JPH07242696A - 植物病原体に対して活性な抗菌性ペプチド、その使用法およびこれに関連するスクリーニング法 - Google Patents

植物病原体に対して活性な抗菌性ペプチド、その使用法およびこれに関連するスクリーニング法

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JPH07242696A
JPH07242696A JP3287422A JP28742291A JPH07242696A JP H07242696 A JPH07242696 A JP H07242696A JP 3287422 A JP3287422 A JP 3287422A JP 28742291 A JP28742291 A JP 28742291A JP H07242696 A JPH07242696 A JP H07242696A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 植物病原体の阻害に有効なペプチド、及び植
物病原体に対して該ペプチドを使用する方法を提供す
る。 【構成】 アミノ酸配列： Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘ
ａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａ
ａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ
−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｘａａ （Ｘａａ ６、Ｘａａ ７、Ｘａａ ８、Ｘａａ １１、Ｘａａ
１３、Ｘａａ １８、Ｘａａ １９、Ｘａａ ２１及びＸａａ
２３は同一または異なり、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｏｒｎ，Ａ
ｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌ
ｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，３Ｈｙ
ｐ，４Ｈｙｐ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，
４，−ジヒドロキシフェニルアラニン又はＶａｌから選
ばれ、Ｘａａ １０はＡｌａ，Ａｒｇ，Ｏｒｎ，Ａｓｎ，
Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌ
ｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒ
ｐ，Ｔｙｒ，３，４，−ジヒドロキシフェニルアラニン
又はＶａｌから選ばれる）のペプチド（但しマガイニン
１ではない）を含む組成物

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は植物病原体を除くのに有
用なペプチド、および植物病原体に対してこれを使用す
る方法に関する。本発明は、またこれらと共に有用なス
クリーニング法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】様々な型の化学的化合物が微生物または
他の生命形態の成長を阻害し、もしくはこれらを殺すこ
とができる。人類は抗生物質などの店頭販売される消毒
薬および医薬化合物などといった日常的な品目で例示さ
れるものとしてこの現象を利用している。この研究の課
題としての本発明は近年に発見された類の抗生物化合物
の改良およびそのための努力に係り、上に例示したよう
な通常の抗生物質化合物とは異なり、この類の化合物を
補う化合物はペプチドとして知られるタンパクである。
タンパク質はアミノ酸と呼ばれる個々の構成ブロックか
ら組立てられている。タンパク中で、これらアミノ酸は
ペプチド結合と呼ばれる化学結合によって相互に結合さ
れている。一つのタンパクを構成するアミノ酸の結合体
の一端はＮ−末端またはアミノ末端と呼ばれ、その他方
の端部はＣ−末端またはカルボキシ末端と呼ばれてい
る。一つのペプチドを構成すべく選択されるアミノ酸構
成ブロックの種類およびその選択の順序は正確に遺伝物
質、即ち細胞のＤＮＡによって決定される。ある特定の
ペプチドは２通りの方法で構築できる。その一つの方法
は主としてヒトの、即ち非遺伝的介入により該ペプチド
を化学的に合成することである。この方法によれば、特
定のアミノ酸構成ブロックを選択し、これらを化学反応
により適当な順序に結合する。このタンパクの化学的合
成は何等直接的な生物的もしくは遺伝的補助を含まな
い。第２の方法は細胞系の遺伝的操作を利用して、該系
に所定のタンパクを生成せしめる。後者の方法は一般に
遺伝子工学と呼ばれている。
【０００３】以下により詳細に記載される本発明の課題
でもある抗生物質タンバクは、本発明で教示される如く
改良されて、農業環境調節に特に適したものとなる。本
発明の発見並びに教示を利用して、抗生物質ペプチドが
耕種学的価値または園芸学的価値を有する植物に対し有
害もしくは著しく破壊的であることがわかっている植物
病原体を阻害および／または殺すのに使用できることを
確立した。本発明の実際の適用の中には、これら抗生物
質ペプチドを、例えば伝統的な撒布などの方法あるいは
非伝統的方法、例えばトウモロコシあるいはジャガイモ
などの植物細胞を遺伝的に改良もしくは操作してこれら
ペプチドを表現させる方法などを利用して植物に適用す
る態様がある。例えば、本発明の抗生物質ペプチドの一
種をコードする遺伝物質をコーン（トウモロコシ）など
のこれらペプチドに対する遺伝子を通常もたない植物に
挿入して、該トウモロコシ植物（遺伝的に形質転換され
た）に高度の植物病原体耐性を付与することができた。
この点に関連して、これら抗生物質ペプチドが通常植物
細胞中には見出されないことが重要である。いずれにし
ろ、本発明の社会に与える利益は極めて大きいものと期
待される。というのは、本明細書に示す抗生物質化合物
は高い石油−由来の殺菌性化合物の使用を著しく減じ、
いくつかの場合にはその必要性を排除さえすることがで
きるからである。
【０００４】ここで言及する抗生物質ペプチドは、まず
１９８７年に報告された。この時２つの研究グループ
（その一つはダッドレイＨ．ウィリアムス（Ｄｕｄｌｅ
ｙ Ｈ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ）を筆頭とするものでありも
う一つはミハエルザスロフ（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｚａｓｌ
ｏｆｆ）を筆頭とする）が、アフリカツメガエル、ゼノ
パスラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の皮膚
内に含まれる腺によって分泌されるいくつかのペプチド
を首尾よく特徴付けし、報告した。これについてはジオ
バニーニ等（Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉ）の“ゼノパスラエ
ビスのプロホルモン由来のペプチドの生合成および分解
（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｄｅｇｒａｄａ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ
ｆｒｏｍＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ Ｐｒｏｈｏｒ
ｍｏｎｓ）”，ＢｉｏｃｈｅｍＪ．，（１９８７），２
４３，ｐｐ．１１３−１２０およびザスロフの“マガイ
ニン類（Ｍａｇａｉｎｉｎｓ），一連のゼノパスラエビ
ス皮フからの抗生物質ペプチド（Ａ Ｃｌａｓｓ ｏｆ
Ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
Ｆｒｏｍ Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｓｋｉｎ）：２種の活性型
の単離、特徴付けおよびプリカーサの部分ｃＤＮＡ配列
（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｔｗｏ Ａｃｔｉｖｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎ
ｄ Ｐａｒｔｉａｌ ｃＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏ
ｆ ａ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１９８７，８４，ｐ
ｐ．５４４９−５４５３を参照のこと。これらの研究
は、少なくとも部分的には、この種のカエルが顕著な回
復力を示し、しかも僅かのまたは殆んど術後の世話なし
に、傷の治癒中に無感染状態を保つ能力を有するという
観察により暗示された。これらペプチドの中で、２種の
２３残基からなる化合物（一般にマガイニン（Ｍａｇａ
ｉｎｉｎ）と命名されている）はますます注目を集める
課題となっている。これらはアミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｉ
ｌｅ−Ｇｌｙ−ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅ
ｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒをもつマガイニン１（Ｍａｇａ
ｉｎｉｎ １）および該アミノ酸配列において、１０−
位のＧｌｙに代えてＬｙｓを、および２２−位のＬｙｓ
に代えてＡｓｎをもつマガイニン２（Ｍａｇａｉｎｉｎ
２）である。マガイニン１および２のいずれについて
も、ヒトの病原菌に対して広い抗菌スペクトルを有する
ことから、その潜在的医薬用途に関る研究がなされてき
た。このことは、特にマガイニン２について顕著であ
る。また、種々の活性を有する多数のマゲイニンを基本
とする誘導体が調製され、かつ研究されている。これに
ついてはジュレティック（Ｊｕｒｅｔｉｃ）等の論文：
Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ．，１９８９，２４９，ｐｐ．２１
９−２２３、チェン（Ｃｈｅｎ）等の論文：ｉｂｉｄ，
１９８８，２３６，ｐｐ．４６２−４６６、クエルボ
（Ｃｕｅｒｖｏ）等の論文：プロシーディングスオブザ
１１ｔｈアメリカンペプチドシンポジウム；ペプチド：
ケミストリー、ストラクチャー＆バイオロジー（Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｌｅｖｅｎｔｈ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕ
ｍ；Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ），［Ｊ．Ｅ．リ
ビアー（Ｒｉｖｉｅｒ）等］、１９９０，ｐｐ．１２４
−１２６，ＥＳＣＯＭ−Ｌｅｉｄｏｎ，Ｎｅｔｈ．発
行；クエルボ等の論文：Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅｒｃ
ｈ，１９８８，１，ｐｐ．８１−８６；国際特許出願Ｎ
ｏ．ＷＯ８８／０６５９７号；および日本国特許出願Ｎ
ｏ．ＪＰ−１／２９９，２９９を参照のこと。これらは
マガイニン１および２の完全な単一残基欠落同族列を含
み、マガイニン２のＮ−末端欠落同族体、並びにマガイ
ニン２の完全なアラニン（Ａｌａ）置換同族列、および
抗菌剤および／または抗癌剤として有用であり得る、か
つ５−位および１２−位で置換されたマガイニン２誘導
体を選択している。
【０００５】これらのマガイニン誘導体は、これら著者
が答えている問題以上に、マガイニン類およびマガイニ
ン由来のペプチドの性質、特徴に関する多くの問題をか
かえている。例えばザスロフ等およびクエルボ等両者と
もに、マガイニン類の欠落同族体は動物の病原体に対し
て低い活性をもつと報告している。ザスロフ等のＰｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１９８
８，８５．ｐｐ．９１０−９１３およびクエルボ等の論
文（上記）を参照。これら両研究グループともに、動物
の病原体に関する該ペプチドの活性に臨界的に作用する
のはＮ−末端領域（アミノ酸１〜１４）であることに同
意しているように思われる。しかし、この領域における
欠落が得られたペプチドの抗生物活性に及ぼす影響の程
度については何等同意していない。ザスロフのグループ
は、アミノ末端において単一のアミノ酸欠落のみをもつ
マガイニン欠落誘導体が活性に認められる程の減少を示
さないことを確立した。ザスロフの研究によれば、得ら
れたペプチドが１９残基またはそれ以下（Ｎ−末端から
の連続的な欠落）である場合にのみ、大巾なおよび／ま
たは全体としての活性の減少がみられるとしている。こ
のことはクエルボのグループの発見とは全く対照的であ
る。クエルボ等は、Ｎ−末端領域における単一残基欠落
によりマガイニン１および２の活性が完全に失われるこ
とを見出した。これら２つの研究グループは、またＣ−
末端マガイニン２のカルボキシ末端上の単一アミノ酸の
削減に関する相対的影響について相互に矛盾する情報を
与えている。ザスロフおよびその共同研究者は、マガイ
ニン２のカルボキシル末端におけるＳｅｒ残基の除去に
より、ヒト病原菌に対する活性が全く失われることを立
証しており、一方でクエルボ等は、このマガイニン２の
単一欠落誘導体の同一のいくつかのヒト病原体に対する
活性は限られた程度の減少を示すにすぎないことを報告
した。ザスロフのＷ０８８／０６５９７およびクエルボ
等の上記文献参照。驚くべきことに、本発明者等は、マ
ガイニン類およびマガイニン由来のペプチドのＣ−末端
領域（Ｎ−末端ではない）における単一および２残基欠
落が、特に植物病原体（動物病原対とは逆に）に関し
て、活性に大きな影響をもつことを見出した。
【０００６】天然マガイニンのいくつかの置換誘導体の
研究は決定的な位置に関する上記の結果を一層混乱させ
るにすぎない。更に詳しくいえば、マガイニンおよび／
またはマガイニン由来のペプチドのＮ−末端領域は活性
について重要と思われる。クエルボ等の上記文献参照。
更に、マガイニン２のアミド型のもの（マガイニン２−
ＮＨ２）の１９−位におけるＡｌａの置換は未置換のマ
ガイニン−２−ＮＨ２と比較して５倍も高い有効性をも
たらした。この置換は、位置１〜１４における他のすべ
てのＡｌａ置換よりも優れていた。クエルボ等の上記文
献およびチェン等の上記文献参照のこと（マガイニン２
の８−位、１３−位および／または１８−位で置換され
たＡｌａをもつ該マガイニン２の高い抗生物活性を報告
している）。このようなペプチドを、植物の植物病原体
からの保護に有用なものとする特定の改良に関する明確
な概説は今のところ存在しない。マゲイニンに関する多
くの文献は仮定された機序に注目している。該機序とは
マゲイニンペプチドが微生物活性を阻害し、かつ例えば
原生動物において細胞溶解を生ずる機構である。これら
の論文は、またこれらのペプチドに付与されたα−ヘリ
ックス構造、サイズおよび電荷とその抗生物質としての
用途との相関関係をも論じている。一般的には、マツザ
キ（Ｍａｔｕｚａｋｉ）等の論文：Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃ
ａ Ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９８
９，９８１，ｐｐ．１３０−１３４；ラナ（Ｒａｎａ）
等の論文：Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，
１９８９，２９２，ｐｐ．７７−８５；チェン（Ｃｈｅ
ｎ）等の上記文献、ｐｐ．１２４−１２６；ウェスター
ホッフ（Ｗｅｓｔｅｒｈｏｆｆ）等の論文：Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１９８９，８
６，ｐｐ．６５９７−６６０１；米国特許出願第０７／
０２１，４９３号（１９８７年３月４日出願）；キャノ
ン（Ｃａｎｎｏｎ）の論文：Ｎａｔｕｒｅ，１９８７，
３２８，ｐ．４７８；ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓ）等の論文：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９０，
２９，ｐｐ．４４９０−４４９６；ラナ（Ｒａｎａ）等
の論文：ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ．，１９９０，２６１，ｐ
ｐ．４６４−４６７；ベルコーヴィッツ（Ｂｅｒｋｏｗ
ｉｔｚ）等の論文：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９０，３９，Ｎｏ．４、ｐｐ．
６２５−６２９：デュクロヒヤー（Ｄｕｃｌｏｈｉｅ
ｒ）等の論文：Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，１９８９，５
６，ｐｐ．１０１７−１０２１；ウルチア（Ｕｒｒｕｔ
ｉａ）、ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ，，１９８９，２４７，ｐ
ｐ．１７−２１参照のこと。
【０００７】本発明者等の気付いたマガイニン類および
他の抗生物質または抗生物ペプチド（例えば、セクロピ
ン類（ｃｅｃｒｏｐｉｎｓ）、デフェンシン類（ｄｅｆ
ｅｎｓｉｎｓ）、ザコトキシン類（ｓａｃｏｔｏｘｉｎ
ｓ）、メリチン類（ｍｅｌｉｔｔｉｎｓ）など）に関す
る刊行された研究は、一般にヒトの医薬−関連保健衛生
技術に集中している。しかし、例外としてジェイネス
（Ｊａｙｎｅｓ）等による２つの出願（ＷＯ８９／０４
３７１およびＷＯ８８／０９７６）があり、これらは一
般に植物に関連し、該植物は疾病に対する抵抗性が遺伝
的に高められている。ジェイネス等は、データにより支
持することなく、表現可能な抗生物ペプチドに対する非
相同遺伝子を含む遺伝的に形質転換された植物を生成し
得るものと憶測した。このように植物は疾病に対する高
い抵抗性をもち得るものと思われる。しかし、ジェイネ
ス等によれば、約３０残基未満のメリチン、ボンビニン
（ｂｏｍｂｉｎｉｎｓ）およびマガイニンなどのペプチ
ドは作物保護用途で使用するには好ましくない。という
のは、多分宿主植物細胞がその配合および／または存在
によって悪影響を受ける可能性があるからである。ジェ
イネス等によれば、好ましいペプチドは約３０〜約４０
個のアミノ酸残基をもつ。というのは、これがバクテリ
アおよび真菌に対してより特異的であるからである。ジ
ェイネス等は、また約４０個以上のアミノ酸を含むペプ
チドは単独で用いた場合には抗生物防禦の広いスペクト
ルを与えるのに十分抗生物性であり得ないと述べてい
る。植物を植物病原体から保護するためのジェイネス等
の研究は、ある水準の活性と有利であると考えられるも
のに近い感度とをもつ天然産の特異的ペプチドを探索す
ることに主眼があり、しかも該ペプチドを改良してその
最適の特性とすることにあるものと思われる。同様に、
ジェイネス等の論文：Ｂｉｏ Ｅｓｓａｙｓ，１９８
７，６，ｐｐ．２３６−２７０をも参照のこと。その他
にも、抗生物ペプチドの植物への配合、あるいは植物を
植物病原体から防禦するための抗生物ペプチドの使用に
関する情報が公開されている。例えば、ＥＰＯ０，２９
９，８２８号；Ｔ．カスティール（Ｃａｓｔｅｅｌｓ）
等の論文：Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．，１９８９，８，ｐ
ｐ．２３８７−２３９１；Ｆ．エブライム−ネスバ（Ｅ
ｂｒａｈｉｍ−Ｎｅｓｂａｔ）等の論文：Ｐｌａｎｔ
ａ，１９８９，１７９，ｐｐ．２０３−２１０を参照。
しかし、公開された情報はかかるペプチドの植物への組
込みおよび／または利用に関する様々な問題並びに解決
法に関する議論の点で不十分である。本発明の抗生物ペ
プチドは植物を植物病原体から防禦する際に有用である
ばかりでなく、防禦しようとする植物細胞自体に対し著
しく有害でないことが望ましい。
【０００８】天然に産するタンパクはおうおうにしてア
ミノ即ちＮ−末端に結合したＮｅｔを含んでいる。この
点は、しかし、天然産のマガイニンあるいは他の天然産
の抗生物ペプチドについては正しくない。本発明の一部
はＮ−末端Ｍｅｔ残基の合成にさかれる。このようなペ
プチドを合成すると、本発明ではかかるペプチドがいか
に植物を植物病原体から防禦するのに有用であるかが示
されることになる。本発明の前に、マガイニンを基本と
するペプチドを、植物病原体に対して活性でしかも植物
に使用しおよび／またはこれに組込むのに特に適したも
のとするべく改良を考えたものはいなかった。更に詳し
くいえば、天然産の植物酵素活性の抗生物ペプチドに及
ぼす作用、即ち植物タンパク分解活性の、本発明に示す
ような抗生物ペプチドに与える作用、抗生物ペプチド
の、該ペプチドにより保護されるものと考えられる植物
細胞に与える潜在的有害作用、あるいはどのようにして
かかる有害な相互作用が改善し得るかについて考察した
者はいない。同様に、薬害としても知られる植物細胞毒
性につき改善されたマガイニンに直面した者はいない。
【０００９】
【発明が解決すべき課題】本発明は少なくとも１種の植
物病原体に対して活性な抗生物ペプチドばかりでなく、
特に植物界で機能させようとするペプチドをも扱う。本
発明は、結果としてマガイニン１誘導体の薬害は一般に
低いことを確立した。従って、本発明はこれら誘導体が
特に農業並びに栽培環境調節において有用であることを
示す。そこでは、該ペプチドは植物に対して、例えば撒
布によりもしくは植物に組込む、例えば植物細胞自体が
該ペプチドを生成するように植物細胞を遺伝的に操作す
るなどにより利用できる。更に、予想外にも、マガイニ
ンの構成アミノ酸間のいくつかの結合がタンパク分解に
敏感であることを見出した。また、このような分解に抵
抗性である抗生物ペプチドをも開発し、しかもこのよう
な変更が抗生物活性を何等低下せず、薬害性を高めない
ことがわかった。従って、本発明の目的の一つは、植物
病原体を阻害するのに有効であるように特別に工夫され
たペプチドおよび特に植物を植物病原体から防禦するの
に有用であるように工夫されたペプチドを提供すること
にある。本発明は、また植物による分解を受けない抗生
物ペプチドを提供することも目的とする。更に別の本発
明の目的は抗生物特性および許容される植物毒性をもつ
抗生物ペプチドを提供することにある。本発明は、更に
Ｎ−末端Ｍｅｔまたは（ｆ）Ｍｅｔをもつ抗生物ペプチ
ドを提供することを目的とする。更に、本発明は特に農
業および園芸栽培の便宜のための植物病原体の阻害法を
提供することを目的とする。本発明の更なる目的は上記
ペプチドを表現し得るＤＮＡ、特に植物細胞などの遺伝
的に操作された細胞中で表現可能なＤＮＡを提供するこ
とにある。これらの並びに他の目的は以下の記載を参照
することにより、当業者には容易に明らかとなるであろ
う。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は特定の抗生物ペ
プチドに特異的ないくつかの事実および植物病原体、植
物細胞および／または植物の細胞下器官との該ペプチド
の相互作用に関する認識並びに発見の結果達成されたも
のである。本発明者等はＡＭＰＰＰＰと命名された一群
の抗生物ペプチドを同定かつ特徴付けした。該ＡＭＰＰ
Ｐは植物病原体に対して活性であり、植物を病害、感
染、侵入並びに植物にとって有害な他の状態から保護す
るのに有用なものである。本発明は、その応用範囲を植
物病原体の根絶すべく機能するペプチドにのみ限定され
るものではない。本発明者等は、またこれらのＡＭＰＰ
Ｐがいかにして、保護すべき生物の自然の機構により不
活性なものとなるかを見出し、かつこの不活性化の発生
を防止する方法を見出した。本発明者等はマガイニン１
および２を含むＡＭＰＰＰが、植物プロテアーゼに暴 に変化させ、抗真菌活性には影響を与えないように思わ
れる。また、全く予想外なことに、７−位および／また
は８−位における特定のアミノ酸の置換が、タンパク分
解感度を著しく減じ得ることをも見出した。事実、本発
明者等は、７−位におけるリジン（Ｌｙｓ）またはアル
ギニン（Ａｒｇ）の置換が該サイトにおけるタンパク分
解感度を全く失わせることを見出した。このことは、一
般に該位置を占有するアルギニン、リジンおよびヒスチ
ジン（Ｈｉｓ）間の類似する帯電性の見地からすると全
く予想外のことである。同様に、８−位におけるグルタ
ミン酸（Ｇｌｕ）の置換はこのように置換されたＡＭＰ
ＰＰのタンパク分解性を全くなくすることも見出した。
【００１１】更に、予想外なことに、タンパク分解に対
する高い抵抗性をもつＡＭＰＰＰを与えるいくつかの置
換は許容し得る、あるいは高められさえする抗菌および
／または抗真菌活性をもつＡＭＰＰＰを与えることもわ
かった。例えば、７−位におけるＡｒｇまたはＬｙｓの
置換などの改良は、７−位と８−位との間のペプチド結
合の植物タンパク分解に対する感受性を減じるばかり
か、特定の植物病原体に対するＡＭＰＰＰ活性を高めさ
えする。また、本発明者等は、ＡＭＰＰＰのＮ−末端へ
のＭｅｔ残基の付加が、一般にその特定の植物病原体に
対する生物活性を殆ど減じないことをも見出した。例え
ば、マガイニン２または（Ａｌａ１３，Ａｌａ１８〕マ
ガイニン１のＮ−末端へのＭｅｔの付加は依然として数
種の植物病原体に対して著しく活性なＡＭＰＰＰを与え
た。マガイニン１およびこれを基本とするＡＭＰＰＰ
が、特に工業的に重要な農業並びに園芸植物に負の影響
を及ぼす植物病原体を撲滅するために植物に対して利用
するのに好ましいことを見出した。これらのペプチド
は、また植物プロテアーゼによる分解に対する良好な抵
抗性を有し、また所定の植物毒性を示す。
【００１２】上記の諸パラメータを確立することによ
り、本発明者等は、植物に対して利用するのに特に適し
ており、しかも植物の分解に対する必要な抵抗性、例え
ばタンパク分解に対する抵抗性、大きな抗生物活性およ
び十分に低い植物毒性をもつことが明らかにされた抗生
物ペプチドを工夫することができた。本発明の工夫され
たＡＭＰＰＰは、公知の適用技術によって植物を植物病
原体から保護するのに有用である。これらのＡＭＰＰＰ
は、これらペプチドを表現し得る遺伝子が植物ゲノム内
に挿入または組込まれた場合には更に一層首尾よいもの
であって、該ペプチドは該植物中およびその後の世代に
おいて表現されることになる。
【００１３】上記目的に従って、本発明によればマガイ
ニン１の置換誘導体であり、かつ以下のアミノ酸配列：
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘ
ａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａ
ａ−Ｌｙ Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍ
ｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，
４−ジヒドロキシフェニルアラニンおよびＶａｌからな
る群から選ばれるアミノ酸である）をもつ物質（但し、
このＡＭＰＰＰはマガイニン１ではない）が提供され
る。この点につき、“マガイニン１ではない”とは、本
発明に関する組成物がマガイニン１ペプチドを含まない
ことを意味するものと理解すベきである。
【００１４】この局面による本発明の化合物は、一般に
１または２種以上の型の植物病原体に対して有用であ
る。これらのＡＭＰＰＰは更に少なくともマガイニン１
と比較してタンパク分解に対する高い抵抗性を有し、か
つ許容し得る水準の薬害、特にこれ等化合物の農業での
用途に関連して薬害をもたないように工夫されている。
本発明の別の局面によれば、マガイニン２の置換誘導体
であって、かつアミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ
−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−
Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐ
ｈｅ− ｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅ
ｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４Ｈ
ｙｐ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒ
ドロキシフェニルアラニンおよびＶａｌからなる群から
選 Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓ
ｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロキシ
フェニルアラニンおよびＶａｌからなる群から選ばれる
アミノ酸残基である）をもつ物質 たマガイニン２ではなく、かつ該ＡＭＰＰＰは単一のＡ
ｌａのみで置換されたマガイニン２ではないことを条件
とする。
【００１５】これらのマガイニン２の置換誘導体である
ＡＭＰＰＰは、マガイニン１の誘導体と同様に植物病原
体に対する特異的なあるいは広いスペクトルの抗生物／
抗菌活性を有する。多くの誘導体が、同様にマガイニン
１および２と比較して高いタンパク分解に対する抵抗性
をもち、かつ低い植物毒性を有している。 ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロ
キシフェニルアラニン、Ｇｌｎ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４
Ｈｙｐ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，Ｏ
ｒｎおよびＡｒｇからなる群から選ばれるアミノ Ｍｅｔ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジ
ヒドロキシフェニルアラニン、Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｓ
ｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，ＯｒｎおよびＡｒｇから
なる群から選ばれるアミノ酸であり、Ｘ ｌｕ，Ｌｙｓ，Ｇｌｎ，Ｔｙｒ，Ｔｈｒ，３，４−ジヒ
ドロキシフェニルアラニン、Ｔｒｐ，Ｍｅｔ，Ａｓｎ，
Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｐｈｅ，Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｕｅ，Ｐ
ｒｏ，３Ｈｙｐおよび４Ｈｙｐからなる群から選ばれる
アミノ酸である上記マガイニン１または２の置換誘導体
である。
【００１６】 ，Ｇｌｎ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４ＨｙｐおよびＴｙｒか
らなる群から選ばれるアミノ酸であるような上記配列を
もつものである。勿論ここに記載の好ましいおよびより
好ましいＡＭＰＰＰは既に述べた条件に従うものであ
る。
【００１７】本発明のこの局面に係るもう一つの好まし
い態様では、ＡＭＰＰＰはマガイニン１または２の置換
誘導体であり、かつ特に植物によるタンパク分解に抵抗
性で Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，３
Ｈｙｐ，４ＨｙｐおよびＭｅｔからなる群から選ばれる
アミノ酸である。
【００１８】本発明のもう一つの局面によれば、マガイ
ニン１の置換誘導体でも、マガイニン２の置換誘導体で
もない物質が提供される。これらのＡＭＰＰＰは一般に
アミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈ
ｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘａａ
−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈ ｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌ
ｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，３Ｈｙ
ｐ，４Ｈｙｐ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，
４−ジヒドロキシフェニルアラニンおよびＶａｌからな
る Ｌｙｓではない）をもつ。
【００１９】本発明のこの局面に従うＡＭＰＰＰは構造
の点でマガイニン１および２並びに上述のその置換誘導
体に類似する。これらのＡＭＰＰＰも植物病原体に対し
て特異的なあるいはスペクトルの広い活性を有し、かつ
植物によるタンパク分解に対する高い抵抗性をもちおよ
び／または高い植物毒性を示さない。更に別の本発明の
局面によれば、ＡＭＰＰＰから選ばれたペプチドのＮ−
末端にペプチド結合を介して結合したＭｅｔおよびＮ−
ホルミル化Ｍｅｔ“（ｆ）Ｍｅｔ”から選ばれるアミノ
酸を含むＡＭＰＰＰが提供される。ここで該ＡＭＰＰＰ
はその１または２以上のアミノ酸がＡｌａ，Ａｒｇ，Ｏ
ｒｎ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉ
ｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅ
ｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロキシフ
ェニルアラニンおよびＶａｌからなる群から選ばれるア
ミノ酸で置換されており、かつその１０−位におけるア
ミノ酸以外の任意のアミノ酸が更にＰｒｏ，３Ｈｙｐお
よび４Ｈｙｐからなる群から選ばれるアミノ酸で置換さ
れているものである。
【００２０】上記本発明のより好ましい局面によれば、
アミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈ
ｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘａａ
−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−
Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｘａ ｒｇ，Ｏｒｎ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌ
ｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈ
ｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒド
ロキシフェニルアラニンおよびＶａｌからなる群から選
ばれる）の末端に付着したＭｅｔまたは（ｆ）Ｍｅｔを
有する。これらのＭｅｔ−ＡＭＰＰＰおよび（ｆ）Ｍｅ
ｔ−ＡＭＰＰＰは、これらのペプチドがＭｅｔまたは
（ｆ）Ｍｅｔ伸長にも拘ず、植物病原体に対して特異的
および／またはスペクトルの広い活性を有することが見
出された限りにおいて、植物病原体阻害において有用で
ある。これらのペプチドは更に低い植物プロテアーゼに
対するタンパク分解感度を有し、および／または高い植
物毒性をもたない。これらのペプチドは、また植物また
はバクテリア細胞に組込み、細胞内で遺伝子表現するの
に特に適している。
【００２１】本発明のもう一つの局面によれば、アミノ
酸配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘ
ａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈ
ｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ
−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（こ でも異っていてもよく、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｏｒｎ，Ａｓ
ｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌ
ｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，３Ｈｙ
ｐ，４Ｈｙｐ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，
