を行なう。例えば、「バイオロジカル・リプロダクシ
ョン」第２８巻、第１０８−１２０頁（１９８３年）に
掲載のベッドフォード(Bedford) 等の論文、「メソッズ
・イン・エンザイモロジー」(Meth. Enzymol.)第２２５
巻、第１１３−１３６頁（１９９３年）に掲載のベルベ
(Bellve)等の論文、「ヒューマン・リプロダクション」
第８巻、第５７５−５８０頁（１９９３年）および「フ
ェルティライザ・ステライザ」第５２巻、第１０４８−
１０５４頁（１９８９年）に掲載のカルボ(Calvo) 等の
論文、「アーカイブズ・オブ・パソロジー・ラボラトリ
ー・メディシン」(Arch. Pathol. Lab. Med.) 第１１６
巻、第３４５−３５０頁（１９９２年）および「メソッ
ズ・イン・エンザイモロジー」第２２５巻、第２３９−
２５３頁（１９９３年）に掲載のエル・アール・フレイ
ザー(L.R. Fraser) の論文、「アニュアルズ・オブ・ザ
・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンス」(Ann
uals of the New York Academy of Science)第６３７
巻、第４５９−４７３頁（１９９１年）に掲載のストー
リー(Storey)の論文、「フェルティライザ・ステライ
ザ」第５６巻、第９６０−９６６頁（１９９１年）に掲
載のストーバル(Stovall) 等の論文、「ヒューマン・リ
プロダクション」第６巻、第１２６５−１２７４頁（１
９９１年）に掲載のザネベルド(Zaneveld)等の論文、
「ディベロプメント」(Development) 第１１０巻、第３
９１−４００頁（１９９０年）に掲載のテサリク(Tesar
ik) 等の論文、並びに、「フェデレーション・オブ・ヨ
ーロピアン・バイオケミカル・ソサイエティーズ」(FEB
S Lett.)第３０８（２）巻、第１１６−１２０頁（１９
９２年）に掲載のテサリック等の論文を参照されたい。
一般に、任意の所定の***細胞サンプルの能力付与は、
ウシ結成アルブミンまたは同等の物質約３−２０ｍｇ／
ｍｌを含み、約５％のＣＯ₂で平衡にされた培養基にお
いて約３７℃で１６時間サンプルを培養することにより
行なわれる。好ましい能力付与のプロトコールは、「Ｗ
ＨＯ実験室マニュアル」に記載されている。これらの操
作パラメータには、異なる個体からの***は異なる速度
で能力付与することができるという事実が考慮されてい
る。「フェルティライザ・ステライザ」第３８巻、第２
５８−６０頁（１９８２年）に掲載のペロー(Perrault)
等の論文を参照されたい。一般に、***の濃度は、培養
基１ｍｌに対する細胞の個数で、約１．０ｘ１０⁶乃至
約１．０ｘ１０⁷個／ｍｌの範囲にある。好ましい***
濃度は、約２．６Ｘ１０⁶乃至約３．０ｘ１０⁶個／ｍ
ｌである。

【００１８】このようにして能力が付与された***細胞
は、所定の条件の下で、例えば、能力が付与された***
において先体反応を誘起するのに十分な温度と時間の下
で、所定濃度のグリコシド−高分子抱合体とともに培養
に供する。グリコシドは、アルドピラノースとアルコー
ルとの反応生成物である。ワース(Worth) 発行（１９７
５年）、レーニンガー(Lehninger) 著の「バイオケミス
トリー」(Biochemistry)第１０章を参照されたい。グリ
コシドの代表的な糖成分には、２−アセトアミド−２−
デオキシ−Ｄ−グルコースアミンとしても知られるＮ−
アセチル−β−Ｄ−グルコースアミン（ＧｌｃＮＡ
ｃ）、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトースアミンおよ
びマンノースが含まれる。ＧｌｃＮＡｃおよびマンノー
スが好ましい。しかしながら、以下において更に説明す
るように、本発明においては他の糖も使用することがで
きる。これらの糖のＮ−ε−アミノカプロイル、ｐ−イ
ソチオシアナトフェニルおよびｐ−アミノフェニルグリ
コシドが好ましい。しかしながら、当業者であれば、糖
と高分子との間の安定な結合基として機能することがで
きる他のグリコシド基を本発明において使用することが
できることを理解することができるものである。一般
に、抱合体の濃度は、培養基に対して約０．６μｇ／ｍ
ｌ乃至約３．０μｇ／ｍｌの範囲にある。好ましい範囲
は、約１μｇ／ｍｌ乃至約２μｇ／ｍｌである。より好
ましい濃度は約１μｇ／ｍｌである。

