JPH07255475A - New rhodophyceous mucous polysaccharide decomposition enzyme, its production and new microorganism therefor - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain a rhodophyceous mucous polysaccharide decomposition enzyme having excellent heat-resistance, to provide its production process and to obtain a new microorganism capable of economically producing the decomposition enzyme. CONSTITUTION:This rhodophyceous mucous polysaccharide decomposition enzyme catalyzes a reaction to hydrolyze a rhodophyceous mucous polysaccharide to endo-type substance and produce oligosaccharides mainly composed of a saccharide having a polymerization degree of 4 and has the following physical and chemical properties. The optimum temperature is 55 deg.C in the case of using a hot water extract of Gracilaria verrucosa as a substrate, it is stable at 50 deg.C at pH7.5 for 10min in the absence of substrate, it leaves about 72.5% of activity at 95 deg.C, etc. The decomposition enzyme can be collected from a cultured product of a soil-originated microbial strain. The microbial strain producing the decomposition enzyme is Pseudomonas sp. O-148 deposited in the name of FERM P-13767.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【技術分野】本発明は、新規な紅藻粘質多糖分解酵素及
びその製造法並びにそのための新規な微生物に係り、特
に微生物由来の紅藻粘質多糖分解酵素、具体的にはシュ
ードモナス（ Pseudomonas）属に属する微生物を培養し
て得られる新規な紅藻粘質多糖分解酵素及びそれを製造
する方法、更には、そのような分解酵素を有利に生産し
得る新規な微生物に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme, a method for producing the same, and a novel microorganism therefor, and in particular, a microorganism-derived red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme, specifically Pseudomonas. The present invention relates to a novel red alga slime polysaccharide degrading enzyme obtained by culturing a microorganism belonging to the genus, a method for producing the same, and a novel microorganism capable of advantageously producing such a degrading enzyme.

【０００２】[0002]

【背景技術】我国においては、海藻は、古くから、体に
良い食品として食されてきており、例えば紅藻類に属す
る天草、オゴノリ等の多糖類は、寒天の主成分として用
いられているのであり、また、同じく、紅藻類に属する
アマノリ等は、そのままでも食されている。そして、近
年、そのような海藻中に含まれる種々の生理活性物質の
開発研究が活発に行なわれるようになり、紅藻由来の抗
ウィルス剤（特開昭６３−３１６７３号公報）や、同じ
く紅藻由来の抗腫瘍剤（特開平１−６６１２６号公報）
等が提案され、また紅藻類であるアマノリ属及びオゴノ
リ属海藻から水性溶媒で抽出される物質を有効成分とす
る免疫不活剤（特開平３−２８４６２６号公報、特開平
５−１３９９８８号公報）も、提案されている。BACKGROUND ART In Japan, seaweed has long been eaten as a food that is good for the body, and for example, polysaccharides such as Amakusa and Ogonori, which belong to the red algae, are used as the main components of agar. Similarly, flax and the like belonging to the red algae are eaten as they are. In recent years, research and development of various physiologically active substances contained in such seaweed has been actively carried out, and an antiviral agent derived from red alga (Japanese Patent Laid-Open No. 63-31673) and the same red. Antitumor agent derived from algae (JP-A-1-66126)
And the like, and an immuno-inactivating agent containing a substance extracted from an algae of the genus Rhizophora and the genus Ogonori with an aqueous solvent as an active ingredient (JP-A-3-284626, JP-A-5-139988). Has also been proposed.

【０００３】ところで、寒天の主成分であるアガロース
は、Ｄ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラ
クトースが交互にβ−１，４結合、α−１，３結合した
中性多糖であるが、もう一つの成分であるアガロペクチ
ンは、アガロースに硫酸やピルビン酸が部分的にエステ
ル結合したものである。一方、オゴノリ属やアマノリ属
に属する海藻から抽出された物質は、アガロースを基本
骨格に持つ高分子の酸性多糖を主成分とすることが知ら
れている。By the way, agarose, which is the main component of agar, is a neutral polysaccharide in which D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose are alternately β-1,4 linked and α-1,3 linked. Another component, agaropectin, is agarose with partial ester linkage of sulfuric acid and pyruvic acid. On the other hand, it is known that substances extracted from seaweed belonging to the genus Ogonori and the genus Amanori have a high molecular weight acidic polysaccharide having agarose as a basic skeleton as a main component.

【０００４】しかして、これら紅藻類の多糖は、粘性が
高く、場合によっては強いゲル形成能を示すものである
ところから、その抽出操作やその利用に際しては、ゲル
化を生じない温度で取り扱う必要がある等、種々の問題
点を内在しているのである。また、このような粘質多糖
を分解する酵素としては、α−アガラーゼやβ−アガラ
ーゼが知られており、そのうち、α−アガラーゼは、ア
ガロースのα−１，３結合を分解して、主としてアガロ
テトラオースを生成することが知られている［「 Carbo
hydr. Res. 」，６６，２０７（１９７８）］。一方、
β−アガラーゼは、アガロースのβ−１，４結合を選択
的に切断する酵素であり、その生産菌としては、シュー
ドモナス（ Pseudomonas ）属細菌［「 Eur.J. Bioche
m. 」，１３３，６７３（１９８３）；「 Eur.J. Bioc
hem.」，１３７，１４９（１９８３）；特開平１−２２
８４６５号；「 Agric. Biol. Chem. 」，５５，２５３
１（１９９１）；「 Appl. Environ. Microbiol. 」，
５９，１５４９（１９９３）］，サイトファーガ（ Cyt
ophaga）属細菌［「 Eur. J. Biochem. 」，１１３，１
３９（１９６９）］，ビブリオ（Vibrio）属細菌［「 E
ur. J. Biochem. 」，１８７，４６１（１９９０）］等
が知られている。However, since these red algae polysaccharides are highly viscous and, in some cases, show a strong gel-forming ability, it is necessary to handle them at a temperature at which gelation does not occur during the extraction operation and the utilization thereof. Therefore, there are various problems inherent therein. Further, α-agarase and β-agarase are known as enzymes for degrading such mucilage polysaccharides, and among them, α-agarase mainly degrades agarose by degrading α-1,3 bond. It is known to produce gallotetraose ["Carbo
hydr. Res. ", 66 , 207 (1978)]. on the other hand,
β-Agarase is an enzyme that selectively cleaves β-1,4 bond of agarose, and as a producing bacterium thereof, a bacterium belonging to the genus Pseudomonas [“Eur. J. Bioche
m. ", 133 , 673 (1983);" Eur.J. Bioc
hem., 137 , 149 (1983); JP-A 1-22
8465; "Agric. Biol. Chem.", 55 , 253.
1 (1991); “Appl. Environ. Microbiol.”,
59 , 1549 (1993)], Cytoferga (Cyt
ophaga) bacterium ["Eur. J. Biochem.", 113 , 1
39 (1969)], bacteria of the genus Vibrio [“E
ur. J. Biochem. ", 187 , 461 (1990)] and the like.

【０００５】さらに、かかるβ−アガラーゼを利用し
て、海藻類からオリゴ糖を製造する方法が、特開平２−
６５７８８号公報や特開平４−２７１７９１号公報等に
おいて、明らかにされている。Further, a method for producing oligosaccharides from seaweeds using such β-agarase is disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 2-2021.
It is clarified in Japanese Patent No. 65788, Japanese Patent Laid-Open No. 4-271791, and the like.

