JPH0724578B2 - Nisin-producing microorganism and method for producing nisin using the same - Google Patents
Nisin-producing microorganism and method for producing nisin using the sameInfo
- Publication number
- JPH0724578B2 JPH0724578B2 JP2246787A JP24678790A JPH0724578B2 JP H0724578 B2 JPH0724578 B2 JP H0724578B2 JP 2246787 A JP2246787 A JP 2246787A JP 24678790 A JP24678790 A JP 24678790A JP H0724578 B2 JPH0724578 B2 JP H0724578B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nisin
- producing
- strain
- strains
- production
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ナイシンの生産方法及びナイシン生産性微生
物に関する。ナイシンは、食品の防腐剤として、またボ
ッリヌス菌の増殖抑制に有用な物質である。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing nisin and a nisin-producing microorganism. Nisin is a substance useful as a food preservative and for inhibiting the growth of Borrinus.
ナイシン(Nisin)はストレプトコッカス ラクチス(S
treptococcus lactis)の特定な菌株(例えばATCC 114
54株)が生産するペプチド性の抗菌性物質である。この
物質は下記に示す一次構造を有することが確認されてい
る(J.Amer.Chemi.Soci.vol.93,4634〜4635,1971)。Nisin is Streptococcus lactis (S
specific strains of treptococcus lactis (eg ATCC 114
54 strain) is a peptide antibacterial substance. It has been confirmed that this substance has the following primary structure (J. Amer. Chemi. Soci. Vol. 93, 4634 to 4635, 1971).
Abu=α−aminobutyric acid(アミノ酪酸) Dha=dehydroalanine(デヒドロアラニン) Dhb=dehydrobutyrine(デヒドロブチリン) ナイシンはクロストリジュウム属など狭い範囲のグラム
陽性菌に対して抗菌性を有しているが臨床での使用は実
現していない。一方、食品製造に使用する乳酸菌が生産
することから、安全性も高く、米国においてはチーズの
異常醗酵防止や腐敗防止の目的で使用されている。又特
開昭59−42322号公報には、ナイシンを有効成分とする
制癌剤が開示されている。 Abu = α-aminobutyric acid Dha = dehydroalanine Dhb = dehydrobutyrine Nisin has antibacterial activity against a narrow range of Gram-positive bacteria such as Clostridium but is clinically Has not been realized. On the other hand, since lactic acid bacteria used for food production are produced, it is highly safe and is used in the United States for the purpose of preventing abnormal fermentation and decay of cheese. Further, JP-A-59-42322 discloses a carcinostatic agent containing nisin as an active ingredient.
ナイシンは、ストレプトコッカス ラクチスATCC11454
株などナイシン生産株を培養し、この培養液から精製回
収されている。又、チーズの異常醗酵防止用には、これ
らの生産株をスターターとして使用することが行なわれ
ている。Nisin, Streptococcus lactis ATCC11454
Nisin-producing strains such as strains are cultivated and purified and recovered from this culture solution. In order to prevent abnormal fermentation of cheese, these production strains are used as a starter.
ナイシン生産株はしばしば培養、継代を続けると生産性
を失うことからプラスミド上にナイシン生産に関連する
遺伝子、若しくはナイシン生産遺伝子が存在すると考え
られてきた。特開昭60−66976号公報には、ナイシン生
産微生物より、接合によりナイシン生産性を目的微生物
に導入する方法が開示されており、又WO/90 0558公報に
は、ナイシン前駆体をコードするDNAが開示されてい
る。Since the nisin producing strain often loses its productivity when it is cultured and passaged, it has been considered that a gene related to nisin production or a nisin producing gene is present on the plasmid. JP-A-60-66976 discloses a method for introducing nisin productivity into a target microorganism by conjugation from a nisin-producing microorganism, and WO / 90 0558 discloses a DNA encoding a nisin precursor. Is disclosed.
本発明者らは、ナイシン生産能を有する微生物について
研究を進めた結果、ナイシンの生産が特定の培養条件下
で増大することを見出した。また従来プラスミドに存在
するとされていたナイシン生産遺伝子を染色体上に有す
る乳酸菌を見出した。本発明はこれらの知見に基づきな
されたもので、ナイシンの高濃度生産方法を提供するこ
とを課題とする。The present inventors have conducted research on microorganisms capable of producing nisin, and as a result, found that the production of nisin is increased under certain culture conditions. We also found a lactic acid bacterium that has a nisin-producing gene on the chromosome, which was previously thought to exist in a plasmid. The present invention was made based on these findings, and an object of the present invention is to provide a high-concentration production method of nisin.