【００１９】高分子は、誘導された(derivatized) 糖の
キャリヤ分子として機能することができるとともに、精
子細胞に不活性な天然または合成の球状重合物質であ
る。即ち、高分子は、先体反応を潜在的に妨害する可能
性のある糖残分を欠いており、即ち、高分子は元のまま
の糖の残分を除去するために、例えば過ヨウ素酸化ナト
リウムで予め処理することができる。合成物質には、例
えば、ポリリシン、ポリアスパラギン、ポリアルギニン
のような誘導可能の(derivatizable) アミノ基含有ポリ
マおよびグリコシドに結合可能なデンドリマ(dendrime
r) が含まれる。デンドリマは、アルキル化反応を行な
い、次いでアミド化を行なってモノマの付加を行なわせ
るアンモニアイニシエータコア(core)を有するポリアミ
ドアミンである。このプロセスを数回繰り返すことによ
り、外部にモノ分散アミノ基を有する高分子が得られ
る。デンドリマは、公知の出所源から、例えば、スター
バースト(Starburst) （商標）［ダウ・ケミカル・カン
パニー(Dow Chemical Co.)］から得ることができる。あ
るいは、これは、通常の手順に従って合成することがで
きる。「ポリマー・ジャーナル」(Polymer J.)第１７
巻、第１１７−１３２頁（１９８５年）および「マクロ
モレキュールズ」(Macromolecules)第１９巻、第２６６
頁（１９８０年）に掲載のトマリア(Tomalia) 等の論文
を参照されたい。適宜の天然の重合物質には、血清グロ
ブリン、例えば、アルブミン（ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）、ヒトアルブミンおよびオボアルブミン）並びに
トランスフェリンおよびキーホールアオガイ(keyhole l
impet)ヘモシアニンのような他の公知のプロテインキャ
リヤが含まれる。約１０，０００Ｄａを越える分子量の
高分子が好ましい。

【００２０】ネオグリコプロテインとして広く呼ばれて
いるグリコシド−プロテイン抱合体を形成する方法が、
本技術分野において公知となっている。例えば、「バイ
オロジカル・セル」(Biol. Cell.) 第５１巻、第１８７
−１９６頁（１９８４年）に掲載のモンシグニ(Monsign
y)等の論文、「バイオケミストリ−」(Biochem.)第１９
（１６）巻、第３８５０−３８５５頁（１９８０年）に
掲載の（種々の糖類のｐ−アミノフェニルおよびｐ−イ
ソチオシアナトフェニルグリコシドの合成法を開示す
る）サンド(Sando) 等の論文、「バイオケミストリー」
第１９（１６）巻、第３８５６−６０頁（１９８０年）
に掲載のカーソン(Karson)等の論文および「ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」(J. Biol. Ch
em.)第２５５（１）巻、第５５−５９頁（１９８０年）
に掲載のスミス(Smith) 等の論文を参照されたい。これ
らの方法は、高分子が合成である場合に等しく適用する
ことができる。

【００２１】好ましいグリコシド−高分子抱合体は、Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコースアミンフェニルイソチ
オシアネートＢＳＡ、パラ−アミノフェニル−Ｎ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコースアミニド−ＢＳＡ（ＢＳＡ−
ＧｌｃＮＡｃ）およびｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−マ
ンノピラノシド−ＢＳＡ（ＢＳＡ−Ｍａｎ）である。Ｂ
ＳＡ−ＧｌｃＮＡｃおよびＢＳＡ−Ｍａｎがより好まし
い。

【００２２】一般には、能力を付与された***における
グルコシド−高分子抱合体による先体反応の誘起の条件
は、透明帯により先体反応を誘起するのに使用される条
件と実質上同じである。例えば、「バイオロジカル・リ
プロダクション」第３８巻、第２３５−２４２頁（１９
８８年）に掲載のクロス(Cross) 等の論文を参照された
い。所定の誘起された***サンプルの全ての***が先体
反応を行なうことができるものではない。即ち、ある部
分は反応に対して耐性がある。かくして、培養は、反応
を完成するのに十分な時間、即ち、抱合体誘起の先体反
応を行なうことができるサンプルにおける最大数の***
に先体反応を誘起するのに十分な時間継続されるべきで
ある。当業者であれば、この時間は時間コーススタディ
(time course study) のような標準的な手順に従って定
めることができることを理解することができる。室温
（３７℃）で行なわれるかかるスタディの結果、本発明
者は、好ましくは培養は少なくとも約１時間行なわれる
べきであるとの決定を行なった。結合検定を行なうため
には、より短い培養時間、例えば、１５分が開示されて
いる。「フェルティライザ・ステライザ」第５９（４）
巻、第８５４−６２頁（１９９３年）および「ヒューマ
ン・リプロダクション」第８（１２）巻、第２１４１−
２１５４頁（１９９３年）に掲載のベノフ(Benoff)等の
論文を参照されたい。しかしながら、この時間では、抱
合体誘起の先体反応を行なうのは***の約４０％未満で
あるので、これらの先行技術の方法の異なるおよび無関
係な目的を強調していることになる。一層好ましい実施
例においては、能力を付与された***細胞は空気と５％
ＣＯ₂ との雰囲気において、３７℃で約１時間グリコシ
ド−高分子抱合体を用いた培養に供される。

