JPH07289275A - Ｄ−プロリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 医薬、農薬などの合成原料として用いられる
Ｄ−プロリンを工業的に供給する手段を提供する。 【構成】 エッシェリヒア属に属し、プロリンラセマー
ゼ活性を有する微生物の、菌体、培養液またはそれらの
処理物を水性媒体中でＬ−プロリンと接触させてＤＬ−
プロリンを生成させ、ついで該水性媒体中に生成したＤ
Ｌ−プロリンとＬ−プロリン分解活性を有する微生物の
菌体、培養液またはそれらの処理物とを接触させて、該
水性媒体中のＬ−プロリンを分解し、該水性媒体から残
存するＤ−プロリンを採取することを特徴とするＤ−プ
ロリンの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｄ−プロリンの製造方
法に関する。Ｄ−プロリンは、医薬、農薬などの合成原
料として有用な物質である。

【従来の技術】Ｄ−プロリンの製造方法としては、Ｌ−
オルニチンにプロテウス・ミタジリ(Proteus mitajiri)
由来の酵素（オルニチンサイクラーゼ）を作用させる方
法（特開昭４６−２７３５４）、が知られている。ＤＬ
−プロリンの製造法としては、Ｌ−プロリンをアルデヒ
ドを触媒として酢酸溶媒中でラセミ化する方法（特開昭
５７−１２３１５０）、Ｌ−プロリンにクロストリジウ
ム・スティックランディ(Clostridium sticklandii)由
来の酵素（プロリンラセマーゼ）を作用させる方法〔Bi
ochemistry, 7(11), 3970(1968)〕などが知られてい
る。また、ＤＬ−プロリンからＤ−プロリンを製造する
方法としては、ＤＬ−プロリンにＬ−プロリン分解菌を
作用させ残ったＤ−プロリンを取得する方法（特開平４
−１８３３９９）が知られている。しかし、これらの方
法による製造工程は複雑で生産性が低く、さらに、化学
合成を用いた場合には特殊な設備が必要であり、酵素を
用いた場合には酵素の安定性が問題となるなど、工業的
に必ずしも満足できる方法とは言えない。

【０００２】また、高いプロリンラセマーゼ活性を有す
る微生物〔例えばクロストリジウム・スティックランデ
ィー(Clostridium sticklandii)ＡＴＣＣ１２６６２〕
を用いてＬ−プロリンをラセミ化し、ＤＬ−プロリンを
得た後、該水性媒体中で生成したＤＬ−プロリンを、Ｌ
−プロリン分解活性を有する微生物の菌体、培養液また
はそれらの処理物と接触させて、該水性媒体中に残存す
るＤ−プロリンを採取するＤ−プロリンの製造法（特開
平４−１８３３９９）が開示されている。しかしなが
ら、この方法はＬ−プロリンからＤＬ−プロリンへのラ
セミ化工程は優れているにもかかわらず、用いるクロス
トリジウム属微生物は、その菌体収量が低く、菌体の大
量調製が困難であるため、工業的に利用できない。

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安価
で効率よくＤ−プロリンを製造する方法を提供すること
にある。

【課題を解決するための手段】本発明者らは、クロスト
リジウム・スティックランディ(Clostridium stickland
ii)ＡＴＣＣ１２６６２のプロリンラセマーゼ遺伝子を
コードする遺伝子を宿主微生物中にクローニングし、得
られた組換え体ＤＮＡを保有する微生物の湿菌体当たり
のプロリンラセマーゼ活性が、クロストリジウム・ステ
ィックランディ(Clostridium sticklandii)ＡＴＣＣ１
２６６２と比較して２３倍以上に向上していることを認
め、該微生物と高いＬ−プロリン分解活性を有する既存
の微生物とを組み合わせて用いることにより、発酵生産
により工業的に効率良くＬ−プロリンからＤ−プロリン
を生成させることができることを見出し、本発明を完成
するに至った。

【０００３】以下に本発明を詳細に説明する。本発明
は、エッシェリヒア属に属し、プロリンラセマーゼ活性
を有する微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物を
水性媒体中でＬ−プロリンと接触させてＤＬ−プロリン
を生成させ、ついで該水性媒体中に生成したＤＬ−プロ
リンとＬ−プロリン分解活性を有する微生物の菌体、培
養液またはそれらの処理物とを接触させて、該水性媒体
中のＬ−プロリンを分解し、該水性媒体から残存するＤ
−プロリンを採取することを特徴とするＤ−プロリンの
製造法に関する。