ナイシンの生産にあたってはナイシン生産能を有し、か
つ自から生産するナイシンに対して耐性を有する株を分
離することが必要である。このためにはナイシン感受性
試験とナイシン生産試験を行う。In the production of nisin, it is necessary to isolate a strain that has nisin-producing ability and is resistant to nisin produced by itself. For this purpose, a nisin sensitivity test and a nisin production test are performed.
ナイシン生産微生物としては、従来知られている乳酸菌
を対象とすることが好ましいがこれ以外の微生物であっ
てもさしつかえない。As the nisin-producing microorganism, it is preferable to target a conventionally known lactic acid bacterium, but other microorganisms may be used.
ナイシン感受性試験は104I.U./mlのナイシンを使用した
カップテストにより行い、生産阻止円の大きさで判定す
る。スクリーニング対象株を混釈したのち、ステンレス
スチールカップ法により検定を行う。The nisin sensitivity test is performed by a cup test using 10 4 IU / ml of nisin, and the size is determined by the size of the production inhibition circle. After the strains to be screened are mixed, the test is performed by the stainless steel cup method.
ついで感受性試験陰性株についてナイシン生産試験を行
う。ナイシンの生産は種々の方法で検定できるが、Gass
onの方法(Gasson,M.J.FEMS microbiol.Lett.vol.21,p7
〜(1984))が一般的である。これは、ナイシン感受性
株ストレプトコッカス クレモリス〔Streptococcus cr
emoris ATCC 14365〕に対し生育阻害を示した菌株の培
養上清をさらにpH8.0の条件下での加熱処理及びα−キ
モトリプシン処理し、そのいずれによっても失活し場
合、その菌株をナイシン生産性と判定し、陽性株として
選別するものである。Then, a nisin production test is carried out on the sensitivity test negative strain. Nisin production can be assayed by various methods, but Gass
on method (Gasson, MJFEMS microbiol.Lett.vol.21, p7
~ (1984)) is common. This is a nisin-sensitive strain Streptococcus cr
emoris ATCC 14365], the culture supernatant of a strain showing growth inhibition was further heat-treated under the condition of pH 8.0 and α-chymotrypsin treatment, and when the strain was inactivated by any of them, the strain was treated with nisin. It is determined to be positive and selected as a positive strain.
このようにして、選別されたナイシン生産株は、本発明
におけるナイシン生産株として使用できる。しかし、ナ
イシン生産と耐性に関する遺伝子はプラスミド上に存在
しており、プラスミドは継代によりしばしば脱落する。
このため、選別された生産株中からナイシン生産に関す
る遺伝子が染色体に存在するもののみを選別することが
好ましい。選別にあたっては、WO/90 0558に開示された
ナイシンプレカーサー遺伝子を使用したスクリーニング
などが採用できる。しかし、本発明においては、より簡
便な方法としてプラスミドの分離試験を行って選別し
た。この方法は、微生物中のプラスミドを分離・検出
し、プラスミドの存在しない株が、染色体中にナイシン
関連遺伝子が存在していると判断するものである。The nisin producing strain thus selected can be used as the nisin producing strain in the present invention. However, genes for nisin production and resistance are present on the plasmid, which is often shed by passage.
Therefore, it is preferable to select only those having a gene for nisin production on the chromosome from the selected production strains. For selection, screening using the nisin precursor gene disclosed in WO / 90 0558 can be employed. However, in the present invention, as a simpler method, a plasmid separation test was performed to select. According to this method, a plasmid in a microorganism is separated and detected, and a plasmid-free strain is determined to have a nisin-related gene in its chromosome.
ナイシン生産株の生産増強は、倍地中へアミノ酸を添加
することにより容易に誘導できる。The production enhancement of the nisin producing strain can be easily induced by adding an amino acid into the medium.
添加するアミノ酸としては、ナイシンの構造中に含ま
れるアミノ酸、Ala,Leu,Ileu,Pro,Lys,Asn,Met,Val,Se
r,His、代謝系路においてこれらのアミノ酸の前駆体
となるアミノ酸、成育に必須なアミノ酸、又はこれら
のアミノ酸の1種または2種以上の混合物を挙げること
ができる。生産に当っては、通常の倍地に添加するアミ
ノ酸を1ml当り0.1〜10mg/ml添加し、対象とする菌株の
至適条件で培養すればよい。培養方法は、通常の静置培
養、振盪培養など微生物に適した培養法であればどのよ
うな方法でも採用し得るものである。また、ナイシンの
採取も従来知られている。例えば、特開昭59−42322号
に開示されているクロロホルム抽出、米国特許2,935,50
3号に開示されているアセトン−メタノール抽出などど
のような方法をも採用することができる。The amino acids to be added include the amino acids contained in the structure of nisin, Ala, Leu, Ileu, Pro, Lys, Asn, Met, Val, Se.