【００２３】先体反応の完了後に、***は培養基から単
離され、先体反応を行なったサンプル中の細胞の数を測
定するために独立して分析に供される。当業者であれ
ば、三重染色、先体成分に対する単クローン性抗体、ク
ロロテトラサイクリン蛍光体およびフルオレセインイソ
チオシアネート（ＦＩＴＣ）−標識レクチン、例えば、
エンドウマメアグルチニン（ＰＳＡ）およびピーナツア
グルチニンのような種々の試薬を使用し、標準的な顕微
鏡技術に従ってこの分析を実施することができる。上記
したリウ(Liu) 等の論文を参照されたい。先体を評価す
る最も有効な方法として電子顕微鏡が一般に考えられる
が、この技術は高価でありかつ時間を要するので、日常
的に使用するには実際的ではない。上記したような検出
可能な標識を使用する方法は、臨床検査室において使用
するのに一般に好ましい。当業者であれば、かかる目的
を達成するのに適した方法を選択することができるもの
である。「バイオロジカル・リプロダクション」第４１
巻、第６３５−４１頁に記載のクロス(Cross) 等の論文
を参照されたい。

【００２４】エンドウマメアグルチニンフルオレセイン
染色は、人の先体の日常評価に関する簡単かつ再現性の
ある技術を提供するので好ましい。「ジャーナル・オブ
・リプロダクション・フェルティライザ」(J. Reprod.
Fertil.)第９５巻、第７５５−７６３頁（１９９２年）
に掲載のメンドーサ(Mendoza) 等の論文、「フェルティ
ライザ・ステライザ」第５０巻、第２８８−９３頁（１
９８８年）に掲載のリウ等の論文を参照されたい。超生
体染色、例えば、ヘキスト(Hoechst)33258［アメリカ合
衆国、ミズーリー州、セントルイスに所在するシグマ・
ケミカル・カンパニ−(Sigma Chemical Co.)］またはＰ
ＳＡ先体評価に関連する浸透圧減退膨潤により、当業者
は生きている不先体***と死んでいる不先体***とを区
別することができる。「ガム・レス」(Gam. Res.) 第１
５巻、第２１３−２２６頁（１９８６年）に掲載のクロ
ス(Cross) 等の論文を参照されたい。先体分析はまた、
染色されたラテックス微粒子［例えば、ポリサイエンス
・インコーポレイテッド(Polyscience Inc.)またはイン
ターフェイシャル・ダイナミックス・コーポレイション
(Interfacial Dynamics Corp.)の０．２ミクロンのも
の］に結合したエンドウマメアグルチニンを使用して行
なうこともでき、この場合には、標準的な光学顕微鏡を
使用することができる。先体反応の程度はまた、流動細
胞計測装置を使用した蛍光活動細胞選別により測定する
こともできる。例えば、「フェルティライザ・ステライ
ザ」第５８巻、第７８４−９２頁（１９９２年）に掲載
のテサリク(Tesarik) 等の論文を参照されたい。

【００２５】本発明によれば、少なくとも１つの対照検
定が、***サンプルのアリコットに対して行なわれる。
この検定は、***が先体反応を非生理学的に、即ち、Ｚ
Ｐに結合しかつ***受容体の配位子依存凝集を行なう能
力とは独立して行なうとともに、機械学的に異なる理由
による不妊症の患者を一層一般的に識別することができ
る能力を試験するものである。「フェルティライザ・ス
テライザ」第５８（３）巻、第４６５−４８３頁（１９
８８年）に掲載のリウ等の論文およびこの論文に引用さ
れている文献を参照されたい。正の対照検定を行なうた
めに、先体反応が、非天然の、例えば、化学薬品のよう
な合成の先体誘起物質により誘起される。抱合体により
誘起される先体反応の場合と同様に、正の対照検定は、
最後まで行ない、本発明の方法の正確度を最大にすべき
である。当業者であれば、標準的な手順に従って最適な
反応条件を定めることができる。先体反応を非生理学的
に誘起するものと報告されているカルシウムイオノフォ
アＡ２３１８７およびイオノマイシン(ionomycin) ［セ
ントルイスに所在するシグマ・カンパニ−］が好まし
い。「ジャーナル・オブ・リプロダクション・フェルテ
ィライザ」第７４巻、第３８３−８８頁（１９８５年）
に掲載のテサリク(Tesarik) 等の論文および「ジャーナ
ル・オブ・アンドロロジア」第１２（２）巻、第９８−
１０３頁（１９９１年）に掲載のキュミンズ(Cummins)
等の論文を参照されたい。一般的には、イオノフォアの
濃度は、約５乃至約２０マイクロモルである。好ましい
濃度は、約１０マイクロモルである。

