JPH0723799A

JPH0723799A - ポリヌクレオチドの検出方法

Info

Publication number: JPH0723799A
Application number: JP17286393A
Authority: JP
Inventors: Kazunobu Okano; 和宣岡野; Hideki Kanbara; 秀記神原; Kazuko Kawamoto; 和子川本; Hiroko Furuyama; 宏子古山
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1993-07-13
Filing date: 1993-07-13
Publication date: 1995-01-27

Abstract

(57)【要約】【構成】核酸プローブにリボヌクレオチドとデオキシリ
ボヌクレオチドで構成されたものを用い、標的ポリヌク
レオチドに結合させる。次に、少なくとも一種のデオキ
シリボヌクレオチド３リン酸とそれとは異なる塩基種の
ダイデオキシヌクレオチド３リン酸共存下で、ＲＮＡ分
解酵素と核酸合成酵素を反応させることで３′末端を一
定塩基長伸長させ、リボヌクレオチド部分を切断する。
伸長分解したプローブは蛍光標識されていて、元の核酸
プローブとはサイズが異なるので電気泳動で検出され
る。【効果】一定温度の反応で伸長分解したプローブとして
増幅検出できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡの検出及び遺伝子
診断法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】遺伝病やウィルス等による感染症の診断
にＤＮＡ等のポリヌクレオチドの検出が用いられてい
る。検査対象となるウィルスのコピー数は少ない場合に
は数十コピー以下であり、ポリメラーゼチェインリ
アクション（ＰＣＲ；PolymeraseChain Reaction）法に
よりＤＮＡを増殖し、検出する方法がネイチャー(Natur
e)３５０，９１−９２(１９９１)あるいは特開昭61−27
4697号公報に開示されている。ＰＣＲ法はＤＮＡの特定
の領域を増殖するもので、対象となる二本鎖ＤＮＡの
（＋）鎖及び（−）鎖にハイブリダイズする二種のオリ
ゴマではさまれる領域のＤＮＡを増殖する。

【０００３】二本鎖ＤＮＡを高温（〜９０℃）下で変性
し、(＋）鎖と(−）鎖に分離する。次いで降温（〜６０
℃）し、それぞれにＤＮＡオリゴマをハイブリダイズさ
せ、Ｔａｑ由来など耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで相補鎖
を合成する。再び昇温して二対の（＋）鎖および（−）
鎖を作製する。以下、降温と昇温の熱サイクルを繰り返
し、ＤＮＡ鎖を倍々と増やしていく。実際には１回の熱
サイクルで平均１.６倍程度になることが知られてお
り、３０回繰り返すと１０⁶ 倍にもコピー数を増やすこ
とが出来る。このようにして得たＤＮＡをゲル電気泳動
分離し、増幅されたＤＮＡの長さを調べることにより標
的ＤＮＡの有無を診断している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】この方法ではＤＮＡコ
ピーの増殖に高価な耐熱性酵素を必要とすること、昇温
と降温を繰り返す手間と時間がかかること、二種のＤＮ
Ａ増殖用オリゴマ（プライマ）が必要である難点があ
る。特に対象によっては２つのプライマをうまく選べな
いこともある。更に電気泳動によりＰＣＲ産物を分離す
る必要があるため手間と労力を必要とする難点があっ
た。また従来技術では、標的ポリヌクレオチドの特定部
位を増幅できるので高感度であるが、検出にＲＩ標識物
を用いたりエチジウムブロマイドを用いた蛍光染色法を
用いている。これらは用手法であり、自動化に適さな
い。また、ＲＩ標識物を用いる場合は作業者の放射線被
爆という問題もあった。

【０００５】本発明の目的は、簡便で高感度な標的ポリ
ヌクレオチド即ちＤＮＡの検出法を提供することにあ
る。より具体的には、本発明の目的は標的ポリヌクレオ
チド試料とハイブリッド体を形成した核酸プローブを一
定温度の酵素反応で増幅する手段を提供することにあ
る。また自動化に適した標的ポリヌクレオチドの検出手
法を提供することにある。また本発明の他の目的は、核
酸プローブの非ＲＩ標識を実現して、作業者を放射線被
爆から開放することと作業場所への制約を無くすことに
ある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に本発明では、以下のような手法を用いる。

