JPH07300425A - 病原菌付着阻止剤及びそれを含有する飲食品等 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ラクトフェリンまたはそのプロテアーゼ分解
物を有効成分とする病原菌付着阻止剤。上記有効成分を
含有する飲食品、飼料、医薬、化粧品。 【効果】 ラクトフェリンまたはそのプロテアーゼ分解
物の歯、皮膚、腸管等の組織への病原菌付着阻止作用に
より、病原菌の感染を有効に防御することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、病原菌、特に病原性大
腸菌、う蝕原菌により引き起こされる感染症を予防する
ために利用される病原菌付着阻止剤に関する。さらに、
本発明は、このような病原菌付着防止作用をもつ飲食
品、飼料、医薬品、化粧品等に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に病原菌は体内への進入、標的細胞
への付着、増殖という過程をもって、感染症を引き起こ
す。これに対して、現在用いられている治療法は、主に
抗生物質を投与することによるものである。これは、付
着、増殖した病原菌を死滅させることにより病原を根滅
しようというもので、病原菌の感染過程の最終段階に作
用するものである。この抗生物質による感染治療は発病
後の生体に対する治療法としては非常に有効であるが、
抗生物質の性格上、様々な副作用あるいはアレルギー症
状を引き起こすなど問題点も多い。

【０００３】一方、生体は、これら病原菌の感染に対し
て、その感染初期の段階において、防御機構を備えてい
る。消化管内においては分泌型IgA を主とする免疫グロ
ブリンによる防御機構がそれであり、これらの免疫グロ
ブリンは病原菌の感染の初期段階、すなわち、病原菌の
標的細胞への付着を阻止することにより、生体を感染か
ら守る。ところで、一般に病原菌は標的細胞に付着する
際、その標的細胞上の特定の構造を受容体として認識す
ることが知られている。このことは、これら受容体また
は受容体と類似した構造をもつもので、病原菌と結合能
をもつものは、病原菌の菌体表面の受容体結合部位に特
異的に結合し、病原菌の標的細胞上の受容体への結合を
特異的に阻害するものと考えられる。この作用は、病原
菌の感染を、その初期段階で阻止するという意味で上述
の免疫グロブリンによる生体防御機構に類似している。
すなわち、この様な病原菌と特異的に結合し、かつ標的
細胞への病原菌の付着を阻止し得る物質は、おだやかな
作用で副作用の少ない病原菌付着阻止剤となり得ること
が考えられる。

【０００４】この様な物質として、κ−カゼインおよび
／またはそのプロテアーゼ分解物であるκ−カゼイング
リコマクロペプチド（以下、GMP という) があり、特開
昭63-284133 号公報には、病原菌やウィルスによって引
き起こされる感染を防御するのに有効である旨が開示さ
れている。また、特開昭63-233911 号公報には、GMPが
抗歯垢および抗う歯剤として有効であることが開示され
ている。

【０００５】一方、乳中の感染防御機能蛋白質としてラ
クトフェリン（以下、Lfという) がある。Lfの作用は、
その鉄キレート力にあり、病原菌がその増殖に必要な鉄
をLfが奪い取るために増殖が抑制されるといわれてい
る。しかしながら、一般にLfによる病原菌増殖抑制効果
は、一時的なものであり数時間後には、再び菌が増殖し
はじめるため、感染の予防および治療剤としての効力に
は不充分であると考えられていた。また、Lfが種々な細
菌に結合することは古くから知られており、Lfが菌に結
合することによって細菌の物質輸送サイトや生合成をブ
ロックし、所謂鉄の存在と密接に関係している静菌効果
とは全く別の機能によって細菌を死滅させると考えられ
ている。しかし、Lfが菌に結合したからといって抗菌効
果を示すとは限らず、例えば、Bordetella pertussisは
Lfと結合し鉄を菌体内に取り込むことによって増殖が可
能になると報告されている（ジャーナル オブ ジェネ
ラルマイクロバイオロジー(J. Gen, Microbiol.) 133:8
91-898, 1987) 。

