JPH07228598A - ペプチド、およびヒトｂｎｐの非特異吸着を抑制する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】本発明は、ＢＮＰの容器壁等への非特異的な吸
着を効果的に防止する技術の提供を目的とする。 【構成】本発明は、ヒト天然ＢＮＰのアミノ酸配列中、
３位のLys、２７位のLys、３０位のArg、３１位のArg、
３２位のHisをそれぞれ非塩基性アミノ酸に置換したペ
プチド、ならびにその用途を提供する。なお本発明のペ
プチドは、アミノ酸を置換後も天然ＢＮＰの免疫学的な
特性を維持しているものである。 【効果】天然のＢＮＰの免疫学的な特性を維持しつつ、
非特異的な吸着のみを効果的に抑制することができる。
このペプチドを免疫学的測定に用いることにより、測定
値の信頼性の向上、そして感度の向上という効果を得ら
れる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトＢＮＰ（脳性ナト
リウム利尿ペプチド、以下特にことわらない限り単にＢ
ＮＰと表記したものはヒトＢＮＰを意味する）に類似す
るペプチドとその用途に関するものである。具体的に
は、天然のＢＮＰと同様の抗原性を持ちながら天然ＢＮ
Ｐ分子で観察される非特異的な吸着を抑制する技術に関
する発明である。

【０００２】ＢＮＰはナトリウム利尿ペプチド系の一つ
であり、主として心室から分泌されるホルモンである。
歴史的にはブタ脳より抽出され、次いでヒト脳でも確認
されたため脳性と名付けられたが、実際には心室組織に
最も多く分布している。組織中ではＢＮＰ−３２とその
前駆体であるγＢＮＰが存在する。なお本発明でＢＮＰ
と称しているものは、このＢＮＰ−３２である。血中Ｂ
ＮＰの測定は心不全等の心疾患の診断に役立つとされて
いる（Mukoyama,M. et al Lancet 335 801-802,199
0）。ヒトＢＮＰの構造は特開平２−２３７９９９に記
載されているとおりである。

【従来技術の問題点】

【０００３】血中ＢＮＰの測定には、簡便性と特異性に
優れる免疫学的な測定方法が利用されることが多い。免
疫学的測定方法では、標準物質や標識物質としてＢＮＰ
の使用は不可欠である。ところが天然のＢＮＰ、あるい
は化学的に同じアミノ酸配列を再現した合成ペプチドは
ガラスや合成樹脂に吸着され易いため、しばしばＢＮＰ
に固有の問題を起こしていた。すなわち、一つは保存中
の容器壁への吸着である。特に保存や反応用容器素材と
して一般的なガラスやポリスチレン等のプラスチックに
は吸着され易い。保存中に標準物質であるＢＮＰが容器
壁に吸着すると、結果として標準液のＢＮＰ濃度が低下
し表示濃度を保証できなくなってしまう。このような標
準液で得られる測定結果はまったく信頼性に欠けるもの
である。ＢＮＰの非特異吸着による第二の問題点は、反
応容器壁への非特異吸着が引き起こす測定誤差である。
免疫学的測定方法としてサンドイッチ法を採用した場合
であれば、標準物質としたＢＮＰが固相や容器壁に非特
異的に吸着して計りこまれるため正誤差として表れる。
他方、標識抗原としてのＢＮＰを利用する競合法におい
ては、標識抗原の非特異的な吸着が負誤差として表れる
ことになる。

【０００４】このようなＢＮＰの非特異的な吸着に起因
する問題を防ぐために、従来は多量の血清蛋白質や界面
活性剤などを反応溶液や標準溶液に添加するというよう
な対策を採っていた。しかしこのような成分の添加は、
非特異的吸着の抑制のみならず免疫反応そのものをも抑
制する場合が有り血中抗原の測定感度を低下させる可能
性につながりかねないので好ましくない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はこのよ
うな従来技術の問題点を解決することである。具体的に
はＢＮＰとしての免疫活性を維持しつつ、非特異吸着が
少ないＢＮＰ様ペプチドを提供することによって従来技
術の問題を解消することが本発明の課題である。本発明
は、免疫学的な特性に大きな影響を与えかねないペプチ
ドのアミノ酸配列の置換というまったく新しいアプロー
チにより、従来技術の問題点を解決しようとするもので
ある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＢＮＰのアミ
ノ酸配列中、次の群から選択された少なくとも１つの部
位を天然のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸で置換した
配列を含むペプチド、またはその断片である。 ３位のLys、 ２７位のLys ３０位のArg ３１位のArg ３２位のHis

