JPH07313179A - トランス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法 - Google Patents
トランス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法Info
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- JPH07313179A JPH07313179A JP6156237A JP15623794A JPH07313179A JP H07313179 A JPH07313179 A JP H07313179A JP 6156237 A JP6156237 A JP 6156237A JP 15623794 A JP15623794 A JP 15623794A JP H07313179 A JPH07313179 A JP H07313179A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 医薬品原料または食品添加物として有用なト
ランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを工業的に有利
に製造する。また微量のプロリン類光学異性体の特異的
高感度自動分離分析を可能にする。 【構成】 ダクチロスポランジウム属またはアミコラト
プシス属由来でかつＬ−プロリンからトランス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリンへの水酸化反応を触媒する酵素
源、二価鉄イオンおよび２ケトグルタル酸の存在下、水
性媒体中でＬ−プロリンをトランス−４−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンに変換させ、生成したトランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンを該水性媒体中より採取すること
を特徴とするトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
の製造法および該製造法に有用なＬ−プロリン４位水酸
化酵素、ならびに、プロリン類を含有する試料を高速液
体クロマトグラフィーを用いて分析する方法。
ランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを工業的に有利
に製造する。また微量のプロリン類光学異性体の特異的
高感度自動分離分析を可能にする。 【構成】 ダクチロスポランジウム属またはアミコラト
プシス属由来でかつＬ−プロリンからトランス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリンへの水酸化反応を触媒する酵素
源、二価鉄イオンおよび２ケトグルタル酸の存在下、水
性媒体中でＬ−プロリンをトランス−４−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンに変換させ、生成したトランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンを該水性媒体中より採取すること
を特徴とするトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
の製造法および該製造法に有用なＬ−プロリン４位水酸
化酵素、ならびに、プロリン類を含有する試料を高速液
体クロマトグラフィーを用いて分析する方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、医薬品の合成原料また
は食品添加物として有用なトランス−４−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンを工業的に製造する方法、該方法に有用な
新規Ｌ−プロリン４位水酸化酵素、ならびに臨床検査等
に有用なプロリン類特異的高感度検出方法に関する。
は食品添加物として有用なトランス−４−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンを工業的に製造する方法、該方法に有用な
新規Ｌ−プロリン４位水酸化酵素、ならびに臨床検査等
に有用なプロリン類特異的高感度検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】微生物を用いトランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを製造する方法として １）エッシェリヒア属に属する微生物を用い、４−ヒド
ロキシ−２−オキソグルタル酸からトランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法（特開平３−２６
６９９５） ２）かび類を用い直接発酵生産する方法（European Pat
ent Application EP 0 547 898 A2） ３）ストレプトマイセス属に属する微生物を用い、Ｌ−
プロリンから製造する方法〔ジャーナル オブ バイオ
ロジカル ケミストリー（J. Biol. Chem.) ，２５４
巻，６６８４〜６６９０ページ（１９７９年）、バイオ
ケミカル アンドバイオフィジカル リサーチ コミュ
ニケーション（Biochem. Biophys. Res. Comm.），１２
０巻，４５〜５１ページ（１９８４年）〕 が知られている。
−Ｌ−プロリンを製造する方法として １）エッシェリヒア属に属する微生物を用い、４−ヒド
ロキシ−２−オキソグルタル酸からトランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法（特開平３−２６
６９９５） ２）かび類を用い直接発酵生産する方法（European Pat
ent Application EP 0 547 898 A2） ３）ストレプトマイセス属に属する微生物を用い、Ｌ−
プロリンから製造する方法〔ジャーナル オブ バイオ
ロジカル ケミストリー（J. Biol. Chem.) ，２５４
巻，６６８４〜６６９０ページ（１９７９年）、バイオ
ケミカル アンドバイオフィジカル リサーチ コミュ
ニケーション（Biochem. Biophys. Res. Comm.），１２
０巻，４５〜５１ページ（１９８４年）〕 が知られている。
【０００３】１）の方法においては４−ヒドロキシ−２
−オキソグルタル酸が高価かつ入手が困難であり、生産
性が低く、２）の方法においても生産性が低く、３）の
方法においてはトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンの製造に関与する酵素の活性が極めて微弱なため、反
応生産物が放射性化合物を用いなければ検出できないほ
ど微量であり、いずれの方法を用いても工業化は困難で
ある。
−オキソグルタル酸が高価かつ入手が困難であり、生産
性が低く、２）の方法においても生産性が低く、３）の
方法においてはトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンの製造に関与する酵素の活性が極めて微弱なため、反
応生産物が放射性化合物を用いなければ検出できないほ
ど微量であり、いずれの方法を用いても工業化は困難で
ある。
【０００４】トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
への水酸化反応を触媒する酵素は単離されておらず、ダ
クチロスポランジウム属あるいはアミコラトプシス属に
属する微生物由来でかつＬ−プロリンからトランス−４
−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンへの水酸化反応を触媒する
酵素源を用いてトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンを製造する方法については知られていない。また前記
のストレプトマイセス属に属する微生物から、Ｌ−プロ
リン４位水酸化酵素を精製したとの報告がある〔テトラ
ヘドロン レターズ（Tetrahedron Letters），３４
巻，７４８９〜７４９２ページ（１９９３年）〕が、そ
の理化学的性質等は開示されていない。いずれにして
も、遊離のＬ−プロリンを水酸化してトランス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する反応を触媒するＬ−
プロリン４位水酸化酵素はこれまでに単離されたことが
なく、またその理化学的性質も明かにされていない酵素
である。
への水酸化反応を触媒する酵素は単離されておらず、ダ
クチロスポランジウム属あるいはアミコラトプシス属に
属する微生物由来でかつＬ−プロリンからトランス−４
−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンへの水酸化反応を触媒する
酵素源を用いてトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンを製造する方法については知られていない。また前記
のストレプトマイセス属に属する微生物から、Ｌ−プロ
リン４位水酸化酵素を精製したとの報告がある〔テトラ
ヘドロン レターズ（Tetrahedron Letters），３４
巻，７４８９〜７４９２ページ（１９９３年）〕が、そ
の理化学的性質等は開示されていない。いずれにして
も、遊離のＬ−プロリンを水酸化してトランス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する反応を触媒するＬ−
プロリン４位水酸化酵素はこれまでに単離されたことが
なく、またその理化学的性質も明かにされていない酵素
である。
【０００５】プロリン類の分析定量方法としては、ニン
ヒドリンを用いた比色定量法が知られているが、プロリ
ン類のイミノ酸に対するニンヒドリンの発色感度は低
く、プロリン類を高感度に検出することができない。プ
ロリン類のイミノ酸に対する特異的な検出方法として、
塩基性条件下、７−クロロ−４−ニトロベンゾ−２−オ
キサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）クロライドによっ
てプロリン類をＮＢＤ化し、得られたプロリン誘導体を
高速液体クロマトグラフィーで検出する方法が知られて
いる〔アナリティカル バイオケミストリー（Anal. Bi
ochem.) 、１３８巻、３９０〜３９５頁、１９８４
年〕。
ヒドリンを用いた比色定量法が知られているが、プロリ
ン類のイミノ酸に対するニンヒドリンの発色感度は低
く、プロリン類を高感度に検出することができない。プ
ロリン類のイミノ酸に対する特異的な検出方法として、
塩基性条件下、７−クロロ−４−ニトロベンゾ−２−オ
キサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）クロライドによっ
てプロリン類をＮＢＤ化し、得られたプロリン誘導体を
高速液体クロマトグラフィーで検出する方法が知られて
いる〔アナリティカル バイオケミストリー（Anal. Bi
ochem.) 、１３８巻、３９０〜３９５頁、１９８４
年〕。
【０００６】光学活性アミノ酸を配位子として担体に固
定化し、これと分析対象アミノ酸との錯体を銅イオンを
介して形成させることにより、アミノ酸類の光学異性体
を分離する配位子交換クロマトグラフィー法が知られて
いる〔ジャーナル オブ クロマトグラフィー(J.Chrom
atogr.) 、６０巻、２８０〜２８３頁、１９７１年；
同、２１６巻、４０６〜４１２頁、１９８１年〕。該原
理に基づき、高速液体クロマトグラフィー用の市販カラ
ムを用いてアミノ酸の光学異性体を自動的に分離するこ
とは知られている。
定化し、これと分析対象アミノ酸との錯体を銅イオンを
介して形成させることにより、アミノ酸類の光学異性体
を分離する配位子交換クロマトグラフィー法が知られて
いる〔ジャーナル オブ クロマトグラフィー(J.Chrom
atogr.) 、６０巻、２８０〜２８３頁、１９７１年；
同、２１６巻、４０６〜４１２頁、１９８１年〕。該原
理に基づき、高速液体クロマトグラフィー用の市販カラ
ムを用いてアミノ酸の光学異性体を自動的に分離するこ
とは知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従来のトランス−４−
ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造方法は（１）原料が高
価である、（２）反応工程が多い、（３）分離精製工程
が複雑である、（４）生産性が低い、等の点で工業的製
造方法としては必ずしも満足できる方法ではなく、工業
的に有利なトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの
製造法が求められている。
ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造方法は（１）原料が高
価である、（２）反応工程が多い、（３）分離精製工程
が複雑である、（４）生産性が低い、等の点で工業的製
造方法としては必ずしも満足できる方法ではなく、工業
的に有利なトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの
製造法が求められている。
【０００８】プロリン類の分析定量方法に関しては、プ
ロリン類をＮＢＤ化した後、ＮＢＤ化プロリン類を高速
液体クロマトグラフィーで分離検出する従来法では、プ
ロリン類の光学異性体は分離検出することができない。
また該方法はサンプルの自動分析ができず多量の試料を
処理することができない。一方、配位子交換クロマトグ
ラフィー法を用いればプロリン類の光学異性体を自動的
に分離可能だが、吸光度法を用いた検出では、感度が悪
く微量成分の検出は困難である。そのため、新規なプロ
リン類の光学異性体の高感度自動検出法の開発が望まれ
ている。
ロリン類をＮＢＤ化した後、ＮＢＤ化プロリン類を高速
液体クロマトグラフィーで分離検出する従来法では、プ
ロリン類の光学異性体は分離検出することができない。
また該方法はサンプルの自動分析ができず多量の試料を
処理することができない。一方、配位子交換クロマトグ
ラフィー法を用いればプロリン類の光学異性体を自動的
に分離可能だが、吸光度法を用いた検出では、感度が悪
く微量成分の検出は困難である。そのため、新規なプロ
リン類の光学異性体の高感度自動検出法の開発が望まれ
ている。
【０００９】本発明の目的は、発酵法によって糖源から
工業的に生産されているＬ−プロリンを直接微生物的あ
るいは酵素的に水酸化することにより、工業的に有利に
トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方
法および該方法に有用なＬ−プロリン４位水酸化酵素を
提供すること、ならびに高速液体クロマトグラフィーを
用いて、多数の試料を効率良く処理することが可能で、
試料中に存在するプロリン類の光学異性体を分離すると
同時に、分離したプロリン類を、他の夾雑アミノ酸に邪
魔されることなく特異的にかつ高感度に検出定量する方
法を提供することにある。
工業的に生産されているＬ−プロリンを直接微生物的あ
るいは酵素的に水酸化することにより、工業的に有利に
トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方
法および該方法に有用なＬ−プロリン４位水酸化酵素を
提供すること、ならびに高速液体クロマトグラフィーを
用いて、多数の試料を効率良く処理することが可能で、
試料中に存在するプロリン類の光学異性体を分離すると
同時に、分離したプロリン類を、他の夾雑アミノ酸に邪
魔されることなく特異的にかつ高感度に検出定量する方
法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、ダクチ
ロスポランジウム属あるいはアミコラトプシス属に属す
る微生物由来でかつＬ−プロリンからトランス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリンへの水酸化反応を触媒する酵素
源、二価鉄イオンおよび２−ケトグルタル酸の存在下、
培養物中もしくは水性媒体中でＬ−プロリンをトランス
−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換させ、生成した
トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを該培養物中
もしくは該水性媒体中より採取することを特徴とするト
ランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法および
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を提供することができる。
ロスポランジウム属あるいはアミコラトプシス属に属す
る微生物由来でかつＬ−プロリンからトランス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリンへの水酸化反応を触媒する酵素
源、二価鉄イオンおよび２−ケトグルタル酸の存在下、
培養物中もしくは水性媒体中でＬ−プロリンをトランス
−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換させ、生成した
トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを該培養物中
もしくは該水性媒体中より採取することを特徴とするト
ランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法および
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を提供することができる。
【００１１】本発明で用いられる酵素源は、ダクチロス
ポランジウム（Dactylosporangium）属あるいはアミコ
ラトプシス（Amycolatopsis）属に属する微生物由来で
かつＬ−プロリンを水酸化してトランス−４−ヒドロキ
シ−Ｌ−プロリンを生成する反応を触媒する活性を有し
ていれば、微生物、その培養物、菌体、菌体処理物、精
製酵素または粗酵素のいずれでもよい。微生物の好適な
例としては、ダクチロスポランジウム・エスピー（Dact
ylosporangium sp.）ＲＨ１、アミコラトプシス・エス
ピー（Amycolattopsis sp.）ＲＨ２あるいはこれらの菌
株の継代培養物、突然変異体もしくは誘導体等があげら
れる。