【０００６】他方、紅藻類における粘性多糖を、希酸の
如き酸を用いて加水分解する手法も知られており、その
ような希酸による加水分解は、該多糖中のα−１，３結
合を比較的選択的に切断するものであるが、酸による加
水分解は、同時に、これら多糖に結合する硫酸基をも遊
離させ、構成糖の基本構造をも変化させてしまう問題を
内在している。On the other hand, a method of hydrolyzing viscous polysaccharides in red algae using an acid such as a dilute acid is also known, and such hydrolysis with a dilute acid results in the α-1,3 bond in the polysaccharide. It is a relatively selective cleaver, but the hydrolysis with acid has the problem that at the same time it also releases the sulfate group that binds to these polysaccharides and changes the basic structure of the constituent sugars. .

【０００７】かかる状況下、紅藻粘質多糖からオリゴ糖
を効率良く製造するためには、酵素による部分加水分解
法が、酸加水分解法等よりも、その基本構造を変える危
険性が少なく、オリゴ糖の収率、脱色、脱塩等の精製の
容易性や作業性等の点において優れていると言うことが
出来る。Under such circumstances, in order to efficiently produce an oligosaccharide from a red algal mucilage polysaccharide, the partial hydrolysis method using an enzyme has less risk of changing its basic structure than the acid hydrolysis method, It can be said that it is excellent in terms of yield of oligosaccharides, ease of purification such as decolorization and desalting, and workability.

【０００８】しかして、これまでに知られている寒天質
分解酵素（アガラーゼ）は、その殆どが、海由来の微生
物から調製されたものであり、一般土壌由来の微生物か
らのものは少ない。また、一般に、海洋微生物から得ら
れる酵素の耐熱性は、低いことが知られており、アガラ
ーゼも、また、その至適温度は高くても４０〜５０℃で
あり、その多くは４０℃以下のものである。特に、寒天
質は、８０℃以上の温度にて水に溶解するが、その温度
を下げると、５０〜４０℃でゲル化が起こり、酵素分解
を行なうその後の操作を極めて困難なものとするのであ
る。このゲル化を抑えるためには、その基質濃度を１％
以下にする必要があるが、そのような低濃度での操作
は、オリゴ糖の生産性を著しく低いものとすることとな
る。[0008] However, most of the agar-degrading enzymes (agarases) known so far are prepared from sea-derived microorganisms, and few are derived from general soil-derived microorganisms. Further, it is generally known that the heat resistance of enzymes obtained from marine microorganisms is low, and the optimum temperature of agarase is also 40 to 50 ° C at the highest, and most of them are 40 ° C or lower. It is a thing. In particular, agar is dissolved in water at a temperature of 80 ° C. or higher, but when the temperature is lowered, gelation occurs at 50 to 40 ° C., which makes subsequent operations for enzymatic decomposition extremely difficult. is there. In order to suppress this gelation, the substrate concentration should be 1%
Although it is necessary to make the following, the operation at such a low concentration results in extremely low oligosaccharide productivity.

【０００９】[0009]

【解決課題】ここにおいて、本発明は、かかる事情を背
景にして為されたものであって、その課題とするところ
は、耐熱性に優れた新規な紅藻粘質多糖分解酵素、特に
微生物由来の紅藻粘質多糖分解酵素を提供することにあ
り、またシュードモナス（ Pseudomonas）属に属する微
生物を培養して得られる新規な紅藻粘質多糖分解酵素
と、その製造法、更にはそのような分解酵素を有利に生
産し得る、新規な微生物を提供することにある。The present invention has been made in view of such circumstances, and a subject of the present invention is to provide a novel red algal mucopolysaccharide degrading enzyme having excellent heat resistance, particularly derived from a microorganism. And a novel red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme obtained by culturing a microorganism belonging to the genus Pseudomonas, and a method for producing the same. It is to provide a novel microorganism that can advantageously produce a degrading enzyme.

【００１０】[0010]

【解決手段】そして、本発明者らは、上記の課題を解決
するために、耐熱性の高い紅藻粘質多糖分解酵素の取得
を目的として、鋭意、その生産菌の選択を行なった結
果、シュードモナス属に属する微生物によって生産され
る新規な紅藻粘質多糖分解酵素が、従来より報告されて
いるアガラーゼよりも優れた耐熱性を有することを見出
し、本発明を完成させるに至ったのである。そして、そ
のような微生物由来の優れた耐熱性を有する新規な紅藻
粘質多糖分解酵素を用いることにより、紅藻粘質多糖か
らのオリゴ糖の製造を工業的に実施することが出来るこ
とを、確認したのである。In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have diligently selected a producing bacterium thereof for the purpose of obtaining a highly thermostable red algal mucopolysaccharide degrading enzyme, The present inventors have found that a novel red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme produced by a microorganism belonging to the genus Pseudomonas has heat resistance superior to that of agarase reported hitherto, and completed the present invention. Then, by using a novel red algal slimy polysaccharide degrading enzyme having excellent heat resistance derived from such a microorganism, it is possible to industrially carry out the production of oligosaccharides from red algal slimy polysaccharide. I confirmed.

【００１１】すなわち、本発明は、以下に示す理化学的
性質を有する新規な紅藻粘質多糖分解酵素を、その要旨
とするものである。： １）作用 紅藻粘質多糖、例えばアガロース、寒天、オゴノリ熱水
抽出物（以下、ＧＷＳと略す）、アマノリ抽出物及びポ
ルフィラン等をエンド型に加水分解し、重合度４を主体
とするオリゴ糖を生成する反応を触媒する； ２）基質特異性 β−１，４ガラクトシド結合を有するアガロース、アガ
ロペクチン、寒天、ＧＷＳ、アマノリ抽出物及びポルフ
ィラン等のガラクタン系の多糖類並びにネオアガロヘキ
サオース以上の少糖に作用する一方、カラギーナン、ネ
オアガロテトラオース、ネオアガロビオース、乳糖には
作用しない； ３）至適ｐＨ及びｐＨ安定性 紅藻粘質多糖であるＧＷＳを基質としたときの至適ｐＨ
は４．５〜５．５であり、２８℃、１６時間、基質非存
在の条件下では、ｐＨ５．５〜８．０で安定である； ４）至適温度及び熱安定性 ＧＷＳを基質としたときの至適温度は５５℃であり、ｐ
Ｈ７．５、１０分間、基質非存在の条件下では、５０℃
で安定、９５℃で約７２．５％の活性が残存している； ５）失活の条件 ｐＨ６．０、１２０℃、１０分間、基質非存在の条件下
では、約１０％の活性が残存し、１２０℃、６０分間で
完全に失活する； ６）分子量 ４１０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）； ７）等電点 ４．７〜５．６（等電点電気泳動法）； ８）金属塩等の影響 ｐＨ６．０、２８℃、１ｍＭの金属塩等の塩濃度下、１
６時間の処理で、Ａｇ⁺ 、Ｎ−ブロモスクシンイミドが
５％以下、Ｃｕ²⁺、Ｆｅ³⁺が１５〜５０％、Ｆｅ²⁺、Ｈ
ｇ²⁺が７０〜８０％の残存活性を示し、Ｎａ⁺ 、Ｍ
ｇ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｎｉ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｂａ
²⁺、Ｐｂ²⁺、Ａｌ³⁺では安定である。That is, the gist of the present invention is a novel red alga mucopolysaccharide degrading enzyme having the following physicochemical properties. : 1) Action An oligosaccharide having a degree of polymerization of 4 as a main component, which hydrolyzes red algal mucilage polysaccharides such as agarose, agar, hot water extract of Agonori (hereinafter abbreviated as GWS), an extract of Porphyra and porphyran to an endo type, and a degree of polymerization of 4 2) Substrate specificity Galactan-based polysaccharides such as agarose, agaropectin, agar, GWS, laver extract and porphyran, and neoagarohexaose having substrate specificity β-1,4 galactoside bond It does not act on carrageenan, neo-agarotetraose, neo-agarobiose, or lactose, while it acts on the oligosaccharides of 3; 3) Optimum pH and pH stability When GWS, a red algal mucilage polysaccharide, is used as a substrate Optimal pH
Is 4.5 to 5.5, and is stable at pH 5.5 to 8.0 under conditions of 28 ° C. and 16 hours in the absence of substrate; 4) Optimum temperature and thermal stability GWS is used as a substrate. The optimum temperature is 55 ° C, and p
H7.5, 10 minutes, 50 ° C under the absence of substrate
Stable, about 72.5% activity remains at 95 ° C; 5) Deactivation condition About 10% activity remains at pH 6.0, 120 ° C for 10 minutes, in the absence of substrate. And completely deactivates at 120 ° C. for 60 minutes; 6) molecular weight 41000 (SDS-PAGE method); 7) isoelectric point 4.7 to 5.6 (isoelectric focusing); 8) metal salt. Effects of pH 6.0, 28 ° C, 1 mM salt concentration such as metal salt, 1
By treatment for 6 hours, Ag ⁺ , N-bromosuccinimide 5% or less, Cu ²⁺ , Fe ³⁺ 15 to 50%, Fe ²⁺ , H
g ²⁺ shows a residual activity of 70 to 80%, Na ⁺ , M
g ²⁺ , Ca ²⁺ , Mn ²⁺ , Co ²⁺ , Ni ²⁺ , Zn ²⁺ , Ba
It is stable with ²⁺ , Pb ²⁺ and Al ³⁺ .