【０００７】なお本明細書にけるアミノ酸表記は、次の
ような対応関係に基づいている。 アラニン A or Ala アルギニン R or Arg アスパラギン N or Asn アスパラギン酸 D or Asp システイン C or Cys グルタミン Q or Gln グルタミン酸 E or Glu グリシン G or Gly ヒスチジン H or His イソロイシン I or Ile ロイシン L or Leu リジン K or Lys メチオニン M or Met フェニルアラニン F or Phe プロリン P or Pro セリン S or Ser トレオニン T or Thr トリプトファン W or Trp チロシン Y or Tyr バリン V or Val

【０００８】本発明によるペプチドは天然のＢＮＰを免
疫原として得られる抗体との反応性を維持しているもの
が好ましい。免疫学的測定方法における標準物質、標識
抗原、および抗体作成用免疫原等としての利用を目的と
するペプチドであるから、アミノ酸の置換によって免疫
学的な特性が天然のＢＮＰと大きく相違しては意味が無
い。天然のＢＮＰを免疫原として得られる抗体とは、公
知の方法によって得ることができるモノクローナル抗体
およびポリクローナル抗体をさす。また本明細書におけ
る天然のＢＮＰとは、天然のＢＮＰと同じアミノ酸配列
を持つペプチドすべてを意味する。したがってヒトの組
織や体液から抽出されたＢＮＰのみならず、化学的に合
成されたもの、遺伝子組み換え技術によって得られたも
の等、その由来を問わずアミノ酸配列さえ一致しておれ
ば天然ＢＮＰと呼ぶ。本発明においては、天然ＢＮＰを
構成するアミノ酸の中から非特異吸着に主導的な役割を
はたす塩基性ペプチドのうち、できるだけ抗原性に影響
を与えない部位に限り天然の配列とは異なるアミノ酸に
置換することによって免疫学的な特性の維持と非特異吸
着の抑制とを満足するペプチドを得た。

【０００９】アミノ酸の置換にあたっては、天然のＢＮ
Ｐのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸、特に好ましくは
非塩基性のアミノ酸に置換するようにする。非塩基性の
アミノ酸とは、Asp、Asn、Glu、およびAla等である。で
きるだけ免疫学的な特性に変化を与えないようにアミノ
酸を置換するという目的からすれば、非塩基性アミノ酸
のうちでも天然の配列におけるアミノ酸と構造的に近い
ものを選択するのが好ましい。したがって、３位のLy
s、２７位のLys、３０位のArg、および３１位のArgに対
しては、Asp、Asn、およびGluから選択したアミノ酸を
置換するのが好ましい。また３２位のHisについては、A
laを置換してやるのが好ましい。なおこれらのアミノ酸
は全ての部位について置換を要求するものではない。し
たがって例えば配列番号１に示すペプチドのように、３
位のみを置換したものであっても十分に非特異吸着の抑
制という効果を得ることは可能である。このような条件
に基づいて実際に合成を試みたペプチドのうち特に天然
のＢＮＰと免疫学的相同性が高く、しかも非特異吸着を
起こしにくかったものについて、そのアミノ酸配列を配
列表の配列番号１−３に示した。ここで免疫学的な相同
性が高いとは、一方のペプチドを免疫原として得られた
抗体が、免疫原としたペプチドと他方のペプチドとに同
じ程度の反応性を示すことをいう。たとえば配列番号１
−３に示したペプチドの場合、天然ＢＮＰを免疫原とし
て得たポリクローナル抗体の、天然ＢＮＰと本発明によ
るペプチドとの交差性は１００%前後の値となりきわめ
て相同性が高いということができる。

【００１０】ただし必ずしもこのように高度な免疫学的
相同性を要求されるものではなく、用途によってはこれ
ほどの相同性は必要ではない。具体的には、たとえば標
準として利用する場合、たとえ３０%程度の交差性しか
持たなくても標準曲線が天然ＢＮＰで得られたものと平
行関係を維持しておれば実用上は大きな障害とならな
い。あらかじめ低い交差性を考慮して表示濃度よりも高
い濃度（すなわち４０%の交差性なら２．５倍量で用い
る）でペプチドを加えておけば、反応性が平行関係にあ
るかぎり標準としては大きな問題は生じない。他方、標
識抗原として利用するのであれば交差性は感度を確保す
る上で重要な条件となる。交差性の低いペプチドでは高
い感度を望めないので、少なくとも８０%程度の交差性
を維持したものを選択すると良い。なお本発明によるＢ
ＮＰ類似ペプチドは、天然ＢＮＰの免疫学的特性を維持
するかぎり、他のアミノ酸配列の中に含まれていても良
いし、あるいはその断片であってもかまわない。