ポランジウム（Dactylosporangium）属あるいはアミコ
ラトプシス（Amycolatopsis）属に属する微生物由来で
かつＬ−プロリンを水酸化してトランス−４−ヒドロキ
シ−Ｌ−プロリンを生成する反応を触媒する活性を有し
ていれば、微生物、その培養物、菌体、菌体処理物、精
製酵素または粗酵素のいずれでもよい。微生物の好適な
例としては、ダクチロスポランジウム・エスピー（Dact
ylosporangium sp.）ＲＨ１、アミコラトプシス・エス
ピー（Amycolattopsis sp.）ＲＨ２あるいはこれらの菌
株の継代培養物、突然変異体もしくは誘導体等があげら
れる。
【００１２】ＲＨ１株は東京都の樹木より、ＲＨ２株は
埼玉県の土壌より、本発明者が新たに分離した微生物で
ある。以下にＲＨ１およびＲＨ２の菌学的性質示す。 １．形態的性質 ＲＨ１およびＲＨ２を各種培地上で２８℃、１４日間培
養したときの形態的性質を第１表にまとめた。
埼玉県の土壌より、本発明者が新たに分離した微生物で
ある。以下にＲＨ１およびＲＨ２の菌学的性質示す。 １．形態的性質 ＲＨ１およびＲＨ２を各種培地上で２８℃、１４日間培
養したときの形態的性質を第１表にまとめた。
【００１３】
【表１】
【００１４】２．培養的性質 ＲＨ１株は、一般に使用されている合成および天然培地
で普通もしくは旺盛な生育を示し、基生菌糸は橙色系を
示す。培地により黄土色あるいは淡赤色系統の可溶性色
素が産生されることもある。ＲＨ２株は、一般に使用さ
れている合成および天然培地で普通もしくは旺盛な生育
を示し、基生菌糸は淡黄色あるいは褐色系を、気菌糸は
白色あるいは灰色系を示す。培地により褐色系統の可溶
性色素が産生されることもある。
で普通もしくは旺盛な生育を示し、基生菌糸は橙色系を
示す。培地により黄土色あるいは淡赤色系統の可溶性色
素が産生されることもある。ＲＨ２株は、一般に使用さ
れている合成および天然培地で普通もしくは旺盛な生育
を示し、基生菌糸は淡黄色あるいは褐色系を、気菌糸は
白色あるいは灰色系を示す。培地により褐色系統の可溶
性色素が産生されることもある。
【００１５】ＲＨ１株およびＲＨ２株を各種培地上で２
８℃、１４日間培養したときの生育および色の特徴を第
２-(1)表および第２-(2)表にまとめた。なお、色の表示
はColor Harmony Manual (Container Corporation of A
merica) による色の分類に従った。
８℃、１４日間培養したときの生育および色の特徴を第
２-(1)表および第２-(2)表にまとめた。なお、色の表示
はColor Harmony Manual (Container Corporation of A
merica) による色の分類に従った。
【００１６】
【表２】
【００１７】
【表３】
【００１８】３、生理学的性質 ＲＨ１株およびＲＨ２株の生理学的性質を第３表にまと
めた。生育温度範囲は液体振盪培養７日後の、その他は
２８℃、２〜３週間後の結果をまとめたものである。
めた。生育温度範囲は液体振盪培養７日後の、その他は
２８℃、２〜３週間後の結果をまとめたものである。
【００１９】
【表４】
【００２０】４．化学分類学的性質 ＲＨ１株およびＲＨ２株の化学分類学的性質を第４表に
まとめた。
まとめた。
【００２１】
【表５】
【００２２】以上、ＲＨ１株は、形態的には気菌糸を形
成しないこと、基生菌糸上に棒状の胞子嚢を形成するこ
と、胞子嚢には運動性を有する胞子が２〜４個含まれる
こと、化学分類的には細胞壁に含まれるジアミノピメリ
ン酸が３−ヒドロキシ−ジアミノピメリン酸であるこ
と、全菌体加水分解物中の還元糖としてアラビノースお
よびキシロースが含まれることから、放線菌の中でダク
チロスポランジウム（Dactylosporangium）属に分類さ
れる。
成しないこと、基生菌糸上に棒状の胞子嚢を形成するこ
と、胞子嚢には運動性を有する胞子が２〜４個含まれる
こと、化学分類的には細胞壁に含まれるジアミノピメリ
ン酸が３−ヒドロキシ−ジアミノピメリン酸であるこ
と、全菌体加水分解物中の還元糖としてアラビノースお
よびキシロースが含まれることから、放線菌の中でダク
チロスポランジウム（Dactylosporangium）属に分類さ
れる。
【００２３】ＲＨ２株は、形態的には気菌糸を形成する
こと、気菌糸および基生菌糸が分断すること、化学分類
的には細胞壁のジアミノピメリン酸としてメソ・ジアミ
ノピメリン酸が、還元糖としてガラクトースおよび微量
のアラビノースが含まれること、全菌体加水分解物中の
還元糖としてアラビノースおよびガラクトースが含まれ
ること、菌体成分としてミコール酸が含まれないこと、
リン脂質としてホスファチジルエタノールアミンを含む
がホスファチジルコリンおよび未知のグルコサミン含有
リン脂質が含まれないこと、メナキノンの主要成分がＭ
Ｋ−９（Ｈ4）であることから、放線菌の中でアミコラ
トプシス（Amycolatopsis）属に分類される。
こと、気菌糸および基生菌糸が分断すること、化学分類
的には細胞壁のジアミノピメリン酸としてメソ・ジアミ
ノピメリン酸が、還元糖としてガラクトースおよび微量
のアラビノースが含まれること、全菌体加水分解物中の
還元糖としてアラビノースおよびガラクトースが含まれ
ること、菌体成分としてミコール酸が含まれないこと、
リン脂質としてホスファチジルエタノールアミンを含む
がホスファチジルコリンおよび未知のグルコサミン含有
リン脂質が含まれないこと、メナキノンの主要成分がＭ
Ｋ−９（Ｈ4）であることから、放線菌の中でアミコラ
トプシス（Amycolatopsis）属に分類される。
【００２４】ＲＨ１株をダクチロスポランジウム・エス
ピー（Dactylosporangium sp.）ＲＨ１、ＲＨ２株をア
ミコラトプシス・エスピ−（Amycolatopsis sp.）ＲＨ
２と命名し、ブダペスト条約に基づいて、ＲＨ１株は平
成５年９月１日付けでFERM BP-４４００として，ＲＨ２
株は平成６年２月２２日付けでFERM BP-４５８１として
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
ピー（Dactylosporangium sp.）ＲＨ１、ＲＨ２株をア
ミコラトプシス・エスピ−（Amycolatopsis sp.）ＲＨ
２と命名し、ブダペスト条約に基づいて、ＲＨ１株は平
成５年９月１日付けでFERM BP-４４００として，ＲＨ２
株は平成６年２月２２日付けでFERM BP-４５８１として
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
【００２５】これらの微生物を培養する培地は、微生物
が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、Ｌ
−プロリンを水酸化してトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンを生成する反応を触媒する活性を有する微生
物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成
培地のいずれでもよい。炭素源としては、それぞれの微
生物が資化し得るものであれば良く、グルコース、フラ
クトース、シュクロース、これらを含有する糖蜜、デン
プンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、
プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等
のアルコール類が用いられる。
が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、Ｌ
−プロリンを水酸化してトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンを生成する反応を触媒する活性を有する微生
物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成
培地のいずれでもよい。炭素源としては、それぞれの微
生物が資化し得るものであれば良く、グルコース、フラ
クトース、シュクロース、これらを含有する糖蜜、デン
プンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、
プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等
のアルコール類が用いられる。
【００２６】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム
塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体
およびその消化物等が用いられる。
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム
塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体
およびその消化物等が用いられる。
【００２７】無機物としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。培養は、振盪培
養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培
養温度は１５〜３７℃がよく、培養時間は、通常１６〜
９６時間である。培養中ｐＨは、５. ０〜９. ０に保持
する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ
溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行
う。
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。培養は、振盪培
養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培
養温度は１５〜３７℃がよく、培養時間は、通常１６〜
９６時間である。培養中ｐＨは、５. ０〜９. ０に保持
する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ
溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行
う。
【００２８】菌体処理物としては、菌体の乾燥物、凍結
乾燥物、界面活性剤処理物、酵素処理物、超音波処理
物、機械的摩砕処理物、機械的圧力処理物、溶媒処理
物、菌体の蛋白分画、菌体および菌体処理物の固定化物
等があげられる。また、酵素源として該菌体より抽出し
て得られるＬ−プロリンからトランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンへの水酸化反応を触媒する活性を有する
酵素、それらの酵素の精製標品、固定化物等も用いられ
る。該活性を有する酵素源としては、下記（１）から
（１０）の理化学的性質を示す新規なＬ−プロリン４位
水酸化酵素をあげることができる。 (1)作用および基質特異性 ２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下、遊離
のＬ−プロリンに作用して、トランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを生成する。 (2)至適ｐＨ ３０℃、２０分間の反応において、ｐＨ６. ０〜７. ０
に至適ｐＨを有する。 (3)ｐＨ安定性 ４℃、２４時間の処理で、ｐＨ６. ５〜１０. ０の範囲
で安定に保たれる。 (4)至適温度 ｐＨ６. ５、１５分間の反応において、３０〜４０℃に
至適温度を有する。 (5)温度安定性 ｐＨ９. ０、５０℃、３０分間の処理で完全に失活す
る。 (6)阻害剤 Zn++およびCu++の金属イオンおよびエチレンジアミンテ
トラ酢酸により阻害を受ける。 (7)活性化 活性化には補酵素を必要としない。
乾燥物、界面活性剤処理物、酵素処理物、超音波処理
物、機械的摩砕処理物、機械的圧力処理物、溶媒処理
物、菌体の蛋白分画、菌体および菌体処理物の固定化物
等があげられる。また、酵素源として該菌体より抽出し
て得られるＬ−プロリンからトランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンへの水酸化反応を触媒する活性を有する
酵素、それらの酵素の精製標品、固定化物等も用いられ
る。該活性を有する酵素源としては、下記（１）から
（１０）の理化学的性質を示す新規なＬ−プロリン４位
水酸化酵素をあげることができる。 (1)作用および基質特異性 ２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下、遊離
のＬ−プロリンに作用して、トランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを生成する。 (2)至適ｐＨ ３０℃、２０分間の反応において、ｐＨ６. ０〜７. ０
に至適ｐＨを有する。 (3)ｐＨ安定性 ４℃、２４時間の処理で、ｐＨ６. ５〜１０. ０の範囲
で安定に保たれる。 (4)至適温度 ｐＨ６. ５、１５分間の反応において、３０〜４０℃に
至適温度を有する。 (5)温度安定性 ｐＨ９. ０、５０℃、３０分間の処理で完全に失活す
る。 (6)阻害剤 Zn++およびCu++の金属イオンおよびエチレンジアミンテ
トラ酢酸により阻害を受ける。 (7)活性化 活性化には補酵素を必要としない。
【００２９】反応液へのＬ−アスコルビン酸の添加は、
反応を促進する。 (8)Ｋｍ値 ８０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６. ５）中に４ｍＭ Ｌ−アス
コルビン酸、２ｍＭ 硫酸第一鉄および酵素標品を含有
する反応液中で測定したＬ−プロリンに対するＫｍ値は
０. ２７ｍＭであり、２−ケトグルタル酸に対するＫｍ
値は０. ５５ｍＭである。 (9)分子量 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動
法による測定で、３２，０００±５，０００ダルトンで
あり、ゲル濾過法によって測定した分子量が４３，８０
０±５，０００ダルトンである。 (10)Ｎ末端アミノ酸配列 配列番号１で表されるＮ末端アミノ酸配列を有する
反応を促進する。 (8)Ｋｍ値 ８０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６. ５）中に４ｍＭ Ｌ−アス
コルビン酸、２ｍＭ 硫酸第一鉄および酵素標品を含有
する反応液中で測定したＬ−プロリンに対するＫｍ値は
０. ２７ｍＭであり、２−ケトグルタル酸に対するＫｍ
値は０. ５５ｍＭである。 (9)分子量 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動
法による測定で、３２，０００±５，０００ダルトンで
あり、ゲル濾過法によって測定した分子量が４３，８０
０±５，０００ダルトンである。 (10)Ｎ末端アミノ酸配列 配列番号１で表されるＮ末端アミノ酸配列を有する
【００３０】
【化１】
【００３１】これら酵素源の反応液中における酵素活性
量は用いる基質の量等により決定されるが、１．０〜１
０，０００，０００Ｕ／ｌ 、好ましくは１０００〜
２，０００，０００Ｕ／ｌ である。反応に用いられる
Ｌープロリンの濃度は、１ｍＭ〜２Ｍである。
量は用いる基質の量等により決定されるが、１．０〜１
０，０００，０００Ｕ／ｌ 、好ましくは１０００〜
２，０００，０００Ｕ／ｌ である。反応に用いられる
Ｌープロリンの濃度は、１ｍＭ〜２Ｍである。
【００３２】反応には二価鉄イオンが必要とされ、通常
１〜１００ｍＭが用いられる。二価鉄イオンとしては、
二価鉄を含み反応を阻害しないものであれば、どのよう
なものでも用いることができる。たとえば硫酸第一鉄な
どの硫化物、塩化第一鉄などの塩化物、炭酸第一鉄など
のほか、クエン酸塩、乳酸塩、フマル酸塩などのような
有機酸塩などをあげることができる。
１〜１００ｍＭが用いられる。二価鉄イオンとしては、
二価鉄を含み反応を阻害しないものであれば、どのよう
なものでも用いることができる。たとえば硫酸第一鉄な
どの硫化物、塩化第一鉄などの塩化物、炭酸第一鉄など
のほか、クエン酸塩、乳酸塩、フマル酸塩などのような
有機酸塩などをあげることができる。
【００３３】また反応には、２−ケトグルタル酸が必要
とされるが、反応液に２−ケトグルタル酸を添加しても
よいし、あるいは用いる菌体および菌体処理物の有する
代謝活性によって２−ケトグルタル酸に転換し得る化合
物を用いてもよい。このような化合物としては、グルコ
ースのような糖質、グルタミン酸、コハク酸等があげら
れる。これらの化合物は単独で用いてもよいし、あるい
は複数を併用してもよい。
とされるが、反応液に２−ケトグルタル酸を添加しても
よいし、あるいは用いる菌体および菌体処理物の有する
代謝活性によって２−ケトグルタル酸に転換し得る化合
物を用いてもよい。このような化合物としては、グルコ
ースのような糖質、グルタミン酸、コハク酸等があげら
れる。これらの化合物は単独で用いてもよいし、あるい
は複数を併用してもよい。
【００３４】水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸
塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリス等の緩衝
液、メタノール、エタノール等のアルコール類、酢酸エ
チル等のエステル類、アセトン等のケトン類、アセトア
ミド等のアミド類があげられる。反応は、Ｌ−プロリン
を水酸化してトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
を生成する反応を触媒する活性を有している前記微生物
の培養物中で行ってもよいし、該培養物から分離した菌
体、該菌体の処理物あるいは精製酵素や粗酵素を用いて
水性媒体中で行ってもよい。
塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリス等の緩衝
液、メタノール、エタノール等のアルコール類、酢酸エ
チル等のエステル類、アセトン等のケトン類、アセトア
ミド等のアミド類があげられる。反応は、Ｌ−プロリン
を水酸化してトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
を生成する反応を触媒する活性を有している前記微生物
の培養物中で行ってもよいし、該培養物から分離した菌
体、該菌体の処理物あるいは精製酵素や粗酵素を用いて
水性媒体中で行ってもよい。
【００３５】反応は通常、温度１５〜５０℃、ｐＨ６.
