JPH07274985A - Ｄ−γ−メチルロイシンの製造法 - Google Patents
Ｄ−γ−メチルロイシンの製造法Info
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- JPH07274985A JPH07274985A JP7067794A JP7067794A JPH07274985A JP H07274985 A JPH07274985 A JP H07274985A JP 7067794 A JP7067794 A JP 7067794A JP 7067794 A JP7067794 A JP 7067794A JP H07274985 A JPH07274985 A JP H07274985A
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- hydantoin
- dimethylpropyl
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- microorganism
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ５−（２，２−ジメチルプロピル）ヒダント
インに、ヒダントイン環を不斉的に開裂加水分解する能
力を有する微生物の菌体又はその菌体処理物を水性媒体
中で作用させることによりＤ−γ−メチルロイシンを製
造する。該微生物としては、アグロバクテリウム属（Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、
アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、オ
ーレオバクテリウム属（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）等に
属する微生物が挙げられる。 【効果】 本発明の方法によれば、従来の発酵法では得
られなかった非天然型のＤ−γ−メチルロイシンが得ら
れるだけでなく、生物化学的に効率よくＤ−γ−メチル
ロイシンを製造することができる。
インに、ヒダントイン環を不斉的に開裂加水分解する能
力を有する微生物の菌体又はその菌体処理物を水性媒体
中で作用させることによりＤ−γ−メチルロイシンを製
造する。該微生物としては、アグロバクテリウム属（Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、
アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、オ
ーレオバクテリウム属（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）等に
属する微生物が挙げられる。 【効果】 本発明の方法によれば、従来の発酵法では得
られなかった非天然型のＤ−γ−メチルロイシンが得ら
れるだけでなく、生物化学的に効率よくＤ−γ−メチル
ロイシンを製造することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＤ−γ−メチルロイシン
の製造法に関し、詳細には医・農薬等の合成中間体とし
て有用なＤ−γ−メチルロイシンを生物化学的に製造す
る方法に関する。
の製造法に関し、詳細には医・農薬等の合成中間体とし
て有用なＤ−γ−メチルロイシンを生物化学的に製造す
る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】天然に
存在する光学活性アミノ酸の多くは、微生物を用いた発
酵法や天然原料からの抽出法により製造されている。し
かしながらＤ−γ−メチルロイシンは非天然型アミノ酸
であるため、従来のような発酵法や抽出法によって製造
されていなかった。
存在する光学活性アミノ酸の多くは、微生物を用いた発
酵法や天然原料からの抽出法により製造されている。し
かしながらＤ−γ−メチルロイシンは非天然型アミノ酸
であるため、従来のような発酵法や抽出法によって製造
されていなかった。
【０００３】一方、光学活性アミノ酸を製造する方法と
して、有機化学的合成により製造したＤＬ−アミノ酸を
光学分割する方法がよく知られている（Ｂｕｌｌ．Ａｇ
ｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐ．，２１，３０４（１９
５７）；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６，６０４
５（１９５４）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１８８，
６５７（１９５１））。しかし、ＤＬ−アミノ酸の光学
分割は操作が煩雑なものになり、収率も低くなると言う
欠点がある。
して、有機化学的合成により製造したＤＬ−アミノ酸を
光学分割する方法がよく知られている（Ｂｕｌｌ．Ａｇ
ｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐ．，２１，３０４（１９
５７）；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６，６０４
５（１９５４）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１８８，
６５７（１９５１））。しかし、ＤＬ−アミノ酸の光学
