JPH07308188A - L−リンゴ酸重合物産生微生物の培養法 - Google Patents
L−リンゴ酸重合物産生微生物の培養法Info
- Publication number
- JPH07308188A JPH07308188A JP6102708A JP10270894A JPH07308188A JP H07308188 A JPH07308188 A JP H07308188A JP 6102708 A JP6102708 A JP 6102708A JP 10270894 A JP10270894 A JP 10270894A JP H07308188 A JPH07308188 A JP H07308188A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- malic acid
- culture
- acid polymer
- producing
- genus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 title claims abstract description 33
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title claims abstract description 17
- 229940116298 l- malic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 30
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 14
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 abstract description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 abstract 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 abstract 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 abstract 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 abstract 1
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 14
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 12
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 9
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 9
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 9
- 229940099690 malic acid Drugs 0.000 description 8
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 7
- -1 monomethyl ester Chemical class 0.000 description 7
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 5
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 5
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 4
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960003390 magnesium sulfate Drugs 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IMWCPTKSESEZCL-SPSNFJOYSA-H (e)-but-2-enedioate;iron(3+) Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].[O-]C(=O)\C=C\C([O-])=O.[O-]C(=O)\C=C\C([O-])=O.[O-]C(=O)\C=C\C([O-])=O IMWCPTKSESEZCL-SPSNFJOYSA-H 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000223651 Aureobasidium Species 0.000 description 1
- 241000307611 Aureobasidium mansonii Species 0.000 description 1
- 241000223678 Aureobasidium pullulans Species 0.000 description 1
- 241001480003 Chaetothyriales Species 0.000 description 1
- 241000222059 Kabatiella microsticta Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 239000008896 Opium Substances 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 241001507683 Penicillium aurantiogriseum Species 0.000 description 1
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002473 artificial blood Substances 0.000 description 1