Examples include r, His, amino acids that are precursors of these amino acids in metabolic pathways, amino acids that are essential for growth, or one or a mixture of two or more of these amino acids. In production, 0.1-10 mg / ml of amino acid to be added to ordinary medium is added per ml, and the strain may be cultured under optimal conditions for the target strain. As a culture method, any method can be adopted as long as it is a culture method suitable for a microorganism such as ordinary static culture and shaking culture. Further, the collection of nisin has been known conventionally. For example, chloroform extraction disclosed in JP-A-59-42322, U.S. Pat.
Any method such as acetone-methanol extraction disclosed in No. 3 can be adopted.
以下に実施例を示し、さらに本発明を詳細に説明する。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.
実施例1. ナイシン耐性株の選別 本発明者らが保存しているストレプトコッカス ラクチ
ス(Streptococcus lactis)78株についてナイシン耐性
株を選別した。Example 1 Selection of Nisin-Resistant Strains Nisin-resistant strains were selected from 78 Streptococcus lactis strains that the present inventors have stored.
M17broth培地で1晩培養し、この培養液を生理食塩水で
10倍に希釈し、希釈液0.2mlと10mlのElliker agar medi
umを混釈し、平板プレートとした。このプレートにはナ
イシンの拡散を促進させるため、ツィーン20を1%濃度
になるよう添加してある。この検出プレートにステンレ
ススチールカップをおき、0.02N塩酸に溶解したナイシ
ン溶液(104I.U./ml)を注入した。その後28℃で一晩培
養し、生育阻止円を測定した。Cultivated overnight in M17broth medium.
Dilute 10 times, and dilute 0.2 ml and 10 ml of Elliker agar medi
Um was poured into a flat plate. Tween 20 was added to this plate at a concentration of 1% to promote the diffusion of nisin. A stainless steel cup was placed on this detection plate, and a nisin solution (10 4 IU / ml) dissolved in 0.02N hydrochloric acid was injected. Then, it was cultured overnight at 28 ° C., and the growth inhibition circle was measured.
大部分の菌株は、ナイシンにより生育が阻害され、15〜
20mmの阻止円が形成された。表1に示す16株については
阻止円が形成されずナイシン耐性を示した。Most strains are growth-inhibited by nisin,
A 20 mm stop circle was formed. The 16 strains shown in Table 1 did not form an inhibition circle and showed nisin resistance.
尚、M−17broth倍地,Elliker agar mediumは下記組成
を有している。The M-17broth medium, Elliker agar medium has the following composition.
M−17broth medium 〔Appl.microbiol.,29,807(1975)参照〕 ポリペプトン(BBL) 5.0g フィトンペプトン(BBL) 5.0g イースト抽出物(BBL) 2.5g ビーフ抽出物(Difco) 5.0g ラクトース 5.0g L−アスコルビン酸 0.5g β−グリセロリン酸・二ナトリウム 19.0g 1M MgSO4・7H2O 1 ml蒸留水 1 pH7.15 滅菌条件:121℃ 15分間 Elliker agar medium 〔J.Dairy Sci.,39,1611(1956)参照〕 トリプトン 2 % イースト抽出物 0.5 % ゼラチン 0.25% デキストロース 0.5 % ラクトース 0.5 % シュクロース 0.5 % 食 塩 0.4 % 酢酸ナトリウム 0.15% アスコルビン酸 0.05%寒 天 1.5 % pH6.8 実施例2. ナイシン生産株の選別 実施例1で選別した16株をそれぞれM−17 broth倍地で
1晩培養し、次いで0.45μmのフィルターで濾過した。
この培養上清を次の三つに試料に分けた。A:(pHを塩酸
で2.0に調整する)、B(pHをNaOHで7.0に調整する)、
C(pHをNaOHで8.0に調整する)、AとCは100℃で30分
間加熱し、Bは5mg/mlのトリプシンまたはα−キモトリ
プシンを用いて37℃で1時間処理をした。一方、ナイシ
ン感受性株であるストレプトコッカス クレモリス(St
reptococcus cremoris)ATCC14356株をM−17倍地で1
晩培養し、この培養液を生理食塩水で10倍に希釈し、そ
の希釈液0.2mlと、10mlのElliker agar medium(寒天濃
度0.7%)を混釈して、あらかじめ作成しておいたEllik
er agar medium(寒天濃度1.5%)を20mlシャーレに分
注し、水平固化させたプレート上に、4ml重層し、固化
させた。実施例1と同様にナイシンの拡散を促進させる
ために、ツィーン20を1%濃度になるよう添加した。こ
の平板を4℃で1時間予備冷却したのち、ステンレスカ
ップをのせ、上述の培養上清、酵素処理液、加熱処理液
を注入した。28℃、24時間培養後、生育阻止円の直径を
測定した。M-17broth medium [Appl.microbiol., 29, 807 (1975 ) refer to Fig polypeptone (BBL) 5.0g phytone peptone (BBL) 5.0g yeast extract (BBL) 2.5 g beef extract (Difco) 5.0g Lactose 5.0g L- ascorbic acid 0.5 g beta-glycerophosphate disodium 19.0g 1M MgSO 4 · 7H 2 O 1 ml distilled water 1 pH 7.15 sterilization conditions:. 121 ° C. 15 minutes Elliker agar medium [J.Dairy Sci, 39, 1611 (1956)] Tryptone 2% yeast extract 0.5% gelatin 0.25% dextrose 0.5% lactose 0.5% sucrose 0.5% dietary salt 0.4% sodium acetate 0.15% ascorbic acid 0.05% agar 1.5% pH6.8 Example 2. Nisin Selection of Production Strains Each of the 16 strains selected in Example 1 was cultured overnight in M-17 broth medium and then filtered with a 0.45 μm filter.