０〜９. ０、で１〜９６時間行う。必要に応じて、菌体
処理あるいは反応時に界面活性剤や有機溶剤を添加す
る。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・ステア
リルアミン（たとえば、ナイミーンＳ−２１５、日本油
脂社製など）、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマ
イド、カチオンＦＢ、カチオンＦ２−４０Ｅなどのカチ
オン性界面活性剤、ナトリウムオレイルアミド硫酸、ニ
ューレックスＴＡＢ、ラビゾール８０などのアニオン性
界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン・モノステ
アレート（たとえば、ノニオンＳＴ２２１）などの両性
界面活性剤、その他三級アミンＰＢ、ヘキサデシルジメ
チルアミンなどがあげられ、反応を促進するものであれ
ばいずれでも使用できる。これらは通常０．１〜５０ｍ
ｇ／ｍｌ、好ましくは１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で用い
られる。
０〜９. ０、で１〜９６時間行う。必要に応じて、菌体
処理あるいは反応時に界面活性剤や有機溶剤を添加す
る。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・ステア
リルアミン（たとえば、ナイミーンＳ−２１５、日本油
脂社製など）、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマ
イド、カチオンＦＢ、カチオンＦ２−４０Ｅなどのカチ
オン性界面活性剤、ナトリウムオレイルアミド硫酸、ニ
ューレックスＴＡＢ、ラビゾール８０などのアニオン性
界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン・モノステ
アレート（たとえば、ノニオンＳＴ２２１）などの両性
界面活性剤、その他三級アミンＰＢ、ヘキサデシルジメ
チルアミンなどがあげられ、反応を促進するものであれ
ばいずれでも使用できる。これらは通常０．１〜５０ｍ
ｇ／ｍｌ、好ましくは１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で用い
られる。
【００３６】有機溶剤としては、トルエン、キシレン、
脂肪族アルコール、ベンゼン、酢酸エチルなどが用いら
れる。通常０．１〜５０μｌ／ｍｌ、好ましくは１〜２
０μｌ／ｍｌの濃度で用いられる。培養物中または水性
媒体中からトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを
回収する方法としては、イオン交換樹脂等を用いるカラ
ムクロマトグラフィーあるいは晶出法等、通常の分離方
法が用いられる。回収されたトランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンは13Ｃ−ＮＭＲスペクトル、1Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトル、マススペクトル、比施光度等の通常の分
析手段によってその構造を確認することができる。
脂肪族アルコール、ベンゼン、酢酸エチルなどが用いら
れる。通常０．１〜５０μｌ／ｍｌ、好ましくは１〜２
０μｌ／ｍｌの濃度で用いられる。培養物中または水性
媒体中からトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを
回収する方法としては、イオン交換樹脂等を用いるカラ
ムクロマトグラフィーあるいは晶出法等、通常の分離方
法が用いられる。回収されたトランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンは13Ｃ−ＮＭＲスペクトル、1Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトル、マススペクトル、比施光度等の通常の分
析手段によってその構造を確認することができる。
【００３７】本発明により製造されたトランス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリンを含め、プロリン類を含有する
試料を定量分析するには次のような方法（以下、ポスト
カラム誘導体化法という。）で行うことができる。プロ
リン類を含有する試料を高速液体クロマトグラフィーを
用いて分析するに際し、含有する各成分をカラムで分離
溶出後、溶出液を分取することなくそのまま高速液体ク
ロマトグラフィーの送液ライン中で、金属キレート剤を
含有させた緩衝液を混入させた後、７−クロロ−４−ニ
トロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール クロラ
イド（7-chloro- 4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole chl
oride 、ＮＢＤクロライド）溶液と反応させ、反応液中
に生成するＮＢＤ化プロリン類を、該ＮＢＤ化物の蛍光
によって、特異的かつ高感度に検出する。
ドロキシ−Ｌ−プロリンを含め、プロリン類を含有する
試料を定量分析するには次のような方法（以下、ポスト
カラム誘導体化法という。）で行うことができる。プロ
リン類を含有する試料を高速液体クロマトグラフィーを
用いて分析するに際し、含有する各成分をカラムで分離
溶出後、溶出液を分取することなくそのまま高速液体ク
ロマトグラフィーの送液ライン中で、金属キレート剤を
含有させた緩衝液を混入させた後、７−クロロ−４−ニ
トロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール クロラ
イド（7-chloro- 4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole chl
oride 、ＮＢＤクロライド）溶液と反応させ、反応液中
に生成するＮＢＤ化プロリン類を、該ＮＢＤ化物の蛍光
によって、特異的かつ高感度に検出する。
【００３８】本発明においてプロリン類とは、Ｄ−プロ
リン、Ｌ−プロリン等のプロリン、トランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリン、シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリン、トランス−４−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン、シ
ス−４−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン、トランス−３−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリン、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリン、トランス−３−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン、
シス−３−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン等のヒドロキシプ
ロリンがあげられる。
リン、Ｌ−プロリン等のプロリン、トランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリン、シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリン、トランス−４−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン、シ
ス−４−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン、トランス−３−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリン、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリン、トランス−３−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン、
シス−３−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン等のヒドロキシプ
ロリンがあげられる。
【００３９】試料とは、前記のプロリン類を単独または
２種以上組み合わせて含む試料であればどのようなもの
でもよく、血液、唾液、尿、組織液等生体由来の試料が
用いられる。高速液体クロマトグラフィーを用いて、多
数の試料を効率よく処理し、かつ試料中に存在するプロ
リン類の各種異性体を分離するには、光学活性アミノ酸
を配位子として担体に固定化しこれと分析対象アミノ酸
との錯体を銅イオンを介して形成させることにより、ア
ミノ酸類の光学異性体を分離するいわゆる配位子交換ク
ロマトグラフィー法が用いられる。この原理に基づいた
高速液体クロマトグラフィー用のカラムは市販されてお
り、たとえば三菱化成工業株式会社製 MCI GELCRS10W
(DLAA)、東ソー株式会社製 TSKgel Enantio L1、株式会
社住化分析センター製SUMCHIRAL OA5000等をあげること
ができるが、好適には株式会社住化分析センター製SUMC
HIRAL OA5000を用いることができる。分離条件は製品に
指定された使用条件に従えばよい。
２種以上組み合わせて含む試料であればどのようなもの
でもよく、血液、唾液、尿、組織液等生体由来の試料が
用いられる。高速液体クロマトグラフィーを用いて、多
数の試料を効率よく処理し、かつ試料中に存在するプロ
リン類の各種異性体を分離するには、光学活性アミノ酸
を配位子として担体に固定化しこれと分析対象アミノ酸
との錯体を銅イオンを介して形成させることにより、ア
ミノ酸類の光学異性体を分離するいわゆる配位子交換ク
ロマトグラフィー法が用いられる。この原理に基づいた
高速液体クロマトグラフィー用のカラムは市販されてお
り、たとえば三菱化成工業株式会社製 MCI GELCRS10W
(DLAA)、東ソー株式会社製 TSKgel Enantio L1、株式会
社住化分析センター製SUMCHIRAL OA5000等をあげること
ができるが、好適には株式会社住化分析センター製SUMC
HIRAL OA5000を用いることができる。分離条件は製品に
指定された使用条件に従えばよい。
【００４０】ＮＢＤ誘導体化によるプロリン類の検出は
以下の方法によって行われる。最初に、プロリン類を配
位子交換クロマトグラフィーを用いて分離溶出する。次
いで、送液ライン中で溶出液に緩衝液を加え、溶出液の
ｐＨをアルカリ性にする。この際、溶出液に緩衝液を加
えると沈殿を生じ、送液ラインが目づまりを起こし、実
質的に測定不可能となる。この原因が溶出液中の銅イオ
ンの水酸化物が非溶解性の沈殿を形成するためとの見地
から鋭意検討を加えた結果、あらかじめ金属キレート剤
を溶解させておいた緩衝液を、送液ライン中で混合すれ
ば、ラインが目詰まりすることがないことを見出した。
金属キレート剤を溶解させておいた緩衝液を送液ライン
中で溶出液に混合後、更にＮＢＤクロライド溶液を送液
ライン中で混入し、しかる後に該溶出液中のプロリン類
を送液ライン中でＮＢＤ化し、ＮＢＤ化プロリン類の蛍
光を測定することによりプロリン類を検出する。
以下の方法によって行われる。最初に、プロリン類を配
位子交換クロマトグラフィーを用いて分離溶出する。次
いで、送液ライン中で溶出液に緩衝液を加え、溶出液の
ｐＨをアルカリ性にする。この際、溶出液に緩衝液を加
えると沈殿を生じ、送液ラインが目づまりを起こし、実
質的に測定不可能となる。この原因が溶出液中の銅イオ
ンの水酸化物が非溶解性の沈殿を形成するためとの見地
から鋭意検討を加えた結果、あらかじめ金属キレート剤
を溶解させておいた緩衝液を、送液ライン中で混合すれ
ば、ラインが目詰まりすることがないことを見出した。
金属キレート剤を溶解させておいた緩衝液を送液ライン
中で溶出液に混合後、更にＮＢＤクロライド溶液を送液
ライン中で混入し、しかる後に該溶出液中のプロリン類
を送液ライン中でＮＢＤ化し、ＮＢＤ化プロリン類の蛍
光を測定することによりプロリン類を検出する。
【００４１】金属キレート剤としては、銅イオンを補足
するマスキング剤として用いられるものであればよく、
エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、エチレングリコ
ールビス（β−アミノエチルエーテル）テトラ酢酸（EG
TA）、シクロヘキサンジアミンテトラ酢酸（CDTA）、ヒ
ドロキシエチルエチレンジアミントリ酢酸（HEDTA）、
ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）、ジヒドロキ
シエチルグリシン（2-HxG）、ニトリロトリ酢酸（NTA）
等のポリアミノカルボン酸類、２，２, −ビピリジル等
のビピリジル類、２，９−ジメチル−４，７−ジフェニ
ル−１，１０−フェナンスロリン等フェナンスロリン誘
導体類があげられるが、好ましくはポリアミノカルボン
酸類、特に好ましくはエチレンジアミンテトラ酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）があげられる。金属キレートの濃度は溶出液中
の硫酸銅濃度および溶出液に対する緩衝液の混入比率に
よって決定すればよいが、通常１〜１００ｍＭ、好適に
は１０〜５０ｍＭの濃度で用いられる。
するマスキング剤として用いられるものであればよく、
エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、エチレングリコ
ールビス（β−アミノエチルエーテル）テトラ酢酸（EG
TA）、シクロヘキサンジアミンテトラ酢酸（CDTA）、ヒ
ドロキシエチルエチレンジアミントリ酢酸（HEDTA）、
ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）、ジヒドロキ
シエチルグリシン（2-HxG）、ニトリロトリ酢酸（NTA）
等のポリアミノカルボン酸類、２，２, −ビピリジル等
のビピリジル類、２，９−ジメチル−４，７−ジフェニ
ル−１，１０−フェナンスロリン等フェナンスロリン誘
導体類があげられるが、好ましくはポリアミノカルボン
酸類、特に好ましくはエチレンジアミンテトラ酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）があげられる。金属キレートの濃度は溶出液中
の硫酸銅濃度および溶出液に対する緩衝液の混入比率に
よって決定すればよいが、通常１〜１００ｍＭ、好適に
は１０〜５０ｍＭの濃度で用いられる。
【００４２】緩衝液としてはＮＢＤクロライドに対する
反応性が無い緩衝液であればどのようなものでもよく、
例えば、リン酸１カリウム／ホウ砂緩衝液、リン酸１カ
リウム／リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸２ナトリウム
／水酸化ナトリウム緩衝液等のリン酸緩衝液、塩酸／ホ
ウ砂緩衝液、硼酸／炭酸ナトリウム緩衝液、硼酸／ホウ
砂緩衝液、硼酸／水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ砂／水
酸化ナトリウム緩衝液、ホウ砂／炭酸ナトリウム緩衝液
等の硼酸緩衝液、重炭酸ナトリウム／水酸化ナトリウム
緩衝液等の炭酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）メ
チル−２−アミノエタンスルホン酸(TES) 緩衝液、トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンス
ルホン酸(TAPS)緩衝液、３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ
−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO) 緩衝液、
２−( シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸(CHES)
緩衝液、２−( Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸(ME
S)緩衝液等があげられるが、好ましくは硼酸緩衝液、特
に好ましくは硼酸／水酸化ナトリウム緩衝液を用いる。
緩衝液のｐＨは、送液ライン上で溶出液を混合後のｐＨ
が８. ５〜１０. ５、好適には９〜１０となるように決
定すればよい。緩衝液の濃度は０. １〜０. ６Ｍ、好適
には０. ２〜０. ４Ｍである。混入速度は、混入後の緩
衝液濃度が５〜２００ｍＭ好適には１０〜１００ｍＭに
なるように決定すればよい。
反応性が無い緩衝液であればどのようなものでもよく、
例えば、リン酸１カリウム／ホウ砂緩衝液、リン酸１カ
リウム／リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸２ナトリウム
／水酸化ナトリウム緩衝液等のリン酸緩衝液、塩酸／ホ
ウ砂緩衝液、硼酸／炭酸ナトリウム緩衝液、硼酸／ホウ
砂緩衝液、硼酸／水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ砂／水
酸化ナトリウム緩衝液、ホウ砂／炭酸ナトリウム緩衝液
等の硼酸緩衝液、重炭酸ナトリウム／水酸化ナトリウム
緩衝液等の炭酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）メ
チル−２−アミノエタンスルホン酸(TES) 緩衝液、トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンス
ルホン酸(TAPS)緩衝液、３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ
−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO) 緩衝液、
２−( シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸(CHES)
緩衝液、２−( Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸(ME
S)緩衝液等があげられるが、好ましくは硼酸緩衝液、特
に好ましくは硼酸／水酸化ナトリウム緩衝液を用いる。
緩衝液のｐＨは、送液ライン上で溶出液を混合後のｐＨ
が８. ５〜１０. ５、好適には９〜１０となるように決
定すればよい。緩衝液の濃度は０. １〜０. ６Ｍ、好適
には０. ２〜０. ４Ｍである。混入速度は、混入後の緩
衝液濃度が５〜２００ｍＭ好適には１０〜１００ｍＭに
なるように決定すればよい。
【００４３】ＮＢＤクロライドを溶解する溶媒として
は、ＮＢＤクロライドを溶解できるものであれば何でも
よいが、例えばメタノール、エタノール、プロパノール
等のアルコール類、アセトン等のケトン類、アセトニト
リル等のニトリル類、ジメチルフォルムアミド等のアミ
ド類、酢酸エチル等のエステル類、ジメチルスルフォキ
サイド等があげられる。好適にはメタノールを用いる。
ＮＢＤクロライドの濃度は混入速度によって決定される
が、通常０. １〜５. ０ｇ／ｌ、好適には０. ２〜１.
０ｇ／ｌの濃度である。混入速度は混入後のＮＢＤクロ
ライドの濃度が通常０. ０２〜１. ０ｇ／ｌ、好適には
０. ０５〜０. ５ｇ／ｌになるようにすればよい。
は、ＮＢＤクロライドを溶解できるものであれば何でも
よいが、例えばメタノール、エタノール、プロパノール
等のアルコール類、アセトン等のケトン類、アセトニト
リル等のニトリル類、ジメチルフォルムアミド等のアミ
ド類、酢酸エチル等のエステル類、ジメチルスルフォキ
サイド等があげられる。好適にはメタノールを用いる。
ＮＢＤクロライドの濃度は混入速度によって決定される
が、通常０. １〜５. ０ｇ／ｌ、好適には０. ２〜１.