【０００４】エッシェリヒア属に属し、プロリンラセマ
ーゼ活性を有する微生物の菌体、培養液またはそれらの
処理物をｐＨ４．５〜９．５、好適にはｐＨ５．５〜
８．０に保持しつつ水性媒体中でＬ−プロリンと接触さ
せることにより、Ｌ−プロリンをＤＬ−プロリンにする
ことができる。接触させる際に用いるＬ−プロリンは、
化学的な純品でも粗精製品でもよく、水性媒体中、１０
〜４００ｇ／ｌ、好適には１００〜４００ｇ／ｌの濃度
範囲で用いる。菌体の濃度は、プロリンラセマーゼ活性
として０．３〜１５０ｋＵ／ｌ、好適には１．５〜３０
ｋＵ／ｌが用いられる（１Ｕ＝Ｌ−プロリンに作用して
１分間に１μmol のＤ−プロリンを生成する酵素活
性）。その際、そのまま菌体を用いてもよいが、トルエ
ンやキシレンなどの有機溶剤を添加したり、アセトン処
理を行ったりすることができる。トルエンやキシレンな
どの有機溶剤を添加する場合には、その添加量は０．１
〜５．０％（ｖ／ｖ）であればよい。

【０００５】ｐＨの調整は、アンモニア水、水酸化ナト
リウムなどのアルカリ溶液または、塩酸、硫酸などの酸
溶液を用い、接触中の温度は、２５〜６５℃、好適には
３０〜４０℃で行う。接触時間は用いるプロリン量およ
び菌体量により異なるが、通常１〜７２時間である。こ
のようにして得られた該水性媒体中には、ＤＬ−プロリ
ンが生成している。該水性媒体中にて、さらに、生成し
たＤＬ−プロリンとＬ−プロリン分解活性を有する微生
物の培養液、菌体あるいは菌体処理物とを、ｐＨ６．０
〜８．０、好適にはｐＨ６．５〜７．５に保持しつつ接
触させることにより、該水性媒体中のＬ−プロリンのみ
を分解することができる。

【０００６】接触させる際に用いる菌体の濃度は、Ｌ−
プロリン分解活性として０．１２〜１２ｋＵ／ｌ、好適
には０．６〜１．２ｋＵ／ｌが用いられる（１Ｕ＝１分
間に１μmol のＬ−プロリンを分解する酵素活性）。そ
の際、そのまま菌体を用いてもよいが、トルエンやキシ
レンなどの有機溶剤を添加したり、アセトン処理を行っ
たりすることができる。トルエンやキシレンなどの有機
溶剤を添加する場合には、その添加量は０．１〜５．０
％（ｖ／ｖ）であればよい。

【０００７】ｐＨの調整は、リン酸、塩酸、硫酸などの
酸溶液を用い、接触中の温度は２５〜４０℃で行う。接
触時間はラセミ化反応に用いたＬ−プロリン量と菌体量
によって異なるが、通常１〜７２時間である。このよう
にして得られた該水性媒体中には、Ｄ−プロリンが存在
している。該水性媒体より、微生物菌体または菌体処理
物を遠心分離等の手段により除去した後、イオン交換樹
脂処理等により、Ｄ−プロリンを採取することができ
る。なお、Ｄ−プロリンの同定は、高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）による測定および比旋光度の測定
によって行う。

【０００８】プロリンラセマーゼ遺伝子を含有する組換
え体ＤＮＡを用いて形質転換される宿主微生物としては
プロリンラセマーゼ活性を有しない微生物であればいず
れでもよく、エッシェリヒア属、エンテロバクター属、
シュードモナス属、コリネバクテリウム属あるいはブレ
ビバクテリウム属などに属する菌があげられる。これら
の微生物は、Ｌ−プロリンを単一の炭素源および窒素源
として良好に生育するが、プロリンラセマーゼ活性を有
しないためＤ−プロリンでは生育できない。しかし、プ
ロリンラセマーゼ活性を有するようになった形質転換株
は、プロリンラセマーゼによりＤ−プロリンがＬ−プロ
リンに転換するため、Ｄ−プロリンを単一の炭素源およ
び窒素源として良好に生育できるようになる。従って、
組換え体ＤＮＡを用いて形質転換される宿主微生物とし
て、より好適には、制限系を欠損し、Ｌ−プロリンを要
求する菌株があげられる。

【０００９】Ｌ−プロリン栄養要求株は一般的にＬ−プ
ロリンが培地中に存在しなければ生育できないのに対
し、プロリンラセマーゼ活性を有するようになった該微
生物では、プロリンラセマ−ゼの働きによってＤ−プロ
リンをＬ−プロリンへと変換する能力を有するため、Ｄ
−プロリンを用いてもＬ−プロリンと同等の生育を示
す。Ｌ−プロリン栄養要求変異株の例としては、エッシ
ェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＨＢ１０１〔モレキ
ュラー・クローニング（Molecular Cloning)，T. Mania
tis et al. コールド スプリング ハーバー ラボラ
トリー （１９８２）〕があげられる。