分割は操作が煩雑なものになり、収率も低くなると言う
欠点がある。
【０００４】また、Ｄ−アミノ酸を製造する方法とし
て、ＤＬ体の５−置換ヒダントイン類にヒダントイン環
を不斉的に開裂加水分解する能力を有する、シュードモ
ナス属等の微生物の菌体、固定化菌体又は菌体処理物を
作用させることによりＤ−アミノ酸を得る方法が知られ
ているが、主に天然型のアミノ酸のＤ体に関してのみで
あった（特開昭５４−８９０８８号；同５５−１１５６
９号；同５５−１５３５９５号各公報等）。
て、ＤＬ体の５−置換ヒダントイン類にヒダントイン環
を不斉的に開裂加水分解する能力を有する、シュードモ
ナス属等の微生物の菌体、固定化菌体又は菌体処理物を
作用させることによりＤ−アミノ酸を得る方法が知られ
ているが、主に天然型のアミノ酸のＤ体に関してのみで
あった（特開昭５４−８９０８８号；同５５−１１５６
９号；同５５−１５３５９５号各公報等）。
【０００５】
【問題点を解決するための手段】本発明者らは効率よく
Ｄ−γ−メチルロイシンを製造する方法を見い出すべく
検討を重ねてきた結果、５−（２，２−ジメチルプロピ
ル）ヒダントインを基質として生物化学的に加水分解す
ることにより目的とするＤ−γ−メチルロイシンを製造
できることを初めて見い出し、本発明を完成するに至っ
た。
Ｄ−γ−メチルロイシンを製造する方法を見い出すべく
検討を重ねてきた結果、５−（２，２−ジメチルプロピ
ル）ヒダントインを基質として生物化学的に加水分解す
ることにより目的とするＤ−γ−メチルロイシンを製造
できることを初めて見い出し、本発明を完成するに至っ
た。
【０００６】即ち本発明の要旨は、５−（２，２−ジメ
チルプロピル）ヒダントインに、ヒダントイン環を不斉
的に開裂加水分解する能力を有する微生物の菌体又はそ
の菌体処理物を水性媒体中で作用させることを特徴とす
る、Ｄ−γ−メチルロイシンの製造法に存する。以下、
本発明につき詳細に説明する。
チルプロピル）ヒダントインに、ヒダントイン環を不斉
的に開裂加水分解する能力を有する微生物の菌体又はそ
の菌体処理物を水性媒体中で作用させることを特徴とす
る、Ｄ−γ−メチルロイシンの製造法に存する。以下、
本発明につき詳細に説明する。
【０００７】本発明において基質となる５−（２，２−
ジメチルプロピル）ヒダントインは、ＤＬ体、Ｌ体又は
Ｄ体のいずれのものでも構わない。即ちそれは、反応を
触媒する微生物の菌体内酵素が５−（２，２−ジメチル
プロピル）ヒダントインのＤ体のみに選択的に作用し
て、そのヒダントイン環を開裂加水分解するからであ
る。加水分解されないＬ体は反応媒体中でラセミ化され
るため、反応系には実質的にＤ体が常に供給されること
になる。従って本発明の反応を式で示すと、以下のよう
になる。
ジメチルプロピル）ヒダントインは、ＤＬ体、Ｌ体又は
Ｄ体のいずれのものでも構わない。即ちそれは、反応を
触媒する微生物の菌体内酵素が５−（２，２−ジメチル
プロピル）ヒダントインのＤ体のみに選択的に作用し
て、そのヒダントイン環を開裂加水分解するからであ
る。加水分解されないＬ体は反応媒体中でラセミ化され
るため、反応系には実質的にＤ体が常に供給されること
になる。従って本発明の反応を式で示すと、以下のよう
になる。
【０００８】
【化１】
【０００９】本発明で使用される微生物は、５−（２，
２−ジメチルプロピル）ヒダントインのＤ体のみに選択
的に作用して、それを開裂加水分解してＤ−γ−メチル
ロイシンに変換する能力を有するものであれば特に制限
はされない。かかる微生物としては、アグロバクテリウ
ム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス
属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）、オーレオバクテリウム属（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ）に属する微生物等が挙げられる。
２−ジメチルプロピル）ヒダントインのＤ体のみに選択
的に作用して、それを開裂加水分解してＤ−γ−メチル
ロイシンに変換する能力を有するものであれば特に制限
はされない。かかる微生物としては、アグロバクテリウ
ム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス
属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）、オーレオバクテリウム属（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ）に属する微生物等が挙げられる。
【００１０】アグロバクテリウム属に属する微生物とし
ては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔ
ｅｒ等が挙げられ、具体的にはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ ＮＲＲＬＢ １１２９
１（Agricultural Research Service Culture Collecti
on）等が挙げられる。シュードモナス属に属する微生物
としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈｙｄａｎｔｏｉ
ｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉ
ｎｕｔａ等が挙げられ、具体的にはＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＪＣＭ ２７９２（Japan co
llection of Microorganisms：理化学研究所微生物系統
保存施設）等が挙げられる。
ては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔ
ｅｒ等が挙げられ、具体的にはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ ＮＲＲＬＢ １１２９
１（Agricultural Research Service Culture Collecti
on）等が挙げられる。シュードモナス属に属する微生物
としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈｙｄａｎｔｏｉ
ｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉ
ｎｕｔａ等が挙げられ、具体的にはＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＪＣＭ ２７９２（Japan co
llection of Microorganisms：理化学研究所微生物系統
保存施設）等が挙げられる。
【００１１】バチルス属に属する微生物としては、Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ等が挙げられ、具体的にはＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＩＦＯ ３３３１（財団
法人 発酵研究所）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎ
ｉｆｏｒｍｉｓ ＩＦＯ １２２００等が挙げられる。
ｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ等が挙げられ、具体的にはＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＩＦＯ ３３３１（財団
法人 発酵研究所）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎ
ｉｆｏｒｍｉｓ ＩＦＯ １２２００等が挙げられる。
【００１２】アルカリゲネス属に属する微生物として
は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ａｑｕａｍａｒｉｎｕ
ｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ等が
挙げられ、具体的にはＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ａｑｕ
ａｍａｒｉｎｕｓ ＦＥＲＭ Ｐ−４２２９（工業技術
院生命工学工業技術研究所）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ ＤＳＭ ４２８（Deutsche Samml
ung von Mikroorganismen und Zullkulturen GmbH, Bra
unschweig, FRG）等が挙げられる。
は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ａｑｕａｍａｒｉｎｕ
ｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ等が
挙げられ、具体的にはＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ａｑｕ
ａｍａｒｉｎｕｓ ＦＥＲＭ Ｐ−４２２９（工業技術
院生命工学工業技術研究所）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ ＤＳＭ ４２８（Deutsche Samml
ung von Mikroorganismen und Zullkulturen GmbH, Bra
unschweig, FRG）等が挙げられる。
【００１３】アルスロバクター属に属する微生物として
は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐ
ｏｉｅｔｅｓ等が挙げられ、具体的にはＡｒｔｈｒｏｂ
ａｃｔｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ ＪＣ
Ｍ ２５２２等が挙げられる。オーレオバクテリウム属
に属する微生物としては、Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｅｓｔａｃｅｕｍ等が挙げられ、具体的にはＡｕ
ｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔａｃｅｕｍ ＪＣ
Ｍ １３５３等が挙げられる。
は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐ
ｏｉｅｔｅｓ等が挙げられ、具体的にはＡｒｔｈｒｏｂ
ａｃｔｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ ＪＣ
Ｍ ２５２２等が挙げられる。オーレオバクテリウム属