【００２６】第２の負の対照検定は、先体反応物質を含
まない培養基または緩衝溶液を使用して、***サンプル
のアリコットに対して行なわれる。この検定は、試験ま
たは検定条件下で先体反応を自然に即ち自発的に行な
う、所定のサンプル内の***のパーセントを測定するた
めに行なわれる。即ち、この検定は、先体反応誘起物質
の存在の有無に拘らず、先体反応を行なう、所定の***
サンプルにおける比較的小さい割合の***細胞を測定す
るものである。かくして、この検定は、本発明の方法の
正確度および信頼性を一層高める。正および負の対照の
それぞれにおける先体反応の程度は、上記した方法に従
って測定することができる。

【００２７】負の対照検定はまた、上記した以外のグリ
コシドを本発明の方法において使用することができる手
段を提供するものである。即ち、（上記したように）高
分子に結合されたときに、負の対照と比較して先体反応
の刺激を少なくとも２倍高めるかかるグリコシドが、本
発明において使用するのに適している。

【００２８】次に、抱合体により誘起された先体反応の
程度が、正および負の対照の結果に対して計算される。
好ましい実施例においては、この値は、相対刺激のパー
セント（％ＳＴＩＭ）として表わされる。この相対刺激
は、抱合体誘起の***細胞と負の対照即ち自発的に誘起
される***細胞との間の程度の差であり、正の対照即ち
非生理学的に誘起される***と負の対照との間の先体反
応の程度により除される。

【００２９】先体反応の相対度の計算は、次に、本技術
分野において公知の方法に従って男性からの***の受精
能力を評価しあるいは決定するのに使用される。好まし
い実施例においては、幾つかの患者からの***サンプル
から得られる個々の結果は、妊娠可能な女性の卵子ドナ
ーからの卵母細胞と生体外で受精を行なう同じ***サン
プルの能力と互いに関係づけられ、次いで、蓄積され
る。蓄積された患者のデータに基づくかかる相関関係に
より、当業者は、正常および異常な受精速度に対応する
ＳＴＩＭ範囲を確立することができるので、所定の男性
の***の受精能力を正確に予測することができる。

【００３０】本発明の方法は、臨床検査室において容易
に実施することができる。かかる実施を容易にするため
に、本発明の方法を実施するのに必要な試薬を含む装置
(kit) もまた、本発明により提供されている。一般に、
この装置は、グリコシド−高分子抱合体から予め調製さ
れた溶液と、取外し自在の標識とを有している。装置は
また、正の対照および負の対照の個々の溶液を含む。例
えば、グリコシド−高分子抱合体と正および負の対照の
溶液を別々の検定容器に加え、窒素流の下で乾燥し、蓋
をする。これらの溶液は、冷凍保存の状態で約６か月間
生存状態を維持する。先体反応の分析を顕微鏡を使用し
て行なう場合には、本発明の装置は更に、１つ以上の取
着装置、例えば、顕微鏡スライドを備えることができ、
この上で先体反応に供された***の測定を行なうことが
できる。

【００３１】

【作用】本明細書に開示の本発明の方法は、現在利用す
ることができる受精試験に関連する多くの欠点を有効に
克服することができる。本発明の方法は、人または動物
の卵子、ＺＰ、小胞流体その他の天然の生物学的組成物
を必要としない。本発明の方法は、容易に入手すること
ができかつ容易に合成することができる試薬を用いて実
施例することができる。更に、この試験の結果は、著し
い再現性を有する。本発明の方法は、精虫が個々の基準
でマークされるので、男の所定の***の固体群に関する
一層信頼性のある統計学的な情報を提供する。更に、本
発明の方法は、上記した利点から明らかなように、不妊
症の原因が精虫自体の欠陥に関連する場合にはこれを一
層正確に予測し、従って、高価な外科的処置を必要とす
る別の評価および処置の必要性をなくすことができる。
更に、人の***を使用するのが好ましいが、本発明の方
法は他のほ乳類の***にも適用することができる。

【００３２】

【実施例】本発明を、以下に詳細に記す実施例に関して
更に説明する。これらの実施例は、単に例示を目的とす
るものであって、別に特定しない限り限定的に解釈され
るべきではない、別に指定しない限り、パーセントは全
て重量である。

【００３３】実施例１ネオグリコプロテインの調製パラ−アミノフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
ースアミニド−ウシ血清アルブミン（「ＢＡＳ−Ｇｌｃ
ＮＡｃ」）と、パラ−アミノフェニル−Ｎ−アセチル−
β−Ｄ−ガラクトースアミニド−ウシ血清アルブミン
（「ＢＳＡ−ＧａｌＮＡｃ」）と、パラ−アミノフェニ
ル−α−Ｄ−マンノピラノシド−ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ−Ｍａｎ）を、（アメリカ合衆国、ミズーリー
州、セントルイスに所在する）シグマ・ケミカル・カン
パニーから入手した。フコース、ガラクトース、グルコ
ースおよびラクトースのピラノシルフェニルイソチオシ
アネート誘導体と、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコース
アミンフェニルイソチオシアネートも同様にシグマから
入手し、「バイオロジカル・セル」第５１巻、第１８７
−１９６頁（１９８４年）に掲載のモンシグニー(Monsi
gny)等の論文に記載のようにしてＢＳＡに結合させた。
この技術はまた、２つの残分Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコースアミン−フェニルイソチオシアネートとマンノ
ースフェニルイソチオシアネートとを有するＢＳＡを誘
導するのに使用した。これらの残分は、ｐＨが９．５の
０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌの濃度
で溶解させ、同じ緩衝液において１ｍｇ／ｍｌの濃度の
ＢＳＡ１０容量と混合させた。培養を５℃で一晩行なっ
た。０．５ＭエタノールアミンのＰＢＳ溶液３００μｌ
を加えることにより反応を停止し、次いで、室温で３０
分間培養を行なった。誘導されたＢＳＡは、セファデッ
クス(Sephadex)（登録商標）Ｇ−２５でのクロマトグラ
フィにより反応を行なわなかった糖から分離した。