【００１０】プロリンラセマーゼ遺伝子源としては、ク
ロストリジウム属に属し、プロリンラセマーゼ活性を有
する微生物であればいずれでもよい。好適な例として
は、クロストリジウム・スティックランディー(Clostri
dium sticklandii)ＡＴＣＣ１２６６２があげられる。
プロリンラセマーゼをコードするＤＮＡを組み込むベク
ターとしては、エッシェリヒア属菌種中で自律複製でき
るものであれば、ファージ・ベクター、プラスミド・ベ
クターなどいずれでも用いることができる。好適な例と
しては、大腸菌たとえばＫ１２株で複製可能なｐＢＲ３
２２（宝酒造社製）があげられる。また、コリネバクテ
リウム属、ブレビバクテリウム属などの他菌種の宿主・
ベクター系を用いてもよい。

【００１１】プロリンラセマーゼをコードするＤＮＡ断
片とベクターとの組換えは、クロストリジュウム属に属
する微生物の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で処理して
プロリンラセマーゼ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を作製
し、同じ制限酵素あるいは同じ接着末端を生じる制限酵
素で処理したベクターに組み込んだ後、該組換え体ＤＮ
Ａで宿主微生物を形質転換し、目的のＤＮＡ断片を含む
組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体を分離することに
より行う。この一連の操作は公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ組
換え技法〔モレキュラー・クローニング（Molecular Cl
oning)，T. Maniatis et al. コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー （１９８２）〕等に従って行
えばよい。

【００１２】クロストリジウム属に属する微生物のプロ
リンラセマーゼをコードするＤＮＡを含有する組換え体
ＤＮＡで宿主菌のＬ−プロリン栄養要求株を形質転換
し、Ｄ−プロリンを単一の炭素源および窒素源あるいは
栄養要求物質として、良好に生育できる形質転換体を選
択する。該形質転換株は該組換え体ＤＮＡを保有する菌
株である可能性が高い。さらに、選択した菌株のプロリ
ンラセマーゼ活性を測定することにより、目的とする組
換え体ＤＮＡを保有する菌株を得ることができる。 こ
のような形質転換株としては、エッシェリヒア・コリ(E
scherichia coli)Ｈ−ＰＲ３があげられる。この微生物
は、平成６年４月２１日付けで工業技術院生命工学工業
技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４６４９として寄託され
ている。

【００１３】プロリンラセマーゼをコードするＤＮＡ断
片を各種の制限酵素で処理して小断片を調製し、得られ
た各々の小断片を含むプラスミドのプロリンラセマーゼ
活性を測定することにより、プロリンラセマーゼ遺伝子
の存在位置をさらに限定することができる。ＤＮＡ断片
の塩基配列は、自動蛍光ＤＮＡシーケンサー（Applied
biosystems製 ABI 373A ）等を用いることにより決定で
きる。

【００１４】プロリンラセマーゼ活性は、以下のように
して測定する。Ｌ−プロリン１００ｇ／ｌ、トルエン２
％（ｖ／ｖ）を含有するリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ
６．２）に、湿菌体を１〜２０ｇ／ｌになるように加
え、３７℃で１時間反応させた後、反応液を沸騰水中で
１０分間保持し反応を停止させる。反応液より菌体を遠
心除去後、上清をＨＰＬＣにて分析し、生成したＤ−プ
ロリン量を測定する。

【００１５】ＨＰＬＣでの分析条件は以下のとおりであ
る。 ＨＰＬＣ分析条件： １）カラム ： TSK GEL Enantio L1（東ソー社
製） ２）移動相 ： ２ｍＭ ＣｕＳＯ₄水溶液 ３）カラム温度： ４０℃ ４）流速 ： １ ｍｌ／ｍｉｎ ５）サンプル量： ２０μｌ ６）検出 ： ２５４ｎｍ 紫外部吸収 なお、１分間に１μｍｏｌのＤ−プロリンを生成する酵
素活性を１ユニット（Ｕ）として表示する。

【００１６】Ｌ−プロリン分解活性を有する微生物とし
ては、該活性を有する微生物であればいずれでもよい
が、より活性の強い微生物を用いることにより、より効
率よくＤ−プロリンを製造することができる。このよう
な微生物として、キャンジダ・エスピー(Candida sp.)
ＰＲＤ−２３８、およびトリコスポロン・エスピー(Tri
chosporon sp.)ＰＲＤ−３１７（特開平４−１８３３９
９）があげられる。

【００１７】プロリンラセマーゼ活性を有する微生物ま
たはＬ−プロリン分解活性を有する微生物を培養する培
地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン類を
含有しているものが使用できる。炭素源としては、グル
コース、フラクトース、シュクロース、ラクトースなど
の各種の炭水化物およびこれらを含有する糖蜜、デンプ
ン加水分解物等が用いられる。