に属する微生物としては、Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｅｓｔａｃｅｕｍ等が挙げられ、具体的にはＡｕ
ｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔａｃｅｕｍ ＪＣ
Ｍ １３５３等が挙げられる。
【００１４】ロドコッカス属に属する微生物としては、
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ等
が挙げられ、具体的にはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒ
ｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＩＦＯ １２３２０、Ｒｈｏｄ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＩＦＭ
０１６５（Research Institute for Chemobiodynamics,
Chiba University, Chiba, JAPAN:千葉大学真核微生物
研究センター）等が挙げられる。
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ等
が挙げられ、具体的にはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒ
ｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＩＦＯ １２３２０、Ｒｈｏｄ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＩＦＭ
０１６５（Research Institute for Chemobiodynamics,
Chiba University, Chiba, JAPAN:千葉大学真核微生物
研究センター）等が挙げられる。
【００１５】本発明において、これらの微生物は、予め
ヒダントイン類を含む培地中で培養させたもの（前培養
したもの）が、ヒダントイン環の不斉的解裂加水分解能
が増強されているので好ましいが、それに限るものでは
ない。その際の培地としては、通常の炭素源、窒素源、
無機イオンを含有する通常の培地が使用できる。さらに
ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加するこ
ともできる。
ヒダントイン類を含む培地中で培養させたもの（前培養
したもの）が、ヒダントイン環の不斉的解裂加水分解能
が増強されているので好ましいが、それに限るものでは
ない。その際の培地としては、通常の炭素源、窒素源、
無機イオンを含有する通常の培地が使用できる。さらに
ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加するこ
ともできる。
【００１６】炭素源としてはグルコース、シュクロース
などの炭水化物、フマル酸、リンゴ酸などの有機酸、ア
ルコール類その他が適宜使用されるが、主にグルコース
が０．１−５％で用いられ、好ましくは０．５−２％で
ある。窒素源としては、アンモニア塩や硝酸塩といった
無機窒素源、あるいは酵母エキスやペプトンといった有
機窒素源が適宜使用される。本発明においては主に酵母
エキスが０．１−５％で用いられ、好ましくは０．３−
１％である。
などの炭水化物、フマル酸、リンゴ酸などの有機酸、ア
ルコール類その他が適宜使用されるが、主にグルコース
が０．１−５％で用いられ、好ましくは０．５−２％で
ある。窒素源としては、アンモニア塩や硝酸塩といった
無機窒素源、あるいは酵母エキスやペプトンといった有
機窒素源が適宜使用される。本発明においては主に酵母
エキスが０．１−５％で用いられ、好ましくは０．３−
１％である。
【００１７】無機イオンとしては、マグネシウムイオ
ン、燐酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、その他が
必要に応じて適宜使用される。本発明においては、主に
硫酸マグネシウム０．０１−０．１％、燐酸二水素カリ
ウム０．０５−０．５％、燐酸水素二カリウム０．１−
１％、硫酸マンガン０．００５−０．０５％が用いられ
る。
ン、燐酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、その他が
必要に応じて適宜使用される。本発明においては、主に
硫酸マグネシウム０．０１−０．１％、燐酸二水素カリ
ウム０．０５−０．５％、燐酸水素二カリウム０．１−
１％、硫酸マンガン０．００５−０．０５％が用いられ
る。
【００１８】また反応を触媒する酵素の誘導物質として
添加する５−置換ヒダントイン類としては、メチルヒダ
ントイン、イソプロピルヒダントイン、ヒダントイン、
メチルチオエチルヒダントイン、５−（２，２−ジメチ
ルプロピル）ヒダントイン等が使用される。好ましく
は、主にメチルヒダントイン又は５−（２，２−ジメチ
ルプロピル）ヒダントイン等が０．００１−０．５％、
より好ましくは０．００５−０．２％で使用される。
添加する５−置換ヒダントイン類としては、メチルヒダ
ントイン、イソプロピルヒダントイン、ヒダントイン、
メチルチオエチルヒダントイン、５−（２，２−ジメチ
ルプロピル）ヒダントイン等が使用される。好ましく
は、主にメチルヒダントイン又は５−（２，２−ジメチ
ルプロピル）ヒダントイン等が０．００１−０．５％、
より好ましくは０．００５−０．２％で使用される。
