JPH07216000A - Combination of monoclonal antibody against epidermal growth factor receptor, its complex and method for transducing the same into cell - Google Patents
Combination of monoclonal antibody against epidermal growth factor receptor, its complex and method for transducing the same into cellInfo
- Publication number
- JPH07216000A JPH07216000A JP4032694A JP4032694A JPH07216000A JP H07216000 A JPH07216000 A JP H07216000A JP 4032694 A JP4032694 A JP 4032694A JP 4032694 A JP4032694 A JP 4032694A JP H07216000 A JPH07216000 A JP H07216000A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- growth factor
- epidermal growth
- factor receptor
- complex
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、上皮細胞増殖因子レセ
プターに対するモノクローナル抗体の結合体ならびにそ
の複合体およびその細胞への嵌入方法に関するものであ
り、さらに詳細には、上皮細胞増殖因子レセプターに対
するモノクローナル抗体と、スペーサーとからなる結合
体またはそれと遺伝子との複合体および上皮細胞増殖因
子レセプターを介したエンドサイトーシスを利用した新
規なジーンデリバリーシステムに関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a conjugate of a monoclonal antibody against epidermal growth factor receptor, a complex thereof and a method for inserting the same into cells. More specifically, the present invention relates to a monoclonal antibody against epidermal growth factor receptor. The present invention relates to a novel gene delivery system utilizing endocytosis mediated by a conjugate comprising an antibody and a spacer or a complex thereof with a gene and an epidermal growth factor receptor.
【０００２】[0002]
【従来の技術】上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）について
は、その生理学的役割が、歯の発育、胃、肺の発達など
において広範に研究されている。この研究の結果、その
上皮細胞増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）が上皮細胞の
表面に局在していることが判明した。上皮細胞増殖因子
（ＥＧＦ）は、特異的な細胞表面のレセプターと相互作
用して、生体内および生体外において、種々の細胞の発
育を刺激する。この研究の結果、その上皮細胞増殖因子
レセプターが上皮細胞の表面に局在していることが判明
した。2. Description of the Related Art The physiological role of epidermal growth factor (EGF) has been extensively studied in tooth development, stomach and lung development and the like. The results of this study revealed that the epidermal growth factor receptor (EGFR) is localized on the surface of epithelial cells. Epidermal growth factor (EGF) interacts with specific cell surface receptors to stimulate the development of various cells in vivo and in vitro. The results of this study revealed that the epidermal growth factor receptor was localized on the surface of epithelial cells.
【０００３】このレセプターは、内的タンパクチロシン
キナーゼ活性をもつ１１８６個のアミノ酸からなる１７
００００ダルトンの膜貫通グリコプロテインである。Ｅ
ＧＦレセプターの発現は、一般には増殖中の細胞に限定
され、その発現は細胞が分化し、増殖を停止したときに
終了する。またＥＧＦの発現は、増殖中の細胞が腺細胞
に分化した後に起こる。細胞ならびに組織のＥＧＦレセ
プターのレベルをラジオレセプターアッセイまたは免疫
組織化学的染色法によって測定したところ、小細胞肺癌
はＥＧＦ結合活性を持ってなく、腺癌は中程度のＥＧＦ
結合活性であるが、通常の組織レベルに比べると明らか
に上昇した活性を示すのに対して、偏平上皮癌は腺癌な
どを含む他の肺癌よりも実質的に高いＥＧＦ結合活性を
示すことが判明している。この結果、ＥＧＦレセプター
が高いレベルにあることは、肺偏平上皮癌ばかりでな
く、腺癌の発達にも関与しているものと考えられる。更
に、ＥＧＦレセプターは、全ての癌細胞の細胞膜上に局
在していて、ＥＧＦレセプターの数は腫瘍の中心部に向
かうにつれて徐々に減少している。また、腫瘍の中心部
の末梢細胞では、ＤＮＡ合成が盛んに行なわれていて、
その細胞が急激に増殖している。従って、ＥＧＦレセプ
ターの発現と悪性腫瘍細胞の生育とは直接的な因果関係
があるといえる。This receptor is composed of 1186 amino acids having an intrinsic protein tyrosine kinase activity. 17
It is a transmembrane glycoprotein of 0000 daltons. E
Expression of the GF receptor is generally restricted to proliferating cells and its expression ceases when the cells differentiate and stop proliferating. Expression of EGF also occurs after proliferating cells have differentiated into glandular cells. Cell and tissue EGF receptor levels were determined by radioreceptor assay or immunohistochemical staining to reveal that small cell lung cancer does not have EGF binding activity and adenocarcinoma has moderate EGF.
Although the binding activity is clearly increased as compared with normal tissue levels, squamous cell carcinoma may show substantially higher EGF binding activity than other lung cancers including adenocarcinoma. It's known. As a result, it is considered that the high level of the EGF receptor is involved in the development of not only lung squamous cell carcinoma but also adenocarcinoma. Furthermore, the EGF receptor is localized on the cell membrane of all cancer cells, and the number of EGF receptors gradually decreases toward the center of the tumor. In the peripheral cells at the center of the tumor, DNA synthesis is actively carried out,
The cells are growing rapidly. Therefore, it can be said that there is a direct causal relationship between the expression of EGF receptor and the growth of malignant tumor cells.
