JPH07289267A - Method for enhancing expression - Google Patents
Method for enhancing expressionInfo
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- JPH07289267A JPH07289267A JP6107406A JP10740694A JPH07289267A JP H07289267 A JPH07289267 A JP H07289267A JP 6107406 A JP6107406 A JP 6107406A JP 10740694 A JP10740694 A JP 10740694A JP H07289267 A JPH07289267 A JP H07289267A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、発現増強方法に関する
ものであって、組換え型タンパク質を大量生産する新規
システムに関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for enhancing expression, and to a novel system for mass-producing a recombinant protein.
【０００２】本発明によれば、遺伝子操作の手法により
各種のタンパク質、酵素を効率よく大量生産することが
でき、例えば本発明によって大量生産が可能となったイ
ソクエン酸脱水素酵素（以下、ｉＣＤということもあ
る）は、試薬として利用できるだけでなく、肝障害等の
臨床検査薬として利用することができ、本発明は医療や
生化学の技術分野において多大の貢献をなすものであ
る。According to the present invention, various proteins and enzymes can be efficiently mass-produced by a genetic engineering method. For example, isocitrate dehydrogenase (hereinafter referred to as iCD) which has been mass-produced by the present invention is possible. Can be used not only as a reagent but also as a clinical test drug for liver disorders and the like, and the present invention makes a great contribution in the technical fields of medicine and biochemistry.
【０００３】[0003]
【従来の技術】ｉＣＤは、生体細胞内に微量存在してお
り、現在においては、ウシ心筋、ブタ心筋、酵母等を起
源とし、抽出法によって製造されている。また、パン酵
母由来のｉＣＤについては、遺伝子の配列及び酵母での
発現が確認されている（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６６
（４），ｐｐ．２３３９−２３４５，１９９１）。2. Description of the Related Art iCD is present in living cells in a trace amount, and is currently produced from bovine cardiac muscle, porcine cardiac muscle, yeast, etc. by an extraction method. Regarding baker's yeast-derived iCD, the gene sequence and expression in yeast have been confirmed (The Journal of
Biological Chemistry, 266
(4), pp. 2339-2345, 1991).
【０００４】このように、ｉＣＤは公知物質ではあるが
抽出法によってごく少量生産されているにすぎず、これ
を効率よく大量生産する方法は知られていないし、まし
てや遺伝子工学技術を応用してパン酵母ｉＣＤを増産す
ることなどは全く知られていない。Thus, although iCD is a known substance, it is only produced in a very small amount by the extraction method, and there is no known method for efficiently producing it in large quantities, let alone applying genetic engineering technology to bread. Nothing is known about increasing production of yeast iCD.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
技術の現状に鑑み、ｉＣＤを効率よく大量生産するシス
テムを開発する目的でなされたものである。また本発明
は、ｉＣＤのみでなく他のタンパク質も増産するシステ
ムを開発する目的でもなされたものである。SUMMARY OF THE INVENTION In view of the current state of the art, the present invention has been made for the purpose of developing a system for efficiently mass-producing iCDs. The present invention was also made for the purpose of developing a system for increasing the production of not only iCD but also other proteins.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、菌体内で複製する
プラスミドに目的とするタンパク質の遺伝子を挿入し発
現させることによって生産量を増加させることを基本と
する遺伝子工学技術を利用するのが最も良いとの観点に
たった。Means for Solving the Problems The present invention has been made in order to achieve the above-mentioned object, and the amount of production can be increased by inserting a gene of a target protein into a plasmid replicating in the cells and expressing it. From the viewpoint that it is best to use the genetic engineering technology based on increasing the number.
【０００７】そして、ｉＣＤについては、本発明におい
て対象としているｉＣＤは、ミトコンドリアに局在する
ＮＡＤＰ特異型酵素であって、細胞質内でまず前駆体が
発現され、これがミトコンドリアに輸送されることによ
って成熟型（活性型）のｉＣＤとなるが、通常このよう
な場合には、菌体内で複製するプラスミドにｉＣＤ前駆
体の塩基配列をもつＤＮＡ断片を挿入する。Regarding iCD, the iCD of the present invention is a NADP-specific enzyme localized in mitochondria, and a precursor is first expressed in the cytoplasm and then matured by being transported to mitochondria. In this case, a DNA fragment having the base sequence of the iCD precursor is inserted into a plasmid that replicates in the cell.
【０００８】上記のように、ｉＣＤは、前駆体がミトコ
ンドリアに輸送されてはじめて成熟型（活性型）に変わ
るのであるが、このｉＣＤ前駆体をミトコンドリアに到
達せしめるためには、プレ配列（通過配列）を必要と
し、したがって、ｉＣＤ前駆体には、（つまりｉＣＤ遺
伝子の全塩基配列には）成熟型（活性型）ｉＣＤのＮ末
端側にプレ配列が包含されているのである。As described above, iCD is transformed into a mature form (active form) only after the precursor is transported to mitochondria. In order to make the iCD precursor reach mitochondria, a presequence (passage sequence) is used. Therefore, the iCD precursor contains a pre-sequence on the N-terminal side of mature (active) iCD (that is, in the entire nucleotide sequence of the iCD gene).