４−ジヒドロキシフェニルアラニンおよびＶａｌからな
る群から選ばれるアミノ酸残基であり、 落誘導体が提供される。
【００２２】本発明に関連する他のペプチドは、アミノ
酸配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘ
ａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈ
ｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ
−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ （Ｘ っていてもよく、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｏｒｎ，Ａｓｎ，Ａ
ｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅ
ｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４Ｈ
ｙｐ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒ
ドロキシフ ｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌ
ｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈ
ｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロキシフェニルア
ラニンおよびＶａｌからなる群から選ばれ、但 欠落誘導体を包含する。これらの単一および２残基欠落
誘導体は、更にそのＮ−末端にペプチド結合を介して結
合しているＭｅｔまたは（ｆ）Ｍｅｔを含むことができ
る。
【００２３】本発明の他の局面によれば、配列：Ｇｌｙ
−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−
Ｘａａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌ
ｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌ
ｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｘａａをもつペプチドの単一残基
欠落誘導体、配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｘ
ａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａ
ｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｘａａ
をもつペプチドの２残基欠落誘導体、配列：Ｇｌｙ−Ｉ
ｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａ
ａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ
−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−
ＸＸａａ−Ａｓｎ−Ｘａａをもつペプチドの単一残基欠
落誘導体、および配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙ
ｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ
−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ− ，Ｏｒｎ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，
Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐ
ｒｏ，３Ｈｙｐ，４Ｈｙｐ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，
Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンおよび
Ｖａｌからなる群から選ばれ、但し少なくとも１ケ所の
非欠落位置が置換されている）から選ばれるペプチドを
含む組成物が提供される。
【００２４】これらの単一および２残基欠落ＡＭＰＰＰ
誘導体は、またペプチド結合を介してそのＮ−末端に結
合したＭｅｔまたは（ｆ）Ｍｅｔを含むことができる。
ここで“少なくとも１ケ所の非欠落位置が置換されてい
る”という表現は、マガイニン１おび／または２と比較
した場合に、単一または２残基欠落に加えて、少なくと
も１つの置換を含む本発明によるＡＭＰＰＰを記載する
ための表現である。これらのペプチドは〔Ａｒｇ７，Ｄ
ｅｓ Ｌｙｓ２２，Ｄｅｓ Ｓｅｒ２３〕マガイニン
１、〔Ｄｅｓ Ｇｌｙ１，Ｇｌｕ８，Ｄｅｓ Ｓｅｒ
２３〕マガイニン１および／または〔Ａｌａ１３，Ａｌ
ａ１８，Ｄｅｓ Ｍｅｔ２１〕マガイニン１を含む。本
発明のこの局面に従うＡＭＰＰＰに関連して、少なくと
も１つの置換は欠落を達成した後にも保存されねばなら
ない。
【００２５】 ｇ，Ｏｒｎ，Ａｓｐ，Ｈｉｓ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ｇｌ
ｎ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、
Ｔｒｐ，Ｍｅｔ，Ａｓｎ，Ａｌａ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，
Ｓｅｒ，Ｔｈｒおよび４Ｈｙｐからなる群から選ば ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４Ｈｙｐ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｒ
ｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、
Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，Ｏ
ｒｎおよびＡｒｇからなる群から選ばれるア ，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、Ｔｒｐ，Ｍｅ
ｔ，Ａｓｎ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｐｈｅ，Ｖａｌ，Ｉｌ
ｅ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐおよび４Ｈｙｐからなる
群から選ばれるアミノ酸であるものを好ましい例として
含む。
【００２６】 ｌｕ，Ｌｙｓ，Ｇｌｎ，Ｔｙｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｍｅ
ｔおよびＡｌａからなる群から選ばれるアミノ酸 ｌａ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｔｒｐ，Ｐｈｅ，Ｈｉｓ，Ｇｌ
ｎおよびＴｙｒからなる群から選ばれるアミノ酸である
配列を有する。
【００２７】もう一つの好ましい本発明の局面によれ
ば、上述の単一および２残基欠落誘導体、Ｍｅｔおよび
（ｆ）Ｍｅｒ、ＡＭＰＰＰ、および非マガイニン１かつ
非マガイニン２ＡＭＰＰＰを含むこれらＡＭＰＰＰは、
好ましくは１種以上の植物プロテアーゼによる分解に対
して高い抵抗性を有する。これらのより好ましいＡＭＰ
ＰＰは一 ｐ，Ｔｙｒ，Ｓｅｒ，３，４−ジヒドロキシフェニルア
ラニン、Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４Ｈｙｐ，Ｖａ
ｌ，Ａｌａ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｐｈｅ，ＡｓｎおよびＭ
ｅｔからなる群から選ばれるアミノ酸である。
【００２８】本発明の一局面によれば、ペプチドが提供
され、該ペプチドはそのＮ−末端にペプチド結合を通し
て結合したＭｅｔまたは（ｆ）Ｍｅｔを含み、かつ配
列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ
−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−
Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘ
ａａ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｘａａをもつペプチド
の単一残基欠落誘導体、配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ
−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−
Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐ
ｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｌｙ
ｓ−Ｘａａをもつペプチドの２残基欠落誘導体、配列：
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘ
ａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａ
ａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ
−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｘａａをもつペプチドの単
一残基欠落誘導体、および配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ
−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ａ
ｓｎ−Ｘａａをもつペプチドの よく、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｏｒｎ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌ
ｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙ
ｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４Ｈｙｐ，Ｓ
ｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロキシ
フェニルアラニンおよびＶａｌからなる群から選ばれる
ものである。
【００２９】本発明の他の局面によれば、ＡＭＰＰＰ組
成物が提供され、該組成物は約１８〜約２３個のアミノ
酸残基をもつペプチドを含み、該ペプチドは少なくとも
１種の植物プロテアーゼによる分解に対して抵抗性とな
るように置換されている。更に詳しくいえば、約１８〜
約２３個のアミノ酸残基をもつペプチドを含む組成物が
提供され、該ペプチドはアミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ
−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−
Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａ
ｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｘａ
ａ−Ｘａａ−Ｘａａ（ここでＸ っていてもよく、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｏｒｎ，Ａｓｎ，Ａ
ｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅ
ｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４Ｈ
ｙｐ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒ
ドロキシフ Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇ１ｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌ
ｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒ
ｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンお
よびＶａｌからなる群から選ばれる）をもつペプチドの
誘導体であり、該ペプチドは、また少なくとも１種の植
物プロテアーゼによるタンパク分解に対して抵抗性であ
るように置換されている。
【００３０】本発明のもう一つの好ましい態様によれ
ば、既に述べたＡＭＰＰＰの任意のものを表現するのに
特に適したオリゴヌクレオチドを提供することにある。
例えば、マガイニン１の置換誘導体は以下のヌクレオチ
ド配列をもつオリゴヌクレオチドから表現させることが
できる。 ここでＣはシトシン、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｔ
はチミン、Ｈは可変であり、アデニン、シトシンまたは
チミンのいずれかであるがグアニンではなく、Ｒはアデ
ニンまたはグアニンであり得、Ｙはシトシンまたはチミ
ンであり得、かつＮはアデニン、シトシン、グアニンま
たはチミンであり得、またＮ１６−Ｎ１８、Ｎ１９−Ｎ
２１、Ｎ２２−Ｎ２４、Ｎ３１−Ｎ３３、Ｎ３７−Ｎ３
９、Ｎ５２−Ｎ５４、Ｎ５５−Ｎ５７、Ｎ６１−Ｎ６３
およびＮ６７−Ｎ６９は夫々同一でも異っていてもよ
い、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌ
ｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅ
ｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ
およびＶａｌからなる群から選ばれるアミノ酸をコード
すべく協働し、かつＮ２８−Ｎ３０はＡｌａ，Ａｒｇ，
Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉ
ｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈ
ｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶａｌからなる群から選ばれ
るアミノ酸をコードすべく協働するが、該オリゴヌクレ
オチドはマガイニン１をコードしない。
【００３１】マガイニン２置換誘導体は以下のヌクレオ
チド配列を有するオリゴヌクレオチドから表現させこと
ができる。 ここで、Ｎ１６−Ｎ１８，Ｎ１９−Ｎ２１，Ｎ２２−Ｎ
２４，Ｎ３１−Ｎ３３，Ｎ３７−Ｎ３９，Ｎ５２−Ｎ５
４，Ｎ５５−Ｎ５４，Ｎ６１−Ｎ６３およびＮ６７−Ｎ
６９は同一でも異っていてもよい、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ａ
ｓｅ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌ
ｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅ
ｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶａｌからなる群か
ら選ばれるアミノ酸をコードすべく協働し、かつＮ２８
−Ｎ３０はＡｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｅ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，
Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍ
ｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶａｌか
らなる群から選ばれるアミノ酸をコードすべく協働し、
ここで該オリゴヌクレオチドはマガイニン２、８−位、
１３−位または１８位の少なくとも２ケ所でのみＡｌａ
で置換されたマガイニン２をコードせずおよび該ペプチ
ドは単一のＡｌａのみで置換されたマガイニン２でない
ことを条件とする。
【００３２】同様に前に述べたようにマガイニン１また
はマガイニン２ではないＡＭＰＰＰは以下のヌクレオチ
ド配列を有するオリゴヌクレオチドにより表現できる。 ここで、Ｎ１６−Ｎ１８，Ｎ１９−Ｎ２１，Ｎ２２−Ｎ
２４，Ｎ３１−Ｎ３３，Ｎ３７−Ｎ３９，Ｎ５２−Ｎ５
４，Ｎ５５−Ｎ５７，Ｎ６１−Ｎ６３、Ｎ６４−Ｎ６６
およびＮ６７−Ｎ６９は夫々同一でも異っていてもよい
Ａｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇ
ｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈ
ｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶ
ａｌからなる群から選ばれるアミノ酸をコードするよう
に協働し、Ｎ２８−Ｎ３０はＡｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，
Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌ
ｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒ
ｐ，ＴｙｒおよびＶａｌからなる群から選ばれるアミノ
酸をコードするように作用するが、Ｎ６４−Ｎ６６がＬ
ｙｓをコードする場合にはＮ２８−Ｎ３０はＧｌｙをコ
ードできず、かつＮ６４−Ｎ６６がＡｓｎをコードする
場合にはＮ２８−Ｎ３０はＬｙｓをコードできない。
【００３３】本発明によるＭｅｔおよび（ｆ）ＭｅｔＡ
ＭＰＰＰはＭｅｔおよび（ｆ）Ｍｅｔからなる群から選
ばれるアミノ酸をコードする第１の複数のヌクレオチド
によって表現でき、この第１の複数のヌクレオチドはＡ
ＭＰＰＰをコードする第２の複数のヌクレオチドにホス
ホジエステル結合を介して結合してり、１以上のそのア
ミノ酸がＡｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇ
ｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅ
ｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶ
ａｌからなる群から選ばれるアミノ酸で置換されてお
り、かつ該マガイニン１または２の置換誘導体の１０−
位のアミノ酸以外の任意のアミノ酸が更にＰｒｏで置換
されていてもよい。
【００３４】本発明によるＡＭＰＰＰの単一残基欠落誘
導体は、以下のヌクレオチド配列をもつオリゴヌクレオ
チドの３ヌクレオチド欠落誘導体によって表現される。 ここでＮ１６−Ｎ１８，Ｎ１９−Ｎ２１，Ｎ２２−Ｎ２
４，Ｎ３１−Ｎ３３，Ｎ３７−Ｎ３９，Ｎ５２−Ｎ５
４，Ｎ５５−Ｎ５７，Ｎ６１−Ｎ６３、Ｎ６４−Ｎ６６
およびＮ６７−Ｎ６９は夫々同一でも異っていてもよい
Ａｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇ
ｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈ
ｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶ
ａｌからなる群から選ばれるアミノ酸をコードし、Ｎ２
８−Ｎ３０はＡｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌ
ｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙ
ｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ
およびＶａｌからなる群から選ばれるアミノ酸をコード
するが、Ｎ６４−Ｎ６６がＬｙｓをコードする場合に
は、Ｎ２８−Ｎ３０はＧｌｙをコードできず、またＮ６
４−Ｎ６６がＡｓｎをコードする場合にはＮ２８−Ｎ３
０はＬｙｓをコードし得ないことを条件とする。
【００３５】本発明によるＡＭＰＰＰの２残基欠落誘導
体は、以下のヌクレオチド配列をもつオリゴヌクレオチ
ドの６−ヌクレオチド欠落誘導体によって表現される。 ここで、Ｎ１６−Ｎ１８，Ｎ１９−Ｎ２１，Ｎ２２−Ｎ
２４，Ｎ３１−Ｎ３３，Ｎ３７−Ｎ３９，Ｎ５２−Ｎ５
４，Ｎ５５−Ｎ５７，Ｎ６１−Ｎ６３、Ｎ６４−Ｎ６６
およびＮ６７−Ｎ６９は夫々同一でも異っていてもよい
Ａｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇ
ｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈ
ｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶ
ａｌからなる群から選ばれるアミノ酸をコードし、Ｎ２
８−Ｎ３０はＡｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌ
ｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙ
ｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ
およびＶａｌからなる群から選ばれるアミノ酸をコード
するが、Ｎ６４−Ｎ６６がＡｓｎをコードする場合には
Ｎ２８−Ｎ３０はＬｙｓをコードできない。上記ペプチ
ドの（ｆ）ＭｅｔおよびＭｅｔ誘導体は、また上記オリ
ゴヌクレオチドに、これらのアミノ酸（Ｍｅｔ，（ｆ）
Ｍｅｔ）をコードすることのできる複数のヌクレオチド
を付加することにより表現できる。これらはホスホジエ
ステル結合により結合することができる。本発明によれ
ば、同様に、ＡＭＰＰＰの単一並びに２−残基欠落誘導
体のＭｅｔおよび（ｆ）Ｍｅｔの伸長は以下のヌクレオ
チド配列をもつオリゴヌクレオチドの３−ヌクレオチド
欠落または６−ヌクレオチド欠落誘導体から表現させる
ことができる。 ここで、Ｎ１６−Ｎ１８，Ｎ１９−Ｎ２１，Ｎ２２−Ｎ
２４，Ｎ３１−Ｎ３３，Ｎ３７−Ｎ３９，Ｎ５２−Ｎ５
４，Ｎ５５−Ｎ５７，Ｎ６１−Ｎ６３およびＮ６７−Ｎ
６９は夫々同一または異っていてよいＡｌａ，Ａｒｇ，
Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉ
ｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅ
ｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶａｌからなる群か
ら選ばれるアミノ酸をコードでき、Ｎ２８−Ｎ３０はＧ
ｌｙおよびＬｙｓからなる群から選ばれるアミノ酸をコ
ードし、かつＮ６４−Ｎ６６はＬｙｓおよびＡｓｎから
なる群から選ばれるアミノ酸をコードする。
【００３６】更に別の本発明の局面によれば、植物病原
体の生存もしくは成長を阻害する方法が提供され、該方
法は少なくとも１種の本発明のＡＭＰＰＰまたはかかる
ＡＭＰＰＰの複数種の混合物を、少なくとも１種の植物
病原体の生存または成長を阻害するのに有効な量で調製
し、これと該病原体とを接触させることを特徴とする。
“少なくとも１種の植物病原体を阻害するのに有効な
量”なる表現によって、該有効量が適用法により影響さ
れると考えられるが、該有効量が通常１〜１００μｇ／
ｍｌの範囲内にあるものと理解される。本発明のもう一
つの局面によれば、化合物のタンパク分解に対する抵抗
性を決定するのに有用な生物学的スクリーニング用試薬
が提供され、該試薬は約５時間以内に、該化合物の少な
くとも５０％の分解を生ずるのに有効な量の少なくとも
１種の実質的に純粋な植物プロテアーゼと、残部の水と
を含有する。これらのタンパク分解溶液は植物細胞の細
胞外空間におけるプロテアーゼ含有環境に厳密に類似す
るように設計される。従って、この試薬は生体内での特
定のペプチドの相対的タンパク分解性のより正確な評価
を得るために使用できる。また、この試薬は植物病原体
のタンパク分解活性をシミュレートでき、しかもＡＭＰ
ＰＰを処理してその分解の程度を決定するのに使用する
ことができる。
【００３７】本発明による液状培地中に含まれる細胞か
らこれらの試薬を作製する方法も提供され、該方法は液
状培地から細胞を分離し、少なくとも１種の細胞外植物
プロテアーゼを含有する該培地を回収する工程を含む。
この方法はいくつかの利点をもつ。しかし、最も重要な
のは、この方法が植物細胞からの細胞外プロテアーゼ含
有溶液ばかりでなく、真菌およびバクテリアなどの植物
病原体からの細胞外プロテアーゼ含有溶液を得るために
も利用し得ることである。本発明のこの局面は、また上
記に試薬を使用して、少なくとも１種の植物プロテアー
ゼによる分解に対する化合物の抵抗性を測定することを
も包含する。この方法は、スクリーニングすべき化合物
の源を準備し、少なくとも１種のプロテアーゼを水百万
部当たり約０．０５部乃至水千部当たり約１部の範囲内
で含有する本発明の生物学的スクリーニング試薬と共に
該化合物を所定時間インキュベートし、該試薬を不活性
化することによる該反応を停止し、得られた化合物を分
析する諸工程を会む。
【００３８】“ＡＭＰＰＰ”は植物病原体に対して活性
な抗生物質ペプチドに対する略号であって、ここで定義
したように、少なくとも抗真菌および／または抗菌活性
をもつタンパクまたはペプチドである。この用語は抗微
生物ペプチドの１以上の全種に対するより広い意味での
使用も可能であるが、ここで使用する如く、ＡＭＰＰＰ
なる用語はマガイニン１、マガイニン２およびマガイニ
ン誘導体組成物、好ましくは１８〜２４個のアミノ酸を
もつものを包含する。一般に、本発明によるＡＭＰＰＰ
はアミノ酸配列（Ｉ）：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙ
ｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｘａａ
−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｇｅ−
Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘ
ａａをもつものであ。この配列で使用する“Ｘａａ”と
は変数を示し、アミノ酸の選択された任意の基がここに ）をもつＡＭＰＰＰの６−位における変数を表す。
“ｎ”番目の位置（ｎ−位）とは該ペプチドのＮ−末端
（通常グリシン（Ｇｌｙ））に相対的な位置を表す。配
列（Ｉ）をもつ上記ペプチドが、更にペプチド結合を介
してＮ−末端グリシンに結合したメチオニン（Ｍｅｔ）
またはＮ−ホルミル化Ｍｅｔ（（ｆ）Ｍｅｔ）をも含む
場 （Ａｓｎ）である。
【００３９】同様に、本発明は本発明のＡＭＰＰＰを表
現することのできる、かつ以下のヌクレオチド塩基配列
（ＩＩ）を含むデオキシリボ核酸および／またはリボ核
酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）をも包含する。 ＲＮＡが問題とするオリゴヌクレオチドである場合、Ｔ
はピリミジン塩基ウラシルを表す。周知のように、ＤＮ
Ａなどのオリゴヌクレオチドはコドン即ち３文字の群で
解読される。即ち、該塩基配列はアミノ酸の型を決定す
る３つの隣接したヌクレオチドに含まれる情報の組合せ
であり、該アミノ酸はコードされたペプチドの特定の対
応する位置に組込まれる。例えば、オリゴヌクレオチド
配列ＩＩの初めの３つのヌクレオチドを含むコドンＧＧ
Ｎは、本発明による該ペプチドのＮ−末端アミノ酸であ
るＧｌｙをコードする。従って、３つのヌクレオチドの
群は夫々特定のアミノ酸をコードするように協働するも
のと理解すべきである。更に、用語“Ｎｎ”（ここで、
“ｎ”はオリゴヌクレオチド配列（ＩＩ）の１〜６９の
ヌクレオチドの位置番号に等しい）は、複数のアミノ酸
をコードするためのコドンにおける他のヌクレオチドと
協働し得る可変ヌクレオチドを同定するために使用す ノ酸をコードするはずの特定をコドンを表す。
【００４０】“マガイニン１または２の置換誘導体”あ
るいは“マガイニン１または２の欠失（落）誘導体”な
る用語は、一般に本発明の文中で使用する“ＡＭＰＰ
Ｐ”な る上述の如きペプチドのみならず、長さにおいて２１〜
２４個のアミノ酸からなり、他の任意の位置で置換され
ているペプチドをも含む。“置換”なる用語は、マガイ
ニン１、マガイニン２あるいは非−マガイニン１、非−
マガイニン２、本発明で例示したマガイニン様のペプチ
ドあるいはその単一または２−残基欠失誘導体のいずれ
かにおける１８〜２４残基の少なくとも一つがその天然
の構造および上記の順序から意図的に変えられた組成物
を規定するのに使用される。置換誘導体の例は、［Ａｒ
ｇ７，Ｇｌｕ８］−Ｍａｇ １（ここで“Ｈａｇ １”
はマガイニン１を意味する）、［Ｌｙｓ７，Ｇｌｕ８，
Ｄｅｓ Ｌｙｓ２２，Ｄｅｓ Ｓｅｒ２３］−Ｍａｇ
１，［Ａｌａ１９］−Ｍａｇ１，［Ａｒｇ７，Ｄｅｓ
Ｍｅｔ２１］−Ｍａｇ １，［Ｐｈｅ７，Ａｌａ１３，
Ａｌａ１８］−Ｍａｇ ２，［Ｌｙｓ７］−Ｍａｇ
２，［Ａｒｇ７］−Ｍａｇ ２，［Ｍｅｔ１，Ｇｌ
ｕ８］−Ｈａｇ２などを包含する。
【００４１】本明細書で使用する用語“誘導体”とは約
１８〜約２３個のアミノ酸残基の範囲内の長さを有する
ＡＭＰＰＰを含む。この規定に従えば、５個までのアミ
ノ酸の欠除がなければ、これらペプチドは、配列および
順序両者において完全な２３残基のＡＭＰＰＰと同一で
ある。５個までのアミノ酸の欠落または欠失は、かかる
欠失がなされた程度まで、一般的配列ＩＩをもつペプチ
ドの２３個の位置のいずれであってもよいので、欠失が
なされたことを示す記述を先行させた２３残基のＡＭＰ
ＰＰ等価物として記述することがより便利であり、かつ
より一般的である。このような誘導体ＡＭＰＰＰの例
は、［Ｄｅｓ Ｇｌｙ１，Ｄｅｓ Ｉｌｅ２，Ｄｅｓ
Ｇｌｙ３，Ｄｅｓ Ｌｙｓ４，Ａｌａ１３，Ａｌ
ａ１８，ＤｅｓＳｅｒ２３］Ｍａｇ１および［Ｄｅｓ
Ｇｌｙ１，Ｄｅｓ Ｉｌｅ２，ＤｅｓＧｌｙ３，Ｄｅｓ
Ｌｙｓ４，Ｄｅｓ Ｐｈｅ５，Ａｌａ１９］Ｍａｇ２
である。“誘導体”は必ずしも、ＡＭＰＰＰが先ず構築
され、次いで特定の欠失を行うことを意味しない。この
用語はまた２３未満の残基で構築されたＡＭＰＰＰをも
包含する。
【００４２】“単一残基欠失誘導体”、“単一欠落（欠
失）誘導体”等は長さ２２残基をもつＡＭＰＰＰをも含
むものとする。これらはペプチドであって、該ペプチド
は、マゲイニン１、マゲイニン２、または非−マガイニ
ン１、非−マガイニン２、本発明で例示したマガイニン
様ペプチド、またはその置換誘導体と比較して、２３残
基の一つの欠失がないとすると、その天然産のものと構
造および配列の点で等価である。該欠失または欠落は元
のＡＭＰＰＰの２３個の位置のいずれでも可能であるか
ら、単一の残基の欠失がなされていることを示す記述を
前においた２３残基ＡＭＰＰＰ等価物として記述するの
がより便利かつ一般的である。例えば、残基５を欠失し
たマガイニン２の欠失誘導体は〔Ｄｅｓ Ｐｈｅ５〕−
マガイニン２（ここで“Ｄｅｓ”は欠失を意味する）な
る名称で記述される。同様に、残基５を欠失し、７−位
においてＡｒｇで置換されたマガイニン２の欠失誘導体
は〔Ｄｅｓ Ｐｈｅ５，Ａｒｇ７〕−マガイニン２のよ
うに記述される。 Ｐｒｏ）を記述できるという事実に拘らず、その単一残
基欠失誘導体では位置１１の残基を排除することもあり
得る。このような例では、使用すべき表記法は、例 ているこの単一残基欠失誘導体に対するペプチド等価物
を意味し、この等価物自体は置換および／または単一残
基欠失誘導体であってもよい）である。
【００４３】同様に、“オリゴヌクレオチドの３−ヌク
レオチド欠落誘導体”は、前に規定したように、単一残
基欠失誘導体としてのＡＭＰＰＰを表現するように設計
されたオリゴヌクレオチドを意味するものとする。オリ
ゴヌクレオチドはコドンとして機能するので、特定のア
ミノ酸の表現を防止し、かつ残りの配列の読取り枠を同
一に保つことを保証するためには完全な３−ヌクレオチ
ドコドンを該配列から排除する必要がある。本発明の範
囲内のオリゴヌクレオチドの３−ヌクレオチド欠落誘導
体の例は以下の配列（ＩＩＩ）をもつオリゴヌクレオチ
ドである。 これはペプチド［Ｄｅｓ Ｓｅｒ２３］−Ｍａｇ−１を
コードする。
【００４４】用語“２−欠落誘導体”または“２−残基
欠落誘導体”は“単一欠落誘導体”または“単一残基欠
失誘導体”なる用語と同様に使用され、２１残基の長さ
のＡＭＰＰＰを包含することを意味する。２−残基欠落
誘導体におけるアミノ酸残基 であり得、または例えば残基９（Ａｌａ）および１７
（Ｖａｌ）が同時に削除されるというようにランダムで
あってもよい。
【００４５】“オリゴヌクレオチドの６−ヌクレオチド
欠失誘導体”なる用語は、２−残基欠失誘導体としての
ＡＭＰＰＰを表現するように設計されたオリゴヌクレオ
チドを意味するものとする。オリゴヌクレオチド配列
（ＩＩＩ）を参照して、ヌクレオチド６４、６５、６６
を更に削除すると、ペプチド［Ｄｅｓ Ｌｙｓ２２，Ｄ
ｅｓ Ｓｅｒ２３］−Ｍａｇ１をコードするオリゴヌク
レオチドを与える。本発明によるＡＭＰＰＰは伝統的な
化学的合成法あるいは一種以上のＡＭＰＰＰを遺伝的に
コードする特定のＤＮＡ物質を宿主細胞に挿入し、該細
胞に所定のペプチドを表現させる一種以上の方法によっ
て有利に製造できる。伝統的な化学的合成法に関連し
て、本発明のＡＭＰＰＰは、例えば“ペプチド：分析、
合成、生物学（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ）”；ｖ
ｏｌ ２−“ペプチド合成における特殊な方法（Ｓｐｅ
ｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ），パートＡ”、Ｅ．グロス（Ｇｒｏ
ｓｓ）＆Ｊ．マイエンホッファー（Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅ
ｒ）編、アカデミックプレス刊、ニューヨーク、１９８
０およびｖｏｌ９−“ペプチド合成における特殊な方法
（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），パートＣ”、Ｓ．アデン
フレンド（Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ）＆Ｊ．マイエンホッ
ファー編、アカデミックプレス刊、サンジェゴ、１９８
７に記載のような公知の任意のペプチド合成法を利用し
て合成し得る。
【００４６】ペプチドの化学合成のために本発明で有利
に使用し得る方法は固相技術である。というのは、これ
が高純度のペプチドの迅速合成を可能とするからであ
る。このような方法においては、該ペプチドのＣ−末端
から開始して、不溶性のポリマー担体（樹脂と呼ばれ
る）上で、一度に選択的に１アミノ酸を結合するように
合成される。合成は、該樹脂に、アミドまたはエステル
などの化学的結合基を介して、該ペプチドのＣ−末端ア
ミノ酸を結合することで開始する。該アミノ酸がエステ
ルとして該樹脂に結合している場合、得られるペプチド
はＣ−末端カルボン酸であり、一方アミド結合している
場合、生成するペプチドはＣ−末端アミドであろう。Ｘ
ＴＡＡ、並びにペプチド合成で使われる他の全てのアミ
ノ酸は、α−アミノ基および側鎖官能基（存在する場
合）をもつ必要があり、これらは合成中に選択的に離脱
し（脱保護）し得る誘導体として特異的に保護されてい
る。合成（カップリング）はアミノ酸の対称的無水物ま
たは活性エステルなどの活性化体と、該樹脂に結合され
たＮ−末端アミノ酸の脱保護されたα−アミノ基との反
応により達成される。このようなα−アミノ基の脱保
護、これに続くカップリングのサイクルが、完全なペプ
チド鎖を構築するまで繰返される。このペプチド中に存
在する官能基の全てが次に脱保護され、かつ該ペプチド
は該樹脂から開裂される。この開列は、通常スキャベン
ジャーと呼ばれる化合物の存在下に行われ、このスキャ
ベンジャーはこの工程中における該ペプチドとの副反応
を阻止する。次に得られたペプチドを種々の方法、例え