- NHJPVZLSLOHJDM-UHFFFAOYSA-N azane;butanedioic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O NHJPVZLSLOHJDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGYZCBIYODIDEY-UHFFFAOYSA-N benzyl 4-oxooxetane-2-carboxylate Chemical compound C1C(=O)OC1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 AGYZCBIYODIDEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- VEPSWGHMGZQCIN-UHFFFAOYSA-H ferric oxalate Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].[O-]C(=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)C([O-])=O VEPSWGHMGZQCIN-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M iron chloride Chemical compound [Cl-].[Fe] FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- MVFCKEFYUDZOCX-UHFFFAOYSA-N iron(2+);dinitrate Chemical compound [Fe+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O MVFCKEFYUDZOCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K iron(III) citrate Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960002337 magnesium chloride Drugs 0.000 description 1
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229960005336 magnesium citrate Drugs 0.000 description 1
- 235000002538 magnesium citrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004337 magnesium citrate Substances 0.000 description 1
- UHNWOJJPXCYKCG-UHFFFAOYSA-L magnesium oxalate Chemical compound [Mg+2].[O-]C(=O)C([O-])=O UHNWOJJPXCYKCG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960001027 opium Drugs 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000007151 ring opening polymerisation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- PLSARIKBYIPYPF-UHFFFAOYSA-H trimagnesium dicitrate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O PLSARIKBYIPYPF-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 オウレオバセディウム属に属するL−リンゴ
酸重合物産生微生物を培養するにあたり、適当量の有機
窒素源及びマグネシウムイオンを添加した培地で培養す
ることを特徴とするL−リンゴ酸重合物産生微生物の培
養法。 【効果】 従来の培養法に比べ高生産性のL−リンゴ酸
産生菌体を得ることができ、高収量でL−リンゴ酸重合
物が得られる。
酸重合物産生微生物を培養するにあたり、適当量の有機
窒素源及びマグネシウムイオンを添加した培地で培養す
ることを特徴とするL−リンゴ酸重合物産生微生物の培
養法。 【効果】 従来の培養法に比べ高生産性のL−リンゴ酸
産生菌体を得ることができ、高収量でL−リンゴ酸重合
物が得られる。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、休止菌体法によりL−
リンゴ酸重合物(poly-L-Malic acid 、以下「PML
A」と略称することがある。)を高収率に製造するため
のL−リンゴ酸重合物産生微生物の培養法に関する。こ
こでいう休止菌体法とは、培養により得られた菌体を回
収し、菌体が増殖し得ない組成の水溶液に作用させるこ
とにより、休止状態の菌体をそのまま酵素触媒として用
いる方法をいう。
リンゴ酸重合物(poly-L-Malic acid 、以下「PML
A」と略称することがある。)を高収率に製造するため
のL−リンゴ酸重合物産生微生物の培養法に関する。こ
こでいう休止菌体法とは、培養により得られた菌体を回
収し、菌体が増殖し得ない組成の水溶液に作用させるこ
とにより、休止状態の菌体をそのまま酵素触媒として用
いる方法をいう。
【0002】PMLAは、生体内分解吸収性高分子化合
物として、生体吸収性縫合糸、骨接合用材料、人工腱、
人工血管及びドラッグデリバリーの高分子キャリアー等
として、医薬及び医療の分野での用途が多いに期待され
ている。
物として、生体吸収性縫合糸、骨接合用材料、人工腱、
人工血管及びドラッグデリバリーの高分子キャリアー等
として、医薬及び医療の分野での用途が多いに期待され
ている。
【0003】
【従来の技術】PMLAは、リンゴ酸モノベンジル又は
モノメチルエステルを原料とする化学合成法〔レポート
・オブ・ファクルティー・エンジニアリング(Reports
of theFaculty Engineering、Tottori University)、
8、 124 (1977) 〕、ベンジルマロラクトネートを開環
重合させる化学合成法〔米国特許第4265247号明