【０００７】まず、次の（１）乃至（３）のいずれかの
方法によって核酸プローブを一定温度の酵素反応で増幅
する。

【０００８】（１）核酸プローブがリボヌクレオチドと
デオキシリボヌクレオチドで構成されたもので、デオキ
シリボヌクレオチドの少なくとも一ヵ所に標識物が結合
したものを用いる。この核酸プローブを標的ポリヌクレ
オチドにハイブリッド形成条件下で結合させる。次に、
少なくとも一種のデオキシリボヌクレオチド３リン酸と
デオキシリボヌクレオチド３リン酸とは異なる塩基種の
ダイデオキシヌクレオチド３リン酸の共存下でリボヌク
レアーゼエイチ（Ribonuclease H）などのＲＮＡ分解
酵素と核酸合成酵素を反応させることで３′末端を一定
塩基長伸長させ、リボヌクレオチド部分を切断する。こ
の一連の伸長分解反応で生成するプローブ産物の塩基長
を１０塩基程度かそれ以下になる様に元の核酸プローブ
を設計する。このような短いプローブ産物は標的ポリヌ
クレオチドとの水素結合を保持出来なくなるため、短く
なったプローブ産物は標的ポリヌクレオチドから遊離
し、元の標的ポリヌクレオチドを再生する。再生した、
標的ポリヌクレオチドは再度核酸プローブと結合し、一
連の伸長分解反応が起きる。一定時間反応させる間にこ
のサイクルを複数回繰り返し行わせる。

【０００９】（２）リボヌクレオチドとデオキシリボヌ
クレオチドで構成された核酸プローブを標的ポリヌクレ
オチドにハイブリッド形成条件下で結合させ、少なくと
も一種のデオキシリボヌクレオチド３リン酸と該デオキ
シリボヌクレオチド３リン酸とは異なる塩基種の標識ダ
イデオキシヌクレオチド３リン酸共存下でＲＮＡ分解酵
素と核酸合成酵素を反応させる。この反応で３′末端を
一定塩基長伸長させて３′末端に標識すると共に、リボ
ヌクレオチド部分を切断し、一定長の３′末端標識デオ
キシリボヌクレオチドを生成する。（１）と同様に、こ
の一連の伸長分解反応で生成するプローブ産物の塩基長
を１０塩基程度かそれ以下になる様に元の核酸プローブ
を設計し、核酸プローブの伸長分解−短くなったプロー
ブ産物の遊離と標的ポリヌクレオチドの再生のサイクル
を複数回繰り返し行わせる。

【００１０】（３）核酸プローブがリボヌクレオチドと
デオキシリボヌクレオチドで構成されたもので、該デオ
キシリボヌクレオチドの少なくとも一ヵ所に標識物が結
合したものを用いる。標的ポリヌクレオチドに結合させ
た後、少なくとも一種のデオキシリボヌクレオチド３リ
ン酸と該デオキシリボヌクレオチド３リン酸とは異なる
塩基種で標識体の結合したダイデオキシヌクレオチド３
リン酸共存下でＲＮＡ分解酵素と核酸合成酵素を反応さ
せる。この反応で３′末端を一定塩基長伸長させて３′
末端に標識し、リボヌクレオチド部分を切断し、中間塩
基部と３′末端が標識された一定長のデオキシリボヌク
レオチドを生成する。（１）と同様に、この一連の伸長
分解反応で生成するプローブ産物の塩基長を１０塩基程
度かそれ以下になる様に元の核酸プローブを設計し、核
酸プローブの伸長分解−短くなったプローブ産物の遊離
と標的ポリヌクレオチドの再生のサイクルを複数回繰り
返し行わせることとした。