ばゲル濾過法、イオン交換法および高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製する。この開裂およ
び精製工程中に、該ペプチドは該Ｎ−末端に存在するお
よび任意の該ペプチドのリジン、アルギニン、ヒスチジ
ンまたはオルニチン中のアミノ基に結合した酸−塩に転
化され、結果として得られる純ペプチドは通常このよう
な塩として得られる。
【００４７】本発明で使用するのに好ましい方法は、メ
リフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）−型の固相法で
あり、これはＧ．バラニー（Ｂａｒａｎｙ）＆Ｒ．Ｂ．
メリフィールドの“固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ−Ｐ
ｈａｓｅ ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）”、ペ
プチド：分析、合成、生物学（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ），ｖｏｌ２，第１章、ｐｐ．３−２８４および
Ｊ．Ｍ．スチュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ）＆Ｔ．Ｄ．ヤ
ング（Ｙｏｕｎｇ）の“固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ
−ＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ）”、第２版”、ピアースケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ロックフォー
ド、イリノイ州、１９８４に記載されている。一般に、
任意の標準的側鎖保護法が有利に使用できるが、ｔ−Ｂ
ｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル；例えば上記のバラ
ニー等およびスチュアート等の文献参照）、およびＦＭ
ＯＣ（９−フルオレニルメトキシカルボニル；例えば
Ｅ．アサートン（Ａｔｈｅｒｔｏｎ）＆Ｒ．Ｃ．シェパ
ード（Ｓｈｅｐｐａｒｄ）の“フルオレニルメトキシカ
ルボニルアミノ保護基（Ｔｈｅ Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍ
ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ Ａｍｉｎｏ Ｐｒｏｔ
ｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）”既出、ｖｏｌ．９、第１
章、ｐｐ．１−３８参照）を用いる方法が好ましい。
【００４８】Ｃ−末端カルボン酸を含有するペプチドに
対するプリカーサとして必要なペプチド−樹脂の合成は
市販品として入手できる架橋ポリスチレンまたはポリア
ミドポリマー樹脂上で、例えばクロロメチル、ヒドロキ
シメチル、アミノメチル、ＰＡＭ（フェニルアセタミド
メチル）、ＨＭＲ（ｐ−ヒドロキシメチルフェノキシ酢
酸）、ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール、ハイク
ラム〔Ｈｙｃｒａｍ（４−ブロモクロトニル−β−アラ
ニルアミドメチル）；アドバンストケムテック社（Ａｄ
ｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ルイスビ
ル、ケンタッキー州〕あるいはザスリン〔Ｓｕｓｒｉｎ
（２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコー
ル）；バケムバイオサイエンス社（Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）、フィラデルフィア、ペ
ンシルバニア州〕から典型的に開始される。アミノ酸の
カップリングは、例えばＤＣＣ（ジシクロヘキルカルボ
ジイミド）、ＨＯＢＴ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール）から生成される対称型無水物あるいは例えばＤＣ
Ｃ／ＨＯＢＴもしくは様々なＢＯＰ試薬（例えば、Ｊ．
コステ（Ｃｏｓｔｅ）等の“ＢＯＰおよび同族体：現状
と新たな進展（ＢＯＰａｎｄ Ｃｏｎｇｅｎｅｒｓ：Ｐ
ｒｅｓｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ＮｅｗＤｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔｓ）”、プロシーディングスオブザ１１
ｔｈアメリカンペプチドシンポジウム；ペプチド：化
学、構造および生物学（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｅｌｅｖｅｎｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ；Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂ
ｉｌｏｇｙ）、Ｊ．Ｅ．リビアー（Ｒｉｖｉｅｒ）＆
Ｇ．Ｒ．マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）編、ＥＳＣＯ
Ｈ、ライデン、ニース、１９９０、ｐｐ．８８５−８８
８を参照のこと）から生成される活性エステルのいずれ
かを用いて、溶媒例えばＤＣＭ（ジクロロメタン）、Ｄ
ＣＭ含有ＴＦＥ（トリフルオロエタノール）、ＤＭＦ
（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）、ＮＭＰ（Ｎ−メチ
ルピロリドン）またはＮＭＦ含有ＤＭＳＯ（ジメチルス
ルホキシド）中で行うことができる。
【００４９】本発明で使用するのに好ましいのは、アル
ギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミ
ン（Ｇｌｎ）およびヒスチジン（Ｈｉｓ）を除き、ｔ−
保護アミノ酸の対称型無水物のカップリングであり、該
例外としてのアミノ酸は好ましくはＤＣＣ／ＨＯＢＴか
ら生成されるＨＯＢＴ活性エステルとして、ＤＭＦまた
はＤＭＦ／ＤＣＭ溶液としてＰＡＭ樹脂上で行われる。
また、ＮＭＰ溶液中でＨＭＰ−ポリスチレン樹脂上で
の、ＦＭＯＣ保護アミノ酸のＤＣＣ／ＨＯＢＴから生成
したＨＯＢＴ活性エステルのカップリングを本発明で使
用するのに好ましい方法である。本発明で使用するのに
最も好ましい方法は、ＰＡＭ樹脂上での、ｔ−Ｂｏｃ保
護アミノ酸のＤＣＣ／ＨＯＢＴから作製したＨＯＢＴ活
性エステルのカップリングであり、これはまずＮＭＰ中
で、次いでＮＭＰ／ＤＭＳＯの８０／２０溶液中でおよ
び最後に１．９ｍｍｏｌＤＩＥＡ／０．５ｍｍｏｌＰＡ
Ｍ樹脂含有ＮＭＰ／ＤＭＳＯの８０／２０溶液中で行わ
れる。
【００５０】Ｃ−末端アミドを含むペプチドのプリカー
サとしてのペプチド−樹脂の合成は上記手順を利用して
十分に達成し得る。しかし、ポリマー担体、例えばベン
ズヒドリルアミン（ＢＨＡ）または４−メチルベンズヒ
ドリルアミン（ＭＢＨＡ）ポリスチレン樹脂を用いるこ
とも可能である。本発明のこの局面で使用することが好
ましいもの、即ちＣ−末端に結合したアミド基をもつＡ
ＭＰＰＰの製造において好ましいのは４−メチルベンズ
ヒドリルアミン−ポリスチレン樹脂である。多くの型の
側鎖保護基がｔ−ＢｏｃまたはＦＭＯＣ固相合成に利用
でき、その例は例えばバラニー等の上記文献、グロス＆
メイエンホッファー（Ｇｒｏｓｓ＆ Ｍｅｉｎｈｏｆｅ
ｒ）の“ペプチド：分析、合成、生物学（Ｔｈｅ Ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ）”，ｖｏｌ．３−“ペプチド合成
での官能基の保護（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕ
ｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄ
ｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）”、アカデミックプレス刊、
ニューヨーク、１９８１、およびスチュアート等の上記
文献（ｔ−Ｂｏｃアミノ酸）並びにアサートン等の上記
文献（ＦＭＯＣアミノ酸）などに記載されている。
【００５１】ｔ−Ｂｏｃアミノ酸について本発明で用い
ることが好ましい保護基はアルギニンに対してＭＴＳ
（メシチレン−２−スルホニル）、アスパラギン酸に対
してはＯＢｚｌ（ベンジルエステル）、システインに対
しては４−ＭｅＢｚｌ（４−メチルベンジルチオエーテ
ル）、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンに対して
はＢｚｌ２（ジベンジルジエーテル）、グルタミン酸に
対してはＯＢｚｌ、ヒスチジンに対してはＢｏｍ（ベン
ジルオキシメチル）またはＺ（ベンジルオキシカルボニ
ル）、３−および４−ヒドロキシプロリンに対してはＢ
ｚｌ、リジンおよびオルニチン両者に対してはＣｌ−Ｚ
（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、セリンおよ
びスレオニン両者に対してはＢｚｌ、トリプトファンに
対してはＣＨＯ（ホルミル）およびチロシンに対しては
Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジル−オキシカルボニル）で
ある。メチオイニンはそのスルホキシド（Ｍｅｔ
（Ｏ））として保護でき、また好ましくは保護の状態で
使用する。
【００５２】本発明によるＡＭＰＰＰは自動設備または
手動技術のいずれを利用して合成することもできる。し
かし、自動合成法が好ましい。本発明で記載するＡＭＰ
ＰＰの例のすべては実際にアプライドバイオシステム社
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）
（ＡＢＩ）のモデル４３０Ａ自動ペプチド合成装置で調
製され、その際該アプライドバイオシステムズモデル４
３０Ａペプチド合成装置の利用者用マニュアル〔バージ
ョン１．３０、第６章、アプライドバイオシステムズ、
フォスター市、カリフォルニア、１９８７年（１９８７
年１１月および１９８８年１０月改訂）に記載されたｔ
−Ｂｏｃプロトコールを利用した。
【００５３】このプロトコールに従えば、ペプチドはそ
のＣ−末端から出発して樹脂上で組立てられる。Ｃ−末
端カルボン酸の合成に必要とされるＰＡＭまたはＨＭＰ
樹脂は、既にα−アミノ酸および側鎖が保護されたＣ−
末端アミノ酸に結合したものとしてＡＢＩまたは他の業
者から購入できる。しかし、Ｃ−末端カルボキシアミド
を調製する場合、該Ｃ−末端アミノ酸は最初にＢＨＡま
たはＭＢＨＡ樹脂のいずれかに結合されなければならな
い。いずれの場合にも、α−アミノおよび側鎖の保護さ
れたＣ−末端アミノ酸を含むこの樹脂は反応容器に置か
れ、該ペプチド鎖は、好ましくは樹脂に結合したＮ−末
端アミノ酸のα−アミノ基の脱保護と、これと次のアミ
ノ酸との（このアミノ酸もα−アミノおよび側鎖が保護
されている）カップリングからなるサイクルを繰返すこ
とにより一時に１個のアミノ酸ずつ結合される（ペプチ
ドフラグメント間の結合も可能であるが、本発明に記載
するＡＭＰＰＰに対しては通常好ましくない）。
【００５４】Ｎ−末端アミノ酸のα−アミノ基の脱保護
と、これに続く次の保護されたアミノ酸とのカップリン
グからなるサイクルは所定のペプチド鎖が組立てられる
まで続けられる。生成するポリマー担体樹脂に結合した
Ｎ−末端と側鎖とが保護されたペプチドは、次いで適当
な脱保護および開裂工程に付されて、未保護状態のペプ
チドが通常はＮ−末端、リジン、ヒスチジンおよびオル
ニチン酸塩として得られる。
【００５５】合成は、カップリング段階では、０．５ｍ
ｍｏｌのＣ−末端アミノ酸樹脂および２．０ｍｍｏｌの
側鎖の保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸から出発するｔ−
Ｂｏｃ保護法を利用して行った。しかし、これらの量は
臨界的なものではなく、使用する自動設備または手動装
置の型に応じて、比例的により多くのあるいはより少な
い量を使用できる。例えば、本発明者は、ＡＢＩ装置を
使用して、０．１ｍｍｏｌ程度および０．６ｍｍｏｌほ
どのアミノ酸−ＰＡＭ樹脂を使用して合成を行った。カ
ップリングすべきアミノ酸対ＰＡＭ樹脂に結合している
アミノ酸またはペプチドのモル比４．０が、この装置を
用いる場合に好ましいが、より少さなおよびより大きな
比を用いることもできる。３．３３（０．６ｍｍｏｌＰ
ＡＭ樹脂／２．０ｍｍｏｌアミノ酸）程度の低い比を、
カップリング効率の大巾な減少を伴うことなく使用し
た。より低い比を使用して実験当たりの生成ペプチド量
を増大させることが可能であるが、余り好ましくない。
というのは、カップリング効率およびその結果としての
ペプチドの純度が低くなる可能性があるからである。よ
り大きな比は、一般にそれ以上の効率を与えないので好
ましくない。
【００５６】ＤＭＦ中でのｔ−Ｂｏｃ保護法において、
α−アミノ基の脱保護はＴＦＡ／ＤＣＭを用いて周囲温
度で行れ、次いでＤＩＥＡ／ＤＭＦで中和される。ロイ
シン、メチオニンスルホキシド、トリプトファンおよび
ホルミル−トリプトファン（これらは１０％ＤＭＦ（Ｄ
ＣＭ中）で形成される）を除き、対称無水物はＤＣＭ中
にてＤＣＣから形成される。副生成物ＤＣＵ（Ｎ，Ｎ−
ジシクロヘキシルウレア）を濾別した後、該ＤＣＭを蒸
発させ、ＤＭＦで置換し一方で温度を１０〜１５℃に保
つ。このプロトコールを利用して合成したＡＭＰＰＰに
対して、アミノ酸は、成長中のペプチド鎖の長さが９−
アミノ酸を越えた後には二重に結合される。これらの場
合において、濾過後のＤＣＭ溶液は直接次工程で使用す
る。ＨＯＢＴ活性エステルは、アスパラギン、グルタミ
ンおよび保護ヒスチジンについてはＤＣＣと８〜１０％
（ｖ／ｖ）ＤＣＭ含有ＨＯＢＴとの反応から形成され、
アルギニン（ＭＴＳ）についてはＤＣＣと２５〜３０％
（ｖ／ｖ）ＤＣＭ含有ＨＯＢＴとの反応から形成され
る。副生物ＤＣＭの濾別後、このＨＯＢＴ活性エステル
溶液を、ＤＣＭの除去なしに直接次工程で使用する。こ
れら４つのアミノ酸は同じ手順で常に二重カップリング
される。
【００５７】一旦アミノ酸の対称無水物またはＨＯＢＴ
活性エステルのいずれかが適当な溶媒中で形成される
と、この溶液は反応容器に移され、そこでＮ−末端α−
アミン脱保護ペプチド−樹脂と共に振盪される。カップ
リングがこの期間中に生じ、該期間は、はじめ対称型無
水物に対する１８〜２６分からＨＯＢＴ活性エステルに
対する２６〜４２分の範囲内にある。このカップリング
期間は、一般にペプチド鎖が長くなるにつれて増大す
る。例えば、１５個のアミノ酸のカップリング後には、
更に１０分追加される。カップリングは初め該対称無水
物が形成される温度で行われるが、一般にこのカップリ
ング期間中に温度は周囲温度に達する。カップリング期
間の完了後、樹脂をＤＣＭで洗い、サンプルをニンヒド
リンモニタリング（例えば、サリン（Ｓａｒｉｎ）等の
論文：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８１，１１
７，ｐｐ．１４７−１５７参照）のために採取し、乾燥
して次のカップリングサイクルのための準備をする。
【００５８】ＮＭＰ中でのｔ−Ｂｏｃ保護法での合成
中、α−アミノ基の脱保護は上記のように行うが、過剰
のＴＦＡの中和はＤＩＥＡ／ＤＣＭ，ＤＩＥＡ／ＮＭＰ
およびＮＭＰ単独で洗浄することにより達成される。す
べてのアミノ酸は、夫々１．０当量のＤＣＣ，ＨＯＢＴ
およびＮ−末端と側鎖とが保護されたアミノ酸とをＮＭ
Ｐ中で約４０〜６０分間、周囲温度にて反応させること
によりＨＯＢＴ活性エステルに転化される。副生成物Ｄ
ＣＵの濾別後、このＨＯＢＴ活性エステル溶液を直接カ
ップリング反応で使用する。カップリングは周囲温度に
て３０分間ＤＭＰ中で、次いで十分なＤＭＳＯを加えて
ＤＭＳＯの２０：８０ＮＭＰ溶液とした後更に６０分間
行って、、最後に１．９ｍｍｏｌのＤＩＥＡを加えた後
更に７分間反応させることにより実施する。ペプチド鎖
の長さの増大に応じて、より長いカップリング時間を使
用する。例えば、ペプチド鎖が１５アミノ酸に達した後
には、カップリング時間は１５分間延長される。二重カ
ップリングサイクルは単一カップリングサイクルと同様
に行われるが、一般にはＬｙｓ４またはマガインペプチ
ドの等価なものに対してのみ実施される。カップリング
サイクルの完了時点で、ペプチド樹脂上に残留する未反
応のアミノ基を、１０％無水酢酸と５０％ＤＩＥＡとの
ＤＣＭ溶液で２分間処理し、次いで無水酢酸の１０％Ｄ
ＣＭ溶液と共に４分間振盪することにより保護される。
ＤＣＭで十分に洗った後、上記のカップリング効率のニ
ンヒドリンモニタリングのために該樹脂サンプルを採取
し、次いで乾燥して、次のカップリングサイクルのため
に準備する。ＤＭＦまたはＮＭＰのいずれかを用いた場
合のカップリング効率は常に９８％以上であり、多くの
場合には９９％よりも高い。
【００５９】本発明のＡＭＰＰＰは、またＦＭＯＣ化学
を利用して首尾良く合成することもできる。これは以下
に説明され、かつＡＢＩモデル４３０Ａペプチド合成装
置〔Ｋ．Ｍ．オットソン（Ｏｔｔｅｓｏｎ），Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦＡＳＥＢ Ｍｅｅｔ
ｉｎｇ，ニューオルレアンズ、４月、１９８９）を用い
て実施できる。また、Ｓ．ノザキ（Ｎｏｚａｋｉ）の論
文：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔ．，１９８９，ｐ
ｐ．７４９−７５２は、ＨＭＰ樹脂およびここに記載の
ものとよく似た自動化ＦＭＯＣ法を利用したマガイニン
１の合成法を詳細に述べている。
【００６０】ここに記載するペプチドのすべては別々に
調製し得るが、複数のペプチドを同時に調製することが
しばしば望ましくかつ有利である。このような合成を実
施する手順は文献において周知であり、このような研究
を実施するための市販の装置も入手可能である。例え
ば、クエルボ等の上記文献“マガイニン：高い抗微生物
活性および低い溶血活性に関連する配列決定因子（Ｔｈ
ｅ Ｍａｇａｉｎｉｎｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｆａｃｔ
ｏｒｓ Ｒｅｌｅｖｅｎｔ ｔｏ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａ
ｎｄ Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ Ａｃ
ｔｉｖｉｔｙ）”および上記文献“マガイニンＡｌａ置
換同族体の合成と抗微生物活性（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ａｎｄ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｃｔｉｖｉｔ
ｙ ｏｆ Ｍａｇａｉｎｉｎ Ａｌａｎｉｎｅ Ｓｕｂ
ｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ）”には、Ｐ
ＡＭおよび４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂両者上
でのｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸を用いたＳＭＰＳ（同時複
数ペプチド合成）法を利用したマガイニン１および２の
Ｃ−末端アミドおよびカルボン酸の欠失およびＡｌａ置
換同族体の同時調製が報告されている。更に、Ｆ．Ｓ．
ツヨン（Ｔｊｒｅｎｇ）等は、ｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸
とＰＡＭ樹脂とによる手作業での合成法を利用した、２
１−位における様々なアミノ酸によるマガイニン２の同
族置換生成物の同時調製を報告している〔“単一担体を
用いた多重ペプチド合成（ＭＰＳ３）”、Ｉｎｔ．Ｊ．
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，１９９
０，３５，ｐｐ．１４１−１４６〕。しかし、同じ論文
の中で、著者はブタアンギオテンシノーゲンペプチドの
１１−置換同族体の同時合成のために、ＡＢＩモデル４
３０Ａペプチド合成装置を用いて、この方法を自動化で
きたことを示した。
【００６１】上記論文中に記載のものと同じ手順を本発
明の具体的実施においても使用した。これに従って、好
ましい方法ではｔ−Ｂｏｃアミノ酸、ＰＡＭ樹脂および
ＮＭＰ−ＮＭＰ／ＤＭＳＯ中でのＤＣＣ／ＨＯＢＴカッ
プリングを利用して３種のマガイニン置換同族体の同時
合成を行った。より一層多くの置換同族体を同時に合成
し得るが、生成したペプチドの分離がより困難となり、
かつ各生成ペプチドの収率も低下する。本発明の実施に
おいて、大きな共通のセグメントを含む様々なＡＭＰＰ
Ｐの部分を同時に合成することは可能であった。例え
ば、置換または鎖長の点でＣ−末端においてのみ異って
いるＡＭＰＰＰは、異るＣ−末端配列を含むＰＡＭ樹脂
を一緒に混合し、次いで同時に、通常の方法で該樹脂の
混合物上で、共通のアミノ酸セグメントを周期的にカッ
プリングすることにより同時に合成できる。この目的の
ため、ＰＡＭ樹脂上で、ｔ−Ｂｏｃアミノ酸を用いてＮ
ＭＰ−ＮＭＰ／ＤＭＳＯ中にてＤＣＣ／ＨＯＢＴを用い
て調製したＨＯＢＴ活性エステルを使用することが好ま
しい。
【００６２】同様に、主としてＮ−末端の異るＡＭＰＰ
Ｐの大きなセグメントが、まず共通のＣ−末端鎖をもつ
ペプチド−ＰＡＭ樹脂をＮ−末端における最初の異るア
ミノ酸に至るまで調製することにより同時に合成でき
る。次いで、該ペプチド−樹脂を別々の容器に分割し、
各別々のペプチド合成を独立に続ける。２種の成長中の
ペプチド樹脂を、完了するまで、あるいは他の分割操作
の望ましい位置に達した際の、ペプチド合成の後の段階
における分割時期まで一緒にしておくことができる。本
発明の範囲において、同時ペプチド合成で使用するのに
適した方法は、ＮＭＰ−ＮＭＰ／ＤＭＳＯ中でのＤＣＣ
／ＨＯＢＴカップリングを利用したＰＡＭ樹脂上でのｔ
−Ｂｏｃ法である。生成するペプチド−樹脂の量を増す
ためには、樹脂の標準的な量０．５ｍｍｏｌよりもむし
ろ０．６ｍｍｏｌを、カップリング効率の低下なしに多
重ペプチド合成で使用することができる。
【００６３】Ｃ−末端カルボン酸またはアミドペプチド
用のプリカーサとして得られるこれらのペプチドは文献
に記載されている周知の標準的手順のいずれかを用いて
該樹脂から開裂し、かつ脱保護処理し得る〔例えば、バ
ラニー等の上記文献；Ｊ．Ｐ．タム（Ｔａｍ）＆Ｒ．
Ｂ．メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）の“合成
ペプチドの強酸による脱保護：メカニズムおよび方法
（Ｓｔｒｏｎｇ ＡｃｉｄＤｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｍｅｃ
ｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ”、（ペプチ
ド：分析、合成、生物学（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：
Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ））”ｖｏｌ．９，第５章、ｐｐ．１８５−２４８；
およびアプライドバイオシステムズの“ペプチド合成に
おける戦略−開裂技術の入門（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ
ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｓｙｎｔｈｅｓ−Ｉｎｔｒｏ
ｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ）”、アプライドバイオシステムズ、１９９
０参照）。ｔ−Ｂｏｃペプチド樹脂については、例え
ば、脱保護剤および開裂剤は標準的無水ＨＦ（フッ化水
素）、低濃度−高濃度ＨＦ，ＴＦＭＳＡ（トリフルオロ
メタンスルホン酸）およびＴＭＳＯＴｆ（トリメチルシ
リルトリフルオロメタンスルホネートを含む。しかし、
標準的ＨＦおよび低濃度−高濃度ＨＦ法は、本発明にお
いてｔ−Ｂｏｃペプチド−樹脂からの脱保護および開裂
のために好ましく使用される。また、Ｎ−末端ｔ−Ｂｏ
ｃ保護基を、該ペプチドのＨＦによる脱保護および開裂
前に除去しておくことが好ましい。
【００６４】“標準的”無水ＨＦ条件を利用したｔ−Ｂ
ｏｃ−ペプチド−ＰＡＭ樹脂の開裂および脱保護は、一
般に上記した文献中に記載されている手順に従って行わ
れる。典型的には、約１ｇの該ペプチド−樹脂を、−５
℃〜０℃にて約５０〜９０分間、１．０ｍｌのアニソー
ル、０．４ｍｌのジメチルスルフィド（ＤＭＳ）、０．
２〜０．４ｍｌの１，２−エタンジオールおよびスキャ
ベンジャーとしての３ｍｇの２−メルカプトピリジンを
含む１０〜１２ｍｌの無水ＨＦ溶液中で撹拌する。存在
するスキャベンジャーの量の僅かな変動は結果に大きな
悪影響を与えない。また、他のスキャベンジャー、例え
ば上に挙げた文献中に記載のものを使用できる（例え
ば、トリプトファンを含むペプチドに対しては３ｍｇの
スカトールをも添加すべきである）。しかし、上記の特
定した反応時間および反応温度を使用することが好まし
い。なんとなれば、より短い反応時間およびより低い反
応温度は不完全な脱保護または開裂をもたらし、一方よ
り高い反応温度の使用は、副反応を起こす恐れがある。
長い反応時間の使用は一般に不利であり、副反応を伴う
恐れがある。しかし、いくつかの場合において、例えば
ペプチド鎖中にトシル基で保護されたアルギニンまたは
数個のアルギニンが存在する場合、より完全な脱保護の
達成のためには２時間までの反応時間が必要とされる場
合がある。このＨＦ法を実施するのに特に好ましい手順
は、イムノ−ダイナミックス社（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｄｙｎ
ａｍｉｃｓ Ｉｎｃ．，ラジョラ、カリホルニア）の手
順である。この手順では、まずＨＦ／スカベンジャー／
ペプチド−樹脂混合物を−１０℃で３０分撹拌し、次い
で０℃にて３０分（０℃て、アルギニン１個につき５分
延長）撹拌する。
【００６５】低濃度−高濃度（ｌｏｗ−ｈｉｇｈ）無水
ＨＦ法を、本発明で記載した任意のペプチド−樹脂の脱
保護および開裂に利用して、メチオニンのアルキル化な
どの副反応を最小化し得るが、この方法は多数のペプチ
ドの同時合成で得られたペプチド−樹脂混合物の脱保護
および開裂に特に適している。この好ましい方法は基本
的にはＪ．Ｐ．タム（Ｔａｍ）等の論文：Ｊ．Ａｍ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８３，１０５，ｐｐ．６４４２
−６４５５およびタムおよびメリフィールドの上記文献
に記載の手順に従い、かつ約１ｇの該ペプチド−樹脂
を、−５℃〜０℃にて約２時間、１０〜２０ｍｌ（好ま
しくは１０〜１２ｍｌ）の２．５：６．５：１の無水Ｈ
Ｆ／ジメチルスルフィド／ｐ−クレゾール（該ペプチド
−樹脂がＴｒｐ（Ｆｏｒ）を含む場合には、１０：２
６：３：１の無水ＨＦ／ジメチルスルフィド／ｐ−クレ
ゾール／チオクレゾールを代わりに使用する）溶液中で
撹拌することを含む。次いで、ＨＦおよびＤＭＳを約−
５℃〜０℃にて真空下で除去し、１０ｍｌの新たな無水
ＨＦを加える。次に、高濃度（ｈｉｇｈ）または標準Ｈ
Ｆ開裂を、−５℃〜０℃にて更に４５〜９０分間、該混
合物を撹拌することにより実施する。この“高濃度”Ｈ
Ｆ脱保護を実施するより好ましい方法はイムノーダイナ
ミックス社の方法である。この方法では、１ｍｌのアニ
ソール、０．４ｍｌのＤＭＳ、０．４ｍｌの１，２−エ
タンジチオールおよび３ｍｇの２−メルカプトピリジン
が１０ｍｇの新たな無水ＨＦと共に添加され、かつ得ら
れた混合物は−１０℃にて３０分および０℃にて３０分
（０℃にて、アルギニン１個につき５分延長）撹拌され
る。
【００６６】“標準”または“低濃度−高濃度”ＨＦ脱
保護および開裂の完了後、ＨＦおよびすべての残留する
ＤＭＳを真空下で−５℃〜０℃にて完全に蒸発させる。
次いで、ペプチド−樹脂−スキャベンジャー混合物を約
１０〜１５ｍｌのジエチルエーテル、酢酸エチルまたは
その他のもの（容量は臨界的ではなく、ジエチルエーテ
ルが好ましい）と混合し、濾過し、残渣を更に、２〜４
回１０〜１５ｍｌのジエチルエーテル、酢酸エチルなど
（容量は特に臨界的ではなく、ジエチルエーテルが好ま
しい）で洗浄して、有機スキャベンジャーを除去する。
この時点で５ｍｌの２−メルカプトエタノール（ＤＭ
Ｅ）と共に残渣を３０分撹拌して、メチオニンスルホキ
シドを還元してメチオニンとすることが好ましい。次
に、このペプチドを２５〜３０ｍｌの１０〜３０％酢酸
（２％のＢＭＥ含有）で３回抽出し、抽出液を併合し、
水で希釈（必要な場合）して酢酸の最終濃度を１０％以
下とし、次いで凍結乾燥する。得られる粗製ペプチドの
収量は典型的には５０〜９０％である。
【００６７】この“低濃度−高濃度”ＨＦ開裂および脱
保護の完了後の、好ましい該ペプチドの抽出法はイムノ
−ダイナミックス社で使用されているものである。この
方法においては、ＨＦおよびＤＭＳの蒸発後、該ペプチ
ド−樹脂混合物をクロロホルムで膨潤し、エーテルで洗
浄（１０ｍｌで３回）、５ｍｌのＢＭＥと共に２０〜３
０分撹拌する。次いで、この混合物を１：１の１０〜３
０％酢酸／ＢＭＥで３回（場合によっては更に、０．１
％のＴＦＡを含む５０％の水性アセトニトリル２０〜３
０ｍｌで抽出することが有利である）抽出する。次に、
これらの抽出液を併合し、２０ｍｌのエーテルで３回抽
出を行って、残留するスキャベンジャーを除き、ペプチ
ドを、水性酢酸／（アセトニトリル）／ＢＭＥ層の凍結
乾燥により回収する。
【００６８】このＨＦ脱保護および開裂処理から得た粗
製ペプチドは、Ｎ−末端、リジン、アルギニン、ヒスチ
ジンおよびオルニチンのフッ化水素酸塩として存在し、
また恐らく他のフッ化物塩およびスキャベンジャー（そ
の他の脱保護法を用いた場合には、例えばトリフロオロ
メタンスルホン酸、他の無機塩、例えばトリフロオロメ
タンスルホン酸塩などが代わりに存在するであろう）で
汚染されている。このようなペプチド即ち無機塩は望ま
しくない。というのは、単独であるいは水分の存在下で
これらの塩は強酸として作用する可能性があり、これら
はペプチドを分解するか、あるいは植物にとって有害と
なる恐れがある。従って、このペプチドを更に精製して
かかる塩としてのペプチドを除くことが好ましく、この
精製は単位重量当たりの活性がより一層高められたペプ
チドを与える。このペプチドの精製に好ましい方法は、
アニオン交換クロマトグラフィーでフッ化物塩を除去
し、次いでペプチドをＨＰＬＣで単離することである。
本発明の実施に際して典型的な精製法は、アニオン交換
クロマトグラフィーまたはＦＭＯＣプロトコールであ
り、これはＡＭＰＰＰを酢酸塩として与え、一方ＨＰＬ
ＣはＡＭＰＰＰをトリフルオロ酢酸塩として与える。
【００６９】ＦＭＯＣ法で調製されたペプチドは、２０
〜２５℃にて１〜１．５時間、約１ｇのペプチド−樹脂
を、ＴＦＡスキャベンジャー溶液と共に撹拌することに
より該樹脂から脱保護および開裂され、該溶液は８：１
のＴＦＡ／アニソール、９５％水性ＴＦＡ、０．７５ｇ
の結晶性フェノールを含む１０ｍｌのＴＦＡ、０．２５
ｍｌのＥＤＴ、０．５ｍｌのチオアニソールおよび０．
５ｍｌの水から、あるいは０．２５ｍｌのＥＤＴおよび
０．２５ｍｌの水を含む９．５ｍｌのＴＦＡから調製さ
れる（アプライドバイオシステムズの“開裂技術入門
（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｅａｖａｇｅ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）”、上記文献、ｐｐ．６〜１
９；およびノザキの“連続流動条件下でのマガイニン１
の固相合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ ｏｆ Ｍａｇａｎｉｎ １Ｕｎｄｅｒ Ｃｏｎｔ
ｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｏｗ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）”、
上記文献を参照）。次いで、このペプチドを、Ｎ−末
端、リジン、アルギニン、ヒスチジンおよびオルニチン
トリフルオロ酢酸塩として単離するが、これは依然とし
て他のトリフルオロ酢酸塩およびスキャベンジャーで汚
染されている可能性がある。これらのトリフルオロ酢酸
塩はフッ化水素酸塩またはトリフルオロメタンスルフォ
ン酸塩ほどには望ましくないものではないが、対応する
フッ化水素酸塩について上記した方法を用いて更に精製
して、このような塩としてのペプチドを除去することが
好ましく、これによって単位重量当たり更に高い活性を
持つペプチド得ることができる。
【００７０】イオン交換クロマトグラフィーを実施する
典型的は方法は、該粗製ペプチドを５〜３０％（これに
より高い酢酸濃度がより疎水性のペプチドに対しては必
要とされる）の、酢酸の最小量に溶解し、あらゆる不溶
性の物質（例えば、吸蔵樹脂）を濾別し、５〜３０％の
酢酸中のアニオン交換樹脂、例えばバイオラド（Ｂｉｏ
Ｒａｄ）ＡＧＩ−Ｘ−９（アセテート型）〔バイオラド
ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）、リッチモンド、カリフォルニア）に該溶液を
通すことである。ニンヒドリンテスト（上記のサリン等
の文献）により検出したペプチド画分を併合し、凍結乾
燥し、無機不純物を含まないが、依然としてスキャベン
ジャーを含む可能性のあるＮ−末端、リジン、アルギニ
ン、ヒスチジンおよびオルニチンの酢酸塩としてペプチ
ドを得る。こうして得られたペプチドはＨＰＬＣ分析
（以下の記載参照）によれば純度５０〜８０％であり、
そのままでも植物病原体の分解において極めて有効であ
る。単位重量当たりより高い活性をもつペプチドは、該
アニオン交換処理前後のいずれかで、該ペプチド塩を弱
塩基、例えば５〜１０％の重炭酸アンモニウムまたは６
Ｍグアニジン塩酸塩で処理して、セリンおよび／または
スレオニンを含有するペプチドにおいて、酸性開裂条件
下で起こるすべてのＮ→Ｏアシルシフトを逆転すること
により得ることができる。典型的には、この処理は該ペ
プチド塩を５〜１０％の重炭酸アンモニウムに溶解し、
この溶液を１５〜２５℃にて一夜放置し、次いで凍結乾
燥によりペプチドを回収することで達成される。
【００７１】いくつかの場合において、特にメチオニン
が該ペプチド鎖の組立て中にそのスルホキシドとして保
護されている場合、該ペプチド混合物を還元剤で再度処
理して、すべての残留メチオニンスルホキシドを還元し
てメチオニンに戻すことが有利である。この目的のため
に使用する多くの試薬が文献中に記載されているが、例
えばＤＴＴ（ジチオスレイトール）、ＤＴＥ（ジチオエ
リスリトール）およびＮＭＡ（Ｎ−メチルメルカプトア
セタミド）が好ましい。この還元は、典型的には１０〜
３０％酢酸中の１０％（ｖ／ｖ）ＭＭＡ溶液としての１
〜５ｍｇ／ｍｌのペプチドを１２〜４８時間、２０〜４
０℃にて窒素雰囲気下でインキュベートする。これは
Ａ．クルウェル（Ｃｕｌｗｅｌｌ）の処理（“Ｎ−メチ
ルメルカプトアセタミド（ＭＭＡ）を用いたペプチド中
のメチオニンスルホキシドの還元（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ
ｉｎＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌ
ｍｅｒｃａｐｔｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）”、アプライド
バイオシステムズペプチド合成装置利用者用ブレタンＮ
ｏ．１７、（１９８７）、フォスタシティー、カリフォ
ルニア）を行うことにより達成される。この還元はＨＰ
ＬＣで監視でき、還元が完了した時点でインキュベーシ
ョンは停止される。このメチオニンスルホキシドのメチ
オニンへの還元は不要である。というのは、本発明者等
はこのようなメチオニンスルホキシド含有ペプチドが植
物病原体に対して活性をもつことを見出したからであ
る。しかし、この還元処理により単位重量当たりの高い
活性をもつペプチドが得られる。ペプチドがＭＭＡで処
理された場合、過剰のＭＭＡおよび関連する副生成物
は、該ペプチド混合物の５〜３０％酢酸溶液をセファデ
ックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム〔ファルマ
シア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＬｋＢバイオテクノロジ
（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）Ｉｎｃ．ピスカタウェ
イ、ニュージャージ州）に通し、流出液を２５４ｎｍで
監視することにより除去される。ペプチド−含有画分は
併合され、凍結乾燥により乾燥される。
【００７２】単位重量当たり最高の活性をもつペプチド
を、更にＨＰＬＣで精製することにより得る。典型的に
は、該ペプチドは逆相ＨＰＬＣにより精製され、この方
法は１〜２ｍｌの０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）
中に溶かした１５〜３０ｍｇの該ペプチドを２．２×２
５ｃｍ、１０μ、３０Åヴィダック（Ｖｙｄａｋ）Ｃ−
４カラムに注入し、０．１％ＴＦＡを含有するアセトニ
トリル−水混合溶媒の種々の勾配で溶出する。このよう
にして得られるペプチドはＮ−末端、リジン、アルギニ
ン、ヒスチジンおよびオルニチントリフルオロ酢酸塩で
あり、これらは一般に２１５ｎｍのＨＰＬＣ積分によれ
ば純度９５％以上である。これらペプチド画分の解析的
ＨＰＬＣは、以下の溶出条件：３０分に亘るＡ中の０〜
６０％Ｂの線形勾配での溶出；流量＝１．０ｍｌ／ｍｉ
ｎ；溶媒Ａ＝０．１％水性ＴＦＡ；溶媒Ｂ＝ＴＦＡの
０．１％アセトニトリル溶液；２１５ｎｍにおける紫外
吸収により監視、を用いて０．４６×２５ｃｍ、１０
μ、３００ÅヴィダックＣ−４カラム上で実施される。
【００７３】多くの場合において、該ペプチドの構造は
アミノ酸分析または質量スペクトル解析により確認し
た。ペプチドのアミノ酸分析は、１００℃にて２４時
間、６Ｎ塩酸で加水分解した後に、ベックマンシステム
ゴールドアミノ酸分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅ
ｍ Ｇｏｌｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｚｅ
ｒ；ベックマンインスツルメント（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）フラートン（Ｆｕｌ
ｌｅｒｔｏｎ），カリフォルニア州）を用いたＨＰＬＣ
で、ニンヒドリン検出を利用したイオン交換カラム（例
えば、ベックマンスフェロゲル（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｐ
ｈｅｒｏｇｅｌ）ＡＡ−Ｌｉ＋カチオン交換カラム）上
で行われる。アミノ酸分析はイムノ−ダイナミックス
（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によっても実施さ
れ、ここではまたはをウォーターズアソシエーツピコー
タグシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｓ Ｐ
ｉｃｏ−Ｔａｇ Ｓｙｓｔｅｍ）〔ミリポーン社（Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ベッドフ
ォード、マサーチュセッツ州〕上でのＰＴＣ（フェニル
チオカルバミル）誘導体として検出された。
【００７４】これらのペプチドのアミノ酸分析は、また
Ｆ．ウェスタル（Ｗｅｓｔａｌｌ）等の“ペプチドの１
５分酸加水分解（Ｆｉｆｔｅｅｎ Ｍｉｎｕｔｅ Ａｃ
ｉｄＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｉｔｉｄｅ
ｓ）”、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９７４，６１，
ｐｐ．６１０〜６１３に記載された手順に従って、ペプ
チド−樹脂を使用して行うこともできた。これらの場合
において、該ペプチド−樹脂は、酸塩単独使用に代えて
１：１の塩酸／プロピオン酸を使用して加水分解され
る。得られた混合物は０．４５μのナイロンフィルタ
（２〜４容の水を水洗のために使用）を通して濾過し、
得られる濾液を凍結乾燥し、残留物を上記の分析にかけ
た。
【００７５】これらのペプチドのＦＡＢ−ＭＳ（高速原
子衝撃−マススペクトル分析法（ｆａｓｔ ａｔｏｍ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｍａｓｓ−ｓｐｅｃｈｏｍｅ
ｔｒｙ））は、８ＫＶおよび電流４０μＡで動作するイ
オンテック（Ｉｏｎ Ｔｅｃｈ）ＢＵＮＦサドルフィー
ルドガン（ｓａｄｄｌｅｄ ｆｉｅｌｄ ｇｕｎ）を備
えたクラトス（Ｋｒａｔｏｓ）ＭＳ５０ＲＦマススペク
トロメータを使用し、た励起イオンを形成するためにキ
セノンを使用して行われた。スペクトルは、該ペプチド
の４ｍＭ溶液１μｌと、４０ｍＭ修酸中の９０％グリセ
リン１μｌとをサンプルプローブの銅ターゲット上で混
合することにより調製された溶液から得た。この装置は
ヨウ化セシウムで較正され、予想される質量の上下約５
００原子質量単位に亘って走査１単位当たり５〜１０秒
の速度で走査され、ＤＳ９０データシステム上に与えら
れるデータは、（Ｍ＋Ｈ）＋フラグメントを与えるマル
チチャンネルアナライザプログラムによって収集した。
【００７６】ＡＭＰＰＰ遺伝子学的合成及び精製 先に記したように、ＡＭＰＰＰはまた、ホスト細胞にデ
オキシリボヌクレオチドまたはＤＮＡ遺伝子配列（例え
ば式ＩＩ及びＩＩＩのもののような）を導入し、一以上
のＡＭＰＰＰを適当な制御シグナル例えば遺伝子プロモ
ーター配列及び遺伝子ターミネーターまたはそれら遺伝
子配列に付着されているポリアデニル化配列でエンコー
ドし、蛋白質合成のための生物学的プロセスを通じてそ
のようなホスト細胞中にＡＭＰＰＰをエンコードする該
遺伝子配列の発現を実現することによって調製すること
ができる。この方法のためのホスト細胞は、原核細胞
（例えば細菌細胞）にでも真核細胞（例えば植物または
動物細胞）にでも由来して良い。大スケールでの製造目
的のために、微生物ホスト例えば細菌または酵母を、こ
れら有機体のための発酵法の進んだ段階の故に、使用す
ることができる。あるいは、他の遺伝子発現系、例えば
菌類（例えばアカパンカビ）、培養されたヒト細胞また
は昆虫細胞を含むものをＡＭＰＰＰの製造のために使用
することができる。ＡＭＰＰＰをエンコードする遺伝子
は、専ら化学的合成方法によって調製することもでき、
また、マガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎｓ）をエンコード
する天然配列から誘導される配列の一部もしくは総てか
ら部分的に成ることもできる。専らデオキシリボヌクレ
オチドから成るオリゴヌクレオチドの化学的合成は、溶
液化学の適用によって達成することもでき、または、好
ましくは固体の担体上にて行うこともできる。オリゴヌ
クレオチドのためのいくつかの合成化学が、創案されて
おり、リン酸トリエステル、亜リン酸トリエステル及び
ホスホルアミダイド化学を包含する。“ＤＮＡ及びＲＮ
Ａ配列化の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ＤＮＡ ａｎ
ｄ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）”（Ｓ．Ｍ．Ｗｅ
ｉｓｓｍａｎ編；Ｐｒｅａｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ
ｓ、ニューヨーク、１９８３年）１〜２２頁中のＭ．
Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓの“デオキシオリゴヌクレオチ
ドの化学的合成のための新しい方法（Ｎｅｗ ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｆｏｒ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｉｎｇ ｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｓ）”、及びＫ．Ｉｔａｋｕｒａ他の“合成オリゴ
ヌクレオチドの合成及び使用（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａ
ｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）”（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．５３巻、１９８４年、３２３〜３５６頁）を
見よ。ホスホルアミダイト合成化学、例えばＮ，Ｎ−ジ
メチルアミノホスホルアミダイトまたはβ−シアノエチ
ル−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトまたはデ
オキシリボヌクレオチド−モルホリノ−メトキシホスフ
ィンを含むものが、成長するオリゴヌクレオチド鎖への
ヌクレオチドの効率的なカップリング、及び用いられる
化学試薬の安定性のために、好ましい。最も好ましいホ
スホルアミダイト化学は、同等の中間体に比べて持続的
な安定性、及びチオフェノールのような毒性の試薬を避
けることの故に、β−シアノエチル−ジイソプロピルア
ミノ−ホスホルアミダイトを用いるものである。Ｓ．
Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＭ．Ｈ．Ｃａｒｔｈｅｒｓの
“デオキシヌクレオシドホスホルアミダイト−デオキシ
ポリヌクレオチド合成のための新しい種類のキー中間体
（Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒ
ａｍｉｄｉｔｅｓ−ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｋ
ｅｙ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒ ｄｅｏｘ
ｙｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ）”（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２巻、
１９８１年、１８５９〜１８６２頁〕；Ｌ．Ｊ．ＭｃＢ
ｒｉｄｅ及びＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓの“デオキシ
オリゴヌクレオチドの合成に有用ないくつかのデオキシ
ヌクレオチドホスホルアミダイトの研究（Ａｎ ｉｎｖ
ｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｄｅｏ
ｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄ
ｉｔｅｓ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚ
ｉｎｇ ｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓ）”（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２４巻、
１９８３年、２４５〜２４８頁〕；Ｔ．Ｄｏｒｐｅｒ及
びＥ．Ｌ．Ｗｉｎｎａｃｋｅｒの“オリゴデオキシリボ
ヌクレオチドの合成のためのホスホルアミダイト法にお
ける改善（Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ
ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇ
ｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）”〔Ｎ
ｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１巻、１９８３年、２５
７５〜２５８４頁）；及びＳ．Ｐ．Ａｄａｍｓらの“二
つのＤＮＡ５１−ｍｅｒの合成におけるヒンダードジア
ルキルアミノヌクレオシド亜リン酸試薬（Ｈｉｎｄｅｒ
ｅｄｄｉａｌｋｙｌａｍｉｎｏ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ
ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈ
ｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｗｏ ＤＮＡ ５１
−ｍｅｒｓ）”（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、
１０５巻、１９８３年、６６１〜６６３頁）を見よ。固
体担体上のホスホルアミダイト化学は、簡単には固体物
質例えばガラス、シリカゲル、ポリアクリルアミド、セ
ルロース、ポリスチレンニトロセルロース及びいくつか
の他の一般に化学的に不活性の物質に変性されたヌクレ
オチドを付着させることから成り、そこにおいて、ヌク
レオチドリン酸基及びヌクレオチド塩基中の有り得る環
外窒素原子は、オリゴヌクレオチド鎖の線状延長の間の
望まない副反応を避けるために、化学基で保護されてい
る。そのような付着は、種々のリンカーまたはスペーサ
ー部分を通していても良いが、しかし、好ましいリンカ
ーは一般に長鎖アルキルアミンである。Ｍ．Ｄ．Ｍａｔ
ｔｅｕｃｃｉ及びＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓの米国特
許第４，４５８，０６６号明細書を見よ。付着したヌク
レオチドは、その５′糖位置（ｓｕｇｅｒ ｐｏｓｉｔ
ｉｏｎ）にて、酸例えばベンゼンスルホン酸、トリクロ
ロ酢酸またはジクロロ酢酸で除去される、酸に対して不
安定なジメトキシトリチル化学基で保護されて、カップ
リングのために５′−ＯＨ基を遊離し、それによって付
加的なヌクレオチドの結合が始まる。このデブロツキン
グまたは活性化工程に適した酸は、トリクロロ酢酸より
もジクロロ酢酸である。固体担体に付着したヌクレオチ
ドと同様に保護されたホスホルアミダイトモノマーヌク
レオチドは次に、ホスホルアミダイト試薬上の５′−Ｏ
Ｈ基の求核攻撃を促進するために弱酸の存在下に加えら
れる。カップリング工程のために適当な弱酸は、テトラ
ゾール、塩酸アミン及び３−ニトロトリアゾールを包含
し、最も好ましい弱酸はテトラゾールである。固体担体
上のカップリングし損った部位は次に、遊離ヒドロキシ
ル基の無水酢酸でのアセチル化によってブロックまたは
キャップされる。キャップ工程における好ましい共反応
体（ｃｏｒｅａｃｔａｎｔ）は１−メチルイミダゾール
である。続いて、天然ヌクレオチドリン酸ジエステル間
の結合が、固体担体上の成長するヌクレオチド鎖の温和
な酸化混合物での処理によるヌクレオチド付加の各サイ
クルにて生じる。この酸化工程は、リン（ＩＩＩ）をよ
り安定なリン（Ｖ）酸化状態へと転化し、ジクロロ酢酸
またはトリクロロ酢酸のような酸種による引き続いての
何らかのデブロッキングまたは活性化処理工程でのヌク
レオチド鎖の開裂を防ぐ。酸化種としてヨウ素が、酸素
ドナーとしての水と共に使用される。好ましい共試剤
は、テトラヒドロフラン及びルチジンを包含する。固体
担体の、無水アセトニトリルでの洗浄に続き、デブロッ
ク／カップリング／酸化／キャッピングサイクルを、選
択した一または二以上のオリゴヌクレオチドを調製する
に必要なだけ回数繰り返すことができ、各回で適当な保
護されたβ−シアノエチルホスホルアミダイトヌクレオ
チドを、プリンまたはピリミジン塩基を有する選択した
ヌクレオチドに挿入するために用いる。プリン塩基は好
ましくは挿入されたヌクレオチド上のアデニンでもグア
ニンでも良く、ピリミジン塩基は好ましくはシトシンま
たはチミンである。オリゴヌクレオチドの化学合成の簡
単さにより、実験室での仕事及び工業的な自動化された
ＤＮＡ合成機での一般的な用途のための実際的なガイド
がもたらされた。Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓの“遺伝
子合成機：ＤＮＡ化学とその使用（Ｇｅｎｅ ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ ｍａｃｈｉｎｅｓ：ＤＮＡ ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ａｎｄｉｔｓ ｕｓｅｓ）”（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２３０巻、１９８５年、２８１〜２８５頁）；及び
Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｌ
ａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９８
８年、２２１〜２３４頁）中の、Ｊ．Ｗ．Ｅｆｃａｖｉ
ｔｃｈの“オリゴデオキシリボヌクレオチドの最適化さ
れた化学的合成のための自動化されたシステム（Ａｕｔ
ｏｍａｔｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｐｔ
ｉｍｉｚｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓ）を見よ。工業的装置は、デュポン社（デラウ
エア州、ウィルミントン）、ミリゲン／バイオサーチ社
（カナダ、サン ラファエル）及びアプライド バイオ
システムズ（カナダ、フォスター市）のようないくつか
の供給元から入手し得る。好ましいのはＢｉｏｓｅａｒ
ｃｈ ８７００またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ ３９１ ＰＣＲ−Ｍａｔｅ ＤＮＡ合成装置で
ある。これら装置の操作及びそこで用いられるβ−シア
ノエチルホスホルアミダイト化学サイクルの詳細は、バ
イオサーチ社のモデル８６００／８７００の使用説明書
またはＰＣＲ−Ｍａｔｅ Ｍｏｄｅｌ ３９１ ＤＮＡ
合成機の使用者用マニュアル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ ｐａｒｔ ｎｕｍｂｅｒ９００９３
６，ｖｅｒｓｉｏｎ １．００，ｒｅｖｉｏｓｉｏｎ
Ａ ｄａｔｅｄ Ｍａｙ １９８９）に記載されてい
る。
【００７７】オリゴヌクレオチドの最後のカップリング
サイクルは、５′末端ジメトキシトリチル基を着けたま
ままたは脱着して終えることができる。ジメトキシトリ
チル基は、オリゴヌクレオチド全体（ｆｕｌｌ−ｌｅｎ
ｇｔｈ）の引き続いての精製において便利なように、好
ましくは着けたままにしておく。終了し、保護されたオ
リゴヌクレオチドは、精製に先立ち、デプロテクトさ
れ、かつ固体担体から開裂されなければならない。担体
樹脂からオリゴヌクレオチドを開裂するために、終了し
たオリゴヌクレオチドを保持する固体担体は、新鮮な濃
水酸化アンモニウムで、室温にて少なくとも１時間処理
される。該固体担体は、次に、さらに濃い水酸化アンモ
ニウムで洗浄され、合わされた濃水酸化アンモニウム
は、保護された塩基から保護化学的官能性を除去するた
めに、密閉されたガラス瓶中、５５〜６０℃で少なくと
も 時間インキュベートされる。試料を次に冷却し、
最小限にて、真空下で乾燥するまで蒸発させる。該試料
はまた、新鮮な濃水酸化アンモニウムまたは純度が少な
くとも９５体積％のエタノールから再蒸発され得る。最
終的な試料は次に、凍結乾燥（乾燥）した状態で貯蔵す
ることができ、また、−２０℃で無期限の貯蔵前に、殺
菌した蒸留水に再懸濁させることもできる。先のＰＣＲ
−Ｍａｔｅ Ｍｏｄｅｌ ３９１使用者用マニュアル、
及びＭ．Ｈ．Ｃａｒｔｈｅｒｓ他の、先のＭｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４巻を見よ。
【００７８】上記の好ましい選択より引き出される方法
によって精製された、開裂及びデプロテクトされたどの
オリゴヌクレオチドも、当業者に公知のいくつかの方法
の一以上によって精製することができる。これら精製法
は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル
電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニテ
ィクロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー
及び疎水性相互作用コロマトグラフィーを包含するが、
これらに限定されない。好ましい方法は、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー及
び疎水性相互作用コロマトグラフィーから成る群より選
択される。それらの好ましい一つの方法は、７Ｍの尿
素、９０ｍＭのトリスＨＣｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、ｐ
Ｈ８．３、９０ｍＭのホウ酸塩、１〜２ｍＭのエチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウムの溶液中の、
垂直１２％ポリアクリルアミドスラブゲル、２０×４０
×０９．０８ｃｍでの、５′末端にジメトキシトリチル
部分の欠如したオリゴヌクレオチドの、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動精製である。精製される各オリゴヌク
レオチドの一部（０．３〜３．０ａ２６０単位）は、真
空下で乾燥するまで蒸発させ、少なくとも０．０１％の
ブロムフェノールブルー及び少なくとも０．０１％のキ
シレンシアノールを含有する、脱イオンホルムアミド：
１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（＞９：
＜１）中に再懸濁し、沸騰した水浴にて２〜３分間加熱
し、迅速に氷のスラリー中に置き、次に、各窪み（少な
くとも幅６ｍｍ）に入れる。該サンプルは、８０〜９０
Ｗにて、ブロモフェノールブルーがポリアクリルアミド
ゲルの長さの少なくとも２／３移動するまで、アノード
側に電気泳動される。オリゴヌクレオチド全体は次に、
該ポリアクリルアミドゲルを、サランラップのような可
撓性の透明なプラスチツクラップの一片に置き、それを
蛍光インジケーター化合物を含有する薄層クロマトグラ
フィープレート〔例えばＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ Ｆ−２
５４；フィッシャーサイエンティフィック社（Ｆｉｓｈ
ｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ、ピッツ
バーク、ＰＡ）〕の先端に置き、短波長の紫外線照射の
下でポリアクリルアミドゲルを検分することによって、
視覚化される。全バンドの物質は、次にポリアクリルア
ミド中で分けられ、電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔ
ｉｏｎ）または緩衝溶液中での簡単な拡散のような種々
の方法によって、ゲルから精製され得る。好ましい抽出
法は、０．５ｍｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ
７．５）中に震蘯しながら一夜拡散させ、続いて遠心分
離によってポリアクリルアミドゲルを除去し、その水層
をフェノール：クロロホルム（１：１、ｖ：ｖ）で継続
的に抽出し、エタノールで沈殿させる方法である。沈殿
したオリゴヌクレオチドは次に、適当な分量（通常、１
０〜１０００ｕｌの範囲内）にて適当な緩衝液例えば１
０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ
二ナトリウム、または殺菌された蒸留水中に再懸濁し、
−２０℃にて貯蔵することができる。分子生物学におけ
る現在の手順（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｈ．Ａ
ｕｓｕｂｅｌ他編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄＳｏ
ｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９年）２．１２群“変
性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたオリゴヌク
レオチドの精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｎｏｆ ｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｕｓｉｎｇ ｄｅｎａｔ
ｕｒｉｎｇ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ
ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）”を見よ。
【００７９】他の、より好ましい精製方法及び５′末端
上のジメトキシトリチル部分をなお有するオリゴヌクレ
オチドの精製に良く適するものは、逆相ＨＰＬＣカラム
上の高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）であ
る。それら逆相ＨＰＬＣカラムには、種々の多くの販売
者、例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｗａｔｅｒｓ（ミルフ
ォード、ＭＡ）、Ｔｈｅ Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ（サウ
スボロ、ＭＡ）、Ｒａｉｎｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．（ウォーバーンＭＡ）、
Ｊ．Ｔ．Ｂａｃｋｅｒ Ｉｎｃ．（フィリプスブルグ、
ＮＪ）、Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎ
ｃ．（ディアフィールド、ＩＬ）またはＰｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（ロックフォード、
ＩＬ）から市販されているシリカまたはポリマーに基づ
く適当な樹脂のいずれをも充填することができる。オリ
ゴヌクレオチドは、例えばいくつかの非破壊的な緩衝液
中のいずれかのアセトニトリル勾配によって、カラムに
入れられ、分画され、それらＨＰＬＣから溶出される。
好ましいアセトニトリル勾配は、０．１Ｍ酢酸トリエチ
ルアンモニウムのｐＨ７．０の緩衝液中、５〜４０％、
より好ましくは５〜３０％の範囲内である。好ましい逆
相ＨＰＬＣカラムは、それらに結合した直鎖アルキル鎖
部分が、例えばＣ４、Ｃ８またはＣ１８のアルキル鎖を
有するものを包含する。精製された全体オリゴヌクレオ
チドを含有する適当な画分は、次に一緒にされ、真空下
で蒸発され、３％（ｖ／ｖ）の酢酸水溶液中、室温で１
０〜３０分間再懸濁される。その脱トリチル化されたオ
リゴヌクレオチドは、次にエタノールで沈殿されるか、
あるいは他の適当な方法例えばサイズ排除クロマトグラ
フィーによって精製される。あるいは、種々のタイプの
カラム及び勾配物質を用いたＨＰＬＣによってもまた、
全体脱トリチル化オリゴヌクレオチドを精製することが
できる。手引きとして、Ｇ．Ｚｏｎ及びＪ．Ｔ．Ｔｈｏ
ｍｐｓｏｎの“核酸研究における高性能液体クロマトグ
ラフィーの概観（Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｈｉｇｈ−
ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ
ｒｅｓｅａｒｃｈ）”〔バイオクロマトグラフィー
（Ｂｉｏ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）第１巻（１
９８６年）、２２〜３２頁〕を見よ。
【００８０】他のより好ましい方法は、疎水性相互作用
クロマトグラフィーによるオリゴヌクレオチドの精製で
ある。本発明の目的のためのこの精製方法は、疎水性樹
脂上の大気圧下での逆相クロマトグラフィーの形であ
る。水酸化アルモニウムデプロテクト及び開裂溶液中の
粗オリゴヌクレオチド混合物は、１．０Ｍの酢酸トリエ
チルアンモニウム（ｐＨ７．０）のような適当な緩衝液
中で平衡にされた疎水性樹脂に添加される。結合したオ
リゴヌクレオチドは次に、２％トリフルオロ酢酸に１〜
３分間暴露することによって脱トリチル化され、次に、
１５〜４０％アセトニトリル水溶液中に回収される。回
収されたオリゴヌクレオチドは次に凍結乾燥され、上記
のように、適当な緩衝液または殺菌された蒸留水中に再
懸濁される。
【００８１】本発明の目的のための部分的にまたは全面
的に合成された遺伝子を調製するために、一以上の合成
オリゴヌクレオチドが必要である。任意の適当なオリゴ
ヌクレオチド及び／または天然の遺伝子例えば天然のマ
ガイニン遺伝子の一部または全部は、そのＤＮＡを加
熱、カオトロピック剤例えば尿素もしくはホルムアミド
との混合、またはアルカリ性溶液への暴露のようないく
つかの方法によって変性することにより、一以上のＡＭ
ＰＰＰをエンコードする遺伝子へと配列するこができ
る。リン酸塩部分を、任意のＤＮＡまたはそれを欠いた
オリゴヌクレオチドに、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
のような酵素を用いて酵素的に付着することができる。
分子生物学における最近の手順（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，前出）の３．１０部を見よ。本発明の範囲内
で、任意の追加的な天然ＤＮＡの存在下または不存在下
での遺伝子の調製において用いられる任意のオリゴヌク
レオチドは、次に、適当な方法、例えば室温へのゆっく
りとした冷却、または任意のカトトロピック剤を除去す
る透析によって、解変性またはアニーリングされる。こ
れらアニーリングされたＤＮＡはＴ４ ＤＮＡリガーセ
のような適当な酵素での処理によって共有結合的に結合
され得る。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、前出の３．１
４部を見よ。
【００８２】もし必要かつ適当であるなら、この方法に
より調製された、ＡＭＰＰＰをエンコードする遺伝子生
成物を、製造社の仕様書に従う制限エンドヌクレアーゼ
での処理によって、または当業者に公知の方法によっ
て、遺伝子制御ＤＮＡ配列に付着するために調製するこ
とができる。例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ他の“分子
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，
ｓｕｐｒａ，前出）、１０４〜１０６頁を見よ。それら
を特定のホスト細胞中で蛋白質として表現し得るように
するためにＡＭＰＰＰをエンコードする遺伝子に付着さ
れた遺伝子制御シグナルは、遺伝子プロモーター（ｇｅ
ｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）配列〔これは、ホスト細胞の
生物学的組織により認識され、ホスト細胞中のＲＮＡポ
リメラーゼによるＤＮＡ配列のメッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）への翻訳を誘引する〕を包含し得る。この
ｍＲＮＡはそれ故、ホスト細胞内でリボゾーム上で蛋白
質生成物へと翻訳され得ることが必要である。該遺伝子
プロモーター配列は、転写及び翻訳についての上記の条
件に合致する限り、ホスト細胞のそれとは異なる細胞中
に見出されるプロモーター配列から部分的にまたは総て
誘導することができる。例えば、グラム陰性菌エシェリ
ヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からの
遺伝子プロモーター配列は、グラム陽性菌バシルスズブ
チリオ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）中の
ＡＭＰＰＰの表現のために十分である。
【００８３】一以上のＡＭＰＰＰの表現のためにＡＭＰ
ＰＰ遺伝子に付着され得る、第二の遺伝子制御要素は、
遺伝子ターミネーターまたはポリアデニル化配列であ
る。このＤＮＡ配列は、さらなる転写を妨害し、中止す
る遺伝子情報を含有し、真核細胞の場合、ｍＲＮＡの
３′末端での一以上のアデノシンヌクレオチドの付着を
指示する情報を提供する。遺伝子ターミネーター配列
は、部分的にまたは全面的に、ホスト細胞のゲノムから
またはホスト細胞内での転写の適当な終了において有効
であることが公知の細胞とは違ういくつかの細胞のゲノ
ムから生じるターミネーター配列を表現することができ
る。そのような配列の例は、サルモネラ チフィムリウ
ム、（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍ）ヒス オペロン独立（ｈｉｓ ｏｐｅｎｒｏｎｒｈ
ｏ−ｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）転写ターミネーター配
列〔例えばＭ．Ｅ．Ｗｉｎｋｌｅｒの“Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍｕ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｃ．Ｎｅ
ｉｄｈａｒｄｔ 主編；Ａｍｒｉｃａｎ Ｓｏｓｉｅｔ
ｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７年）
第２５章を見よ〕、またはオクトピンシンターゼアグロ
バクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｔｉプラスミド
〔例えばＨ．ＤｅＧｒｅｖｅ他の“Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ｍａｐ ｏｆｔｈｅ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔｉ ｐｌａｓｍｉｄ−ｅｎ
ｃｏｄｅｄ ｏｃｔｏｐｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇ
ｅｎｅ”（Ｊ．Ｍｏ１．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１巻、
１９８２年、４９９〜５１１頁）を見よ〕である。
【００８４】遺伝子制御シグナルを付着された一又は複
数のＡＭＰＰＰ遺伝子は好ましくは、適切な遺伝子によ
ってエンコードされる一以上のＡＭＰＰＰを表現する目
的のために、原核のまたは真核の出所のホスト細胞中に
導入される。導入の手段は、当該技術の文献に良く記載
されており、遺伝子表現が望まれるホスト細胞のタイプ
に依存する。例えば、外部から供給されたＤＮＡによる
バクテリア細胞例えばエシェリヒア コリの細胞形質転
換は、塩化カルシウム法によって行うことができる。典
型的には、遺伝子制御シグナルを付着された一又は複数
のＡＭＰＰＰ遺伝子は、形質転換操作に先立ち、適当な
形質転換ベクターに共有結合的に結合される。そのよう
なベクターは、Ｒ．Ｌ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ及びＤ．
Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔの、ベクター：分子クローニング
ベクター及びその使用の概観（Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ Ｓ
ｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇＶｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ）
〔ブッターワース（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ）、ボス
トン：１９８８年〕中で概説されている。同様に、Ｔ．
Ｍａｎｉａｔｉｓ他の分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、前出）第２４７〜２５５頁を
見よ。
【００８５】適当なホスト細胞に任意のそれら遺伝子表
現系で表現されると、該ＡＭＰＰＰは慣用の手段で抽出
及び／または精製され、部分的に精製されたまたは実質
的に精製された形で、植物病原体に対して用いられる。