【００１１】生体内ではＢＮＰは１０位と２６位のCys
がジスルフィド結合（以下ＳＳ結合と省略する）を形成
した環状構造をとっている。免疫学的特性をできるだけ
忠実に再現するためには、このＳＳ結合も再現すべきで
あることは言うまでもない。しかし環状構造を持たない
場合であっても免疫学的な活性を維持している場合も考
えられるので、必ずしも環状構造としなくともよい。あ
るいはＳＳ結合による環状構造を再現するための中間体
として利用するので、直鎖構造のペプチドであっても有
用である。もっともＳＳ結合は自然酸化によってもある
ていど形成されるものである。

【００１２】本発明のペプチドは公知のペプチド合成法
よって合成することができる。具体的には、適当に保護
したアミノ酸を固相合成法により順次縮合させる方法、
適当な断片を合成した後に各断片を縮合させる方法等を
挙げられる。いずれの場合でも、使用した保護基はトリ
フルオロ酢酸、フッ化水素、塩化水素／酢酸、燐酸等で
脱保護することができる。脱保護したペプチド溶液を希
釈し、中和後にかくはんする等の操作によって空気酸化
すれば１０位と２６位のCysがＳＳ結合を形成し環状構
造のペプチドを得ることができる。本発明のペプチドは
遺伝子工学技術を用いても合成することができる。大腸
菌、酵母、枯草菌、哺乳類細胞など公知の宿主とそれに
適した発現ベクターを用い、置換したアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡを発現させて目的のペプチドを得れば良
い。得られたペプチドは、抽出、分配、再沈澱、再結
晶、カラムクロマトグラフィー等の公知の方法により精
製する。

【００１３】本発明のペプチドは以下の実施例に示すよ
うに、天然のＢＮＰとほぼ同等な免疫特性を有するので
ＢＮＰの免疫学的測定に用いることができる。例えば競
合法に使用する標識抗原やサンドイッチ法での標準品と
してＢＮＰと同様に使用することができる。またＢＮＰ
に対する抗体を得るための免疫原として利用することが
できる。

【００１４】本発明によるＢＮＰ抗体作製用免疫原は、
本発明ペプチドまたはその断片を適当な担体と結合する
ことによって得ることができる。担体としては、サイロ
グロブリン、血清アルブミン、キーホールリンペットヘ
モシアニン等が知られている。免疫原は必要に応じてア
ジュバント等とともに混合し免疫に用いる。免疫原とし
ての本発明のペプチドの有用性は、第一にはやはり免疫
原調製段階における容器壁への非特異吸着による収率の
低下を防止できる点にある。その他、本発明のペプチド
を標識抗原や標準品等に用いる免疫学的測定方法におい
てより十分な反応性を期待できる点も天然ＢＮＰの配列
を用いる場合よりも有利である。

【００１５】本発明は、前記免疫原を用いた抗ＢＮＰ抗
体の作製方法を提供するものである。本発明による免疫
原を、マウス、ラット、ラビット、ヤギ、ヒツジ、およ
びニワトリ等、公知の免疫動物に投与することにより抗
ＢＮＰ抗体を得ることができる。免疫動物の血中や卵に
産生される抗ＢＮＰ抗体は、塩析、透析、イムノアフィ
ニティクロマトグラフィー等の操作によって分離すれば
良い。また免疫動物の抗体産生細胞を、細胞融合やＥＢ
Ｖによる形質転換法等を利用して不死化しクローニング
すれば、モノクローナル抗体を得ることも可能である。
なおモノクローナル抗体のスクリーニングにあたって
は、天然ＢＮＰとの反応性を指標として行うのが有利で
ある。本発明の抗ＢＮＰ抗体作製方法によって得られる
抗体は、そのままあるいは適当な手段で断片化し、公知
の方法で標識することによってＢＮＰの免疫学的測定方
法に利用することができる。標識としてはラジオアイソ
トープ、酵素、補酵素、発光物質、および蛍光物質等が
一般的である。これらの標識物質と抗体または抗体断片
の結合には、ＳＭＣＣ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、ＥＭＣ
Ｓ、等の二官能性試薬を利用すると便利である。あるい
は適当な担体に固定すれば、ＢＮＰを精製するためのア
フィニティリガンドとして、また免疫学的測定方法にお
ける固相化抗体として機能する。