【００１１】次いで、次の（４）または（５）の方法に
より標的ポリヌクレオチドを検出する。

【００１２】（４）上記（１）において、ダイデオキシ
ヌクレオチド三リンがビオチンの結合したもので、一定
長になった３′末端ビオチン化デオキシリボヌクレオチ
ドをアビジンあるいはストレプトアビジンを固定した担
体を用いて分離する。

【００１３】（５）上記（２）または（３）において、
核酸プローブのデオキシリボヌクレオチド部分の少なく
とも一ヵ所にビオチンが結合したものを用い、一定長に
なったビオチン化プローブをアビジンあるいはストレプ
トアビジンを固定した担体を用いて分離する工程を設け
ることとした。

【００１４】また、次の（６）または（７）の方法によ
り核酸プローブの非ＲＩ標識を実現する。

【００１５】（６）上記（１）、（２）、（３）におい
て、標識物に蛍光体を用いる。

【００１６】（７）上記（３）では、核酸プローブのデ
オキシヌクレオチド部の標識物と標識ダイデオキシヌク
レオチド３リン酸の標識物がそれぞれ異なる蛍光体で構
成され、前記二種の蛍光体はエネルギ移動を起こすよう
にし、一方の蛍光体を励起することで他方の蛍光体を間
接的に励起する。

【００１７】

【作用】標的核酸が、一本鎖ＤＮＡなどの一本鎖核酸の
場合にはそのまま試料とすることができる。また、二本
鎖ＤＮＡの場合には、熱あるいはアルカリ変性してもよ
いが、ハイブリッド形成条件下で標的核酸同士のハイブ
リッド形成が起こり、核酸プローブとのハイブリッド形
成効率が低下するので、エキソヌクレアーゼIIIのよう
な二本鎖特異的ヌクレアーゼで処理して一本鎖にしてお
く方がよい。

【００１８】リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオ
チドで構成された核酸プローブは、１６塩基長以上のも
のであれば標的ポリヌクレオチドと結合することが出来
る。デオキシリボヌクレオチド３リン酸とダイデオキシ
ヌクレオチド３リン酸の共存下で核酸合成酵素を反応さ
せると、核酸プローブをプライマとして３′末端に塩基
を付加することができる。ここでデオキシリボヌクレオ
チド３リン酸とダイデオキシヌクレオチド３リン酸を別
の種類の塩基種にしておけば、最初のダイデオキシヌク
レオチド３リン酸結合部位で伸長反応を停止することが
出来る。

【００１９】核酸合成酵素による伸長反応はダイデオキ
シヌクレオチド３リン酸結合部位で１００％反応が停止
するとは限らないので、ダイデオキシヌクレオチド３リ
ン酸結合部位の次の３′側塩基部分に相当するデオキシ
ヌクレオチド３リン酸は加えない方が伸長反応を確実に
停止できる。

【００２０】核酸合成酵素による伸長反応を行うときに
Ribonuclease HのようなＤＮＡとＲＮＡのハイブリダイ
ゼーション形成部分のＲＮＡ部分を特異的に分解するRN
A分解酵素を用いれば、標的ポリヌクレオチドにハイブ
リダイゼーション条件下で結合した核酸プローブのリボ
ヌクレオチド部分を分解することが出来る。この時、デ
オキシリボヌクレオチド部分即ち標的ポリヌクレオチド
や核酸プローブのデオキシリボヌクレオチド部分や伸長
した部分は分解されない。このため、核酸プローブは
５′末端側が短くなり、３′末端側が長くなる。

【００２１】伸長する長さを２〜５塩基とし、分解され
た核酸プローブの全長を１０塩基以下になるようにプロ
ーブを設計すれば、このように短いプローブは標的ポリ
ヌクレオチドとの水素結合を保持出来なくなる。このた
め一連の反応で伸長分解を受けた核酸プローブは標的ポ
リヌクレオチドから遊離し、元の標的ポリヌクレオチド
を再生する。通常、核酸プローブは大過剰存在するの
で、再生した標的ポリヌクレオチドは再度核酸プローブ
と結合し、一連の分解伸長反応が起きる。このサイクル
は核酸プローブが消費しつくされるまで起きるので、分
解伸長した核酸プローブは増幅産生される。