ホスト細胞からのＡＭＰＰＰの抽出法は、ホスト細胞の
加熱及び／または酵素的溶解、脂質溶液、または水性有
機ミセル溶液への可溶化、並びにフレンチプレスによっ
てホスト細胞を押し破ることによる、細胞膜及び／また
は細胞壁の圧力による破壊（ｐｒｅｓｓｕｒｅｒｅｐｔ
ｕｒｅｉｎｇ）を包含する。細菌がホスト細胞である場
合の好ましい細胞溶解法は、望まれる製造スケールに依
存する。大スケールでの製造のためには、細菌細胞の熱
または圧力による破壊が好ましい。例えばＨ．Ｈｅｌｌ
ｅｂｕｓｔの“組み替え融合蛋白質を安定化させるため
の種々のアプローチ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｐｐｒｏ
ａｃｈｅｓ ｔｏ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ａ ｒｅｃｏ
ｍｂｉｎａｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）”
〔ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７巻（１９８８年）、
１６５〜１６８頁〕を見よ。抽出されたＡＭＰＰＰは、
さらなる精製を行わない中間の形で用いられても良く、
また、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、電気泳動、アフィニティークロマトグ
ラフィーのような方法によって細胞の内容物の一以上の
分別を適用することによって部分的にまたは完全に精製
されても良い。
【００８６】他の可能性は、ＡＭＰＰＰをエンコードす
るこれらの遺伝子を表現しかつＡＭＰＰＰを蛋白質生成
物として表現するために、ホスト受容体（ｒｅｃｉｐｉ
ｅｎｔ）として全型発育能の植物細胞（ｔｏｔｉｐｌｅ
ｎｔ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ）を使用することであり、
それによって繁殖能力ある作物植物を再生することがで
きる。この後者の例において、受容体植物は、遺伝子的
に形質転換したまたは突然変異植物と称される。外来遺
伝子を植物中に導入するためのいくつかの公知の方法が
ある。方法の選択は主に、形質転換される作物植物のタ
イプに依存する。しかしながら、これらの方法の他多く
を、本発明に従い用いることができる。
【００８７】双子植物中にＤＮＡを移すのに特に有効な
方法は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）の使用である。この方法において、問題の遺伝子
（例えば、ＣＡＭＶ３５Ｓ５′プロモーター領域及び
３′ＯＣＳターミネーター領域を有するＡＭＰＰＰ）
は、選別しうる遺伝子（ｓｅｌｅｃａｂｌｅ ｇｅｎ
ｅ）〔例えば、トランスポゾンＴｎ５のネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｓ
ｐｈｏｔａｎｓｆｅｒａｓｅ）ＩＩ、ホスフィノスリエ
インアセチルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏ
ｔｈｒｉｅｉｎ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓ
ｅ）等をエンコードする遺伝子〕を持つ小さな組み替え
プラスミド中に重ね継がれたＴ−ＤＮＡ領域の境界の間
に挿入される。該組み替えプラスミドは次にアグロバク
テリウムホスト中に、直接形質転換によりまたは三親交
配（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ）により導
入される。問題の遺伝子を担持するアグロバクテリウム
株は次に、細菌と植物サンプル（例えば葉盤）を２〜３
日間共培養することによって、双子葉植物の組織の形質
転換に用いられる。形質転換された細胞は適当な試薬の
選択によって回収され、そして、植物は再生され得る。
Ｒ．Ｂ．Ｈｏｒｓｃｈ他の“植物中への遺伝子の移入の
簡単かつ一般的な方法（Ａ Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ Ｇ
ｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｅｒ
ｒｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ）”
〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ ）２２７巻、１９８５
年、１２２９〜１２３１頁〕を見よ。
【００８８】植物細胞の形質転換において、特に、より
扱いにくい単子葉作物植物で用いられてきた他の方法
は、化学的に誘発される移入（例えばポリエチレングリ
コールを用いて）；（Ｌｏｒｚ他のＰｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：５８２４〜５８２８、１
９８５年を見よ）、バイオリスティクス（ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃｓ〔Ｗ．Ｊ．Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ他“メイズ
細胞形質転換及び繁殖しうる突然変異植物の再生（Ｔｒ
ａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｉｚｅ Ｃｅｌ
ｌｓ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅ
ｒｔｉｌｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｓ Ｐｌａｎｔｓ）”
Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔｃｅｌｌ、２巻、１９９０年、６０
３〜６１８頁〕、微量注入法（Ｎｅｕｈａｕｓ他、Ｔｈ
ｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、７５：３０、３６、
１９８７年）、及び他（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：５３５〜５４２、１９９０
年）を包含する。
【００８９】ＡＭＰＰＰの外部施与 病原体に対して植物を保護するためにＡＭＰＰＰの外部
施与を用いるならば、ＡＭＰＰＰは、１〜１００μｇ／
ｍｌの間のＡＭＰＰＰを含有する液状溶液もしくは懸濁
物を形成するように希釈されるか、または微粉末として
施与するために希釈の固体と混合されるであろうと予期
される。施与の正確な特性は、標的とする特定の病原菌
に一部依存する。特定の作物及び病原体へ一般的な施与
方法を適合させる詳細な方法は、植物病原体の制御のた
めの殺虫剤の評価方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｅｖ
ａｌｕａｔｉｎｇ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ Ｆｏｒ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎ
ｓ）、アメリカ植物病理学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈ
ｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、
１９８６年〕中に見ることができる。本発明のこの態様
に従い特に有用であると期待される施与方法は、植物全
体もしくはその部分の間欠性の水性及び非水性噴霧、種
のコーティング、及びかんがいシステム（例えばグリー
ンハウス霧ベンチ（ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｍｉｓｔ−
ｂｅｎｃｈｅｓ）への含有）を包含する。該処方に加え
得る補剤は、可溶化を助ける剤、湿潤剤及び安定化剤、
またはマイクロカプセル化生成物を生じる剤を包含す
る。該処方は好ましくは無機塩を高い含有率で含むべき
ではなく、特に、二価のカチオン例えばＣａ＋＋、Ｍｇ
＋＋、Ｆｅ＋＋を含まない。外部施与はまた、組み替え
微生物体を、増殖し得る形で、またはＡＭＰＰＰを不活
性にしない方法で増殖し得ない形に転換して使用するこ
とができる。もし増殖し得る組換微生物をＡＭＰＰＰを
運ぶために使用するのなら、それらが目的植物をコロナ
イズする能力を有するのが好ましい。
【００９０】ＡＭＰＰＰ抗菌活性 本発明の目的のために好ましいこれらのＡＭＰＰＰ組成
物は、多様な判断基準の少なくともいくつかに合致する
ものである。本発明に従うＡＭＰＰＰのための主な判断
基準は、一以上の植物病原体に対する活性である。すな
わち、これらペプチドは植物病原体を妨げるのに有効で
あるべきである。“植物病原体”と言う語は、植物にダ
メージ及び／または病気をもたらし得る有機体を包含
し、菌類、原核生物（細菌及びマイコプラズマ）、ウィ
ルス及びウイロイド、線虫、原生動物を包含する。
【００９１】例えば、植物の病気を引き起こし得る、
８，０００種よりも多くの菌類が存在する。植物病原体
（Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）（Ｇｅｏｒｇｅ
Ｎ．Ａｇｒｉｏｓ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｉｎｃ，、１９８８年）；植物病原体細菌の同定
のための文献ガイド（Ａ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ Ｇｕ
ｉｄｅ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉ
ａ）（Ａ．Ｙ．Ｒｏｓｓｍａｎ他、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｓｔ，Ｐ
ａｕｌ．ＭＮ、１９８８年）；植物病原体細菌の同定の
ための実験室ガイド（Ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅ
ｒｉａ）（Ｎ．Ｗ．Ｓｃｈａｄ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｓｔ．Ｐ
ａｕｌ．ＭＮ、１９８０年）を見よ。そのような広範な
病原体の認識において、本発明の一態様の文脈で最も有
用なＡＭＰＰＰは、数多くの植物病原体の成長または存
在を阻止または遅らせる広い活性スペクトルを有するも
の、または特定の病原菌の群、特に作物において病気を
引き起こす群に対して非常に有効なものである。例え
ば、エルウィニア種は、農民が年に数億ドル費やすとこ
ろの種々の腐敗病及び立ち枯れ病の原因となる。エルウ
ィニア種の生存または増殖を制御し得る一以上のＡＭＰ
ＰＰがそれ故、望まれる。しかしながら、より望ましい
のは、他の菌類に対して及び／または組み合わされて特
定のホストを攻撃し得る他のクラスの病原菌に対するあ
る程度の活性をまた提供するＡＭＰＰＰである。上記の
ような状態の例は、いくつかの菌類及び細菌（例えばフ
サリウムｓｐｐ、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）ｓ
ｐｐ、ディプロディアｓｐｐ、マクロホミナ（Ｍａｃｒ
ｏｐｈｏｍｉｎａ）ｓｐｐ、ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕ
ｍ）ｓｐｐ、セファロスペリウムｓｐｐ、エルウィニア
ｓｐｐ、シュードモナスｓｐｐ）の種々の組み合わせに
より生じるメイズにおける茎の腐敗である。他の例は、
作物生成物の収穫後の病気におけるように、ダメージを
受けた組織が腐敗性の有機体により侵入される状態を包
含する。
【００９２】数多くの共生のまたは良性の微生物（これ
らは主に細菌種である）が、植物に関連して発見されて
いる。有用なＡＭＰＰＰは、一以上のはっきりした植物
病原体の有効な制御を示す一方で、これらの微生物の生
存に影響を有さないものである。それ故、いくつかの状
態においては、ある程度の特異性が有益である。例え
ば、根系の保護を望む場合には、リゾビウムｓｐｐのよ
うな有機体（これは、大気中の窒素を固定する）または
シュードモナスｓｐｐのような根生有機体（ｒｏｏｔ
ｃｏｌｏｎｉｚｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍ、これらは、
特定の病原体からの根の保護をもたらす）を、そのまま
放っておくのが好ましい。これらの有益なまたは良性の
有機体の多くが細菌であるため、細菌に対する低下した
活性を有するＡＭＰＰＰに対して特定の用途がある。こ
の見地に従うＡＭＰＰＰは、〔Ｈｉｓ１０〕Ｍａｇ２、
〔Ｈｉｓ１１〕Ｍａｇ２、（Ｈｉｓ１０、Ｈｉｓ１１〕
Ｍａｇ２、〔Ｔｈｒ８）Ｍａｇ２、〔Ｇｌｕ８〕Ｍａｇ
２及び（Ｐｈｅ７〕Ｍｇ２を包含するが、これらに限定
されない。
【００９３】ＡＭＰＰＰ蛋白分解耐性 本発明に従う好ましいＡＭＰＰＰ組成物の選択のための
他の基礎は、一以上の植物プロテアーゼまたは植物病原
体プロテアーゼによる消化または分解に対する耐性であ
る。植物は蛋白質を分解するのに用いられる酵素を、細
胞中に、細胞レベルより下の細胞内器官中に、小室中
に、または細胞間の細胞外スペースに含有する。これら
の酵素（プロテアーゼとしてもまた知られている）は、
アミノ酸配列を結び付ける特定の結合を切り、不活性な
または活性度の低いフラグメントを生じることによって
蛋白質及びペプチドを分解する。本発明の関係におい
て、この自然の現象は、植物病原体の成長を妨げること
により植物を保護し得るＡＭＰＰＰを不活性にし得るた
めに、害となり得る。この問題は、細胞外スペースに含
有されるプロテアーゼに暴露される局所的に施与された
ＡＭＰＰＰ、及び細胞内プロテアーゼに暴露される表現
されたＡＭＰＰＰの両者について存在する。 の皮膚の滲出物にあるプロテアーゼにより生じ、この部
位が消化のためにプロテアーゼにとって利用しうると言
うことを示す。先の、Ｍ．Ｇ．Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉら
の文献を見よ。
【００９４】一以上の植物プロテアーゼに対して敏感で
あるとして特徴付けられ得るペプチド結合に隣接する部
位における、少なくともいくつかのアミノ酸置換及び／
または欠失は、蛋白質加水分解を低下または排除する。
これは、少なくとも部分的には、プロテアーゼ酵素とＡ
ＭＰＰＰ基質の開裂部位の間に乏しい“適合”を導入す
ることによって、一又は複数の個々の植物プロテアーゼ
の活性が阻害されることによるのであろう。
【００９５】予想外なことに、植物プロテアーゼを含有
する植物細胞外液でのＡＭＰＰＰの処理による蛋白質加
水分解は、マガイニン１及びマガイニン２の位置７及び
８における夫々ＨｉｓとＳｅｒ、並びにマガイニン２の
位置２１及び２２における夫々ＭｅｔとＡｓｎの間の結
合の開裂によって起こると言うことが見出された。これ
らの現象の認識において、植物プロテアーゼによる不利
な蛋白質加水分解を大きく減じるに有効なこれら一以上
の位置における特定の置換が発見された。そのように変
性されたペプチドは、それ故、変異遺伝子の植物におけ
る表現のための候補であり、かつ作物の保護のための慣
用の応用のために有用である。前記の位置での置 におけるＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｔ
ｈｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｓ
ｐ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、３Ｈｙｐ、４ＨｙｐもしくはＭｅ
ｔを包含する）による不利な蛋白質加水分解を（除去し
ないなら）減じるのに有効であろう。本発明のこの見地
に従 おけるＧｌｕ置換である。
【００９６】Ａｒｇ及びＬｙｓが蛋白質加水分解に実質
的な作用を有することが見出されたと言う事実は、これ
ら化合物と、それらがマガイニン１及びマガイニン２に
おいて置換するＨｉｓ残基との間の生化学的ｐＨにおけ
る電荷が類似であることより、予想外のことである。本
発明に従い、ＡＭＰＰＰにおける位置７、８、２１及び
／または２２における好ましいアミノ酸置換のいくつか
または総ては、他の置換、除去、及び／または延長（ｅ
ｘｔｅｎｓｉｏｎ）と組み合わされることができ、蛋白
質加水分解に抵抗するだけでなく、一以上の植物病原菌
に対する増大した活性、特定の植物病原菌に対する選択
された活性、及び／または低い植物毒性例えば農業にお
いて受容し得る植物毒性を有するペプチドを提供する。
これらの位置におけるどの置換がＡＭＰＰＰの蛋白質加
水分解に対する耐性を高めるかの決定において、多くの
要因を考慮すべきである。考慮すべき一つの要
【００９７】さらにその上、種々の位置、特に位置２１
及び２２における置換を行うかまたは行わないかの決定
において、ＡＭＰＰＰのサイズが重要である。例えば
〔Ｄｅｓ Ａｓｎ２２、Ｄｅｓ Ｓｅｒ２３〕マガイニ
ン２は、本発明に従う、有意な抗菌活性を有する二重残
基省略誘導体（ｄｏｕｂｌｅ ｒｅｓｉｄｕｅ ｏｍｉ
ｓｓｉｏｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）である。しかしな
がら、この２１−ｍｅｒは、別の方法で蛋白質加水分解
より生じるであろう２１− り、残留する２１−ｍｅｒの感度の低下を提供するのが
望ましい。ＡＭＰＰＰの組み立てにおいて考慮する他の
要因は、先に記したように、植物毒性である。潜在的な
植物毒性を有する特定のＡＭＰＰＰは、その濃度が特定
のレベル未満に保たれるならば、機能上植物毒性でな
い。それ故、先述の位置のいずれかを変性させて、蛋白
質加水分解に対する減ぜられた（しかし完全ではない）
耐性を、少なくとも位置７及び８に提供するのが望まし
いであろう。植物毒性濃度の蓄積を避ける速度で分解さ
れるＡＭＰＰＰを設計することが可能である。
【００９８】植物組織中の一以上の植物プロテアーゼ、
特に細胞外プロテアーゼに対するＡＭＰＰＰの相対的抵
抗の尺度は、蛋白質を多量に含み、植物組織から誘導さ
れた植物プロテアーゼを含む溶液の使用によって得るこ
とができる。細胞外プロテアーゼの場合、このことは細
胞外液を得るための標準的な方法、例えばＦ．Ｋｌｅｍ
ｎｏｔの“Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ
Ｆｕｌｕｉｄ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ
ｕｌａｒ Ｓｐａｃｅｓ ｏｆ Ｆｏｌｉａｇｅ ａｎ
ｄ ｔｈｅ Ｆｌｕｉｄ’ｓ Ｍｅｒｉｔ Ａｓ Ｓｕ
ｂｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒｉ
ａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ”（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ
ｏｇｙ、５５巻１９６５年、１０３３〜１０３４頁）中
で論議されたような方法を用いて、または特定の作物植
物の培養した細胞から採られた上澄液または植物組織の
浸潤液の一部を集めることによって行うことができる。
これらの方法は、植物病原体からプロテアーゼを得るた
めにもまた、用いられる。もし、時間長さを増大させる
または溶液（一以上の植物プロテアーゼを含む）の濃度
を増大させて行ったＡＭＰＰＰのインキュベーションが
ＡＭＰＰＰの蛋白質加水分解の量の増大をもたらすと言
うことが示されるならば、投与−反応の関係が、ＡＭＰ
ＰＰの任意の蛋白質加水分解について推定される。この
方法は、それらで処理される又はその中で作られる作物
植物中で出合う蛋白質加水分解条件及び化合物にＡＭＰ
ＰＰを付す故に、他の方法よりもかなり優れている。
【００９９】細胞外プロテアーゼに加えて、ＡＭＰＰＰ
は他の小器官又は小室に存在するプロテアーゼに対して
も試験することができる。これは、植物細胞または組織
を機械的または酵素的に破壊し、次に小器官を速度及び
密度勾配遠心分離によって分別することにより行うこと
ができる。該小器官はすると破壊されて内部のプロテア
ーゼを放出する。この一般的操作は小器官例えば葉緑
体、ミトコンドリア、ペルオキシゾーム、空胞等の中の
プロテアーゼの存在下でのＡＭＰＰＰの安定性の試験に
使用することができる。
【０１００】本発明に従い、細胞より下のレベルの小器
官、植物組織、植物細胞培養物または植物病原体細胞培
養物から調製された溶液は、通常非常に稀薄である。プ
ロテアーゼは通常、溶液中に、水の約１ｐｐｍ（水百万
部当たり１部）から水の約１ｐｐｔ（水千部当たり１
部）の量にて含まれる。しかしながら、蛋白質加水分解
に対する耐性の試験に用いる場合、該溶液はさらに水で
２０倍まで希釈される。それ故、プロテアーゼは水の約
０．０５ｐｐｍもの少量にて含まれる。本発明に従う試
薬において有用なプロテアーゼの実際の量は、はっきり
させるのが困難である。しかしながら、該試薬は、予め
決められた時間（通常約５時間未満）の間に試験化合物
の少なくとも５０％の分解を生ずるに十分な量のプロテ
アーゼを含有して用いられるのが好ましい。試験される
試薬及び化合物は、約３７℃の温度にてインキュベート
され、次に、試薬内のプロテアーゼを不活性化すること
によって（ある程度生じた）分解を止める。このこと
は、多くの方法、例えば酸例えばクエン酸、トリフルオ
ロ酢酸の添加、界面活性剤の添加、または加熱によって
行うことができる。該試薬の効力を証明するための簡単
なチェックは、蛋白質加水分解に対する天然の耐性を持
たないマガイニン１またはマガイニン２についてその作
用を試験することによる。試験されたマガイニン１また
はマガイニン２が約５時間未満に十分に分解されたなら
ば、該試薬で試験された他のＡＭＰＰＰは、定性的にそ
れと同程度であろう。
【０１０１】他の慣用の添加物は、容易に明白な理由に
より、本発明に従う試薬中に含めて良い。これらは緩衝
剤例えばトリス〔トリス（ヒドロキシエチル）アミノメ
タン〕；Ｍｅｔ〔２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスル
ホン酸〕；及び（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラ
ジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸））、保存剤例え
ばナトリウムアジドまたはチメロサールを包含する。こ
れらの添加物の混合物もまた有用である。これら添加物
は、存在する場合、一般に約０．０１〜０．１０％の量
にて含まれる。
【０１０２】蛋白質加水分解は、多くの方法、例えばイ
オン交換クロマトグラフィー、電気泳動分析法、等電点
電気泳動法、高性能液体クロマトグラフィー、サイズ排
除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ
ー、イムノアッセイ、及び当業者に公知の他の方法によ
って監視することができる。蛋白質加水分解の証拠は、
ＡＭＰＰＰのフラグメントを検出することによって得る
ことができる。蛋白質加水分解のさらなる証拠は、それ
らＡＭＰＰＰフラグメントの組成を同定することによっ
て得ることができる。そのような同定は、それらフラグ
メソトのアミノ酸分析及び分子量測定を包含する（但し
これらに限定されない）当業者に公知の種々の方法によ
って行うことができる。分子量測定の好ましい測定は、
ＦＡＢ−ＭＳ及びＨＰＬＣ−ＭＳを包含する。この特性
の情報はまた、ＡＭＰＰＰ上の蛋白質加水分解攻撃の一
又は複数の部位についての証拠を提供し、アミノ酸の置
き換え及び／または置換が蛋白質加水分解に対するＡＭ
ＰＰＰの耐性を増大させると言うことを示唆する。
【０１０３】本発明において具現化された一以上のＡＭ
ＰＰＰが、一以上の植物プロテアーゼによる分解に対し
て耐性であるがしかし、植物病原体によって分泌された
一以上のプロテアーゼによる蛋白質加水分解に対しては
敏感であることも有り得る。この例において、それらプ
ロテアーゼの検出は、ＡＭＰＰＰを、ＡＭＰＰＰの有効
性が望まれる一以上の植物病原体の培養上澄液と共にイ
ンキュベートし、先に議論した一以上の方法によって、
ＡＭＰＰＰがエキソまたはエンド蛋白質加水分解的のど
ちらで分解されるか判定することにより可能である。す
ると、そうして検出されたＡＭＰＰＰに対するこの性質
の任意の微生物的に誘導されたプロテアーゼ活性は、Ａ
ＭＰＰＰ内の開裂の部位を決定するための基礎として役
立つことができ、ＡＭＰＰＰ内のアミノ酸置換及び／ま
たは除去の設計及び合成を潜在的に導き、そのことは、
目的の植物病原体から生じるプロテアーゼによる分解に
対する感度を減じるまたは除去する。
【０１０４】あるアミノ酸置換及び／または除去は、蛋
白質加水分解を減じるために好ましいものの、農業上重
要な一以上の植物病原体に対するＡＭＰＰＰの効力に負
の影響を有するであろう。逆に、ＡＭＰＰＰの効力を保
護するまたは高めるために好ましいこれら置換及び／ま
たは除去は、一以上の植物プロテアーゼに対する耐性を
与える点で、効果がないことが示され得る。それ故、最
大の利益は、植物プロテアーゼに対するより大きな耐性
を生じ、一方でまた、抗生のいくつかの好ましい特徴例
えば目的有機体としてのいくつかの好ましい植物病原体
に対する高レベルの活性、または減じられた植物毒性の
ような他の改善されたいくつかの特徴を保護するまたは
高めるペプチドにより与えられる。
【０１０５】かなりの濃度の一以上のＡＭＰＰＰが求め
られるところの植物組織内の部位は、当該ＡＭＰＰＰの
蛋白質加水分解に対する耐性を与える故に、同様に考慮
しなければならない。例えば、根のレベルでの感染によ
りもたらされる病気（例えば菌類及び／または線虫によ
る）に対する大きな耐性を与えるために、主に植物の根
における有効な濃度でのＡＭＰＰＰを望むのであれば、
根に特有のプロテアーゼ活性に対する耐性が第一の関心
事であろう。蛋白質加水分解に対する耐性をＡＭＰＰＰ
に与えるために、一以上のＡＭＰＰＰのかなりの濃度が
望まれるところの植物組織内の部位を考慮にいれなけれ
ばならない。例えば、根のレベルでの感染によりらもた
らされる病気（例えば菌類及び／または線虫による）に
対するより大きな耐性を与えるために、ＡＭＰＰＰが主
に植物の根において有効な濃度であることを望むのであ
れば、根に特有のプロテアーゼ活性に対する耐性が第一
の関心事であろう。
【０１０６】植物毒性 植物病原体の阻害に使用される好ましい組成物を選択す
るためのさらに他の基準は、植物毒性である。ＡＭＰＰ
Ｐは、好ましくは、植物細胞または植物組織に対して、
相対的に最小の毒性挙動を示すべきである。特に、抗菌
活性またはプロテアーゼ分解に対する安定性を増大させ
る意図の変性は、植物毒性を増大させてはならない。毒
性挙動は、死亡、成長の抑制、大気中の炭素の光固定の
低下、栄養素例えば窒素もしくはリンの同化の低下、ま
たは作物収量の低下によって明らかにし得る。それ故、
機能上それらのホストと相容性のペプチドを提供するこ
とが重要である。
【０１０７】それ故、一つのＡＭＰＰＰを、別のＡＭＰ
ＰＰ、又は天然のマガイニン、又は実際のまたは将来的
工業的価値の他の抗菌化合物との比較において、植物毒
性のいくつかの相対的指数が好ましい。そのような指数
は、正常な植物細胞小器官機能の阻害におけるＡＭＰＰ
Ｐの可能な作用であり得る。好ましい指数は、分離した
植物葉緑体による酸素の放出もしくは炭素の固定、また
は分離した植物ミトコンドリアもしくは細胞による酸素
呼吸である。これら作用は、当該技術分野において入手
し得る種々の方法及び装置例えばワールブルク（Ｗａｒ
ｂｕｒｇ）装置または酸素電極によって監視することが
できる。“光合成の簡単な測定における酸素電極及び蛍
光プローブの使用（Ｔｈｅ Ｕｓｅ Ｏｆ ｔｈｅ Ｏ
ｘｙｇｅｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｖｅ Ｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ Ｍ
ｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ Ｏｆ Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ）”（Ｄ．Ｗａｌｋｅｒ、１９８７年、Ｈａｎ
ｓａｔｅｃｈ Ｌｔｄ．、Ｋｉｎｇｓ Ｌｙｎｎ、Ｎｏ
ｒｆｏｌｋ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を見よ。
【０１０８】ＡＭＰＰＰアミノ酸成分 今議論した植物相互作用判断基準に加えて、本発明に従
うＡＭＰＰＰは好ましいサイズを有する。天然のマガイ
ニンをモデルとするＡＭＰＰＰのための好ましいサイズ
は、約１８〜２４のアミン酸、より好ましくは約２１〜
２４個のアミノ酸である。１８個のアミノ酸と言うＡＭ
ＰＰＰについての最小のサイズは、これがトランスメン
ブランペプチドのための概略の最小サイズであるために
選択される。約２１個のアミノ酸と言う好ましい最大サ
イズは、このサイズが、先に議論した方法で試験した場
合に、少なくともいつくかのヒト病原性微生物及び少な
くともいくつかの植物病原体に対して本質的に完全なま
たはほぼ完全な活性を有する天然マガイニンの誘導体の
概略のサイズを表すために、ＡＭＰＰＰのために選択さ
れる。長さの上限は、約２４個の残基である。と言うの
もこのサイズは、Ｎ末端Ｍｅｔまたは（ｆ）Ｍｅｔを包
含する本発明に従うＡＭＰＰＰの延長を表すためであ
る。
【０１０９】 Ｈｙｐ，４Ｈｙｐ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，
３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、Ｇｌｎ，Ｌｙ
ｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，Ｏｒｎ及びＡｒ
ｇから成る群より選択されるアミノ酸で ｌ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ及び４Ｈｙｐか
ら成る群より選択されるアミノ酸であり、Ｘ も異なっていても良く、Ａｒｇ，Ｏｒｎ，Ａｓｐ，Ｈｉ
ｓ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ｇｌｎ，Ｔｙｒ，Ｔｈｒ，３，４
−ジヒドロキシフェニルアラニン、Ｔｒｐ，Ｍｅｔ，Ａ
ｓｎ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｐｈｅ，Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅ
ｕ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ及び４Ｈｙｐから成る群より選択
されるアミノ酸である）を有する組成物を包含する。上
記の位置にこれら一以上のアミノ酸で置換されたマガイ
ニン１は、植物病原体の阻害における有用性の故に、好
ましい。ここで使用する“阻害する”及び“阻害”と言
う語は、阻止、破壊及び／または不活性化を意味する。
すなわち、本発明に従うペプチドは、目的の植物病原体
を殺す必要はなく、植物感染の進行を妨げることのみを
必要とする。
【０１１０】 Ｈｉｓ，Ｇｌｎ及びＴｙｒから成る群より選択されるア
ミノ酸である式（Ｉ）の配列を有する組成物を包含す
る。
【０１１１】本発明に従うマガイニン１のいくつかのよ
り好ましい置換は、Ａｌａ１３，Ａｌａ１８；Ｌｙ
ｓ７；Ａｒｇ７，Ａｌａ７；Ｐｈｅ７；Ｔｈｒ８；Ｇｌ
ｕ８；Ｌｙｓ１０，Ａｌａ１８；Ａｌａ１９；Ａｒ
ｇ７，Ｔｈｒ８；Ａｒｇ７，Ｇｌｕ８；Ａｒｇ７；Ａｌ
ａ８；Ｌｙｓ７，Ｔｈｒ８；Ｌｙｓ７，Ａｌａ８；Ｌｙ
ｓ７，Ｇｌｕ８；Ａｌａ７，Ｔｈｒ８；Ａｌａ７；Ａｌ
ａ８；Ｐｈｅ７；Ｔｈｒ８；Ｐｈｅ７，Ａｌａ８；Ｐｈ
ｅ７，Ｇｌｕ８；Ｐｒｏ１１，Ｈｉｓ１０；Ｈｉ
ｓ１１；及びＨｉｓ１０，Ｈｉｓ１１包含する。
【０１１２】天然に産出するマガイニン１及びマガイニ
ン２は、動物病原体に対して活性であり、アフリカツメ
ガエル（Ａｆｒｉｃａｎ ｃｌａｗｅｄ ｆｒｏｇ）に
おいては、Ｎ−ターミナル末端において、Ｍｅｔ及び
（ｆ）Ｍｅｔのいずれのメチオニル基をも有さないと言
うことが見出される。高度な生命型（ｌｉｆｅ ｆｏｒ
ｍ）すなわち真核生物はペプチドを通常メチオニン化さ
れた形（ｍｅｔｈｉｏｎａｔｅｄ ｆｏｒｍ）で表現
し、続いてメチオニン化されたペプチドを処理して活性
なペプチドの形を得る故、そのことは驚くことではな
い。本発明の教示に従い組み立てられる活性なＡＭＰＰ
Ｐは、Ｎ−末端メチオニル残基すなわちｆ（Ｍｅｔ）ま
たはＭｅｔを有することができ、このことは特定の例に
おいて望ましい。前記のように組み立てられたＡＭＰＰ
Ｐの細胞処理の必要性は、（除かれていないとしても）
有意に減じられているので、そのことは意味のある発見
である。すなわち、メチオニル残基の付加によって、ま
たはメチオニル残基の付加と組み合わされた他のアミノ
酸残基の除去及び／または置換によってメチオニン化さ
れるＡＭＰＰＰは、さらなる細胞処理なしで、抗菌活性
を示す。この発見の利用は、農業用製品の開発を非常に
容易にするだけでなく、ＡＭＰＰＰの遺伝的に操作され
る製造をも容易にするであろう。
【０１１３】天然に産出する蛋白質は通常アミノ末端に
おいてメチオニン（Ｍｅｔ）を有するので、ＡＭＰＰＰ
のアミノ末端への一のアミノ酸メチオニンまたはＮ−ホ
ルミル化メチオニン“（ｆ）Ｍｅｔ”の付加によるＡＭ
ＰＰＰの延長はまた、本発明に従う好ましい態様であ
る。しかしながら、細菌蛋白質は通常、Ｎ−末端におい
てＮ−ホルミル化Ｍｅｔを導入し、続いてホルミル基の
翻訳後除去による蛋白質合成を開始する。ＡＭＰＰＰが
細菌によって作られるところの天然に生じる活性マガイ
ニン１及び２と異なり、製造された活性ＡＭＰＰＰのい
くつかまたは総ては、Ｎ−末端（ｆ）Ｍｅｔアミノ酸を
含むべきである。本発明のＡＭＰＰＰは、特定の一重及
び二重残基省略（ｏｍｉｓｓｉｏｎ）誘導体を含む。こ
れらＡＭＰＰＰは、先に報告された類似の化合物がヒト
細菌病原体の処理において作用しないと言う事実にも関
わらず、植物病原体に対するそれらの抗菌活性を保持す
る。例えば、［Ｄｅｓ Ｇｌｙ１］Ｍａｇ１はヒト病原
体エシェリヒアコリ（ＥＳｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）、スタフィロコッカスエピデルミス（Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）またはカンジ
ダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）
に対して活性でないにも関わらず、［Ｄｅｓ Ｇｌ
ｙ１］Ｍａｇ１及び〔Ｄｅｓ Ｇｌｙ１，ＤｅｓＩｌｅ
２〕Ｍａｇ１は、いずれも特定の植物病原体例えばエル
ウィニアカロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖ
ｏｒａ）またはトリコデルマリージ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅ
ｒｍａ ｒｅｅｓｉ）の処理において有効である。Ｊ．
Ｈ．Ｃｕｅｒｖｏらの“Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．”
（前出）を見よ。
【０１１４】本発明に従うマガイニン１のいつくかの好
ましい除去及び／または延長は、Ｍｅｔ−，Ｍｅｔ［Ａ
ｌａ１３，Ａｌａ１８］；［Ｄｅｓ Ｇｌｙ１，Ｄｅｓ
Ｉｌｅ２］；Ｍｅｔ［Ｄｅｓ Ｍｅｔ２１］；Ｍｅｔ
［Ｄｅｓ Ｌｙｓ２２，Ｄｅｓ Ｓｅｒ２３］；［Ｄｅ
ｓ Ｌｙｓ２２，Ｄｅｓ Ｓｅｒ２３］である。“Ｄｅ
ｓ”は除去を意味し、上付き数宇は先に定義したように
Ｎ末端ＧｌｙまたはＮ末端に対する相対的位置を示し、
“Ｍｅｔ”はＮ末端に対する付加を意味し、残りの三つ
の文字の組み合わせは天然に産出するアミノ酸に代り、
対応する上付き数字で示された位置において置換された
アミノ酸を示すと言うことを思い出して頂きたい。先述
のＡＭＰＰＰ構成物の組合せ、例えば［Ａｒｇ７，Ｇｌ
ｕ８，Ａｌａ１３，Ａｌａ１８，Ｄｅｓ Ｌｙｓ２２，
Ｄｅｓ Ｓｅｒ２３］Ｍａｇ１、Ｍｅｔ［Ｐｈｅ７］Ｍ
ａｇ１、または［Ｌｙｓ７，Ｇｌｕ８，Ａｌａ１９］Ｍ
ａｇ１も 除去及び／または延長と組み合わせることができる。こ
れは、生じるペプチドがマガイニン１でなく、又はマガ
イニン１の一重残基省略類似体（ｏｍｉｓｓｉｏｎ ａ
ｎａｌｏｇ）でないと言う条件を伴う。
【０１１５】マガイニン２の類似の置換、除去及び／ま