【００１９】前培養は、上記の培地中で２５−４０℃、
１２−２４時間程度培養することが好ましい。前記微生
物を培養する際には、５−置換ヒダントイン類を初めか
ら含有した培地で培養してもよいし、培養途中から添加
してもよいし、全く添加しなくてもよい。培養は好気条
件下、ｐＨ４−８、温度２５−４０℃の範囲で制御しつ
つ行うと望ましい結果が得られる。
１２−２４時間程度培養することが好ましい。前記微生
物を培養する際には、５−置換ヒダントイン類を初めか
ら含有した培地で培養してもよいし、培養途中から添加
してもよいし、全く添加しなくてもよい。培養は好気条
件下、ｐＨ４−８、温度２５−４０℃の範囲で制御しつ
つ行うと望ましい結果が得られる。
【００２０】本発明における「菌体処理物」とは、微生
物菌体の抽出物や微生物菌体の磨砕物、さらにそれらを
硫安分別、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等
の公知の方法により分離精製したものを意味し、本発明
においては、５−（２，２−ジメチルプロピル）ヒダン
トインに微生物菌体自身（生菌体または乾燥菌体）を作
用させてもよいし、あるいは菌体処理物を作用させても
よい。
物菌体の抽出物や微生物菌体の磨砕物、さらにそれらを
硫安分別、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等
の公知の方法により分離精製したものを意味し、本発明
においては、５−（２，２−ジメチルプロピル）ヒダン
トインに微生物菌体自身（生菌体または乾燥菌体）を作
用させてもよいし、あるいは菌体処理物を作用させても
よい。
【００２１】また上記のようにして増殖させた菌体また
はその菌体処理物を、κ−カラゲーナン、アルギン酸、
寒天、ポリアクリルアミドゲル等のゲルで包括固定化し
た後、５−（２，２−ジメチルプロピル）ヒダントイン
と反応させることも可能である。菌体自身を作用させる
場合、上記のようにして十分に菌を生育させた後、菌体
を分離し洗浄後、水あるいは緩衝液に懸濁させ、５−
（２，２−ジメチルプロピル）ヒダントインを飽和濃度
以上添加する。５−（２，２−ジメチルプロピル）ヒダ
ントインは水性媒体に対する溶解度が低いが、反応の進
行とともに溶解されて行く。通常は０．１−５％の範囲
で添加するが、より好ましくは０．２−３％である。添
加後、１０−５０℃、好ましくは２５−４０℃の温度
で、ｐＨは４．０−１０．０、好ましくは７．０−９．
０で、窒素置換をした後、１−１４日、通常は１−７日
程度反応を行う。
はその菌体処理物を、κ−カラゲーナン、アルギン酸、
寒天、ポリアクリルアミドゲル等のゲルで包括固定化し
た後、５−（２，２−ジメチルプロピル）ヒダントイン
と反応させることも可能である。菌体自身を作用させる
場合、上記のようにして十分に菌を生育させた後、菌体
を分離し洗浄後、水あるいは緩衝液に懸濁させ、５−
（２，２−ジメチルプロピル）ヒダントインを飽和濃度
以上添加する。５−（２，２−ジメチルプロピル）ヒダ
ントインは水性媒体に対する溶解度が低いが、反応の進
行とともに溶解されて行く。通常は０．１−５％の範囲
で添加するが、より好ましくは０．２−３％である。添
加後、１０−５０℃、好ましくは２５−４０℃の温度
で、ｐＨは４．０−１０．０、好ましくは７．０−９．
０で、窒素置換をした後、１−１４日、通常は１−７日
程度反応を行う。
【００２２】菌体の処理物を作用させる場合、タンパク
質重量で１０−１０００ｍｇ程度の菌体抽質物または菌
体磨砕物を含む０．０１−１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７−
９）等の溶液に、５−（２，２−ジメチルプロピル）ヒ
ダントインを上記範囲で添加、反応させる。微生物菌体
またはその菌体処理物を固定化した場合は、上記の条件
下で攪拌型反応槽内で５−（２，２−ジメチルプロピ
ル）ヒダントインと反応させる。
質重量で１０−１０００ｍｇ程度の菌体抽質物または菌
体磨砕物を含む０．０１−１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７−
９）等の溶液に、５−（２，２−ジメチルプロピル）ヒ
ダントインを上記範囲で添加、反応させる。微生物菌体
またはその菌体処理物を固定化した場合は、上記の条件
下で攪拌型反応槽内で５−（２，２−ジメチルプロピ
ル）ヒダントインと反応させる。
【００２３】尚、本発明でいう水性媒体とは、水または
燐酸バッファー等の通常使用し得る緩衝液を意味する。
かかる水性媒体は、基質となる５−（２，２−ジメチル
プロピル）ヒダントインに対して過剰量存在することが
望ましい。かくして得られるＤ−γ−メチルロイシン
は、反応物から公知の方法、例えば酸による沈澱、ある
いはＯＤＳ樹脂などによるカラムクロマトグラフィー等
で精製することができる。
燐酸バッファー等の通常使用し得る緩衝液を意味する。
かかる水性媒体は、基質となる５−（２，２−ジメチル
プロピル）ヒダントインに対して過剰量存在することが
望ましい。かくして得られるＤ−γ−メチルロイシン
は、反応物から公知の方法、例えば酸による沈澱、ある
いはＯＤＳ樹脂などによるカラムクロマトグラフィー等
で精製することができる。
【００２４】前述したように、本発明によって得られる
Ｄ−γ−メチルロイシンは、医農薬の合成中間体等とし
て有用な物質である。
Ｄ−γ−メチルロイシンは、医農薬の合成中間体等とし
て有用な物質である。