【０００９】本発明者らは、前駆体を活性型に変えるの
に必須の配列であるプレ配列に着目し、全く発想を逆転
して、活性化に必須であるこのプレ配列をあえてｉＣＤ
前駆体の塩基配列から除去し、得られた残りの配列をプ
ラスミドに連結し、このプラスミドでパン酵母を形質転
換し、形質転換体を培養したところ、全く予期せざるこ
とに従来の５０〜１００倍というきわめて著量のｉＣＤ
が生産されることを新たに発見し、この新知見を基礎と
して更に検討の結果、本発明の完成に至ったものであ
る。The present inventors have paid attention to a pre-sequence which is an essential sequence for converting a precursor into an active form, and have the idea completely reversed, and this pre-sequence which is essential for activation is dared to
When the base sequence of the precursor was removed, the remaining sequence obtained was ligated to a plasmid, baker's yeast was transformed with this plasmid, and the transformant was cultured. Extremely large amount of iCD
Was newly produced, and as a result of further studies based on this new finding, the present invention has been completed.
【００１０】すなわち本発明は、構造遺伝子からプレ配
列（通過配列）部分を除去した遺伝子を用いることを特
徴とするタンパク質の発現増強システムを基本的技術思
想とするものである。That is, the present invention has as its basic technical idea a protein expression enhancing system characterized by using a gene obtained by removing a pre-sequence (passage sequence) from a structural gene.
【００１１】本発明を実施するには、プレ配列を除いた
遺伝子を用いるほかは遺伝子工学技術として知られてい
る一般的手法によればよく、例えばプレ配列を除いたｉ
ＣＤ遺伝子を発現ベクターへ連結して組換えＤＮＡを作
製し、これを酵母等の宿主細胞に移入し、得られた形質
転換体を培養して、ｉＣＤを発現させればよい。したが
って、従来用いられている装置や手法をそのまま使用す
ることができ、これらの改変等の必要がない点でも本発
明は卓越している。In order to carry out the present invention, a general method known as a genetic engineering technique may be used except that a gene excluding the pre-sequence is used.
The CD gene may be ligated to an expression vector to prepare a recombinant DNA, which is then transferred into a host cell such as yeast, and the resulting transformant is cultured to express iCD. Therefore, the present invention is excellent in that the devices and methods that have been conventionally used can be used as they are without any modification or the like.
【００１２】本発明においては、ｉＣＤ遺伝子（前駆体
タンパク質遺伝子、構造遺伝子）からプレ配列を除去し
た遺伝子を用いることによりｉＣＤの発現量を大幅に上
昇せしめることができる。しかしながら、ｉＣＤ遺伝子
からプレ配列を除き、更に開始コドンの次のアミノ酸を
改変したＤＮＡ断片を用いると、更にｉＣＤの発現量を
増強することができる。In the present invention, the expression level of iCD can be significantly increased by using a gene obtained by removing the presequence from the iCD gene (precursor protein gene, structural gene). However, the expression level of iCD can be further enhanced by removing the presequence from the iCD gene and using a DNA fragment in which the amino acid next to the start codon is modified.
【００１３】また本発明は、ｉＣＤの発現増強のみでな
く、ミトコンドリア、リソソーム、等オルガネラで活性
型となる前駆体タンパク質等各種のタンパク質の発現増
強にも広く適用することができる。Further, the present invention can be widely applied not only to enhance the expression of iCD, but also to enhance the expression of various proteins such as precursor proteins that are active in organelles such as mitochondria, lysosomes.
【００１４】ミトコンドリアのマトリックスタンパク質
前駆体としては、既述したｉＣＤ（イソクエン酸脱水素
酵素）のほか、例えば、クエン酸合成酵素、フマラー
ゼ、アコニターゼ、Ｌ−リンゴ酸脱水素酵素、α−ケト
グルタル酸脱水素酵素、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素、
アスパラギン酸トランスアミナーゼ、δ−アミノレブリ
ン酸合成酵素、等が挙げられ、いずれも、本発明を適用
することが可能である。Examples of the mitochondrial matrix protein precursor include, in addition to the above-mentioned iCD (isocitrate dehydrogenase), for example, citrate synthase, fumarase, aconitase, L-malate dehydrogenase, α-ketoglutarate dehydration. Elementary enzyme, L-glutamate dehydrogenase,
Examples thereof include aspartate transaminase, δ-aminolevulinic acid synthase, and the like, and the present invention can be applied to any of them.