【０００４】多くの腫瘍細胞は、ポリペプチド成長因子
を産生し、放出しているが、しばしばこれらの因子に対
する機能的レセプターをも保有している。かかる因子の
１つとして、オートクリン成長因子であるＴＧＦ−αが
あり、このＴＧＦ−αはＥＧＦに構造が類似している。
またＥＧＦレセプターはＴＧＦ−αの機能的レセプター
と推定されている。しかしながら、小細胞肺癌細胞はＥ
ＧＦに拮抗するＴＧＦ−α様因子を産生も放出もしてい
ないことが明白である。このように小細胞肺癌セルライ
ンや新鮮な小細胞肺癌組織にしばしば見られるようなＥ
ＧＦレセプターが欠如することは、いろんな種類の肺癌
の中の小細胞肺癌に特徴的であって、特殊なマーカーと
して使用することができるものと思われる。Many tumor cells produce and release polypeptide growth factors, but often also carry functional receptors for these factors. One such factor is TGF-α, which is an autocrine growth factor, and this TGF-α is similar in structure to EGF.
The EGF receptor is presumed to be a functional receptor for TGF-α. However, small cell lung cancer cells
It is clear that it neither produces nor releases TGF-α-like factors that antagonize GF. Thus, as often seen in small cell lung cancer cell lines and fresh small cell lung cancer tissue, E
The lack of the GF receptor is characteristic of small cell lung cancer among various types of lung cancer and could be used as a special marker.
【０００５】一方、最近では、正確に標的を捕えること
ができる癌化学療法が強く要望されている。今日では、
トランスフェリンレセプター、神経成長因子レセプター
などのレセプターばかりでなく、乳癌細胞、胸癌細胞、
前立腺癌細胞など種々の癌細胞に対するモノクローナル
抗体も、種々のタンパクトキシンに結合されるイムノト
キシンとして使用されている。偏平上皮癌は上皮細胞増
殖因子レセプターを過剰に産生し、ＥＧＦレセプターを
過剰に産生する細胞の生体内での成長を促進し、また細
胞表面のＥＧＦレセプターは抗体と結合して嵌入される
ことが知られているので、ＥＧＦレセプターは偏平上皮
癌に対する療法のための優れた標的と考えられる。On the other hand, recently, there has been a strong demand for cancer chemotherapies that can accurately capture the target. Nowadays,
Not only receptors such as transferrin receptor and nerve growth factor receptor, but also breast cancer cells, breast cancer cells,
Monoclonal antibodies against various cancer cells such as prostate cancer cells have also been used as immunotoxins bound to various protein toxins. Squamous cell carcinoma produces excessive epidermal growth factor receptor and promotes in vivo growth of cells that excessively produce EGF receptor, and the EGF receptor on the cell surface may be inserted by binding with an antibody. As known, the EGF receptor is considered an excellent target for therapy against squamous cell carcinoma.
【０００６】ＥＧＦレセプターに対するモノクローナル
抗体（以下、「抗ＥＧＦレセプターモノクローナル抗
体」ともいう）は、主に、ＥＧＦレセプターを過剰産生
する偏平上皮癌の細胞において過剰産生される低親和性
のＥＧＦレセプターと免疫反応をする。ＥＧＦレセプタ
ーに対するモノクローナル抗体を、６０Ｓリボゾーム不
活化タンパクであるゲロニンに結合させたものが既に知
られている（ＨｉｒｏｔａＮ．， ｅｔ ａｌ．；ＣＡ
ＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ４９，７１０６−７１０
９，Ｄｅｃ．１５，１９８９）。 このモノクローナル
抗体−ゲロニン結合体は、ＥＧＦレセプターの数に比例
して細胞表面に結合し、ＥＧＦレセプターに結合するた
めに上記モノクローナル抗体を拮抗する。この結合体
は、タンパク合成を阻害し、ＥＧＦレセプターを過剰産
生する癌細胞を死滅させることができる。更に、この結
合体は、通常のヒト繊維芽細胞に対して僅かに細胞毒性
を示すが、ＥＧＦレセプターが欠失している小細胞肺癌
細胞とマウス繊維芽細胞を死滅させることはない。これ
に対して、遊離のゲロニンおよびこれらの混合物では、
ＥＧＦレセプターを過剰産生する細胞を死滅させること
はなかった。これらの結果から、このモノクローナル抗
体−ゲロニン結合体は、ＥＧＦレセプターを過剰産生す
る偏平上皮癌と対する標的療法に使用できることが示唆
されている。Monoclonal antibodies against the EGF receptor (hereinafter, also referred to as "anti-EGF receptor monoclonal antibody") are mainly immunized with the low-affinity EGF receptor that is overproduced in squamous cell carcinoma cells that overproduce the EGF receptor. React. It is already known that a monoclonal antibody against the EGF receptor is bound to gelonin which is a 60S ribosomal inactivating protein (Hirota N., et al .; CA.
NCER RESEARCH 49, 7106-710
9, Dec. 15, 1989). This monoclonal antibody-gelonin conjugate binds to the cell surface in proportion to the number of EGF receptors and antagonizes the above monoclonal antibodies to bind to the EGF receptors. This conjugate can inhibit protein synthesis and kill cancer cells that overproduce the EGF receptor. Furthermore, this conjugate is slightly cytotoxic to normal human fibroblasts but does not kill small cell lung cancer cells lacking the EGF receptor and mouse fibroblasts. In contrast, free gelonin and mixtures thereof,
It did not kill cells that overproduce the EGF receptor. These results suggest that this monoclonal antibody-gelonin conjugate can be used for targeted therapy against squamous cell carcinoma that overproduces the EGF receptor.