０ｇ／ｌの濃度である。混入速度は混入後のＮＢＤクロ
ライドの濃度が通常０. ０２〜１. ０ｇ／ｌ、好適には
０. ０５〜０. ５ｇ／ｌになるようにすればよい。
【００４４】ＮＢＤクロライドの混入後、送液ラインを
そのまま加温することによりＮＢＤ誘導体化反応を行
う。反応温度は３０〜８０℃、好適には４０〜７０℃が
用いられる。反応時間は０．５〜１０分、好適には１〜
５分間である。反応後、反応液をそのまま紫外線検出器
あるいは蛍光検出器に導き紫外線吸収あるいは蛍光強度
を測定し検出を行う。用いる紫外線波長および蛍光波長
はそれぞれの誘導体に特異的なものであればよい。上記
の方法により、ピコモルレベル程度の極めて微量のプロ
リン類をそれぞれの光学異性体として分離検出可能であ
る。また、プロリン類以外の他のアミノ酸のＮＢＤ誘導
体化による検出感度はプロリン類の約１／５０あるいは
それ以下と低く、侠雑アミノ酸による妨害を受けにくい
ため、このままでプロリン類特異的な分離測定が可能で
あるが、試料を事前にo−フタルアルデヒド処理し、試
料中の一級アミノ酸をo−フタルアルデヒド化すること
により、侠雑アミノ酸による妨害をほぼ完全に除去する
ことが可能である。
そのまま加温することによりＮＢＤ誘導体化反応を行
う。反応温度は３０〜８０℃、好適には４０〜７０℃が
用いられる。反応時間は０．５〜１０分、好適には１〜
５分間である。反応後、反応液をそのまま紫外線検出器
あるいは蛍光検出器に導き紫外線吸収あるいは蛍光強度
を測定し検出を行う。用いる紫外線波長および蛍光波長
はそれぞれの誘導体に特異的なものであればよい。上記
の方法により、ピコモルレベル程度の極めて微量のプロ
リン類をそれぞれの光学異性体として分離検出可能であ
る。また、プロリン類以外の他のアミノ酸のＮＢＤ誘導
体化による検出感度はプロリン類の約１／５０あるいは
それ以下と低く、侠雑アミノ酸による妨害を受けにくい
ため、このままでプロリン類特異的な分離測定が可能で
あるが、試料を事前にo−フタルアルデヒド処理し、試
料中の一級アミノ酸をo−フタルアルデヒド化すること
により、侠雑アミノ酸による妨害をほぼ完全に除去する
ことが可能である。
【００４５】次に、本発明のＬ−プロリン４位水酸化酵
素の取得方法を示す。該酵素はＬ−プロリン４位水酸化
酵素を生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中
にＬ−プロリン４位水酸化酵素を生成蓄積させ、該培養
物からＬ−プロリン４位水酸化酵素を採取することによ
り得られる。Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を生産する能
力を有する微生物であれば、野生株でも、その継代培養
物、突然変異体、誘導体などいずれの微生物も用いるこ
とができる。好適な例としては、ダクチロスポランジウ
ム（Dactylosporangium）属に属し、かつＬ−プロリン
４位水酸化酵素を生産する微生物があげられる。具体的
には前述したダクチロスポランジウム・エスピー（Dact
ylosporangium sp.）ＲＨ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４４０
０）、あるいはこれらの菌株の継代培養物、突然変異
体、誘導体などがあげられる。
素の取得方法を示す。該酵素はＬ−プロリン４位水酸化
酵素を生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中
にＬ−プロリン４位水酸化酵素を生成蓄積させ、該培養
物からＬ−プロリン４位水酸化酵素を採取することによ
り得られる。Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を生産する能
力を有する微生物であれば、野生株でも、その継代培養
物、突然変異体、誘導体などいずれの微生物も用いるこ
とができる。好適な例としては、ダクチロスポランジウ
ム（Dactylosporangium）属に属し、かつＬ−プロリン
４位水酸化酵素を生産する微生物があげられる。具体的
には前述したダクチロスポランジウム・エスピー（Dact
ylosporangium sp.）ＲＨ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４４０
０）、あるいはこれらの菌株の継代培養物、突然変異
体、誘導体などがあげられる。
【００４６】このような微生物を培養する培地は、微生
物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を生成する能力を有する微
生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合
成培地のいずれでも良い。炭素源としては、それぞれの
微生物が資化し得るものであれば良く、グルコース、フ
ラクトース、シュクロース、これらを含有する糖蜜、デ
ンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢
酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノー
ル等のアルコール類が用いられる。
物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を生成する能力を有する微
生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合
成培地のいずれでも良い。炭素源としては、それぞれの
微生物が資化し得るものであれば良く、グルコース、フ
ラクトース、シュクロース、これらを含有する糖蜜、デ
ンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢
酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノー
ル等のアルコール類が用いられる。
【００４７】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム
塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体
およびその消化物等が用いられる。
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム
塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体
およびその消化物等が用いられる。
【００４８】無機物としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。培養は、振盪培
養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培
養温度は１５〜３７℃がよく、培養時間は、通常１６〜
９６時間である。
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。培養は、振盪培
養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培
養温度は１５〜３７℃がよく、培養時間は、通常１６〜
９６時間である。
【００４９】培養中ｐＨは、５. ０〜９. ０に保持す
る。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶
液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行
う。培養の際、必要によりＬープロリンを添加してもよ
い。このように培養して得た菌体中にＬ−プロリン４位
水酸化酵素が生成していることは、、培養物中もしくは
該菌体あるいは菌体処理物を含む酵素反応に適した水性
媒体中にＬ−プロリン、二価鉄イオン、２−ケトグルタ
ル酸とともに加え、また必要に応じて界面活性剤や有機
溶剤を添加することにより、Ｌ−プロリンをトランス−
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換させることによっ
て知ることができる。
る。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶
液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行
う。培養の際、必要によりＬープロリンを添加してもよ
い。このように培養して得た菌体中にＬ−プロリン４位
水酸化酵素が生成していることは、、培養物中もしくは
該菌体あるいは菌体処理物を含む酵素反応に適した水性
媒体中にＬ−プロリン、二価鉄イオン、２−ケトグルタ
ル酸とともに加え、また必要に応じて界面活性剤や有機
溶剤を添加することにより、Ｌ−プロリンをトランス−
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換させることによっ
て知ることができる。
【００５０】水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸
塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリス等の緩衝
液、メタノール、エタノール等のアルコール類、酢酸エ
チル等のエステル類、アセトン等のケトン類、アセトア
ミド等のアミド類等があげられる。反応は前述と同様に
行うことができる。
塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリス等の緩衝
液、メタノール、エタノール等のアルコール類、酢酸エ
チル等のエステル類、アセトン等のケトン類、アセトア
ミド等のアミド類等があげられる。反応は前述と同様に
行うことができる。
【００５１】反応の結果生成したトランス−４−ヒドロ
キシ−Ｌ−プロリンの回収および構造確認は前述と同様
の方法にしたがって行うことができる。この反応によっ
てトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生成が確
認されることにより、菌体中に生成が確認されるＬ−プ
ロリン４位水酸化酵素の活性は以下のような方法により
測定することができる。酵素活性は、下記測定条件下、
１分間に１nmolのトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リンを生成する活性を１単位（Ｕ）として表示する。
キシ−Ｌ−プロリンの回収および構造確認は前述と同様
の方法にしたがって行うことができる。この反応によっ
てトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生成が確
認されることにより、菌体中に生成が確認されるＬ−プ
ロリン４位水酸化酵素の活性は以下のような方法により
測定することができる。酵素活性は、下記測定条件下、
１分間に１nmolのトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リンを生成する活性を１単位（Ｕ）として表示する。
【００５２】４ｍＭ Ｌ−プロリン、８ｍＭ ２−ケト
グルタル酸、２ｍＭ 硫酸第一鉄および４ｍＭ Ｌ−ア
スコルビン酸を含有する８０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ
６.５）に酵素標品を添加して合計２５０μｌとし、３
０℃、２０分間反応する。反応液を１００℃、２分間加
熱して反応を停止した後に、反応液中に生成したトラン
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを高速液体クロマト
グラフィーを用いて定量する。
グルタル酸、２ｍＭ 硫酸第一鉄および４ｍＭ Ｌ−ア
スコルビン酸を含有する８０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ
６.５）に酵素標品を添加して合計２５０μｌとし、３
０℃、２０分間反応する。反応液を１００℃、２分間加
熱して反応を停止した後に、反応液中に生成したトラン
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを高速液体クロマト
グラフィーを用いて定量する。
【００５３】定量にはトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリンを定量できる方法であればどのような方法を用
いてもよいが、たとえば通常高速液体クロマトグラフィ
ーを用いたポストカラム誘導体化法あるいは反応液中の
目的化合物をあらかじめＮＢＤ誘導体化しておき、これ
を高速液体クロマトグラフィーを用いた逆相クロマトグ
ラフィーにかけてＮＢＤ誘導体化物を分離後、その蛍光
（励起波長 ５０３ｎｍ、蛍光波長 ５４１ｎｍ）を用
いて定量する方法（プレカラム誘導体化法）等があげら
れる。
プロリンを定量できる方法であればどのような方法を用
いてもよいが、たとえば通常高速液体クロマトグラフィ
ーを用いたポストカラム誘導体化法あるいは反応液中の
目的化合物をあらかじめＮＢＤ誘導体化しておき、これ
を高速液体クロマトグラフィーを用いた逆相クロマトグ
ラフィーにかけてＮＢＤ誘導体化物を分離後、その蛍光
（励起波長 ５０３ｎｍ、蛍光波長 ５４１ｎｍ）を用
いて定量する方法（プレカラム誘導体化法）等があげら
れる。
【００５４】なお、プレカラム誘導体化法による検出
は、ウィリアム ジェイ リンドブラッドおよびロバー
ト エフ ディーゲルマンらの方法〔William J. Lindb
lad and Robert F. Diegelmann, 、アナリティカル バ
イオケミストリー（AnalyticalBiochemistry ），１３
８巻，３９０〜３９５ページ，１９８４年〕に従って行
う。しかしこの方法では、プロリン類を特異的に検出す
ることは可能であるが、それぞれの光学異性体を全て識
別することはできない。
は、ウィリアム ジェイ リンドブラッドおよびロバー
ト エフ ディーゲルマンらの方法〔William J. Lindb
lad and Robert F. Diegelmann, 、アナリティカル バ
イオケミストリー（AnalyticalBiochemistry ），１３
８巻，３９０〜３９５ページ，１９８４年〕に従って行
う。しかしこの方法では、プロリン類を特異的に検出す
ることは可能であるが、それぞれの光学異性体を全て識
別することはできない。
【００５５】酵素精製途中等の活性の測定においては、
種々の化合物を緩衝液等の形で使用するため、状況に応
じて上記２つの方法を用いることができる。培養液から
酵素を単離精製するには、通常の酵素の単離、精製法を
用いればよい。例えば、培養液を遠心分離して集菌し充
分洗浄した後に、超音波菌体破砕器、フレンチ・プレ
ス、マントン・ガウリン・ホモゲナイザー、ダイノミル
等により菌体を破砕し、無細胞抽出液を得る。遠沈分離
後の上清を、硫安等による塩析、ジエチルアミノエチル
（ＤＥＡＥ）−セファロース等の陰イオン交換クロマト
グラフィー、ブチルセファロース、フェニルセファロー
ス等の疎水性クロマトグラフィー、レッドアガロース等
の色素アフィニティークロマトグラフィー、分子篩を用
いたゲル濾過法、等電点電気泳動等の電気泳動法等を行
い精製酵素標品を得る。得られた酵素標品の理化学的特
徴は、通常の酵素学的手法により特定できる。
種々の化合物を緩衝液等の形で使用するため、状況に応
じて上記２つの方法を用いることができる。培養液から
酵素を単離精製するには、通常の酵素の単離、精製法を
用いればよい。例えば、培養液を遠心分離して集菌し充
分洗浄した後に、超音波菌体破砕器、フレンチ・プレ
ス、マントン・ガウリン・ホモゲナイザー、ダイノミル
等により菌体を破砕し、無細胞抽出液を得る。遠沈分離
後の上清を、硫安等による塩析、ジエチルアミノエチル
（ＤＥＡＥ）−セファロース等の陰イオン交換クロマト
グラフィー、ブチルセファロース、フェニルセファロー
ス等の疎水性クロマトグラフィー、レッドアガロース等
の色素アフィニティークロマトグラフィー、分子篩を用
いたゲル濾過法、等電点電気泳動等の電気泳動法等を行
い精製酵素標品を得る。得られた酵素標品の理化学的特
徴は、通常の酵素学的手法により特定できる。
【００５６】このようにして得られたＬ−プロリン４位
水酸化酵素は、下記（１）〜（１０）の理化学的性質を
有する。 (1)作用および基質特異性 ２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下、遊離
のＬ−プロリンに作用して、トランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを生成する。 (2)至適ｐＨ 前記Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の活性測定法におい
て、反応液成分中の緩衝液成分を、ｐＨ３. ５〜５. ５
は酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５. ５〜６. ５はＭＥＳ
緩衝液、ｐＨ７. ０〜７. ５はＴＥＳ緩衝液〔Ｎ−トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスル
フォン酸〕、ｐＨ８. ０〜９. ０はＴＡＰＳ緩衝液〔Ｎ
−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロ
パンスルフォン酸〕、ｐＨ９. ５〜１１. ０はＣＡＰＳ
Ｏ緩衝液（３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロ
キシプロパン−スルフォン酸）に置換え反応を行った結
果、至適ｐＨは、ｐＨ６. ０〜７. ０であった。 (3)ｐＨ安定性 本酵素を、５０ｍＭ緩衝液〔ｐＨ３. ５〜５. ５は酢酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ５. ５〜６. ５はＭＥＳ緩衝
液、ｐＨ７. ０〜７. ５はＴＥＳ緩衝液、ｐＨ８. ０〜
９. ０はＴＡＰＳ緩衝液、ｐＨ９. ５〜１１. ０はＣＡ
ＰＳＯ緩衝液〕、２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）
および２０％（ｖ／ｖ）グリセロール存在下、４℃、２
