JPH07223972A - 反応性小胞体、小胞体修飾剤および製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アミノ基と容易に反応するオキシカルボニル
イミダゾール基を有するポリオキシアルキレン鎖がリポ
ソームの外表面にのみ結合し、内表面には存在しない反
応性リポソームを得る。 【構成】 アミノ基を有するリン脂質を膜形成成分とし
て含むリポソームに、下式で表わされるポリアルキレン
オキシド誘導体を反応させる。 【化１】 （ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎは１〜
１０００、Ｒ¹、Ｒ²はＨまたはメチル基）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、反応性小胞体、これを
製造するための小胞体修飾剤、および反応性小胞体の製
造方法に関する。さらに詳しくは医薬の運搬体、検査
薬、診断薬、アジュバント、センサー、固定化触媒、バ
イオリアクター、バイオエレクトロニクス素子、マイク
ロカプセル代替品など、種々の機能性リポソームまたは
脂肪乳剤等として有用な反応性小胞体、これを製造する
ための小胞体修飾剤、および反応性小胞体の製造方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】リポソームはリン脂質の二分子膜からな
る小胞体であり、多分野での応用が試みられている。特
に、医薬運搬体、診断・検出用のセンサーなどへの応用
が注目されているが、リポソーム外表面上または膜中に
機能性物質を固定して各種機能をもたせること、および
リポソームの血中濃度を維持することなどが大きな課題
となっている。

【０００３】従来、リポソーム外表面上または膜中への
機能性物質の固定化に関しては、プルラン誘導体で被覆
したリポソームの外表面上の多糖上に置換したアミノエ
チルカルバミルメチル基にγ−マレイミドブチルオキシ
サクシニミジルを介して抗体フラグメントを結合させる
方法（Biochem. Biophys. Acta., 898, 323(1987)）、
あるいはあらかじめリポソーム膜形成成分中に糖脂質を
加えておき、リポソーム形成後過よう素酸酸化を行い、
生じたアルデヒド基と抗体とを反応させて固定化する方
法（J. Biol. Chem., 255, 10509(1980)）などがある。

【０００４】しかし、これらの従来法では、リポソーム
調製後にリポソーム膜外表面上での多段階の化学反応を
行う必要があり、このため目的とする機能性物質の導入
量が低く制限され、また反応による副生成物や不純物が
混入し、リポソーム膜へのダメージが大きいなどの問題
点がある。

【０００５】一方、リポソームを生体内へ投与したと
き、その多くは肝臓、脾臓などの網内系器官で捕捉され
るため、十分な効果が得られないことが指摘されている
（Cancer Res., 43, 5328(1983)）。そこで、この網内
系器官で捕捉されてしまう問題点や、リポソームに封入
した薬剤のもれ防止、あるいはリポソーム自身の崩壊性
・凝集性など安定性の低さに関する問題点を改善する方
法として、リポソームの外表面にポリエチレングリコー
ル鎖を導入することが試みられている（例えば、特開平
１−２４９７１７号公報、FEBS letters, 268, 235(199
0)）。また、ポリエチレングリコールで修飾されたリポ
ソームは、長期間にわたり血液中濃度を維持できること
が明らかになっている（Biochem. Biophys. Acta., 106
6, 29-36(1991)）。しかし、このような方法により得ら
れるポリエチレングリコール鎖の導入されたリポソーム
は機能性物質と反応しないので、リポソーム外表面上に
機能性物質を固定化することはできない。

【０００６】さらに、米国特許第４４８３９２９号に
は、抗体を化学結合により担持した抗体担持リポソーム
が開示されている。この抗体担持リポソームは、反応活
性基としてオキシカルボニルイミダゾール基を有する糖
脂質を膜形成成分とする反応性リポソームと抗体とを反
応させることにより得られる。

【０００７】しかし、この抗体担持リポソームでは、リ
ポソームの内表面（内側）にも反応活性を有するオキシ
カルボニルイミダゾール基が存在することになり、この
ためこのようなリポソームをドラッグデリバリーシステ
ム（ＤＤＳ）用の医薬運搬体などとして用いた場合、生
体内でリポソームが崩壊した際内側に存在していたオキ
シカルボニルイミダゾール基が生体内のタンパク質など
と反応し、副作用や毒性を起こすなどの危険性がある。
またリポソームに封入した医薬と内側のオキシカルボニ
ルイミダゾール基とが反応し、期待される医薬効果が得
られないなどの問題点もある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
問題点を解決するため、アミノ基などの官能基と容易に
反応する反応活性基を先端に有する（ポリ）オキシアル
キレン鎖が小胞体の外表面（外側）にのみ存在し、内側
には反応活性基が存在しない反応性小胞体、これを製造
するための小胞体修飾剤、および反応性小胞体の製造方
法を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は次の反応性小胞
体、小胞体修飾剤、および反応性小胞体の製造方法であ
る。 （１）アミノ基を有するリン脂質を小胞体形成成分とし
て含む小胞体において、小胞体の外表面に存在する前記
アミノ基のウレタン結合により、一般式〔１〕