【００１６】本発明のペプチドにより、ＢＮＰの免疫学
的測定方法における免疫測定用標準が提供される。本発
明のペプチドの一定量をそのまま溶液状態で、あるいは
凍結乾燥してＢＮＰの免疫測定用標準とすることができ
る。本発明によるＢＮＰの免疫測定用標準には、ペプチ
ドを安定化することを目的として適当な緩衝成分、安定
剤、防腐剤等を添加しても良い。安定剤にはＢＳＡやＨ
ＳＡ等が知られている。本発明のペプチドとしてＳＳ結
合を持つ環状構造のものを提供する時には、ＳＳ結合を
保護することを目的としてL-cystine等を添加するのが
有効である。防腐剤としては、アジ化ナトリウム等が挙
げられる。

【００１７】更に本発明のペプチドは、ＢＮＰの免疫学
的測定用試薬を提供するものである。本発明のペプチド
またはその断片を公知の標識方法によって標識すること
によって、ＢＮＰの免疫学的測定用試薬を得ることがで
きる。標識としてはラジオアイソトープ、酵素、補酵
素、発光物質、および蛍光物質等が一般的である。これ
らの標識物質とペプチドとの結合には、ＳＭＣＣ、Ｓｕ
ｌｆｏ−ＳＭＣＣ、ＥＭＣＳ等の二官能性試薬を利用す
ると便利である。本発明のペプチドは、Ｎ末端側のSer
に続けてチロシンを結合することができる。チロシンは
¹²⁵Ｉによる放射標識に利用できるアミノ酸であり、こ
のような構造とすることでラジオイムノアッセイ（以下
ＲＩＡと省略する）用の放射標識抗原を容易に得ること
ができる。チロシンの他にも、必要に応じて標識や免疫
原用担体と結合等を目的として任意のアミノ酸やペプチ
ドを結合しても良い。

【００１８】

【作用】本発明のペプチドは、天然のＢＮＰが持つ免疫
学的な特性を維持しつつ容器壁への非特異的な吸着を抑
制したものである。本発明のペプチドにより初めて実現
したペプチドそのものが非特異吸着を起こしにくいとい
う特徴によって、容器壁への非特異吸着に起因する測定
誤差の少ない免疫測定を実現できる。アミノ酸配列を適
宜改変することによってペプチドの特性を特定の利用目
的に有利な方向に誘導する技術は既に知られている。た
とえば特開平５−２８６９９７では、ヒト心房性ナトリ
ウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）のアミノ酸配列を改変する
ことによって合成の容易なペプチドを提供している。本
発明もアミノ酸配列を改変するという点では同じ技術に
属するが、非特異吸着というまったく相違する特性につ
いて応用を試みたものである。ＢＮＰが塩基性のアミノ
酸を多く含む配列を持つため、ガラス表面等に吸着し易
いことは理論的に説明できる。しかしながら非特異吸着
の原因となる塩基性アミノ酸を単に置換していくだけで
は、免疫学的な特性を変更してしまう危険性が非常に大
きい。本発明では、置換可能なアミノ酸の位置を特定
し、更には置換に好ましいアミノ酸を選択することによ
り、ＢＮＰの免疫学的特性に大きな影響を与えることな
く非特異吸着のみを効果的に抑制することを可能にし
た。以下、実施例によって本発明を詳細に説明する。