４時間保持する。保持後活性を測定する。ｐＨ６. ５〜
１０. ０の範囲で保持した酵素は保持前の活性の９０％
以上の活性を有しており、ｐＨ６.５〜１０. ０の範囲
で活性は安定に保たれる。 (4)至適温度 前記Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性測定法において、
種々温度を変えて活性を測定した結果、ｐＨ６. ５、１
５分間の反応において、３０〜４０℃に至適温度を有す
る。 (5)温度安定性 本酵素をｐＨ９. ０、５０℃、３０分間処理することに
より、完全に失活する。 (6)阻害剤 本酵素活性は、Zn++およびCu++の金属イオンおよびＥＤ
ＴＡによって阻害される。前記Ｌ−プロリン４位水酸化
酵素活性測定法において、Cu++およびZn++イオンを各々
１ｍＭの濃度で加え活性を測定すると、活性は各々無添
加時の１３％および６％に低下した。また同様にＥＤＴ
Ａを５ｍＭ添加して活性を測定すると、活性は検出でき
なかった。 (7)活性化 本酵素について各種金属イオンおよび補酵素類による活
性化は観察されず、本酵素の活性化には補酵素を必要と
しない。反応液へのアスコルビン酸の添加は、反応を促
進する。 (8)Ｋｍ値 ８０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６. ５、４ｍＭ Ｌ−ア
スコルビン酸、２ｍＭ硫酸第一鉄および酵素標品を含有
する反応液中で測定したＬ−プロリンに対するＫｍ値は
０. ２７ｍＭ、２−ケトグルタル酸に対するＫｍ値は
０. ５５ｍＭであった。 (9)分子量 分子量はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
電気泳動法（ATTO社製ポリアクリルアミドゲルPAGEL NP
U-12.5L およびバイオラッド社製分子量スタンダードSD
S-PAGE Molecular Weight Standard, Broad Range を使
用）による測定で、３２，０００±５，０００ダルトン
と計算された。また高速液体クロマトグラフィーを用い
たゲル濾過法（カラム Ｇ−３０００ＳＷ、２１. ５ｍ
ｍ ｘ６０ｃｍ、オリエンタルイースト社製ＨＰＬＣ用
分子量マーカーをスタンダードとして使用）による測定
で、４３，８００±５，０００ダルトンと算出された。 (10)Ｎ末端アミノ酸配列 島津製作所社製Protein sequencer model PPSQ-10 を用
いて分析した結果、本酵素蛋白のＮ末端アミノ酸配列は
以下の様に決定された。
水酸化酵素は、下記（１）〜（１０）の理化学的性質を
有する。 (1)作用および基質特異性 ２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下、遊離
のＬ−プロリンに作用して、トランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを生成する。 (2)至適ｐＨ 前記Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の活性測定法におい
て、反応液成分中の緩衝液成分を、ｐＨ３. ５〜５. ５
は酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５. ５〜６. ５はＭＥＳ
緩衝液、ｐＨ７. ０〜７. ５はＴＥＳ緩衝液〔Ｎ−トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスル
フォン酸〕、ｐＨ８. ０〜９. ０はＴＡＰＳ緩衝液〔Ｎ
−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロ
パンスルフォン酸〕、ｐＨ９. ５〜１１. ０はＣＡＰＳ
Ｏ緩衝液（３−Ｎ−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロ
キシプロパン−スルフォン酸）に置換え反応を行った結
果、至適ｐＨは、ｐＨ６. ０〜７. ０であった。 (3)ｐＨ安定性 本酵素を、５０ｍＭ緩衝液〔ｐＨ３. ５〜５. ５は酢酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ５. ５〜６. ５はＭＥＳ緩衝
液、ｐＨ７. ０〜７. ５はＴＥＳ緩衝液、ｐＨ８. ０〜
９. ０はＴＡＰＳ緩衝液、ｐＨ９. ５〜１１. ０はＣＡ
ＰＳＯ緩衝液〕、２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）
および２０％（ｖ／ｖ）グリセロール存在下、４℃、２
４時間保持する。保持後活性を測定する。ｐＨ６. ５〜
１０. ０の範囲で保持した酵素は保持前の活性の９０％
以上の活性を有しており、ｐＨ６.５〜１０. ０の範囲
で活性は安定に保たれる。 (4)至適温度 前記Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性測定法において、
種々温度を変えて活性を測定した結果、ｐＨ６. ５、１
５分間の反応において、３０〜４０℃に至適温度を有す
る。 (5)温度安定性 本酵素をｐＨ９. ０、５０℃、３０分間処理することに
より、完全に失活する。 (6)阻害剤 本酵素活性は、Zn++およびCu++の金属イオンおよびＥＤ
ＴＡによって阻害される。前記Ｌ−プロリン４位水酸化
酵素活性測定法において、Cu++およびZn++イオンを各々
１ｍＭの濃度で加え活性を測定すると、活性は各々無添
加時の１３％および６％に低下した。また同様にＥＤＴ
Ａを５ｍＭ添加して活性を測定すると、活性は検出でき
なかった。 (7)活性化 本酵素について各種金属イオンおよび補酵素類による活
性化は観察されず、本酵素の活性化には補酵素を必要と
しない。反応液へのアスコルビン酸の添加は、反応を促
進する。 (8)Ｋｍ値 ８０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６. ５、４ｍＭ Ｌ−ア
スコルビン酸、２ｍＭ硫酸第一鉄および酵素標品を含有
する反応液中で測定したＬ−プロリンに対するＫｍ値は
０. ２７ｍＭ、２−ケトグルタル酸に対するＫｍ値は
０. ５５ｍＭであった。 (9)分子量 分子量はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
電気泳動法（ATTO社製ポリアクリルアミドゲルPAGEL NP
U-12.5L およびバイオラッド社製分子量スタンダードSD
S-PAGE Molecular Weight Standard, Broad Range を使
用）による測定で、３２，０００±５，０００ダルトン
と計算された。また高速液体クロマトグラフィーを用い
たゲル濾過法（カラム Ｇ−３０００ＳＷ、２１. ５ｍ
ｍ ｘ６０ｃｍ、オリエンタルイースト社製ＨＰＬＣ用
分子量マーカーをスタンダードとして使用）による測定
で、４３，８００±５，０００ダルトンと算出された。 (10)Ｎ末端アミノ酸配列 島津製作所社製Protein sequencer model PPSQ-10 を用
いて分析した結果、本酵素蛋白のＮ末端アミノ酸配列は
以下の様に決定された。
【００５７】
【化２】
【００５８】以下に本発明の実施例を示す。
【００５９】
【００６０】実施例１ トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンの生成 ＳＲ３培地〔グルコース１．０％、可溶性澱粉１．０
％、酵母エキス０．５％、トリプトン０．５％、肉エキ
ス０．３％およびリン酸マグネシウム０．０５％を含
み、６N ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整した培地〕を試験
管（径２５ｍｍ ｘ２００ｍｍ）に１０ｍｌずつ分注
し、１２０℃、２０分間殺菌した。この培地に、ＨＴ寒
天平板培地〔可溶性澱粉１％、ＮＺアミン０．２％、酵
母エキス０．１％、肉エキス０．１％および寒天１．５
％を含み、６N ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整後、１２０
℃、２０分間殺菌処理した培地〕に生育したダクチロス
ポランジウム・エスピー（Dactylosporangium sp.）Ｒ
Ｈ１を一白金耳植菌し、２８℃、２日間振盪培養し、種
培養液として用いた。
−プロリンの生成 ＳＲ３培地〔グルコース１．０％、可溶性澱粉１．０
％、酵母エキス０．５％、トリプトン０．５％、肉エキ
ス０．３％およびリン酸マグネシウム０．０５％を含
み、６N ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整した培地〕を試験
管（径２５ｍｍ ｘ２００ｍｍ）に１０ｍｌずつ分注
し、１２０℃、２０分間殺菌した。この培地に、ＨＴ寒
天平板培地〔可溶性澱粉１％、ＮＺアミン０．２％、酵
母エキス０．１％、肉エキス０．１％および寒天１．５
％を含み、６N ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整後、１２０
℃、２０分間殺菌処理した培地〕に生育したダクチロス
ポランジウム・エスピー（Dactylosporangium sp.）Ｒ
Ｈ１を一白金耳植菌し、２８℃、２日間振盪培養し、種
培養液として用いた。
【００６１】一方、Ｄｆ１培地〔可溶性澱粉５％、ソイ
ビーンミール１．５％、リン酸１カリウム０．０５％、
硫酸マグネシウム７水塩０．０５％および炭酸カルシウ
ム０．５％を含み、６N ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し
た培地〕を試験管（径２５ｍｍｘ ２００ｍｍ）に１０
ｍｌずつ分注し、１２０℃、２０分間殺菌した。この培
地に、種培養液１ｍｌを無菌的に接種し、２８℃、２日
間振盪培養した。得られた培養液を７，０００ ｘ ｇ、
１０分間、４℃で遠心分離した。得られた菌体を８０ｍ
Ｍ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、遠心分離し
た。得られた湿菌体１５０ｍｇを、１．５ｍｌの反応液
〔４ｍＭ Ｌ−プロリン、８ｍＭ α−ケトグルタル
酸、４ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸および２ｍＭ 硫酸第
一鉄を含有する８０ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）
にナイミーン溶液（ナイミーンＳ−２１５（日本油脂株
式会社製）４ｇをキシレン１０ｍｌに溶解）を１．４％
（ｖ／ｖ）添加した液〕に懸濁し、３０℃、２時間反応
を行った。
ビーンミール１．５％、リン酸１カリウム０．０５％、
硫酸マグネシウム７水塩０．０５％および炭酸カルシウ
ム０．５％を含み、６N ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し
た培地〕を試験管（径２５ｍｍｘ ２００ｍｍ）に１０
ｍｌずつ分注し、１２０℃、２０分間殺菌した。この培
地に、種培養液１ｍｌを無菌的に接種し、２８℃、２日
間振盪培養した。得られた培養液を７，０００ ｘ ｇ、
１０分間、４℃で遠心分離した。得られた菌体を８０ｍ
Ｍ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、遠心分離し
た。得られた湿菌体１５０ｍｇを、１．５ｍｌの反応液
〔４ｍＭ Ｌ−プロリン、８ｍＭ α−ケトグルタル
酸、４ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸および２ｍＭ 硫酸第
一鉄を含有する８０ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）
にナイミーン溶液（ナイミーンＳ−２１５（日本油脂株
式会社製）４ｇをキシレン１０ｍｌに溶解）を１．４％
（ｖ／ｖ）添加した液〕に懸濁し、３０℃、２時間反応
を行った。
【００６２】反応後、菌体反応液より菌体を遠心分離に
より除去した上清中に生成したヒドロキシプロリンにつ
いて分析を行った。分析は、高速液体クロマトグラフィ
ーで、以下の条件で分析した。検出は、目的化合物をカ
ラム溶出後、送液ライン上でＮＢＤ誘導体化し、ＮＢＤ
誘導体化物の蛍光を測定することにより行った。
より除去した上清中に生成したヒドロキシプロリンにつ
いて分析を行った。分析は、高速液体クロマトグラフィ
ーで、以下の条件で分析した。検出は、目的化合物をカ
ラム溶出後、送液ライン上でＮＢＤ誘導体化し、ＮＢＤ
誘導体化物の蛍光を測定することにより行った。
【００６３】高速液体クロマトグラフィー分析条件 ［１］装置：島津製作所製高速液体クロマトグラフィー クロマトパック CR6A システムコントローラー SCL-6B オートインジェクター SIL-6B 送液ポンプ LC-6A カラムオーブン CTO-6A 化学反応槽 CRB-6A 蛍光検出器 RF-550A ［２］使用カラム：株式会社住化分析センター製 SUMC
HIRAL OA5000（径４．５ｍｍ ｘ ２５０ｍｍ） ［３］分析条件： １）移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液 ２）同上流速 ：１．０ｍｌ／分 ３）カラム温度 ：３８℃ ４）緩衝液 ：０．３Ｍ ホウ酸緩衝
液、ｐＨ９．６ ２５ｍＭ エチレンジアミンテトラ酢酸 ５）同上流速 ：０．２ｍｌ／分 ６）ＮＢＤクロライド溶液 ：０．５ｇ／ｌ メタノー
ル溶液 ７）同上流速 ：０．５ｍｌ／分 ８）反応温度 ：６０℃ ９）反応時間 ：約３分 １０）検出波長 ：励起波長 ５０３ｎｍ 蛍光波長 ５４１ｎｍ １１）試料 ：１０μｌ その結果、反応液中に２４９μＭ（３２．６ｍｇ／ｌ）
のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが生成して
いることが確認された。
HIRAL OA5000（径４．５ｍｍ ｘ ２５０ｍｍ） ［３］分析条件： １）移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液 ２）同上流速 ：１．０ｍｌ／分 ３）カラム温度 ：３８℃ ４）緩衝液 ：０．３Ｍ ホウ酸緩衝
液、ｐＨ９．６ ２５ｍＭ エチレンジアミンテトラ酢酸 ５）同上流速 ：０．２ｍｌ／分 ６）ＮＢＤクロライド溶液 ：０．５ｇ／ｌ メタノー
ル溶液 ７）同上流速 ：０．５ｍｌ／分 ８）反応温度 ：６０℃ ９）反応時間 ：約３分 １０）検出波長 ：励起波長 ５０３ｎｍ 蛍光波長 ５４１ｎｍ １１）試料 ：１０μｌ その結果、反応液中に２４９μＭ（３２．６ｍｇ／ｌ）
のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが生成して
いることが確認された。
【００６４】実施例２ トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンの精製 実施例１における種培養を、ＳＲ３培地２００ｍｌを分
注した２ｌ三角フラスコを用いて実施した。あらかじめ
５ｌジャーファーメンターに分注後、１２０℃、２０分
間殺菌した２ｌのＤｆ１培地に、この種培養を無菌的に
接種し、７００ｒｐｍ、１ｖｖｍの条件で２８℃、２日
間培養した。培養中のｐＨは調整しなかった。得られた
培養液を７，０００ ｘ ｇ、１０分間、４℃で遠心分離
し、湿菌体を培養液１リットル当たり７５ｇ得た。湿菌
体は４℃で生理食塩水で洗浄し、遠心後使用時まで−８
０℃で凍結保存した。本湿菌体４００ｇを２ｌの実施例
１に記載された反応液に懸濁し、３ｌビーカー中、攪拌
しつつ、３０℃、４時間、反応を行った。
−プロリンの精製 実施例１における種培養を、ＳＲ３培地２００ｍｌを分
注した２ｌ三角フラスコを用いて実施した。あらかじめ
５ｌジャーファーメンターに分注後、１２０℃、２０分
間殺菌した２ｌのＤｆ１培地に、この種培養を無菌的に
接種し、７００ｒｐｍ、１ｖｖｍの条件で２８℃、２日
間培養した。培養中のｐＨは調整しなかった。得られた
培養液を７，０００ ｘ ｇ、１０分間、４℃で遠心分離
し、湿菌体を培養液１リットル当たり７５ｇ得た。湿菌
体は４℃で生理食塩水で洗浄し、遠心後使用時まで−８
０℃で凍結保存した。本湿菌体４００ｇを２ｌの実施例
１に記載された反応液に懸濁し、３ｌビーカー中、攪拌
しつつ、３０℃、４時間、反応を行った。
【００６５】反応後、菌体反応液より菌体を遠心分離除
去した上清中に生成したヒドロキシプロリンについて分
析を行った。その結果、反応液中に４８０μＭ（６３．
０ｍｇ／ｌ）のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンが生成していることが確認された。反応液上清を、ｐ
Ｈ４．５に調整した後に、イオン交換樹脂ダイヤイオン
ＳＫ１Ｂ（ＮＨ4 +型、三菱化成社製）２００ｍｌを充填
したカラムに通塔した。トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンを含む画分を減圧下濃縮後、イオン交換樹脂
ダイヤイオンPA412（OH-型、三菱化成社製）２０ｍｌを
充填したカラムに通塔した。トランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを含む画分を減圧濃縮後、ｐＨを９．６
とした後に、１０％容量のo−フタルアルデヒド溶液
（０．０７５ｇ／ｍｌエタノール溶液）および２％容量
のβ−メルカプトエタノール溶液（１０％ｖ／ｖ水溶
液）を加え、６０℃、５分間保持し、侠雑一級アミノ酸
をo−フタルアルデヒド化した。この混合液をセパビー
ズＳＰ２０７（三菱化成社製）１０ｍｌを充填したカラ
ムに通塔し、o−フタルアルデヒド化した侠雑一級アミ
ノ酸とトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンとを分
離した。トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを含
む画分を減圧濃縮後、再度イオン交換樹脂ダイヤイオン
PA412（OH-型、三菱化成社製）２０ｍｌを充填したカラ
ムに通塔し、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
を含む画分を得た。本画分を濃縮乾燥し、トランス−４
−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの白色結晶７８ｍｇを得た