【００１８】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウムなどの各種無機酸や有機酸のアンモニウム
塩、アミン類、その他含窒素化合物、ならびにペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カ
ゼイン加水分解物、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体お
よびその消化物などが用いられる。

【００１９】無機物としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。培養温度は、
２０〜４２℃、好適には３０〜３８℃が用いられる。培
養中ｐＨは５．０〜９．０、好適には６．０〜７．５に
保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アル
カリ溶液、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行
う。

【００２０】培養時間は、通常５〜７２時間である。こ
のようにして得られる各々の微生物の菌体中には、プロ
リンラセマーゼ活性、もしくはＬ−プロリン分解活性の
蓄積が認められる。以下に本発明の実施例を示す。

【００２１】

【実施例】

実施例１． プロリンラセマーゼ遺伝子のクローニング プロリンラセマーゼを有するクロストリジウム・スティ
ックランディー(Clostridium sticklandii)ＡＴＣＣ１
２６６２を、ＧＡＭ寒天培地（日水製薬社製）に刺針
し、ガスパックシステム（Becton Dickinson and Co.,
BBL Gas Pack Anaerobic Systems, H₂ + CO₂ Type）を
用いて、嫌気条件下、３７℃で２日間培養した。

【００２２】培養菌体を１白金耳、２０ｍｌのＧＡＭブ
イヨン培地（日水製薬社製）に植菌し、ガスパックシス
テムを用いて、嫌気条件下、３７℃で２４時間静置培養
した。さらに、この培養液の全量を、１リットルのＧＡ
Ｍブイヨン培地（日水製薬社製）に移植し、ガスパック
システムを用いて、嫌気条件下、３７℃で２４時間静置
培養した。

【００２３】培養液を４℃、５，０００ｒｐｍ、１０分
間遠心分離し、集菌後、菌体をＴＥ緩衝液〔トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと略す）１
０ｍＭ、１ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ₂、ｐＨ７．５〕にて
洗浄集菌し、集菌した菌体から、斉藤−三浦の方法〔バ
イオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ(Biochem.Bio
phys.Acta)，７２，６１９（１９６３）〕に従って、高
分子染色体ＤＮＡを単離した。

【００２４】この染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII
で消化した。即ち、染色体ＤＮＡ２μｇを含む制限酵素
ＨｉｎｄIII用反応液（トリス ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ₂
１０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ７．５）９０μｌ
に、２単位のＨｉｎｄIII（宝酒造社製）を添加し、３
７℃、６０分間反応させ、６５℃、１０分間の加温で反
応を停止させた。

【００２５】一方クローニングのベクターとして用いた
ｐＢＲ３２２〔ジーン（Ｇｅｎｅ），２，９５（１９７
５）〕は、宝酒造社製の市販のものを用いた。このｐＢ
Ｒ３２２ １μｇを含むＨｉｎｄIII用反応液９０μｌ
に、２単位のＨｉｎｄIIIを添加し、３７℃、６０分間
反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止させた。
両反応物を混合し、１０倍濃度のＴ４ＤＮＡリガーゼ用
緩衝液（トリス ６６０ｍＭ、ＭｇＣｌ₂ ６６ｍＭ、
ジチオスレイトール １００ｍＭ、ｐＨ７．６）２０μ
ｌ、１００ｍＭ ＡＴＰ２μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製）３５０単位を加え、１２℃で１６時間連
結反応させた。この反応物を、エッシェリヒア・コリ(E
scherichia coli)ＨＢ１０１の形質転換に供した。

【００２６】形質転換は、モレキュラー・クローニング
（Molecular Cloning，T. Maniatiset al. コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー （１９８２））
記載の方法に従って行った。即ち、Ｌ培地（バクトトリ
プトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース１ｇおよび
塩化ナトリウム５ｇを水１リットルに含み、ｐＨ７．２
に調整した培地）１００ｍｌにエッシェリヒア・コリ(E
scherichia coli)ＨＢ１０１を植菌し、ＯＤ_660nmが
０．２になるまで３７℃で培養した。培養液を氷中で１
０分間冷やしたのち遠心した。冷却した５０ｍＭ塩化カ
ルシウム−２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、２５ｍｌに菌
体を再懸濁し氷水中に１５分間置き、再遠心した。菌体
を２ｍｌの５０ｍＭ塩化カルシウム─２０ｍＭトリス、
ｐＨ８．０、に懸濁し氷中で１８時間置いた。この菌液
１５０μｌに上記リガ−ゼ反応混合物５０μｌを添加混
合し氷中で１０分間置いてから４２℃で２分間加温し
た。次いでＬ−培地２mlを添加し、３７℃で２時間培養
した。この菌液を遠心し、生理食塩水で２回洗浄後、ア
ンピシリン１００μｇ／ｍｌ、Ｄ−プロリン５０μｇ／
ｍｌを含むＭ９寒天培地（Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ６ｇ，ＫＨ₂
ＰＯ₄ ３ｇ，ＮａＣｌ ０．５ｇ，ＮＨ₄Ｃｌ１ｇ，Ｍ
ｇＳＯ₄ ０．５ｇ，グルコース ２ｇ，塩化カルシウ
ム ０．０１ｇ，サイアミン塩酸塩 ０．１ｍｇを水１
リットルに含みｐＨ７．２に調整した培地（Ｍ９培地）
１リットルに寒天２０ｇを加えた培地）に塗布し、３０
℃で５日間培養した。寒天培地上で生育したコロニーを
釣菌しＬ培地で培養後菌体を集菌し、そのプロリンラセ
マーゼ活性を調べたところ、クロストリジウム・スティ
ックランディー(Clostridium sticklandii)ＡＴＣＣ１
２６６２の菌体活性とほぼ同等のプロリンラセマーゼ活
性を有していることが判明した。結果を第１表に示す。