【００２２】本発明では、核酸プローブの一部に蛍光体
を結合したものを用いるか、蛍光体の結合したダイデオ
キシリボヌクレオチドを用いて伸長反応の際の３′末端
に蛍光体を導入するので、検出は蛍光検出で行うことが
出来る。蛍光体にはフルオレッセイン，テトラメチルロ
ーダミン，ローダミンＸ，スルホローダミン１０１等を
用いることが出来る。あるいは、核酸プローブの蛍光体
と３′末端に導入される蛍光体の種類を変えておけば両
蛍光体間のエネルギ移動を利用できるので、片方の蛍光
体を励起して他方の蛍光体の蛍光を検出することが出来
る。このような蛍光体の組合せとしてはフルオレッセイ
ンとスルホローダミン１０１等の組合せが有効である。

【００２３】標的ポリヌクレオチドに結合して分解伸長
した核酸プローブは分解されていないプローブや伸長す
る前に分解したプローブと塩基長が異なるために電気泳
動を用いて容易に分離検出できる。

【００２４】ダイデオキシヌクレオチド三リンがビオチ
ンの結合したものを用いて分解伸長反応で３′末端にビ
オチンを導入したプローブはストレプトアビジン等を固
定した担体で容易に捕捉できる。ビオチンが入らなかっ
たプローブ、即ち、３′末端の伸長が起きなかったプロ
ーブ等は洗浄して除くことが出来るので、担体上の蛍光
を測定することで分解伸長がおきたプローブ量、即ち、
試料中の標的ポリヌクレオチド量を知ることが出来る。
同様に、核酸プローブのデオキシリボヌクレオチド部分
にビオチンが結合したものを用いる場合でも、分解伸長
反応で３′末端に蛍光体が導入されるケースでは担体上
の蛍光強度を測定することで試料中の標的ポリヌクレオ
チド量を知ることが出来る。

【００２５】

【実施例】

（実施例１）核酸プローブを一定温度の酵素反応で増幅
する本発明について説明する。本発明でのＤＮＡプロー
ブの構造を図１に記した。図中の標識体にはスルホロー
ダミン１０１蛍光体を用いたが、他の蛍光色素でも可能
である。

【００２６】各プローブの基本的な動作を図２ないし図
４を用いて説明する。第１の例は図２に示す様に、試料
に一本鎖ＤＮＡ１０１とこれに相補的な塩基配列を持つ
図１（ａ）に記載の核酸プローブ１を用いる。核酸プロ
ーブ１は５′末端に１０塩基長のデオキシリボヌクレオ
チド部分１１があり、その３′側に８塩基長のリボヌク
レオチド１２が続き、５′末端側が６塩基長のデオキシ
リボヌクレオチド部分１３からなる全長２４塩基長のハ
イブリッドオリゴヌクレオチドである。デオキシリボヌ
クレオチド部分１３の５′から４番目の塩基にはスルホ
ローダミン101蛍光体が結合している。

【００２７】図２のように、試料ＤＮＡ１０１と核酸プ
ローブ１を３７℃で混合すると両者は相補的な配列を持
っているためにハイブリダイズし、１０２のような複合
体を形成する。ここで、二種のデオキシリボヌクレオチ
ド三燐酸１０３，１０４とダイデオキシリボヌクレオチ
ド三燐酸１０５とＤＮＡポリメラーゼであるシーケネー
ス（東洋紡績株式会社製）１０７とＲＮＡ分解酵素であ
るRNase H(宝酒造株式会社製）１０６を共存させてお
く。