【化４】 〔式中、Ｒ¹は水素原子またはメチル基、ＡＯは炭素数
２〜４のオキシアルキレン基、ｎはオキシアルキレン基
の平均付加モル数で、１〜１０００の正数を表わす。ｎ
が２以上の場合、オキシアルキレン基は同一でも異なっ
ていてもよく、またランダム状に付加していても、ブロ
ック状に付加していてもよい。〕で表わされる反応活性
基を有する（ポリ）オキシアルキレン鎖が、小胞体の外
表面にのみ結合した反応性小胞体であって、一般式
〔２〕

【化５】 〔式中、Ｒ¹、ＡＯおよびｎは前記一般式〔１〕と同じ
である。Ｌｉｐ−ＮＨ−はアミノ基を有するリン脂質を
小胞体形成成分として含む小胞体を示す。〕で表わされ
る構造を有することを特徴とする反応性小胞体。 （２）一般式〔３〕

【化６】 〔式中、Ｒ¹およびＲ²は水素原子またはメチル基を表わ
し、同一でも異なっていてもよい。ＡＯおよびｎは前記
一般式〔１〕と同じである。〕で表わされる（ポリ）ア
ルキレンオキシド誘導体からなることを特徴とする上記
（１）記載の反応性小胞体製造用の小胞体修飾剤。 （３）アミノ基を有するリン脂質を小胞体形成成分とし
て含む小胞体に、上記（２）記載の小胞体修飾剤を反応
させることを特徴とする上記（１）記載の反応性小胞体
の製造方法。

【００１０】本発明において、「（ポリ）オキシアルキ
レン」はｎが１のオキシアルキレンまたはｎが２以上の
ポリオキシアルキレンを意味する。また「（ポリ）アル
キレン」も上記と同様にアルキレンまたはポリアルキレ
ンを意味する。

【００１１】本発明において小胞体とは、小胞体形成成
分の親水基が界面の水相に向って配向した構造を有する
粒子を意味する。本発明においては、小胞体はアミノ基
を有するリン脂質を小胞体形成成分として含有している
ので、反応性小胞体を製造する前の小胞体には、外表面
にアミノ基が存在している。小胞体の具体的なものとし
ては、二分子膜からなる閉鎖小胞であるリポソーム、植
物油およびリン脂質などの混合物が乳化された脂肪乳
剤、またはミセルなどがあげられる。

【００１２】本発明の反応性小胞体は、一般式〔１〕で
表わされる反応活性を有する鎖が、小胞体の外表面にの
み結合した小胞体であり、内側または内表面（以下、両
者をまとめて内側という）には反応活性を有する鎖は結
合していない。反応活性を有する鎖は、一般式〔２〕に
示されているように、ウレタン結合（−ＮＨＣ（＝Ｏ）
Ｏ−）により小胞体の外表面にのみ結合している。

【００１３】一般式〔１〕〜〔３〕のＡＯで表わされる
オキシアルキレン基は、炭素数２〜４のオキシアルキレ
ン基であり、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、
オキシトリメチレン基、オキシ−１−エチルエチレン
基、オキシ−１，２−ジメチルエチレン基、オキシテト
ラメチレン基などがあげられる。これらのオキシアルキ
レン基は、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、オ
キセタン、１−ブテンオキシド、２−ブテンオキシド、
テトラヒドロフランなどのアルキレンオキシドを付加重
合させた基である。一般式〔１〕〜〔３〕のｎはオキシ
アルキレン基の平均付加モル数を表わし、１〜１００
０、好ましくは１０〜３００、さらに好ましくは２０〜
１２０の正数である。

【００１４】ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基の
種類は同一のものでも、異なるものでもよい。後者の場
合、ランダム状に付加していても、ブロック状に付加し
ていてもよい。親水性を付与する場合、ＡＯとしてはエ
チレンオキシドが単独で付加したものが好ましく、この
場合、ｎが１０以上のものが好ましい。また種類の異な
るアルキレンオキシドが付加している場合、エチレンオ
キシドが２０モル％以上、好ましくは５０モル％以上付
加しているのが望ましい。（ポリ）アルキレンオキシド
鎖に親油性を付与する場合はエチレンオキシド以外の付
加モル数を多くする。

【００１５】一般式〔１〕〜〔３〕において、オキシカ
ルボニルイミダゾール基部分はアミノ基、水酸基または
チオール基などの官能基、特に第１級アミノ基に対して
高い反応性を有している反応活性基部分である。このた
め本発明の反応性小胞体は、小胞体の外表面において、
（ポリ）オキシアルキレン鎖の先端に上記官能基を有す
る機能性物質を、容易に共有結合により結合させること
ができる。