【００２７】

【表１】

【００２８】この形質転換株から、プラスミドＤＮＡを
単離し、制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析
した。得られたプラスミドの大きさは、約９．８キロベ
ース（ｋｂ）であり、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄIII切断
点の位置に、クロストリジウム・スティックランディー
(Clostridium sticklandii)ＡＴＣＣ１２６６２の染色
体ＤＮＡ由来の約５．４ｋｂのＨｉｎｄIII挿入断片を
有していた。このプラスミドをｐＰＲ１、また、ｐＰＲ
１を有する組換え菌をＨ−ＰＲ１と命名した。このプラ
スミドｐＰＲ１の制限酵素切断地図を図１に示す。

【００２９】ｐＰＲ１の挿入断片についてサブクローニ
ング解析を行った結果、プロリンラセマーゼは、約１．
４ｋｂのＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲI断片に存在することが
判明した。この、約１．４ｋｂのＨｉｎｄIII−Ｅｃｏ
ＲI断片をｐＢＲ３２２のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲI切断
点の位置に挿入した組換えプラスミドをｐＰＲ２と命名
した。ｐＰＲ２をエッシェリヒア・コリ(Escherichia c
oli)ＨＢ１０１に導入した組換え菌Ｈ−ＰＲ２は、クロ
ストリジウム・スティックランディー(Clostridium sti
cklandii)ＡＴＣＣ１２６６２およびＨ−ＰＲ１の菌体
活性とほぼ同等のプロリンラセマーゼ活性を有している
ことが判明した。結果を第１表に示す。また、このプラ
スミドｐＰＲ２の制限酵素切断地図を図２に示す。

【００３０】実施例２． プロリンラセマーゼ遺伝子の
高発現株の取得 ｐＰＲ１のサブクローニングを行う過程で、ｐＰＲ１に
挿入されたクロストリジウム・スティックランディー(C
lostridium sticklandii)ＡＴＣＣ１２６６２由来のプ
ロリンラセマーゼ遺伝子を含む約１．４ｋｂのＨｉｎｄ
III−ＥｃｏＲI断片と、蛋白質をコードしないｐＰＲ１
に挿入されたクロストリジウム・スティックランディー
(Clostridium sticklandii)ＡＴＣＣ１２６６２由来の
約１ｋｂのＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲI断片を有する組換え
プラスミドｐＰＲ３を得た。このサブクローニングの過
程を図３に示す。また、このプラスミドｐＰＲ３の制限
酵素切断地図を図４に示す。

【００３１】プラスミドｐＰＲ３をエッシェリヒア・コ
リ(Escherichia coli)ＨＢ１０１に導入した組換え株を
Ｈ−ＰＲ３と命名した。組換え菌Ｈ−ＰＲ３は、クロス
トリジウム・スティックランディー(Clostridium stick
landii)ＡＴＣＣ１２６６２の菌体活性の約２３倍のプ
ロリンラセマーゼ活性を有していることが判明した。結
果を第２表に示す。

【００３２】

【表２】

【００３３】実施例３． プロリンラセマーゼをコード
する遺伝子の塩基配列の決定 プラスミドｐＰＲ３の有するプロリンラセマーゼ遺伝子
を含むＤＮＡ断片について、ベクタープラスミドｐＵＣ
１９、および、Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用Ｄｅｌｅ
ｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて約１００ｂｐ
毎の欠失変異株を取得した。この欠失変異株について、
自動蛍光ＤＮＡシーケンサー（Appliedbiosystems社製
ABI 373A）にて、ＤＮＡ塩基配列の決定を行い、プラス
ミドｐＰＲ３の有するプロリンラセマーゼ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片について全ＤＮＡ塩基配列の決定を行った。
この際、シーケンシングキットに、Taq Dyefeoxy^TM Ter
minator Cycle Sequencing Kit（Applied biosystems社
製）、また、シーケンシングのためのプライマーには、
M13 Primer M4、およびM13 Primer RV（宝酒造社製）を
用いた。