This culture supernatant was divided into the following three samples. A: (pH adjusted to 2.0 with hydrochloric acid), B (pH adjusted to 7.0 with NaOH),
C (pH adjusted to 8.0 with NaOH), A and C were heated at 100 ° C. for 30 minutes, and B was treated with 5 mg / ml trypsin or α-chymotrypsin at 37 ° C. for 1 hour. On the other hand, Streptococcus cremoris (St
reptococcus cremoris) ATCC14356 strain 1 in M-17 medium
After overnight culture, this culture solution was diluted 10-fold with physiological saline, and 0.2 ml of the diluted solution was mixed with 10 ml of Elliker agar medium (agar concentration 0.7%) to prepare Ellikr agar prepared in advance.
The er agar medium (agar concentration: 1.5%) was dispensed into a 20 ml Petri dish, and 4 ml was layered on a horizontally solidified plate to solidify. As in Example 1, in order to promote the diffusion of nisin, Tween 20 was added at a concentration of 1%. This plate was pre-cooled at 4 ° C. for 1 hour, placed on a stainless steel cup, and the above-mentioned culture supernatant, enzyme treatment solution, and heat treatment solution were injected. After culturing at 28 ° C. for 24 hours, the diameter of the growth inhibition circle was measured.
同様にナイシン生産株であるATCC 7962,ATCC11454,NCDO
497株の培養上清をコントロールとして試験を行った。Similarly, ATCC 7962, ATCC 11454, NCDO, which are Nisin producers
The test was performed using the culture supernatant of 497 strain as a control.
ナイシンはペプチド清の抗菌物質のためpHに依存して熱
安定性は変化する。又一部のプロテアーゼにより加水分
解されて失活する特性を有している。これらの既知のナ
イシン生産株の培養上清は、pH2.0で加熱処理を行うと
安定であるがpH8.0で失活する。またトリプシンでは安
定であるがα−キモトリプシンでは失活する。この性質
を利用し、実施例1で分離した16株の培養上清の上記
(A),(B),(C)について、標準株の培養上清と
比較したところ、表1に(+)と示した4株が陽性であ
ると判定された。Since nisin is an antibacterial substance for peptide purification, its thermal stability changes depending on pH. It also has the property of being hydrolyzed by some proteases and inactivated. The culture supernatants of these known nisin-producing strains are stable when heat-treated at pH 2.0, but deactivate at pH 8.0. It is stable with trypsin but inactivated with α-chymotrypsin. Utilizing this property, the above (A), (B) and (C) of the culture supernatants of 16 strains isolated in Example 1 were compared with the culture supernatant of the standard strain, and Table 1 shows (+). The four strains indicated as "A" were determined to be positive.
またナイシン生産遺伝子はGassonらによりスクロース醗
酵遺伝子と近接して存在するといわれている(Gasson
他、FEMS microbiol.Lett.vol.21,7(1984)〕。In addition, the nisin-producing gene is said to exist in close proximity to the sucrose fermentation gene by Gasson et al. (Gasson
FEMS microbiol. Lett. Vol. 21, 7 (1984)].
このため16株のスクロース醗酵性を検索したところ表1
に示す結果を得た。Therefore, the sucrose fermentability of 16 strains was searched and Table 1
The results shown in are obtained.