細書〕、直接熱縮合法〔高分子論文集、44、701 (198
7)〕等の化学合成法による製造法が報告されている。
モノメチルエステルを原料とする化学合成法〔レポート
・オブ・ファクルティー・エンジニアリング(Reports
of theFaculty Engineering、Tottori University)、
8、 124 (1977) 〕、ベンジルマロラクトネートを開環
重合させる化学合成法〔米国特許第4265247号明
細書〕、直接熱縮合法〔高分子論文集、44、701 (198
7)〕等の化学合成法による製造法が報告されている。
【0004】また、微生物を用いたPMLAの製造で
は、ペニシリウム・サイクロピウム(Penicillium cycl
opium )を用いた固体培養による製造例〔アグリカルチ
ュアル・バイオロジカル・ケミストリー(Agricultural
Biological Chemistry )、33、 459 (1969)〕、オウ
レオバセディウム(Aureobasidium )属菌を用いた発酵
法(特開平4−211385)及び酵素法(特開平4−
341189)による製造例等が知られている。
は、ペニシリウム・サイクロピウム(Penicillium cycl
opium )を用いた固体培養による製造例〔アグリカルチ
ュアル・バイオロジカル・ケミストリー(Agricultural
Biological Chemistry )、33、 459 (1969)〕、オウ
レオバセディウム(Aureobasidium )属菌を用いた発酵
法(特開平4−211385)及び酵素法(特開平4−
341189)による製造例等が知られている。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、化学合成法による製造では原料が高価
であるばかりか、多数の工程を必要とするため収率が低
いという欠点を有している。一方、前記したペニシリウ
ム・サイクロピウムを用いた固体培養法による製造では
収率が低く、また精製に多工程を要するため、実際的な
方法とは言い難い。
しかしながら、化学合成法による製造では原料が高価
であるばかりか、多数の工程を必要とするため収率が低
いという欠点を有している。一方、前記したペニシリウ
ム・サイクロピウムを用いた固体培養法による製造では
収率が低く、また精製に多工程を要するため、実際的な
方法とは言い難い。
【0006】また、オウレオバセディウム属菌を用いた
発酵法及び酵素法による製造では、工業的製造を行う上
ではいまだ収量が十分ではなく、より高収量で安価に製
造する方法の開発が望まれていた。
発酵法及び酵素法による製造では、工業的製造を行う上
ではいまだ収量が十分ではなく、より高収量で安価に製
造する方法の開発が望まれていた。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
について鋭意検討し、オウレオバセディウム属に属する
PMLA産生菌の培養培地にマグネシウムイオン及びペ
プトン、コーンスティープリカー等の有機窒素源を添加
することにより、PMLAを高収量に産生しうる微生物
菌体を得る方法を見出し、本発明を完成するに至った。
について鋭意検討し、オウレオバセディウム属に属する
PMLA産生菌の培養培地にマグネシウムイオン及びペ
プトン、コーンスティープリカー等の有機窒素源を添加
することにより、PMLAを高収量に産生しうる微生物
菌体を得る方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【0008】すなわち、本発明は、オウレオバセディウ
ム属に属するL−リンゴ酸重合物産生微生物を培養する
にあたり、0.1〜2重量%の有機窒素源及び0.2〜
30mMのマグネシウムイオンを添加した培地で培養す
ることを特徴とするL−リンゴ酸重合物産生微生物の培
養法を提供するものである。以下に、本発明のL−リン
ゴ酸重合物産生微生物の培養法について更に詳細に述べ
る。
ム属に属するL−リンゴ酸重合物産生微生物を培養する
にあたり、0.1〜2重量%の有機窒素源及び0.2〜
30mMのマグネシウムイオンを添加した培地で培養す
ることを特徴とするL−リンゴ酸重合物産生微生物の培
養法を提供するものである。以下に、本発明のL−リン
ゴ酸重合物産生微生物の培養法について更に詳細に述べ
る。
【0009】オウレオバセディウム属に属する微生物に
は、従来プルラリア(Pullularia)属に分類され、後に
オウレオバセディウム属に再分類された微生物も含ま
れ、総括的に黒色酵母(black yeast )とも言われてい
る〔マイコパソロジア・マイコロジア・アプリカータ
(Mycopathologia et Mycologia Applicata )、12、1
(1959)、同17、1 (1962)〕。従って、PMLAを産生し
得る黒色酵母であれば、これらをも本発明の範囲に含む
ものである。そのような微生物としては、例えば、以下
のものが挙げられる。
は、従来プルラリア(Pullularia)属に分類され、後に
オウレオバセディウム属に再分類された微生物も含ま
れ、総括的に黒色酵母(black yeast )とも言われてい
る〔マイコパソロジア・マイコロジア・アプリカータ
(Mycopathologia et Mycologia Applicata )、12、1
(1959)、同17、1 (1962)〕。従って、PMLAを産生し
得る黒色酵母であれば、これらをも本発明の範囲に含む
ものである。そのような微生物としては、例えば、以下
のものが挙げられる。
【0010】オウレオバセディウム・プルランス(Aure
obasidium pullulans )IFO 4464、同IFO
4465、同IFO 4875、同IFO 7757、
同ATCC 7305、オウレオバセディウム・マンソ
ニー(Aureobasidium mansonii)IFO 6421、同
IFO 8194、同IFO 9233、同ATCC1
4249、オウレオバセディウム・ミクロステイクタム
(Aureobasidium microstictum)IFO 32066、
同IFO 32067、同IFO 32068、同IF
O 32069、オウレオバセディウムsp.A−91
株、及びこれらの変異株。
obasidium pullulans )IFO 4464、同IFO