【００３４】この結果、プラスミドｐＰＲ３の有するプ
ロリンラセマーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片には、８２８
ｂｐからなるＯＲＦ(Open Readiong Frame)が存在し
た。この塩基配列およびＯＲＦの塩基配列から予想され
る蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。このＮ末
２０アミノ酸の配列は、クロストリジウム・スティック
ランディー(Clostridium sticklandii)ＡＴＣＣ１２６
６２、および、組換え体Ｈ−ＰＲ３の菌体から精製した
プロリンラセマーゼ蛋白のＮ末２０アミノ酸の配列と一
致した。また、予想される蛋白の分子量と、クロストリ
ジウム・スティックランディー(Clostridium stickland
ii)ＡＴＣＣ１２６６２、および、組換え体Ｈ−ＰＲ３
の菌体から精製したプロリンラセマーゼ蛋白のＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる分子量の測定結果が一致した。これらの
結果より、配列番号１に示す塩基配列が、クロストリジ
ウム・スティックランディー(Clostridium sticklandi
i)ＡＴＣＣ１２６６２由来のプロリンラセマーゼである
と判断した。

【００３５】実施例４． 組換え体ＤＮＡを保有する微
生物によるＬ−プロリンのラセミ化 プラスミドｐＰＲ３を保有する組換え株Ｈ−ＰＲ３を、
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３００ｍｌのＬ
培地に植菌し、３０℃、１８時間振盪培養した。培養後
菌体を集菌し、Ｌ−プロリン １００ｇ／ｌ、トルエン
１％（ｖ／ｖ）を含む水溶液（ｐＨ６．２）に、湿菌
体として１ｇ／ｌ（３ｋＵ／ｌ）となるように加え、反
応液５００ｍｌを１リットル三角フラスコ中で、３７
℃、２４時間緩やかに振盪し、反応した。その結果、反
応液中にはＤ−プロリン４９．８ｇ／ｌが生成し、残存
するＬ−プロリンは４９．８ｇ／ｌであった。

【００３６】実施例５． ＤＬ−プロリン中のＬ−プロ
リンの分解 オートクレーブにて滅菌した、ペプトン１０ｇ／ｌ、イ
ーストエキス５ｇ／ｌおよび塩化ナトリウム５ｇ／ｌを
含む培地（ｐＨ７．２）４０ｍｌ（２５０ｍｌ三角フラ
スコ）にキャンジダ・エスピー(Candida sp.) ＰＲＤ−
２３８（特開平４−１８３３９９）を１白金耳植菌し、
３０℃にて２４時間振盪培養を行った。

【００３７】この培養液２０ｍｌを、オートクレーブに
て滅菌した、グルコース１０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／
ｌ、肉エキス５ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム２ｇ／
ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／ｌ、硫酸第一鉄１ｍｇ
／ｌ、硫酸マンガン１ｍｇ／ｌ、およびＬ−プロリン１
０ｇ／ｌを含む培地（ｐＨ７．０）１リットル（２リッ
トルジャーファーメンター）に無菌的に接種し、３０℃
にて２４時間通気撹拌培養（通気量１v.v.m.）した。培
養中は、４規定アンモニア水にて培地ｐＨをｐＨ７．０
±０．１に調整した。この培養液１リットルを遠心分離
（１０，０００ｒｐｍ、１０分間）して、湿菌体３９ｇ
を得た。

【００３８】実施例４で得た反応液（プロリンラセミ化
液）を、ＤＬ−プロリンが４０ｇ／ｌになるように蒸留
水にて希釈し、水酸化ナトリウムにてｐＨを７．０に調
整した後、この溶液１リットルを２リットルジャーファ
ーメンターに入れてオートクレーブにて１２０℃、２０
分間滅菌し、同時に溶液中に残存するプロリンラセマー
ゼを完全に失活させた。

【００３９】この溶液に、キャンジダ・エスピー(Candi
da sp.) ＰＲＤ−２３８の生菌体３０ｇ（１．２ｋＵ）
を加え、３０℃にて４８時間通気撹拌（通気量１v.v.
m.）を行った。この間、反応液のｐＨを７．０±０．１
となるように、４規定硫酸にて調整を行った。反応の結
果、反応液中にはＤ−プロリン１９．２ｇ／ｌ が残存
し、Ｌ−プロリンは検出されなかった。