以上の結果から16株中4株SBT1212,1213,1227,S2001を
ナイシン生産株と判定した。 From the above results, 4 out of 16 strains SBT1212, 1213, 1227, S2001 were determined to be nisin-producing strains.
実施例3. ナイシン生産株のプラスミド検索 上述したようにナイシン生産株のナイシン生産耐性遺伝
子は、これまでの報告によればプラスミド上に存在して
いると推定される。このため継代培養による生産能の欠
失などが発生すものとおもわれる。このため生産遺伝子
が染色体中に組みこまれた株の検索をAnderon,Mckayの
方法 〔Appl.Envirom.Microbiol.46,549(1983)参照〕を改
変して行った。Example 3. Plasmid search of nisin-producing strain As described above, the nisin-producing resistance gene of the nisin-producing strain is presumed to be present on the plasmid according to the reports so far. For this reason, it is considered that the production ability is lost due to the subculture. Therefore, the search for strains in which the produced gene was integrated into the chromosome was carried out by modifying the method of Anderon, Mckay [see Appl. Envirom. Microbiol. 46 , 549 (1983)].
実施例2で陽性と判定した4株、SBT1212,1213,1227,S2
001,ナイシン生産菌であることは確認されているが、プ
ラスミドの関与が未確認である株、NCDO 497およびプラ
スミド上にナイシン生産遺伝子が存在していることが確
認されているATCC 11454株、ATCC 7962株の計7株を対
象としてプラスミドの存在を検索した。Four strains determined to be positive in Example 2, SBT1212,1213,1227, S2
001, a strain that has been confirmed to be a nisin-producing bacterium, but the involvement of a plasmid has not been confirmed, NCDO 497, and ATCC 11454 strain that has been confirmed to have a nisin-producing gene on the plasmid, ATCC 7962 A total of 7 strains were searched for the presence of the plasmid.
各株をM−17broth培地において32℃4時間培養し、遠
心分離により菌体を回収した。Each strain was cultured in M-17 broth medium at 32 ° C. for 4 hours, and cells were collected by centrifugation.
菌体を10mM tris−NaCl(pH8.0)1mlに懸濁し、15000rp
mで5分間遠心し、上清を捨て菌体を6.7%ショ糖−50mM
Tris・Cl(pH8.0)380μに再懸濁させ、37℃5分間
放置した。次いでTris・HClに10mg/mlに溶解したリゾチ
ームを97μ添加し、37℃で10〜15分間放置する。次い
で0.25MEDTA−50mM Tris・HCl(pH8.0)を48μ、200m
g/mlの濃度になるように50mM Tris・HCl−20mM EDTA(p
H8.0)に溶解したSDSを28μを加え、混合し、3.0N Na
OH 28μ加え、さらに混合後、2.0M Tris・HCl(pH7.
0)を50μ加え、ゆるやかに混合する。5.0M NaCl72μ
を加え、1時間氷冷した後15000r.p.m.で30分間遠心
し、上清を得る。この上清に500μのTE緩衝液飽和フ
ェノールを添加混合し、常温で15000r.p.m.5分間遠心す
る。得られた上層液を回収し、500μのクロロホルム
−イソアルミアルコール(24:1)混液を添加し、混合す
る。この上層液を回収し、1mlの−20℃に冷却したエタ
ノールを添加混合し、次いで氷水中で30分間冷却する。
0℃で15000r.p.m.、30分間遠心しエタノールを除去
し、TE緩衝液20μを添加し、RNase液(10mg/ml、10mM
Tris.HCl、15mM NaCl,pH7.5)を1μ添加し37℃で30
分間反応させ、精製DNAを得る。Suspend the cells in 1 ml of 10 mM tris-NaCl (pH8.0),
Centrifuge at m for 5 minutes, discard the supernatant, and collect the cells for 6.7% sucrose-50 mM.
The cells were resuspended in 380 μm of Tris · Cl (pH8.0) and left at 37 ° C. for 5 minutes. Next, add 97 μ of lysozyme dissolved in Tris · HCl at 10 mg / ml, and leave at 37 ° C. for 10 to 15 minutes. Then add 0.25M EDTA-50mM Tris.HCl (pH8.0) 48μ, 200m
50mM Tris ・ HCl-20mM EDTA (p
28μ of SDS dissolved in H8.0) was added and mixed, and 3.0N Na
Add 28μ of OH and mix, then 2.0M Tris ・ HCl (pH 7.