【００１９】

【実施例】

実施例１．本発明のペプチドの合成１ 配列番号１に示すアミノ酸配列を持つ本発明によるペプ
チドを合成した。ペプチド合成装置（日本ミリポア社
バイオサーチ model9600）を使用し、Ｆｍｏｃ Ｂｏ
ｐ固相合成法に基づいて本発明のペプチドを合成した。
市販の０.２７mmoleのFmoc-His(Trt)-Alko resin樹脂
（渡辺化学工業製）に以下の保護アミノ酸（渡辺化学工
業製）０.２７mmoleを順に縮合反応させて、保護基を有
する本発明のペプチド（配列番号１）を得た。 Fmoc-Arg(Pmc) Fmoc-Arg(Pmc) Fmoc-Leu Fmoc-Val Fmoc-Lys(Boc) Fmoc-Cys(Trt) Fmoc-Gly Fmoc-Leu Fmoc-Gly Fmoc-Ser(tBu) Fmoc -Ser(tBu) Fmoc-Ser(tBu) Fmoc-Ser(tBu) Fmoc-Ile Fmoc-Arg(Pmc) Fmoc-Asp(otBu) Fmoc-Met Fmoc-Lys(Boc) Fmoc-Arg(Pmc) Fmoc-Gly Fmoc-Phe Fmoc-Cys(Trt) Fmoc-Gly Fmoc-Gly Fmoc-Asp(otBu) Fmoc-Asn OPfp ester Fmoc-Val Fmoc-Met Fmoc-Asn OPfp ester Fmoc-Pro Fmoc-Ser(tBu) 得られた保護基を有するペプチド樹脂を減圧下で乾燥
し、適当量のTFA,Thioanisol,Ethandithiol,m-Cresol
（１０：０.５６：０.３４：０.２２）を使用して脱保
護（室温、４時間）し、樹脂からペプチドを切り出し
た。ついでアルゴンガスで封入し、冷ジエチルエーテル
中に反応液を滴下して粗ペプチドを析出させた。エーテ
ルで洗浄後、精製水に溶解して凍結真空乾燥した。０．
０５MのN-ethylmorpholine acetate１００μlに１００
−３００μgの粗ペプチドを加えた。更にＤＴＴを最終
濃度０.００５Mになるように添加して室温下、４時間反
応後、ＴＦＡを添加してｐＨ３とした。この内の一部を
マイクロボンダスフェアー（日本ウオーターズ社製、１
５μＣ１８）１.８×３０cmのカラムに吸着させ、アセ
トニトリル濃度を０−６０%まで直線的に変化させつつ
毎分１mlの速度で送液し、２２０nmの紫外吸収で検出さ
れる主ペプチドピーク部分を分取し、凍結真空乾燥によ
り配列番号１に示すアミノ酸配列を持つ本発明のペプチ
ド１を得た。なおこの段階で合成ペプチドは既に空気酸
化されてＳＳ結合を形成した環状構造となっている。得
られたペプチドのアミノ酸組成分析を行ったところ表１
に示すように理論値に良く一致する結果が得られ、目的
のペプチドが合成できていることを確認した。

【表１】

【００２０】実施例２．本発明のペプチドの合成２ ０.２７mmoleのFmoc-Ala-Alko resin樹脂を用い、以下
の保護アミノ酸を用いる他は１と同じ操作によって保護
基を有する本発明のペプチド（配列番号２）を得た。 Fmoc-Glu(otBu) Fmoc-Glu(otBu) Fmoc-Leu Fmoc-Val Fmoc-Glu(otBu) Fmoc-Cys(Trt) Fmoc-Gly Fmoc-Leu Fmoc-Gly Fmoc-Ser(tBu) Fmoc -Ser(tBu) Fmoc-Ser(tBu) Fmoc-Ser(tBu) Fmoc-Ile Fmoc-Arg(Pmc) Fmoc-Asp(otBu) Fmoc-Met Fmoc-Lys(Boc) Fmoc-Arg(Pmc) Fmoc-Gly Fmoc-Phe Fmoc-Cys(Trt) Fmoc-Gly Fmoc-Ser(tBu) Fmoc-Gly Fmoc-Gln OPfp ester Fmoc-Val Fmoc-Met Fmoc-Lys(Boc) Fmoc-Pro Fmoc-Ser(tBu) 上記で得られた保護基を有するペプチド樹脂を１と同じ
操作によって脱保護し、配列番号２に示すアミノ酸配列
を持つ本発明のペプチド２を得た。このペプチドのアミ
ノ酸組成分析を行ったところ表２に示すように理論値に
良く一致する結果が得られ、目的のペプチドが合成でき
ていることを確認した。

【表２】

【００２１】実施例３．本発明のペプチドの合成３ 以下の保護アミノ酸を用いる他は２と同じ操作によって
保護基を有する本発明のペプチド（配列番号３）を得
た。 Fmoc-Asp(otBu) Fmoc-Asp(otBu) Fmoc-Leu Fmoc-Val Fmoc-Asp(otBu) Fmoc-Cys(Trt) Fmoc-Gly Fmoc-Leu Fmoc-Gly Fmoc-Ser(tBu) Fmoc -Ser(tBu) Fmoc-Ser(tBu) Fmoc-Ser(tBu) Fmoc-Ile Fmoc-Arg(Pmc) Fmoc-Asp(otBu) Fmoc-Met Fmoc-Lys(Boc) Fmoc-Arg(Pmc) Fmoc-Gly Fmoc-Phe Fmoc-Cys(Trt) Fmoc-Gly Fmoc-Ser(tBu) Fmoc-Gly Fmoc-Gln OPfp ester Fmoc-Val Fmoc-Met Fmoc-Asp(otBu) Fmoc-Pro Fmoc-Ser(tBu) 上記で得られた保護基を有するペプチド樹脂を１と同じ
操作によって脱保護し、配列番号３に示すアミノ酸配列
を持つ本発明のペプチド３を得た。このペプチドのアミ
ノ酸組成分析を行ったところ表３に示すように理論値に
良く一致する結果が得られ、目的のペプチドが合成でき
ていることを確認した。