【００１２】なお、本発明の有利な態様の一つによれ
ば、上述の如き新規な紅藻粘質多糖分解酵素は、土壌由
来の微生物にて生産されたものである。According to one of the advantageous aspects of the present invention, the novel red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme as described above is produced by a soil-derived microorganism.

【００１３】また、本発明は、シュードモナス属に属す
る紅藻粘質多糖分解酵素生産菌を培養し、その培養物か
ら、上述の新規な紅藻粘質多糖分解酵素を採取すること
を特徴とする紅藻粘質多糖分解酵素の製造法をも、その
要旨とするものであり、特にそこでは、そのような紅藻
粘質多糖分解酵素生産菌としては、ＦＥＲＭ Ｐ−１３
７６７として寄託されたシュードモナス・エスピー・Ｏ
−１４８（ Pseudomonas sp ．Ｏ−１４８）若しくはそ
の変異株が、有利に用いられることとなる。The present invention is also characterized by culturing a red algal slimy polysaccharide-degrading enzyme-producing bacterium belonging to the genus Pseudomonas, and collecting the novel red algal slimy polysaccharide-degrading enzyme from the culture. A method for producing a red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme is also included in the gist of the present invention. In particular, as such a red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme-producing bacterium, FERM P-13
Pseudomonas sp. O deposited as 767
-148 (Pseudomonas sp. O-148) or a mutant strain thereof will be advantageously used.

【００１４】さらに、本発明は、上記した耐熱性に優れ
た紅藻粘質多糖分解酵素を生産する能力を有する微生物
として、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６７として寄託されたシ
ュードモナス・エスピー・Ｏ−１４８（ Pseudomonas s
p ．Ｏ−１４８）をも、その要旨とするものである。Further, the present invention is a microorganism having the ability to produce the above-described thermostable red algal mucopolysaccharide degrading enzyme, Pseudomonas sp. O-148 (Pseudomonas s) deposited as FERM P-13767.
p. O-148) is also the gist thereof.

【００１５】[0015]