【００２８】試料ＤＮＡ１０１に結合した核酸プローブ
１の３′末端にはシーケネースによりデオキシリボヌク
レオチド三燐酸が３塩基長分伸長した後、ダイデオキシ
リボヌクレオチド三燐酸が結合し反応が停止する。ま
た、試料ＤＮＡ１０１に結合した核酸プローブ１のリボ
ヌクレオチド部分はRNase H により分解される。伸長と
分解を受けたプローブは約１０塩基長になる。ここで、
伸長反応が起きる前にRNase H による分解を受けた核酸
プローブは６塩基長になるので試料ＤＮＡ101から遊離
してしまうので、その後の伸長反応は起きない。このよ
うに伸長反応が起きずに分解を受けたものは６塩基長
で、伸長反応を受けた後に分解したフラグメント１０８
は１０塩基長であるので両者は電気泳動的に分離するこ
とが出来る。

【００２９】伸長反応と分解を受けて１０塩基長になっ
たフラグメント１０８は３７℃では試料ＤＮＡ１０１か
ら遊離し、元の試料ＤＮＡ１０１を再生する。再生した
試料ＤＮＡ１０１は、再度、核酸プローブ１と結合し、
伸長分解の一連のサイクルを繰り返す。

【００３０】実際に、１×１０~¹⁸mol の標的ＤＮＡ１
０１と１×１０~¹³mol の核酸プローブ１をデオキシリ
ボヌクレオチド三燐酸であるｄＴとｄＣとダイデオキシ
リボヌクレオチド三燐酸ｄｄＧ共存下で１ユニットのシ
ーケネースと１ユニットのRNase H を３７℃３０分間反
応させた。反応液を９５℃２分間加熱し、反応を停止し
た後、電気泳動で分離分析した。電気泳動には日立ＷＳ
Ｑ−３０００型DANシーケンサの励起用レーザをＨｅ／
Ｎｅレーザ（６３３ｎｍ）に変え、更に、集光効率を上
げるために電気泳動版にシリンドリカルレンズを貼付て
高感度検出できるように改造して用いた。

【００３１】その結果、伸長反応を受けた後に分解した
フラグメントが未反応のプローブや伸長反応を受ける前
に分解されたフラグメントと分離して検出できた。検出
された全ての蛍光ピークの強度総和と伸長反応を受けた
後に分解したフラグメントのピークの強度の比から伸長
反応を受けた後に分解したフラグメント量を計算したと
ころ、標的ＤＮＡに対し約２００倍のフラグメントが生
成していた。このことから本実施例を用いれば、一定温
度の酵素反応で核酸プローブの増幅を起こすことができ
ることが確認された。

【００３２】本実施例では核酸プローブに図１の（ａ）
の構造のものを用いたが、図１の（ｄ）のように、リボ
ヌクレオチド４３が複数部位ある核酸プローブ４でも、
同様な結果を得ることが出来る。

【００３３】（実施例２）本実施例では図１（ｂ）に記
載の核酸プローブ２を用いる。核酸プローブ２は５′末
端に１０塩基長のデオキシリボヌクレオチド部分２１が
あり、その３′側に８塩基長のリボヌクレオチド２２が
続き、５′末端側が６塩基長のデオキシリボヌクレオチ
ド部分２３からなる全長２４塩基長のハイブリッドオリ
ゴヌクレオチドである。蛍光体は結合していない。

【００３４】図３のように、試料ＤＮＡ１０１と核酸プ
ローブ１を３７℃で混合すると両者は相補的な配列を持
っているためにハイブリダイズし、２０２のような複合
体を形成する。ここで、二種のデオキシリボヌクレオチ
ド三燐酸１０３，１０４と蛍光標識ダイデオキシリボヌ
クレオチド三燐酸２０５とＤＮＡポリメラーゼであるシ
ーケネース(東洋紡績株式会社製）１０７とＲＮＡ分解
酵素であるRNase H（宝酒造株式会社製）１０６を共存
させておく。蛍光標識にはスルホローダミン１０１蛍光
体を用いた。試料ＤＮＡ１０１に結合した核酸プローブ
２の３′末端にはシーケネースによりデオキシリボヌク
レオチド三燐酸が３塩基長分伸長した後、蛍光標識ダイ
デオキシリボヌクレオチド三燐酸２０５が結合し、反応
が停止する。また、試料ＤＮＡ１０１に結合した核酸プ
ローブ２のリボヌクレオチド部分２２はRNase H により
分解される。