【００１５】本発明においては、上記したミトコンドリ
アのマトリックスタンパク質のみを対象とするのではな
く、更に、ミトコンドリアに含まれる種々の区画に含ま
れるタンパク質、葉緑体のタンパク質、核タンパク質、
ペルオキシソームタンパク質、小胞体を通過するタンパ
ク質（小胞体タンパク質、ゴルジ体タンパク質、リソソ
ームタンパク質、液胞タンパク質等）も対象として含ま
れる。In the present invention, not only the above-mentioned mitochondrial matrix proteins are targeted, but further, proteins contained in various compartments contained in mitochondria, chloroplast proteins, nuclear proteins,
Peroxisomal proteins and proteins that pass through the endoplasmic reticulum (endoplasmic reticulum proteins, Golgi proteins, lysosomal proteins, vacuolar proteins, etc.) are also included in the target.
【００１６】ミトコンドリアに含まれる種々の区画に含
まれるタンパク質としては、内膜（Ｃ側）タンパク質
（例えばチトクロムｃ1等）、内膜（内在性）タンパク
質（例えばチトクロム酸化酵素ＩＶ等）、内膜（外側に
局在下する）タンパク質（例えばチトクロムｂｃ1複合
体；膜間部（膜間腔）タンパク質（例えばチトクロムｂ
2、アデニル酸キナーゼ、ヌクレオチド二リン酸キナー
ゼ、チトクロムｃペルオキシダーゼ等）；外側タンパク
質（例えば７０ｋＤａタンパク質等）が例示される。Proteins contained in various compartments contained in mitochondria include inner membrane (C side) protein (eg cytochrome c 1 etc.), inner membrane (endogenous) protein (eg cytochrome oxidase IV etc.), inner membrane Proteins (localized outside) such as cytochrome bc 1 complex; intermembrane (intermembrane space) proteins (such as cytochrome b)
2 , adenylate kinase, nucleotide diphosphate kinase, cytochrome c peroxidase and the like); and external proteins (for example, 70 kDa protein and the like).
【００１７】葉緑体のタンパク質としては、ストローマ
タンパク質（例えばＲｕｂｉｓｃｏの小サブユニット
等）；チラコイド膜タンパク質（例えば集光性クロロフ
ィルａ／ｂ結合タンパク質等）；チラコイドのストロー
マ側表面タンパク質（例えばフェレドキシン等）；チラ
コイドタンパク質（例えばプラストシアニン、チトクロ
ムｆ等）が例示される。Examples of chloroplast proteins include stroma proteins (eg, small Rubisco subunits); thylakoid membrane proteins (eg, light-harvesting chlorophyll a / b binding proteins); thylakoid stroma-side surface proteins (eg, ferredoxin). ); Thylakoid proteins (eg, plastocyanin, cytochrome f, etc.) are exemplified.
【００１８】以下、本発明の実施例について述べる。Examples of the present invention will be described below.
【００１９】[0019]
【実施例１】 （１）発現ベクターの構築 ＡＲＳ１（酵母染色体由来の自律複製配列１（酵母菌染
色体の複製開始点））、ＲＥＰ３（２μｍＤＮＡ（酵母
菌の内在性プラスミド）由来のプラスミド安定化配
列）、ＵＲＡ３（マーカー遺伝子：オロチジン−５−リ
ン酸デカルボキシラーゼ遺伝子）、ＧＰＤプロモーター
（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子由来のプロモーター）、クローニング部位、ＰＧＫ
ターミネーター（３−ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝
子由来のターミネーター）から構成されるＤＮＡ断片を
ＰＣＲによって作製した。これをプラスミドｐＵＣ１９
ＢｇｌＩＩへ連結して、発現ベクターＹＲｐ１Ｇ（図
１）を構築した。ＹＲｐ１Ｇの全塩基配列（５７６３ｂ
ｐ）を図２、図３に示す。Example 1 (1) Construction of Expression Vector ARS1 (autonomous replication sequence 1 from yeast chromosome (origin of replication of yeast chromosome)), REP3 (2 μm DNA (yeast endogenous plasmid) -derived plasmid stabilizing sequence) ), URA3 (marker gene: orotidine-5-phosphate decarboxylase gene), GPD promoter (promoter derived from glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene), cloning site, PGK
A DNA fragment composed of a terminator (terminator derived from 3-phosphoglycerate kinase gene) was prepared by PCR. This is plasmid pUC19
The expression vector YRp1G (FIG. 1) was constructed by ligating to BglII. Full base sequence of YRp1G (5763b
p) is shown in FIGS.
【００２０】ＰＣＲは常法にしたがって行い、プライマ
ー配列としては、図１０に記載した配列を使用した。PCR was carried out according to a conventional method, and the sequences shown in FIG. 10 were used as the primer sequences.
【００２１】またＰＣＲで作製したＤＮＡ断片は、ｍＰ
ＣＲ法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，２０２，ｐｐ．１５９−１６１，１９９２）によ
って連結した。Further, the DNA fragment prepared by PCR is
CR method (Analytical Biochemist
ry, 202, pp. 159-161, 1992).
【００２２】プラスミドｐＵＣ１９Ｕ ＢｇｌＩＩは、
文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ，２３７，ｐｐ．３２７−３３３，１９９３）
に記載されているものを使用した。The plasmid pUC19U BglII is
Literature (Molecular & General Gene
tics, 237, pp. 327-333, 1993).