（収率６２％）。本白色結晶を分析した結果、13Ｃ−Ｎ
ＭＲスペクトル、1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、マススペク
トル、比旋光度等が、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリン標準品（ナカライテスク株式会社）と一致し
た。
去した上清中に生成したヒドロキシプロリンについて分
析を行った。その結果、反応液中に４８０μＭ（６３．
０ｍｇ／ｌ）のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンが生成していることが確認された。反応液上清を、ｐ
Ｈ４．５に調整した後に、イオン交換樹脂ダイヤイオン
ＳＫ１Ｂ（ＮＨ4 +型、三菱化成社製）２００ｍｌを充填
したカラムに通塔した。トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンを含む画分を減圧下濃縮後、イオン交換樹脂
ダイヤイオンPA412（OH-型、三菱化成社製）２０ｍｌを
充填したカラムに通塔した。トランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを含む画分を減圧濃縮後、ｐＨを９．６
とした後に、１０％容量のo−フタルアルデヒド溶液
（０．０７５ｇ／ｍｌエタノール溶液）および２％容量
のβ−メルカプトエタノール溶液（１０％ｖ／ｖ水溶
液）を加え、６０℃、５分間保持し、侠雑一級アミノ酸
をo−フタルアルデヒド化した。この混合液をセパビー
ズＳＰ２０７（三菱化成社製）１０ｍｌを充填したカラ
ムに通塔し、o−フタルアルデヒド化した侠雑一級アミ
ノ酸とトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンとを分
離した。トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを含
む画分を減圧濃縮後、再度イオン交換樹脂ダイヤイオン
PA412（OH-型、三菱化成社製）２０ｍｌを充填したカラ
ムに通塔し、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
を含む画分を得た。本画分を濃縮乾燥し、トランス−４
−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの白色結晶７８ｍｇを得た
（収率６２％）。本白色結晶を分析した結果、13Ｃ−Ｎ
ＭＲスペクトル、1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、マススペク
トル、比旋光度等が、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリン標準品（ナカライテスク株式会社）と一致し
た。
【００６６】実施例３ トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンの生成 ＳＲ３培地を試験管（径２５ｍｍ ｘ ２００ｍｍ）に
１０ｍｌずつ分注し、１２０℃、２０分間殺菌した。こ
の培地に、ＨＴ寒天平板培地に生育したアミコラトプシ
ス・エスピ−（Amycolatopsis sp.）ＲＨ２を一白金耳
植菌し、２８℃、２日間振盪培養し、種培養液として用
いた。
−プロリンの生成 ＳＲ３培地を試験管（径２５ｍｍ ｘ ２００ｍｍ）に
１０ｍｌずつ分注し、１２０℃、２０分間殺菌した。こ
の培地に、ＨＴ寒天平板培地に生育したアミコラトプシ
ス・エスピ−（Amycolatopsis sp.）ＲＨ２を一白金耳
植菌し、２８℃、２日間振盪培養し、種培養液として用
いた。
【００６７】一方、Ｄｆ１培地を試験管（径２５ｍｍ
ｘ ２００ｍｍ）に１０ｍｌずつ分注し、１２０℃、２
０分間殺菌した。この培地に、種培養液１ｍｌを無菌的
に接種し、２８℃、２日間振盪培養した。得られた培養
液を７，０００ ｘ ｇ、１０分間、４℃で遠心分離し
た。得られた菌体を１００ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ
７．５）で洗浄後、遠心分離した。得られた湿菌体１０
０ｍｇを、１ｍｌの反応液［５ｍＭ Ｌ−プロリン、５
ｍＭ α−ケト−グルタル酸、５ｍＭ Ｌ−アスコルビ
ン酸および１ｍＭ 硫酸第一鉄、を含有する１００ｍＭ
ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）にナイミーン溶液（ナイ
ミーンＳ−２１５（日本油脂株式会社製）４ｇをキシレ
ン１０ｍｌに溶解）を１．４％（ｖ／ｖ）添加］に懸濁
し、３０℃、３時間反応を行った。
ｘ ２００ｍｍ）に１０ｍｌずつ分注し、１２０℃、２
０分間殺菌した。この培地に、種培養液１ｍｌを無菌的
に接種し、２８℃、２日間振盪培養した。得られた培養
液を７，０００ ｘ ｇ、１０分間、４℃で遠心分離し
た。得られた菌体を１００ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ
７．５）で洗浄後、遠心分離した。得られた湿菌体１０
０ｍｇを、１ｍｌの反応液［５ｍＭ Ｌ−プロリン、５
ｍＭ α−ケト−グルタル酸、５ｍＭ Ｌ−アスコルビ
ン酸および１ｍＭ 硫酸第一鉄、を含有する１００ｍＭ
ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）にナイミーン溶液（ナイ
ミーンＳ−２１５（日本油脂株式会社製）４ｇをキシレ
ン１０ｍｌに溶解）を１．４％（ｖ／ｖ）添加］に懸濁
し、３０℃、３時間反応を行った。
【００６８】反応後、菌体反応液より菌体を遠心分離に
より除去した上清中に生成したヒドロキシプロリンにつ
いて分析を行った。分析および検出は実施例１に準じて
実施した。その結果、反応液中に２５μＭ（３．３ｍｇ
／ｌ）のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが生
成していることが確認された。
より除去した上清中に生成したヒドロキシプロリンにつ
いて分析を行った。分析および検出は実施例１に準じて
実施した。その結果、反応液中に２５μＭ（３．３ｍｇ
／ｌ）のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが生
成していることが確認された。
【００６９】実施例４ トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンの精製 実施例３における種培養を、ＳＲ３培地２００ｍｌを分
注した２ｌ三角フラスコを用いて実施した。あらかじめ
５ｌジャーファーメンターに分注後、１２０℃、２０分
間殺菌した２ｌのＤｆ１培地に、この種培養を無菌的に
接種し、７００ｒｐｍ、１ｖｖｍの条件で２８℃、２日
間培養した。培養中のｐＨは調整しなかった。得られた
培養液を７，０００ ｘ ｇ、１０分間、４℃で遠心分離
し、湿菌体を培養液１リットル当たり７５グラム得た。
本湿菌体４００ｇを２ｌの実施例３に記載された反応液
に懸濁し、３ｌビーカー中、攪拌しつつ、３０℃、４時
間、反応を行った。
−プロリンの精製 実施例３における種培養を、ＳＲ３培地２００ｍｌを分
注した２ｌ三角フラスコを用いて実施した。あらかじめ
５ｌジャーファーメンターに分注後、１２０℃、２０分
間殺菌した２ｌのＤｆ１培地に、この種培養を無菌的に
接種し、７００ｒｐｍ、１ｖｖｍの条件で２８℃、２日
間培養した。培養中のｐＨは調整しなかった。得られた
培養液を７，０００ ｘ ｇ、１０分間、４℃で遠心分離
し、湿菌体を培養液１リットル当たり７５グラム得た。
本湿菌体４００ｇを２ｌの実施例３に記載された反応液
に懸濁し、３ｌビーカー中、攪拌しつつ、３０℃、４時
間、反応を行った。
【００７０】反応液上清を、ｐＨ４．５に調整した後
に、イオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（ＮＨ4 +型、
三菱化成社製）２００ｍｌを充填したカラムに通塔し
た。トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを含む画
分を減圧濃縮後、イオン交換樹脂ダイヤイオンPA412（O
H- 型、三菱化成社製）２０ｍｌを充填したカラムに通
塔した。トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを含
む画分を減圧濃縮後、ｐＨ９．６とした後に、１０％容
量のo−フタルアルデヒド溶液（０．０７５ｇ／ｍｌエ
タノール溶液）および２％容量のβ−メルカプトエタノ
ール溶液（１０％ｖ／ｖ水溶液）を加え、６０℃、５分
間保持し、侠雑一級アミノ酸をo−フタルアルデヒド化
した。この混合液をセパビーズＳＰ２０７（三菱化成社
製）１０ｍｌを充填したカラムに通塔し、o−フタルア
ルデヒド化した侠雑一級アミノ酸とトランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンを分離した。トランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンを含む画分を減圧濃縮後、再度イ
オン交換樹脂ダイヤイオンPA412（OH-型、三菱化成社
製）２０ｍｌを充填したカラムに通塔し、トランス−４
−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを含む画分を得た。本画分
を濃縮乾燥し、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンの白色結晶４．８ｍｇを得た（収率６２％）。
に、イオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（ＮＨ4 +型、
三菱化成社製）２００ｍｌを充填したカラムに通塔し
た。トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを含む画
分を減圧濃縮後、イオン交換樹脂ダイヤイオンPA412（O
H- 型、三菱化成社製）２０ｍｌを充填したカラムに通
塔した。トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを含
む画分を減圧濃縮後、ｐＨ９．６とした後に、１０％容
量のo−フタルアルデヒド溶液（０．０７５ｇ／ｍｌエ
タノール溶液）および２％容量のβ−メルカプトエタノ
ール溶液（１０％ｖ／ｖ水溶液）を加え、６０℃、５分
間保持し、侠雑一級アミノ酸をo−フタルアルデヒド化
した。この混合液をセパビーズＳＰ２０７（三菱化成社
製）１０ｍｌを充填したカラムに通塔し、o−フタルア
ルデヒド化した侠雑一級アミノ酸とトランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンを分離した。トランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンを含む画分を減圧濃縮後、再度イ
オン交換樹脂ダイヤイオンPA412（OH-型、三菱化成社
製）２０ｍｌを充填したカラムに通塔し、トランス−４
−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを含む画分を得た。本画分
を濃縮乾燥し、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンの白色結晶４．８ｍｇを得た（収率６２％）。
【００７１】本白色結晶を分析した結果、13Ｃ−ＮＭＲ
スペクトル、1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、マススペクト
ル、比旋光度、などが、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリン標準品（ナカライテスク株式会社）と一致し
た。
スペクトル、1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、マススペクト
ル、比旋光度、などが、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリン標準品（ナカライテスク株式会社）と一致し
た。
【００７２】実施例５ Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の
単離および精製 (1) 無細胞抽出液の調製 実施例２で得た凍結菌体６００ｇを融解後、３ｌの緩衝
液Ａ〔２ｍＭ ＤＴＴ、０. ２ｍＭ ＥＤＴＡおよび２
０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む５０ｍＭＴＡＰＳ緩
衝液（ｐＨ９. ０）〕に氷冷下で懸濁した。懸濁液をダ
イノミル（DYNO-MILL, WILLY A BACHOFEN MASCHINENFAB
RIK, BASEL, スイス）で処理し、菌体を破砕した。この
処理液を、４℃、６，５００ ｘ ｇ、３０分間遠心分離
し、上清を取得した。これ以降の操作は全て氷冷下ない
しは４℃で行った。 (2)カラムクロマトグラフィーによる単離および精製 (2)−１ ストリームライン 前記工程で得た上清を、緩衝液Ａで平衡化しておいたＤ
ＥＡＥ吸着体３００ｍｌを充填したファルマシア社製ス
トリームライン（STREAMLINETM）に通塔し、Ｌ−プロリ
ン４位水酸化酵素を含む画分を０. ３Ｍの食塩を含む緩
衝液Ａで溶出した。
単離および精製 (1) 無細胞抽出液の調製 実施例２で得た凍結菌体６００ｇを融解後、３ｌの緩衝
液Ａ〔２ｍＭ ＤＴＴ、０. ２ｍＭ ＥＤＴＡおよび２
０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む５０ｍＭＴＡＰＳ緩
衝液（ｐＨ９. ０）〕に氷冷下で懸濁した。懸濁液をダ
イノミル（DYNO-MILL, WILLY A BACHOFEN MASCHINENFAB
RIK, BASEL, スイス）で処理し、菌体を破砕した。この
処理液を、４℃、６，５００ ｘ ｇ、３０分間遠心分離
し、上清を取得した。これ以降の操作は全て氷冷下ない
しは４℃で行った。 (2)カラムクロマトグラフィーによる単離および精製 (2)−１ ストリームライン 前記工程で得た上清を、緩衝液Ａで平衡化しておいたＤ
ＥＡＥ吸着体３００ｍｌを充填したファルマシア社製ス
トリームライン（STREAMLINETM）に通塔し、Ｌ−プロリ
ン４位水酸化酵素を含む画分を０. ３Ｍの食塩を含む緩
衝液Ａで溶出した。
【００７３】(2)−２ ＤＥＡＥセファロースカラムク
ロマトグラフィー 前記工程で得た活性画分を緩衝液Ａで３倍に希釈後、予
め緩衝液Ａで平衡化しておいたＤＥＡＥセファロースカ
ラム（５ｃｍ ｘ １５ｃｍ）に通塔した。カラムを緩
衝液Ａで洗浄後、該酵素を含む画分を緩衝液Ａ中に作成
した０から０.３Ｍまでの食塩の直線濃度勾配を用いて
溶出した。
ロマトグラフィー 前記工程で得た活性画分を緩衝液Ａで３倍に希釈後、予
め緩衝液Ａで平衡化しておいたＤＥＡＥセファロースカ
ラム（５ｃｍ ｘ １５ｃｍ）に通塔した。カラムを緩
衝液Ａで洗浄後、該酵素を含む画分を緩衝液Ａ中に作成
した０から０.３Ｍまでの食塩の直線濃度勾配を用いて
溶出した。
【００７４】(2)−３ ブチルセファロースカラムクロ
マトグラフィー 前記工程で得た活性画分に３Ｍ濃度になるように食塩を
添加溶解し、予め３Ｍ食塩を含む緩衝液Ａで平衡化して
おいたブチルセファロースカラム（Butyl Sepharose 4
Fast Flow 、２. ６ｃｍ ｘ １３ｃｍ）にかけた。酵
素を３Ｍ 食塩を含む緩衝液Ａ、１. ９８Ｍ 食塩を含
む緩衝液Ａ、０. ９９Ｍ 食塩を含む緩衝液Ａおよび緩
衝液Ａのみ、の食塩濃度が異なる４種類の緩衝液で、食
塩濃度の高いほうから低いほうへ段階的に溶出した。
マトグラフィー 前記工程で得た活性画分に３Ｍ濃度になるように食塩を
添加溶解し、予め３Ｍ食塩を含む緩衝液Ａで平衡化して
おいたブチルセファロースカラム（Butyl Sepharose 4
Fast Flow 、２. ６ｃｍ ｘ １３ｃｍ）にかけた。酵
素を３Ｍ 食塩を含む緩衝液Ａ、１. ９８Ｍ 食塩を含
む緩衝液Ａ、０. ９９Ｍ 食塩を含む緩衝液Ａおよび緩
衝液Ａのみ、の食塩濃度が異なる４種類の緩衝液で、食
塩濃度の高いほうから低いほうへ段階的に溶出した。
【００７５】(2)−４ フェニルセファロースカラムク
ロマトグラフィー 前記工程で得た活性画分に３Ｍ濃度になるように食塩を
添加溶解し、予め３Ｍ食塩を含む緩衝液Ａで平衡化して
おいたフェニルセファロースカラム（Phenyl Sepharose
HP HiLoad 16/10, 1.6cm x 10cm) に通塔した。３Ｍ
食塩を含む緩衝液Ａで洗浄後、該酵素を含む画分を緩衝
液Ａで溶出した。
ロマトグラフィー 前記工程で得た活性画分に３Ｍ濃度になるように食塩を
添加溶解し、予め３Ｍ食塩を含む緩衝液Ａで平衡化して
おいたフェニルセファロースカラム（Phenyl Sepharose
HP HiLoad 16/10, 1.6cm x 10cm) に通塔した。３Ｍ
食塩を含む緩衝液Ａで洗浄後、該酵素を含む画分を緩衝
液Ａで溶出した。
【００７６】(2)−５ 色素アフィニティーカラムクロ
マトグラフィー 前記工程で得た活性画分をファルマシア社製ＰＤ−１０
カラムを用いて脱塩後、予め緩衝液Ａで平衡化しておい
たリアクティブレッド１２０カラム（シグマ社製Reacti
ve red 120, 1cm x 12. 7 cm）に通塔した。緩衝液Ａで
洗浄後、該酵素を含む画分を緩衝液Ａ中に作成した０か
ら１. ５Ｍまでの食塩の直線濃度勾配を用いて溶出し
た。
マトグラフィー 前記工程で得た活性画分をファルマシア社製ＰＤ−１０
カラムを用いて脱塩後、予め緩衝液Ａで平衡化しておい
たリアクティブレッド１２０カラム（シグマ社製Reacti
ve red 120, 1cm x 12. 7 cm）に通塔した。緩衝液Ａで
洗浄後、該酵素を含む画分を緩衝液Ａ中に作成した０か
ら１. ５Ｍまでの食塩の直線濃度勾配を用いて溶出し
た。
【００７７】(2)−６ リソースＱカラムクロマトグラ
フィー 前記工程で得た活性画分を緩衝液Ｂ〔２ｍＭ ＤＴＴ、
０. １％（ｖ／ｖ）Tween ２０および２０％（ｖ／ｖ）
グリセロールを含む５０ｍＭ ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ
８. ０）〕で平衡化したファルマシア社製ＰＤ−１０カ
ラムを用いて脱塩後、予め緩衝液Ｂで平衡化しておいた
リソースＱカラム（ファルマシア社製 RESOURCETM Q,
1ml ）に通塔した。緩衝液Ｂ中に作成した０から０. ２
Ｍまでの食塩の直線濃度勾配を用いて溶出した。
フィー 前記工程で得た活性画分を緩衝液Ｂ〔２ｍＭ ＤＴＴ、
０. １％（ｖ／ｖ）Tween ２０および２０％（ｖ／ｖ）
グリセロールを含む５０ｍＭ ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ
８. ０）〕で平衡化したファルマシア社製ＰＤ−１０カ
ラムを用いて脱塩後、予め緩衝液Ｂで平衡化しておいた
リソースＱカラム（ファルマシア社製 RESOURCETM Q,
1ml ）に通塔した。緩衝液Ｂ中に作成した０から０. ２
Ｍまでの食塩の直線濃度勾配を用いて溶出した。
【００７８】Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の単離および
精製の概要を第５表にまとめた。
精製の概要を第５表にまとめた。
【００７９】
【表６】
【００８０】実施例６ Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の
性質 (1)電気泳動による分析 実施例５で得られた精製標品を、ドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミド電気泳動法（ATTO社製ポリアク
リルアミドゲルPAGEL NPU-12.5L およびバイオラッド社
製分子量スタンダードSDS-PAGE Molecular Weight Stan
dard, Broad Range を使用）によって分析した。その結
果本酵素は分子量約３２，０００±５，０００ダルトン
のほぼ均一なサブユニットからなることが明らかとなっ
た。 (2)酵素反応に関する性質 以下の反応液を用いて、反応成分の基質省略テスト（オ
ミッションテスト）および添加物テストを行うことによ
り、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素反応の必須化合物、促
進化合物、阻害化合物の検討を行った。
性質 (1)電気泳動による分析 実施例５で得られた精製標品を、ドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミド電気泳動法（ATTO社製ポリアク
リルアミドゲルPAGEL NPU-12.5L およびバイオラッド社
製分子量スタンダードSDS-PAGE Molecular Weight Stan
dard, Broad Range を使用）によって分析した。その結
果本酵素は分子量約３２，０００±５，０００ダルトン
のほぼ均一なサブユニットからなることが明らかとなっ
た。 (2)酵素反応に関する性質 以下の反応液を用いて、反応成分の基質省略テスト（オ
ミッションテスト）および添加物テストを行うことによ
り、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素反応の必須化合物、促
進化合物、阻害化合物の検討を行った。
【００８１】基本となる反応液組成は、４ｍＭ Ｌ−プ
ロリン、８ｍＭ ２−ケトグルタル酸、２ｍＭ 硫酸第
一鉄、４ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸、カタラーゼ ２ｍ
ｇ／ｍｌおよび酵素標品を含有する８０ｍＭ ＴＥＳ緩
衝液（ｐＨ７. ５）で、液量は計５００μｌとした。反
応は酵素の添加によって開始し、３０℃、１５分間行っ
た。反応液を１００℃、２分間加熱することにより、反
応を停止した。反応液中に生成したトランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリン量をプレカラム誘導体化法によっ
て定量した。反応液１００μｌに、０. ３Ｍ ホウ酸緩
衝液（ｐＨ１０. ７）１００μｌ、１０％（ｖ／ｖ）メ
ルカプトエタノール水溶液４μｌおよび５％（ｗ／ｖ）
o−フタルアルデヒドのエタノール溶液１６μｌを添加
し６０℃、３０秒放置した。更に２％（ｗ／ｖ）ＮＢＤ
クロライドのエタノール溶液５０μｌを加え、６０℃、
４０分間反応した。１Ｎ 塩酸３０μｌを加えて反応を
停止後、沈殿を遠心およびフィルター濾過により除去し
た後、高速液体クロマトグラフィーにより分析を行い、
生成したトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定
量した。
ロリン、８ｍＭ ２−ケトグルタル酸、２ｍＭ 硫酸第
一鉄、４ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸、カタラーゼ ２ｍ
ｇ／ｍｌおよび酵素標品を含有する８０ｍＭ ＴＥＳ緩
衝液（ｐＨ７. ５）で、液量は計５００μｌとした。反
応は酵素の添加によって開始し、３０℃、１５分間行っ
た。反応液を１００℃、２分間加熱することにより、反
応を停止した。反応液中に生成したトランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリン量をプレカラム誘導体化法によっ
て定量した。反応液１００μｌに、０. ３Ｍ ホウ酸緩
衝液（ｐＨ１０. ７）１００μｌ、１０％（ｖ／ｖ）メ
ルカプトエタノール水溶液４μｌおよび５％（ｗ／ｖ）
o−フタルアルデヒドのエタノール溶液１６μｌを添加
し６０℃、３０秒放置した。更に２％（ｗ／ｖ）ＮＢＤ
クロライドのエタノール溶液５０μｌを加え、６０℃、
４０分間反応した。１Ｎ 塩酸３０μｌを加えて反応を
停止後、沈殿を遠心およびフィルター濾過により除去し
た後、高速液体クロマトグラフィーにより分析を行い、
生成したトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定
量した。
【００８２】高速液体クロマトグラフィーは、以下の条
件にて行った。 移動相：１０ｍＭ クエン酸（ｐＨ４. ０）／メタノー
ル＝３／１（ｖ／ｖ） 流速：１ｍｌ／分 カラム：YMC Pack ODS AQ-312 （ＹＭＣ社製、６ｘ１５
０ｍｍ） カラム温度：５０℃ 検出：蛍光検出、励起波長５０３ｎｍ、蛍光波長５４１
ｎｍ その結果、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素反応には、Ｌ−
プロリン、２−ケトグルタル酸、Fe++イオンが必須であ
り、Ｌ−アスコルビン酸は反応を促進、またZn ++, Cu++
イオンおよびＥＤＴＡの添加は反応を阻害した。
件にて行った。 移動相：１０ｍＭ クエン酸（ｐＨ４. ０）／メタノー
ル＝３／１（ｖ／ｖ） 流速：１ｍｌ／分 カラム：YMC Pack ODS AQ-312 （ＹＭＣ社製、６ｘ１５
０ｍｍ） カラム温度：５０℃ 検出：蛍光検出、励起波長５０３ｎｍ、蛍光波長５４１
ｎｍ その結果、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素反応には、Ｌ−
プロリン、２−ケトグルタル酸、Fe++イオンが必須であ
り、Ｌ−アスコルビン酸は反応を促進、またZn ++, Cu++
イオンおよびＥＤＴＡの添加は反応を阻害した。
【００８３】結果を第６表に示す。
【００８４】
【表７】
【００８５】(3)至適ｐＨ Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の活性測定法において、反
応液成分中の緩衝液成分を、ｐＨ３. ５〜５. ５は酢酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ５. ５〜６. ５はＭＥＳ緩衝
液、ｐＨ７. ０〜７. ５はＴＥＳ緩衝液、ｐＨ８. ０〜
９. ０はＴＡＰＳ緩衝液、ｐＨ９. ５〜１１. ０はＣＡ
ＰＳＯ緩衝液に置換え反応を行った結果、ｐＨ６. ０〜
７. ０で最高活性の９０％以上の活性を示した。結果を
第７表に示す。
応液成分中の緩衝液成分を、ｐＨ３. ５〜５. ５は酢酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ５. ５〜６. ５はＭＥＳ緩衝
液、ｐＨ７. ０〜７. ５はＴＥＳ緩衝液、ｐＨ８. ０〜
９. ０はＴＡＰＳ緩衝液、ｐＨ９. ５〜１１. ０はＣＡ
ＰＳＯ緩衝液に置換え反応を行った結果、ｐＨ６. ０〜
７. ０で最高活性の９０％以上の活性を示した。結果を
第７表に示す。
【００８６】
【表８】
【００８７】(4)ｐＨ安定性 本酵素を、５０ｍＭ緩衝液〔ｐＨ３. ５〜５. ５は酢酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ５. ５〜６. ５はＭＥＳ緩衝
液、ｐＨ７. ０〜７. ５はＴＥＳ緩衝液、ｐＨ８. ０〜
９. ０はＴＡＰＳ緩衝液、ｐＨ９. ５〜１１. ０はＣＡ
ＰＳＯ緩衝液〕、２ｍＭ ＤＴＴおよび２０％（ｖ／
ｖ）グリセロール存在下、４℃、２４時間保持した後活
性を測定した。ｐＨ６. ５〜１０. ０の範囲で保持した
酵素は保持前の活性の９０％以上の活性を有しており、
ｐＨ６. ５〜１０. ０の範囲で活性は安定に保たれた。 (5)至適温度 Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の活性測定法において、１
５〜５０℃の温度範囲で１５分間反応を行った結果、３
０〜４０℃で最高活性の９０％以上の活性を示した。結
果を第８表に示す。
ナトリウム緩衝液、ｐＨ５. ５〜６. ５はＭＥＳ緩衝
液、ｐＨ７. ０〜７. ５はＴＥＳ緩衝液、ｐＨ８. ０〜
９. ０はＴＡＰＳ緩衝液、ｐＨ９. ５〜１１. ０はＣＡ
ＰＳＯ緩衝液〕、２ｍＭ ＤＴＴおよび２０％（ｖ／
ｖ）グリセロール存在下、４℃、２４時間保持した後活
性を測定した。ｐＨ６. ５〜１０. ０の範囲で保持した
酵素は保持前の活性の９０％以上の活性を有しており、
ｐＨ６. ５〜１０. ０の範囲で活性は安定に保たれた。 (5)至適温度 Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の活性測定法において、１
５〜５０℃の温度範囲で１５分間反応を行った結果、３
０〜４０℃で最高活性の９０％以上の活性を示した。結
果を第８表に示す。
【００８８】
【表９】
【００８９】(6)温度安定性 本酵素を、２ｍＭ ＤＴＴ、０．１％（ｖ／ｖ）Tween2
0 および２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する５０
ｍＭ ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．０）中で０〜６０℃の
温度範囲で３０分間保持した後、活性測定を行った結
果、本酵素は５０℃、３０分間の処理で完全に失活し
た。 (7)Ｎ末端アミノ酸配列 島津製作所社製Protein sequencer model PPSQ-10 を用
いて本酵素蛋白のＮ末端アミノ酸配列を分析した結果、
以下の結果を得た。
0 および２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する５０
ｍＭ ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．０）中で０〜６０℃の
温度範囲で３０分間保持した後、活性測定を行った結
果、本酵素は５０℃、３０分間の処理で完全に失活し
た。 (7)Ｎ末端アミノ酸配列 島津製作所社製Protein sequencer model PPSQ-10 を用
いて本酵素蛋白のＮ末端アミノ酸配列を分析した結果、
以下の結果を得た。
【００９０】
【化３】
【００９１】実施例７ Ｌ−プロリンの水酸化 実施例５で取得した精製酵素標品を用いて、Ｌ−プロリ
ンの水酸化を行った。２０ｍＭ Ｌ−プロリン、２０ｍ
Ｍ ２−ケトグルタル酸、５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸、
２ｍＭ 硫酸第一鉄および９０Ｕの精製酵素標品を含有
する２００ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） ５０μｌ
を用いて３５℃、３０分間反応を行った。その結果、反
応液中には１２．９ｍＭ（１．７ｇ／ｌ）のトランス−
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが生成した。
ンの水酸化を行った。２０ｍＭ Ｌ−プロリン、２０ｍ
Ｍ ２−ケトグルタル酸、５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸、
２ｍＭ 硫酸第一鉄および９０Ｕの精製酵素標品を含有
する２００ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） ５０μｌ
を用いて３５℃、３０分間反応を行った。その結果、反
応液中には１２．９ｍＭ（１．７ｇ／ｌ）のトランス−
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが生成した。
【００９２】実施例８ プロリン類の分離検出 図１に示した高速液体クロマトグラフィー〔クロマトパ
ック：CR6A、システムコントローラー：SCL-6B、オート
インジェクター：SIL-6B、送液ポンプ：LC-6A、カラム
オーブン：CTO-6A、化学反応漕：CRB-6A、蛍光検出器：
RF-550A （以上、島津製作所製）使用カラム：SUMCHIRA
L OA5000（径４．５ｍｍＸ２５０ｍｍ；株式会社住化分
析センター製）〕の試料注入口からＬ−プロリン、トラ
ンス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、シスー４−ヒド
ロキシ−Ｄ−プロリン、シスー４−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリン、Ｄ−プロリンを各々０. ０１ｇ／ｌ含有する標
準水溶液１０μｌを注入した。以下の条件〔移動相：１
ｍＭ 硫酸銅水溶液、移動相流速：１. ０ｍｌ／分、カ
ラム温度：３８℃〕でカラムからプロリン類を分離した
後、２５ｍＭEDTA含有０．３Ｍ硼酸緩衝液（ｐＨ９．
６）を流速０．２ｍｌで混入し、さらにＮＢＤクロライ
ドのエタノール溶液（０．５ｇ／ｌ）を流速０．５ｍｌ
／分で混入させ、６０℃で３分間加温した。送液中５０
３ｎｍの励起光を照射して５４１ｎｍにおける蛍光を測
定してプロリン類のＮＢＤ誘導体の検出を行った。
ック：CR6A、システムコントローラー：SCL-6B、オート
インジェクター：SIL-6B、送液ポンプ：LC-6A、カラム
オーブン：CTO-6A、化学反応漕：CRB-6A、蛍光検出器：
RF-550A （以上、島津製作所製）使用カラム：SUMCHIRA
L OA5000（径４．５ｍｍＸ２５０ｍｍ；株式会社住化分
析センター製）〕の試料注入口からＬ−プロリン、トラ
ンス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、シスー４−ヒド
ロキシ−Ｄ−プロリン、シスー４−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリン、Ｄ−プロリンを各々０. ０１ｇ／ｌ含有する標
準水溶液１０μｌを注入した。以下の条件〔移動相：１
ｍＭ 硫酸銅水溶液、移動相流速：１. ０ｍｌ／分、カ
ラム温度：３８℃〕でカラムからプロリン類を分離した
後、２５ｍＭEDTA含有０．３Ｍ硼酸緩衝液（ｐＨ９．
６）を流速０．２ｍｌで混入し、さらにＮＢＤクロライ
ドのエタノール溶液（０．５ｇ／ｌ）を流速０．５ｍｌ
／分で混入させ、６０℃で３分間加温した。送液中５０
３ｎｍの励起光を照射して５４１ｎｍにおける蛍光を測
定してプロリン類のＮＢＤ誘導体の検出を行った。
【００９３】上記条件に於て標記標準液を分析した結
果、標準試料中に含有されるプロリン、ヒドロキシプロ
リンの全ての光学異性体を別々のピークとして明瞭に分
離検出することが可能であった。結果を第９表および図
２に示す。
果、標準試料中に含有されるプロリン、ヒドロキシプロ
リンの全ての光学異性体を別々のピークとして明瞭に分
離検出することが可能であった。結果を第９表および図
２に示す。
【００９４】
【表１０】
【００９５】実施例９ プロリン類の分離検出 トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの０．０００
１ｇ／ｌ（１０μｌ中に７．６pmol含有）から０．１ｇ
／ｌ（同７．６nmol含有）までの段階的に一定濃度の水
溶液を作成し、実施例８の方法に従ってトランス−４−
ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを分離測定した。結果を図３
および図４に示す。
１ｇ／ｌ（１０μｌ中に７．６pmol含有）から０．１ｇ
／ｌ（同７．６nmol含有）までの段階的に一定濃度の水
溶液を作成し、実施例８の方法に従ってトランス−４−
ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを分離測定した。結果を図３
および図４に示す。
【００９６】図３および図４によれば、トランス−４−
ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは０．０００１ｇ／ｌまで検
出可能であり、０．０００１ｇ／ｌから０．１ｇ／ｌの
間で定量性が確認された。この結果は参考例１で得られ
たＮＢＤを用いない自動分析法で得られたトランス−４
−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの検出感度の１０倍の値で
あった。
ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは０．０００１ｇ／ｌまで検
出可能であり、０．０００１ｇ／ｌから０．１ｇ／ｌの
間で定量性が確認された。この結果は参考例１で得られ
たＮＢＤを用いない自動分析法で得られたトランス−４
−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの検出感度の１０倍の値で
あった。
【００９７】実施例１０ プロリン類の分離検出 第１０表に示した２２種類のアミノ酸について各々０.