【表３】

【００２２】実施例４．本発明によるＢＮＰ様ペプチド
と天然ＢＮＰの交差率 実施例１−３で得た本発明のペプチドと、同じく化学的
に合成した天然のＢＮＰと同じ配列を持つＢＮＰペプチ
ドとの間の免疫学的な交差率を、ＲＩＡにより調査し
た。 ４（ａ）¹²⁵Ｉ標識ペプチド 天然ＢＮＰ、または実施例１で得た本発明のペプチド１
のＮ末端に酵素法によってＬ−チロシンを結合した。チ
ロシン化したペプチド１の１０μgを酵素法により４０M
BqのＮａ¹²⁵Ｉで標識し、反応溶液（０．５%ＢＳＡ，
０．１%ＮａＮ₃を含む５０mMりん酸緩衝液ｐＨ７．４）
で１８０００cpm/100μlになるように希釈して¹²⁵Ｉ標
識ペプチドとした。 ４（ｂ）ペプチド標準液 実施例１−３で得た本発明のＢＮＰ様ペプチド１、２、
および３を反応溶液に溶解し、０−５２０pg/mlの標準
溶液を作製した。同様に天然のものと同じアミノ酸配列
を持つ合成ＢＮＰペプチド（以下天然ＢＮＰと呼ぶこと
もある、ペプチド研究所製）を反応溶液に溶解し、０−
５２０pg/mlの標準溶液を作製した。 ４（ｃ）抗体 サイログロブリンとカルボジイミドを一定量混ぜ、更に
天然ＢＮＰ、または本発明のＢＮＰ様ペプチド１を添加
して４時間４℃で反応後、更に２時間室温で反応させ
た。sephadex G-50を用いたゲルろ過で得られるサイロ
グロブリン結合ペプチドを免疫原とした。この免疫原１
００μgを等量のＦＣＡに懸濁させてウサギに免疫し
た。１回目の免疫から３週間後に同じ免疫原で追加免疫
し、抗体価の上昇を確認したところで全採血した。得ら
れた血清分画を反応溶液で２００００倍に希釈して抗天
然ＢＮＰ抗体、あるいは抗ＢＮＰ様ペプチド１抗体とし
た。一方第２抗体である抗ウサギＩｇＧ山羊血清は、市
販品（芝山羊製）を反応溶液で２０倍に希釈して使用し
た。 ４（ｄ）ＲＩＡ 各ペプチド標準液または血漿検体１００μlに抗天然Ｂ
ＮＰ抗体、または抗ＢＮＰ様ペプチド１抗体１００μl
を加え、２０時間、４℃で反応させた後、¹²⁵Ｉ標識Ｂ
ＮＰ様ペプチドを加えて２０時間、４℃で反応させた。
反応後に抗ウサギＩｇＧ山羊血清を１００μl加えて３
０分間反応させ、３０００rpmで３０分間の遠心分離に
より回収した沈でんの放射能量をウエル型シンチレーシ
ョンカウンターで測定した。

【００２３】４（ｅ）標準曲線の作成 上記ＲＩＡを用いてＢＮＰ様ペプチド標準液及びＢＮＰ
標準液（いずれも０−５２０pg/ml）を測定し、表４・
表８（天然ＢＮＰ）、表５・表９（配列番号１）、表６
・表１０（配列番号２）、および表７・表１１（配列番
号３）の結果を得た。免疫原、ならびに標識抗原として
アミノ酸を１つ置換した本発明ペプチド１を用た場合で
あっても、いずれのペプチドにおいてもほぼ共通の標準
曲線を得られ、各ペプチド間の免疫学的な交差性が非常
に高いことが確認された。なお本実施例によって得られ
た抗ＢＮＰ様ペプチド１抗体による標準曲線を図１に示
した。