【００３４】実施例２グリコシド−デンドリマ抱合体の調製Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコースアミンフェニルイソ
チオシアネートの多数の残分(multiple residues) を、
ポリアミドアミンデンドリマ微粒子［ダウ・ケミカル・
カンパニー(Dow Chemical Co.)のスターバースト(Starb
urst) （登録商標）］に次のようにして結合させた。デ
ンドリマスターバースト［ポリサイエンス(Polyscienc
e) カタログ＃２１１５３］は、直径が４０オングスト
ロームで、分子量が４３，５００の粒子である。これら
は、分子当たり１９２のＮＨ₂残分を担持する。製造者
により提供されたストック溶液は１ｍｌ当たり２ｘ１０
¹⁶分子即ち３３ｍＭの濃度を有していた。デンドリマス
トック溶液（１ｍｌ）に、０．５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐ
Ｈ９．５）０．１５ｍｌと、水およびジメチルスルホキ
シド（１：１）の混合物２００μｌに溶解させたＮ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコースアミンフェニルイソチオシ
アネート０．５ｍｇを補充した。培養を５℃で一晩行な
った。０．５ＭエタノールアミンのＰＢＳ溶液３００μ
ｌを加えることにより反応を停止し、次いで、室温で３
０分間培養を行なった。誘導されたデンドリマを、蒸留
水で平衡させたセファデックスＧ−２５のカラムを通過
させることにより、他の試薬からクロマトグラフ分離し
た。マンノースフェニルイソチオシアネートの結合に同
じプロトコールを使用した。セファデックスのカラムの
溶出液への組込み速度は２００乃至３２０ｎｍの範囲で
吸光分光分析により評価した。結合残分は、２４０ｎｍ
で吸収ピークの特徴を呈した。この結合プロトコールを
使用し、グリコシド残分の最大組込みの半分を行なうこ
とにより、本発明の方法の目的に関してデンドリマ抱合
体がＧｌｃＮＡｃＢＳＡと機能的に同等となるようにし
た。

【００３５】実施例３ ***サンプルの調製と***の能力付与 ***サンプルを、世界保健機構の基準に従って受精能力
のある男性から得た。上記した「ＷＨＯ実験室マニュア
ル」を参照されたい。完全に液化した後に、***細胞を
精漿から分離した。１．５ｍｌのマイクロ遠心器円錐チ
ューブに入れた７００μｌのパーコール(Percoll) （登
録商標）の上に各サンプルの１／２ミリリットルを層状
に形成し、９００ｘｇで１０分間遠心分離処理すること
により、５０％等張パーコールグラジェントで精漿から
分離した。***のペレットを再懸濁させ、［ＢＳＡ、フ
ラクションＶ３５ｍｇ／ｍｌ（主成分がアルブミンであ
る血清の標準分別物、シグマ・ケミカル・カンパニーか
ら入手可能）３５ｍｇ／ｍｌを含む］ＢＷＷ培養基［フ
リーマン(Freeman) （サンフランシスコ）発行、ビッガ
ーズ(Biggers) 等著の「ほ乳類胎生学の方法」(Methods
in Manmmalian Embryology)第８６−１１６頁参照］
で、マイクロ遠心器において円錐状の１．５ｍｌチュー
ブにおいて９００ｘｇで回転させることにより、２回洗
浄した。最終ペレットを再懸濁させ、ＢＷＷ培養基にお
いて２回洗浄し、５％ＣＯ₂ を含む３７℃の空気中にお
いて１０乃至１８時間同様のチューブで培養を行なっ
た。

【００３６】実施例４先体反応の誘起能力付与に続いて、***懸濁液（１−２ｘ１０⁶細胞個
／ｍｌ）のアリコット（３００−４００μｌ）を、プラ
スチックのマイクロ遠心器チューブに移した。負の対照
としての新鮮なＢＷＷ培養基２０μｌである溶液Ａと、
実施例１および２において調製した異なるグリコシド−
高分子抱合体（最終濃度１−２μｇ／ｍｌ）の各２００
μｇ／ｍｌのストック溶液２０μＧである溶液Ｂと、正
の対照としてのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７
［アメリカ合衆国、サンジエゴに所在するカルバイオケ
ムベーリング(Calbiochem-Behring)］の１ｍＭジメチル
スルホキシドストック溶液または最終濃度が１０μＭの
イオノマイシン２μｌである溶液Ｃとを加えた。チュー
ブに蓋をしてから、数秒間撹拌を行なった。次に、チュ
ーブを開放し、ＣＯ₂５％を含む空気雰囲気において３
７℃で６０分間培養を行なった。