０１ｇ／ｌの濃度の水溶液を作成し、実施例８の方法に
従いＮＢＤ化法によって分析を行った。結果を第１０表
に示す。
０１ｇ／ｌの濃度の水溶液を作成し、実施例８の方法に
従いＮＢＤ化法によって分析を行った。結果を第１０表
に示す。
【００９８】
【表１１】
【００９９】第１０表によれば、トランス−４−ヒドロ
キシ−Ｌ−プロリンの検出感度を１００としたときに、
プロリン以外の他の２０種のアミノ酸の検出感度はいず
れも２以下であった。即ち、トランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンの他のアミノ酸に対する比検出感度が他
のアミノ酸よりも５０倍高いことがしめされたが、これ
は参考例２で得られたＮＢＤを用いない自動分析法で得
た比検出感度よりも著しく高い値であった。
キシ−Ｌ−プロリンの検出感度を１００としたときに、
プロリン以外の他の２０種のアミノ酸の検出感度はいず
れも２以下であった。即ち、トランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンの他のアミノ酸に対する比検出感度が他
のアミノ酸よりも５０倍高いことがしめされたが、これ
は参考例２で得られたＮＢＤを用いない自動分析法で得
た比検出感度よりも著しく高い値であった。
【０１００】参考例１ 図５に示した高速液体クロマトグラフィー〔クロマトパ
ック：CR6A、システムコントローラー：SCL-6B、オート
インジェクター：SIL-6B、送液ポンプ：LC-6A、カラム
オーブン：CTO-6A、UV-VIS 検出器： SPD-6AV（以上、
島津製作所製）使用カラム：SUMCHIRAL OA5000（径４．
５ｍｍＸ２５０ｍｍ；株式会社住化分析センター製）〕
の試料注入口から実施例９で用いた試料１０μｌを注入
し、以下の条件〔移動相：１ｍＭ 硫酸銅水溶液、移動
相流速：１. ２ｍｌ／分、カラム温度：３５℃〕でカラ
ムからプロリン類を分離した後、２５４ｎｍの紫外線吸
収を用いてプロリン類の検出を行った。
ック：CR6A、システムコントローラー：SCL-6B、オート
インジェクター：SIL-6B、送液ポンプ：LC-6A、カラム
オーブン：CTO-6A、UV-VIS 検出器： SPD-6AV（以上、
島津製作所製）使用カラム：SUMCHIRAL OA5000（径４．
５ｍｍＸ２５０ｍｍ；株式会社住化分析センター製）〕
の試料注入口から実施例９で用いた試料１０μｌを注入
し、以下の条件〔移動相：１ｍＭ 硫酸銅水溶液、移動
相流速：１. ２ｍｌ／分、カラム温度：３５℃〕でカラ
ムからプロリン類を分離した後、２５４ｎｍの紫外線吸
収を用いてプロリン類の検出を行った。
【０１０１】その結果検出限界は０．００１ｇ／ｄｌで
あった。
あった。
【０１０２】参考例２ 実施例９で用いた試料を参考例１の方法で測定した。結
果を第１０表に示した。第１０表によれば、トランス−
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの検出感度を１００とし
た場合に、プロリン以外の他の２０種のアミノ酸の検出
感度は４５〜１７０であった。即ち、トランス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリンの他のアミノ酸に対する比検出
感度は０．４５〜１．７倍であった。
果を第１０表に示した。第１０表によれば、トランス−
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの検出感度を１００とし
た場合に、プロリン以外の他の２０種のアミノ酸の検出
感度は４５〜１７０であった。即ち、トランス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリンの他のアミノ酸に対する比検出
感度は０．４５〜１．７倍であった。
【０１０３】
【発明の効果】本発明によれば、発酵法によって糖源か
ら工業的に生産されているＬ−プロリンを直接微生物的
あるいは酵素的に水酸化することにより、工業的に有利
にトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する
方法、該製造法に有用なＬ−プロリン４位水酸化酵素、
および検出感度が高く、プロリン類の特異的検出定量が
可能な自動分析法を提供することができる。
ら工業的に生産されているＬ−プロリンを直接微生物的
あるいは酵素的に水酸化することにより、工業的に有利
にトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する
方法、該製造法に有用なＬ−プロリン４位水酸化酵素、
および検出感度が高く、プロリン類の特異的検出定量が
可能な自動分析法を提供することができる。
【０１０４】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 トロポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：ダクチロスポランジウム・エスピー（Dactylos
porangium sp.） 株名：ＲＨ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４４００） 配列： Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Gln Tyr Arg Glu Ala Gly Tyr Leu Leu 1 5 10 15 Ile Glu Asp Gly Leu Gly Pro Arg Arg Val 20 25
porangium sp.） 株名：ＲＨ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４４００） 配列： Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Gln Tyr Arg Glu Ala Gly Tyr Leu Leu 1 5 10 15 Ile Glu Asp Gly Leu Gly Pro Arg Arg Val 20 25
【図１】 ＮＢＤを用いた高速液体クロマトグラフィー
システム構成
システム構成
【図２】 ＮＢＤを用いたプロリン類の高速液体クロマ
ートグラフィー
ートグラフィー
（１）トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン （２）シス−４−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン （３）Ｌ−プロリン （４）シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン （５）Ｄ−プロリン
【図３】 ＮＢＤを用いたプロリン類の自動分析法で得
られた７．６ピコモルから３０５ピコモルでの検量線。
られた７．６ピコモルから３０５ピコモルでの検量線。
【図４】 ＮＢＤを用いたプロリン類の自動分析法で得
られた１５３ピコモルから７６００ピコモルでの検量
線。
られた１５３ピコモルから７６００ピコモルでの検量
線。
【図５】 ＮＢＤを用いない高速液体クロマトグラフィ
ーシステム構成。
ーシステム構成。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年１２月５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】
【化１】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５７】
【化２】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９０】
【化３】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０４】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 トロポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：ダクチロスポランジウム・エスピー（Dactylos
porangium sp.） 株名：ＲＨ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４４００） 配列： Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Gln Tyr Arg Glu Ala Gly Tyr Leu Leu 1 5 10 15 Ile Glu Asp Gly Leu Gly Pro Arg Glu Val 20 25
porangium sp.） 株名：ＲＨ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４４００） 配列： Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Gln Tyr Arg Glu Ala Gly Tyr Leu Leu 1 5 10 15 Ile Glu Asp Gly Leu Gly Pro Arg Glu Val 20 25
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (31)優先権主張番号 特願平6−60377 (32)優先日 平６(1994)３月30日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ）
Claims (10)
- 【請求項１】 Ｌ−プロリンからトランス−４−ヒドロ
キシ−Ｌ−プロリンへの水酸化反応を触媒する酵素源、
二価鉄イオンおよび２−ケトグルタル酸の存在下、培養
物中もしくは水性媒体中でＬ−プロリンをトランス−４
−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換させ、生成したトラ
ンス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを該培養物中もし
くは該水性媒体中より採取することを特徴とするトラン
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。 - 【請求項２】 酵素源が、微生物、その培養物、菌体、
菌体処理物、精製酵素または粗酵素である請求項１に記
載の製造法。 - 【請求項３】 該微生物が、ダクチロスポランジウム
（Dactylosporangium）属あるいはアミコラトプシス（A
mycolatopsis）属に属する微生物である請求項２記載の
製造法。 - 【請求項４】 酵素源が、下記の理化学的性質を示すＬ
−プロリン４位水酸化酵素である請求項１記載の製造
法。 (1)作用および基質特異性 ２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下、遊離
のＬ−プロリンに作用して、トランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを生成する。 (2)至適ｐＨ ３０℃、２０分間の反応において、ｐＨ６．０〜７．０
に至適ｐＨを有する。 (3)ｐＨ安定性 ４℃、２４時間の処理で、ｐＨ６. ５〜１０. ０の範囲
で安定に保たれる。 (4)至適温度 ｐＨ６. ５、１５分間の反応において、３０〜４０℃に
至適温度を有する。 (5)温度安定性 ｐＨ９. ０、５０℃、３０分間の処理で完全に失活す
る。 (6)阻害剤 Zn++およびCu++の金属イオンおよびエチレンジアミンテ
トラ酢酸により阻害を受ける。 (7)活性化 活性化には補酵素を必要としない。反応液へのＬ−アス
コルビン酸の添加は、反応を促進する。 (8)Ｋｍ値 ８０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６. ５）中に４ｍＭ Ｌ−アス
コルビン酸、２ｍＭ 硫酸第一鉄および酵素標品を含有
する反応液中で測定したＬ−プロリンに対するＫｍ値は
０. ２７ｍＭであり、２−ケトグルタル酸に対するＫｍ
値は０. ５５ｍＭである。 (9)分子量 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動
法による測定で、３２，０００±５，０００ダルトンで
あり、ゲル濾過法によって測定した分子量が４３，８０
０±５，０００ダルトンである。 (10)Ｎ末端アミノ酸配列 配列番号１で表されるＮ末端アミノ酸配列を有する - 【請求項５】 下記の理化学的性質を示すＬ−プロリン
４位水酸化酵素。 (1)作用および基質特異性 ２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下、遊離
のＬ−プロリンに作用して、トランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを生成する。 (2)至適ｐＨ ３０℃、２０分間の反応において、ｐＨ６. ０〜７. ０
に至適ｐＨを有する。 (3)ｐＨ安定性 ４℃、２４時間の処理で、ｐＨ６. ５〜１０. ０の範囲
で安定に保たれる。 (4)至適温度 ｐＨ６. ５、１５分間の反応において、３０〜４０℃に
至適温度を有する。 (5)温度安定性 ｐＨ９. ０、５０℃、３０分間の処理で完全に失活す
る。 (6)阻害剤 Zn++およびCu++の金属イオンおよびエチレンジアミンテ
トラ酢酸により阻害を受ける。 (7)活性化 活性化には補酵素を必要としない。反応液へのＬ−アス
コルビン酸の添加は、反応を促進する。 (8)Ｋｍ値 ８０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６. ５）中に４ｍＭ Ｌ−アス
コルビン酸、２ｍＭ 硫酸第一鉄および酵素標品を含有
する反応液中で測定したＬ−プロリンに対するＫｍ値は
０. ２７ｍＭであり、２−ケトグルタル酸に対するＫｍ
値は０. ５５ｍＭである。 (9)分子量 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動
法による測定で、３２，０００±５，０００ダルトンで
あり、ゲル濾過法によって測定した分子量が４３，８０
０±５，０００ダルトンである。 (10)Ｎ末端アミノ酸配列 配列番号１で表されるＮ末端アミノ酸配列を有する - 【請求項６】 ダクチロスポランジウム属に属し、かつ
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を生産する能力を有する微
生物を培養し、培養物中にＬ−プロリン４位水酸化酵素
を生成蓄積させ、該培養物からＬ−プロリン４位水酸化
酵素を採取することを特徴とするＬ−プロリン４位水酸
化酵素の製造法。 - 【請求項７】 プロリン類を含有する試料を高速液体ク
ロマトグラフィーを用いて分析する方法において、試料
をカラムで処理後、送液ライン中で溶出液に金属キレー
ト剤を含有させた緩衝液を混入させた後、溶出液中のプ
ロリン類と７−クロロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ
−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）クロライドとを反応さ
せ、生成したＮＢＤ化プロリン類を検出定量することを
特徴とするプロリン類の検出定量方法。 - 【請求項８】 溶出液に金属キレート剤を含有した緩衝
液を混入させ、該溶出液のｐＨを８．５〜１０．５にし
た後、該溶出液にＮＢＤクロライド溶液を混入し、該溶
出液を４０〜８０℃に維持することを特徴とする請求項
８記載の方法。 - 【請求項９】 緩衝液が硼酸緩衝液であることを特徴と
する請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 金属キレート剤が、エチレンジアミン
テトラ酢酸であることを特徴とする請求項８記載の方
法。
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1994
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