【００３５】伸長と分解を受けたプローブは約１０塩基
長になる。実施例１と同様に、伸長と分解を受けたプロ
ーブ２０８は試料ＤＮＡ１０１から遊離して元の試料Ｄ
ＮＡ１０１を再生する。再生した試料ＤＮＡ１０１は再
度核酸プローブ２と結合し、伸長分解の一連のサイクル
を繰り返す。

【００３６】実施例１と同様に、１×１０~¹⁸molの標的
ＤＮＡ１０１と１×１０~¹³molの核酸プローブ２をデオ
キシリボヌクレオチド三燐酸であるｄＴとｄＣと蛍光標
識ダイデオキシリボヌクレオチド三燐酸ｄｄＧ共存下で
１ユニットのシーケネースと１ユニットのRNase H を３
７℃３０分間反応させた。反応液を９５℃で２分間加熱
し、反応を停止した後、後の電気泳動分析の妨害になら
ない程度にゲル濾過を行い、未反応の蛍光標識ダイデオ
キシリボヌクレオチド三燐酸を大まかに取り除く。続い
て電気泳動で分離分析した。

【００３７】その結果、実施例１と同様に、伸長反応を
受けた後に分解したフラグメントが未反応のプローブや
伸長反応を受ける前に分解されたフラグメントと分離し
て検出できた。本実施例では一連の反応で３′末端に蛍
光体が取り込まれたものを検出することで、標的ポリヌ
クレオチドに対する選択性を上げる効果がある。

【００３８】本実施例では、核酸プローブ２を用いた
が、図１（ｃ）の核酸プローブ３のように、ビオチン３
４が結合したものを用いることもできる。

【００３９】この場合、上記手法と同様の操作で、３′
末端にデオキシリボヌクレオチド３リン酸を３塩基長分
伸長した後、蛍光標識ダイデオキシリボヌクレオチド３
リン酸を結合させる。同時にRNase H でリボヌクレオチ
ド部分３２を分解し、分解伸長フラグメントを得る。

【００４０】続いて、反応液を電気泳動で分離し、電気
泳動担体ゲルから溶出してくる分解伸長フラグメントを
含むフラクションをストレプトアジピンを固定したマイ
クロプレートに分集する。

【００４１】この操作で、ビオチンの結合したフラグメ
ントはマイクロプレートに結合する。この時点で、電気
泳動で分離不十分のために残されている未反応の蛍光標
識ダイエオキシリボヌクレオチドは分離除去される。マ
イクロプレート表面に結合した蛍光体由来の蛍光を測定
することで、上記実施例１と同様の結果を得ることがで
きた。

【００４２】（実施例３）本実施例ではスルホローダミ
ン１０１を蛍光標識した核酸プローブ１とスルホローダ
ミン１０１を結合した蛍光標識ダイデオキシリボヌクレ
オチド三燐酸を用いてエネルギ移動で標的ポリヌクレオ
チドを検出する例について述べる。

【００４３】実施例１及び２と同様に図４のように、試
料ＤＮＡ１０１と核酸プローブ１をハイブリダイズさ
せ、１０２のような複合体を形成する。一連の反応で
３′末端は３塩基長分伸長した後、蛍光標識ダイデオキ
シリボヌクレオチド三燐酸が結合し反応が停止する。ま
た、核酸プローブのリボヌクレオチド部分はRNase H に
より分解される。伸長と分解を受けたプローブは約１０
塩基長になり、二種の蛍光体の結合した伸長と分解を受
けたプローブ２０８が得られる。実施例１と同様に、伸
長と分解を受けたプローブは試料ＤＮＡから遊離して元
の試料ＤＮＡ１０１を再生する。再生した試料ＤＮＡ
は、再度、核酸プローブと結合し、伸長分解の一連のサ
イクルを繰り返す。