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【００２４】４（ｆ）未知検体の測定 ３種の血漿検体Ａ、Ｂ、およびＣを上記ＲＩＡで測定
し、４（ｅ）で作成したＢＮＰ様ペプチド１による標準
曲線（表５から作製）及びＢＮＰによる標準曲線（表４
から作製）から測定値を求め、表１２に示す結果を得
た。いずれの検体においても標準曲線を得たペプチドの
間で測定値が一致しており、本発明のペプチドがいずれ
もＢＮＰの標準として利用可能なことが確認された。

【表１２】

【００２５】４（ｇ）交差率の計算 表５−７、または表９−１１に示した本発明のＢＮＰ様
ペプチドの各濃度で得られたカウント数を、天然のＢＮ
Ｐで得た標準曲線（表４と表８から作製）にあてはめて
濃度値に換算し表１３、および表１４に示す結果を得
た。いずれのペプチドにおいても９０−１００%という
高い交差率が得られた。表中の交差率は、つぎの式によ
って求めたものである。 表１３：交差率＝（表５−７のカウント数から表４の標
準曲線により求めた測定値）／（実際の濃度）×１００
% 表１４：交差率＝（表９−１１のカウント数から表８の
標準曲線により求めた測定値）／（実際の濃度）×１０
０% これらの結果から本発明によるペプチドは、免疫原、標
識抗原、標準のいずれの用途においても、免疫学的には
天然のＢＮＰと同じように挙動することを確認した。

【表１３】

【表１４】

【００２６】実施例５．吸着の影響 本発明のＢＮＰ様ペプチドが、天然のＢＮＰと同じ配列
を持つペプチドに比較して非特異吸着を起しにくいこと
を確認するために次のような実験を行った。実施例１−
３で得た本発明のペプチド１、２、および３、または天
然ＢＮＰで作製した標準溶液（５２０−８．１pg/ml）
をガラスチューブにそれぞれ５００μl分注した。４℃
で４時間放置後、それぞれの免疫活性を測定し、表１５
の結果を得た。天然のＢＮＰにおいては、いずれの濃度
でも４時間以内に２０−３０%の吸着が観察されるが、
本発明のペプチドでは吸着量が１０%以下に抑制されて
いる。なお表中には４時間までのデータしか記載してい
ないが、４時間以降はいずれのペプチドでも吸着量に大
きな変動が観察されなかった。

【表１５】

【００２７】

【発明の効果】本発明のペプチドは、天然のＢＮＰに特
有のガラスや合成樹脂容器に非特異的に吸着し易いとい
う特性を効果的に抑制した。天然のＢＮＰが吸着抑制剤
を利用しない場合に４時間でガラスチューブに３０%も
吸着するのに対して、本発明のペプチドはほとんど吸着
しない。しかも本発明よって提供される新規なペプチド
は、天然のＢＮＰの免疫学的特性を維持しつつ非特異的
な吸着のみを抑制しているので、ＢＮＰの免疫学的な測
定においてヒト天然ＢＮＰとまったく同様に利用するこ
とができる。たとえば本発明のペプチドを標識抗原とし
て利用すれば、測定中の非特異的な吸着が抑制されるの
で、競合法による測定時の負誤差を効果的に抑制するこ
とができる。また本発明のペプチドをＢＮＰの標準とし
て用いた時には、容器等による吸着がおこりにくいので
表示濃度が保証されるという効果とともに、競合法にお
ける負誤差、サンドイッチ法における正誤差の原因を取
り除くことができる。

【００２８】本発明のペプチドは化学合成によって容易
に得ることができる。また主反応である免疫学的な反応
に影響を及ぼしかねない非特異反応の防止用添加物につ
いての検討を省き、容易にＢＮＰの免疫測定用試薬を調
製することが可能となる。更に、本発明によって提供さ
れるＢＮＰの免疫学的測定方法によれば、前記の非特異
吸着を起こしにくい新規なペプチドを利用するので、免
疫学的反応を抑制する可能性の有る成分を添加すること
なく反応系を構成することが可能である。したがって、
非特異吸着が低下することによる測定値の信頼性の向上
に合せて、反応を妨害する可能性の有る成分を添加する
必要が無くなることによって感度の向上をも期待するこ
とができる。本発明によるペプチドは、ＢＮＰの免疫学
的特性を高度に維持しているので、標準や標識抗原のみ
ならず特異抗体を得るための免疫原としてしての利用も
可能である。本発明によるペプチドは容器壁等への非特
異的な吸着を起しにくいので免疫原として利用する時に
も操作性が向上する。