【具体的構成】ところで、このような本発明に係る、耐
熱性に優れた、新規な紅藻粘質多糖分解酵素は、微生物
を用いて生産されることとなるが、その生産菌として
は、有利には、シュードモナス（ Pseudomonas）属に属
し、前記した理化学的性質を有する分解酵素を生産する
能力を有する微生物が用いられ、中でも、本発明者らに
よって新たに岐阜県伊那市内の土壌から分離された、シ
ュードモナス・エスピー・Ｏ−１４８（ Pseudomonas s
p ．Ｏ−１４８）が、有利に用いられるのである。な
お、本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、
平成５年７月３０日に「ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６７（生
技研寄託Ｐ−１３７６７号）」として受託されており、
その菌学的性質は、以下の通りである。 （Ｉ）形態学的性質 （１）細胞の形及び大きさ 桿菌 ０．４〜０．８μｍ×１．０〜２．０μｍ （２）多形性・・・なし （３）運動性・・・あり （４）鞭毛・・・あり （５）胞子形成・・・なし （６）グラム染色・・・陰性 （７）抗酸性・・・なし （II）各培地における生育 （１）肉汁寒天平板培養 生育の程度：良好、形：円形、表面の形状：放射状皺
面、***：円錐状、色：黄白色、光沢：鈍光、周辺の形
状：不斉歯牙状、性状：粘調 （２）肉汁寒天斜面培養 表面の形状：糸状、寒天ゲルは液化される。 （３）肉汁液体培養 生育の状態：菌膜形成、粘調沈殿物生成。 （４）肉汁寒天穿刺培養 生育の場所：表面及び上部 生育の形状：糸状、寒天ゲル上部は液化される。 （５）肉汁ゼラチン穿刺培養 生育の状態：上部のみに生育するも、液化能はない。 （６）リトマスミルク培地 反応：アルカリ生成 (III) 生理的性質 （１）硝酸塩の還元：陽性 （２）インドールの生成：陰性 （３）硫化水素の生成：陰性 （４）メチルレッド試験：陰性 （５）Ｖ−Ｐ反応：陰性 （６）デンプンの加水分解：陽性 （７）クエン酸の利用：陽性 （８）無機窒素源の利用：硫酸塩、アンモニウム塩を窒
素源として利用する。 （９）色素生成：黄白色の非水溶性色素を生成する。 （１０）オキシダーゼテスト：陽性 （１１）カタラーゼテスト：陽性 （１２）生育の範囲 生育温度：１０〜４０℃、至適温度：２０〜３０℃、生
育のｐＨ：５．５〜１０．０、至適ｐＨ：６．０〜９．
０ （１３）酸素に対する態度：好気性 （１４）Ｏ−Ｆテスト：酸化型 （１５）リジンデカルボキシラーゼ：陰性 （１６）アルギニンジハイドロラーゼ：陽性 （１７）オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性 （１８）ウレアーゼ：陽性 （１９）セルラーゼ：陽性 （２０）ＯＮＰＧの加水分解：陽性 （２１）ゼラチン分解能：陰性 （２２）エスクリン分解能：陽性 （２３）Ｔｗｅｅｎ化合物の加水分解：Ｔｗｅｅｎ−２
０、Ｔｗｅｅｎ−８０共に陽性 （２４）キノン系の種類：Ｑ₉ （２５）糖からの酸の生成糖類 酸の生成 Ｄ−グルコース ＋ 麦芽糖 ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｌ−アラビノース − Ｄ−フルクトース − ショ糖 ＋ 乳糖 ＋ トレハロース ＋ セロビオース ＋ メリビオース ＋ ネオアガロビオース ＋ ネオアガロテトラオース ＋ ネオアガロヘキサオース ＋ Ｄ−グルシトール − Ｄ−マンニトール − イノシトール − グリセロール − エタノール − メタノール − 寒天 ＋ アガロース ＋ （２６）塩化ナトリウムの耐性：０〜４．５％で生育
（ペプトン寒天斜面） （２７）菌体中のＤＮＡのＧ＋Ｃ含量：６５．０％ （IV）同定 上記の菌学的性質を有する菌株につき、「バージェイズ
・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロ
ジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）
第１巻、１９８４年」に基づき、検索した結果、シュー
ドモナス属に属する菌株と同定し、また本菌株を詳細に
比較すると、シュードモナス属に属する新菌株であるこ
とを認め、シュードモナス・エスピー・Ｏ−１４８（ P
seudomonas sp ．Ｏ−１４８）と命名した。SPECIFIC STRUCTURE By the way, the novel red algal mucopolysaccharide degrading enzyme according to the present invention, which is excellent in heat resistance, is produced by using a microorganism. Advantageously, a microorganism belonging to the genus Pseudomonas and having the ability to produce a degrading enzyme having the above-mentioned physicochemical properties is used. Among them, the present inventors newly isolated from soil in Ina City, Gifu Prefecture. Pseudomonas s
p. O-148) is preferably used. In addition, this strain is
It was entrusted on July 30, 1993 as "FERM P-13767 (Seikagakuken deposit P-13767)".
Its bacteriological properties are as follows. (I) Morphological properties (1) Cell shape and size Bacilli 0.4-0.8 μm × 1.0-2.0 μm (2) Polymorphism ... None (3) Motility ... Yes (4) Flagella ... Yes (5) Spore formation ... No (6) Gram stain ... Negative (7) Anti-acid ... No (II) Growth in each medium (1) Meat agar plate culture Degree of growth: Good, Shape: Circular, Surface shape: Radial wrinkle, Ridge: Conical, Color: Yellowish white, Gloss: Dull, Surrounding shape: Asymmetric tooth, Property: Viscous (2) Meat juice Agar slant culture Surface shape: filamentous, agar gel is liquefied. (3) Broth liquid culture Growth state: Pellicle formation, viscous precipitate formation. (4) Meat broth agar stab culture Place of growth: surface and upper part Growth shape: filamentous, upper part of agar gel is liquefied. (5) Meat broth gelatin stab culture Growth condition: It grows only on the upper part, but it has no liquefaction ability. (6) Litmus milk medium reaction: Alkali formation (III) Physiological properties (1) Reduction of nitrate: Positive (2) Indole formation: Negative (3) Hydrogen sulfide formation: Negative (4) Methyl red test: Negative ( 5) VP reaction: negative (6) hydrolysis of starch: positive (7) use of citric acid: positive (8) use of inorganic nitrogen source: sulfate, ammonium salt is used as nitrogen source. (9) Dye formation: A yellowish white water-insoluble dye is formed. (10) Oxidase test: positive (11) Catalase test: positive (12) Range of growth Growth temperature: 10 to 40 ° C, optimum temperature: 20 to 30 ° C, growth pH: 5.5 to 10.0, to Suitable pH: 6.0-9.
0 (13) Attitude toward oxygen: aerobic (14) OF test: oxidized form (15) lysine decarboxylase: negative (16) arginine dihydrolase: positive (17) ornithine decarboxylase: negative (18) urease: Positive (19) Cellulase: Positive (20) ONPG Hydrolysis: Positive (21) Gelatin Degradation: Negative (22) Esculin Degradation: Positive (23) Tween Compound Hydrolysis: Tween-2
0, Tween-80 both positive (24) quinone type: Q ₉ (25) generating the product saccharides acid acid from sugars D- Glucose + Maltose + D- xylose + D- galactose + D- mannose + L- Arabinose-D-fructose-sucrose + lactose + trehalose + cellobiose + melibiose + neoagarobiose + neoagarotetraose + neoagarohexaose + D-glucitol-D-mannitol-inositol-methanol-glycerol-ethanol Agar + Agarose + (26) Sodium chloride tolerance: Grows at 0-4.5% (peptone agar slope) (27) G + C content of DNA in cells: 65.0% (IV) Identification For the strains with characteristics, refer to "Berjay's Manual of Systema". Bergey's Manual of Systematic Bacteriology
As a result of a search based on "Vol. 1, 1984", it was identified as a strain belonging to the genus Pseudomonas, and when this strain was compared in detail, it was confirmed that it was a new strain belonging to the genus Pseudomonas, and Pseudomonas sp. 148 (P
seudomonas sp. O-148).

【００１６】なお、本発明においては、上記した菌株と
その変種、変異種が、特に好適に用いられるものである
が、勿論、他の微生物であっても、前記した紅藻粘質多
糖分解酵素の生産能を有するものであれば、何れをも、
使用可能であることは、勿論である。また、上記した菌
株の変異の一つには、突然変異によるものがあり、それ
は、例えば放射線や紫外線の照射、ニトロソグアニジン
等の薬剤の適用等によって実現され、また遺伝子の組み
換えによっても、そのような菌株の変異は可能である。In the present invention, the above-mentioned strains and their variants and mutants are particularly preferably used, but, of course, other microorganisms can also be used as the aforementioned red algal mucilage polysaccharide degrading enzyme. As long as it has the production capacity of
Of course, it can be used. Further, one of the mutations of the above-mentioned strains is due to mutation, which is realized by, for example, irradiation of radiation or ultraviolet rays, application of a drug such as nitrosoguanidine, and also by recombination of genes. Mutations of various strains are possible.

【００１７】ところで、かくの如き微生物を用いて、本
発明に従う新規な紅藻粘質多糖分解酵素を製造するに際
しては、そのような微生物を培養し、その培養液中に、
目的とする紅藻粘質多糖分解酵素を蓄積せしめ、そし
て、それから分離採取されることとなるが、その際の菌
株を培養する培地は、液状であっても、固体状であって
もよい。しかし、通常は、液体培地を使用するのが有利
であり、工業的には、一般に、攪拌培養が採用されるこ
ととなる。また、用いられる培地としては、炭素源、窒
素源、無機塩及びその他の栄養素を適当量含有する培地
であるならば、合成培地及び天然培地の何れをも、使用
可能である。By the way, when producing a novel red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme according to the present invention using such a microorganism, such a microorganism is cultivated, and in the culture solution,
The target red algal mucopolysaccharide degrading enzyme is accumulated and then separated and collected, and the culture medium for culturing the strain at that time may be liquid or solid. However, it is usually advantageous to use a liquid medium, and industrially, agitation culture is generally adopted. As the medium to be used, any of synthetic medium and natural medium can be used as long as it is a medium containing an appropriate amount of carbon source, nitrogen source, inorganic salt and other nutrients.

【００１８】また、かかる培地に添加される炭素源とし
ては、菌の生育の為には、澱粉、デキストリン、ショ
糖、麦芽糖、グルコース、乳糖、ガラクトース、廃糖蜜
等が用いられるが、本発明に係る酵素を生成せしめるに
際しては、天草、オゴノリ或いはアマノリ等の紅藻類海
藻粉末、それらの熱水抽出物、寒天、或いはポルフィラ
ン等を添加する必要がある。このような炭素源の添加量
は、目的に応じて適宜に決定されることとなるが、一般
に、培地中に０．１〜３．０重量％程度の含有割合とな
るように添加せしめられることとなる。Further, as a carbon source added to such a medium, starch, dextrin, sucrose, maltose, glucose, lactose, galactose, molasses, etc. are used for the growth of the fungus. In producing such an enzyme, it is necessary to add Amakusa, red algae seaweed powder such as Agonori or Amanori, hot water extract thereof, agar, or porphyran. The amount of such a carbon source to be added will be appropriately determined according to the purpose, but in general, it should be added so as to have a content ratio of about 0.1 to 3.0% by weight in the medium. Becomes