Add 50μ of 0) and mix gently. 5.0M NaCl 72μ
Is added, and the mixture is ice-cooled for 1 hour and then centrifuged at 15000 rpm for 30 minutes to obtain a supernatant. To this supernatant, 500 μl TE buffer saturated phenol is added and mixed, and the mixture is centrifuged at room temperature at 15000 rpm for 5 minutes. The obtained upper layer solution is collected, and 500 μl of a chloroform-isoaluminum alcohol (24: 1) mixed solution is added and mixed. The upper layer liquid is collected, 1 ml of ethanol cooled to -20 ° C is added and mixed, and then cooled in ice water for 30 minutes.
Centrifuge at 15000 rpm for 30 minutes at 0 ° C to remove ethanol, add 20μ of TE buffer, and add RNase solution (10mg / ml, 10mM
Tris.HCl, 15mM NaCl, pH7.5) was added at 1μ and the temperature was 30 ℃ at 37 ℃.
Reaction for minutes to obtain purified DNA.
上述のようにして得たDNAをアガロースNA(ファルマシ
ア製)による電気泳動を行った。比較例としてλファー
ジのHindIII切断処理したものを同様に操作した。電気
泳動の結果を第1図に示す。SBT 1212,SBT 1227には染
色体DNA以外は検出されなかった。The DNA obtained as described above was electrophoresed with agarose NA (Pharmacia). As a comparative example, HindIII cleaved λ phage was treated in the same manner. The results of electrophoresis are shown in FIG. No chromosomal DNA was detected in SBT 1212 and SBT 1227.
この結果から、この2種のナイシン関連遺伝子は染色体
上に存在することが確認された。このSBT 1212,SBT 122
7は微工研に寄託している 〔寄託番号微工研菌寄第11674号,微工研菌寄第11675
号〕。この2株はナイシン生産株として有用である。From this result, it was confirmed that these two types of nisin-related genes exist on the chromosome. This SBT 1212, SBT 122
7 has been deposited with the Institute of Microtechnology [Deposit No. Microorganism Institute No. 11674, Microorganism Institute No. 11675
issue〕. These two strains are useful as nisin-producing strains.
実施例4. 実施例3で得られた2株について、このアミノ酸要求性
を検討した。Example 4. The amino acid requirement of the two strains obtained in Example 3 was examined.
KozakとDobrzanskiの培地(Kozak,W.,Dobr−zanski,W.
T.;Acta Microbiologica Polonica,26,361(1977))に
10mMのピルビン酸ナトリウムを添加したものを完全合成
培地として用いた。供試菌株はM17broth培地で1晩培養
し、生理食塩水で2回洗浄した後、完全合成培地に5%
接種した。アミノ酸要求性は、28℃、24時間後の菌株の
増殖の有無で判定した。Kozak and Dobrzanski medium (Kozak, W., Dobr−zanski, W.
T.; Acta Microbiologica Polonica, 26 , 361 (1977))
The medium supplemented with 10 mM sodium pyruvate was used as a completely synthetic medium. The test strain was cultured overnight in M17broth medium, washed twice with physiological saline, and then 5% in complete synthetic medium.
I inoculated. The amino acid requirement was judged by the presence or absence of growth of the strain after 28 hours at 28 ° C.
結果を表2に示した。両株とも多様なアミノ酸要求性を
示した。The results are shown in Table 2. Both strains showed diverse amino acid requirements.
実施例5. アミノ酸添加によるナイシン生産の増強 実施例4で選別した2株のナイシン生産株の内SBT 1212
株を使用し、アミノ酸添加によるナイシン生産増強につ
いて試験を行った。 Example 5 Enhancement of Nisin Production by Addition of Amino Acid Of the two nisin producing strains selected in Example 4, SBT 1212
The strain was used to test the enhancement of nisin production by the addition of amino acids.
SBT 1212株をM−17培地で培養を行った。M−17培地に
は、表3に示すアミノ酸を0.67mg/ml添加しておき、28
℃24時間培養し、培養上清中のナイシン活性を実施例2
に記載したS.cremoris ATCC 14365株を指標とするカッ
プ検定法により測定した。尚ナイシン標準として、Apli
n&Bar−rett社製のナイシン(106I.U./g)を用い、あ
らかじめ作製した検量線より求めた。SBT 1212 strain was cultured in M-17 medium. Amino acids shown in Table 3 were added to M-17 medium at 0.67 mg / ml.
After culturing at 24 ° C. for 24 hours, the nisin activity in the culture supernatant was determined in Example 2
It was measured by the cup assay method using the S. cremoris ATCC 14365 strain described in 1. As a nisin standard, Apli
It was determined from a calibration curve prepared in advance using nisin (10 6 IU / g) manufactured by n & Bar-rett.