【００２５】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、その要旨を越えない限り以下の実施例に限定
されるものではない。
明するが、その要旨を越えない限り以下の実施例に限定
されるものではない。
【００２６】実施例１−２ 酵母エキス３ｇ、グルコース１０ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ３
ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ５００ｍｇ、ＭｎＳ
Ｏ4 １０ｍｇ及び５−メチルヒダントイン ２ｇを水１
Ｌに含有する培地をへそ付き三角フラスコ１０本に満た
し、１２０℃において２０分間殺菌した。３０℃に冷却
した後に、普通寒天培地上で２４時間培養したＡｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ ＮＲＲ
ＬＢ １１２９１（実施例１）またはＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＪＣＭ２７９２（実施例
２）を１白金耳接種し、３０℃、２０時間、１６０ｒｐ
ｍのロータリーシェーカーで培養した。２０時間後培養
物を回収し、菌体を遠心分離によって分離した。分離し
た菌体をさらに０．１モル燐酸バッフアー（ｐＨ８．
０）に懸濁洗浄し、遠心分離によって分離し、休止菌体
を得た。１００ｍｌ容サンプル瓶に５０ｍｌになるよう
にバッファーに懸濁した休止菌体を入れ、５−（２，２
−ジメチルプロピル）ヒダントインを１ｇ添加した。サ
ンプル瓶を窒素置換したのちに、蓋を閉め、３０℃にて
攪拌した。途中発生するアンモニアガスを抜き、窒素置
換しながら反応させた。７日間後反応溶液を取り出し、
遠心分離によって菌体と反応上清とに分離した。上清を
シリカゲルのＴＬＣおよびカイラルプレート（Ｍｅｒｃ
ｋ１４１０１）によって調べ、Ｄ−γ−メチルロイシン
の生成を確認した。またＨＰＬＣにて定量を行った。結
果を下記表１に示す。
ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ５００ｍｇ、ＭｎＳ
Ｏ4 １０ｍｇ及び５−メチルヒダントイン ２ｇを水１
Ｌに含有する培地をへそ付き三角フラスコ１０本に満た
し、１２０℃において２０分間殺菌した。３０℃に冷却
した後に、普通寒天培地上で２４時間培養したＡｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ ＮＲＲ
ＬＢ １１２９１（実施例１）またはＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＪＣＭ２７９２（実施例
２）を１白金耳接種し、３０℃、２０時間、１６０ｒｐ
ｍのロータリーシェーカーで培養した。２０時間後培養
物を回収し、菌体を遠心分離によって分離した。分離し
た菌体をさらに０．１モル燐酸バッフアー（ｐＨ８．
０）に懸濁洗浄し、遠心分離によって分離し、休止菌体
を得た。１００ｍｌ容サンプル瓶に５０ｍｌになるよう
にバッファーに懸濁した休止菌体を入れ、５−（２，２
−ジメチルプロピル）ヒダントインを１ｇ添加した。サ
ンプル瓶を窒素置換したのちに、蓋を閉め、３０℃にて
攪拌した。途中発生するアンモニアガスを抜き、窒素置
換しながら反応させた。７日間後反応溶液を取り出し、
遠心分離によって菌体と反応上清とに分離した。上清を
シリカゲルのＴＬＣおよびカイラルプレート（Ｍｅｒｃ
ｋ１４１０１）によって調べ、Ｄ−γ−メチルロイシン
の生成を確認した。またＨＰＬＣにて定量を行った。結
果を下記表１に示す。
【００２７】
【表１】 表１ ────────────────────────────────── Ｄ−γ−メチルロイシン生成量（ｇ／ｌ） 光学純度（％） ────────────────────────────────── 実施例１ １０．３ ９８ 実施例２ ０．６５ ９８ ──────────────────────────────────
【００２８】実施例３Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ
ＮＲＲＬＢ １１２９１を用いて同様に反応を行った
後、反応上清に水飽和したフェノールを加え除タンパク
した後、クロロホルムを用いてフェノールを取り除き、
Ｄ−γ−メチルロイシンを含んだ水層画分を得た。これ
を濃縮乾固した後エタノールを加え、副生成物を除去し
てＤ−γ−メチルロイシンの結晶を０．２ｇ得た。 1Ｈ
−ＮＭＲ及び比旋光度の結果を以下に示す。
ＮＲＲＬＢ １１２９１を用いて同様に反応を行った
後、反応上清に水飽和したフェノールを加え除タンパク
した後、クロロホルムを用いてフェノールを取り除き、
Ｄ−γ−メチルロイシンを含んだ水層画分を得た。これ
を濃縮乾固した後エタノールを加え、副生成物を除去し
てＤ−γ−メチルロイシンの結晶を０．２ｇ得た。 1Ｈ
−ＮＭＲ及び比旋光度の結果を以下に示す。
【００２９】
【表２】 1Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＤＭＳＯ−ｄ6 ，２５０ＭＨｚ） δ＝３．０７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，３．６Ｈｚ） １．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．５，３．６Ｈｚ） １．３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．５，１８．２Ｈｚ） ０．９１（９Ｈ，ｓ） 比旋光度 ＋１０．２