4465、同IFO 4875、同IFO 7757、
同ATCC 7305、オウレオバセディウム・マンソ
ニー(Aureobasidium mansonii)IFO 6421、同
IFO 8194、同IFO 9233、同ATCC1
4249、オウレオバセディウム・ミクロステイクタム
(Aureobasidium microstictum)IFO 32066、
同IFO 32067、同IFO 32068、同IF
O 32069、オウレオバセディウムsp.A−91
株、及びこれらの変異株。
【0011】上記菌株の中で、オウレオバセディウムs
p.A−91株は、工業技術院生命工学工業技術研究所
に微生物受託番号 微工研菌寄第11966号(FER
MP−11966)として寄託されている。上記のオウ
レオバセディウム属菌を培養するには、炭素源、窒素
源、無機塩等に加えて適当量の有機窒素源及びマグネシ
ウムイオンの栄養分を含む培地を用いて行うことができ
る。
p.A−91株は、工業技術院生命工学工業技術研究所
に微生物受託番号 微工研菌寄第11966号(FER
MP−11966)として寄託されている。上記のオウ
レオバセディウム属菌を培養するには、炭素源、窒素
源、無機塩等に加えて適当量の有機窒素源及びマグネシ
ウムイオンの栄養分を含む培地を用いて行うことができ
る。
【0012】培地の炭素源としては、例えば、グルコー
ス、フルクトース、シュークロース等の糖質原料、それ
らの中で特にグルコースが好適に用いられ、その添加濃
度は1〜30重量%、好ましくは1〜20重量%が適当
である。窒素源としては、微生物の培養に際して通常使
用される無機物質、例えば、アンモニア、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、コハク酸
アンモニウムなどの有機酸アンモニウム塩、尿素等を単
独もしくは混合して用いることができる。
ス、フルクトース、シュークロース等の糖質原料、それ
らの中で特にグルコースが好適に用いられ、その添加濃
度は1〜30重量%、好ましくは1〜20重量%が適当
である。窒素源としては、微生物の培養に際して通常使
用される無機物質、例えば、アンモニア、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、コハク酸
アンモニウムなどの有機酸アンモニウム塩、尿素等を単
独もしくは混合して用いることができる。
【0013】また、無機塩としては、例えば、リン酸一
水素カリウム、リン酸二水素カリウム等を用いることが
でき、その添加濃度は、0.001〜5重量%、好まし
くは0.01〜1重量%が適当である。有機窒素源とし
ては、例えば、酵母エキス、コーンスティープリカー、
ペプトン、肉エキス、カザミノ酸、麦芽エキス、大豆粕
又はトリプトン等、好ましくは、コーンスティープリカ
ー又はペプトン等を用いることができ、その添加濃度
は、0.1〜2重量%、好ましくは0.1〜1重量%が
適当である。
水素カリウム、リン酸二水素カリウム等を用いることが
でき、その添加濃度は、0.001〜5重量%、好まし
くは0.01〜1重量%が適当である。有機窒素源とし
ては、例えば、酵母エキス、コーンスティープリカー、
ペプトン、肉エキス、カザミノ酸、麦芽エキス、大豆粕
又はトリプトン等、好ましくは、コーンスティープリカ
ー又はペプトン等を用いることができ、その添加濃度
は、0.1〜2重量%、好ましくは0.1〜1重量%が
適当である。
【0014】マグネシウムイオンはマグネシウム塩とし
て添加することができ、例えば、塩化マグネシウム、硫
酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム又はシュウ酸マ
グネシウム等、好ましくは、塩化マグネシウムまたは硫
酸マグネシウム等を挙げることができ、その添加濃度
は、マグネシウムイオンの濃度が0.2〜30mM、好
ましくは0.2〜5mMとなるように添加するのが適当
である。
て添加することができ、例えば、塩化マグネシウム、硫
酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム又はシュウ酸マ
グネシウム等、好ましくは、塩化マグネシウムまたは硫
酸マグネシウム等を挙げることができ、その添加濃度
は、マグネシウムイオンの濃度が0.2〜30mM、好
ましくは0.2〜5mMとなるように添加するのが適当
である。
【0015】この他に菌の生育に必要であれば、各種ビ
タミン等の栄養素を培地に添加し用いることができる。
培養は振とう、通気撹拌等の好気的条件下で行われ、培
養温度は一般に20〜40℃、好ましくは22〜35℃
が好適である。培養pHは、通常2〜10、好ましくは
3〜9、更に好ましくは3〜7が適当である。
タミン等の栄養素を培地に添加し用いることができる。
培養は振とう、通気撹拌等の好気的条件下で行われ、培
養温度は一般に20〜40℃、好ましくは22〜35℃
が好適である。培養pHは、通常2〜10、好ましくは
3〜9、更に好ましくは3〜7が適当である。
【0016】本発明の培養方法により得られた菌体を用
いPMLAを製造する場合、上記のように培養して得ら
れた培養物から菌体を集め、水や適当な緩衝液で洗浄し
たのち、そのまま使用することができる。あるいは該菌
体をそれ自体既知の方法で固定化し、固定化物として使
用することができる。微生物菌体の固定化法としては、
例えば、アクリルアミド等の重合体モノマーを用いる方
法、アルギン酸塩やカラギーナン等の適当な担体を用い
て不溶化させる方法等が挙げられる。
いPMLAを製造する場合、上記のように培養して得ら
れた培養物から菌体を集め、水や適当な緩衝液で洗浄し
たのち、そのまま使用することができる。あるいは該菌
体をそれ自体既知の方法で固定化し、固定化物として使
用することができる。微生物菌体の固定化法としては、
例えば、アクリルアミド等の重合体モノマーを用いる方
法、アルギン酸塩やカラギーナン等の適当な担体を用い
て不溶化させる方法等が挙げられる。
【0017】かくして得られる菌体又はその固定化物
を、少なくとも糖質原料及び鉄イオンを含有し菌体増殖
必須成分の少なくとも一つの成分を含有しない水溶液
(以下これを「水性反応液」と略称することがある)に
作用させることにより、該水溶液中にL−リンゴ酸重合
物を生成蓄積せしめることができる。該水性反応液は、