【００１６】本発明の反応性小胞体は、アミノ基を有す
るリン脂質を小胞体形成成分として含む小胞体に、一般
式〔３〕で表わされる小胞体修飾剤を反応させることに
より製造することができる。アミノ基を有するリン脂質
としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファ
チジルセリンまたはホスファチジルスレオニンなどがあ
げられ、一種単独で、または二種以上組合せて使用でき
る。これらのリン脂質としては、２つの脂肪酸エステル
部位に炭素数４〜３０、好ましくは８〜１８の飽和また
は不飽和の脂肪酸を有するものが望ましく、天然または
合成のいずれのものでもよい。具体的には、ジミリスト
イルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイル
ホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホス
ファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファ
チジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、
ジステアロイルホスファチジルセリン、ジミリストイル
ホスファチジルスレオニン、ジパルミトイルホスファチ
ジルスレオニン、ジステアロイルホスファチジルスレオ
ニンなどがあげられる。

【００１７】小胞体形成成分としては、アミノ基を有す
るリン脂質の他にも小胞体を形成しうる他の化合物も使
用でき、例えば大豆レシチン、卵黄レシチン、その他の
リン脂質類、コレステロール、イントラリピッド（大塚
製薬（株）、商標）、大豆油、サフラワー油など、従来
から小胞体の形成成分として用いられているものが使用
できる。また小胞体としては上記イントラリピッドのよ
うな脂質混合乳化物を使用することもできる。

【００１８】全小胞体形成成分中に占めるアミノ基を有
するリン脂質の割合は、通常０．０１〜１００モル％と
するのが好ましく、アミノ基の有するリン脂質の割合を
多くするほど、一般式〔１〕で表わされる反応活性を有
する鎖の量を多くすることができる。これにより小胞体
の外表面に存在する反応活性を有する鎖の量を所望の値
に調節することができる。

【００１９】小胞体と一般式〔３〕で表わされる小胞体
修飾剤との反応は、水系溶媒、例えば蒸留水、生理的食
塩水のほかリン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、
酢酸緩衝液など種々の緩衝液中で、ｐＨ１〜１２、好ま
しくはｐＨ３〜１０、反応温度０〜１００℃、好ましく
は０〜４０℃で、反応時間３０分間〜１６８時間、好ま
しくは１時間〜２４時間の条件で行うことができる。こ
のようにして反応させることにより、小胞体外表面のア
ミノ基と小胞体修飾剤のオキシカルボニル基部分とが反
応してウレタン結合を形成し、一般式〔１〕で表わされ
る反応活性を有する鎖が小胞体外表面に導入され、一般
式〔２〕で表わされる構造を有する反応性小胞体が得ら
れる。

【００２０】アミノ基を有するリン脂質としてホスファ
チジルエタノールアミンを用いた場合のリポソームと小
胞体修飾剤とから反応性リポソームを製造する反応式は
次の〔４〕式で示される。式中、Ｌｉｐはホスファチジ
ルエタノールアミンを含むリポソームを示す。Ｒ¹、
Ｒ²、ＡＯ、ｎは前記と同じものを示す。

【化７】

【００２１】このようにして得られた本発明の反応性小
胞体は、ゲルろ過、透析、限外ろ過などにより容易に単
離・精製することができる。なお条件によっては、小胞
体同士が架橋された架橋小胞体が生じる場合もあるが、
この場合には必要に応じて、ゲルろ過、または適当なポ
アサイズを有するメンブランフィルターなどを使用する
ことにより、容易に分別することができる。

【００２２】このように本発明の製造方法では、調製済
みの小胞体に、後から反応活性を有する鎖を導入してい
るので、小胞体の外表面にのみ反応活性を有する鎖が存
在し、内側には存在しない反応性小胞体が得られる。

【００２３】本発明の小胞体修飾剤は、例えば両末端に
水酸基を有する（ポリ）アルキレングリコールとＮ，
Ｎ′−カルボニルジイミダゾール（以下、ＣＤＩと略
す）またはＮ，Ｎ′−カルボニルジ（２−メチルイミダ
ゾール）とを反応させることにより製造することができ
る。（ポリ）アルキレングリコールとＣＤＩとの仕込モ
ル比は、１：０．１〜１：１０、好ましくは１：０．５
〜１：４とするのが望ましい。

【００２４】反応は無溶媒または１，４−ジオキサン、
テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ベンゼンなどの
有機溶媒中で、反応温度−１００〜＋１００℃、好まし
くは０〜４０℃で、反応時間１０分間〜１６８時間、好
ましくは３０分間〜１２時間の条件で容易に行うことが
できる。得られた反応混合物は、精製することなくその
ままで、あるいは再沈殿、カラム、ゲルろ過、限外ろ
過、透析などの方法により単離・精製した後、小胞体修
飾剤として使用される。