【０００７】他方、上皮細胞増殖因子レセプターを認識
するモノクローナル抗体と、偏平上皮癌に対する抗癌剤
であるペプロマイシン（ＰＥＰ）とを結合させた結合体
も知られている（Ｏｓａｋｕ Ｍ．ｅｔ ａｌ．；ＡＮ
ＴＩＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ １１：１９５１
−１９５６（１９９１））。この結合体は、ＰＥＰ単独
よりも低濃度で、ＥＧＦレセプターを過剰産生する偏平
上皮癌のＡ４３１細胞を死滅させるとのが報告されてい
る。また、この結合体は、ＥＧＦレセプターが偏平上皮
癌における多くの症例で発見されることから、ＥＧＦレ
セプターを利用する処置において有用な武器となりうる
であろうとも報告されている。On the other hand, a conjugate in which a monoclonal antibody recognizing the epidermal growth factor receptor and peplomycin (PEP) which is an anticancer agent against squamous cell carcinoma are bound is also known (Osaku M. et al .; AN).
TICANER RESEARCH 11: 1951
-1956 (1991)). This conjugate is reported to kill A431 cells of squamous cell carcinoma that overproduce the EGF receptor at lower concentrations than PEP alone. It has also been reported that this conjugate could be a useful weapon in treatments that utilize the EGF receptor, as the EGF receptor is found in many cases in squamous cell carcinoma.
【０００８】上述したように、抗ＥＧＦレセプターモノ
クローナル抗体との結合体が知られていて、ある程度の
効果は期待されるけれども、癌という病気の多様性等を
考慮すると、多様な抗癌剤や癌療法を開発することが強
く望まれているのが現状である。As described above, although a conjugate with an anti-EGF receptor monoclonal antibody is known and expected to have some effects, various anti-cancer agents and cancer therapies are used in consideration of the diversity of diseases such as cancer. At present, there is a strong demand for development.
【０００９】また、最近では、治療のために、外部の遺
伝子を標的とする細胞中にデリバリーするシステムに強
い関心が寄せられている。これらのジーンデリバリーシ
ステムは主にレトロビールスやアデノビールスベクター
を使用し、それらの感染力を介して行なわれている。癌
の遺伝子療法としては、潰瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子
を潰瘍浸潤骨髄細胞中に導入して黒色腫の治療を行なっ
た症例が知られている（Ｈｗｕ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．；
Ｊ．Ｎｅｖｒｏ−ｓｕｒｇ．７９，１０４−１１０（１
９９３））。この症例では、患者から単離した骨髄細胞
をカルシウムーリン酸沈殿法ならびにエレクトロポレー
ションによってＤＮＡを用いて生体外で処理した後、患
者の血液中に戻すことによって治療が行なわれた。しか
しながら、この方法は、遺伝子を特定の標的細胞に直接
導入するものではない。従って、遺伝子を特定の標的細
胞に直接導入できるジーンデリバリーシステムが開発さ
れれば、癌療法にとって極めて有用であろう。[0009] Recently, there has been a great interest in a system for delivering an external gene into cells targeting it for therapy. These gene delivery systems mainly use retrovirus and adenovirus vectors, and are carried out through their infectivity. As gene therapy for cancer, a case in which an ulcer necrosis factor (TNF) gene is introduced into ulcer-infiltrating bone marrow cells to treat melanoma is known (Hwu, P. et al .;
J. Nevro-surg. 79, 104-110 (1
993)). In this case, the treatment was performed by treating bone marrow cells isolated from the patient with calcium-phosphate precipitation method as well as by electroporation with DNA in vitro and then returning to the patient's blood. However, this method does not directly introduce the gene into a specific target cell. Therefore, if a gene delivery system capable of directly introducing a gene into a specific target cell is developed, it would be extremely useful for cancer therapy.
【００１０】[0010]
【発明の解決しようとする課題】したがって、本発明
は、前述した課題を解決することを目的として、上皮細
胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体と、
スペーサーとが結合していることを特徴とする上皮細胞
増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体の結合
体を提供することを目的としている。Therefore, for the purpose of solving the above-mentioned problems, the present invention provides a monoclonal antibody against epidermal growth factor receptor,
It is an object of the present invention to provide a conjugate of a monoclonal antibody against the epidermal growth factor receptor, which is characterized in that it is bound to a spacer.
【００１１】また、本発明は、上皮細胞増殖因子レセプ
ターに対するモノクローナル抗体と、遺伝子とが、スペ
ーサーを介しまたは介さずに結合して複合体を形成して
いることを特徴とする上皮細胞増殖因子レセプターに対
するモノクローナル抗体の複合体を提供することを目的
としている。Further, the present invention is characterized in that a monoclonal antibody against epidermal growth factor receptor and a gene are bound to each other via a spacer to form a complex. It is intended to provide a complex of a monoclonal antibody against.