糖質原料及び鉄イオンを含有し、菌体増殖必須成分であ
る窒素源、リン酸、ビタミン等のうち少なくとも一つの
成分が欠如し、実質的に菌体が増殖し得ない水溶液であ
れば特に制限はなく、通常、糖質原料及び鉄イオンを含
有する水又はリン酸若しくはトリス塩酸等の緩衝液であ
ることができる。
を、少なくとも糖質原料及び鉄イオンを含有し菌体増殖
必須成分の少なくとも一つの成分を含有しない水溶液
(以下これを「水性反応液」と略称することがある)に
作用させることにより、該水溶液中にL−リンゴ酸重合
物を生成蓄積せしめることができる。該水性反応液は、
糖質原料及び鉄イオンを含有し、菌体増殖必須成分であ
る窒素源、リン酸、ビタミン等のうち少なくとも一つの
成分が欠如し、実質的に菌体が増殖し得ない水溶液であ
れば特に制限はなく、通常、糖質原料及び鉄イオンを含
有する水又はリン酸若しくはトリス塩酸等の緩衝液であ
ることができる。
【0018】水性反応液中に添加される糖質原料として
は、本発明に使用する微生物が資化するものであれば特
に制限されるものではなく、例えば、グルコース、フル
クトース、シュークロース、マルトース等を挙げること
ができ、それらの中でもグルコースが好適に用いられ
る。その添加濃度は、特に制限はないが、一般には0.
1〜30重量%、好ましくは0.2〜15重量%の範囲
内が適当である。
は、本発明に使用する微生物が資化するものであれば特
に制限されるものではなく、例えば、グルコース、フル
クトース、シュークロース、マルトース等を挙げること
ができ、それらの中でもグルコースが好適に用いられ
る。その添加濃度は、特に制限はないが、一般には0.
1〜30重量%、好ましくは0.2〜15重量%の範囲
内が適当である。
【0019】水性反応液中に添加される鉄イオンとして
は、通常使用される無機あるいは有機塩、例えば、硫酸
鉄、塩化鉄、硝酸鉄、クエン酸鉄、シュウ酸鉄、フマル
酸鉄等を用いることができる。その添加濃度は、特に制
限はないが、一般には0.01〜50mM、好ましくは
0.1〜3mMの範囲内が適当である。上記した休止菌
体反応は、一般的に約20〜50℃、好ましくは約25
〜40℃の温度で、通常約10〜170時間行う。ま
た、反応液のpHは、通常2〜10、好ましくは3〜
9、更に好ましくは3〜7が適当である。
は、通常使用される無機あるいは有機塩、例えば、硫酸
鉄、塩化鉄、硝酸鉄、クエン酸鉄、シュウ酸鉄、フマル
酸鉄等を用いることができる。その添加濃度は、特に制
限はないが、一般には0.01〜50mM、好ましくは
0.1〜3mMの範囲内が適当である。上記した休止菌
体反応は、一般的に約20〜50℃、好ましくは約25
〜40℃の温度で、通常約10〜170時間行う。ま
た、反応液のpHは、通常2〜10、好ましくは3〜
9、更に好ましくは3〜7が適当である。
【0020】以上に述べた休止菌体法により反応液中に
生成蓄積されたPMLAの反応液からの採取は、それ自
体既知の通常用いられる分離・精製法に従い、例えば、
アセトン、メタノール、エタノール、n−プロパノール
またはメチルエチルケトン等の有機溶媒沈澱法、イオン
交換樹脂処理法、沈澱法等を適宜組み合わせて行うこと
ができる。
生成蓄積されたPMLAの反応液からの採取は、それ自
体既知の通常用いられる分離・精製法に従い、例えば、
アセトン、メタノール、エタノール、n−プロパノール
またはメチルエチルケトン等の有機溶媒沈澱法、イオン
交換樹脂処理法、沈澱法等を適宜組み合わせて行うこと
ができる。
【0021】以上に述べた方法で製造されるPMLAの
物理学的性質は、以下の通りである。 (1)GPC法により測定した分子量は、約2,000
〜50,000の範囲内である。 (2)1N硫酸溶液による加水分解処理により、L−リ
ンゴ酸のみが生成する。
物理学的性質は、以下の通りである。 (1)GPC法により測定した分子量は、約2,000
〜50,000の範囲内である。 (2)1N硫酸溶液による加水分解処理により、L−リ
ンゴ酸のみが生成する。
【0022】
【発明の効果】本発明によれば、従来の培養法に比べ高
生産性のPMLA産生菌体を得ることができ、高収量で
PMLAを得ることができる。
生産性のPMLA産生菌体を得ることができ、高収量で
PMLAを得ることができる。
【0023】
【実施例】次に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に
説明する。しかしながら、下記の実施例は、本発明につ
いて具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであ
り、これによって本発明はなんら限定されるものではな
い。
説明する。しかしながら、下記の実施例は、本発明につ
いて具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであ
り、これによって本発明はなんら限定されるものではな
い。
【0024】実施例1 第1表に示す各濃度のマグネシウムイオンを添加(Mg
SO4 ・7H2 O添加)した培地(グルコース 8%、
NH4 Cl 0.2%、KH2 PO4 0.05%、Z
nSO4 ・7H2 O 5ppm、K2 CO3 0.04
%及び酵母エキス 0.02%を含む水溶液)50ml
を500ml容三角フラスコに分注し、滅菌(121
℃、15分間)した。培養は、該培地に乾熱滅菌した炭
酸カルシウム1gを添加後、オウレオバセディウムs
p.A−91(FERM P−11966)を植菌し、
25℃にて3日間振とう培養を行い、これを前培養物と
した。本培養は、上記培地200mlを1000ml容
三角フラスコに分注、滅菌(121℃、15分間)した
後、乾熱滅菌した炭酸カルシウム6gを添加後、前培養
物の5mlを添加して25℃にて3日間振とう培養を行
った。培養終了後、培養物の580nm における吸光度を測
定し菌体量とした。その結果を第1表に示す。
SO4 ・7H2 O添加)した培地(グルコース 8%、
NH4 Cl 0.2%、KH2 PO4 0.05%、Z
nSO4 ・7H2 O 5ppm、K2 CO3 0.04
%及び酵母エキス 0.02%を含む水溶液)50ml
を500ml容三角フラスコに分注し、滅菌(121
℃、15分間)した。培養は、該培地に乾熱滅菌した炭
酸カルシウム1gを添加後、オウレオバセディウムs