【００３０】実施例４ 実施例１と同様の培地１０ｍｌを２１φの試験管に入れ
て殺菌し、冷却した後下記表２に示す菌を１白金耳植菌
し、３０℃で２４時間培養を行い、同様にして休止菌体
を得た。５−（２，２−ジメチルプロピル）ヒダントイ
ンを５ｍｇ、リン酸バッファーを０．５ｍｌ及び休止菌
体を２ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、窒素封入
した後３０℃、２４時間振とうさせながら反応させた。
結果を表２に示す。
て殺菌し、冷却した後下記表２に示す菌を１白金耳植菌
し、３０℃で２４時間培養を行い、同様にして休止菌体
を得た。５−（２，２−ジメチルプロピル）ヒダントイ
ンを５ｍｇ、リン酸バッファーを０．５ｍｌ及び休止菌
体を２ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、窒素封入
した後３０℃、２４時間振とうさせながら反応させた。
結果を表２に示す。
【００３１】
【表３】 表２ ──────────────────────────────────── 微 生 物 D-GML L-GML 光学純度 (g/L) (g/L) (%) ──────────────────────────────────── Alcaligenes aquamarinus FERM P-4229 0.082 0.033 42.6 Alcaligenes eutrophus DSM 428 0.022 0.019 7.3 Arthrobacter crystallopoietes JCM 2522 0.010 0.000 100.0 Aureobacterium testaceum JCM 1353 0.048 0.000 100.0 Bacillus brevis IFO 3331 0.018 0.009 33.3 Bacillus licheniformis IFO 12200 0.022 0.000 100.0 Rhodococcus erythropolis IFO 12320 0.070 0.024 48.4 Rhodococcus erythropolis IFM 0165 0.021 0.000 100.0 ──────────────────────────────────── D-GML:Ｄ−γ−メチルロイシン L-GML:Ｌ−γ−メチルロイシン
【００３２】実施例５ 実施例４において、培地を１０％ サッカロース、０．
３％ ポリペプトン、０．２％ ５−メチルヒダントイ
ン、０．３％ Ｋ2 ＨＰＯ4 、０．１％ ＫＨ 2 ＰＯ
4 、０．０５％ ＭｇＳＯ4 、１０ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ
4 に変えた以外は同様にして、反応を行った。結果を下
記表３に示す。
３％ ポリペプトン、０．２％ ５−メチルヒダントイ
ン、０．３％ Ｋ2 ＨＰＯ4 、０．１％ ＫＨ 2 ＰＯ
4 、０．０５％ ＭｇＳＯ4 、１０ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ
4 に変えた以外は同様にして、反応を行った。結果を下
記表３に示す。
【００３３】
【表４】 表３ ──────────────────────────────────── 微 生 物 D-GML L-GML 光学純度 (g/L) (g/L) (%) ──────────────────────────────────── Bacillus licheniformis IFO 12200 2.337 0.088 92.7 Bacillus brevis IFO 3331 1.445 0.502 48.4 Rhodococcus erythropolis IFO 12320 1.432 0.398 56.5 Rhodococcus erythropolis IFM 0165 0.904 0.019 95.9 Arthrobacter crystallopoietes JCM 2522 1.515 0.235 73.1 Alcaligenes aquamarinus FERM P-4229 1.666 0.152 83.3 Pseudomonas hydantoinophilum FERM P-4347 0.504 0.198 43.6 ────────────────────────────────────
【００３４】
【発明の効果】上記の結果より、本発明の方法によれ
ば、従来の発酵法では得られなかった非天然型のＤ−γ
−メチルロイシンが得られるだけでなく、生物化学的に
効率よくＤ−γ−メチルロイシンを製造することができ
る。本発明方法で得られる非天然型のＤ−γ−メチルロ
イシンは、医・農薬等の合成中間体として有用である。
ば、従来の発酵法では得られなかった非天然型のＤ−γ
−メチルロイシンが得られるだけでなく、生物化学的に
効率よくＤ−γ−メチルロイシンを製造することができ
る。本発明方法で得られる非天然型のＤ−γ−メチルロ
イシンは、医・農薬等の合成中間体として有用である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:08） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:10）