【００１２】更に、本発明は、上皮細胞増殖因子レセプ
ターに対するモノクローナル抗体の複合体を用いて、上
皮細胞増殖因子レセプターを介して、エンドサイトーシ
スを利用した細胞中に導入する新規なジーンデリバリー
システムを提供することを目的としている。Furthermore, the present invention provides a novel gene delivery system which uses a complex of a monoclonal antibody against an epidermal growth factor receptor to introduce it into cells utilizing endocytosis via the epidermal growth factor receptor. It is intended to be provided.
【００１３】加えて、本発明は、上皮細胞増殖因子レセ
プターに対するモノクローナル抗体の結合体または複合
体を作製する結合体または複合体を作製する製法を提供
することをも目的としている。In addition, the present invention also aims at providing a process for producing a conjugate or complex for producing a conjugate or complex of a monoclonal antibody against the epidermal growth factor receptor.
【００１４】[0014]
【課題を解決するための手段】本発明者は、前述した目
的を達成するために、鋭意研究ならびに検討を重ねた結
果、ＩｇＧクラス２に属するマウスモノクローナル抗体
がＥＧＦレセプターのタンパク部分に特異的に結合する
ことおよびこのモノクローナル抗体がＥＧＦレセプター
を介して細胞中に嵌入する特殊なエンドサイトーシス機
能を利用して、ＥＧＦレセプターを過剰産生する癌細胞
を標的とするモノクローナル抗体の複合体を構築すると
共に、この複合体を介してヒト細胞中に遺伝子となるタ
ンパクを導入することを見出して、本発明を完成するに
至った。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted extensive studies and studies to achieve the above-mentioned object, and as a result, a mouse monoclonal antibody belonging to IgG class 2 was found to specifically bind to the protein portion of the EGF receptor. Using the binding and the special endocytosis function of this monoclonal antibody to insert into the cell via the EGF receptor, a complex of the monoclonal antibody targeting the cancer cell which overproduces the EGF receptor is constructed. The inventors have found that a protein to be a gene is introduced into human cells via this complex, and completed the present invention.
【００１５】したがって、まず、本発明に使用すること
ができる上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノクロ
ーナル抗体としては、上皮細胞増殖因子レセプターを認
識できるモノクローナル抗体であればいずれも使用する
ことができる。なお、多くの細胞には、リガンドに対す
る親和性に関して２つのクラスのＥＧＦレセプターがあ
ると考えられる。現在のところ、これらのＥＧＦレセプ
ターが異なる機能を有しているかどうかは明らかではな
いが、生理学的な条件ではこれら２つのＥＧＦレセプタ
ーが互いに互換的に作用していることは知られている。
またＥＧＦが親和性の高いレセプターに結合することは
細胞のマイトジェン応答に関連しているとの証拠もあ
る。更に、高親和性レセプターについても、低親和性レ
セプターについても、その正確な組成もそれらを規制す
る機能も明らかではないが、本発明に使用するモノクロ
ーナル抗体は、特に低親和性クラスであるヒトＥＧＦレ
セプターのサブクラスと免疫反応するものであるが、何
らこれに限定されるものではない。なお、本明細書にお
いて単にモノクローナル抗体と称する場合は、特段の定
めがないかぎり、本発明に使用することができる上皮細
胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体を意
味するものと理解すべきである。Therefore, as the monoclonal antibody against the epidermal growth factor receptor which can be used in the present invention, any monoclonal antibody capable of recognizing the epidermal growth factor receptor can be used. It should be noted that many cells are thought to have two classes of EGF receptors with respect to their affinity for ligands. At present, it is not clear whether these EGF receptors have different functions, but it is known that these two EGF receptors act interchangeably under physiological conditions.
There is also evidence that binding of EGF to high affinity receptors is associated with cell mitogenic responses. Furthermore, regarding the high-affinity receptor and the low-affinity receptor, the exact composition thereof and the function of regulating them are not clear, but the monoclonal antibody used in the present invention is particularly low-affinity class human EGF. It immunoreacts with a subclass of receptor, but is not limited thereto. In the present specification, the term “monoclonal antibody” is to be understood as meaning a monoclonal antibody against the epidermal growth factor receptor that can be used in the present invention, unless otherwise specified.
【００１６】本発明において、モノクローナル抗体は、
まず、このモノクローナル抗体を他の物質に結合するた
めのスペーサーの役割を担うことができる物質（以下、
単に「スペーサー」ということがある）と結合体が形成
される。このモノクローナル抗体とスペーサーとは、ジ
スルフィド結合またはチオエーテル結合で結合するのが
好ましい。従って、モノクローナル抗体は、スペーサー
との結合反応を円滑に進行させるために、例えば、Ｎ−
サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オネート（ＳＰＤＰ）などのジチオ基を有する化合物で
修飾するのが好ましい。この目的のためには、モノクロ
ーナル抗体の性質や活性を損なうことなく、このモノク
ローナル抗体にジチオ基を付与することができる化合物
であればいずれも使用することができる。In the present invention, the monoclonal antibody is
First, a substance that can play the role of a spacer for binding this monoclonal antibody to another substance (hereinafter,
(Sometimes referred to simply as "spacer") and a conjugate is formed. The monoclonal antibody and the spacer are preferably bound by a disulfide bond or a thioether bond. Therefore, the monoclonal antibody may be, for example, N-, in order to facilitate the binding reaction with the spacer.
It is preferably modified with a compound having a dithio group such as succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP). For this purpose, any compound can be used as long as it can impart a dithio group to the monoclonal antibody without impairing the properties and activity of the monoclonal antibody.