【０００６】このように、Lfの感染防御効果について
は、in vitroの実験結果では静菌効果や抗菌効果が示さ
れてはいるものの単純ではない。一方、in vivo におい
ては、ラクトパーオキシダーゼと共に添加されたLfは動
物の生存率を延長する可能性が示唆されている (特開昭
61-83131号公報) もののLfがin vivo で感染防御効果を
持つかどうかは不明である。さらに又、病原性大腸菌を
マウスに投与する24時間前にLfを静脈から注射するとマ
ウスの生存率が著しく高まることが報告されているが
（J. EXP. Path. 70:697-704) 、Lfがマウスの免疫系を
刺激し間接的に効果を発揮したと考えられている。この
ように、Lfの感染防御効果がin vivo の系で確認された
ことはこれまで無かった。そこで、本発明者らはLfの薬
理作用について研究していたところ、Lfは上述した鉄キ
レート力に由来する静菌作用あるいは菌に結合すること
によって菌を死滅させる抗菌作用とは全く別のメカニズ
ムによって、病原菌の歯、皮膚あるいは腸管細胞への付
着を阻止することを発見した。Lfがビフィダス菌や乳酸
菌のような有用菌の腸管内への定着を促進することはす
でに開示されているが（特開平1-221319号公報）、本発
明はそれとは逆にLfが病原性細菌の腸管への付着を阻止
する。本発明は、このようなLfが病原性細菌の腸管への
付着阻止作用を見出し、本発明をなすに至った。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、病原菌、特
に病原性大腸菌、う蝕原菌に起因する感染症の防御効果
を有し、しかも安全性の点でも何ら問題のない新規な病
原菌付着阻止剤を提供することを課題とする。さらに、
本発明はこのような病原菌付着阻止作用をもつ飲食品、
飼料、医薬および化粧品等を提供することを課題とす
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明はLfま
たはそのプロテアーゼ分解物を有効成分とする病原菌付
着阻止剤に関する。特に、病原菌が皮膚および口から大
腸に至る消化器官において感染する場合に病原菌の付着
を有効に阻止する病原菌付着阻止剤に関する。また、こ
の様な有効成分を含有せしめた食品、飼料、医薬品、化
粧品等に関する。

【０００９】本発明で用いるLfは、牛、羊、山羊および
ヒトの乳等の分泌液から単離して得られたものであり、
また遺伝子組換技術などによって生産されたものであっ
てもよい。Lfの単離法としては、すでにいくつかの技術
が開示されており、例えば、特開昭61-145000 号公報、
特開昭61-246198 号公報、特開昭62-19523号公報、特開
昭63-152400 号公報、特開昭63-255300 号公報、特開昭
64-86839号公報などがある。工業的な実用性を考慮すれ
ば、硫酸エステル化した多糖類担体を利用する方法 (特
開昭63-255300 号公報) が最も好ましい。なお、Lfには
鉄をキレートする機能があり、乳等の分泌液より単離さ
れたLfの一部は鉄と結合したものが含まれている。しか
し、本発明による病原菌付着阻止効果は、鉄の結合状態
には依存しないので、鉄の結合した形態であっても結合
していない形態であってもそのいずれでもよい。Lfをプ
ロテアーゼ処理する場合、特に制限はないが極端に低分
子化しない程度の限定分解を行なうべきである。低分子
化すると効果が弱くなる。ここで用いるプロテアーゼは
特に制限はなく、トリプシン、キモトリプシン、パパイ
ン、ペプシン、酸性プロテアーゼ、パンクレアチン、微
生物起源プロテアーゼ、サーモリシン、アルカラーゼ、
プロナーゼなどを例示することができる。分解条件は酵
素の種類、Lfの濃度、pH、温度などによって変わるが、
例えばトリプシンではLf１％となるように水に溶解し、
0.01％のトリプシンを加え、10分〜数時間分解すればよ
い。トリプシンインヒビターで酵素活性を止めてもよい
が、加熱して失活させてもよい。Lfのイオン強度さえ低
ければ加熱しても沈澱しない (特開平2-108629号公報)
。そして、本発明ではLfまたはそのプロテアーゼ分解
物を単独で用いてもよいし、また両者を併用してもよ
い。