【００４０】実施例６． 反応液からのＤ−プロリンの
取得 実施例５の反応液から、菌体を遠心分離除去（１０，０
００ｒｐｍ、１０分間）したのち、上清液をイオン交換
樹脂ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ（Ｈ型）（三菱化成社製）
５００ｍｌに通塔し、Ｄ−プロリンを吸着させた。該樹
脂を水洗後、１規定アンモニア水にてＤ−プロリンを溶
出した。溶出液を減圧濃縮してＤ−プロリンの粗結晶１
４ｇを得た。

【００４１】このＤ−プロリン粗結晶１４ｇを蒸留水に
溶解し、活性炭７ｇを加え脱色を行い、ろ過してろ液を
得た。このろ液を濃縮後、冷却して析出した結晶を乾燥
した結果、Ｄ−プロリン６ｇ（光学純度９９．５ｅｅ％
以上）を得た。

【００４２】

【発明の効果】本発明により、Ｌ−プロリンから、医薬
・農薬などの合成原料として重要なＤ−プロリンを工業
的に効率よく生産できる。

【００４３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１００８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：クロストリジウム・スティックランディ（Clos
tridium sticklandii)株名：ＡＴＣＣ１２６６２ 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..1005 特徴を決定した方法：S 配列 ATG AAG TTT TCT AAA GGA ATT CAC GCT ATA GAT TCA CAT ACT ATG 45 Met Lys Phe Ser Lys Gly Ile His Ala Ile Asp Ser His Thr Met 1 5 10 15 GGA GAA CCT ACT AGA ATA GTT GTA GGA GGT ATT CCG CAG ATT AAT 90 Gly Glu Pro Thr Arg Ile Val Val Gly Gly Ile Pro Gln Ile Asn 20 25 30 GGA GAA ACT ATG GCT GAC AAG AAA AAA TAT CTT GAA GAT AAC CTA 135 Gly Glu Thr Met Ala Asp Lys Lys Lys Tyr Leu Glu Asp Asn Leu 35 40 45 GAC TAC GTT AGA ACT GCT TTA ATG CAT GAG CCA AGA GGA CAT AAT 180 Asp Tyr Val Arg Thr Ala Leu Met His Glu Pro Arg Gly His Asn 50 55 60 GAT ATG TTT GGT TCT ATT ATA ACT AGC TCG AAT AAT AAA GAA GCT 225 Asp Met Phe Gly Ser Ile Ile Thr Ser Ser Asn Asn Lys Glu Ala 65 70 75 GAT TTT GGA ATT ATA TTT ATG GAT GGC GGC GGA TAC TTA AAT ATG 270 Asp Phe Gly Ile Ile Phe Met Asp Gly Gly Gly Tyr Leu Asn Met 80 85 90 TGC GGC CAT GGT TCA ATT GGA GCT GCA ACT GTA GCA GTA GAA ACA 315 Cys Gly His Gly Ser Ile Gly Ala Ala Thr Val Ala Val Glu Thr 95 100 105 GGA ATG GTA GAA ATG GTA GAG CCT GTT ACT AAT ATC AAC ATG GAA 360 Gly Met Val Glu Met Val Glu Pro Val Thr Asn Ile Asn Met Glu 110 115 120 GCA CCT GCT GGA CTT ATC AAA GCT AAG GTT ATG GTA GAA AAT GAA 405 Ala Pro Ala Gly Leu Ile Lys Ala Lys Val Met Val Glu Asn Glu 125 130 135 AAA GTA AAA GAA GTA TCT ATA ACT AAC GTT CCT TCA TTT TTA TAT 450 Lys Val Lys Glu Val Ser Ile Thr Asn Val Pro Ser Phe Leu Tyr 140 145 150 ATG GAA GAT GCT AAA TTA GAA GTA CCT TCT TTA AAC AAG ACT ATT 495 Met Glu Asp Ala Lys Leu Glu Val Pro Ser Leu Asn Lys Thr Ile 155 160 165 ACA TTT GAT ATT TCT TTT GGC GGA AGC TTC TTT GCT ATT ATA CAT 540 Thr Phe Asp Ile Ser Phe Gly Gly Ser Phe Phe Ala Ile Ile His 170 175 180 GCA AAA GAG CTA GGA GTT AAA GTA GAA ACT AGC CAG GTT GAT GTA 585 Ala Lys Glu Leu Gly Val Lys Val Glu Thr Ser Gln Val Asp Val 185 190 195 CTT AAG AAA TTA GGT ATA GAA ATC AGA GAT TTA ATA AAT GAA AAA 630 Leu Lys Lys Leu Gly Ile Glu Ile Arg Asp Leu Ile Asn Glu Lys 200 205 210 ATC AAA GTT CAA CAT CCA GAG TTA GAG CAT ATC AAA ACT GTT GAT 675 Ile Lys Val Gln His Pro Glu Leu Glu His Ile Lys Thr Val Asp 215 220 225 TTA GTA GAA ATC TAC GAT GAG CCA TCT AAT CCT GAA GCT ACA TAC 720 Leu Val Glu Ile Tyr Asp Glu Pro Ser Asn Pro Glu Ala Thr Tyr 230 235 240 AAA AAC GTT GTT ATC TTT GGA CAA GGG CAA GTA GAC CGT TCT CCT 765 Lys Asn Val Val Ile Phe Gly Gln Gly Gln Val Asp Arg Ser Pro 245 250 255 TGT GGA ACT GGA ACT AGT GCT AAG CTT GCA ACA CTT TAC AAA AAA 810 Cys Gly Thr Gly Thr Ser Ala Lys Leu Ala Thr Leu Tyr Lys Lys 260 265 270 GGA CAT CTT AAG ATA GAT GAA AAA TTT GTA TAC GAA AGC ATC ACT 855 Gly His Leu Lys Ile Asp Glu Lys Phe Val Tyr Glu Ser Ile Thr 275 280 285 GGA ACA ATG TTC AAA GGA AGA GTT TTA GAA GAA ACT AAA GTT GGA 900 Gly Thr Met Phe Lys Gly Arg Val Leu Glu Glu Thr Lys Val Gly 290 295 300 GAA TTT GAT GCT ATA ATC CCA GAA ATT ACA GGG GGA GCA TAT ATA 945 Glu Phe Asp Ala Ile Ile Pro Glu Ile Thr Gly Gly Ala Tyr Ile 305 310 315 ACT GGA TTC AAT CAT TTC GTA ATT GAT CCA GAA GAT CCA CTT AAG 990 Thr Gly Phe Asn His Phe Val Ile Asp Pro Glu Asp Pro Leu Lys 320 325 330 TAT GGA TTT ACA GTA TAA 1008 Tyr Gly Phe Thr Val 335