【００３７】実施例５ａ先体反応の蛍光測定先体反応の測定を、「ガム・レス」(Gam. Res.) 第１５
巻、第２１３−２２６頁（１９８６年）に掲載のクロス
(Cross) 等の論文に記載の方法に従い、「ジャーナル・
オブ・リプロダクション・フェルティライザ」第９５
巻、第７５５−７６３頁（１９９２年）に掲載のメンド
ーサ(Mendoza) 等の論文に開示のように多少の修正を加
えながら行なった。ネオグリコプロテイン即ち緩衝液で
処理した後、***細胞をＰＢＳにおける遠心分離により
３回（各回１ｍｌ）洗浄し、湿潤な室においてポリリシ
ンをコーティングしたスライドの上に拡げた。細胞が表
面に被着した後（約２０分）に緩衝液をピペットで除去
し、細胞を２分間乾燥させ、スライドを９５％メタノー
ルに４℃で３０秒間浸漬して細胞透過を行ない、次に、
室温において空気流の下で迅速乾燥を行なった。０．０
２ｍｇ／ｍｌのポリリシン（アメリカ合衆国、ミズーリ
ー州、セント・ルイスに所在するシグマ・ケミカル・カ
ンパニーの分子量１５，０００のもの）の溶液３０μｌ
を蛍光スライド［アメリカ合衆国、ペンシルバニア州、
ワリントンに所在するポリサイエンス(Polyscience) の
もの］上で乾燥することにより、スライドのポリリシン
コーティングを行なった。これらのスライドは、使用す
るまで冷気雰囲気、例えば、５−１０℃の雰囲気におい
て、埃のない、封止されたプラスチックの袋または箱に
保管した。

【００３８】スライドを室温で乾燥し、各溜めで、燐酸
緩衝生理的食塩水溶液においてフルオレセインイソチオ
シアネート（ＦＩＴＣ）に結合された５０μｇ／ｍｌエ
ンドウマメアグルチニンの３０μｌ、２０ｍＭ燐酸ナト
リムおよび０．１５Ｍ塩化ナトリウムｐＨ７．２（ＰＢ
Ｓ）を用いて３０分間室温で培養を行なった。スライド
を蒸留水流で洗浄し、かつ、スライドを水に１５分間室
温で浸漬することにより未結合のレクチンを除去した。
次に、スライドを室温の空気流の下で乾燥し、ＰＢＳ：
グリセロール（重量比１：９）の混合物内に装置し、カ
バースリップで覆った。蛍光細胞を、フルオレセインフ
ィルタを装備したエピ蛍光顕微鏡［日本国に所在する、
ニコン、日本光学株式会社のラボフォト(Labophot)顕微
鏡］において記録を行なった。上記したクロス等の論文
およびメンドーサ等の論文に記載されているように、異
なる染色状態に関して、溜め当たり百個の細胞に記録を
行なった。

【００３９】結果は、下記の式１

【式１】に従い、相対刺激のパーセントとして表わしたが、式１
において、％ＡＲｔは被処理細胞における先体反応（Ａ
Ｒ）のパーセントを示し、％ＡＲｃは緩衝液（負の対
照）においてのみ培養された細胞におけるＡＲのパーセ
ントを示し、％ＡＲｉはイオノフォアで処理された細胞
（正の対照）におけるＡＲのパーセントを示す。正常な
（受精能力を有する）男と不妊の男のそれぞれに対する
これら３つの値の例が、以下に示す表１において、ライ
ン２、１および３にそれぞれ示されている。

【００４０】実施例５ｂ先体反応の非蛍光測定 ***の先体に、実施例３に記載の手順に従って能力を付
与し、次いで、ペルオキシダーゼ標識エンドウマメアグ
ルチニン［アメリカ合衆国、カリフォルニア州に所在す
るベクター(Vector)］で染色を行なった。培養（６０
分）後、未結合のレクチンをＰＢＳで洗浄し、ペルオキ
シダーゼ０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．２において０．
０１％の過酸化水素および０．０４％ジアミノベンジジ
ンと約１０分間反応させた後に視認を行なった。