The one described in was used.
【００２３】このようにして構築された新規発現ベクタ
ーＹＲｐ１Ｇは、ＰＣＲを駆使することによって必要の
ない配列が最大限除去されていることで、従来のベクタ
ーとは作製法を異にしている。そして、サイズが小さい
という特徴のほか、染色体に組み込まないでも、プラス
ミドとして酵母内で安定に維持されるという特徴を有す
るため、きわめて汎用性の高い有用な発現ベクターとし
て広く利用することができる。The novel expression vector YRp1G constructed in this way differs from conventional vectors in that the unnecessary sequences are maximally removed by making full use of PCR. In addition to its small size, it has the characteristic of being stably maintained as a plasmid in yeast even if it is not integrated into a chromosome, and thus can be widely used as a very versatile and useful expression vector.
【００２４】（２）ｉＣＤ遺伝子の構造 ｉＣＤ遺伝子は既述のように既知である。その制限酵素
地図は図４に示すとおりであり、その全塩基配列とアミ
ノ酸配列は図５、図６に示すとおりである。なお図中、
網かけしたＰｈｅは成熟型（活性型）ｉＣＤのＮ末端で
あり、開始コドンＡＴＧ（Ｍｅｔ）からＴＴＣ（Ｐｈ
ｅ）の前までの配列が、プレ配列（ミトコンドリアにタ
ーゲティングするプレ配列）である。(2) Structure of iCD gene The iCD gene is known as described above. The restriction enzyme map is shown in FIG. 4, and the entire base sequence and amino acid sequence are shown in FIGS. 5 and 6. In the figure,
The shaded Phe is the N-terminus of the mature (active) iCD, and the start codon ATG (Met) to TTC (Ph
The sequence before e) is the presequence (presequence that targets mitochondria).
【００２５】（３）ｉＣＤの発現（１） パン酵母の染色体ＤＮＡからＰＣＲによってｉＣＤ遺伝
子を単離した。これを先に作製した発現ベクターＹＲｐ
１Ｇへ連結して、組換えＤＮＡ（ＹＲｐ１Ｇ−ｉＣ
Ｄ1）を作製し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅの実験室パン酵母株Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ ＹＰＨ５００（米国、カリフォルニア大からの
分譲株）へ移入した。その組換え体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅＹＰＨ５００（ＹＲｐ１Ｇ−ｉＣＤ1）をフラス
コ培養した結果、非組換え酵母の場合に比して、そのｉ
ＣＤの発現量は約８倍に増加した（図７）。(3) Expression of iCD (1) The iCD gene was isolated from the chromosomal DNA of baker's yeast by PCR. Expression vector YRp prepared previously
Recombinant DNA (YRp1G-iC
D 1 ) was prepared and Saccharomyces cer
E. vivisae laboratory baker's yeast strain S. cerevis
Transferred to iae YPH500 (sold from the University of California, USA). The recombinant S. cerevis
As a result of flask culture of iaeYPH500 (YRp1G-iCD 1 ), the i
The expression level of CD was increased about 8-fold (Fig. 7).
【００２６】（４）ｉＣＤの発現（２） 更にｉＣＤ遺伝子のプレ配列（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉ
ａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）
を除去することにより、下記の表１、表２、表３で示さ
れる配列表の配列番号１に示されるＤＮＡ配列を得、こ
れを先に作製した発現ベクターＹＲｐ１Ｇへ連結して、
組換えＤＮＡ（ＹＲｐ１Ｇ−ｉＣＤ2）を作製し、上記
と同様に処理してｉＣＤの発現をみた結果、非組換え酵
母の場合に比して、そのｉＣＤの発現量は約４０倍に増
加した。(4) Expression of iCD (2) Furthermore, a presequence of the iCD gene (mitochondri)
al targeting pressure)
Is removed to obtain the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listings shown in Table 1, Table 2 and Table 3 below, which is ligated to the expression vector YRp1G prepared above,
As a result of producing recombinant DNA (YRp1G-iCD 2 ) and treating it in the same manner as described above and observing the expression of iCD, the expression amount of iCD was increased about 40 times as compared with the case of non-recombinant yeast. .