【００１９】さらに、窒素源としては、コーン・スティ
ープリカー、大豆粉、小麦ふすま、ペプトン、肉エキ
ス、カザミノ酸、フィッシュミール、尿素、酵母エキ
ス、乾燥酵母等の動物、植物、微生物由来の有機窒素源
やアンモニウム塩や硝酸塩等の無機窒素化合物が、１種
又は２種以上、選択されて用いられ、無機塩にあって
も、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、リン
酸塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、亜鉛塩、炭酸
塩、酢酸塩等の１種又は２種以上が適宜に選択されて用
いられることとなる。なお、これら窒素源や無機塩の添
加量にあっても、適宜に決定されるものであるが、一般
に窒素源としては、０〜３．０重量％の含有割合となる
ように、また、無機塩としては、０〜１．０重量％の含
有割合となるように、それぞれ添加せしめられることと
なる。Further, as the nitrogen source, organic nitrogen derived from corn steep liquor, soybean flour, wheat bran, peptone, meat extract, casamino acid, fish meal, urea, yeast extract, dry yeast, etc., plants, microorganisms. One or two or more kinds of inorganic nitrogen compounds such as a source, an ammonium salt and a nitrate are selected and used. Even among the inorganic salts, sodium salt, magnesium salt, potassium salt, phosphate salt, calcium salt, iron One or more of salts, manganese salts, zinc salts, carbonates, acetates, etc. are appropriately selected and used. It should be noted that the addition amount of these nitrogen source and inorganic salt is also appropriately determined, but generally, as the nitrogen source, the content ratio of 0 to 3.0% by weight, and The salt will be added so that the content of the salt will be 0 to 1.0% by weight.

【００２０】特に、好ましい培地には、ペプトン、酵母
エキス、ノリ粉末（或いはオゴノリ粉末または寒天）、
硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウムが
組み合わされて、添加され、そしてその好ましい培地組
成は、下記の通りである。 ペプトン：０．５重量％ 酵母エキス：０．１重量％ ノリ粉末：２．０重量％（オゴノリ：１．５重量％又は
寒天：１．５重量％） 硫酸マグネシウム：０．２５重量％ 塩化ナトリウム：０．１重量％ 塩化カルシウム：０．０１重量％Particularly preferred media include peptone, yeast extract, Nori powder (or Ogonori powder or agar),
Magnesium sulphate, sodium chloride, calcium chloride are combined and added, and the preferred medium composition is as follows. Peptone: 0.5% by weight Yeast extract: 0.1% by weight Nori powder: 2.0% by weight (Ogonori: 1.5% by weight or agar: 1.5% by weight) Magnesium sulfate: 0.25% by weight Sodium chloride : 0.1% by weight Calcium chloride: 0.01% by weight

【００２１】なお、培養は、一般に、出発ｐＨ：５．５
〜８．０において、２０〜３５℃程度の培養温度に保持
して、好気性条件下で、２〜５日間培養することによ
り、行なわれる。The culture generally has a starting pH of 5.5.
It is carried out by holding the culture temperature at about 20 to 35 ° C. for about 2 to 5 days under aerobic conditions.

【００２２】そして、かかる培養の結果、培地中に生産
された目的とする多糖分解酵素は、濾過或いは遠心分離
等の方法にて、菌体を除去し、酵素液を得た後、該酵素
液を真空濃縮又は限外濾過膜を用いて濃縮し、液状酵素
として、或いは凍結乾燥や噴霧乾燥法により、粉末化し
て、採取されることとなる。なお、上記で得られた酵素
液を、更に有機溶剤沈澱、塩析、減圧濃縮、アフィニテ
ィー・クロマトグラフィ、イオン交換法による吸着・脱
離、ゲル分画法等の酵素精製の常法に従って処理するこ
とにより、かかる酵素の純化・精製を行なうことが出来
る。The target polysaccharide-degrading enzyme produced in the medium as a result of such culture is filtered or centrifuged to remove bacterial cells to obtain an enzyme solution, and then the enzyme solution is obtained. To be collected as a liquid enzyme, or as a powdery enzyme by freeze-drying or spray-drying method. The enzyme solution obtained above may be further treated according to a conventional method for enzyme purification such as organic solvent precipitation, salting-out, vacuum concentration, affinity chromatography, adsorption / desorption by ion exchange method, gel fractionation method and the like. Thus, such an enzyme can be purified and purified.

【００２３】かくして得られる紅藻粘質多糖分解酵素
は、従来からの多糖分解酵素とは異なり、耐熱性に優れ
た新規な酵素であって、前述の如き理化学的性質（作
用；基質特異性；至適ｐＨ及びｐＨ安定性；至適温度及
び熱安定性；失活の条件；分子量；等電点；金属塩等の
影響）を有し、これにより、紅藻粘質多糖からのオリゴ
糖の製造を工業的に有利に実施可能ならしめたのであ
る。Unlike the conventional polysaccharide degrading enzymes, the red algal mucopolysaccharide degrading enzyme thus obtained is a novel enzyme having excellent heat resistance and has the above-mentioned physicochemical properties (action; substrate specificity; Optimum pH and pH stability; optimum temperature and heat stability; deactivation conditions; molecular weight; isoelectric point; influence of metal salts, etc.). The production could be carried out industrially advantageously.

【００２４】なお、かかる本発明に従う紅藻粘質多糖分
解酵素の特徴的な理化学的性質において、酵素の分子量
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて測定されているが、この分
子量測定法は、表面活性剤：ドデシル硫酸ナトリウム
（Sodium Dodecyl Sulfate: ＳＤＳ）を用いたポリアク
リルアミドゲル電気泳動（Polyacrylamide Gel Electro
phoresis：ＰＡＧＥ）手法にて分子量を測定するもので
あって、タンパクの分子量測定によく用いられている方
法である（１９９０年２月１日（株）東京化学同人発
行、E.E.Conn、P.K.Stumpf、G.Bruening, R.H.Doi 著、
田宮信夫、八木達彦訳、「生化学」、第５版、第４刷、
第７５〜７９頁参照）。Incidentally, in the characteristic physicochemical properties of the red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme according to the present invention, the molecular weight of the enzyme is measured by SDS-PAGE method. Agent: Polyacrylamide Gel Electrophoresis Using Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
phoresis (PAGE) method, which is a method that is often used to measure the molecular weight of proteins (February 1, 1990, Tokyo Kagaku Dojin, EEConn, PKStumpf, G. By Bruening, RHDoi,
Translated by Nobuo Tamiya and Tatsuhiko Yagi, "Biochemistry", 5th edition, 4th edition,
See pages 75-79).

【００２５】また、本発明においては、紅藻粘質多糖分
解酵素の活性は、以下の如くして測定されている。先
ず、イオン交換水で、適宜、希釈した酵素液１００μＬ
を５０℃に保温しておき、これに、ｐＨ６．０、５５．
５６ｍＭの酢酸緩衝液に溶解した０．１６７％ＧＷＳ溶
液（５０℃予熱）９００μＬを添加して、反応を開始さ
せる。この反応は、５０℃で２０分間行い、次いでソモ
ギー液を添加して、反応を停止せしめた後、ソモギー・
ネルソン法にて、還元糖を定量する。そして、活性は、
１μＭのガラクトースに相当する還元力を生成する酵素
量を１単位として表示する。In the present invention, the activity of the red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme is measured as follows. First, 100 μL of enzyme solution appropriately diluted with ion-exchanged water
Was kept at 50 ° C., and the pH was adjusted to 6.0, 55.
The reaction is initiated by the addition of 900 μL of a 0.167% GWS solution (50 ° C. preheat) dissolved in 56 mM acetate buffer. This reaction was carried out at 50 ° C. for 20 minutes, and then a somogy solution was added to stop the reaction.
The reducing sugar is quantified by the Nelson method. And the activity is
The amount of enzyme that produces a reducing power corresponding to 1 μM galactose is shown as one unit.