【００４４】実施例１と同様に、１×１０~¹⁸mol の標
的ＤＮＡ１０１と１×１０~¹³mol の核酸プローブ１を
デオキシリボヌクレオチド三燐酸であるｄＴとｄＣと蛍
光標識ダイデオキシリボヌクレオチド三燐酸ｄｄＧ共存
下で１ユニットのシーケネースと１ユニットのRNase H
を３７℃３０分間反応させた。反応液を９５℃２分間加
熱し反応を停止した後、電気泳動で分離分析した。電気
泳動には日立ＷＳＱ−３０００型ＤＡＮシーケンサを用
いた。レーザは４８８ｎｍのアルゴンレーザを用いた。
検出には６０５ｎｍないし６４０ｎｍのバンドパスフィ
ルタを用いてスルホローダミン１０１由来の蛍光を検出
した。

【００４５】その結果、伸長反応を受けた後に分解した
フラグメントが未反応のプローブや伸長反応を受ける前
に分解されたフラグメントと分離して検出できた。蛍光
強度より増幅した分解伸長フラグメント量を求めると標
的ＤＮＡに対し約１００倍の分解伸長フラグメントが増
幅して得られることがわかった。

【００４６】本実施例では二種の蛍光体が取り込まれた
フラグメントをエネルギ移動を用いて検出するので、反
応生成物以外の電気泳動分離ピークの影響を抑えること
ができるので、実施例２のような反応後のゲル濾過がい
らなくなり、より検出が容易になる利点がある。

【００４７】（実施例４）図５に示すように、ビオチン
結合ダイデオキシリボヌクレオチド三燐酸４０８を用い
て蛍光標識プローブ１を他の実施例と同様な反応を行い
分解伸長し、３′末端にビオチンを導入した分解伸長フ
ラグメント４１８を得る。反応液をストレプトアビジン
４１０の結合したマイクロプレート４１１に移し、３０
分間撹拌する。この工程で、ビオチンを導入した分解伸
長フラグメント４０９がマイクロプレート表面に捕捉さ
れる。十分洗浄した後に、マイクロプレート表面に結合
した蛍光体由来の蛍光を測定する。この方法を用いても
他の実施例と同様に１×１０~¹⁸molの標的ＤＮＡを測定
できた。検出された蛍光強度から標的ＤＮＡに対し約８
０倍の分解伸長フラグメントが増幅して得られることが
わかった。

【００４８】

【発明の効果】極微量存在する標的ＤＮＡを検出する核
酸プローブがリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオ
チドで構成されたものを用い、デオキシリボヌクレオチ
ド３リン酸とデオキシリボヌクレオチド３リン酸とは異
なる塩基種のダイデオキシヌクレオチド３リン酸共存下
でＲＮＡ分解酵素と核酸合成酵素を反応させることで
３′末端を一定塩基長伸長させ、リボヌクレオチド部分
を切断する方法を用いれば、一連の反応で生成した分解
伸長フラグメントとして増幅できる。この反応は、一定
の温度で行える利点がある。標的ＤＮＡを分解伸長フラ
グメントとして増幅できるので、標的ＤＮＡを高感度に
検出できる。

【００４９】また、核酸プローブ内とダイデオキシヌク
レオチド３リン酸で伸長した末端に蛍光体を導入する方
法を組み合わせることで、種類の違う二種の蛍光体を導
入し、エネルギ移動を用いて検出することで、より容易
に分解伸長したフラグメントを検出できる。また、ビオ
チン化ダイデオキシヌクレオチド３リン酸を用いてプロ
ーブの３′末端にビオチンを導入することで、未反応プ
ローブ等を容易に除ける方法を用いることでより装置化
に適した方法にすることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】核酸プローブの説明図。