【００１７】他方、かかるスペーサーとしては、例え
ば、モノクローナル抗体とジチオ結合ができると共に、
モノクローナル抗体の複合体を形成する成分とも結合で
き、かつ、この複合体が投与される生体に対して毒性を
示したり、細胞への嵌入に悪影響を及ぼしたりしなけれ
ば、いずれの物質も使用することができる。かかる物質
としては、特に、ポリリジンなどのアミノ酸、その他の
ポリカチオンなどが挙げられる。なお、これらのスペー
サー自身がモノクローナル抗体とジチオ結合することが
できない場合には、スペーサーにジチオ基を付与するこ
とができる化合物、例えば、イミノチオランなどの硫黄
含有物質で修飾して使用することもできる。On the other hand, examples of such a spacer include a dithio bond with a monoclonal antibody, and
Any substance can be used as long as it can bind to a complex-forming component of a monoclonal antibody and does not show toxicity to the living body to which the complex is administered or adversely affect the fit into cells. be able to. Examples of such substances include amino acids such as polylysine and other polycations. When these spacers themselves cannot form a dithio bond with the monoclonal antibody, they can be used after being modified with a compound capable of imparting a dithio group to the spacer, for example, a sulfur-containing substance such as iminothiolane.
【００１８】上記のようにして調製されたモノクローナ
ル抗体と、スペーサー化合物とは、常法に従って反応さ
せることによって、モノクローナル抗体の結合体を得る
ことができる。なお、この反応においては、残存する遊
離のスルフヒドリル基を常法に従って保護するのが好ま
しい。A monoclonal antibody conjugate can be obtained by reacting the monoclonal antibody prepared as described above with a spacer compound according to a conventional method. In this reaction, it is preferable to protect the remaining free sulfhydryl group according to a conventional method.
【００１９】このようにして得られたモノクローナル抗
体の結合体は、次いで、遺伝子と結合されて、モノクロ
ーナル抗体の複合体にされる。このモノクローナル抗体
と遺伝子、つまりＤＮＡフラグメント、との結合は、例
えば、親和性によるのが好ましい。例えば、モノクロー
ナル抗体とポリリジンとの結合体に、ＤＮＡを加えて、
適当な条件で保温することによって、所定のＤＮＡが結
合されたモノクローナル抗体の複合体を得ることができ
る。なお、モノクローナル抗体および／または遺伝子の
種類によっては、つまり、モノクローナル抗体と遺伝子
とがスペーサーを介在させることなく結合して複合体を
作製することができる場合には、このモノクローナル抗
体と遺伝子ＤＮＡとはかかるスペーサーを介さずに複合
体を形成してもよい。The thus obtained monoclonal antibody conjugate is then combined with a gene to form a monoclonal antibody complex. The binding between the monoclonal antibody and the gene, that is, the DNA fragment is preferably based on affinity, for example. For example, by adding DNA to a conjugate of a monoclonal antibody and polylysine,
By incubating under appropriate conditions, a complex of a monoclonal antibody bound with a predetermined DNA can be obtained. Depending on the type of the monoclonal antibody and / or the gene, that is, when the monoclonal antibody and the gene can be bound to each other without interposing a spacer to form a complex, the monoclonal antibody and the gene DNA are The complex may be formed without using such a spacer.
【００２０】この発明によれば、この結合体によって細
胞中に嵌入（エンドサイトーシス）できる遺伝子につい
ては、特に限定されるものではなく、使用目的に応じ
て、いずれの遺伝子をも本発明の複合体に結合して、所
望の細胞に遺伝子を抗体として嵌入することができる。According to the present invention, the gene that can be inserted into cells (endocytosis) by this conjugate is not particularly limited, and any gene can be used as the complex of the present invention depending on the purpose of use. Once bound to the body, the gene can be inserted as an antibody into the desired cells.
【００２１】従って、本発明の目的に最も沿うものの１
つとして、本発明は、ＥＧＦレセプターを過剰に発現す
る偏平上皮癌細胞などの癌細胞に応用することができ
る。この種の癌細胞には、例えば、ヘルペスウイルスの
チミジンキナーゼ遺伝子を効率よく導入した後に、ガン
シクロビルを投与すれば、癌細胞を選択的に死滅させる
ことができる。その他の癌細胞には、癌抑制遺伝子を導
入することができる。かかる癌抑制遺伝子としては、例
えば、ウイルムス腫瘍にはＷＴ−１、網膜芽細胞腫には
Ｒｂなどが挙げられる。Therefore, one of the objects which is most in line with the object of the present invention is
As one, the present invention can be applied to cancer cells such as squamous cell carcinoma cells that overexpress the EGF receptor. Cancer cells of this type can be selectively killed by efficiently introducing the thymidine kinase gene of herpesvirus and then administering ganciclovir, for example. A tumor suppressor gene can be introduced into other cancer cells. Examples of such tumor suppressor genes include WT-1 for Wilms tumor and Rb for retinoblastoma.