p.A−91(FERM P−11966)を植菌し、
25℃にて3日間振とう培養を行い、これを前培養物と
した。本培養は、上記培地200mlを1000ml容
三角フラスコに分注、滅菌(121℃、15分間)した
後、乾熱滅菌した炭酸カルシウム6gを添加後、前培養
物の5mlを添加して25℃にて3日間振とう培養を行
った。培養終了後、培養物の580nm における吸光度を測
定し菌体量とした。その結果を第1表に示す。
【0025】
【表1】 第1表 マグネシウムイオン濃度 菌体量 (mM) (580nm における吸光度) 0.1 3 5 25 15 24 30 24
【0026】上記培養物を遠心分離(8, 000rpm 、
15分間、室温)し菌体を集め、得られた菌体を、洗浄
液(100mMリン酸緩衝液、pH7.0)にて1度洗
浄した。洗浄菌体を、反応液(グルコース 8%、硫酸
第一鉄 0.5mM、100mMリン酸緩衝液)に懸濁
後、菌体濃度を調整(580nm における吸光度=30)
し、その懸濁液10mlを、炭酸カルシウム0.3gと
ともに50ml容三角フラスコに分注して、30℃にて
24時間反応させた。
15分間、室温)し菌体を集め、得られた菌体を、洗浄
液(100mMリン酸緩衝液、pH7.0)にて1度洗
浄した。洗浄菌体を、反応液(グルコース 8%、硫酸
第一鉄 0.5mM、100mMリン酸緩衝液)に懸濁
後、菌体濃度を調整(580nm における吸光度=30)
し、その懸濁液10mlを、炭酸カルシウム0.3gと
ともに50ml容三角フラスコに分注して、30℃にて
24時間反応させた。
【0027】反応終了後、該反応物から遠心分離(8,
000rpm 、15分間、室温)により除菌した上清1m
lに2N H2 SO4 を1mlを添加し、該液を100
℃で5時間加水分解処理を行った。PMLAの生成量
は、該処理物を高速液体クロマトグラフィー(島津製L
C−5A型)により有機酸の分析を行い〔カラム:HP
X−87H(BIO−RAD)、カラム温度:60℃、
移動相:0.01M H 2 SO4 、流速:0.7ml/
分、検出器:UV(210nm)〕リンゴ酸量として定
量を行った。
000rpm 、15分間、室温)により除菌した上清1m
lに2N H2 SO4 を1mlを添加し、該液を100
℃で5時間加水分解処理を行った。PMLAの生成量
は、該処理物を高速液体クロマトグラフィー(島津製L
C−5A型)により有機酸の分析を行い〔カラム:HP
X−87H(BIO−RAD)、カラム温度:60℃、
移動相:0.01M H 2 SO4 、流速:0.7ml/
分、検出器:UV(210nm)〕リンゴ酸量として定
量を行った。
【0028】その結果を第2表に示した。尚、加水分解
処理前の反応液上清中の遊離のリンゴ酸を同様に高速液
体クロマトグラフィーにより分析した結果、リンゴ酸に
相当するピークは検出されなかった。これより加水分解
により生成するリンゴ酸はすべてPMLA由来であるこ
とが確認された。
処理前の反応液上清中の遊離のリンゴ酸を同様に高速液
体クロマトグラフィーにより分析した結果、リンゴ酸に
相当するピークは検出されなかった。これより加水分解
により生成するリンゴ酸はすべてPMLA由来であるこ
とが確認された。
【0029】
【表2】 第2表 マグネシウムイオン濃度 PMLA量 (mM) (mg/ml) 0.1 4.8 5 8.3 15 8.2 30 8.3
【0030】実施例2 第3表に示す各有機窒素源1%を添加した培地(グルコ
ース 8%、NH4 Cl 0.2%、KH2 PO4
0.05%、MgSO4 ・7H2 O 0.1%、ZnS
O4 ・7H2 O 5ppm及びK2 CO3 0.04%
を含む水溶液)50mlを500ml容三角フラスコに
分注し、滅菌(121℃、15分間)した。培養は、該
培地に乾熱滅菌した炭酸カルシウム1gを添加後、オウ
レオバセディウムsp.A−91(FERM P−11
966)を植菌し、25℃にて3日間振とう培養を行
い、これを前培養物とした。本培養は、上記培地100
mlを1000ml容三角フラスコに分注、滅菌(12
1℃、15分間)した後、乾熱滅菌した炭酸カルシウム
3gを添加後、前培養物の20mlを添加して25℃に
て3日間振とう培養を行った。培養終了後、培養物の58
0nm における吸光度を測定し菌体量とした。その結果を
第3表に示す。
ース 8%、NH4 Cl 0.2%、KH2 PO4
0.05%、MgSO4 ・7H2 O 0.1%、ZnS
O4 ・7H2 O 5ppm及びK2 CO3 0.04%
を含む水溶液)50mlを500ml容三角フラスコに
分注し、滅菌(121℃、15分間)した。培養は、該
培地に乾熱滅菌した炭酸カルシウム1gを添加後、オウ
レオバセディウムsp.A−91(FERM P−11
966)を植菌し、25℃にて3日間振とう培養を行
い、これを前培養物とした。本培養は、上記培地100
mlを1000ml容三角フラスコに分注、滅菌(12
1℃、15分間)した後、乾熱滅菌した炭酸カルシウム
3gを添加後、前培養物の20mlを添加して25℃に
て3日間振とう培養を行った。培養終了後、培養物の58
0nm における吸光度を測定し菌体量とした。その結果を
第3表に示す。
【0031】
【表3】 第3表 有機窒素源 菌体量 (各1%) (580nm における吸光度) 酵母エキス 20 カザミノ酸 8 コーンスティープリカー 23 ペプトン 28
【0032】上記培養物を遠心分離(8, 000rpm 、
15分間、室温)し菌体を集め、得られた菌体を、洗浄
液(100mMリン酸緩衝液、pH7.0)にて1度洗
浄した。洗浄菌体を、反応液(グルコース 8%、硫酸
第一鉄 0.5mM、100mMリン酸緩衝液)に懸濁
後、菌体濃度を調整(580nm における吸光度=30)
し、その懸濁液50mlを、炭酸カルシウム1.5gと
ともに300ml容三角フラスコに分注して、30℃に
て3日間反応させた。反応終了後、該反応物を実施例1
と同様に加水分解処理を行い、生成PMLA量をリンゴ
酸量として定量を行った。結果は第4表に示した。
15分間、室温)し菌体を集め、得られた菌体を、洗浄
液(100mMリン酸緩衝液、pH7.0)にて1度洗
浄した。洗浄菌体を、反応液(グルコース 8%、硫酸
第一鉄 0.5mM、100mMリン酸緩衝液)に懸濁
後、菌体濃度を調整(580nm における吸光度=30)