【００４１】標準的な光学顕微鏡を使用して標識***細
胞の記録を行なった（データは示さず）。

【００４２】実施例６２人の患者の検討におけるＳＴＩＭ結果の補正とＩＶＦ
結果生体外受精（ＩＶＦ）プロトコールに参加した２人の患
者からの***を、患者の妻の卵母細胞の生体外受精と同
時に、本発明の方法による分析に供した。患者からの精
子は、ＢＷＷ培養基においてまたは血清を含まない同等
物において８乃至１６時間能力付与に供し（最初の培
養）、次いで、受精のために人間の卵母細胞とともにペ
トリ皿に移した。１６時間後、患者Ａに対する６個の卵
母細胞と患者Ｂに対する５個の卵母細胞を、細胞質の脱
凝縮***頭部と第２極体の放出とを観察することにより
記録した。第１の培養のアリコットに、卵母細胞での培
養に先立ち、実施例４に記載したようにして、緩衝液、
ＢＳＡ−ＧｌｃＮＡｃまたはイオノフォアを補給し、実
施例５ａに記載のようにして先体反応を測定した。

【００４３】結果は、以下に示す表１の通りであった。

【表１】

【００４４】６２％の正常なＳＴＩＭ値（ライン４）を
有する患者Ａからの***は、試験において使用された人
の卵子の全てに受精した（ライン６）。これに対して、
患者Ｂからの***は、１７％という低いＳＴＩＭ値を呈
し（ライン４）、人の卵子のいずれとも受精しなかった
（ライン６）。

【００４５】これに対して、「ＷＨＯ実験室マニュア
ル」に開示されているＨＯＰＴを使用した場合、患者Ａ
およびＢの双方からの***は、正常であると考えられる
範囲にあるハムスターの卵母細胞を通過し、かくして、
患者Ｂからの***は人の卵子と相互作用を行なわず、受
精しないものと予測し得ないことにより不正確な結果を
提供した（表１、ライン６）。更に、患者Ｂからの***
は、累積細胞層（露出帯層完全卵母細胞）なしに曝され
たときに人の卵母細胞に結合しないことを示している。
自然に先体反応を行なうサンプルの***のパーセントを
測定する患者ＡおよびＢのＡＲｃ値（それぞれ、１０±
１％および１１±２％）は、「ヒューマン・リプロダク
ション」第８（１２）巻、第２１５５−６６頁（１９９
３年）に掲載のベノフ(Benoff)等の論文の図３（Ｄ）に
記載の測定値と適合している。

【００４６】実施例７平均ＳＴＩＭ値とＩＶＦ結果との相関関係：多数の患者
の検討多数の卵胞発現が、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）［メト
ロジン(Metrodine（登録商標）：セロノ・ラボラトリー
ズ(Serono Laboratories) ］と閉経婦人尿性腺刺激ホル
モン（ＨＭＧ）［ペルゴナール（登録商標）、セロノ・
ラボラトリーズ］との組み合わせを用いたＩＶＦによる
婦人探索処理において誘起された。卵母細胞の検索を、
５，０００単位ＨＣＧ注入後３６時間、腟超音波案内吸
引により行なった。［ウイリアムズ・アンド・ウィルカ
ーズ(Williams and Wilkers)［ボルチモア(Boltimore)
］１９８６年発行、ジョーンズ(Jones) 等編の「生体
外受精−ノーフォーク(In Vitro Fertilization-Norfol
k)の第１６８頁に掲載のビーク(Veeck) 等の論文「授精
および受精」(Insemination and Fertilization)に開示
の確立されたガイドラインに従って行なわれるＩＶＦ、
卵母細胞授精および胚培養の***処理参照。

【００４７】受精能力が未知の男性からの***に対し
て、上記したようにして、１６乃至２０時間生体外で能
力付与を行なった。１乃至２百万個の細胞を含む１ｍｌ
のアリコットを使用して、グリコシド−高分子抱合体お
よびイオノフォア正対照との先体反応の誘起を行なっ
た。

【００４８】卵母細胞は、「累積細胞伸展」("cumulus
cell-spreading")技術により、集めた直後に核成熟に関
して試験を行ない、未熟（胚胞存在、前記Ｉ）、中期Ｉ
（第１の極体の胚胞の存在なし）または中期ＩＩ（第１
の極体存在）として分類した。

【００４９】未熟の卵母細胞は、胚胞の破壊が生ずるま
で２４時間、ＦＳＨを含むＨａｍＦ１０培養基において
培養状態に保持し、次いで、１６乃至２４時間***とと
もに培養した。成熟した卵母細胞は、検索直後にまたは
同等の結果を有する培養基における培養後に授精させ
た。

【００５０】各卵母細胞は、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを
補給したハムＦ１０培養基１ミリリットル当たり１０，
０００乃至１００，０００個の***と授精させた。授精
から２４時間後、２つの前核を有する卵母細胞が受精し
たと考えられ、次に、開裂および女性への復位のために
新鮮な受精培養基で更に培養させた。

【００５１】生体外受精に先立ってまたは生体外受精と
同時に、本発明に従って試験を行なった全ての患者は、
ＩＶＦの速度に従ってグリープＩとグループＩＩの２つ
のカテゴリに分けられた。即ち、グループＩは、受精さ
れた卵子の０−２５％を有し、低受精速度を有するもの
として特徴づけられ、グループＩＩは５１−１００％の
受精卵子を有し、高受精速度を有するものとして特徴づ
けられた。