【００２２】更には、癌遺伝子（オンコジン）が過剰発
現しているものには、既に発明者らによって発表された
アンチセンス発現ベクターなどを導入して、抑制するこ
ともできる。更にまた、本発明にかかる複合体ならびに
エンドサイトーシスを適用することができるその他の癌
としては、例えば、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｉｅｄｅｍａ
ｎｎ症候群（例えば、ヘパトプラストーマ、横紋筋肉
腫、ウイルムス腫瘍など）、膀胱癌、Ｅｗｉｎｇ肉種な
どが挙げられる。つまり、本発明は、当該遺伝子を結合
させて癌細胞に導入して、所謂遺伝子の治療に応用する
ことができる。Furthermore, an antisense expression vector, etc., which has been previously published by the present inventors, can be introduced into an overexpressing oncogene (oncodin) to suppress it. Furthermore, the complex according to the present invention and other cancers to which endocytosis can be applied include, for example, Beckwith-Wiedema.
Examples include nn syndrome (eg, hepatoplastoma, rhabdomyosarcoma, Wilms tumor, etc.), bladder cancer, Ewing flesh and the like. That is, the present invention can be applied to so-called gene therapy by introducing the gene into a cancer cell by binding the gene.
【００２３】以下、本発明を実施例によって説明する。 実施例 ヒトＥＧＦレセプターに対するモノクローナル抗体 低アフィニテイー（親和）型ＥＧＦレセプターと免疫反
応するＩｇＧ２型マウスモノクローナル抗体をハイブリ
ドーマセルラインによって作製した（Ｂｅｈｚａｄｉａ
ｎ Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｎ．：Ｃｅｌｌ
Ｓｔｒｕｃｔｕｅ Ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ；１
０，２１９−２３２（１９８５））。つまり、ヒト類表
皮腫細胞で免疫したＢＡＬＢｃマウスの脾臓細胞をマウ
ス骨髄腫細胞と融合した。細胞融合は、文献記載の方法
（Ｏｉ，Ｖ．Ｔ．＆ Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．
Ａ．： Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＣｅ
ｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｂ．
Ｂ．ＭＩＳＨＥＬＬａｎｄ Ｓ．Ｍ．ＳＨＩＩＧＩ，
Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｆｒｅｅｍａｎ，ｐｐ．
３５１−３７２，１９８０）を改良して行なった。つま
り、マウス脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とをダルベッコ
改良イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆ
ｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ））
で２度洗浄した後、５対１の割合で混合してペレットに
した。このペレットを柔かくして、これに４５％ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）と５％ジメチルスルホキシ
ドＤＭＥＭ溶液からなるＰＥＧ０．６ｍｌを室温で１分
間掛けて滴下した。続いて、６ｍｌのＤＭＥＭを６−７
分間掛けて徐々に添加した後、２０％ＦＢＳを含むＤＭ
ＥＭ１０ｍｌを添加した。得られた細胞を７分間７００
ｒｐｍで遠心分離をしてペレットにした後、ＨＡＴ（ヒ
ポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を含有する
Ｈｙ培地に懸濁し、各穴に一滴（８０μｌ）づつ９６穴
マイクロタイタープレートに分配した。次の日、ｍｌ当
たり１−２ｘ１０５個のマウス腹膜細胞を含むＨＡＴ−
Ｈｙ培地を１滴づつ各穴に添加した。７日目に、培地の
半分を、ＨＴだけを含有する新鮮なＨｙ培地に入れ替え
た。１２−１５日目に、８０μｌの培地を１７０個の生
育しているコロニーから取り出して１２５Ｉ−プロテイ
ンＡ結合アッセイに使用した。次いで、Ｈｙ培地を追加
して、３日後にＩ−プロテインＡ結合アッセイを繰り返
した。この時点で、３６個のＩｇＧ産生コロニーを２４
穴培養プレートに移した。これらのコロニーを培養した
培地をＥＧＦ結合を阻害するかどうかのアッセイをし
た。このうちで阻害活性を示した２個のコロニーを限界
希釈培養法でサブクローンした後、液体窒素中に凍結し
て保存した。The present invention will be described below with reference to examples. Example Monoclonal antibody against human EGF receptor An IgG2-type mouse monoclonal antibody that immunoreacts with a low-affinity (affinity) type EGF receptor was prepared by a hybridoma cell line (Behzadia).
n M. A. and Shimizu, N. et al. : Cell
Structure And Function; 1
0,219-232 (1985)). That is, spleen cells of BALBc mice immunized with human epidermoid cells were fused with mouse myeloma cells. Cell fusion is performed by a method described in the literature (Oi, VT & Herzenberg, L. et al.
A. : Selected Methods in Ce
Illular Immunology, eds. B.
B. MISHELLAND S.M. M. SHIIGI,
San Francisco, Freeman, pp.
351-372, 1980). That is, mouse spleen cells and mouse myeloma cells were treated with Dulbecco's Modified Eagle Medium (Dulbecco's Modif).
ied Eagle's Medium (DMEM))
After washing twice with, the mixture was mixed at a ratio of 5: 1 to form pellets. The pellet was softened, and 0.6 ml of PEG consisting of 45% polyethylene glycol (PEG) and 5% dimethylsulfoxide DMEM solution was added dropwise at room temperature over 1 minute. Subsequently, 6 ml of DMEM was added to 6-7.