【００２５】次にそれぞれの反応性小胞体について詳し
く説明する。まず代表的な反応性小胞体である反応性リ
ポソームについて説明する。本発明に係る反応性リポソ
ームは膜を構成するいちばん外側の膜の外表面にのみ一
般式〔１〕で表わされる反応活性を有する鎖が存在し、
それ以外には存在しない反応性リポソームである。

【００２６】反応性リポソームを構成する膜形成成分
（小胞体形成成分）としては、前記アミノ基を有するリ
ン脂質の他に、従来からリポソームの膜形成成分として
用いられているものが制限なく使用できる。具体的に
は、ジホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、
ホスファチジルイノシトール、大豆レシチン、卵黄レシ
チン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロ
ール等のリン脂質および脂肪酸部に不飽和基を有する重
合性リン脂質；スルホキシリボシルジグリセリド、ジガ
ラクトシルジグリセリド、ラクトシルジグリセリド等の
糖脂質類；コレステロール等の非極性脂質；その他に
は、非イオン性界面活性剤、ホスファチジルポリエチレ
ングリコール、「Biochem. Biophys. Acta., 1066, 29-
36(1990)」に記載されているホスファチジルエタノール
アミンとポリエチレングリコールとの反応物、およびこ
れらの混合物などがあげられる。

【００２７】全膜形成成分中に占めるアミノ基を有する
リン脂質の割合は、通常前記範囲で用いられるが、０．
１〜５０モル％とするのが好ましい。０．０１モル％未
満の場合、リポソーム外表面に存在する一般式〔１〕で
表わされる反応活性を有する鎖の導入量が少なくなり、
このためリポソーム外表面に共有結合させる機能性物質
の量が少なくなるので好ましくない。

【００２８】小胞体修飾剤と反応させる前のリポソーム
は、膜形成成分を有機溶媒等の適当な溶媒に溶解し、エ
クスツルージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波
法、界面活性剤除去法、逆層蒸発法、エタノール注入
法、プレベシクル法、フレンチプレス法、Ｗ／Ｏ／Ｗエ
マルジョン法、アニーリング法、凍結融解法など、種々
の公知の方法によりリポソーム化することにより製造す
ることができる。また、これらの製造法を選択すること
により、多重層リポソーム、小さな一枚膜リポソーム、
大きな一枚膜リポソームなど、種々の大きさや形態を有
するリポソームを製造することができる。このような方
法により、リポソームの外表面および内側にアミノ基が
存在するリポソームが得られる。

【００２９】リポソームの内部には、一般のリポソーム
と同様に種々の物質を公知の方法により封入することが
可能である。被封入物質としては、例えば色素、染料、
放射線ラベル化合物、蛍光化合物、化学発光化合物等の
標識物質；光応答性化合物、ｐＨ応答性化合物、熱応答
性化合物、電極反応性化合物等の外部刺激反応性化合
物；酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、糖タ
ンパク質、糖脂質、ホルモン等の生理活性物質；医薬；
ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチ
レングリコール、ヒアルロン酸等の水溶性高分子類；ホ
スファチジルセリン等のリン脂質；これらの混合物など
があげられる。

【００３０】上記のようなリポソームと一般式〔３〕で
表わされる小胞体修飾剤とを前記のようにして反応させ
ることにより、反応性リポソームが得られる。この場
合、全反応溶液中のリポソームの濃度は、固形分量とし
て０．００１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１
〜１００ｍｇ／ｍｌとするのが望ましく、また小胞体修
飾剤の濃度は特に限定されないが、０．００１〜１００
０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜５００ｍｇ／ｍｌ
とするのが望ましい。小胞体修飾剤の使用量が上記下限
値より少ない場合、得られた反応性リポソームは外表面
に共有結合させる機能性物質の量が少なくなるので好ま
しくない。一方、上限値を超えると反応溶液の粘度が高
くなり、リポソームの安定性が低下するため好ましくな
い。

【００３１】なお、リポソーム外表面のアミノ基の全量
を小胞体修飾剤と反応させる必要がない場合には、アミ
ノ基ブロック化剤、例えば片末端には反応性基を持た
ず、もう片末端にのみアミノ基に対する反応性基を有す
る（ポリ）アルキレンオキシド誘導体、具体的にはサン
プライドＶＥＭ４１０１（日本油脂（株）製品、商
標）、メトキシポリエチレングリコールオキシカルボニ
ルイミダゾール、または小胞体修飾剤を製造した際に副
生した片末端にのみオキシカルボニルイミダゾールが導
入された（ポリ）アルキレンオキシド誘導体などを、リ
ポソーム外表面のアミノ基と反応させて、アミノ基をブ
ロックすることができる。このようなアミノ基のブロッ
ク化は、反応性リポソームを製造する際の反応溶液中に
アミノ基ブロック化剤を添加して行うこともできるし、
小胞体修飾剤と反応させる前に行うこともできるし、ま
たは小胞体修飾剤と反応させた後に行うこともできる。
このようにリポソーム外表面のアミノ基をブロックする
ことにより、リポソーム外表面に導入される一般式
〔１〕で表わされる反応活性を有する鎖の量を所望の値
に調節することができる。