【００５２】患者は、ＩＶＦの性能（受精された卵母細
胞のパーセント）に従ってグループ分けされた。累積結
果は、下記の表２に示す通りであった。

【表２】

【００５３】試験を受けた全ての患者は、ＩＶＦに関す
る範囲において著しく高いか、あるいは著しく低いかで
あった。これらのグループにおける結果の統計学的比較
を、一方向変動試験(one-way variance test) と複数比
較に関するシェフ試験(Scheffe's test)［グラフィック
・ソフトウエア・コーポレイション・インコーポレイテ
ッド(Graphic Software Corporation, Inc.)を使用して
行なった。グループＩの８人の患者のうちの２人は、比
較的高い（２０％を越える）ＳＴＩＭ値を有していた
が、受精割合は零であった。これらのケースを入念に分
けた。これら２つのケースにおいて、受精が不首尾であ
ったのは、***を原因とするものではなく、「女性のフ
ァクタ」によるものであった。これは、２つの事実、即
ち、ａ）受精能力のあるドナーからの***の受精能力の
ない卵母細胞への不結合およびｂ）高いＳＴＩＭ値を有
する***を受精能力のあるドナーからの卵母細胞ととも
にその後培養を行なったときには受精があったという事
実により明らかとなった。

【００５４】１５％よりも低いＳＴＩＭ値を有する***
サンプルが受精した卵子の数は、零乃至著しく少数であ
った。かくして、正常のＳＴＩＭ値を有する***が卵子
に受精しない場合には、受精の失敗を説明するうえで、
卵母細胞の受精能力を調査しなければならない。かかる
評価は、受精能力のない卵母細胞と、受精能力のあるド
ナーからの***との受精を標準的な技術に従って試験す
ることにより行なうことができる。

【００５５】本明細書において掲げた刊行物および特許
はいずれも、本発明が属する技術分野における通常の知
識を有するものの技術レベルを示すものである。これら
の刊行物および特許は、特定してかつ個々に引用される
場合でも、同じ程度に引用されるものである。

【００５６】本発明の種々の修正が当業者に明らかとな
るものである。かかる修正は、特許請求の範囲に記載の
本発明の範囲に含まれるものである。

【００５７】

【発明の効果】本発明の方法を用いて得られる結果は、
ＩＶＦの結果に対して正の相関関係を有する。かかる結
果は、***が受精にとって重要な先体反応を行なう能力
についての包括的な分析の基づくものであって、単にそ
の一の観点、例えば、結合だけによるものではないの
で、公知の方法を使用して得られる結果と比べて信頼性
が有意に高いものとなる。同時に、本発明の方法は、現
在使用されている方法に関連する種々の欠点を除去する
ことができる。更に、実施例７において説明したよう
に、***が受精能力を有する場合には、本発明の方法
は、受精能力のない卵子の検出を行なうことができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ほ乳類から得た***細胞のサンプルに能力
を付与する工程と、かくして能力を付与された***細胞を、能力を付与され
た***細胞において先体反応を誘起するのに十分な条件
と時間の下で高分子と糖のグリコシド誘導体との所定濃
度の抱合体とともに培養する工程と、かくして培養された***細胞の先体反応の程度を正およ
び負の対照に対して計算することにより雄の***細胞の
受精能力を前記計算の関数として評価することができる
ようにした工程とを備えることを特徴とするほ乳類の精
子細胞の受精能力を評価する方法。
【請求項２】雄の***細胞の受精能力を前記計算の関数
として評価する工程を更に備えることを特徴とする請求
項１に記載の方法。
【請求項３】先体反応の程度を計算する前記工程に先立
ち前記培養された***細胞を検出可能な標識と反応させ
ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記糖はＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコー
スアミン、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトースアミン
またはマンノースであることを特徴とする請求項１に記
載の方法。
【請求項５】前記グルコシド誘導体はｐ−アミノフェニ
ル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコースアミド、２−ア
セトアミド−Ｎ−（ε−アミノカプロイル）−２−デオ
キシ−β−Ｄ−グルコースアミンまたはパラ−アミノフ
ェニル−α−Ｄ−マンノピラノシドであることを特徴と
する請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記高分子は合成または天然の球状重合材
料であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記高分子は合成材料であることを特徴と
する請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記合成材料はデンドリマであることを特
徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】前記重合材料はプロテインであることを特
徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】前記プロテインは血清アルブミンである
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】前記血清アルブミンはウシ血清アルブミ
ンであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】前記ほ乳類の***細胞のサンプルは人か
ら得ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】前記培養工程は少なくとも１時間行なわ
れることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】糖のグリコシド誘導体と高分子との前記
抱合体の第１の溶液と、前記正の対照の検定用の第２の
溶液と、前記負の対照の検定用の第３の溶液とを備え、
前記各溶液は別々に収容されることを特徴とする請求項
１に記載の方法を実施する装置。
【請求項１５】検出可能の標識の溶液を更に備えること
を特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】少なくとも１つの取着装置を更に備える
ことを特徴とする請求項１４に記載の装置。