【００２６】[0026]

【実施例】以下に、本発明の幾つかの実施例を示し、本
発明を更に具体的に明らかにすることとするが、本発明
が、そのような実施例の記載によって、何らの制約を
も、受けるものでないことは言うまでもないところであ
る。また、本発明には、以下の実施例の他にも、更には
上記の具体的記述以外にも、本発明の趣旨を逸脱しない
限りにおいて、当業者の知識に基づいて、種々なる変
更、修正、改良等を加え得るものであることが、理解さ
れるべきである。EXAMPLES Some examples of the present invention will be shown below to clarify the present invention in more detail. However, the present invention is not limited by the description of such examples. However, it goes without saying that they do not receive it. In addition to the following embodiments, the present invention is not limited to the above specific description, and various changes and modifications are made based on the knowledge of those skilled in the art without departing from the spirit of the present invention. It is to be understood that improvements, etc. can be added.

【００２７】なお、以下の実施例中の百分率は、特に断
りのない限り、重量基準によって示されるものである。The percentages in the following examples are shown on a weight basis unless otherwise specified.

【００２８】実施例 １ オゴノリ粉末：２．０％、ポリペプトン：０．５％、酵
母エキス：０．１％、ＭｇＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ：０．２５
％、ＮａＣｌ：０．１％、及びＣａＣｌ₂ ：０．０１％
をイオン交換水に懸濁、溶解し、ｐＨ６．０に調節した
後、１２０℃で２０分間、滅菌して得られた培地３０ｍ
Ｌを、３００ｍＬの三角フラスコに収容した状態におい
て、シュードモナス・エスピー・Ｏ−１４８（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３７６７）を一白金耳植菌し、２８℃の温度下
において、４日間培養した。Example 1 Ogonori powder: 2.0%, polypeptone: 0.5%, yeast extract: 0.1%, MgSO ₄ .5H ₂ O: 0.25
%, NaCl: 0.1%, and CaCl ₂ : 0.01%
30m of the medium obtained by suspending and dissolving in water in ion-exchanged water, adjusting to pH 6.0, and sterilizing at 120 ° C for 20 minutes
L in a 300 mL Erlenmeyer flask, Pseudomonas SP O-148 (FERM
P-13767) was inoculated with one platinum loop and cultured at 28 ° C. for 4 days.

【００２９】そして、かかる培養の終了後、菌体とオゴ
ノリ残渣を遠心分離にて除去し、得られた培養液の酵素
活性を測定したところ、ＧＷＳ分解酵素（紅藻粘質多糖
分解酵素）が、０．２０単位／ｍＬ生産されていること
が明らかとなった。After the completion of the culture, the bacterial cells and the gonorrhea residue were removed by centrifugation, and the enzyme activity of the obtained culture solution was measured. As a result, GWS degrading enzyme (red algal mucopolysaccharide degrading enzyme) , 0.20 unit / mL was produced.

【００３０】実施例 ２ シュードモナス・エスピー・Ｏ−１４８（ＦＥＲＭ Ｐ
−１３７６７）を寒天：０．１％、ポリペプトン：０．
１％、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ：０．１％、ＮａＣｌ：０．１％、
ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ：０．０５％をイオン交換水に懸
濁してなるｐＨ７．０の前培養培地において、培養せし
めた。次いで、この得られた前培養液：３００ｍＬを、
オゴノリ粉末：１．５％、ポリペプトン：０．１％、酵
母エキス：０．１％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ：０．２５
％、ＮａＣｌ：０．１％、ＣａＣｌ₂ ：０．０１％、消
泡剤としてのアデカノールＬＧ１２６（旭電化工業株式
会社）：０．０３％の組成を有するｐＨ６．０の培地：
１５Ｌを入れた３０Ｌのジャーファーメンター（菌培養
基）に植菌し、２８℃の温度で、３日間培養した。培養
は、通気量：０．５ＶＶＭ、攪拌速度：２００ｒｐｍで
行なった。Example 2 Pseudomonas SP O-148 (FERM P
-13767) agar: 0.1%, polypeptone: 0.
1%, K ₂ HPO ₄ : 0.1%, NaCl: 0.1%,
MgSO ₄ · 7H ₂ O: 0.05% before culture medium pH7.0 obtained by suspending in deionized water, it was allowed to culture. Then, the obtained preculture liquid: 300 mL,
Gracilaria powder: 1.5%, polypeptone 0.1%, yeast _{extract: 0.1%, MgSO 4 · 7H} 2 O: 0.25
%, NaCl: 0.1%, CaCl ₂ : 0.01%, ADEKA NOL LG126 (Asahi Denka Co., Ltd.) as a defoaming agent: 0.03% of a medium having a pH of 6.0:
30 L jar fermenter (bacterial culture medium) containing 15 L was inoculated and cultured at a temperature of 28 ° C. for 3 days. The culture was performed at an aeration rate of 0.5 VVM and a stirring rate of 200 rpm.

【００３１】かかる培養の終了後、菌体を濾過により取
り除き、培養濾液：１２．７Ｌを得た。この培養濾液の
酵素活性は、０．５単位／ｍＬであった。また、かかる
培養濾液を限外濾過濃縮装置：ザルトコンミニ（ドイツ
国：ザルトリウス社）で約１５倍濃縮し、８６０ｍＬの
濃縮液（活性：７．７単位／ｍＬ）を得、更にこの濃縮
液をアガロースゲル：セファロースＣＬ−６Ｂ（スウェ
ーデン国：ファルマシア社）の５００ｍＬのカラムに吸
着させ、７５０ｍＬ／ｈｒの流速で、２０ｍＭ酢酸ソー
ダ緩衝液、ｐＨ６．０（４℃）で洗浄した後、更に１２
５０ｍＬ／ｈｒの流速で、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ
緩衝液にて、ｐＨ８．０（３５℃）で溶出せしめて、活
性区分を取得した。この得られた区分をゲル濾過用樹
脂：トヨパールＨＷ６５Ｓ（東ソー株式会社）５００ｍ
Ｌのカラムに吸着させ、１０００ｍＬ／ｈｒの流速に
て、４ＭのＮａＣｌ／２０ｍＭ酢酸ソーダ緩衝液（ｐＨ
６．０）で洗浄した後、１５００ｍＬ／ｈｒの流速に
て、２ＭのＮａＣｌ／２０ｍＭ酢酸ソーダ緩衝液（ｐＨ
６．０）で溶出して、ほぼ純品に近い精製酵素活性区分
（４６．７単位／ｍｇ蛋白質）２６０ｍＬを得た。この
活性収率は、約２７．６％であった。After the completion of the culture, the bacterial cells were removed by filtration to obtain a culture filtrate: 12.7L. The enzyme activity of this culture filtrate was 0.5 unit / mL. The culture filtrate was concentrated about 15 times with an ultrafiltration concentrator: Sartokonmini (Germany: Sartorius) to obtain 860 mL of concentrated solution (activity: 7.7 units / mL), and this concentrated solution was further added to agarose. Gel: Sepharose CL-6B (Sweden: Pharmacia) adsorbed on a 500 mL column, washed with 20 mM sodium acetate buffer, pH 6.0 (4 ° C.) at a flow rate of 750 mL / hr, and then further 12
20 mM Tris-HCl at a flow rate of 50 mL / hr
Elution was performed with a buffer solution at pH 8.0 (35 ° C.) to obtain the active category. This obtained section is designated as gel filtration resin: Toyopearl HW65S (Tosoh Corporation) 500 m
L column and adsorbed at a flow rate of 1000 mL / hr, 4 M NaCl / 20 mM sodium acetate buffer (pH
6.0), and then washed with 2 M NaCl / 20 mM sodium acetate buffer (pH) at a flow rate of 1500 mL / hr.
Elution at 6.0) yielded 260 mL of a purified enzyme activity fraction (46.7 units / mg protein) that was almost pure. The activity yield was about 27.6%.