After adding slowly over a period of 20 minutes, DM containing 20% FBS
10 ml of EM was added. 700 cells for 7 minutes
After centrifugation at rpm to pellet, the cells were suspended in Hy medium containing HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) and distributed in a 96-well microtiter plate, one drop (80 μl) in each well. The next day, HAT- containing 1-2 × 10 5 mouse peritoneal cells per ml
Hy medium was added drop by drop to each well. On day 7, half of the medium was replaced with fresh Hy medium containing HT only. On day 12-15, 80 μl of medium was removed from 170 growing colonies and used for 125 I-Protein A binding assay. Hy medium was then added and the I-Protein A binding assay was repeated 3 days later. At this point 24 IgG-producing colonies
Transferred to well culture plates. The culture medium in which these colonies were cultured was assayed for inhibition of EGF binding. Of these, two colonies showing inhibitory activity were subcloned by the limiting dilution culture method, then frozen in liquid nitrogen and stored.
【００２４】ＩｇＧの精製 上記のようにして凍結保存しておいたハイブリドーマサ
ブクローンを１８％ＦＢＳを含有する多量のＨｙ培地で
ｍｌ当たり１ｘ１０６個の細胞密度になるまで生育させ
た。得られた細胞は、血清フリーのＤＭＥＭで洗浄した
後、血清フリーのＨｙ培地にｍｌ当たり５ｘ１０６個の
細胞密度になるように懸濁させてＣＯ２を含む培養器中
に３０時間放置した。その細胞から得られたＩｇＧを常
法の硫酸アンモニウム沈殿法ならびにＤＥＡＥセルロー
スカラムクロマトグラフィーによって精製した。Purification of IgG The hybridoma subclone cryopreserved as described above was grown in a large amount of Hy medium containing 18% FBS to a cell density of 1 × 10 6 cells / ml. The obtained cells were washed with serum-free DMEM, suspended in serum-free Hy medium at a cell density of 5 × 10 6 cells / ml, and left in a CO 2 -containing incubator for 30 hours. The IgG obtained from the cells was purified by a conventional ammonium sulfate precipitation method and DEAE cellulose column chromatography.
【００２５】モノクローナル抗体の確認 このようにして得られた精製モノクローナル抗体は、二
重免疫拡散法によるウサギの抗マウスＩｇＧ抗体との沈
殿によってＩｇＧであることを確認した。このモノクロ
ーナル抗体は、ポリアクリルアミドゲル上でＭｒ＝１６
０００の１本だけのタンパクバンドを示し、また還元剤
を適用するとＭｒ＝５２０００と２４０００の２本のバ
ンドに解離した。これらのプロフィールは、イムノグロ
ブリンＧの分子構造と一致しており、得られたモノクロ
ーナル抗体が均質であることを確認した。Confirmation of Monoclonal Antibody The purified monoclonal antibody thus obtained was confirmed to be IgG by precipitation with a rabbit anti-mouse IgG antibody by the double immunodiffusion method. This monoclonal antibody gave Mr = 16 on a polyacrylamide gel.
Only one protein band of 000 was shown, and when the reducing agent was applied, it dissociated into two bands of Mr = 52000 and 24000. These profiles were consistent with the molecular structure of immunoglobulin G, confirming that the resulting monoclonal antibody was homogeneous.
【００２６】プラスミドの調製 ｐＳＶ２ＣＡＴプラスミドＤＮＡを大腸菌で生育し、単
離した後、文献記載の方法で精製した（Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍ，Ｈ．Ｃ．＆ Ｄｏｌｙ，Ｊ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，７，１５１３−１５１８（１９７
９））。この精製したプラスミドを１％アガロースゲル
で電気泳動して細菌由来のＤＮＡが存在してないことを
確認した。Preparation of plasmid pSV2CAT plasmid DNA was grown in E. coli, isolated, and then purified by the method described in the literature (Birnboi).
m, H.M. C. & Doly, J: Nucleic Ac
ids Res. , 7, 1513-1518 (197
9)). The purified plasmid was electrophoresed on a 1% agarose gel to confirm the absence of bacterial DNA.
【００２７】モノクローナル抗体の修飾 ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）を含有する１００ｍＭリン酸カ
リウムバッファー（ｐＨ８．０）に溶解したモノクロー
ナル抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を、１７倍モル過剰量のＮ−
サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オネート（ＳＰＤＰ）のエタノール溶液（１０ｍＭ）と
混合した後、３７℃で３０分間培養した。この反応を、
ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）を含む２００ｍＭのＨＥＰＥＳ
バッファー（ｐＨ７．９）で平衡にしたセファデックス
Ｇ２５カラムを用いて４℃でゲルろ過することによって
終了させた。得られたモノクローナル抗体を、文献記載
の方法で測定したところ、抗体１分子当たり約３個のジ
チオピリジル基が導入されていることが判明した（Ｏｚ
ａｗａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅ
ｒ，４３，１５２−１５７，（１９８９）；Ｌａｍｂｅ
ｒｔ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６０，１２０３５−１２０４１（１９８
５））。次いで、得られた反応生成物を、１０倍量のＨ
ＢＳバッファー（ＨＥＰＥＳ２０ｍＭ（ｐＨ７．３）、
ＮａＣ１１５０ｍＭ）で４℃で希釈し、限界ろ過をした
後、メンブレンでろ過した。Modification of Monoclonal Antibody Monoclonal antibody (1 mg / ml) dissolved in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing EDTA (0.5 mM) was added with a 17-fold molar excess of N-.