表3に示すようにSer,Phe,Hypの3種のアミノ酸はナイ
シンの生産を増強し、特にSer,Pheは顕著であった。又
コントロールとしては生育要求性アミノ酸のみを添加
し、培養した。As shown in Table 3, the three amino acids Ser, Phe, and Hyp enhanced the production of nisin, and Ser and Phe were particularly remarkable. Further, as a control, only growth-requiring amino acids were added and cultured.
Serはナイシンの構成アミノ酸であり、添加によりナイ
シンの合成が促進されたものと考えられる。またフェニ
ールアラニンの添加はグルコース代謝に関係し代謝がセ
リンの合成に傾いたためと考えられた。Ser is a constituent amino acid of nisin, and it is considered that the addition thereof promoted the synthesis of nisin. It was also considered that the addition of phenylalanine was related to glucose metabolism and the metabolism was inclined to the synthesis of serine.
実施例6. 全乳30を殺菌後冷却し、この牛乳にセリンを20.1g添
加し、溶解し、あらかじめスターターとして培養したSB
T 1212株を加え、28℃で24時間培養した。この培養液の
ナイシン活性は103unit/mlであった。塩酸を加えpHを2.
0として、遠心分離により、カードとホエーを分離し
た。ホエー画分のpH4.2〜4.5に調整しこれに5%のクロ
ロホルムと0.1%の2級オクチルアルコールで乳濁させ
る。その後静置し、生じたクロロホルムゲルを得て、こ
のクロロホルムゲルに少量のアルコールを加えるとナイ
シン活性物質の沈澱が得られる。この沈澱を希塩酸に溶
解し、pH2.5〜3.0に調整後、等量のアルコールを加え不
沈物を沈澱として除去した後、減圧下で濃縮し、pH4に
調整し、折出する沈澱を回収した。この沈澱を0.01Nの
塩酸に溶解し凍結乾燥を行った。約11.9gのナイシンを
回収した。 Example 6. Whole milk 30 was sterilized and then cooled, and 20.1 g of serine was added to this milk, dissolved, and cultivated in advance as a starter SB
The T 1212 strain was added, and the mixture was cultured at 28 ° C for 24 hours. The nisin activity of this culture was 10 3 unit / ml. Add hydrochloric acid to adjust the pH to 2.
As 0, the curd and whey were separated by centrifugation. The pH of the whey fraction is adjusted to 4.2 to 4.5, and this is emulsified with 5% chloroform and 0.1% secondary octyl alcohol. Then, the mixture is allowed to stand to obtain a formed chloroform gel, and a small amount of alcohol is added to this chloroform gel to obtain a precipitate of the nisin active substance. This precipitate is dissolved in dilute hydrochloric acid, adjusted to pH 2.5-3.0, and then an equal amount of alcohol is added to remove the non-precipitate as a precipitate, which is then concentrated under reduced pressure to adjust the pH to 4 and recover the precipitated precipitate did. This precipitate was dissolved in 0.01N hydrochloric acid and freeze-dried. About 11.9 g of nisin was recovered.
発明の効果 本発明の方法によると生物によりナイシンの生産効率を
増強することができる。また、本発明の微生物はナイシ
ン生産遺伝子が染色体中に存在し、安定な株としてナイ
シン生産に使用することができる。Effect of the Invention According to the method of the present invention, the production efficiency of nisin can be enhanced by organisms. Further, the microorganism of the present invention has a nisin-producing gene in its chromosome and can be used as a stable strain for nisin production.
第1図は、乳酸菌の精製DNAのアガーロース電気泳動を
示す。FIG. 1 shows agarose electrophoresis of purified DNA of lactic acid bacteria.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:46) ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI technical display location C12R 1:46)
Claims (3)
トコッカス ラクチス。 菌体からDNAを抽出しプラスミドの存在を試験した場
合プラスミドに相当するDNAは検出されない。 培養液にセリンまたはフェニルアラニンの添加により
ナイシン生産が増強される。 ナイシン生産遺伝子が染色体中に存在する。1. A nisin-producing Streptococcus lactis having the following characteristics. When DNA is extracted from the cells and tested for the presence of the plasmid, the DNA corresponding to the plasmid is not detected. Nisin production is enhanced by the addition of serine or phenylalanine to the culture. The nisin producing gene is present in the chromosome.
チスSBT 1212株(微工研菌寄第11674号)またはSBT 122
7(微工研菌寄第11675号)である請求範囲(1)記載の
ストレプトコッカス ラクチス。2. A nisin-producing Streptococcus lactis strain SBT 1212 (Microtechnology Research Institute No. 11674) or SBT 122.