【００３２】実施例 ３ 乾燥オゴノリ原藻１５ｋｇを、充分量の水で洗浄した
後、更に４０℃の温水５００Ｌに１時間浸漬した。水切
り後、４５℃の８５％エタノール７０Ｌに１５分間、攪
拌浸漬せしめ、この操作を２回繰り返した。その後、水
洗を行ない、そして水切りした後、９０℃の熱水２００
Ｌ中で３時間の攪拌抽出を行なった。そして、５５℃ま
で冷却した後、実施例２で培養濾液として得られた紅藻
粘質多糖分解酵素（１５０単位／５０ｍＬ）を加えて８
０分間反応させ、粘度を低下させた後、温度を９０℃ま
で上げて、反応を停止させ、遠心分離により、上澄み区
分２３０Ｌを回収した。こうして得られた濾液に、９５
％エタノール：１０００Ｌ、２０％ＮａＣｌ：７５０ｍ
Ｌを加えて攪拌した後、４℃に冷却し、一夜放置して、
沈澱を充分に析出させた。その後、沈澱物を回収し、イ
オン交換水６５Ｌを加えて９０℃に加熱溶解せしめ、遠
心分離して、約１００Ｌの分離液を得た。その後、かか
る分離液を無菌濾過した後、凍結乾燥して、２．６ｋｇ
のオゴノリ熱水抽出物（ＧＷＳ）を得た。収率は、１
７．３％であった。Example 3 15 kg of dried agar beetle algae was washed with a sufficient amount of water and then further immersed in 500 L of warm water at 40 ° C. for 1 hour. After draining, the mixture was immersed in 70 L of 85% ethanol at 45 ° C. for 15 minutes with stirring, and this operation was repeated twice. Then, after washing with water and draining, hot water at 90 ° C. 200
Stirring extraction was performed in L for 3 hours. Then, after cooling to 55 ° C., the red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme (150 units / 50 mL) obtained as the culture filtrate in Example 2 was added to give 8
After reacting for 0 minutes to reduce the viscosity, the temperature was raised to 90 ° C. to stop the reaction, and 230 L of supernatant was collected by centrifugation. The filtrate thus obtained contains 95
% Ethanol: 1000 L, 20% NaCl: 750 m
After adding L and stirring, the mixture was cooled to 4 ° C. and left overnight,
The precipitate was fully precipitated. Thereafter, the precipitate was collected, and 65 L of ion-exchanged water was added, and the mixture was heated and dissolved at 90 ° C and centrifuged to obtain about 100 L of a separated liquid. Then, the separated liquid is sterile filtered and freeze-dried to give 2.6 kg.
Was obtained (GWS). Yield is 1
It was 7.3%.

【００３３】実施例 ４ 実施例２において得られた紅藻粘質多糖分解酵素を用い
て、その至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、及び温度安
定性を下記の如くして調べ、その結果を、図１〜図４に
示した。Example 4 Using the red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme obtained in Example 2, its optimum pH, pH stability, optimum temperature and temperature stability were examined as follows, and The results are shown in FIGS.

【００３４】１）至適ｐＨ 酢酸緩衝液（Ｂｆ）、リン酸緩衝液（Ｂｆ）、Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液（Ｂｆ）を用い、それぞれの緩衝液（Ｂ
ｆ）１００ｍＭを含む基質に対して、３７℃で、２０分
間酵素を作用せしめ、最も高い活性を示したｐＨ５．０
での活性値を１００％として、相対活性を算出し、その
結果を図１に示した。1) Optimum pH Acetate buffer (Bf), phosphate buffer (Bf), Tris
-HCl buffer (Bf) is used, and each buffer (Bf
f) The enzyme was allowed to act on the substrate containing 100 mM at 37 ° C. for 20 minutes, and showed the highest activity at pH 5.0.
The relative activity was calculated by setting the activity value at 100% as 100%, and the result is shown in FIG.

【００３５】２）ｐＨ安定性 上記の３種の緩衝液を用い、それぞれの緩衝液（Ｂｆ）
を濃度５０ｍＭとなるように添加した酵素液を、２８℃
で、１６時間放置した後、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
６．０）で１０倍希釈し、活性を測定した。試験前の活
性値を１００％として、残存活性を算出し、図２に示し
た。2) pH stability Using the above three buffers, each buffer (Bf)
The enzyme solution was added at a concentration of 50 mM at 28 ° C.
Then, after standing for 16 hours, 20 mM acetate buffer (pH
After diluting 10 times with 6.0), the activity was measured. The residual activity was calculated by setting the activity value before the test as 100% and shown in FIG.

【００３６】３）至適温度 各温度で活性測定を行ない、最大活性を示した５５℃で
の活性値を１００％として、相対活性を算出し、図３に
示した。3) Optimum temperature The activity was measured at each temperature, and the relative activity was calculated by setting the activity value at 55 ° C., which showed the maximum activity, to 100%, and the relative activity was calculated.

【００３７】４）温度安定性 それぞれの温度で酵素液を１０分間放置した後、適宜に
希釈し、活性を測定した。試験前の活性値を１００％と
して、残存活性を算出し、図４に示した。4) Temperature stability The enzyme solution was allowed to stand at each temperature for 10 minutes, then diluted appropriately and the activity was measured. The residual activity was calculated by setting the activity value before the test as 100% and shown in FIG.

【００３８】[0038]

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
によれば、優れた耐熱性を有する有用な紅藻粘質多糖分
解酵素が提供され得、そして、その性質を利用すること
によって、紅藻多糖からのオリゴ糖の工業的な製造が可
能となったのである。そして、そのような紅藻多糖から
のオリゴ糖については、でんぷん老化防止作用、難消化
性、水分活性調節性、保湿性蛋白質の保護・安定化、整
腸作用、難う蝕性、抗う蝕性、血糖上昇抑制作用、静菌
作用等の優れた諸性質が確認されており、それらの性質
を用いた用途への適応は勿論、今後様々な分野での利用
が期待されているのである。As is clear from the above description, according to the present invention, a useful red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme having excellent heat resistance can be provided, and by utilizing its properties, It has become possible to industrially produce oligosaccharides from red algal polysaccharides. And for oligosaccharides from such red algal polysaccharides, starch anti-aging action, indigestion, water activity regulation, protection / stabilization of moisturizing protein, intestinal action, carious caries, anti-caries, It has been confirmed that various properties such as a blood glucose elevation suppressing action and a bacteriostatic action are exhibited, and it is expected to be used in various fields in the future as well as being adapted to applications using these properties.

【００３９】また、この本発明に係る新規な紅藻粘質多
糖分解酵素は、シュードモナス属に属する細菌を培養す
ることによって、有利に製造され得るものであり、特に
本発明者らが見出したシュードモナス・エスピー・Ｏ−
１４８（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６７）は、土壌由来の微
生物からなる生産菌として、そのような酵素を効果的に
与え得るものである。The novel red algal mucopolysaccharide degrading enzyme according to the present invention can be advantageously produced by culturing a bacterium belonging to the genus Pseudomonas, and in particular Pseudomonas found by the present inventors.・ SP ・ O-
148 (FERM P-13767) can effectively give such an enzyme as a production bacterium composed of a soil-derived microorganism.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】実施例４において得られた紅藻粘質多糖分解酵
素の至適ｐＨを示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the optimum pH of the red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme obtained in Example 4.