【００４４】

【図面の簡単な説明】

【００４５】

【図１】図１は、クロストリジウム・スティックランデ
ィーＡＴＣＣ１２６６２由来のプロリンラセマーゼをコ
ードする遺伝子を含むプラスミドｐＰＲ１の制限酵素地
図を示す。

【００４６】

【図２】図２は、クロストリジウム・スティックランデ
ィーＡＴＣＣ１２６６２由来のプロリンラセマーゼをコ
ードする遺伝子を含むプラスミドｐＰＲ２の制限酵素地
図を示す。

【００４７】

【図３】図３は、クロストリジウム・スティックランデ
ィーＡＴＣＣ１２６６２由来のプロリンラセマーゼをコ
ードする遺伝子を含むプラスミドｐＰＲ１のサブクロー
ニングにより、プロリンラセマーゼ高発現プラスミドｐ
ＰＲ３を取得する工程を示す。

【００４８】

【図４】図４は、クロストリジウム・スティックランデ
ィーＡＴＣＣ１２６６２由来のプロリンラセマーゼをコ
ードする遺伝子を含むプラスミドｐＰＲ３の制限酵素地
図を示す。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エッシェリヒア属に属し、プロリンラセ
   マーゼ活性を有する微生物の菌体、培養液またはそれら
   の処理物を水性媒体中でＬ−プロリンと接触させてＤＬ
   −プロリンを生成させ、ついで該水性媒体中に生成した
   ＤＬ−プロリンとＬ−プロリン分解活性を有する微生物
   の菌体、培養液またはそれらの処理物とを接触させて、
   該水性媒体中のＬ−プロリンを分解し、該水性媒体から
   残存するＤ−プロリンを採取することを特徴とするＤ−
   プロリンの製造法。
2. 【請求項２】 エッシェリヒア属に属し、プロリンラセ
   マーゼ活性を有する微生物が、クロストリジウム属に属
   する微生物のプロリンラセマーゼをコードするＤＮＡを
   含有する組換え体ＤＮＡを組み込んでなる微生物である
   請求項１記載の製造法。
3. 【請求項３】 Ｌ−プロリンからＤＬ−プロリンへのラ
   セミ化をｐＨ４．５〜９．５で行い、Ｌ−プロリンの分
   解をｐＨ６．０〜８．０で行うことからなる請求項１記
   載の製造法。
4. 【請求項４】 プロリンラセマーゼをコードするＤＮＡ
   が配列番号１で示されるＤＮＡである請求項２記載の製
   造法。
5. 【請求項５】 クロストリジウム属に属する微生物のプ
   ロリンラセマーゼをコードするＤＮＡを含有する組換え
   体ＤＮＡを組み込んでなる、エッシェリヒア属に属する
   微生物。
6. 【請求項６】 配列番号１に示されるプロリンラセマー
   ゼをコードするＤＮＡ。