【００１０】このようにして得られたLfまたはその分解
物は、経口的に投与する場合、標準的な服用量は成人一
日一人当り６〜300mg を一応の目安とすることができ
る。また外用的に投与する場合、この程度乃至その数倍
量を使用することができる。さらに、食品や飼料中に混
合したり、あるいは医薬品や化粧品組成物として用いる
ことも可能である。これらLfは、天然物であり、乳の一
成分として古来より飲用されてきたものであるだけに、
安全性に何ら問題はない。

【００１１】次に本発明の病原菌付着阻止効果について
試験例をあげて説明する。 ＜試験例＞ １．病原性大腸菌のヒト小腸細胞（JTC-17) への付着に
対する阻止効果。ヒト小腸細胞JTC-17（東京医科大学よ
り分譲を受けた）を、５％牛胎児血清を含むダルベッコ
変法イーグル培地（５％FCS/DMEM) にて25cm² の底面積
をもつ培養フラスコに３７℃、ＣＯ₂ 濃度５％で培養す
る。細胞がフラスコの底面一面に増殖したら、培養をや
め常法どうりトリプシン（200U/ml)含有、リン酸緩衝生
理食塩水(PBS)1mlにて細胞をはがし取り、1000rpm で５
分間遠心分離することで細胞を集めた。上清を吸い出
し、新たに５％FCS/DMEM 8mlに細胞を懸濁した。この細
胞懸濁液各１mlを10mlポリスチレンチューブ (ファルコ
ン社2095) に入れ37℃３日間培養した。

【００１２】病原性大腸菌H10407株、Pb176 株 (都立衛
生研より分譲を受けた) をそれぞれ１白金耳取り、普通
ブイヨン培地４mlに37℃で一夜培養した。培養後、3000
rpm10分間遠心分離することにより集菌し、これをpH８
に調整したPBS で３回洗浄した。その後、大腸菌をpH８
に調整したPBS １mlに懸濁し、フルオレッセインイソチ
オシアネート(FITC) (シグマ社）１mgを加えよく溶解し
４℃で３時間ゆっくり撹拌しながら反応させ、大腸菌を
FITCにてラベルした。ラベルを終えた大腸菌は、3000rp
m 10分間の遠心分離にて集菌し、PBS にて３回洗浄した
後、３mlのPBSに懸濁した。この様にして調製した、FIT
Cでラベルした大腸菌懸濁液 400μl に、目的のサンプ
ルPBS 溶液 200μl を混合し、37℃で１時間インキュベ
ートした。

【００１３】一方、３日間の培養を終えたJTC17 細胞を
1000rpm で５分間遠心分離し上清の培地を除き、さらに
PBS で３回洗浄し、これに上述の大腸菌とサンプルとを
混合し、インキュベートした溶液各 600μl を加え37℃
で30分間インキュベートした。インキュベート終了後、
750rpm５分間遠心分離し、細胞だけを沈澱させ、細胞に
付着せず上清に残った大腸菌を吸い出した。さらに、PB
S にて細胞を２回洗浄した。PBS で洗浄した細胞に200U
トリプシン/PBS 900μl を加え、激しく撹拌した。これ
に0.1 ％SDS100μl, 1mlの脱イオン水を加え激しく撹拌
し、30分間静置することにより細胞を溶解した。この溶
液を蛍光分光光度計 (日立フルオレッセンススペクトロ
メーターF-3000) にて励起波長490nm 、蛍光波長520nm
で相対蛍光強度を測定し、蛍光ラベルした大腸菌のJTC1
7 細胞への付着を評価した。表１には、サンプルを添加
しない時（ブランク）の相対蛍光強度を付着率100 ％、
蛍光ラベルした大腸菌のポリスチレンチューブへの非特
異的な吸着 (ポリスチレンチューブ内に検体と同じ濃度
の蛍光ラベルした大腸菌を入れ、検体と同じ条件で測定
した相対蛍光強度) を付着率０％とし、各サンプルを添
加した際の付着率を示している。実験は、すべて３連で
行った。