し、その懸濁液50mlを、炭酸カルシウム1.5gと
ともに300ml容三角フラスコに分注して、30℃に
て3日間反応させた。反応終了後、該反応物を実施例1
と同様に加水分解処理を行い、生成PMLA量をリンゴ
酸量として定量を行った。結果は第4表に示した。
【0033】
【表4】 第4表 有機窒素源 PMLA量 (各1%) (mg/ml) 酵母エキス 14 カザミノ酸 8 コーンスティープリカー 28 ペプトン 32
【0034】実施例3 第5表に示す各濃度のペプトンを添加した培地(グルコ
ース 8%、NH4 Cl 0.2%、KH2 PO4
0.05%、MgSO4 ・7H2 O 0.1%、ZnS
O4 ・7H2 O 5ppm及びK2 CO3 0.04%
を含む水溶液)50mlを500ml容三角フラスコに
分注し、滅菌(121℃、15分間)した。培養は、該
培地に乾熱滅菌した炭酸カルシウム1gを添加後、オウ
レオバセディウムsp.A−91(FERM P−11
966)を植菌し、25℃にて3日間振とう培養を行
い、これを前培養物とした。本培養は、上記培地100
mlを1000ml容三角フラスコに分注、滅菌(12
1℃、15分間)した後、乾熱滅菌した炭酸カルシウム
3gを添加後、前培養物の20mlを添加して25℃に
て3日間振とう培養を行った。培養終了後、培養物の58
0nm における吸光度を測定し菌体量とした。その結果を
第3表に示す。
ース 8%、NH4 Cl 0.2%、KH2 PO4
0.05%、MgSO4 ・7H2 O 0.1%、ZnS
O4 ・7H2 O 5ppm及びK2 CO3 0.04%
を含む水溶液)50mlを500ml容三角フラスコに
分注し、滅菌(121℃、15分間)した。培養は、該
培地に乾熱滅菌した炭酸カルシウム1gを添加後、オウ
レオバセディウムsp.A−91(FERM P−11
966)を植菌し、25℃にて3日間振とう培養を行
い、これを前培養物とした。本培養は、上記培地100
mlを1000ml容三角フラスコに分注、滅菌(12
1℃、15分間)した後、乾熱滅菌した炭酸カルシウム
3gを添加後、前培養物の20mlを添加して25℃に
て3日間振とう培養を行った。培養終了後、培養物の58
0nm における吸光度を測定し菌体量とした。その結果を
第3表に示す。
【0035】
【表5】 第5表 ペプトン濃度 菌体量 (%) (580nm における吸光度) 0.1 10 0.5 18 1.0 32 2.0 35 5.0 37
【0036】上記培養物を遠心分離(8, 000rpm 、
15分間、室温)し菌体を集め、得られた菌体を、洗浄
液(100mMリン酸緩衝液、pH7.0)にて1度洗
浄した。洗浄菌体を、反応液(グルコース 8%、硫酸
第一鉄 0.5mM、100mMリン酸緩衝液)に懸濁
し、菌体濃度を調整(580nm における吸光度=30)後
50mlとし、炭酸カルシウム1.5gとともに300
ml容三角フラスコに分注して、30℃にて24時間反
応させた。反応終了後、該反応物を実施例1と同様に加
水分解処理を行い、生成PMLA量をリンゴ酸量として
定量を行った。その結果を第6表に示す。
15分間、室温)し菌体を集め、得られた菌体を、洗浄
液(100mMリン酸緩衝液、pH7.0)にて1度洗
浄した。洗浄菌体を、反応液(グルコース 8%、硫酸
第一鉄 0.5mM、100mMリン酸緩衝液)に懸濁
し、菌体濃度を調整(580nm における吸光度=30)後
50mlとし、炭酸カルシウム1.5gとともに300
ml容三角フラスコに分注して、30℃にて24時間反
応させた。反応終了後、該反応物を実施例1と同様に加
水分解処理を行い、生成PMLA量をリンゴ酸量として
定量を行った。その結果を第6表に示す。
【0037】
【表6】 第6表 ペプトン濃度 PMLA量 (%) (mg/ml) 0.2 10 0.5 11 1.0 11 2.0 8 5.0 1
【0038】実施例4 培地(グルコース 8%、NH4 Cl 0.2%、ペプ
トン 1%、KH2 PO4 0.05%、MgSO4 ・
7H2 O 0.1%、ZnSO4 ・7H2 O5ppm及
びK2 CO3 0.04%を含む水溶液)50mlを5
00ml容三角フラスコに分注し、滅菌(121℃、1
5分間)した。培養は、該培地に乾熱滅菌した炭酸カル
シウム1gを添加後、オウレオバセディウムsp.A−
91(FERM P−11966)を植菌し、25℃に
て3日間振とう培養を行い、これを前培養物とした。本
培養は、上記培地100mlを1000ml容三角フラ
スコに分注、滅菌(121℃、15分間)した後、乾熱
滅菌した炭酸カルシウム3gを添加後、前培養物の20
mlを添加して25℃にて3日間振とう培養を行った。
トン 1%、KH2 PO4 0.05%、MgSO4 ・
7H2 O 0.1%、ZnSO4 ・7H2 O5ppm及
びK2 CO3 0.04%を含む水溶液)50mlを5
00ml容三角フラスコに分注し、滅菌(121℃、1
5分間)した。培養は、該培地に乾熱滅菌した炭酸カル
シウム1gを添加後、オウレオバセディウムsp.A−
91(FERM P−11966)を植菌し、25℃に
て3日間振とう培養を行い、これを前培養物とした。本
培養は、上記培地100mlを1000ml容三角フラ
スコに分注、滅菌(121℃、15分間)した後、乾熱
滅菌した炭酸カルシウム3gを添加後、前培養物の20
mlを添加して25℃にて3日間振とう培養を行った。
【0039】培養終了後、培養物を遠心分離(8, 00
0rpm 、15分間、室温)し、菌体を集めた。得られた
菌体を、洗浄液(100mMリン酸緩衝液、pH7.
0)にて1度洗浄した。上記洗浄菌体を、反応液(グル
コース 15%、硫酸第一鉄 0.3mM、100mM
リン酸緩衝液)に懸濁後、菌体濃度を調整(580nm にお
ける吸光度=30)し、その懸濁液50mlを、炭酸カ
ルシウム1.5gとともに300ml容三角フラスコに
分注して、30℃にて7日間及び12日間反応させた。
尚、反応5日目にグルコース濃度が15%となるよう
に、更にグルコースを追加した。反応終了後、該反応物
を実施例1と同様に加水分解処理を行い、生成PMLA
量をリンゴ酸量として定量を行った。その結果を第7表
に示す。
0rpm 、15分間、室温)し、菌体を集めた。得られた
菌体を、洗浄液(100mMリン酸緩衝液、pH7.