【００２７】[0027]
【表１】 [Table 1]
【００２８】[0028]
【表２】 [Table 2]
【００２９】[0029]
【表３】 [Table 3]
【００３０】（５）ｉＣＤの発現（３） ｉＣＤ遺伝子のプレ配列を除き、更にＮ末端のアミノ酸
がフェニルアラニンではなくアラニンになるように改変
することにより、下記の表４、表５、表６で示される配
列表の配列番号２に示されるＤＮＡ配列を得、これを先
に作製した発現ベクターＹＲｐ１Ｇへ連結して、組換え
ＤＮＡ（ＹＲｐ１Ｇ−ｉＣＤ3）を作製し、Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ５００へ移入した。この組換え
ＤＮＡを含むパン酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰ
Ｈ５００（ＹＲｐ１Ｇ−ｉＣＤ3）をフラスコ培養した
結果、非組換え酵母の場合に比して、そのｉＣＤの発現
量は約１００倍に増加した。(5) Expression of iCD (3) By removing the pre-sequence of the iCD gene and modifying it so that the N-terminal amino acid is alanine instead of phenylalanine, the following Tables 4, 5 and 6 are obtained. The DNA sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing shown was obtained and ligated to the expression vector YRp1G prepared above to prepare a recombinant DNA (YRp1G-iCD 3 ). cer
Transferred to Evisiae YPH500. The baker's yeast S. cerevisiae YP
As a result of flask culture of H500 (YRp1G-iCD 3 ), the expression level of iCD increased about 100 times as compared with the case of non-recombinant yeast.
【００３１】[0031]
【表４】 [Table 4]
【００３２】[0032]
【表５】 [Table 5]
【００３３】[0033]
【表６】 [Table 6]
【００３４】これらの組換えプラスミドによるイースト
ミトコンドリアｉＣＤの発現をまとめると、下記表７の
とおりである。The expression of yeast mitochondrial iCD by these recombinant plasmids is summarized in Table 7 below.
【００３５】[0035]
【表７】 [Table 7]
【００３６】（６）合成選択培地及び栄養培地による生
産 上記により作製した形質転換体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ ＹＰＨ５００（ＹＲｐ１Ｇ−ｉＣＤ1）及びＳ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ５００（ＹＲｐ１Ｇ−ｉＣ
Ｄ3）を用い、次のようにしてそれぞれ合成選択培地及
び栄養培地で培養し、ｉＣＤを製造した。(6) Production in synthetic selection medium and nutrient medium The transformant S. cerevisia
e YPH500 (YRp1G-iCD 1) and S. c
erevisiae YPH500 (YRp1G-iC
D 3) used were cultured in each synthetic selection medium and nutrient medium as follows, was prepared ICD.
【００３７】合成選択培地は、４％グルコース、０．８
％アルギニン、０．８５％カザミノ酸、０．２％アミノ
酸とヌクレオチドの混合物（ウラシルを含まないも
の）、０．６７％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂ
ａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ社、アミノ酸を含まないもの）、
０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）の組成からなる培
地を用いた。アミノ酸とヌクレオチドの混合物は、文献
（Ｒｏｓｅ Ｍ Ｄ，Ｗｉｎｓｔｏｎ Ｆ ＆Ｈｉｅｔｅ
ｒ Ｐ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ
ｍａｎｕａｌ，ｐｐ１７９−１８０，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓ
ｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９９０）に従って調製した。栄養培地は、
２％グルコース、２％大豆ペプトン（ＳＥ５０Ｍ，Ｄｅ
ｌｔｏｗｎ）、酵母エキス（オリエンタル酵母工業
（株））からなる培地を用いた。５０ｍＬの各培地を使
用し、温度３０℃で約８０時間培養して、菌体の増殖と
ｉＣＤ活性を測定した。菌体の増殖は培養液の６００ｎ
ｍでの吸光度（ＯＤ600）を測定して調べた。菌体抽出
液のｉＣＤ活性は、文献（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６
６（４），ｐｐ．２３３９−２３４５，１９９１）に従
って、３４０ｎｍでの吸光度の変化を測定することによ
って行った。酵素の１単位（１Ｕ）は、２５℃で１分間
当りに１μｍｏｌ ＮＡＤＰＨを増加させる酵素量と定
義する。菌体抽出液は、文献（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ
Ｍ，Ｂｒｅｎｔ Ｒ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ ＲＥ，Ｍｏｏ
ｒｅ Ｄ Ｄ，Ｓｅｉｄｍａｎ Ｊ Ｇ，Ｓｍｉｔｈ Ｊ
Ａ，Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，
ｕｎｉｔ １３，１３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏ
ｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７））に従
って、グラスビーズによって菌体を破砕して調製した。
結果を図８に示す。Synthetic selection medium is 4% glucose, 0.8
% Arginine, 0.85% casamino acid, 0.2% mixture of amino acids and nucleotides (without uracil), 0.67% yeast nitrogen b
ase (Difco, does not contain amino acids),
A medium having a composition of 0.1 M HEPES (pH 7.0) was used. Mixtures of amino acids and nucleotides are described in the literature (Rose MD, Winston F & Hiete.
r P: Methods in yeast gene
tics: a laboratory course
manual, pp179-180, Cold Spr
ing Harbor Laboratory Pres
s, Cold Spring Harbor, New
Prepared according to York (1990). The nutrient medium is
2% glucose, 2% soybean peptone (SE50M, De
used a medium containing yeast extract (Oriental Yeast Co., Ltd.). Using 50 mL of each medium, the cells were cultured at a temperature of 30 ° C. for about 80 hours, and the proliferation of cells and iCD activity were measured. Cell growth is 600n of culture
The absorbance at m (OD 600 ) was measured and examined. The iCD activity of the microbial cell extract is shown in the literature (The Journal o
f Biological Chemistry, 26
6 (4), pp. 2339-2345, 1991) by measuring the change in absorbance at 340 nm. One unit of enzyme (1 U) is defined as the amount of enzyme that increases 1 μmol NADPH per minute at 25 ° C. The bacterial cell extract is available in the literature (Ausubel F
M, Brent R, Kingston RE, Moo
re DD, Seidman J G, Smith J
A, Struhl K: Current proto
cols in molecular biology,
unit 13, 13, John Wiley & So
ns, Inc. , New York (1987)).