【図２】本発明の反応の一実施例の説明図。

【図３】本発明の反応の第二の実施例の説明図。

【図４】本発明の反応の第三の実施例の説明図。

【図５】本発明の反応の第四の実施例の説明図。

【符号の説明】

１１，１３，２１，２３，３１，３３，４１，４２，４
４…デオキシリボヌクレオチド部分、１２，２２，３
２，４３…リボヌクレオチド部分、１４…蛍光体、３４
…ビオチン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者古山宏子東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地株式会社日立製作所中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】標的となるポリヌクレオチドの特定部位の
塩基配列と相補的な配列を有する核酸プローブがリボヌ
クレオチドとデオキシリボヌクレオチドで構成されたも
ので、デオキシリボヌクレオチドの少なくとも一ヵ所に
標識物が結合したものを用い、核酸プローブを標的ポリ
ヌクレオチドにハイブリッド形成条件下で結合させ、少
なくとも一種のデオキシリボヌクレオチド３リン酸とデ
オキシリボヌクレオチド３リン酸とは異なる塩基種のダ
イデオキシヌクレオチド３リン酸の共存下でＲＮＡ分解
酵素と核酸合成酵素を反応させ、３′末端を一定塩基長
伸長させ、リボヌクレオチド部分を切断し、一定長にな
った標識デオキシリボヌクレオチドの生成量から標的ポ
リヌクレオチドの検出を行うことを特徴とするポリヌク
レオチドの検出方法。
【請求項２】標的となるポリヌクレオチドの特定部位の
塩基配列と相補的な配列を有する核酸プローブがリボヌ
クレオチドとデオキシリボヌクレオチドで構成されたも
ので、核酸プローブを標的ポリヌクレオチドにハイブリ
ッド形成条件下で結合させ、少なくとも一種のデオキシ
リボヌクレオチド３リン酸とデオキシリボヌクレオチド
３リン酸とは異なる塩基種の標識ダイデオキシヌクレオ
チド３リン酸の共存下でＲＮＡ分解酵素と核酸合成酵素
を反応させ、３′末端を一定塩基長伸長させ、リボヌク
レオチド部分を切断し、一定長になった３′末端標識デ
オキシリボヌクレオチドの生成量から標的ポリヌクレオ
チドの検出を行うことを特徴とするポリヌクレオチドの
検出方法。
【請求項３】請求項１において、ダイデオキシヌクレオ
チド三リンが標識体の結合したものであるポリヌクレオ
チドの検出方法。
【請求項４】請求項１において、ダイデオキシヌクレオ
チド三リンがビオチンの結合したもので、一定長になっ
た３′末端ビオチン化デオキシリボヌクレオチドをアビ
ジンあるいはストレプトアビジンを固定した担体を用い
て分離する工程を設けたポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項５】請求項２において、核酸プローブがリボヌ
クレオチドとデオキシリボヌクレオチドで構成されたも
ので、デオキシリボヌクレオチドの少なくとも一ヵ所に
ビオチンが結合したものを用い、一定長になったビオチ
ン化デオキシリボヌクレオチドをアビジンあるいはスト
レプトアビジンを固定した担体を用いて分離する工程を
設けたポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項６】請求項１，２，３，４または５において、
標識物が蛍光体であるポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項７】請求項３において、核酸プローブの標識物
と標識ダイデオキシヌクレオチド３リン酸の標識物がそ
れぞれ異なる蛍光体で、前記二種の蛍光体はエネルギ移
動を起こすものであるポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項８】請求項１，２，３，４，５，６または７に
おいて、３′末端のデオキシリボヌクレオチド部分が３
ないし７塩基長で、その５′末端側の少なくとも一ヵ所
にリボヌクレオチド部分を持つ構造で、３′末端側に伸
長する塩基長が３ないし７塩基長であるポリヌクレオチ
ドの検出方法。