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：３２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：合成 他の情報：ＢＮＰ−３２と免疫学的に相同なペプチド 配列 Ser Pro Asn Met Val Asn Asp Gly Gly Cys 10 Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser 20 Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg 30 Arg His 配列番号：２ 配列の長さ：３２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：合成 他の情報：ＢＮＰ−３２と免疫学的に相同なペプチド 配列 Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys 10 Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser 20 Ser Ser Gly Leu Gly Cys Glu Val Leu Glu 30 Glu Ala 配列番号：３ 配列の長さ：３２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：合成 他の情報：ＢＮＰ−３２と免疫学的に相同なペプチド 配列 Ser Pro Asp Met Val Gln Gly Ser Gly Cys 10 Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser 20 Ser Ser Gly Leu Gly Cys Asp Val Leu Asp 30 Asp Ala 配列番号：４ 配列の長さ：３２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：合成 他の情報：ＢＮＰ−３２ 配列 Ser Pro LYS Met Val Gln Gly Ser Gly Cys 10 Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser 20 Ser Ser Gly Leu Gly Cys LYS Val Leu Arg 30 Arg His

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、抗ＢＮＰ様ペプチド１抗体と各種ペプ
チドによって得られた標準曲線である。

Claims (21)

【整理番号】Ｐ−０００２９１ 【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトＢＮＰのアミノ酸配列中、次の群から
   選択された少なくとも１つの部位を天然のアミノ酸配列
   とは異なるアミノ酸で置換した配列を含むペプチド、ま
   たはその断片 ３位のLys、 ２７位のLys、 ３０位のArg、 ３１位のArg、および３２位のHis
2. 【請求項２】置換後のアミノ酸が、非塩基性アミノ酸で
   ある請求項１のペプチド
3. 【請求項３】３位のLysを、Asn、Asp、Gluから選択した
   アミノ酸に置換した請求項１または２のペプチド
4. 【請求項４】２７位のLysを、Asn、Asp、Gluから選択し
   たアミノ酸に置換した請求項１または２のペプチド
5. 【請求項５】３０位のArgを、Asn、Asp、Gluから選択し
   たアミノ酸に置換した請求項１または２のペプチド
6. 【請求項６】３１位のArgを、Asn、Asp、Gluから選択し
   たアミノ酸に置換した請求項１または２のペプチド
7. 【請求項７】３２位のHisを、Alaに置換した請求項１ま
   たは２のペプチド
8. 【請求項８】アミノ酸配列が配列番号１、２、および３
   から選択される請求項１または２のペプチド
9. 【請求項９】請求項１−８のいずれかのペプチドのＮ末
   端に更にチロシンを付加したペプチド
10. 【請求項１０】請求項１−９のいずれかのペプチドの１
    ０位と２６位のCysが分子内ジスルフィド結合を形成
    し、環状構造となっているペプチド
11. 【請求項１１】ペプチドが天然のヒトＢＮＰを免疫原と
    して得られる抗体との反応性を維持している請求項１−
    １１のいずれかのペプチド
12. 【請求項１２】請求項１１のペプチドを含むヒトＢＮＰ
    抗体作製用免疫原
13. 【請求項１３】請求項１２のヒトＢＮＰ抗体作製用免疫
    原を動物に投与する抗ヒトＢＮＰ抗体作製方法
14. 【請求項１４】抗体がモノクローナル抗体である請求項
    １３の抗ヒトＢＮＰ抗体作製方法
15. 【請求項１５】請求項１２のヒトＢＮＰ抗体作製用免疫
    原を動物に投与して得た抗ヒトＢＮＰ抗体
16. 【請求項１６】抗体がモノクローナル抗体である請求項
    １５の抗ヒトＢＮＰ抗体
17. 【請求項１７】請求項１−１０のいずれかのペプチドを
    含むヒトＢＮＰの免疫測定用標準
18. 【請求項１８】請求項１−１０のいずれかのペプチドを
    標識したヒトＢＮＰの免疫学的測定用試薬
19. 【請求項１９】請求項１−１０のいずれかのペプチドを
    標識抗原、または標準品として用いるヒトＢＮＰの免疫
    学的測定方法
20. 【請求項２０】ヒトＢＮＰまたはその断片のアミノ酸配
    列中、次の群から選択された少なくとも１つの部位を天
    然のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸で置換することに
    より、天然のヒトＢＮＰを免疫原として得られる抗体と
    の反応性を維持しながら非特異吸着を抑制する方法 ３位のLys、 ２７位のLys、 ３０位のArg、 ３１位のArg、および３２位のHis
21. 【請求項２１】アミノ酸を置換したＢＮＰが、標識され
    ている請求項２０の非特異吸着を抑制する方法