The results are shown in Fig. 8.
【００３８】上記結果から明らかなように、プレ配列を
切除したＤＮＡ断片を用いた組換え酵母は、プレ配列を
除去しないｉＣＤ遺伝子を用いて作製した組換え酵母に
比して、きわめて顕著なｉＣＤ発現量を示した。As is clear from the above results, the recombinant yeast using the DNA fragment with the pre-sequence excised is extremely remarkable as compared with the recombinant yeast produced using the iCD gene which does not remove the pre-sequence. The expression level was shown.
【００３９】（７）１６Ｌ容発酵槽による生産 上記により作製した形質転換体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ ＹＰＨ５００（ＹＲｐ１Ｇ−ｉＣＤ3）を用い、次
のようにしてｉＣＤを製造した。(7) Production in 16 L fermentor The transformant S. cerevisia
e YPH500 using (YRp1G-iCD 3), was prepared ICD as follows.
【００４０】前培養として合成選択培地（５０ｍＬ）で
２日間フラスコ培養した後、１６Ｌ容発酵槽（ＮＢＳ
Ｍｉｃｒｏｆｅｒｍ Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）を使用して
本培養を行なった。本培養は、酵母エキス（オリエンタ
ル酵母工業（株））４％、大豆ペプトン（ＳＥ５０Ｍ，
Ｄｅｌｔｏｗｎ）４％、グルコース２％からなる基本培
地（５．５Ｌ）を用いて、温度２８℃、攪拌速度４００
ｒｐｍ、通気速度５Ｌ／ｍｉｎという条件で行った。さ
らに、培養開始後１６時間目から９１時間目まで、大豆
ペプトン４％、グルコース１７．４％からなる添加培地
（４．５Ｌ）を１ｍｌ／ｍｉｎの速度で連続流加した
（図９）。その結果、１．６６ｋｇの湿菌体が得られ、
ダイノミルで菌体を破砕した抽出液のｉＣＤの比活性は
６．８Ｕ／ｍｇ、総活性は４２６，０００Ｕであった。
また、精製ｉＣＤの比活性を１１４．１Ｕ／ｍｇとする
と、培養液１Ｌ当たりのｉＣＤの発現量は３７３ｍｇと
推定された。As a preculture, a flask was cultured in a synthetic selection medium (50 mL) for 2 days, and then a 16 L fermenter (NBS was used).
Main culture was performed using a Microferm Fermentor). The main culture was 4% yeast extract (Oriental Yeast Co., Ltd.), soybean peptone (SE50M,
Using basal medium (5.5 L) consisting of 4% Delta) and 2% glucose, temperature 28 ° C., stirring speed 400
It was carried out under the conditions of rpm and aeration rate of 5 L / min. Furthermore, from 16 hours to 91 hours after the start of culture, an additive medium (4.5 L) consisting of 4% soybean peptone and 17.4% glucose was continuously fed at a rate of 1 ml / min (FIG. 9). As a result, 1.66 kg of wet cells were obtained,
The iCD specific activity of the extract obtained by crushing the cells with Dynomill was 6.8 U / mg, and the total activity was 426,000 U.
Further, when the specific activity of the purified iCD was 114.1 U / mg, the expression level of iCD per 1 L of the culture solution was estimated to be 373 mg.
【００４１】その結果、従来よりも簡単に高純度の精製
ｉＣＤを調製することができ、ｉＣＤの製造工程並びに
精製工程の大幅な省力化が可能となった。As a result, it is possible to prepare a highly purified purified iCD more easily than ever before, and it is possible to greatly reduce the labor of the manufacturing process and the purification process of the iCD.
【００４２】[0042]
【発明の効果】生体内において前駆体タンパク質が活性
型に変わるために必須の配列であるプレ配列をあえて切
除することにより、タンパク質の発現を大幅に増加する
ことができる。EFFECTS OF THE INVENTION By intentionally excising a pre-sequence which is an essential sequence for changing a precursor protein into an active form in vivo, protein expression can be significantly increased.
【００４３】また、単にプレ配列を切除するだけでな
く、アミノ末端のアミノ酸（開始コドンの次のアミノ
酸）を改変することにより、更にタンパク質の発現を大
幅に増強することができる。Further, not only excision of the pre-sequence but also modification of the amino-terminal amino acid (amino acid next to the start codon) can significantly enhance the protein expression.