【００３２】このようにして得られた反応性リポソーム
は、リポソーム膜の外表面に（ポリ）オキシアルキレン
からなるスペーサーを介してオキシカルボニルイミダゾ
ール基が結合しているので、アミノ基、水酸基、チオー
ル基などの官能基、特に第１級アミノ基を有する機能性
物質を効率よくかつ簡単に、リポソームの二分子膜の外
表面上に（ポリ）オキシアルキレンからなるスペーサー
を介して、ウレタン結合、カーボネート結合またはチオ
カーボネート結合により化学的に固定化することができ
る。

【００３３】反応性リポソームに固定化できる機能性物
質としては、例えば色素、染料、放射線ラベル化合物、
蛍光化合物、化学発光化合物、電極反応性化合物等の標
識物質；光応答性化合物、ｐＨ応答性化合物、熱応答性
化合物等の外部刺激反応性化合物；酵素、抗体、その他
のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホル
モン等の生理活性物質；医薬；ホスファチジルセリン等
のリン脂質；これらの混合物などがあげられる。

【００３４】反応性リポソーム外表面への機能性物質の
固定化反応は、水系溶媒、例えば蒸留水や生理的食塩水
のほか、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢
酸緩衝液などの種々の緩衝液、またはこれらの水系溶媒
とアセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、
１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチル
アセタミド、ジメチルスルホキシド、ピロリドン等の有
機溶媒との混合溶媒中で、反応性リポソームと機能性物
質とをｐＨ１〜１２、好ましくはｐＨ３〜１０、反応温
度−１０〜１２０℃、アミノ基との反応の場合は好まし
くは０〜６０℃、さらに好ましくは０〜４０℃、水酸基
またはチオール基との反応の場合は好ましくは０〜１２
０℃で、反応時間５分間〜１０００時間、好ましくは３
０分間〜７２時間の条件で、攪拌下に反応させる方法な
どにより、一段階で容易に行うことができる。これらの
条件外では、リポソームの安定性が悪くなるため好まし
くない。固定化反応の終了後は、必要によりゲル濾過、
限外濾過、透析、遠心分離、静置沈降分離等の方法によ
り精製を行うことができる。

【００３５】リポソーム外表面上でのアミノ基を有する
機能性物質の固定化反応を模式的に示すと次のようにな
る。式中、波線はポリオキシアルキレン鎖、Ｆは機能性
物質を示す。

【化８】

【００３６】機能性物質を固定化したリポソームは、
（ポリ）オキシアルキレン鎖の先端に機能性物質が固定
されているので（ポリ）オキシアルキレン鎖の長さを調
節することにより機能性物質の作用を十分に発揮させる
ことができる。また、（ポリ）オキシアルキレン鎖が導
入されているので、従来からの（ポリ）オキシアルキレ
ン鎖導入の効果、例えば長期間にわたる血液中濃度の維
持、非免疫原生、リポソーム内部に封入した物質の漏れ
防止などの効果も期待できる。さらにリポソームの内側
（内表面）には反応活性の高い基は存在しないので、Ｄ
ＤＳ用の医薬運搬体、診断薬、アジュバントなど、生体
内に投与する機能性リポソームとして用いても生体内の
官能基とは反応せず、副作用や毒性を示す危険性がない
ほか、封入した機能性物質とも反応しない。このほか、
不必要なオキシカルボニルイミダゾール基が残存したと
しても、酸・アルカリ雰囲気中で加水分解したり、また
はグリシン等のアミノ酸やアミノエチルアルコールな
ど、アミノ基を有する化合物を作用させてキャッピング
を行う方法などにより、その全てを容易に失活させるこ
とができる。

【００３７】このため反応性リポソームは、医薬の運搬
体、検査薬、診断薬、アジュバント、センサー、固定化
触媒、バイオリアクター、バイオエレクトロニクス素
子、マイクロカプセル代替品など、種々の機能性リポソ
ームとして利用できる。これらの中でも、医薬の運搬
体、診断薬、アジュバントなどの生体内に投与する機能
性リポソームとして好適に利用できる。

【００３８】なお、リポソームを製造する際、膜形成成
分として重合性リン脂質を配合することにより、重合性
の反応性リポソームとすることができる。重合性のリン
脂質としては、公知の重合性リン脂質を使用することが
できるが、例えば１，２−ジ（２，４−オクタデカジエ
ノイル）−３−ホスファチジルコリンの他、野島庄七、
砂本順三、井上圭三編集、１９８８年南雲堂発行の「リ
ポソーム」ｐ３１３〜３１５に記載のものなどがあげら
れる。これらの中では、１，２−ジ（２，４−オクタデ
カジエノイル）−３−ホスファチジルコリンが好まし
い。