たは延長もまた考えられる。これらは、マガイニン１に
関する上記の好ましい置換並びに上記の好ましい除去及
び延 においてＡｌａで置換されたマガイニン２、唯一つのＡ
ｌａで置換されたマガイニン２、他の置換及び／もしく
は延長を伴わないマガイニン２の一重残基省略類似体 たマガイニン２でないと言う条件を伴う。それ故、本発
明に従うマガイニン２のいくつかの最も好ましい置換並
びにいくつかの好ましい除去及び／または延長は、Ｌｙ
ｓ７；Ａｒｇ７；Ａｌａ７；Ｐｈｅ７；Ｔｈｒ８；Ｇｌ
ｕ８；Ｌｙｓ１０；Ａｒｇ７，Ｔｈｒ８；Ａｒｇ７，Ｇ
ｌｕ８；Ａｒｇ，７，Ａｌａ８；Ｌｙｓ７，Ｔｈｒ８；
Ｌｙｓ７，Ａｌａ８；Ｌｙｓ７，Ｇｌｕ８；Ａｌａ７，
Ｔｈｒ８；Ａｌａ７，Ｇｌｕ８；Ａｌａ７，Ａｌａ８；
Ｐｈｅ７，Ｔｈｒ８；Ｐｈｅ７，Ａｌａ８；Ｐｈｅ７，
Ｇｌｕ８；Ｐｒｏ１１；Ｈｉｓ１０；Ｈｉｓ１１；Ｈｉ
ｓ１０，Ｈｉｓ１１；Ｍｅｔ−；Ｍｅｔ［Ａｌａ１３，
Ａｌａ１８］；Ｍｅｔ［Ｄｅｓ Ｇｌｙ１，Ｄｅｓ Ｉ
ｌｅ２］；Ｍｅｔ［Ｄｅｓ Ｍｅｔ２１］；Ｍｅｔ［Ｄ
ｅｓ Ａｓｎ２２，Ｄｅｓ Ｓｅｒ２３］及び／または
［Ｄｅｓ Ａｓｎ２２，Ｄｅｓ Ｓｅｒ２３］を包含す
る。
【０１１６】先に議論した置換、除去及び／または延長
と同類のＡＭＰＰＰ構成物は、マガイニン１及びマガイ
ニン２でない、マガイニンから誘導されたペプチド中に
作られても良い。すなわち、これらのペプチドは、マガ
イニン１、マガイニン２、またはそれらの直接の誘導体
ではない。それらＡＭＰＰＰは位置２２においてＬｙｓ
またはＡｓｎ及び／または位置１０において対応するＧ
ｌｙまたはＬｙｓを含まない。 Ｌｙｓ，Ｇｌｎ，Ｔｈｒ，３，４−ジヒドロキシフェニ
ルアラニン、Ｔｒｐ，Ｍｅｔ，Ａｓｎ，Ａｌａ，Ｐｒ
ｏ，３Ｈｙｐ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ及び４Ｈｙｐから成る群
より選択されるアミノ酸であり、そ ３Ｈｙｐ，４Ｈｙｐ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙ
ｒ，３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、Ｇｌｎ，
Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，Ｏｒｎ及び
Ａｒｇから成る群より選択されるアミノ酸 でも異なっていても良く、Ａｒｇ，Ｏｒｎ，Ａｓｐ，Ｈ
ｉｓ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ｇｌｎ，Ｔｙｒ，Ｔｈｒ，３，
４−ジヒドロキシフェニルアラニン、Ｔｒｐ，Ｍｅｔ，
Ａｓｎ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｐｈｅ，Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌ
ｅｕ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ及び４Ｈｙｐから成る群より選
択されるアミノ酸であるところの、式Ｉの配列を有する
組成を包含する。
【０１１７】 Ｔｈｒ，Ｔｙｒ，Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ及びＡｒｇか
ら成る群より選択されるアミノ酸であり、 ｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｓ
ｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ及びＡｒｇから成る群より
選 ｒｐ，Ｔｙｒ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｇｌ
ｎ，Ｈｉｓ及びＭｅｔから成る群より選択されるア ｈｅ，Ｈｉｓ，Ｇｌｎ及びＴｙｒから成る群より選択さ
れるアミノ酸であるところの、式Ｉの配列を有する組成
を包含する。
【０１１８】これらの置換は他の置換、除去及び／また
は延長と組み合わされて、植物の蛋白質加水分解に耐性
であるだけでなく、一以上の植物病原体に対する増大し
た活性、特定の植物病原体に対して選択的活性、及び／
または比較的低い植物毒性を持つペプチドを与えること
ができる。本発明の範囲内に入るＡＭＰＰＰの同様の実
例は、次の配列を有するペプチドである：
【０１１９】
【０１２０】
【０１２１】
【０１２２】
【０１２３】
【０１２４】
【０１２５】
【０１２６】
【０１２７】
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】
【０１３１】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【０１３５】
【０１３６】
【０１３７】
【０１３８】
【０１３９】
【０１４０】
【０１４１】
【０１４２】
【０１４３】
【０１４４】
【０１４５】
【０１４６】これらＡＭＰＰＰの遊離酸形及びそのＣ末
端アミン形の塩もまた、他の及び／または追加的な置換
または除去がそうであるように、本発明の対象である。
一以上の植物病原体に対するその有効性を改善し得る、
ＡＭＰＰＰの種々の合成後変性がある。そのような合成
後変性の一つは、天然マガイニン及び本発明のＡＭＰＰ
Ｐのカルボキシル末端のアミド化である。例えば、Ｃｕ
ｅｒｖｏ他の“Ｔｈｅ Ｍａｇａｉｎｓ：Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｒｅｌｅｖａｎｔ Ｔｏ Ｉｎ
ｃｒｅａｓｅｄ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｃｔ
ｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ Ｈｅｍｏｌ
ｙｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ”（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅ
ｓ．，１巻、１９８８年、８１〜８６頁）を見よ。ＡＭ
ＰＰＰのアミド化は、その抗細菌活性を改善することが
一般に知られている。抗細菌活性、蛋白質加水分解耐性
及び／または植物毒性に関して有益であることを示すこ
とができるＡＭＰＰＰの他の合成後変性（一以上のＡＭ
ＰＰＰをエンコードするＤＮＡ配列からの生物学的表現
により調製されたＡＭＰＰＰの翻訳後変性から生じる変
性を包含する）は、アセチル化、グリコシル化、ファル
ネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、アミド化、
チロシンスルホン化、メチオニン残基の酸化によるよう
な化学的もしくは酵素的方法による酸化、プロリンもし
くはチロシンヒドロキシル化、プロリン異性化、及び／
またはホスファリル化（ｐｈｏｓｐｈａｒｙｌａｔｉｏ
ｎ）を包含するが、これらに限定されない。
【０１４７】これらの置換は、他の置換、除去及び／ま
たは延長と組み合わされて、植物病原体に対して耐性で
あるだけでなく、一以上の植物病原体に対する増大した
活性、特定の植物病原体に対する選択的な活性及び／ま
たはより低い植物毒性を有するものであるところのペプ
チドを与えることができる。Ａｒｇ及びＬｙｓが蛋白質
加水分解に実質的な影響を有すると言う事実は、これら
の化合物と、天然に産出するマガイニン１、マガイニン
２及び本発明に従う他のＡＭＰＰＰでそれらが置き換わ
るアミノ酸すなわちＨｉｓとの間での電荷（ｃｈａｒｇ
ｅ）及び又は構造の類似性故、予想外のことである。先
の記述は、以下の実施例を参照してより良く理解される
であろう。これらの実施例は例示の目的のためのもので
ある。これらは本発明の範囲及び特性を限定するもので
あると解されるべきではない。
【０１４８】実施例１−［Ｍｅｔ］Ｍａｇ２−ＯＨ（Ａ
ＨＰＰＰ＃３）の調製 ＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａペプチド合成機を用い、
ｔ−Ｂｏｃ保護、ＤＭＦ／ＤＣＭ中のＤＣＣ促進対称無
水物形成（ＤＣＣ−ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｓｙｍｍｅｔｒ
ｉｃａｌ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ ｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ）、並びに、側鎖保護基としてのＧｌｕ（ＯＢｚ
ｌ）、Ｈｉｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）及びＳｅｒ
（Ｂｚｌ）を用いて、ｔ−Ｂｏｃ−［Ｍｅｔ］Ｍａｇ２
−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂を調製した。合成は、０．５ｍｍ
ｏｌ（０．７８ｇ）のｔ−Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−
ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂から開始し、該樹脂を、該装置で用
いられる標準的なＤＭＦ／ｔ−Ｂｏｃ化学サイクルに従
い繰り返しの脱保護、中和、及びカップリング工程に付
した。Ｎ末端メチオニンのカップリングの前に、Ｍａｇ
２−ＯＨの調製のために樹脂の半分を取除き、そうして
最後のカップリングを樹脂の半分について行った。
【０１４９】得られたｔ−Ｂｏｃ及び側鎖保護された樹
脂（乾燥重量＝０．６ｇ）を、６ｍｌの無水ＨＦ、０．
６ｍｌのアニソール、０．２３ｍｌのＤＭＳ及び０．１
８ｍｌの１，２−エタンジチオールの溶液と共に、−５
℃で５０分間撹拌した。ＨＦ及びＤＭＳの蒸発の後、ペ
プチド／樹脂／スカベンジャー混合物を冷エタノール／
ＢＭＥ（９９：１）１０ｍｌづつで３回洗浄し、スカベ
ンジャー及び他の副生成物を除去した。次に、６Ｍの塩
酸グアニジン／１％ＢＭＥ６ｍｌずつで、ペプチドを２
回抽出した。抽出物を合わせ、２．２×２５ｃｍ、１０
μ、３３０Å、Ｖｙｄａｋ Ｃ−１８カラムでのＨＰＬ
Ｃにより、以下の溶出条件を用いて、望みのペプチド
を、室温にて、塩酸グアニジン溶液から直接単離した：
４ｍｌ／分の流速；６０分間に渡るＡ中のＢ０〜１００
％の直線的勾配（ｌｉｎｅｒａｌｇｒａｄｉｅｎｔ）；
溶媒Ａ：０．１％の水性ＴＦＡ；溶媒Ｂ：０．０８７％
のＴＦＡ、１０％の水、２０％のイソプロパノール、７
０％のアセトニトリル；監視：２２９ｎｍでのＵＶ吸
収。４７．６分で溶出するメインピークを採集したとこ
ろ、そのヘキサトリフロロ酢酸塩から推定して、［Ｍｅ
ｔ］Ｍａ２−ＯＨであることが示された。ＨＰＬＣ分析
により、該ペプチドは９５％よりも純粋であることが示
された。［Ｍｅｔ］Ｍａ２−ＯＨはまた、実施例３に記
載された方法によっても調製された。
【０１５０】実施例２−［Ｐｒｏ１１］Ｍａｇ２−ＯＨ
（ＡＭＰＰＰ＃５）の調製 実施例１で示した方法に従い、但しアミノ酸１〜１４を
ＤＭＦ／ＤＣＭ中で二重にカップルし、かつＨｉｓ
（Ｚ）の代わりにＨｉｓ（Ｂｏｍ）を用いて、ｔ−Ｂｏ
ｃ−［Ｐｒｏ１１］Ｍａｇ２−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂を調
製した。脱保護及び開裂は、１．０ｇのペプチド−樹脂
を、１２ｍｌの無水ＨＦ、１．０ｍｌのアニソール、
０．４ｍｌのＤＭＳ及び０．２ｍｌの１，２−エタンジ
チオールの溶液と共に、−１０℃で３０分間、次に０℃
で３０分間撹拌することによって行った。ＨＦ及びＤＭ
Ｓの蒸発の後、残渣を５ｍｌのＢＭＥと撹拌し、次に、
１５％酢酸／２％ＢＭＥ１０ｍｌづつで３回抽出した。
抽出物を合わせ、引き続いて、ジエチルエーテル２０ｍ
ｌづつで２回抽出した。酢酸層を次に凍結乾燥して２１
７ｍｇの粗ペプチドを得、それを１％のＢＭＥを含有す
る約４ｍｌのＩＮ酢酸に溶かし、２．６×１０ｃｍの、
ＩＮ酢酸中のＢｉｏ−ＲａｄＡＧ１−Ｘ−８イオン交換
カラム（酢酸塩型）に通じた。ニンヒドリン監視（Ｓａ
ｒｉｎら、前出）により検出されたペプチド画分を合わ
せ、凍結乾燥して、０．２６ｇの、推定するにペンタ酢
酸塩として存在する粗ペプチドを得た。１０％酢酸／１
％ＢＭＥ中のペプチドの溶液を、２．６×７０ｃｍのＳ
ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに流速１ｍｌ／分の流
速にて通して溶出し、ペプチド分画（それは流出物を２
５４ｎｍで監視することによって検出された）を集める
ことによってさらに精製した。該ペプチド画分を合わ
せ、凍結乾燥して２５０ｍｇのベプチドを得、このペプ
チドはＨＰＬＣ分析により９５％より高い純度を有する
ことが示され、かつその組成はアミノ酸分析により確認
した。
【０１５１】実施例３− ［Ｈｉｓ１０］Ｍａｇ２−Ｏ
Ｈ（ＡＨＰＰＰ＃１２）の調製 ＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａペプチド合成機を用い、
ｔ−Ｂｏｃ保護、ＮＭＰ中のＤＣＣ／ＨＯＢＴ製造ＨＯ
ＢＴ活性エステル（ＤＣＣ／ＨＯＢＴ ｐｒｏｄｕｃｅ
ｄ ＨＯＢＴ ａｃｔｉｖｅ ｅｓｔｅｒｓ）、並び
に、側鎖保護基としてのＧｌｕ（ＯＢｚｌ）、Ｈｉｓ
（Ｂｏｍ）、Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）及びＳｅｒ（Ｂｚｌ）
を用いて、ｔ−Ｂｏｃ−［Ｈｉｓ１０］Ｍａｇ２−ＯＣ
Ｈ２ＰＡＭ樹脂を調製した。合成は、０．５ｍｍｏｌ
（０．６９３ｇ）のｔ−Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｏ
ＣＨ２ＰＡＭ樹脂（置換レベル＝０．７３ｍｍｏｌ／
ｇ）から開始し、該樹脂を、該装置で用いられる標準的
なＮＭＰ／ｔ−Ｂｏｃ化学サイクルに従い繰り返しの脱
保護、中和、及びカップリング工程に付した。恒量まで
乾燥した後、１．８２ｇ（７８％）のペプチド−樹脂が
得られた。
【０１５２】０．９５ｇのペプチド−樹脂の、実施例２
に記載された方法を用いての脱保護及び開裂により、４
３２ｍｇ（８２％）の粗ペプチドが得られた。これを、
実施例８記載の方法を用いて酢酸塩形へと転化し、恐ら
くはヘキサ酢酸塩の４００ｍｇを得た。後者を、５０ｍ
ｌの１０％炭酸水素アンモニウム中に溶解し、該溶液を
窒雰囲気下室温で２０時間撹拌した。この溶液を凍結乾
燥すると、改善された製品プロフィールを有する０．３
８ｇのペプチドが得られた。最後の精製は、２．２×２
５ｃｍ、１０μ、３００Å、Ｖｙｄａｋ Ｃ−４カラム
へのペプチド（１５〜３０ｍｇ）の繰り返しての注入及
び以下の線形勾配での溶出を用いた予備的な逆相ＨＰＬ
Ｃにより行った：４０分間に渡るＡ中の２２〜４２％の
Ｂ；流速；６．０ｍｌ／分；溶媒Ａ：０．１％の水性Ｔ
ＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル中の０．０８％ＴＦＡ；
監視：２３５ｎｍでのＵＶ吸収。２８．１分で溶出する
メインピーク（推定するにペプチドのヘキサトリフルオ
ロ酢酸塩形）を集めたところ、９８％よりも純粋である
ことがＨＰＬＣにより示された。
【０１５３】実施例４−［Ｄｅｓ Ｇｌｙ１，Ｍｅ
ｔ２］Ｍａｇ２−ＯＨ（ＡＭＰＰＰ＃９）の調製 実施例３で与えられた方法を用い、但しＬｙｓ３を二重
にカップルして、ｔ−Ｂｏｃ［Ｄｅｓ Ｇｌｙ１，Ｍｅ
ｔ２］Ｍａｇ２−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂を調製した。樹脂
上のペプチドの組成は、アミノ酸分折（Ｗｅｓｔａｌｌ
他、前出）によって確認された。該ペプチド−樹脂を、
実施例２に記載の方法を用いて脱保護及び開裂した
〔１．６５ｇのペプチド−樹脂から８２４ｍｇ（９５
％）の粗ペプチドが得られた〕。該ペプチドを、実施例
３記載の方法で、但しアニオン交換クロマトグラフィー
の後に炭酸水素アンモニウムで処理しないで精製した。
実施例３記載のＨＰＬＣ条件を用い、２３．８２分で溶
出するメインピークを集めると、所望のペプチド（これ
はＨＰＬＣ分析より９７％よりも純粋である）が、恐ら
くはそのヘキサフルオロ酢酸塩として得られた。
【０１５４】実施例５−Ｍｅｔ［Ａｌａ１３，Ａｌａ
１８］Ｍａｇ２−ＯＨ（ＡＭＰＰＰ＃１１）の調製 実施例３で与えられた方法を用いてｔ−Ｂｏｃ−Ｍｅｔ
［Ａｌａ１３，Ａｌａ１８］Ｍａｇ ２−ＯＣＨ２Ｐ
ＡＭ樹脂を調製し、脱保護し、開裂して、酢酸塩形の該
ペプチドを実施例４記載の方法を用いて単離した。ＨＰ
ＬＣ精製は、線形勾配をＡ中の２８〜４８％のＢとした
以外は実施例３に記載のようにして行った。３５．７分
で溶出するメインピーク（これは推定するにペプチドの
ヘキサトリフルオロ酢酸塩形である）を集めた。これは
９７％より高い純度であることがＨＰＬＣより示され
た。
【０１５５】実施例６−［Ｈｉｓ１１］Ｍａｇ ２−Ｏ
Ｈ（ＡＭＰＰＰ＃１３）及び［Ｈｉｓ１０，Ｈｉ
ｓ１１］Ｍａｇ ２−ＯＨ（ＡＭＰＰＰ＃１４）の調製 実施例３記載の方法を用い、二つのペプチドの共通のセ
グメント、マガイニン２のＨｉｓ１１−Ｓｅｒ２３をＰ
ＡＭ樹脂上に集めた。該樹脂を半分に分け、二つの別々
の容器中で合成を継続した（両者の相違は、次のカップ
リングされたアミノ酸が一方ではヒスチジンであり他方
ではリシンであるのみである）。各合成は、実施例３記
載の方法を用い、独立に終了した。［Ｈｉｓ１１］Ｍａ
ｇ２の場合については、８８９ｍｇのペプチド−樹脂を
通常の方法で脱保護しかつ開裂して３８５ｍｇの粗ペプ
チドを与え、一方で［Ｈｉｓ１０，Ｈｉｓ１１］Ｍａｇ
２の場合については、８０４ｍｇのペプチド−樹脂は３
２０ｍｇ（７１％）の粗ペプチドを与えた。該ペプチド
を、実施例４の方法を用いて精製し、その酢酸塩形へと
転化し、夫々に実施例３記載の方法を用いてのＨＰＬＣ
による最終精製に付した。［Ｈｉｓ１１］Ｍａｇ ２−
ＯＨでは２７．９分に、［Ｈｉｓ１０，Ｈｉｓ１１］Ｍ
ａｇ ２−ＯＨでは２５．１分に溶出するメインピーク
（恐らくはこれらペプチドのヘキサトリフルオロ酢酸塩
形）を単離した。ＨＰＬＣにより、いずれも９５％より
高い純度であることが示された。
【０１５６】実施例７−［Ａｒｇ７］Ｍａｇ ２−ＯＨ
（ＡＭＰＰＰ＃１９）、［Ｌｙｓ７］Ｍａｇ２−ＯＨ
（ＡＭＰＰＰ＃１８）及び［Ｐｈｅ７］Ｍａｇ ２−Ｏ
Ｈ（ＡＭＰＰＰ＃２０の調製 実施例３記載の方法を用い、三つのペプチドの共通のセ
グメント、マガイニン２のＡｌｇ９−Ｓｅｒ２３をＰＡ
Ｍ樹脂上に集めた。０．６００ｍｍｏｌのｔ−Ｂｏｃ−
ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂から出発し、Ｐ
ＡＭ樹脂上のマガイニン２の側鎖保護されたｔ−Ｂｏｃ
−Ａｌａ９−Ｓｅｒ２３セグメント１．７６ｇが得られ
た。この半分、０．８８ｇ（０．２４４ｍｍｍｏｌ）を
実施例２での使用のために取っておき、他方の半分をｔ
−Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）でカップルしてｔ−Ｂｏｃ
−Ｓｅｒ８−Ｓｅｒ２３−Ｍｇ２−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂
を作った。次に、Ｔｊｏｅｎｇ他による記載（前出）に
類似の方法を用い、ｔ−Ｂｏｃ−Ａｒｇ（ＭＴＳ）、ｔ
−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）及びｔ−Ｂｏｃ−Ｐｈｅ
の等モル量の混合物（各０．６６７ｍｍｍｏｌ）を、ペ
プチド合成機のｔ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）／ＮＭ
Ｐ単一カップルサイクルを用いて、該樹脂にカップルし
た〔ニンヒドリン監視（Ｓａｒｉｎ他、前出）は、この
工程についての９９．１％のカップリング効率を示し
た〕。該ペプチド−樹脂混合物を次にアセチル化により
キャップし、残った共通のセグメントの、ペプチド合成
機の標準ＨＯＢＴ／ＮＭＰカツプリングサイクルを用い
ての着物〔ニンヒドリン監視（Ｓａｒｉｎ他、前出）〕
は、９８．５％９９．６％のカップリング能率を示し
た。
【０１５７】ＴＦＡを用いたペプチド合成機により、Ｎ
末端ｔ−Ｂｏｃ−基を除去し、該ペプチド混合物を次に
脱保護し、以下の低／高ＨＦ操作を用いて樹脂から開裂
した：１．０３ｇのペプチド−ＰＡＭ樹脂混合物を、
２．５ｍｌの無水ＨＦ、６．５ｍｌのＤＭＳ及び１．０
ｍｌのＰ−クレゾールの溶液と共に、０℃で２時間撹拌
した。ＨＦ及びＤＭＳの蒸発の後、ペプチド−樹脂混合
物を、１２ｍｌの無水ＨＦ、１．０ｍｌのアニソール、
０．４ｍｌのＤＭＳ、０．２ｍの１，２−エタンジチオ
ール及び３．０ｍｇの２−メルカプトピリジンの新鮮な
溶液と共に撹拌した。ＨＦ及び他の揮発分の蒸発の後、
該樹脂をクロロホルムで膨潤させ、該混合物をエーテル
１０ｍｌづつで３回洗浄し、５ｍｌのＢＭＥと共に３０
分間撹拌し、１５％酢酸／ＢＭＥ（１：１）６ｍｌづつ
で３回、０．００１％のＴＦＡを含有する５０％水性ア
セトニトリル３０ｍｌで一回抽出した。水性抽出物を合
わせ、エーテル１５ｍｌづつで３回抽出し、凍結乾燥し
て３９８ｍｇ（約７０％）のペプチド混合物を得、それ
を実施例４記載の方法を用いて酢酸塩形へと転化した。
【０１５８】該ペプチドを分離し、実施例３記載のＨＰ
ＬＣ操作を用い、但し用いる勾配を６０分間のＡ中の２
２〜２８％のＢ、続いての１０分間のＡ中の２８〜３９
％のＢとして、単離した。ペプチド（推定するにそのト
リフルオロ酢酸塩として、Ａｒｇ７及びＬｙｓ７につい
てはヘキサ；Ｐｈｅ７についてはペンタ）をＨＰＬＣ及
びＦＡＢ−ＭＳにより分析すると、以下の特性を有する
ことが見出された〔予備の室温でのＨＰＬＣ（分）、Ｈ
ＰＬＣによる％純度、（Ｍ＋Ｈ）＋の論理値（ａｍ
ｕ）、（Ｍ＋Ｈ）＋の実測値（ａｍｕ）〕：［Ａｒ
ｇ７］Ｍａｇ ２（４９．８、＞９６、２４５８．４、
２４５８．７）；［Ｌｙｓ７］Ｍａｇ ２（４８．２、
＞９６、２４５８．４、２４５８．７）；［Ｐｈｅ７］
Ｍａｇ ２（６４．０、＞９８、２４７７．３、２４７
７．９）。
【０１５９】実施例８−［Ａｌａ８］Ｍａｇ ２−ＯＨ
（ＡＭＰＰＰ＃１６）、［Ｇｌｕ８］Ｍａｇ ２−ＯＨ
（ＡＭＰＰ＃１７）及び［Ｔｈｒ８］Ｍａｇ ２−ＯＨ
（ＡＭＰＰＰ＃１５）の調製 実施例７におけるマガイニン２のセグメントＡｌａ９−
Ｓｅｒ２３を含有するＰＡＭ樹脂を、ｔ−Ｂｏｃ−Ａｌ
ａ、ｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）及びｔ−Ｂｏｃ−
Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）の等モル量の混合物（各０．６６７ｍ
ｍｍｏｌ）でカップルした。該ペプチド−樹脂混合物を
アセチル化によりキャップし、残った共通のセグメント
を、実施例７に記載の方法で付着した。ニンヒドリン監
視（Ｓａｒｉｎ、前出）は、総ての場合においてカップ
リング効率は９８．５％より高いと言うことを示した。
ペプチド−樹脂混合物（０．９４０ｍｇ）を、実施例１
３記載の方法を用いて脱保護及び開裂して３５２ｍｇ
（６８％）のペプチド混合物をえ、それを実施例４記載
の方法を用いて酢酸塩形へと転化した。実施例３記載の
ＨＰＬＣ法を用い、但し用いる勾配を７０分間はＡ中の
２３〜３０％のＢ、続いて５分間は３０％のＢとして、
該ペプチドを分離及び単離した。該ペプチド（推定する
にそのヘキサトリフルオロ酢酸塩）をＨＰＬＣ及びＦＡ
Ｂ−ＭＳにより分析すると、以下の特性を有することが
見出された。〔予備の室温でのＨＰＬＣ（分）、ＨＰＬ
Ｃによる％純度、（Ｍ＋Ｈ）＋の理論値（ａｍｕ）、
（Ｍ＋Ｈ）＋の実測値（ａｍｕ）〕：［Ａｌａ８］Ｍａ
ｇ ２−ＯＨ（６７．４、＞９５、２４５１．３、２４
５１．４）；［Ｇｌｕ８Ｍａｇ ２−ＯＨ（７０．５、
＞９０、２５０９．３、２５０９．６）；［Ｔｈｒ８］
Ｍａｇ ２−ＯＨ（５６．２、＞９５、２４８１．４、
２４８１．７）。
【０１６０】実施例９−［Ｄｅｓ Ａｓｎ２２，Ｄｅｓ
Ｓｅｒ２３］Ｍａｇ ２−ＯＨ（ＡＭＰＰＰ＃２２）
の調製 実施例３記載の方法を用い、二つのペプチドの共通のセ
グメント、マガイニン２のＧ１ｙ１−Ｉｌｅ２０を、
０．２０ｍｍｏｌのｔ−Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＣＨ２ Ｐ
ＡＭ及び０．３０ｍｍｏｌのｔ−Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−Ａｓ
ｎ−ＯＣＨ２ ＰＡＭ（ｔ−Ｂｏｃ−Ａｓｎ−ＯＣＨ２
ＰＡＭから出発し、実施例３の方法を用いて調製し
た）の混合物上に付着した。しかしながら、この合成に
おいて、Ｇｌｙ１〜Ｌｙｓ１１のセグメントは、各アミ
ノ酸について二重カップルにより集められた。該ペプチ
ド−樹脂混合物（１．１５ｇ）を、実施例７記載の方法
を用いて脱保護及び開裂し、４１９ｍｇ（６５％）のペ
プチド混合物をえ、それを実施例４記載の方法を用いて
酢酸塩形に転化した。実施例３記載のＨＰＬＣ法を用
い、但し用いる勾配を６０分間はＡ中の２０〜２３の
Ｂ、続いて２０分間は２３〜２５％のＢとして、該ペプ
チドを分離及び単離した。該ペプチド（推定するにその
ヘキサトリフルオロ酢酸塩）をＨＰＬＣ及びＦＡＢ−Ｍ
Ｓにより分析すると、以下の特性を有することが見出さ
れた。〔予備の室温でのＨＰＬＣ（分）、ＨＰＬＣによ
る％純度、（Ｍ＋Ｈ）＋の理論値（ａｍｕ）、（Ｍ＋
Ｈ）＋の実測値（ａｍｕ）〕：［Ｄｅｓ Ａｓｎ２２，
ＤｅｓＳｅｒ２３］Ｍａｇ ２（６５．６、＞９４、２
２６６．３、２２６６．９）；〔Ｄｅｓ Ｓｅｒ２３〕
Ｍａｇ ２（ＡＭＰＰＰ＃２１、対照の目的のために作
った）（６２．２、＞９２ 、２３８０．３、２３８
１．８）。
【０１６１】実施例１０−［Ｄｅｓ Ｇｌｙ１，Ｄｅｓ
Ｉｌｅ２］Ｍａｇ １−ＯＨ（ＡＭＰＰＰ＃２３）及
び［Ｍｅｔ］Ｍａｇ １−ＯＨ（ＡＭＰＰＰ＃２５）の
調製 ０．６０２ｍｍｏｌのｔ−Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−
ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂から出発し、実施例３記載の方法を
用い、但しＧｌｙ３及びＬｙｓ４を二重にカップルし
て、ｔ−Ｂｏｃ−［Ｄｅｓ Ｇｌｓ１，Ｄｅｓ Ｉｌｅ
２］Ｍａｇ １−ＯＣＨ２ ＰＡＭ樹脂を合成した。こ
のペプチド−樹脂の約１／３（乾燥重量８３０ｍｇ）を
取除き、取っておいた。一重カップルを用い、残った樹
脂にイソロイシンをカップルしてｔ−Ｂｏｃ−［Ｄｅｓ
Ｇｌｙ１］Ｍａｇ １−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂を作り、
またも、これの約半分（乾燥重量７９２ｍｇ）を取除い
て取っておいた。残った樹脂にグリシン及びメチオニン
をカップルし、乾燥後に６６１ｍｇ［Ｍｅｔ］Ｍａｇ
１−ＯＣＨ２ ＰＡＭ樹脂を得た。各樹脂を次に、実施
例３記載の方法を用い、但しＨＦ開裂の間スカベンジャ
ーとして３ｍｇの２−メルカプトピリジンを加えて、夫
々別個に脱保護及び開裂し、夫々４３０ｍｇ（９２
％）、３５０ｍｇ（８４％）及び２５０ｍｇ（６９％）
の［Ｄｅｓ Ｇｌｙ１，Ｄｅｓ Ｉｌｅ２］Ｍａｇ １
−ＯＨ、［Ｄｅｓ Ｇｌｙ１］Ｍａｇ １−ＯＨ、（Ａ
ＭＰＰＰ＃２４、対照の目的のために作った）及び［Ｍ
ｅｔ］Ｍａｇ １−ＯＨを、それらのフッ化水素塩とし
て得た。実施例４の方法を用いて、該ペプチドを精製
し、それらの酢酸塩（推定するにヘキサ酢酸塩）の形へ
と転化した。ＨＰＬＣ分析は、それらが夫々約７８％、
４８％、６６％の純度であることを示した。
【０１６２】実施例１１−［Ａｌａ１３，Ａｌａ１８］
Ｍａｇ１−ＯＨ（ＡＭＰＰＰ＃２６）、Ｍｅｔ［Ａｌａ
１３，Ａｌａ１８］Ｍａｇ １−ＯＨ（ＡＭＰＰＰ＃２
７）及び［Ａｌａ１８］Ｍａｇ １−ＯＨ（ＡＭＰＰＰ
＃２８）の調製 実施例３記載の方法を用い、０．６０１ｍｍｏｌのｔ−
Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）から出発して、ＰＡＭ樹脂上
に［Ａｌａ１８］Ｍａｇ １のセグメント、Ｌｙｓ１４
〜Ｓｅｒ２３、を合成した。このペプチド−樹脂の約１
／３を取除いて、他の反応容器中に入れ、カップリング
を継続して８３２ｍｇ（乾燥重量）の［Ａｌａ１８］Ｍ
ａｇ １−ＯＣＨ２ ＰＡＭ樹脂を製造した。容器に残
した樹脂は、セグメントｔ−Ｂｏｃ−（Ａｌａ１３，Ａ
ｌａ１８］Ｍａｇ １−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂が生じるま
でカップルした。この樹脂の約半分（６８３ｍｇ、乾燥
重量）を取除き、残った樹脂にメチオニンをカップルさ
せて、５４２ｍｇ（乾燥重量）のＭｅｔ［Ａｌａ１３，
Ａｌａ１８］Ｍａｇ １−ＯＣＨ２ ＰＡＭ樹脂を製造
した。各三つの樹脂の各々を次に、独立して、実施例１
０記載の方法を用いて脱保護及び開裂し、夫々、２８５
ｍｇ（６６％）、２５９ｍｇ（７２％）、及び１０４ｍ
ｇ（３７％）の、フッ化水素酸塩としての［Ａｌ
ａ１８］Ｍａｇ１−ＯＨ、［Ａｌａ１３，Ａｌａ１８］
Ｍａｇ １−ＯＨ及びＭｅｔ［Ａｌａ１３，Ａｌ
ａ１８］Ｍａｇ １−ＯＨを製造した。実施例４の方法
を用いて、該ペプチドを精製し、その酢酸塩形恐らくは
ヘキサ酢酸塩へと転化した。ＨＰＬＣによる分析は、そ
れらが、夫々約７３％、６５％、及び６７％の純度であ
ると言うことを示した。
【０１６３】実施例１２−抗細菌バイオアッセイ エルウィニアカロトボラカロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ
ｃａｒｏｔｏｖｏｒａｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）株ＳＲ３
１９（Ｅｃｃ ＳＲ３１９）をＬＢ寒天プレート上で画
線培養し、２８℃にて一夜成育させた。）２４時間後に
Ｅｃｃ ＳＲ３１９の白金サジ量を寒天プレートから取
り出して、滅菌したキャップ付き１０ｍｌの試験管中の
３ｍｌのルリア（Ｌｕｒｉａ）ブロス〔溶液１リットル
当たり、１０ｇのバクト−トリプトン（Ｂａｃｔｏ−ｔ
ｒｙｐｔｏｎ）、５ｇのバクト−酵母抽出物（Ｂａｃｔ
ｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）及び１０ｇの塩化ナ
トリウム；加圧滅菌〕に加えた。Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｍ
Ｒ６００ミクロプレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，アレキサンドリ
ア、ＶＡ）を用いて６３０ｎｍでの光学密度を記録する
前に、この培養液を一夜成育させた。一夜培養液の一部
分を、ルリアブロスで、６３０ｎｍで０．２の光学密度
を有する培養液を得られるように調節した。この培養液
の約２５０μｌを、滅菌したキャップ付き１０ｍｌの試
験管中の２２５０μｌのルリアブロスに加え、この希釈
された培養液を震盪インキュベーター中、２８℃にて３
時間成育させた。その新たに成育させた培養液の６３０
ｎｍでの光学密度を記録し、この半指数関数的（ｍｉｄ
−ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ）成長相の培養液の一部をル
リアブロスで１０００倍に希釈して、培養液１ｍｌ当た
り約１０５のコロニー形成単位の概略の濃度とした。こ
の希釈された培養液の約８５μｌを、各ＡＭＰＰＰを試
験するために、９６個の窪みのミクロタイタープレート
（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）の１２個の窪み
中に加えた（一回の実験において、各ＡＭＰＰＰのため
に１２個の窪みの１〜４の繰り返しセットを用意し
た）。各ＡＭＰＰＰの貯蔵溶液は、１ｍｇ／ｍｌの濃度
にて調製し、各ペプチド貯蔵溶液の０〜１５μｌをミク
ロタイタープレート中の一つの窪みに入れ、続いて、窪
みの全体積を１００μｌとするに十分な量の水を入れ
た。アッセイされたペプチドの典型的な体積は、０、
１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１５μ
ｌであり、それらは、０〜１５０μｇ／ｍｌの範囲の最
終ペプチド濃度に対応する。該ミクロタイタープレート
をパラフィルムでシールし、震盪プラットフォーム上、
２８℃で４４時間インキュベートした。各Ｅｃｃ ＳＲ
３１９培養くぼみ液の光学密度を、２０時間の時点で及
び４４時間の時点で記録した。次に、最小完全阻止濃度
（ｍｉｎｉｍｕｍ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｉｎｈｉｂｉｔ
ｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＭＣＩＣ）を、
各ＡＭＰＰＰについての種々のペプチド濃度の各繰り返
しセットについて測定した。それにより、ＭＣＩＣは、
細菌の成育が観察されない最低ペプチド濃度として定義
される。各ＡＭＰＰＰについての少なくとも３回の繰り
返し実験から２０時間の処理の後の算出された平均ＭＣ
ＩＣ値を、表１に列挙する。“Ｍｅｔ（Ｓ）（Ｏ）”及
び“Ｍｅｔ（Ｒ）（Ｏ）”は、メチオニンスルホキシド
残基の光学的対掌体を表す。
【０１６４】表１に列挙された殆どのＡＭＰＰＰ化合物
は、逆相ＨＰＬＣ精製の後に９５％よりも均質であった
ものの、ＡＭＰＰＰ＃５及び＃２３〜２８は、イオン交
換クロマトグラフィーによる部分的な精製及び塩交換の
後に僅か５０〜８８％の純度であった。
【０１６５】
【０１６６】 Ｎｏ．４、５、６、７、８、１２、１３、１４、１５及
び２２のような多くのＡＭＰＰＰは、１５０μｇＡＭＰ
ＰＰ／ｍｌより高い濃度においても、ＥｃｃＳＲ３１９
に対して不活性であった。
【０１６７】実施例１３−抗カビ（菌）バイオアッセイ カビは、適当な媒体（この場合においては、ポテトデキ
ストロース寒天プレート）上、数週間成育させた。その
終りに、収穫した胞子に対し、該プレートを、滅菌した
約５ｍｌの蒸留水で満たした。胞子の濃度は、血球計数
計を用いて測定し、胞子懸濁物は、それが必要となるま
で、滅菌した管中、４℃にて保管した。８２μｌのポテ
トデキストロースブロス基及び３μｌの胞子懸濁物（合
計で、１０５〜１０７個の胞子）を次に、各ＡＭＰＰＰ
を試験するために、９６個の窪みのミクロタイタープレ
ートの１２個の窪み中に加えた（一回の実験において、
各ＡＭＰＰＰのために１２個の窪みの１〜４の繰り返し
セットを用意した）。いくつかの例においては、特定の
ＡＭＰＰＰの有効性を目的胞子の数の関数として測定す
るために、一以上の胞子濃度を使用した。各ＡＭＰＰＰ
の貯蔵溶液は、１ｍｇ／ｍｌの濃度にて調製し、各ペプ
チド貯蔵溶液の０〜１５μｌをミクロタイタープレート
中の単一の窪みに入れ、続いて、窪み内の全体積を１０
０μｌとするに十分な量の水を入れた。アッセイされた
ペプチドの典型的な体積は、０、１、２、３、４、５、
６、７、８、９、１０及び１５μｌであり、それらは、
０〜１５０μｇ／ｍｌの範囲の最終ペプチド濃度に対応
する。該ミクロタイタープレートをパラフィルムでシー
ルし、室温で４８時間インキュベートした。カビの成長
は２４時間後及び４８時間後に、４倍及び／または１０
倍の対物レンズを用いて顕微鏡により観察した。胞子の
発芽の量及びカビの成長を、以下の＋及び−系を用いて
各観察時間における定量的な測定として記録した：
［−］は、発芽が生じなかったことを意味する、［＋］
は、ルーズな格子（ｌｏｏｓｅ ｌａｔｔｉｃｅ）の全
体的な外観を持つ菌糸体の成長の開始を意味し、［＋＋
＋］は、密な不透明な網状の全面的な外観を持つ密集し
た菌糸体の成長の開始を意味する。試験した各ＡＭＰＰ
ＰのＭＣＩＣ値を次に記録した。そこでは、ＭＣＩＣ値
は、胞子の発芽が生じない（−と評価される）ところの
最低ペプチド濃度として定義される。二または三種の植
物病原性カビ：アルテルナリアアルエルナタ（Ａｌｔｅ
ｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ）、Ｐ３フサリウム
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）及びトリコデルマリーセイ（Ｔｒ
ｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の夫々に対する各
ＡＭＰＰＰについての少なくとも３回の繰り返し実験か
ら２４時間の処理の後の算出された平均ＭＣＩＣ値を、
表２に列挙する。表２におけるＡＭＰＰＰのＮｏ．は、
表１において詳記されたのと同じである。
【０１６８】
【０１６９】
【０１７０】
【０１７１】テストされた三つの植物病原性カビ間で応