Claims (2)
- 【請求項１】 ５−（２，２−ジメチルプロピル）ヒダ
ントインに、ヒダントイン環を不斉的に開裂加水分解す
る能力を有する微生物の菌体又はその菌体処理物を水性
媒体中で作用させることを特徴とする、Ｄ−γ−メチル
ロイシンの製造法。 - 【請求項２】 微生物が、アグロバクテリウム属、シュ
ードモナス属、バチルス属、アルカリゲネス属、アルス
ロバクター属、オーレオバクテリウム属及びロドコッカ
ス属に属する微生物から選ばれることを特徴とする、請
求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7067794A JPH07274985A (ja) | 1994-04-08 | 1994-04-08 | Ｄ−γ−メチルロイシンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7067794A JPH07274985A (ja) | 1994-04-08 | 1994-04-08 | Ｄ−γ−メチルロイシンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07274985A true JPH07274985A (ja) | 1995-10-24 |
Family
ID=13438526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7067794A Pending JPH07274985A (ja) | 1994-04-08 | 1994-04-08 | Ｄ−γ−メチルロイシンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07274985A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002072841A1 (fr) * | 2001-03-08 | 2002-09-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Adn codant pour une hydantoinase, adn codant pour une hydrolase d'acide amine l carbamyle, adn recombinant, cellules transformees, procede de production de proteine et procede de production d'acide amine optiquement actif |
-
1994
- 1994-04-08 JP JP7067794A patent/JPH07274985A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002072841A1 (fr) * | 2001-03-08 | 2002-09-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Adn codant pour une hydantoinase, adn codant pour une hydrolase d'acide amine l carbamyle, adn recombinant, cellules transformees, procede de production de proteine et procede de production d'acide amine optiquement actif |
| US7098020B2 (en) | 2001-03-08 | 2006-08-29 | Ajinomoto Co., Inc. | DNA encoding hydantoinase, DNA encoding N-carbamyl-L-amino acid hydrolase, recombinant DNA, transformed cell, method of producing protein, and method of producing optically active amino acid |
| US7361490B2 (en) | 2001-03-08 | 2008-04-22 | Ajinomoto Co., Inc. | DNA encoding hydantoinase, DNA encoding N-carbamyl-L-amino acid hydrolase, recombinant DNA, transformed cell, method of producing protein and method of producing optically active amino acid |
| US8460902B1 (en) | 2001-03-08 | 2013-06-11 | Ajinomoto Co., Inc. | DNA encoding hydantoinase, DNA encoding N-carbamyl-L-amino acid hydrolase, recombinant DNA, transformed cell, method of producing protein, and method of producing optically active amino acid |
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