【図２】実施例４において得られた紅藻粘質多糖分解酵
素のｐＨ安定性を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the pH stability of the red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme obtained in Example 4.

【図３】実施例４において得られた紅藻粘質多糖分解酵
素の至適温度を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the optimum temperature of the red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme obtained in Example 4.

【図４】実施例４において得られた紅藻粘質多糖分解酵
素の温度安定性を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing the temperature stability of the red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme obtained in Example 4.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 伊藤 昌雄 愛知県安城市昭和町19番10号 新日本化学 工業株式会社内 (72)発明者 山本 綽 愛知県安城市昭和町19番10号 新日本化学 工業株式会社内 (72)発明者 吉沢 康子 千葉県船橋市日の出２丁目20番２号 昭和 産業株式会社総合研究所内 (72)発明者 常広 淳 千葉県船橋市日の出２丁目20番２号 昭和 産業株式会社総合研究所内 (72)発明者 福井 史生 千葉県船橋市日の出２丁目20番２号 昭和 産業株式会社総合研究所内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI technology display location (C12N 1/20 C12R 1:38) (72) Inventor Masao Ito 19 Showamachi, Anjo City, Aichi Prefecture No. 10 within Shin Nippon Kagaku Kogyo Co., Ltd. (72) Inventor Takeshi Yamamoto 19-10 Showa-machi, Anjo City, Aichi Prefecture Within No. 10 Shin-Nippon Kagaku Kogyo Co., Ltd. (72) Yasuko Yoshizawa 2-20-2 Hinode, Funabashi City, Chiba Prefecture No. Showa Sangyo Co., Ltd. Research Institute (72) Inventor Atsushi Jun Hiroshi 2-20-2 Hinode, Funabashi City, Chiba Prefecture Showa Sangyo Co., Ltd. Research Institute (72) Fumio Fukui 2-20 2 Hinode, Funabashi City, Chiba Prefecture No. Showa Sangyo Co., Ltd. Research Institute

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する新規な紅藻
粘質多糖分解酵素： １）作用 紅藻粘質多糖をエンド型に加水分解し、重合度４を主体
とするオリゴ糖を生成する反応を触媒する； ２）基質特異性 β−１，４ガラクトシド結合を有するガラクタン系の多
糖類並びにネオアガロヘキサオース以上の少糖に作用
し、カラギーナン、ネオアガロテトラオース、ネオアガ
ロビオース、乳糖には作用しない； ３）至適ｐＨ及びｐＨ安定性 紅藻粘質多糖であるオゴノリ熱水抽出物を基質としたと
きの至適ｐＨは４．５〜５．５であり、２８℃、１６時
間、基質非存在の条件下では、ｐＨ５．５〜８．０で安
定である； ４）至適温度及び熱安定性 オゴノリ熱水抽出物を基質としたときの至適温度は５５
℃であり、ｐＨ７．５、１０分間、基質非存在の条件下
では、５０℃で安定、９５℃で約７２．５％の活性が残
存している； ５）失活の条件 ｐＨ６．０、１２０℃、１０分間、基質非存在の条件下
では、約１０％の活性が残存し、１２０℃、６０分間で
完全に失活する； ６）分子量 ４１０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）； ７）等電点 ４．７〜５．６（等電点電気泳動法）； ８）金属塩等の影響 ｐＨ６．０、２８℃、１ｍＭの金属塩等の塩濃度下、１
６時間の処理で、Ａｇ⁺ 、Ｎ−ブロモスクシンイミドが
５％以下、Ｃｕ²⁺、Ｆｅ³⁺が１５〜５０％、Ｆｅ²⁺、Ｈ
ｇ²⁺が７０〜８０％の残存活性を示し、Ｎａ⁺ 、Ｍ
ｇ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｎｉ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｂａ
²⁺、Ｐｂ²⁺、Ａｌ³⁺では安定である。1. A novel red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme having the following physicochemical properties: 1) Action Hydrolysis of red alga mucilage polysaccharide to endo type produces oligosaccharides mainly having a degree of polymerization of 4. Catalyze the reaction; 2) Substrate specificity Acts on galactan-based polysaccharides having β-1,4 galactoside bond and oligosaccharides of neo-agarohexaose or higher, carrageenan, neo-agaro-tetraose, neo-agarobiose , It does not act on lactose; 3) Optimum pH and pH stability The optimum pH is 4.5 to 5.5 at 28 ° C when the hot water extract of red seaweed mucilage, Ogonori, is used as a substrate. It is stable at pH 5.5 to 8.0 under the condition that no substrate is present for 16 hours; 4) Optimum temperature and thermostability The optimum temperature is 55 when using the hot water extract of Scutellaria japonica as a substrate.
C., pH 7.5, 10 minutes, in the absence of substrate, stable at 50.degree. C., about 72.5% activity remains at 95.degree. C .; 5) Deactivation condition pH 6.0, About 10% of the activity remains under the condition that the substrate is absent at 120 ° C. for 10 minutes, and is completely inactivated at 120 ° C. for 60 minutes; 6) Molecular weight 41000 (SDS-PAGE method); 7) Isoelectricity Points 4.7 to 5.6 (isoelectric focusing); 8) Effect of metal salts, etc. pH 6.0, 28 ° C., 1 mM under salt concentration of metal salts, etc., 1
By treatment for 6 hours, Ag ⁺ , N-bromosuccinimide 5% or less, Cu ²⁺ , Fe ³⁺ 15 to 50%, Fe ²⁺ , H
g ²⁺ shows a residual activity of 70 to 80%, Na ⁺ , M
g ²⁺ , Ca ²⁺ , Mn ²⁺ , Co ²⁺ , Ni ²⁺ , Zn ²⁺ , Ba
It is stable with ²⁺ , Pb ²⁺ and Al ³⁺ . 【請求項２】 土壌由来の微生物にて生産された請求項
１に記載の新規な紅藻粘質多糖分解酵素。2. The novel red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme according to claim 1, which is produced by a microorganism derived from soil. 【請求項３】 シュードモナス属に属する紅藻粘質多糖
分解酵素生産菌を培養し、その培養物から、請求項１に
記載の紅藻粘質多糖分解酵素を採取することを特徴とす
る紅藻粘質多糖分解酵素の製造法。3. A red alga characterized by culturing a red alga slime polysaccharide-degrading enzyme-producing bacterium belonging to the genus Pseudomonas, and collecting the red alga slime polysaccharide degrading enzyme according to claim 1 from the culture. A method for producing a mucilage polysaccharide degrading enzyme. 【請求項４】 前記紅藻粘質多糖分解酵素生産菌が、Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１３７６７として寄託されたシュードモナ
ス・エスピー・Ｏ−１４８（ Pseudomonas sp. Ｏ−１
４８）若しくはその変異株である請求項３に記載の紅藻
粘質多糖分解酵素の製造方法。4. The red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme producing bacterium is F
Pseudomonas sp. O-1 deposited as ERM P-13767
48) or its mutants, The method for producing a red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme according to claim 3. 【請求項５】 請求項１に記載の耐熱性に優れた紅藻粘
質多糖分解酵素を生産する能力を有し、ＦＥＲＭ Ｐ−
１３７６７として寄託されたシュードモナス・エスピー
・Ｏ−１４８（ Pseudomonas sp.Ｏ−１４８）。5. FERM P-, which has the ability to produce the red alga mucilage polysaccharide degrading enzyme excellent in heat resistance according to claim 1.
Pseudomonas sp. O-148 deposited as 13767.