答に少し違いがある。しかし一般に、テストされたＡＭ
ＰＰＰの殆んど総ては、９〜１５０μｇ ＡＭＰＰＰ／
ｍｌ範囲内でのある処理投与量において、テストされた
総てのカビ類に対して活性があった。カビ菌に対して活
性なＡＭＰＰＰの例外は、Ｐ３フサリウム（Ｆｕｓａｒ
ｉｕｍ）及びトリコデルマリーセイ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒ
ｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の両者についてのＡＭＰＰＰ４お
よびＰ３フサリウムについてのＡＭＰＰＰであった。Ａ
ＭＰＰＰ化合物の多くは、細菌Ｅｃｃ ＳＲ３１９に対
するとほぼ同様に植物病原性カビに対して活性であり
（たとえばＡＭＰＰＰ１、１６、１８、１９及び２
１）、一方、あるＡＭＰＰＰ化合物は、細菌Ｅｃｃ Ｓ
Ｒ３１９に対するより以上に植物病原性カビに対しては
るかに有効であった。後者のカテゴリーは、ＡＭＰＰＰ
２、６〜９、１２〜１５、１７及び２２を含み、しかし
これらに限定されない。実験で少しのバラつきがあり、
これは生物学的テスト物質における違いに帰されうるこ
とに留意されたい。
【０１７２】本発明に従うＡＭＰＰＰのほとんどは、植
物病原性カビ、細菌又は両者に対して活性である。いく
つかのＡＭＰＰＰ、たとえばＡＭＰＰＰ１１、１８及び
１９は、Ｅｃｃ ＳＲ３１９に対して天然のマガイニン
２よりも活性であった。他は、僅かにのみ低活性であっ
た（ＡＭＰＰＰ２１）。これら同じ化合物は、有意な抗
カビ活性を犠牲にしなかった。驚ろくべきことに、他の
ＡＭＰＰＰ、たとえばＡＭＰＰＰ１２〜１５、１７及び
２０は、植物病原性細菌に対する活性の劇的損失を示し
たが、植物病原性カビに対して実質的活性を維持した。
これら化合物は、その生物学的特異性が土壌又は環境中
のある有用な細菌に対する脅威なしにカビに対する保護
を可能にするので、植物病原体から植物を保護する上で
極めて重要である。
【０１７３】実施例１４ 蛋白質加水分解に対する耐性
の測定 細胞外プロテアーゼに対するマガイニンペプチドの感受
性を測定するため、及びこれらプロテアーゼによる処理
の部位を決定するため、メイズ、タバコ及びポテトの葉
から細胞外液を得て、これらをマガイニン類似物の安定
性テストに用いるように系を設計した。細胞外液（ＥＣ
Ｆ）は、タバコの葉からの葉脈内片を脱イオン水ですす
いだ後に切ることによって、Ｚ・Ｋｌｅｍｅｎｔ（前
出）に従って得た。切片を真空デシケーター内で水に浸
し、５〜１０分間真空をかけた。真空をゆっくり解除
し、葉をなすりつけて（ｂｌｏｔｔａｄ）乾燥し、４〜
５片を丸め、回転バケット遠心分離ローター内に合うよ
うに切断された５０ｍｌ使いすてシリンジ筒内に置い
た。シリンジ筒を、５０ｍｌスクリューキャップ円錐状
遠心分離管に入れ、回転バケットローター内で５００×
ｇで３０分間違心分離した。液体を回収し、微小遠心分
離機で１０分間遠心分離した。上澄液を−８０℃で貯蔵
し、後の実験に用いた。
【０１７４】細胞外植物プロテアーゼに対するマガイニ
ン類似体の安定性をテストするために、マガイニンペプ
チド類似体（１ｍｇ／ｍｌ）の２０μｇを５０ｍｌ Ｔ
ｒｉｓ、ｐＨ７．４中の０、２．５、５、１０％細胞外
液と共にインキュベートした。３７℃で１時間のインキ
ュベーション後に、ＴＦＡを１％最終体積まで加えるこ
とによってプロテアーゼを失活させた。ヒューレットー
パッカードＨＰ１０９０高圧液体クロマトクラブ（ヒュ
ーレットーパッカード、Ａｖｏｎｄａｌｅ，ＰＡ）で
０．１％ＴＦＡ中の０〜６０％アセトニトリル勾配を用
いて４．６ｍｍ×２５０ｍｍＶｙｄａｃ Ｃ−４プロテ
インカラム（Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒ
ｏ，ＭＡ）上で逆相クロマトグラフィにより、ペプチド
を分析した。ＥＣＦの量を増した時、二つの早期溶出ピ
ークが親ピークから発生されたことが観察された。これ
らペプチドを精製し、ＦＡＢ−ＭＳ及びアミノ酸分析に
より分析した ことを示した。表ＩＩＩ中の数値は、親ピーク内の面積
ピーセント、およびＥＣＦ添加なしのＡＭＰＰＰ親ピー
クの面積に対する、２．５％ＥＣＦの表示したＡＭＰ ることを示す。
【０１７５】
【０１７６】実施例１５ ＡＭＰＰＰの抗カビ活性に対
するＥＣＦの効果 作物植物に施与される任意のＡＭＰＰＰは植物組織及び
有りうる関連植物プロテアーゼと接触するであろう故
に、ＡＭＰＰＰ活性への植物蛋白質酵素の作用を理解す
ることが重要である。一以上の植物プロテアーゼにより
切られうるＡＭＰＰＰの生物学的活性を評価すること、
ならびにそのような事象が起ったことを認識することが
重要である。実施例１４で述べたような細胞外液（ＥＣ
Ｆ）の抽出物は、植物組織の細胞外小室中の植物プロテ
アーゼ中に曝露されることによるＡＭＰＰＰの抗微生物
活性のそのような損失を測定するにおいて有用な試薬で
ある。バイオアッセイ実験は、いくつかの作物種からの
ＥＣＦに曝露された、又はポテトデキストロースブロス
（ＰＤＢ）、コーン茎培地（ＣＳＭ）、又は水中で後述
のように生育された遠心分離した三日齢Ｐ３フサリウム
培養物からの上澄液として集められた使用済培地に曝露
された種々のＡＭＰＰＰについて、実施例１３で実質的
に述べたように３００〜１０００個の予め発芽したＰ３
フサリウム胞子を用いて行った。実施例１３で述べた方
法と、ここで用いた方法の僅かの主な違いは、バイオア
ッセイが、１００μｌでなくで１０μｌの合計培養体積
で行われたことである。ＥＣＦは、これらバイオアッセ
イにおいて１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度で存在し、種々
のＡＭＰＰＰ濃度でフサリウム胞子にＡＭＰＰＰと同時
に加えられた。これらテストからのバイオアッセイ結果
は、実施例１３記載のように解釈され、任意のＡＭＰＰ
Ｐについての抗カビ活性の概算の減少パーセントが、Ｅ
ＣＦ添加のあり及びなしでの最小完全阻止濃度（ＭＣＩ
Ｃ）の比較から得られた。減少パーセントは、（ＭＣＩ
Ｃ＋−ＭＣＩＣ）／ＭＣＩＣ＋として計算される。表Ｉ
Ｖは、種々のＡＭＰＰＰ化合物でのこれらテストの結果
をまとめて示す。一般に、総てのＡＭＰＰＰの活性は、
ＥＣＦ存在によって阻止された。阻止がＥＣＦサンプル
中に存在する蛋白質加水分解活性に依る可能性は、２％
フェニルメチルスルホニルフルオライド（公知の蛋白質
減成剤）でのＥＣＦの処理、又は沸騰水浴中で１０分間
のＥＣＦの加熱がＡＭＰＰＰ抗カビ活性を阻止するＥＣ
Ｆの能力を除去した観察により支持された。
【０１７７】
【０１７８】
【０１７９】実施例１６ 植物及びカビ細胞から分泌さ
れたプロテアーゼの分析 細胞外プロテアーゼ試薬溶液はまた、組織培養培地及び
カビ培養培地から作ることができ、蛋白質加水分解に対
する耐性の決定について実施例１４で記載したように用
いられる。組織培養培地から集めたプロテアーゼを用い
ることに、いくつかの利点がある。詳しく云うと、引き
続くバッチの濃度及び内容がより一定である傾向があ
り、本発明に従う方法がより多種類の植物及び植物病原
体からプロテアーゼを集めることを可能にする。従っ
て、ホスト有機体プロテアーゼ及び植物病原体プロテア
ーゼの両者に対するＡＭＰＰＰの蛋白質加水分解耐姓を
考慮することが可能である。これらプロテアーゼ含有試
薬は、遠心分離により培地から細胞を除去し、１ＭＴｒ
ｉｓ ｐＨ７．４貯蔵溶液の２０倍希釈により５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４へと上澄液を調節することによ
り得られる。
【０１８０】実施例１７ 植物害性についての酸素発生
バイオアッセイ 酵素電極で用いる葉緑体の調製のための下記手順は、Ｇ
ｕｐｔａらのＰｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．，８９巻（１９８
９）７５３−７６１のそれと類似である。ホウレン草
（Ｓｐｉｎａｄａｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．ｖａｒ．“Ｍ
ｅｌｏｄｙ”）を、成育室内で１０時間光期間でもっ
て、１：１ピート／ひる石の鉢植混合物中で成育させ
た。室温は、成育期間の間、２１℃（昼）及び１６℃
（液）に維持された。全ての植物を、６〜８週間生育の
後に葉緑体分離のために用いた。
【０１８１】葉緑体に富む画分を得るために、葉脈を取
ったホウレン草葉の約１２ｇを良く洗い、乾燥した。次
に葉を、小片（各約１／２インチ角）に切り、５０ｍｌ
の冷却したホモゲナイズ媒体（０．３３Ｍソルビトー
ル、５０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、ｐＨ６．８、
２ｍＭ Ｎａ２ ＥＰＴＡ、１ ｍＭ ＭｎＣｌ２、１
ｍＭ ＭｇＣｌ２）を含む小さなブレンダージャーに入
れた。この組織をブレンダー中で高速で３秒間隔で２度
ブレンドした。得た均質物をチーズクロスの四層及びミ
ラクロス（ｍｉｒａｃｌｏｔｈ，Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｄｉ
ａｇｏｎｏｓｔｉｃｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の二
層で、二つの冷却した３０ｍｌガラス遠心分離管中に濾
過した。濾過した溶液を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１
Ｍ遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ社、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＮＪ）でＪＳ１３．１回転バ
ケットローター中で７５０ｇ（２，２００ｒｐｍ）で
１．０分間遠心分離した。次に上澄液をデカントし、ペ
レットを０℃で振ることにより緩やかに再懸濁した。約
１５ｍｌのホモゲナイズ媒体を葉緑体の各管に加えた
後、葉緑体を３０ｍｌガラス遠心分離管中で４０％Ｐｅ
ｒｃｏｌｌ勾配（６ｍｌＰｅｒｃｏｌｌ，９ｍｌホモゲ
ナイズ媒体及び０．０３ｇウシ血清アルブミン）で層化
した。これら管を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１Ｍ遠心
分離機でＪＳ１３．１回転バケントローター中で２５０
０ｇ（４，０００ｒｐｍ）で４．０分間遠心分離した。
得たペレットを少量のホモゲナイズ媒体（約５００μ
ｌ）中に再懸濁した。
【０１８２】色素体濃度は一般に、葉緑素に基づいて表
現された。葉緑素は、Ａｒｎｏｎ（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙ
ｓ．，２４巻（１９４９）１−１４）の方法により測定
される。葉緑体貯蔵懸濁液の約５０μｌを８０％アセト
ンの１０ｍｌに加え、この溶液を暗所で５．０分間イン
キュベートし、次にＢｅｃｋｍａｎ ＧＰ遠心分離機で
５００ｇ（１，６３８ｒｐｍ）にて５．０分間遠心分離
した。アセトン−葉緑体溶液の吸光度を６４５ｎｍ、６
６３ｎｍ及び７３０ｎｍでモニターした。次に葉緑素濃
度を、１０×〔（６４５ｎｍでの吸光度×２０．２）＋
（６６３ｎｍでの吸光度×８．０２）−７３０ｎｍでの
バックグラウンド〕として計算した。これは、葉緑体の
元の５０μｌ当りの葉緑素の量（μｇ）を与えた。次に
葉緑体の濃度をホモゲナイズ媒体で調節して、５０μｌ
の懸濁液が２６μｇの葉緑素を含むようにした。これら
葉緑体は１．５〜２時間のみ活性であり、従って直ちに
用いた。
【０１８３】分離した葉緑体からの酸素発生を測定する
ために、酸素電極（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，Ｋｉｎｇｓ Ｌｙｎｎ，Ｎｏｒ
ｆｏｌｋ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いた。この方法の詳細
な検討は、Ｄ．Ｗａｌｋｅｒ（前出）を見よ。飽和ＫＣ
ｌ溶液を電極井に入れ、１インチ角のローリングペーパ
ー又はレンズペーパーを電極井中に置いて、それがＫＣ
ｌを吸ってイオン橋を形成するようにした。次に、１イ
ンチ角のテフロン膜を用意し（その表面に触れないよう
に注意しながら）、ぬれた紙の上に置いた。膜アプリケ
ーターを用いてＯリングを電極の頭に置き、それによっ
て電極間に紙及び膜を固定した。ＣＢ−１Ｄコントロー
ルボックスをオンにし、系を較正の前に約１時間ウォー
ムアップした。次に、空気飽和水（脱イオン水の洗浄ボ
トルを激しく振った）を用いて、系を較正した。次に、
チャートレコーダー上のペンが最大チャート高さになる
ように、ゲインスイッチを用いて出力をセットした。井
中の水から総ての空気を除去し、かつチャートレコーダ
ーをゼロにするために、約２〜３ｍｇの亜二チオン酸ナ
トリウムを加え、プロッターペンがグラフの底に動くの
を観察した。もし線のスロープが不安定なら、膜及び紙
を取除き、酸素電極のセットアップを初めから行う。
【０１８４】酸素電極での植物毒性バイオアッセイを行
うために、下記成分を酸素電極井に加えた：８５５μｌ
のアッセイ媒体（ｐＨ７．６に調節されたホモゲナイズ
媒体＋２５ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４）、５０μｌの０．
１Ｍ新鮮なＮａＨＣＯ３、２０μｌのカタラーゼ（合計
４９．６単位／μｌ）、及び５０μｌの葉緑体懸濁物
（最後に加えた）。次に、電極への光源をオンにした。
当初の遅行段階は、葉緑体系が平衡化されていると見え
る。もし、当初遅行段階が１分間より長いなら、葉緑体
分離に用いた植物が不十分であったと判断された。本実
験において、酸素発生の安定な速度が２〜３分間確立さ
れ、次にペプチド含有溶液２５μｌをハミルトン注射器
を用いて加えた。ペプチド添加の後、４分間酸素発生速
度をモニターした。ペプチド添加後のこれら実験におけ
る酸素発生速度の減少は、ペプチド添加前のチャートレ
コーダー出力線の勾配をペプチド添加後の設定時点での
線の勾配と比べることにより測定された。結果は、葉緑
素含量に対して標準化された。なぜなら、照射した反応
室中で葉緑体濃度が実験間で少しバラついたからであ
る。標準化は、勾配を葉緑素濃度（ｍｇ単位）で割るこ
とにより行われた。最終結果は、ペプチド添加後の酸素
発生速度を当初の対照の酸素発生速度で割り、１００を
掛けることによって導かれた酸素発生阻止パーセントと
して表わされた。
【０１８５】表Ｖは、１６μＭの最終濃度でペプチドに
曝露された葉緑体に関して、いくつかのＡＭＰＰＰにつ
いての観察をまとめて示す。平均値及び標準偏差は、各
ＡＭＰＰＰでの４〜１５回の繰返しのアッセイから計算
された。対照の酸素発生速度は、７２〜２８３マイクロ
モルＯ２／時／葉緑素ｍｇの範囲であった。結果におけ
る日毎のバラつきを最小にするために、各実験において
複数のペプチドを調べた。表示した個々のＡＭＰＰＰの
番号は、実施例４の表ＩＩに示したペプチドに対応す
る。
【０１８６】
【０１８７】実施例１８−合成［（ｆ）Ｍｅｔ］−Ｍａ
ｇａｉｎｉｎ ２遺伝子の組み立て及び該合成遺伝子の
エシェリヒアコリ中での固定 普遍的な遺伝子コード及び細菌のコドン使用表〔Ｍａｘ
ｉｍｉｚｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｅｓｓｉｏｎ
（Ｗ．Ｓ．Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ及びＬ．Ｇｏｌｄ編；Ｂ
ｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９８６年）の
２２５〜２８５頁中の、Ｈ．Ａ．ＤｅＢｏｅｒ及びＲ．
Ａ．Ｋａｓｔｅｌｅｉｎの“Ｂｉａｓｅｄｃｏｄｏｎ
Ｕｓａｇｅ：ａｎ ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉ
ｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”、及びＶｅｃｔｏｒｓ：
ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓ
ｅｓ”（Ｒ．Ｌ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ及びＤ．Ｔ．Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ編；Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏ
ｎ，１９８８年）の２０５〜２２５頁中のＪ．Ｂｒｏｓ
ｉｕｓの“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｅ
ｍｐｌｏｙｉｎｇ ｌａｍｂｄａ−，ｌａｃ−ａｎｄ
ｌｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｍｏｔｅｒｓ”を見よ〕
を基に、かつ規制された表現が可能な市販の細菌プラス
ミドｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎ
ｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のポリリンカー領
域への簡便な直接挿入のために等しくないＥｃｏＲＩ及
びＨｉｎｄ ＩＩＩ制限エソドヌクレアーゼ認識配列を
フランキングして、合成［（ｆ）Ｍｅｔ］−Ｍａｇａｉ
ｎｉｎ ２遺伝子を設計した。（ｆ）Ｍｅｔ−Ｍａｇａ
ｉｎｉｎ ２の毒性活性によるホスト細胞の成長に対す
る有毒な作用を避けるために、合成遺伝子の規制された
表現が望ましい。遺伝子的に良く定義された細菌エシェ
リヒアコリにおいてこのペプチドを表現させるために、
マガイニン２をエンコードするＤＮＡ配列に付加された
第一コドンとしてＡＴＧを合成遺伝子は組み入れる。該
合成遺伝子は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｍｏｄｅｌ ３９１ＰＣＲ−Ｍｅｔｅオリゴヌクレオ
チド合成機にて調製された二つのオリゴヌクレオチドか
ら、β−シアノエチルホスホルアミダイト化学を用いて
組立てられる。合成遺伝子を調製するために組立てられ
たその二つの合成オリゴヌクレオチドの配列は次の通り
である。
【０１８８】
【０１８９】上記オリゴヌクレオチドの各１〜３μｇを
１５μｌの滅菌した蒸留水と合わせ、それに２μｌの１
０Ｘリンカーキナーゼバッファー（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１２５
頁；Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，
ＮＹ，１９８２年を見よ）及び２μｌの４ｍＭのＡＴＰ
を加えた。該溶液を６５〜７０℃に２〜３分間加熱し、
少なくとも４５分間かけて室温へとゆっくりと冷却し
て、オリゴヌクレオチドを互いにアニールさせた。該冷
却した混合物に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ；少なくと
も１０単位／μｌ）の１μｌを加え、該溶液を３７℃で
６０分間インキュベートした。該反応混合物を次に６５
℃に５分間加熱してキナーゼ酵素を不活性にした。
【０１９０】５μｇのプラスミドｐＫＫ２２３−３を、
製造者の仕様書または公知の方法に従い、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）により、全体積１５μｌにおいて、
完全に消化させた。Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ他“Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”前出、９８〜１０６頁。
続いて、２９μｌの水、５μｌの１９ＸＴ４ ＤＮＡリ
ガーセバッファー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｈａ
ｖｅｎ，ＣＴ）及び子牛の腸のアルカリホスファターゼ
（ｃａｒｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ
ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ；
１単位／μｌ）を次に、制限消化混合物に加えた。この
ホスファターゼ反応混合物を３７℃で３０分間、次に６
５℃で１５分間インキュベートし、次にホスファゼート
反応混合物を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭの
Ｎａ２ＥＤＴＡに対して平衡された５０μｌのフェノー
ル：クロロホルム（１：１）で２回抽出した。８μｌの
５Ｍ酢酸アソモニウム及び１５０μｌの−２０℃の１０
０％エタノールを次に該水注反応混合物に加え、該サン
プルを−２０℃で１０分間貯蔵し、次にＥｐｐｅｎｄｏ
ｒｆ ｍｉｃｒｏｆｕｇｅで、４℃にて３０分間遠心分
離した。その上澄液を捨て、ペレットを真空下で３〜５
分間乾燥した。該乾燥ペレットを次に、１０μｌの滅菌
した蒸留水に再懸濁させ、そのサンプル全体を、１Ｘ
ＴＢＥバッファー（８９ｍＭのＴｒｉｓ−ＯＨ、８９ｍ
Ｍのホウ酸、ｐＨ８．３、２．５ｍＭのＮａ２ＥＤＴ
Ａ）中の０．８％アグロース／１μｇ／ｍｌエチジウム
ブロマイドゲル中で電気泳動させた。全長の線形ｐＫＫ
２２３−３プラスミドＤＮＡを、長波長紫外光の下で可
視化し、該線形ＤＮＡバンドを、剃刀刃を用いてゲルか
ら切り取った。精製された線形プラスミドＤＮＡは、Ｇ
ｅｎｅ−Ｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ１０１、Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ，ＣＡ）を用い、製造者の仕様書またはサイズ排除ク
ロマトグラフィーのような類似の方法に従って、このサ
ンプルから得ることができる。Ｍａｎｉａｔｉｓ他の前
出書４６４〜４６７頁を見よ。
【０１９１】線状の、ホスファターゼ化されたｐＫＫ２
２３−３ＤＮＡ及びアニールされたオリゴヌクレオチド
を、水中に１６μｌのＤＮＡを含有する溶液中のｐＫＫ
２２３−３−ＤＮＡの少くとも０．５μｇを用い、モル
比１：１０にて混合した。次に、２μｌの１０Ｘリガー
ゼバッファー（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｌｎｃ．）及び２μｌのＴ４
ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ；４００，０００単位／μｌ）を加えた。該リゲー
ション反応混合物を１４〜１５℃にて一夜インキュベー
トした。
【０１９２】反応能シェリヒアコリ株ＩＧ１０９細胞
（Ｉ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ他、“Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ｅｘｐｌｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｌｌａｇｅｎ
−ａｎａｌｏｇ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉ
ｃ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉ，Ｇｅｎｅ８０、１９８９年、３０５〜３１４頁）
を、慣用の手段（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ他、前掲書中、
２５０頁）によって調製した。２μｌのリゲーション反
応混合物を氷上、１００μｌの反応能細胞と混合し、該
混合物を氷上で３０〜６０分間放置した。該形質転換混
合物を次に４２℃に６０秒間加熱し、氷上で２分間冷却
し、次に、５００μｌのＬＢブロス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ他、前掲書中、４４０頁）を加えた。この細胞混合
物を３７℃で４５分間インキュベートし、該細胞を軽く
遠心分離し、上澄液を２００μｌの新鮮なＬＢブロスに
置き換えた。再懸濁された細胞のペレットの一部をＬＢ
／アンピシリン寒天点選択プレート（ｓｅｌｅｃｔｉｃ
ｅ ｐｌａｔｅ）上に置き、該プレートを３７℃で一夜
インキュベートした。選択プレート上に見出される細菌
のコロニーを翌日、プラズミドミニブレップ（ｍｉｎｉ
−ｐｒｅｐｓ）を調製し、各プラズミドミニプレップの
一部をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素で消化
し、そして該消化生成物を１Ｘ ＴＢＥバッファー中の
０．８％分析アガロースゲル上で分析することによっ
て、組換えプラスミドの存在を確認するためにスクリー
ンされる。
【０１９３】合成［（ｆ）Ｍｅｔ］−Ｍｇａｉｎｉｎ２
遺伝子の規制された表現は、組換え細菌クローンを３７
℃で発育させ、培養物温度を４２℃に２〜６０分間高め
ることによって行った。培養液の温度を次に３７℃に３
０分〜９０分間減じ、そして該細胞を収穫した。該細菌
細胞のペーストを次にフレンチプレスに通し、［（ｆ）
Ｍｅｔ］−Ｍｇａｉｎｉｎ２を慣用の手段により精製し
た。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他編；Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅ
ｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８年）中のＣｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓの１６章を見よ。
【０１９４】実施例１９−比較のためのＡＭＰＰＰの調
製 本発明に記載されたＡＭＰＰＰ化合物に関連する数多く
のペプチドが比較のために求められた。マガイニン２−
ＯＨ（ＡＭＰＰＰ＃１）及びマガイニン１−ＯＨ（ＡＭ
ＰＰＰ＃２）を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から入
手するかまたは実施例１及び３記載の方法を用いて作る
ことができた。［Ｐｒｏ１０］Ｍａｇ２−ＯＨ（ＡＭＰ
ＰＰ＃４）は、実施例４記載の方法により合成された
が、実施例３で与えられたのと類似の条件を用いて予備
的なＨＰＬＣにより精製された。ジアステレオマーのス
ルホキシド、［Ｍｅｔ２１（Ｓ）（Ｏ）］Ｍａｇ２−Ｏ
Ｈ及び［Ｍｅｔ２１（Ｒ）（Ｏ）］Ｍａｇ２−ＯＨ（Ａ
ＭＰＰＰ＃６及び＃７、立体化学は任意的に指定した）
は、予備的なＨＰＬＣによりマガイニン２合成の副生成
物として単離された。［Ｄｅｓ Ｍｅｔ２１］Ｍａｇ１
−ＯＨ（ＡＭＰＰＰ＃８）はＡＭＰＰＰ＃４と同じ方法
で調製された。［Ａｌａ１３，Ａｌａ１８］Ｍａｇ２−
ＯＨ（ＡＭＰＰＰ＃１０）は、実施例５の方法により調
製された。［Ｄｅｓ Ｓｅｒ２３］Ｍａｇ２−ＯＨ（Ａ
ＭＰＰＰ＃２１）は、実施例９の方法で調製された。
［ＤｅｓＧｌｙ１］Ｍａｇ １−ＯＨ（ＡＭＰＰＰ＃２
４）は、実施例１０の方法で調製された。Ｍａｇ２−Ｎ
Ｈ２（ＡＭＰＰＰ＃２９）は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，
ＣＡ）から入手した。これら総てのペプチドは、０．１
％のＴＦＡを含有する水／アセトニトリルを用いてＨＰ
ＬＣにより精製されたので、それらは総てそのトリフル
オロ酢酸塩として存在すると想定される。総てのペプチ
ドはＨＰＬＣにより分析され、少なくとも９４％の純度
であることが見出された。
【０１９５】本発明の原理、好ましい実施態様及び操作
のやり方を、上記で述べた。しかし、ここで保護される
べき発明は、開示した特定の態様に限定されると解釈さ
れるべきではない。なぜなら、それらは、限定ではなく
て例示と認識されるべきであるからである。本発明の精
神及び範囲をはずれることなく、変形及び変更を行うこ
とができる。たとえば、構成及び／又は機能において均
等である、本発明に従うＡＭＰＰＰの誘導体は、本発明
の開示の範囲内に取り囲まれるものとする等である、本
発明に従うＡＭＰＰＰの誘導体は、本発明の開示の範囲
内に取り囲まれるものとする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 7055−2Ｊ // Ａ０１Ｎ 63/00 Ｚ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 クローディオ マペリー アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08540プリンストン デルメア ドライヴ 107 (72)発明者 マイケル デニス スウェアドロフ アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08540プリンストン オールドゲート コ ート 14 (72)発明者 ジョン アイラ ウィリアムズ アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08691ロビンスヴィル ダーヴェル ドラ イヴ 11 (72)発明者 ニコラス ポール エヴァレット アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08534ペニングトン シティー バード ロード 292ジェイ

Claims (144)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ
    −Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−
    Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐ
    ｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｌｙ
    ｓ−Ｘａａ または異っており、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｏｒｎ，Ａｓｎ，
    Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌ
    ｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４
    Ｈｙｐ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジ
    ヒドロキシ Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉ
    ｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈ
    ｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロキシフェニルア
    ラニンおよびＶａｌからなる群から選ばれる）を有する
    ペプチド（但し、該ペプチドはマガイニン１ではない）
    を含む組成物。
  2. 【請求項２】 アミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ，Ｇｌｙ
    −Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−
    Ｘａａ ａ，Ａｒｇ，Ｏｒｎ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌ
    ｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅ
    ｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４Ｈｙｐ，Ｓｅｒ，Ｔ
    ｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロキシフェニル
    アラニンおよ Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐ
    ｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒ
    ドロキシフェニルアラニンおよびｖａｌからなる群から
    選ばれる）をもつペプチド（た マガイニン２ではなく、更に該ペプチドは単一のＡｌａ
    のみで置換されたマガイニン２ではない）を含む組成
    物。
  3. 【請求項３】 −ジヒドロキシフェニルアラニン、Ｇｌｎ，Ｐｒｏ，３
    Ｈｙｐ，４Ｈｙｐ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４Ｈｙｐ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｒ
    ｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、
    Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，Ｏ
    ｒｎおよびＡｒｇからなる群から選ばれるア Ｐｈｅ，Ｖａｌ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐお
    よび４Ｈｙｐからなる群から選ばれるアミノ酸で ｒ，３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、Ｔｒｐ，
    Ｈｅｔ，Ａｓｎ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｐｈｅ，Ｖａｌ，Ｉ
    ｌｅ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐおよび４Ｈｙｐからな
    る群から選ばれるアミノ酸を表す請求項１または２記載
    の組成物。
  4. 【請求項４】 ｒ，Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ
    およびＡｒｇからなる群から選ばれるアミノ酸 ｕ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｇｌｎ，ＨｉｓおよびＭｅｔから
    なる群から選ばれるアミノ酸を表し、Ｘ Ｔｒｐ，Ｐｈｅ，Ｈｉｓ，Ｇｌｎ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，
    ４ＨｙｒおよびＴｙｒからなる群から選ばれる請求項３
    記載の組成物。
  5. 【請求項５】 該ペプチドが、少なくとも１種の植物プ
    ロテアーゼによる分解に対して耐性である請求項３記載
    の組成物。
  6. 【請求項６】
  7. 【請求項７】 ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｔｈｒ，Ａｌａ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，
    Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４ＨｙｐおよびＭｅｔからなる群か
    ら選ばれるアミノ酸である請求項６記載の組成物。
  8. 【請求項８】
  9. 【請求項９】
  10. 【請求項１０】
  11. 【請求項１１】
  12. 【請求項１２】
  13. 【請求項１３】
  14. 【請求項１４】
  15. 【請求項１５】
  16. 【請求項１６】
  17. 【請求項１７】
  18. 【請求項１８】 物。
  19. 【請求項１９】
  20. 【請求項２０】
  21. 【請求項２１】
  22. 【請求項２２】
  23. 【請求項２３】
  24. 【請求項２４】
  25. 【請求項２５】
  26. 【請求項２６】
  27. 【請求項２７】
  28. 【請求項２８】
  29. 【請求項２９】
  30. 【請求項３０】
  31. 【請求項３１】
  32. 【請求項３２】
  33. 【請求項３３】
  34. 【請求項３４】
  35. 【請求項３５】
  36. 【請求項３６】
  37. 【請求項３７】
  38. 【請求項３８】
  39. 【請求項３９】
  40. 【請求項４０】
  41. 【請求項４１】
  42. 【請求項４２】
  43. 【請求項４３】
  44. 【請求項４４】
  45. 【請求項４５】
  46. 【請求項４６】
  47. 【請求項４７】
  48. 【請求項４８】