【００１４】

【表１】

【００１５】なお、表中の記号は次のことを示す（表２
及び表３でも同様である。） bLf:ウシラクトフェリン、hLf:ヒトラクトフェリン、gL
f:ヤギラクトフェリン、wLf:水牛ラクトフェリン、bGM
P: ウシグリコマクロペプチド。いずれの試料でも病原
性大腸菌のヒト小腸細胞(JTC-17)への付着は阻止される
が、特にbLf はその効果が優れており、プロテアーゼ処
理したbLf においても付着阻止効果を示した。特にトリ
プシン処理したものは未処理と殆ど変わらない効果を示
した。

【００１６】２．う歯原菌のポリスチレンチューブへの
付着に対する阻止効果 ３種のストレプトコッカス・ミュータンス（ATCC-2760
7、25175 、27351)を１白金耳取り、ブレインハートイ
ンフュージョン（BHI)培地4ml で、一夜培養した。一夜
後、3000rpm 10分間遠心することにより集菌し、上清の
培地を吸い出す。さらに、これをPBS で３回洗浄し、こ
れをＯＤ₆₅₀ ＝0.8 となるようにPBS に懸濁した。この
菌懸濁液とサンプル溶液を当量混合し、10mlのポリスチ
レンチューブ（ファルコン社2095) に入れ、よく撹拌
し、37℃３時間インキュベートした。インキュベート終
了後、ＯＤ₆₅₀ を測定し、次式から付着率を求めた。 付着率（％）＝[(0.4 −χ) ÷ 0.4] × 100 χ：サンプルのＯＤ₆₅₀ 実験は、すべて２連で行い、結果を表２に示した。いず
れの試料でもう歯原菌のポリスチレンチューブへの付着
は、阻止されるが、特にLfにおいてはその由来にかかわ
らず高い阻止効果を示した。

【００１７】

【表２】

【００１８】３．４週令の無菌マウスＩＣＲに10mg/ml
のウシラクトフェリンを実験終了時まで飲料水として与
えた。ラクトフェリン投与開始後７日目に病原性大腸菌
H-10407(0-78)またはPb-176(0-6))を4.7 -7.0×10² CF
U/マウスとなるようにゾンデを用いて経口投与した。コ
ントロール群には脱イオン水を与えた。経日的に１群４
〜５匹を屠殺し、腸管各部位（十二指腸、空・回腸、大
腸）を約４cmの長さに切り取り、腸管を開き内容物を生
理的リン酸緩衝液（PBS)10mlで洗浄した。この操作を10
回繰り返した後、濾紙で水分を吸収した。次いで、試料
の重量を測定し、その10倍量のPBS を加え、ホモゲナイ
ズした後に、その0.1ml を普通寒天培地に塗抹して菌数
を測定した。また、別にマウスの糞便を集め、同様にし
て便中の菌数を測定した。

【００１９】なお、ここで用いた病原性大腸菌はヒト由
来の菌であるが、マウスに経口投与することによって下
痢を生じることから、腸管内に定着し、毒素を産生する
と判断された。糞便中の大腸菌数を図１に示す。いずれ
の菌の場合も糞便１ｇ当たりの生菌数は約10¹⁰CFU であ
り、コントロール群と同じであった。この結果より、ラ
クトフェリンはこれら大腸菌の増殖を抑制し得ないこと
が示された。次に、H-10407 株の腸管各部位に対する付
着した菌数を表３に示す。

【００２０】

【表３】

【００２１】対照群と比べ、ラクトフェリン投与群の十
二指腸および空・回腸部において菌数が有意に減少して
いた。大腸においては統計的な有意差は認められなかっ
たが、ラクトフェリン投与群の方が低い菌数を示す傾向
にあった。また、Pb-176株を投与した結果を図２に示
す。腸管のいずれの部位においてもラクトフェリン投与
群の方が低い菌数であった。どちらの菌株の場合も、コ
ントロール群では下痢または軟便が認められたが、ラク
トフェリン群では正常便であった。以上の結果より、ラ
クトフェリンは腸管において病原性大腸菌に対する静菌
あるいは抗菌作用を示さないが、菌の腸管への付着を阻
止することが明らかとなった。