【００３９】重合性リポソームは、リポソーム調製後
に、光重合開始剤の存在下または非存在下でＵＶ、γ
線、電子線などの光照射を行うことにより、あるいはレ
ドックス開始剤系により、あるいはアゾ系開始剤または
有機過酸化物などの存在下で加熱を行うことにより、容
易に重合を行うことができる。このようにして得られた
重合後のリポソームは、優れた安定性を有しているの
で、水溶液に分散させたままで、あるいは凍結乾燥等に
より粉末状に調製し、安定して使用することができる。

【００４０】他の反応性小胞体としての反応性脂肪乳剤
は、アミノ基を有するリン脂質と、大豆油、サフラワー
油等の植物油と、必要により添加される他の添加剤、例
えば大豆レシチン、卵黄レシチン等のリン脂質、イント
ラリピッド（大塚製薬（株）製、商標）、乳化補助剤、
安定化剤、等張化剤、脂溶性医薬、脂溶性生理活性物質
などを含む油脂混合物が、外表面にのみ一般式〔１〕で
表わされる反応活性を有する鎖が存在する状態で乳化さ
れたものである。

【００４１】小胞体修飾剤との反応前の脂肪乳剤は、公
知の方法により製造することができる。例えば、アミノ
基を有するリン脂質、植物油、および必要により配合す
る添加剤を混合、加熱し、水を加えてホモミキサー等で
粗乳化し、次にマントン−ガウリン型の加圧噴射式ホモ
ジナイザー等で均質化する方法などにより製造すること
できる。また脂肪乳剤としては、上記イントラリピッド
のような脂質混合乳化物を使用することもできる。

【００４２】このようにして得られた小胞体修飾剤との
反応前の脂肪乳剤と一般式〔３〕で表わされる小胞体修
飾剤とを、反応性リポソームの場合と同様にして反応さ
せることにより、本発明に係る反応性脂肪乳剤が得られ
る。反応性乳剤は反応性リポソームと同様にして、同様
の機能性物質を容易に固定化することができる。このた
め反応性脂肪乳剤は、医薬の運搬体、検査薬、診断薬、
センサー、固定化触媒などとして利用できる。

【００４３】上記以外の反応性小胞体である反応性ミセ
ルは、アミノ基を有するリン脂質が単独で、または他の
成分、例えばホスファチジルコリン、その他のリン脂質
類、コレステロールなどが、外表面にのみ一般式〔１〕
で表わされる反応活性を有する鎖が存在する状態でミセ
ル化したものである。反応性ミセルも反応性脂肪乳剤と
同様にして機能性物質を固定化することができ、また同
様の用途に利用できる。

【００４４】

【発明の効果】本発明の反応性小胞体は、反応活性基が
小胞体の外表面にのみ存在し、内側には存在していない
ので、機能性物質を固定化した小胞体中には反応活性基
が残存せず、このため生体内に投与しても生体内の官能
基とは反応が起らず、副作用や毒性を起す危険性がな
い。また機能性物質の固定化は簡単にかつ効率よく行う
ことができる。さらにポリオキシアルキレン鎖の長さを
調節することにより、固定化した機能性物質の作用を十
分に発揮させることができる。

【００４５】本発明の小胞体修飾剤は、上記のような反
応性小胞体を製造するための原料として用いることによ
り、簡単な操作で、小胞体の外表面にのみ一般式〔１〕
で表わされる鎖を結合させることができる。

【００４６】本発明の反応性小胞体の製造方法では、ア
ミノ基を有するリン脂質を小胞体形成成分として含む小
胞体に、上記小胞体修飾剤を反応させるだけで、簡単に
効率よく前記のような反応性小胞体を製造することがで
きる。

【００４７】

【実施例】以下実施例によりさらに詳細な説明を行う
が、本発明はこれらに限定されるものではない。 合成例１ 乾燥アセトニトリル５０ｍｌ中に、両末端に水酸基を有
するポリエチレングリコール（平均付加モル数約６５、
分子量約３０００）１ｇ（０．３３ｍｍｏｌ）および
Ｎ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾール １６２ｍｇ（１
ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終了
後、減圧下濃縮した後残渣に蒸留水を加え、限外ろ過
（分画分子量１０００）により精製を行い、凍結乾燥し
て白色粉末状のポリエチレングリコールジ（オキシカル
ボニルイミダゾール）からなる小胞体修飾剤を得た（収
率８８％）。生成物の確認は、ＩＲにおいて、ポリエチ
レングリコール末端の水酸基（ＯＨ伸縮、３４２８ｃｍ
^-1）の消失、およびオキシカルボニルイミダゾール結合
（Ｃ＝Ｏ伸縮、１７６０ｃｍ^-1）の生成により確認し
た。