0)にて1度洗浄した。上記洗浄菌体を、反応液(グル
コース 15%、硫酸第一鉄 0.3mM、100mM
リン酸緩衝液)に懸濁後、菌体濃度を調整(580nm にお
ける吸光度=30)し、その懸濁液50mlを、炭酸カ
ルシウム1.5gとともに300ml容三角フラスコに
分注して、30℃にて7日間及び12日間反応させた。
尚、反応5日目にグルコース濃度が15%となるよう
に、更にグルコースを追加した。反応終了後、該反応物
を実施例1と同様に加水分解処理を行い、生成PMLA
量をリンゴ酸量として定量を行った。その結果を第7表
に示す。
【0040】
【表7】 第7表 反応時間 PMLA量 (日) (mg/ml) 7 68 12 86
Claims (2)
- 【請求項1】 オウレオバセディウム属に属するL−リ
ンゴ酸重合物産生微生物を培養するにあたり、0.1〜
2重量%の有機窒素源及び0.2〜30mMのマグネシ
ウムイオンを添加した培地で培養することを特徴とする
L−リンゴ酸重合物産生微生物の培養法。 - 【請求項2】 オウレオバセディウム属に属するL−リ
ンゴ酸重合物産生微生物が、オウレオバセディウムs
p. A−91株である請求項1記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6102708A JPH07308188A (ja) | 1994-05-17 | 1994-05-17 | L−リンゴ酸重合物産生微生物の培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6102708A JPH07308188A (ja) | 1994-05-17 | 1994-05-17 | L−リンゴ酸重合物産生微生物の培養法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07308188A true JPH07308188A (ja) | 1995-11-28 |
Family
ID=14334775
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6102708A Pending JPH07308188A (ja) | 1994-05-17 | 1994-05-17 | L−リンゴ酸重合物産生微生物の培養法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH07308188A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108841879A (zh) * | 2018-07-11 | 2018-11-20 | 天津慧智百川生物工程有限公司 | 一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法 |
CN109280678A (zh) * | 2018-10-11 | 2019-01-29 | 天津科技大学 | 一种添加硝酸钠提高β-聚苹果酸产量的制备方法 |
-
1994
- 1994-05-17 JP JP6102708A patent/JPH07308188A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108841879A (zh) * | 2018-07-11 | 2018-11-20 | 天津慧智百川生物工程有限公司 | 一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法 |
CN109280678A (zh) * | 2018-10-11 | 2019-01-29 | 天津科技大学 | 一种添加硝酸钠提高β-聚苹果酸产量的制备方法 |
CN109280678B (zh) * | 2018-10-11 | 2021-10-08 | 天津科技大学 | 一种添加硝酸钠提高β-聚苹果酸产量的制备方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5200332A (en) | Process for preparation of copolymer | |
JPS6137919B2 (ja) | ||
JPS6023838B2 (ja) | 微生物の全細胞におけるスクロ−ス・ムタ−ゼの固定化方法 | |
JPH03180186A (ja) | 共重合体およびその製造法 | |
JP3740358B2 (ja) | 側鎖にエポキシ基を含むポリエステルの製造方法及び架橋ポリマーの製造方法 | |
JPH07308188A (ja) | L−リンゴ酸重合物産生微生物の培養法 | |
JPH07284395A (ja) | L−リンゴ酸重合物の製造法 | |
JP2654825B2 (ja) | 新規環状イヌロオリゴ糖およびその製造法 | |
JPH01304891A (ja) | ポリエステル共重合体の製造方法 | |
JPH01222788A (ja) | ポリエステル共重合体の製造方法 | |
JP3915505B2 (ja) | ε−ポリ−L−リジンの製造法 | |
JP2971158B2 (ja) | 微生物によるl−リンゴ酸重合物の製造法 | |
JP2971196B2 (ja) | 酵素法によるl−リンゴ酸重合物の製造法 | |
JPH01174397A (ja) | ポリグルタミン酸の製造法 | |
JPH02234683A (ja) | ポリエステル共重合体の製造方法 | |
JPH06181784A (ja) | ポリエステル共重合体の製造方法 | |
JPH04341190A (ja) | 酵素法によるl−リンゴ酸重合物の製造法 | |
JPH03247293A (ja) | 吸水性高分子量物質の製造法 | |
JP3521493B2 (ja) | 微生物によるナフトールの製造法 | |
JP2519980B2 (ja) | (s)−2−ヒドロキシ−4−フェニル−3−ブテン酸の製造方法 | |
JP2670130B2 (ja) | ロドコッカス属細菌の培養方法及び該微生物を用いた2―ケト酪酸の製造方法 | |
JPH05260984A (ja) | 3−ヒドロキシ酪酸および/またはその3量体の製造方法 | |
JPS6342692A (ja) | L−イソロイシンの製造法 | |
JPH0484890A (ja) | 共重合体の製造法 | |
JPS60120983A (ja) | ブレビバクテリウム属に属する菌体の培養法 |