【００４４】したがって本発明によれば、タンパク質の
収率の増加、生産設備のスケールダウン、生産工程の短
縮が図られ、高純度のタンパク質を大量に生産すること
が可能となる。特に、例えば、組換えＤＮＡ（ＹＲｐ１
Ｇ−ｉＣＤ3）を使用した場合、ｉＣＤの発現量は従来
の５０〜１００倍にも達する。Therefore, according to the present invention, it is possible to increase the yield of protein, scale down the production facility, and shorten the production process, and it is possible to mass-produce high-purity protein. In particular, for example, recombinant DNA (YRp1
When G-iCD 3 ) is used, the expression level of iCD reaches 50 to 100 times that of the conventional method.
【図１】発現ベクターＹＲｐ１Ｇの制限酵素地図を示
す。FIG. 1 shows a restriction map of the expression vector YRp1G.
【図２】発現ベクターＹＲｐ１Ｇの全塩基配列（５７６
３ｂｐ）その１を示す。FIG. 2 is the entire nucleotide sequence of the expression vector YRp1G (576
3 bp) No. 1 is shown.
【図３】同その２を示す。FIG. 3 shows the same part 2.
【図４】ｉＣＤ遺伝子の制限酵素地図を示す。FIG. 4 shows a restriction map of the iCD gene.
【図５】ｉＣＤ遺伝子の全塩基配列とアミノ酸配列その
１を示す。FIG. 5 shows the entire nucleotide sequence and amino acid sequence 1 of the iCD gene.
【図６】同その２を示す。FIG. 6 shows the second part.
【図７】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ５００（Ｙ
Ｒｐ１Ｇ−ｉＣＤ1）によるｉＣＤの生産を示す。FIG. 7: S. cerevisiae YPH500 (Y
2 shows iCD production by Rp1G-iCD 1 ).
【図８】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ５００（Ｙ
Ｒｐ１Ｇ−ｉＣＤ1）及び同（ＹＲｐ１Ｇ−ｉＣＤ3）に
よる合成選択培地及び栄養培地におけるｉＣＤの生産を
示す。FIG. 8: S. cerevisiae YPH500 (Y
1 shows production of iCD by Rp1G-iCD 1 ) and the same (YRp1G-iCD 3 ) in a synthetic selection medium and a nutrient medium.
【図９】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ５００（Ｙ
Ｒｐ１Ｇ−ｉＣＤ3）によるｉＣＤの生産を示す。FIG. 9: S. cerevisiae YPH500 (Y
3 shows iCD production by Rp1G-iCD 3 ).
【図１０】ＰＣＲに用いたプライマー配列を示す。FIG. 10 shows the primer sequences used in PCR.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:865） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI technical display location C12R 1: 865) (C12N 9/04 C12R 1: 865)
Claims (18)
遺伝子を用いることを特徴とするタンパク質の発現増強
方法。1. A method for enhancing protein expression, which comprises using a gene obtained by removing a pre-sequence portion from a structural gene.
更に開始コドンの次のアミノ酸をコードする塩基配列を
改変した遺伝子を用いることを特徴とするタンパク質の
発現増強方法。2. A presequence portion is removed from a structural gene,
A method for enhancing protein expression, which comprises using a gene having a modified base sequence encoding the amino acid next to the start codon.
ク質の遺伝子配列の中から、プレ配列を除いたＤＮＡ断
片をプラスミドに連結し、更に宿主細胞に導入した後、
これを培養することによってタンパク質を発現させるこ
とを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の発現増強
方法。3. A DNA fragment from which a pre-sequence has been removed from the gene sequence of the precursor protein which is active in organelles is ligated to a plasmid, which is then introduced into a host cell,
The method for enhancing protein expression according to claim 1, wherein the protein is expressed by culturing the protein.
ク質の遺伝子配列の中からプレ配列を除き、開始コドン
の次のアミノ酸を改変したＤＮＡ断片をプラスミドに連
結し、更に宿主細胞に導入した後、これを培養すること
によってタンパク質を発現させることを特徴とする請求
項２に記載のタンパク質の発現増強方法。4. After removing a pre-sequence from the gene sequence of the precursor protein which is active in organelles, ligating a DNA fragment in which the amino acid next to the start codon is modified to a plasmid, and further introducing it into a host cell, The protein expression enhancing method according to claim 2, wherein the protein is expressed by culturing the protein.
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法。5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the host cell is yeast.
クスタンパク質であることを特徴とする請求項１〜請求
項５のいずれか１項に記載の方法。6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the protein is a mitochondrial matrix protein.
ラーゼ、アコニターゼ、イソクエン酸脱水素酵素（ｉＣ
Ｄ）、Ｌ−リンゴ酸脱水素酵素、α−ケトグルタル酸脱
水素酵素、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素、アスパラギン
酸トランスアミナーゼ、及びδ−アミノレブリン酸合成
酵素からなる群から選ばれるものであることを特徴とす
る請求項６に記載の方法。7. The protein is citrate synthase, fumarase, aconitase, isocitrate dehydrogenase (iC).