【００４８】合成例２ 乾燥アセトニトリル５０ｍｌ中に、両末端に水酸基を有
するポリエチレングリコール（平均付加モル数約６５、
分子量約３０００）１ｇ（０．３３ｍｍｏｌ）および
Ｎ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾール ８１ｍｇ（０．
５０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終
了後、減圧下濃縮した後残渣に蒸留水を加え、限外ろ過
（分画分子量１０００）により精製を行い、凍結乾燥し
て白色粉末状のポリエチレングリコールジ（オキシカル
ボニルイミダゾール）とヒドロキシポリエチレングリコ
ールオキシカルボニルイミダゾールのモル比約１：１の
混合物からなる小胞体修飾剤を得た（収率８６％）。生
成物の確認は、ＩＲにおいて、ポリエチレングリコール
末端の水酸基（ＯＨ伸縮、３４２８ｃｍ^-1）の減少、お
よびオキシカルボニルイミダゾール結合（Ｃ＝Ｏ伸縮、
１７６０ｃｍ^-1）の生成により確認した。

【００４９】実施例１−１ 卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２６μｍｏｌ）、
コレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）およびジパ
ルミトイルホスファチジルエタノールアミン２．８ｍｇ
（４μｍｏｌ）を茄子型フラスコに入れ、２ｍｌのベン
ゼンで溶解させた後、凍結乾燥を行った。これに生理的
食塩水１ｍｌを加え、バス型超音波照射およびボルテッ
クスミキサーにより、多重層リポソームを得た。さらに
エクスツルーダーにより３．０→１．０→０．２μｍの
ポリカーボネートメンブランを順次通過させることによ
り、大きな単層リポソームを得た。

【００５０】次に、得られたリポソーム分散液（リポソ
ーム濃度約２０ｍｇ／ｍｌ）の５００μｌに、合成例１
で得られたポリエチレングリコールジ（オキシカルボニ
ルイミダゾール）を１０重量％の濃度で含む生理的食塩
水１ｍｌを加え、ｐＨ７．５において室温で６時間反応
させ、オキシカルボニルイミダゾール基を有するポリオ
キシエチレン鎖がウレタン結合により外表面に導入され
た反応性リポソームを得た。反応終了後、Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ−５０を用いてゲル濾過を行い、含リポソーム
分画を分取し、反応性リポソームを得た。得られた反応
性リポソームの粒径をレーザー散乱粒度分布計（ＮＩＣ
ＯＭＰ社製、ＮＩＣＯＭＰ３７０ＨＰＬ、商標）を用い
て測定したところ、粒径は２５３ｎｍ（ＣＶ値１９％）
であった。

【００５１】実施例１−２ 実施例１−１と同様にして、ただし合成例１の小胞体修
飾剤に代えて、合成例２で得られたポリエチレングリコ
ールジ（オキシカルボニルイミダゾール）とヒドロキシ
ポリエチレングリコールオキシカルボニルイミダゾール
との混合物を１０重量％の濃度で含む生理的食塩水１ｍ
ｌを用いて、オキシカルボニルイミダゾール基を有する
ポリオキシエチレン鎖がウレタン結合により外表面に導
入されるとともに、ポリエチレングリコール鎖も導入さ
れて、オキシカルボニルイミダゾール基の量が調節され
た反応性リポソームを得た（粒径２３４ｎｍ、ＣＶ値２
０％）。

【００５２】実施例１−３ 実施例１−１と同様にして、ただし合成例１の小胞体修
飾剤に代えて、ポリエチレングリコール（平均付加モル
数約２０）／ポリテトラヒドロフラン（平均付加モル数
約５）−ジ（オキシカルボニルイミダゾール）（ブロッ
ク共重合体；分子量約１２５０）を１重量％の濃度で含
む生理的食塩水１ｍｌを用いて、オキシカルボニルイミ
ダゾール基を有するポリアルキレンオキシド鎖がウレタ
ン結合により外表面に導入された反応性リポソームを得
た（粒径２４２ｎｍ、ＣＶ値２２％）。

【００５３】実施例１−４ 実施例１−１と同様にして、ただし合成例１の小胞体修
飾剤に代えて、ポリエチレングリコール（平均付加モル
数約２０）／ポリプロピレンオキシド（平均付加モル数
約５）−ジ（オキシカルボニルイミダゾール）（ブロッ
ク共重合体；分子量約１２００）を１重量％の濃度で含
む生理的食塩水１ｍｌを用いて、オキシカルボニルイミ
ダゾール基を有するポリアルキレンオキシド鎖がウレタ
ン結合により外表面に導入された反応性リポソームを得
た（粒径２１６ｎｍ、ＣＶ値１９％）。