【００２２】４．無菌マウスICR 20匹を５匹ずつ４群に
分け、各群に以下の試料を毎日0.2mlずつ経口投与し
た。 Ａ群 PBS 0.2ml Ｂ群 bLf 1mg/0.2ml PBS Ｃ群 bGMP 1mg/0.2ml PBS

【００２３】なお、各試料は、0.22μm のフィルターで
濾過除菌してから用いた。一方、病原性大腸菌Pb176 株
を普通ブイヨン培地で培養後、集菌し、PBS で３回洗浄
した。各試料投与後１週間目の各マウスに10⁴CFU／0.2m
l の菌液を経口投与し、さらに１週間各試料を投与し続
けた。その後マウスを無菌的に解剖し腸管を摘出した。
この腸管をホモゲナイズし、その１mlを寒天ゲル平板に
接種し菌数を数えた。 Ａ群 4.3×10⁵ CFU Ｂ群 7.0×10³ CFU Ｃ群 3.9×10⁴ CFU このように、Ｂ群では、Ａ群に比べ有意に菌数が低く、
さらに従来公知のＣ群に比べても菌数が低く、病原性大
腸菌の付着が顕著に阻止された。

【００２４】５．ラットを用いたう歯原菌付着阻止効果 ３週齢ウィスターラットに下表のショ糖強化食を与え飼
育した。 全小麦粉 ６ｇ ショ糖 ５６ｇ 脱脂粉乳 ２８ｇ アルファルファの葉の粗粉 ３ｇ 肝全体 １ｇ ビール酵母 ４ｇ 食塩 ２ｇ ラットは５匹ずつ５群に分け、各群には以下の試料を飲
料水として給水ボトルに入れて飼育した。 Ａ群 脱イオン水 Ｂ群 １％ bLf Ｃ群 １％ bκ−カゼイン Ｄ群 １％ bGMP

【００２５】１週間後、S. mutace を口腔内に接種し、
さらに３ケ月間飼育を継続した。その後、歯を顎ごと摘
出し、実体顕微鏡下で虫歯の発生状態を観察し、虫歯の
程度を調べた。全く発生していないもの０点〜歯全体に
広がっているもの10点の範囲で各群の得点を合計した。
結果を表４に示す。

【００２６】

【表４】 これらの結果からみて、従来公知のＤ群に比べてＢ群は
虫歯の発生を同様に有効に予防することができた。

【００２７】６．マウスを用いた皮膚への大腸菌付着阻
止 無菌マウスICR の背中の体毛を約２cmそり落とし、アル
コール綿で消毒した。このマウスを４匹ずつ４群に分け
た。体毛をそった部分の中心に注射針で傷をつけ、各群
のマウスに下記の試料を塗り付けた。 Ａ群 脱イオン水 Ｂ群 １％ bLf Ｃ群 １％ bLfトリプシン分解物 Ｄ群 １％ bGMP 塗り付けた直後に病原性大腸菌 H 10407株を10⁴CFUずつ
塗り付けた。１時間後、PBS にて傷口を洗い１週間その
まま無菌的に飼育した。

【００２８】その後皮膚を１cm² 角に切り取り、ホモゲ
ナイズした。この液１mlを寒天培地を入れたシャーレに
接種し、37℃一夜培養後菌数を測定した。結果を下記に
示す。 Ａ群 1.8×10⁸ CFU Ｂ群 5.2×10⁴ CFU Ｃ群 4.4×10⁵ CFU Ｄ群 2.5×10⁵ CFU Ｂ群及びＣ群は、従来公知のＤ群と同様に付着していた
菌数が有意に少ない結果を示した。

【００２９】次に、本発明を実施例を挙げて説明する。

【実施例１】下記配合のLf配合飲料を製造した。 溶液Ａ Lf 1.2kg 脱イオン水 50kg 溶液Ｂ ショ糖 48g クエン酸 800g クエン酸ナトリウム 800g ビタミンB₂ 1.1g ビタミンB₆ 2.2g ビタミンC 5.5g 葉 酸 0.4g 香 料 100g 1/5濃縮果汁 1kg 水 50kg 溶液ＡとＢを別々にプレート殺菌機にて93℃３分間保持
して殺菌後、冷却（５〜10℃) し、殺菌済タンク中に貯
蔵した。次いでこの混合液を殺菌済紙容器に無菌的に充
填し、大腸菌付着阻止用飲料を製造した。