D), L-malate dehydrogenase, α-ketoglutarate dehydrogenase, L-glutamate dehydrogenase, aspartate transaminase, and δ-aminolevulinate synthase. The method according to claim 6, wherein
間部（膜間腔）、及び／又は外膜タンパク質であること
を特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載
の方法。8. The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the protein is a mitochondrial inner membrane, an intermembrane portion (intermembrane space), and / or an outer membrane protein. .
Ｖ、チトクロムｃ1、チトクロムｂｃ1複合体；チトクロ
ムｂ2、アデニル酸キナーゼ、ヌクレオチド二リン酸キ
ナーゼ、チトクロムｃペルオキシダーゼ；及び７０ｋＤ
ａ蛋白質からなる群から選ばれるものであることを特徴
とする請求項８に記載の方法。9. The protein is cytochrome oxidase I.
V, cytochrome c 1 , cytochrome bc 1 complex; cytochrome b 2 , adenylate kinase, nucleotide diphosphate kinase, cytochrome c peroxidase; and 70 kD
The method according to claim 8, wherein the method is selected from the group consisting of a protein.
ことを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか１項に
記載の方法。10. The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the protein is a chloroplast protein.
ド、チラコイド膜、及び／又はチラコイドのストローマ
側表面に局在するタンパク質であることを特徴とする請
求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の方法。11. The protein according to claim 1, wherein the protein is a protein localized on the stroma-side surface of stroma, thylakoid, thylakoid membrane, and / or thylakoid. Method.
ペルオキシソームタンパク質であることを特徴とする請
求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の方法。12. The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the protein is a nuclear protein and / or a peroxisomal protein.
ジ体タンパク質、リソソームタンパク質、及び／又は液
胞タンパク質であることを特徴とする請求項１〜請求項
６のいずれか１項に記載の方法。13. The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the protein is an endoplasmic reticulum protein, a Golgi apparatus protein, a lysosomal protein, and / or a vacuolar protein.
プラスミドＹＲｐ１Ｇ。14. A plasmid YRp1G having the restriction enzyme map shown in FIG.
前駆体ｉＣＤのプレ配列を除いた配列表の配列番号１に
示す遺伝子の配列を組み込んだプラスミドＹＲｐ１Ｇ−
ｉＣＤ2。15. Having the restriction enzyme map shown in FIG. 1,
Plasmid YRp1G-incorporating the sequence of the gene shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing excluding the precursor iCD precursor sequence
iCD 2 .
前駆体ｉＣＤのプレ配列を除き、開始コドンの次のアミ
ノ酸を改変した配列番号２に示す遺伝子の配列を組み込
んだプラスミドＹＲｐ１Ｇ−ｉＣＤ3。16. Having the restriction enzyme map shown in FIG. 1,
Precursor except presequence of ICD, plasmid YRp1G-ICD 3 incorporating the sequence of the gene shown in SEQ ID NO: 2 obtained by modifying the following amino acid initiation codon.
はＹＲｐ１Ｇ−ｉＣＤ3を導入したサッカロミセス属菌
形質転換体。17. Saccharomyces genus transformant transformed with a plasmid YRp1G-ICD 2 or YRp1G-ICD 3.
はＹＲｐ１Ｇ−ｉＣＤ3を導入したサッカロミセス属菌
形質転換体を培養することによってｉＣＤを発現させる
ことを特徴とするｉＣＤの製造方法。18. A method for producing iCD, which comprises expressing the iCD by culturing a Saccharomyces bacterium transformant introduced with the plasmid YRp1G-iCD 2 or YRp1G-iCD 3 .
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6107406A JPH07289267A (en) | 1994-04-25 | 1994-04-25 | Method for enhancing expression |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6107406A JPH07289267A (en) | 1994-04-25 | 1994-04-25 | Method for enhancing expression |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07289267A true JPH07289267A (en) | 1995-11-07 |
Family
ID=14458345
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6107406A Pending JPH07289267A (en) | 1994-04-25 | 1994-04-25 | Method for enhancing expression |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07289267A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6387683B1 (en) | 1997-02-07 | 2002-05-14 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Recombinant yeast PDI and process for production thereof |
| JP2009510998A (en) * | 2005-07-22 | 2009-03-19 | カロビオス・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | Antibody secretion from bacteria without signal peptide |
-
1994
- 1994-04-25 JP JP6107406A patent/JPH07289267A/en active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6387683B1 (en) | 1997-02-07 | 2002-05-14 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Recombinant yeast PDI and process for production thereof |
| JP2009510998A (en) * | 2005-07-22 | 2009-03-19 | カロビオス・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | Antibody secretion from bacteria without signal peptide |
| US9127046B2 (en) | 2005-07-22 | 2015-09-08 | Kalobios Pharmaceuticals, Inc. | Secretion of antibodies without signal peptides from bacteria |
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