【００５４】実施例２−１ 実施例１−１で得られた反応性リポソーム溶液（固形分
量２．３重量％、ｐＨ７．５）０．５ｍｌに、西洋山葵
ペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略す）１ｍｇを溶解
させた生理的食塩水（ｐＨ７．５）１ｍｌを加え、４℃
で２４時間攪拌し、ＨＲＰをリポソームに固定化した。
反応終了後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を用いてゲル
濾過を行い、含リポソーム分画を分取した。これにＨＲ
Ｐの基質である１，２−フェニレンジアミン溶液（１０
ｍｍｏｌ／ｌ）０．１ｍｌを加え、３０℃で１０分間イ
ンキュベートし、さらに０．１Ｎ硫酸１０μｌを加えた
ところ、褐色の呈色が見られた。この結果から、実施例
１−１の反応性リポソームは、ＨＲＰと攪拌するだけで
ＨＲＰを固定化できることが確認できた。

【００５５】実施例２−２ 実施例１−１で得られた反応性リポソーム溶液（固形分
量２．３重量％、ｐＨ７．５）０．５ｍｌに、あらかじ
め３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸−Ｎ−ヒド
ロキシコハク酸イミドエステルを作用させさらにメルカ
プトエタノールによりジチオピリジル基を還元すること
によりチオール基を担持させた西洋山葵ペルオキシダー
ゼ１ｍｇを溶解させた生理的食塩水（ｐＨ７．５）１ｍ
ｌを加え、４℃で２４時間攪拌し、ＨＲＰをリポソーム
に固定化した。反応終了後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５
０を用いてゲル濾過を行い、含リポソーム分画を分取し
た。これにＨＲＰの基質である１，２−フェニレンジア
ミン溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）０．１ｍｌを加え、３０
℃で１０分間インキュベートし、さらに０．１Ｎ硫酸１
０μｌを加えたところ、褐色の呈色が見られた。この結
果から、実施例１−１の反応性リポソームは、ＨＲＰと
攪拌するだけでチオール基を有するＨＲＰを固定化でき
ることが確認できた。

【００５６】比較例１ 卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２６μｍｏｌ）、
コレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）およびジパ
ルミトイルホスファチジルエタノールアミン２．８ｍｇ
（４μｍｏｌ）を用いて、実施例１−１と同様の操作に
より、固形分量２．５重量％の多重層リポソームを得
た。このリポソームを小胞体修飾剤と反応させることな
く、実施例２−２と同様にしてＨＲＰを作用させた。次
にゲル濾過により精製後、１，２−フェニレンジアミン
溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）０．１ｍｌを加え、３０℃で
１０分間インキュベートし、さらに０．１Ｎ硫酸１０μ
ｌを加えたが、発色は見られなかった。この結果から、
オキシカルボニルイミダゾール基を持たないリポソーム
ではＨＲＰは固定化できないことがわかる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アミノ基を有するリン脂質を小胞体形成
   成分として含む小胞体において、小胞体の外表面に存在
   する前記アミノ基のウレタン結合により、一般式〔１〕 【化１】 〔式中、Ｒ¹は水素原子またはメチル基、 ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、 ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で、１〜１０
   ００の正数を表わす。ｎが２以上の場合、オキシアルキ
   レン基は同一でも異なっていてもよく、またランダム状
   に付加していても、ブロック状に付加していてもよ
   い。〕で表わされる反応活性基を有する（ポリ）オキシ
   アルキレン鎖が、小胞体の外表面にのみ結合した反応性
   小胞体であって、一般式〔２〕 【化２】 〔式中、Ｒ¹は水素原子またはメチル基、 ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、 ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で、１〜１０
   ００の正数を表わす。ｎが２以上の場合、オキシアルキ
   レン基は同一でも異なっていてもよく、またランダム状
   に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。
   Ｌｉｐ−ＮＨ−はアミノ基を有するリン脂質を小胞体形
   成成分として含む小胞体を示す。〕で表わされる構造を
   有することを特徴とする反応性小胞体。
2. 【請求項２】 一般式〔３〕 【化３】 〔式中、Ｒ¹およびＲ²は水素原子またはメチル基を表わ
   し、同一でも異なっていてもよい。ＡＯは炭素数２〜４
   のオキシアルキレン基、 ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で、１〜１０
   ００の正数を表わす。ｎが２以上の場合、オキシアルキ
   レン基は同一でも異なっていてもよく、またランダム状
   に付加していても、ブロック状に付加していてもよ
   い。〕で表わされる（ポリ）アルキレンオキシド誘導体
   からなることを特徴とする請求項１記載の反応性小胞体
   製造用の小胞体修飾剤。
3. 【請求項３】 アミノ基を有するリン脂質を小胞体形成
   成分として含む小胞体に、請求項２記載の小胞体修飾剤
   を反応させることを特徴とする請求項１記載の反応性小
   胞体の製造方法。