【００３０】次に溶液Ｃとして下記の配合のものを用い
た。 溶液Ｃ Lfトリプシン１時間分解物 600g Lfペプシン１時間分解物 600g 脱イオン水 50kg 溶液ＣとＢを同様に別々に殺菌し無菌的に両者を混合充
填して、病原菌付着阻止用飲料を製造した。

【００３１】

【実施例２】

【００３２】

【実施例３】 虫歯予防用歯磨配合例（％） リン酸水素カルシウム・２水和物 45.0 グリセリン 10.0 ソルビトール 25.0 Lf 2.0 カルボキシメチルセルロース・ 0.5 ナトリウム カラギーナン 3.0 ビーガム 0.2 サッカリンナトリウム 0.2 ラウリル硫酸ナトリウム 1.2 ビタミンＥ酢酸塩 0.1 香 料 1.0 水 残

【００３３】

【実施例４】 ニキビ予防用ローション配合例（％） クエン酸 0.1 スルホ石灰酸亜鉛 0.2 グリセリン 0.5 ポリオキシエチレン（20モル） 1.0 オレイルアルコールエーテル エチルアルコール 20.0 香料・防腐剤 適量 Lf 1.0 水 残余 本ローションは顔面に１日１〜３回塗布して使用する。

【００３４】

【実施例５】

【００３５】

【実施例６】 上記の配合を行ない、よく混合した後に400mg ずつカプ
セルに入れた。本カプセルは１日１〜３回程度を目安に
投与される。

【００３６】

【実施例７】 医薬用錠剤 Lf100mg、および微結晶セルロース100mg を含む錠剤を
常法に従って調製し、シロップゼラチン沈降性炭酸カル
シウムで糖衣をほどこした。本錠剤は１日１〜３錠を目
安にして投与される。

【００３７】

【発明の効果】本発明のLfまたはLf部分分解物を有効成
分とする病原菌付着阻止剤は、従来病原菌付着阻止効果
があるとして知られているκ−カゼインまたはκ−カゼ
イン分解物と同様にいずれも歯、皮膚および腸管におけ
る病原菌の付着を阻止することができる。また、本発明
の有効成分はその安全性も確認されており、さらに牛乳
より大量に入手し得るのでコストの面からも実用性が高
い。さらに、本発明でLfまたはその部分分解物を飲食
品、飼料、医薬品、化粧品等に添加することによって毒
性のない病原菌付着阻止効果を有する飲食品、飼料、医
薬品、化粧品等を安定的かつ安価に供給することがで
き、虫歯予防、にきび等皮膚炎症、食中毒を未然に防止
することが可能になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】試験例３の無菌マウスに病原性大腸菌(Ph-176
及びH-10407)投与後の日数と糞便中の病原性大腸菌数と
の関係を示す。

【図２】試験例３の病原性大腸菌(Pb-176)の腸管付着防
止に対するウシラクトフェリンの効果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ２３Ｋ 1/16 ３０３ Ｆ 9123−2Ｂ Ａ２３Ｌ 3/3463 Ａ６１Ｋ 7/00 Ｙ Ｋ 7/16 7/28 9/18 38/00

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラクトフェリンまたはそのプロテアーゼ
   分解物を有効成分とする病原菌付着阻止剤
2. 【請求項２】 ラクトフェリンは、牛、水牛、山羊また
   はヒト由来である請求項１に記載の病原菌付着阻止剤。
3. 【請求項３】 請求項１または２のいずれかに記載され
   る有効成分を有効量含有する飲食品。
4. 【請求項４】 請求項１または２のいずれかに記載され
   る有効成分を有効量含有する飼料。
5. 【請求項５】 請求項１または２のいずれかに記載され
   る有効成分を有効量含有する医薬。
6. 【請求項６】 請求項１または２のいずれかに記載され
   る有効成分を有効量含有する化粧品。