Streptococcus lactis according to claim (1), which is 7 (Microbiology Research Institute No. 11675).
ラクチスを培養し、ナイシンを生産するにあたり、培養
液中にセリンまたはフェニルアラニンを0.1〜10mg/ml添
加して培養を行い、ナイシンの生産を増強することを特
徴とナイシンの生産方法。3. Streptococcus according to claim 1.
A method for producing nisin, which comprises culturing lactis and producing nisin, in which 0.1 to 10 mg / ml of serine or phenylalanine is added to the culture solution and culturing to enhance nisin production.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2246787A JPH0724578B2 (en) | 1990-09-17 | 1990-09-17 | Nisin-producing microorganism and method for producing nisin using the same |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2246787A JPH0724578B2 (en) | 1990-09-17 | 1990-09-17 | Nisin-producing microorganism and method for producing nisin using the same |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04126093A JPH04126093A (en) | 1992-04-27 |
JPH0724578B2 true JPH0724578B2 (en) | 1995-03-22 |
Family
ID=17153669
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2246787A Expired - Lifetime JPH0724578B2 (en) | 1990-09-17 | 1990-09-17 | Nisin-producing microorganism and method for producing nisin using the same |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0724578B2 (en) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6794181B2 (en) * | 2002-10-09 | 2004-09-21 | Immucell Corporation | Method of purifying lantibiotics |
-
1990
- 1990-09-17 JP JP2246787A patent/JPH0724578B2/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ActaMicrobiologicaPolonica,26[4(1977)P.361−368 |
松原謙一著「プラスミド」(昭57−8−20)講談社P.99 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH04126093A (en) | 1992-04-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kwon-Chung et al. | Genetic evidence for role of extracellular proteinase in virulence of Candida albicans | |
Maisnier-Patin et al. | Purification, partial characterisation and mode of action of enterococcin EFS2, an antilisterial bacteriocin produced by a strain of Enterococcus faecalis isolated from a cheese | |
JPH04211360A (en) | New lactic acid bacterium, antimicrobial substance produced thereby, starter for fermenting milk containing the same bacterium and production of fermented milk using the same starter | |
US5173297A (en) | Bacteriocin from lactococcus lactis subspecies lactis | |
US5962240A (en) | Mycobacterium proteins and applications | |
Casman | Staphylococcal food poisoning | |
Tahara et al. | Isolation, partial characterization and mode of action of acidocin J1229, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus JCM 1229 | |
CA1277617C (en) | Antibiotic polypeptide, process for preparing it and the use thereof | |
JPH0724578B2 (en) | Nisin-producing microorganism and method for producing nisin using the same | |
Heilbronn et al. | Purification of a metalloprotease produced by Erwinia carotovora ssp. carotovora and the degradation of potato lectin in vitro | |
Mindich | Bacteriocins of Diplococcus pneumoniae I. Antagonistic Relationships and Genetic Transformations | |
JP2004512817A (en) | B2 / D + A-type polynucleotides isolated from Escherichia coli and biological uses of these polynucleotides and their polypeptides | |
US5232849A (en) | Bacteriocin from lactococcus lactis subspecies lactis | |
Bosne et al. | Mycobactin analysis as an aid for the identification of Mycobacterium fortuitum and Mycobacterium chelonae subspecies | |
US4931396A (en) | pTR2030, a conjugal plasmid and derivatives thereof that confer phage reisistance to group N streptococci | |
EP0208468A2 (en) | PTR2030, a conjugal plasmid and derivatives thereof that confer phage resistance to group N streptococci | |
Gutekunst et al. | A filamentous-like mutant of Listeria monocytogenes with reduced expression of a 60-kilodalton extracellular protein invades and grows in 3T6 and Caco-2 cells | |
US5139950A (en) | PTR2030, a conjugal plasmid and derivatives thereof that confer phage resistance to group N streptococci | |
Davie et al. | Action of streptolysin S, the group D hemolysin, and phospholipase C on whole cells and spheroplasts | |
JP2000505642A (en) | Novel adhesion factors of non-pathogenic microorganisms and their application for screening microorganisms for specific symbiotic properties; novel pharmaceutical compositions and food additives containing such microorganisms and adhesion factors | |
US7160548B2 (en) | Mycobacterium strains with modified erp gene and vaccine composition containing same | |
US5215898A (en) | Cytotoxic protein from the yeast Pichia inositovora | |
Berdal et al. | Occurrence and immunogenicity of proteinases from Legionella species | |
Barefoot et al. | Lactacin B, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus | |
Sedgwick et al. | Minicell production and bacteriophage superinducibility of thymidine-requiring strains of Haemophilus influenzae |