  49. 【請求項４９】
  50. 【請求項５０】
  51. 【請求項５１】
  52. 【請求項５２】
  53. 【請求項５３】
  54. 【請求項５４】
  55. 【請求項５５】
  56. 【請求項５６】
  57. 【請求項５７】
  58. 【請求項５８】
  59. 【請求項５９】
  60. 【請求項６０】
  61. 【請求項６１】
  62. 【請求項６２】
  63. 【請求項６３】
  64. 【請求項６４】
  65. 【請求項６５】
  66. 【請求項６６】
  67. 【請求項６７】
  68. 【請求項６８】
  69. 【請求項６９】
  70. 【請求項７０】
  71. 【請求項７１】 該ペプチドが実質的に純粋である請求
    項３記載の組成物。
  72. 【請求項７２】 更に、該ペプチドのＣ−末端に結合し
    た−ＮＨｚ基を含む請求項３記載の組成物。
  73. 【請求項７３】 該ペプチドが遊離酸の塩の形状にある
    請求項３記載の組成物。
  74. 【請求項７４】 該ペプチドが実質的に純粋である請求
    項５記載の組成物。
  75. 【請求項７５】 更に、該ペプチドのＣ−末端に結合し
    た−ＮＨｚ基を含む請求項５記載の組成物。
  76. 【請求項７６】 該ペプチドが遊離酸の塩の形状にある
    請求項５記載の組成物。
  77. 【請求項７７】 アミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌ
    ｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ
    −Ｘａ っており、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｏｒｎ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，
    Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌ
    ｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４Ｈｙｐ，
    Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロキ
    シフェニル ｓではない）を有するペプチドを含有する組成物。
  78. 【請求項７８】 ＡＭＰＰＰのＮ−末端にペプチド結合
    を介して結合したＭｅｔおよび（ｆ）Ｍｅｔからなる群
    から選ばれるアミノ酸を含む組成物であって、該ＡＭＰ
    ＰＰの１種以上のアミノ酸がＡｌａ，Ａｒｇ，Ｏｒｎ，
    Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉ
    ｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈ
    ｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロキシフェニルア
    ラニンおよびＶａｌからなる群から選ばれるアミノ酸で
    置換されており、かつ該ＡＭＰＰＰの１０−位のアミノ
    酸以外の任意のアミノ酸が付随的にＰｒｏ，３Ｈｙｐお
    よび４Ｈｙｐからなる群から選ばれるアミノ酸で置換さ
    れていてもよいことを特徴とする上記の組成物。
  79. 【請求項７９】 該ＡＭＰＰＰがアミノ酸配列：Ｇｌｙ
    −Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−
    Ｘａａ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌ
    ｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌ
    ｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（こ 々同一または異っており、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｏｒｎ，Ａ
    ｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌ
    ｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，３Ｈｙ
    ｐ，４Ｈｙｐ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，
    ４−ジヒドロキシフェニルアラニンおよびＶａｌからな
    る群から選ばれるものであり、かつＸ ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロ
    キシフェニルアラニンおよびＶａｌからなる群から選ば
    れる）を有する請求項７８記載の組成物。
  80. 【請求項８０】 アミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌ
    ｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌｅ
    −Ｘａ っており、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｏｒｎ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，
    Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌ
    ｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４Ｈｙｐ，
    Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロキ
    シフェニル はない）を有するペプチドの単一の残基のみが欠落した
    誘導体を含む組成物。
  81. 【請求項８１】 更に該ペプチドの単一残基欠落誘導体
    のＮ−末端に、ペプチド結合を介して結合したＭｅｔお
    よび（ｆ）Ｍｅｔからなる群から選ばれるアミノ酸をも
    含む請求項８０記載の組成物。
  82. 【請求項８２】 アミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌ
    ｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ
    −Ｘａ っており、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｏｒｎ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，
    Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌ
    ｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４Ｈｙｐ，
    Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロキ
    シフェニル 欠落した誘導体を含む組成物。
  83. 【請求項８３】 更に、該ペプチドの２残基欠落誘導体
    のＮ−末端にペプチド結合を介して結合したＭｅｔおよ
    び（ｆ）Ｍｅｔからなる群から選ばれるアミノ酸をも含
    む請求項８２記載の組成物。
  84. 【請求項８４】 アミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌ
    ｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ
    −Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−
    Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｌ
    ｙｓ−Ｘａａを有するペプチドの単一残基欠落誘導体、
    アミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈ
    ｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ
    −Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−
    Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｘａａを有
    するペプチドの２残基欠落誘導体、配列：Ｇｌｙ−Ｉｌ
    ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ
    −Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−
    Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｘ
    ａａ−Ａｓｎ−Ｘａａを有するペプチドの単一残基欠落
    誘導体および配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
    Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｘ
    ａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａ
    ｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｘａａ
    を有するペプチドの２残基欠落誘導体からなる群から選
    ばれるペプチドのＮ−末端にペプチド結合を介して結合
    したＭｅｔおよび（ｆ）Ｍｅｔからなる群から選ばれる
    アミノ酸を含む組成物（該配列におい 異っており、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｏｒｎ，Ａｓｎ，Ａｓ
    ｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅ
    ｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４Ｈ
    ｙｐ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒ
    ドロキシフェニルアラニンおよびＶａｌからなる群から
    選ぶことができる）。
  85. 【請求項８５】 配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙ
    ｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
    −Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−
    Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｘ
    ａａを有するペプチドの単一残基欠落誘導体、配列：Ｇ
    ｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａ
    ａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ
    −Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−
    Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｘａａをもつペプチドの２残
    基欠落誘導体、配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
    −Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
    Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖ
    ａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｘａ
    ａをもつペプチドの単一残基欠落誘導体、および配列：
    Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘ
    ａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｘａ
    ａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａ ｒｇ，Ｏｒｎ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌ
    ｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈ
    ｅ，Ｐｒｏ，３Ｈｙ，４Ｈｙｐ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒ
    ｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンお
    よびＶａｌからなる群から選ばれるが、該ペプチドの非
    欠落位置の少なくとも一箇所は置換されている）からな
    る群から選ばれるペプチドを含む組成物。
  86. 【請求項８６】 Ｍｅｔ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジ
    ヒドロキシフェニルアラニン、Ｇｌｕ，Ｐｒｏ，３Ｈｙ
    ｐ，４Ｈｙｐ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ａｓ
    ｐ，ＯｒｎおよびＡｒｇからなる群から選ばれる ａ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙ
    ｒ，３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、Ｇｌｎ，
    Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，Ｏｒｎおよ
    びＡｒｇからなる群から選ばれるアミノ酸 ｉｓ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ｇｌｎ，Ｔｙｒ，Ｔｈｒ，３，
    ４−ジヒドロキシフェニルアラニン、Ｔｒｐ，Ｍｅｔ，
    Ａｓｎ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｐｈｅ，Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌ
    ｅｕ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐおよび４Ｈｙｐからなる群から
    選ばれるアミノ酸である請求項７７、７９、８０、８
    １、８２、８３、８４または８５記載の組成物。
  87. 【請求項８７】 ｐ，Ｔｙｒ，Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉ
    ｓ，ＡｓｐおよびＡｒｇからなる群から選ばれるアミ Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｖａｌ，Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｔ
    ｒｐ，Ｐｈｅ，Ｈｉｓ，Ｇｌｕ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４
    ＨｙｐおよびＴｙｒからなる群から選ばれるアミノ酸で
    ある請求項８０記載の組成物。
  88. 【請求項８８】 該ペプチドが、少なくとも１種の植物
    プロテアーゼによる分解に耐性である請求項８６記載の
    組成物。
  89. 【請求項８９】 くとも一種が置換されている請求項８８記載の組成物。
  90. 【請求項９０】 ラニン、Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４Ｈｙｐ，Ｖａ
    ｌ，Ａｌａ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，ＰｈｅおよびＭｅｔから
    なる群から選ばれるアミノ酸である請求項８９記載の組
    成物。
  91. 【請求項９１】 成物。
  92. 【請求項９２】
  93. 【請求項９３】
  94. 【請求項９４】
  95. 【請求項９５】
  96. 【請求項９６】
  97. 【請求項９７】
  98. 【請求項９８】
  99. 【請求項９９】
  100. 【請求項１００】
  101. 【請求項１０１】
  102. 【請求項１０２】
  103. 【請求項１０３】
  104. 【請求項１０４】
  105. 【請求項１０５】
  106. 【請求項１０６】
  107. 【請求項１０７】 落しており、該ペプチドのＮ−末端にペプチド結合を介
    して結合しているアミノ酸がＭｅｔである請求項８４記
    載の組成物。
  108. 【請求項１０８】 ド結合を介して結合したアミノ酸がＭｅｔである請求項
    ７９記載の組成物。
  109. 【請求項１０９】 チド結合を介して結合したアミノ酸がＭｅｔである請求
    項７９記載の組成物。
  110. 【請求項１１０】 欠落しており、しかも該ペプチドのＮ−末端にペプチド
    結合を介して結合している該アミノ酸がＭｅｔである請
    求項８４記載の組成物。
  111. 【請求項１１１】 チド結合を介して結合している該アミノ酸がＭｅｔであ
    る請求項７９記載の組成物。
  112. 【請求項１１２】 している該アミノ酸がＭｅｔである請求項８４記載の組
    成物。
  113. 【請求項１１３】 ｅが欠落している請求項８２記載の組成物。
  114. 【請求項１１４】
  115. 【請求項１１５】 該ペプチドが配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ
    −Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−
    Ａｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａ
    ｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｍｅ
    ｔをもつ請求項８２記載の組成物。
  116. 【請求項１１６】 該ペプチドが配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ
    −Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−
    Ａｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐ
    ｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔをもつ
    請求項８２記載の組成物。
  117. 【請求項１１７】 該ペプチドが配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ
    −Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−
    Ａｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａ
    ｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｍｅ
    ｔをもつ請求項８３記載の組成物。
  118. 【請求項１１８】 該ペプチドが配列：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ
    −Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−
    Ａｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａ
    ｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｍｅ
    ｔをもつ請求項８３記載の組成物。
  119. 【請求項１１９】 該ペプチドが実質的に純粋である請
    求項８６記載の組成物。
  120. 【請求項１２０】 更に該ペプチドのＣ−末端に結合し
    た−ＮＨ２基を含む請求項８６記載の組成物。
  121. 【請求項１２１】 該ペプチドが遊離酸の塩の形状にあ
    る請求項８６記載の組成物。
  122. 【請求項１２２】 該ペプチドが実質的に純粋である請
    求項８８記載の組成物。
  123. 【請求項１２３】 更に、該ペプチドのＣ−末端に結合
    した−ＮＨ２基を含む請求項８８記載の組成物。
  124. 【請求項１２４】 該ペプチドが遊離酸の塩の形状にあ
    る請求項８８記載の組成物。
  125. 【請求項１２５】 請求項１、２、７７、７８、８０、
    ８２、８３、８４または８５に記載の植物病原体に対し
    て活性な抗微生物ペプチドの少なくとも一種を、少なく
    とも１種の植物病原体を阻害するのに有効な量で調製
    し、該少なくとも一種の植物病原体と、該少なくとも一
    種の抗微生物ペプチドとを接触させることを特徴する植
    物病原体の阻害方法。
  126. 【請求項１２６】 該少なくとも１種の抗微生物ペプチ
    ドが、植物の少なくとも表面に、局所的に適用される請
    求項１２５記載の方法。
  127. 【請求項１２７】 該少なくとも１種の抗微生物ペプチ
    ドがトランスジェニック植物における表現により得られ
    る請求項１２５に記載の方法。
  128. 【請求項１２８】 ヌクレオチド配列： （ここで、Ｎ１６−Ｎ１８、Ｎ１９−Ｎ２１、Ｎ２１−
    Ｎ２４、Ｎ３１−Ｎ３３、Ｎ３７−Ｎ３９、Ｎ５２−Ｎ
    ５４、Ｎ５５−Ｎ５７、Ｎ６１−Ｎ６３およびＮ６７−
    Ｎ６９は、同一または異っていてもよくＡｌａ，Ａｒ
    ｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉ
    ｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒ
    ｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶａｌから
    なる群から選ばれるアミノ酸をコードすべく協動し、ま
    たＮ２８−Ｎ３０はＡｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，
    Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌ
    ｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙ
    ｒおよびＶａｌからなる群から選ばれるアミノ酸をコー
    ドすべく作用する）をもつオリゴヌクレオチド（但し、
    このオリゴヌクレオチドはマガイニン１をコードしな
    い）を含む組成物。
  129. 【請求項１２９】 ヌクレオチド配列： （ここで、Ｎ１６−Ｎ１８、Ｎ１９−Ｎ２１、Ｎ２２−
    Ｎ２４、Ｎ３１−Ｎ３３、Ｎ３７−Ｎ３９、Ｎ５２−Ｎ
    ５４、Ｎ５５−Ｎ５７、Ｎ６１−Ｎ６３およびＮ６７−
    Ｎ６９は、同一または異っていてもよく、Ａｌａ，Ａｒ
    ｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉ
    ｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒ
    ｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶａｌ か
    らなる群から選ばれるアミノ酸をコードすべく協働し、
    またＮ２８−Ｎ３０はＡｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓ
    ｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅ
    ｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒ
    ｐ，ＴｙｒおよびＶａｌからなる群から選ばれるアミノ
    酸をコードするように作用する）をもつオリゴヌクレオ
    チド（但し、該オリゴヌクレオチドはマガイニン２、Ａ
    ｌａで２１−位のみ置換されたマガイニン２、８−、１
    ３−または１８−位の少なくとも２ケ所でのみ置換され
    たマガイニン２をコードせず、かつ該ペプチドは単一の
    Ａｌａのみで置換されたマガイニン２ではない）を含む
    組成物。
  130. 【請求項１３０】 ヌクレオチド配列： （ここで、Ｎ１６−Ｎ１８、Ｎ１９−Ｎ２１、Ｎ２２−
    Ｎ２４、Ｎ３１−Ｎ３３、Ｎ３７−Ｎ３９、Ｎ５２−Ｎ
    ５４、Ｎ５５−Ｎ５７、Ｎ６１−Ｎ６３、Ｎ６４−Ｎ６
    ６、Ｎ６７−Ｎ６９は、同一または異っていてもよいＡ
    ｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌ
    ｙ，Ｈｉｓ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈ
    ｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶ
    ａｌからなる群から選ばれるアミノ酸をコードすべく協
    働し、かつＮ２９−Ｎ３０はＡｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，
    Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌ
    ｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒ
    ｐ，ＴｙｒおよびＶａｌからなる群から選ばれるアミノ
    酸をコードするように作用する）をもつオリゴヌクレオ
    チド（但し、Ｎ６４−Ｎ６６がアミノ酸Ｌｙｓをコード
    するように作用する場合、Ｎ２８−Ｎ３０はアミノ酸を
    Ｇｌｙをコードするように作用できず、かつＮ６４−Ｎ
    ６６がアミノ酸Ａｓｎをコードする場合に、Ｎ２８−Ｎ
    ３０はアミノ酸Ｌｙｓをコードし得ない）を含む組成
    物。
  131. 【請求項１３１】 Ｍｅｔおよび（ｆ）Ｍｅｔからなる
    群から選ばれるアミノ酸をコードする第１の複数のヌク
    レオチドを含み、該第１の複数のヌクレオチドは、ＡＭ
    ＰＰＰをコードする第２の複数のヌクレオチドに、ホス
    ホジエステル結合を介して結合している、組成物であっ
    て、該ＡＭＰＰＰの１種以上のアミノ酸がＡｌａ，Ａｒ
    ｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉ
    ｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅ
    ｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶａｌからなる群か
    ら選ばれるアミノ酸で置換されており、かつ該マガイニ
    ン１またはマガイニン２の置換誘導体の１０−位におけ
    るアミノ酸以外の任意のアミノ酸が更にＰｒｏで置換さ
    れていることを特徴とする上記組成物。
  132. 【請求項１３２】 ヌクレオチド配列： （ここで、Ｎ１６−Ｎ１８、Ｎ１９−Ｎ２１、Ｎ２２−
    Ｎ２４、Ｎ３１−Ｎ３３、Ｎ３７−Ｎ３９、Ｎ５２−Ｎ
    ５４、Ｎ５５，Ｎ５７、Ｎ６１−Ｎ６３、Ｎ６４−Ｎ６
    ６、Ｎ６７−Ｎ６９は、同一または異っていてもよい、
    Ａｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇ
    ｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈ
    ｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶ
    ａｌからなる群から選ばれるアミノ酸をコードすべく協
    働し、かつＮ２８−Ｎ３０はＡｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，
    Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌ
    ｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒ
    ｐ，ＴｙｒおよびＶａｌからなる群から選ばれるアミノ
    酸をコードすべく作用し、Ｎ６４−Ｎ６６がアミノ酸Ｌ
    ｙｓをコードする場合にはＮ２８−Ｎ３０はアミノ酸Ｇ
    ｌｙをコードし得ず、かつＮ６４−Ｎ６６がアミノ酸Ａ
    ｓｎをコードする場合には、Ｎ２８−Ｎ３０はアミノ酸
    Ｌｙｓをコードし得ない）をもつオリゴヌクレオチドの
    ３ヌクレオチド欠落誘導体を含む組成物。
  133. 【請求項１３３】 Ｍｅｔおよび（ｆ）Ｍｅｔからなる
    群から選ばれるアミノ酸をコードする複数のヌクレオチ
    ドを更に含み、該複数のヌクレオチドは、ホスジエステ
    ル結合を介して該オリゴヌクレオチドの５′−末端に結
    合されている請求項１３２記載の組成物。
  134. 【請求項１３４】 ヌクレオチド配列： （ここで、Ｎ１６−Ｎ１８、Ｎ１９−Ｎ２１、Ｎ２２−
    Ｎ２４、Ｎ３１−Ｎ３３、Ｎ３７−Ｎ３９、Ｎ５２−Ｎ
    ５４、Ｎ５５−Ｎ５７、Ｎ６１−Ｎ６３、Ｎ６４−Ｎ６
    ６、Ｎ６７−Ｎ６９は、同一または異っていてもよいＡ
    ｌａ，Ａｒｐ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌ
    ｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈ
    ｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶ
    ａｌからなる群から選ばれるアミノ酸をコードすべく協
    働し、かつＮ２８−Ｎ３０はＡｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，
    Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌ
    ｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒ
    ｐ，ＴｙｒおよびＶａｌからなる群から選ばれるアミノ
    酸をコードするように作用し、但し、Ｎ６４−Ｎ６６が
    アミノ酸Ａｓｎをコードする場合、Ｎ２８−Ｎ３０はア
    ミノ酸Ｌｙｓをコードし得ない）をもつオリゴヌクレオ
    チドの６−ヌクレオチド欠落誘導体を含む組成物。
  135. 【請求項１３５】 更に、Ｍｅｔおよび（ｆ）Ｍｅｔか
    らなる群から選ばれるアミノ酸をコードする複数のヌク
    レオチドをも含み、該複数のヌクレオチドは、ホスホジ
    エステル結合を介して該オリゴヌクレオチドの５′−末
    端に結合されている請求項１３４記載の組成物。
  136. 【請求項１３６】 化合物のタンパク分解による分解に
    対する耐性を測定するのに有用な生物学的スクリーニン
    グ試薬であって、約５時間以内に該化合物の少なくとも
    ５０％の分解に有効な量の少なくとも１種の実質的に純
    粋な植物プロテアーゼを含み、残部が水であることを特
    徴とする上記生物学的スクリーニング試薬。
  137. 【請求項１３７】 更に、バッファー、保存剤およびそ
    の混合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の添加
    剤をも含む請求項１３６記載の試薬。
  138. 【請求項１３８】 該植物プロテアーゼが水百万部当た
    り約０．０５部〜水千部当たり約１部の量で存在する請
    求項１３６記載の試薬。
  139. 【請求項１３９】 少なくとも１種の植物プロテアーゼ
    による分解に対する化合物の耐性を測定するための化合
    物のスクリーニング法であって、スクリーニングすべき
    化合物の起源を調製し、該化合物を、水百万部当たり約
    ０．０５部乃至し水千部当たり約１部の少なくとも１種
    のプロテアーゼを含む請求項１３６記載の生物学的スク
    リーニング試薬と所定時間反応させ、該反応を該試薬の
    不活化により停止させ、得られる化合物を分析すること
    を特徴とする上記方法。
  140. 【請求項１４０】 化合物の、タンパク分解による分解
    に対する抵抗性を測定するのに有用な生物学的スクリー
    ニング用試薬の製法であって、液状培地から細胞を分離
    し、少なくとも１種の細胞外植物プロテアーゼを含有す
    る該培地を集めることを特徴とする上記方法。
  141. 【請求項１４１】 約１８〜約２３個のアミノ酸残基を
    含むペプチドを含み、該ペプチドは、アミノ酸配列：Ｇ
    ｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａ
    ａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘａ もよく、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｏｒｎ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇ
    ｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｕ
    ｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，４Ｈｙｐ，Ｓ
    ｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，３，４−ジヒドロキシ
    フェニルア Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌ
    ｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙ
    ｒ，３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンおよびＶａ
    ｌからなる群から選ばれる）をもつペプチドの誘導体で
    あり、該ペプチドは少なくとも１種の植物プロテアーゼ
    によるタンパク分解に対して抵抗性であるように置換さ
    れていることを特徴とする組成物。
  142. 【請求項１４２】 も一つが置換されている請求項１４３記載の組成物。
  143. 【請求項１４３】 アラニン、Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，３Ｈｙｐ，Ｖａｌ，Ａｌ
    ａ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，ＰｈｅおよびＭｅｔからなる群か
    ら選ばれる請求項１４４記戴の組成物。
  144. 【請求項１４４】 更に、該ペプチドの２残基欠落誘導
    体のＮ−末端にペプチド結合を介して結合したＭｅｔお
    よび（ｆ）Ｍｅｔからなる群から選ばれるアミノ酸をも
    含む請求項１４３記載の組成物。
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