After mixing with succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) in ethanol (10 mM), the mixture was incubated at 37 ° C for 30 minutes. This reaction
200 mM HEPES containing EDTA (0.5 mM)
It was terminated by gel filtration using a Sephadex G25 column equilibrated with buffer (pH 7.9) at 4 ° C. When the obtained monoclonal antibody was measured by the method described in the literature, it was found that about 3 dithiopyridyl groups were introduced per antibody molecule (Oz
awa, S.S. , Et al: Int. J. Cancel
r, 43, 152-157, (1989); Lambe.
rt, J. M. , Et al: J. Biol. Che
m. , 260, 12035-12041 (198
5)). Then, the obtained reaction product was mixed with 10 volumes of H 2.
BS buffer (HEPES 20 mM (pH 7.3),
It was diluted with NaC1150 mM) at 4 ° C., subjected to ultrafiltration and then filtered with a membrane.
【００２８】ポリリジンの修飾 ポリリジン水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を、それぞれが６０
ｍＭと１ｍＭの最終濃度になるようにトリエタノールア
ミン／ＨＣｌバッファー０．５Ｍ（ｐＨ８．０）とＥＤ
ＴＡ０．１Ｍとを混合した。この混合物から脱気をし、
０℃で窒素中に放置した後、０℃で窒素中において２−
イミノチオラン（１ｍＭ）を用いて２時間処理した。過
剰の試薬を除去した後、１／１０量の０．５ｍＭトリエ
タノールアミン／ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を添
加して、ポリリジンのｐＨを７．０に上げた。Modification of polylysine An aqueous solution of polylysine (1 mg / ml) was added to each of 60 parts.
Triethanolamine / HCl buffer 0.5 M (pH 8.0) and ED to final concentration of mM and 1 mM
TA 0.1M was mixed. Degas this mixture,
After leaving in nitrogen at 0 ° C., in nitrogen at 0 ° C. 2-
It was treated with iminothiolane (1 mM) for 2 hours. After removing excess reagent, the pH of polylysine was raised to 7.0 by adding 1/10 amount of 0.5 mM triethanolamine / HCl buffer (pH 8.0).
【００２９】修飾モノクローナル抗体と修飾ポリリジン
との結合体の調製 修飾モノクローナル抗体のＨＢＳバッファー溶液を等量
（約５倍モル過剰量）の修飾ポリリジンと混合した。こ
の混合物を４℃で２０時間窒素条件下で放置した。次い
で、２ｍＭヨードアセタミドを添加して残存する遊離の
スルフヒドリル基をブロックして、２５℃で更に１時間
培養を続けた。Preparation of Conjugate of Modified Monoclonal Antibody and Modified Polylysine An HBS buffer solution of modified monoclonal antibody was mixed with an equal amount (about 5-fold molar excess) of modified polylysine. The mixture was left under nitrogen conditions at 4 ° C. for 20 hours. Then, 2 mM iodoacetamide was added to block the remaining free sulfhydryl groups, and the culture was continued at 25 ° C. for another hour.
【００３０】修飾モノクローナル抗体と修飾ポリリジン
との結合体の精製 得られた修飾モノクローナル抗体と修飾ポリリジンとの
結合体を、モノＳＨＲ５／Ｓカラム（ファルマシア社
製）でのカチオン交換クロマトグラフィーによってＡバ
ッファー８０％／Ｂバッファー２０％からＢバッファー
１００％までの傾斜法によって単離した。ここでＡバッ
ファーは５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）からな
り、ＢバッファーはＡバッファーと３ＭＮａＣｌとの混
合液からなっている。１．６５Ｍ２Ｍとの食塩の間で溶
離することによって得られた生成物分画をＨＢＳで塩析
した後、メンブレンでろ過することによって、使用した
結合体に沈殿物が何ら含まれていないことを確認した。Purification of the conjugate of modified monoclonal antibody and modified polylysine The obtained conjugate of modified monoclonal antibody and modified polylysine was subjected to cation exchange chromatography on a Mono SHR5 / S column (Pharmacia) to obtain A buffer 80. % / B buffer 20% to B buffer 100%. Here, the A buffer consists of 50 mM HEPES (pH 7.9), and the B buffer consists of a mixed solution of A buffer and 3M NaCl. The product fraction obtained by eluting between 1.65M and 2M sodium chloride was salted out with HBS and then filtered through a membrane to ensure that the conjugate used did not contain any precipitate. confirmed.
【００３１】結合体／ＤＮＡ複合体の調製およびＤＮＡ
デリバリーのためのアッセイ 上記において修飾モノクローナル抗体と修飾ポリリジン
との結合体とＤＮＡとの複合体は、文献記載の方法に従
って作製した（Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ：
Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３，１４７−１５４
（１９９２））。つまり、上記結合体とｐＳＶ２ＣＡＴ
プラスミドＤＮＡとを室温で３０分間培養した後、得ら
れた複合体を１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で３７℃で
５％ＣＯ２の存在下で生育させたＮＡ細胞を５ｘ１０５
個含む組織培養皿に入れた。この細胞を３７℃で２４時
間培養して、１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭで洗浄した後、６
０時間放置した。図１に示すように、得られた複合体
は、アガロース電気泳動により、ＤＮＡ自体とは別個の
泳動パターンを示していることが分かる。得られたＤＮ
Ａ／結合体の複合体は、ＤＮＡ濃度に比例して作製され
た。Preparation of Conjugate / DNA Complex and DNA
Assay for Delivery In the above, a complex of the modified monoclonal antibody-modified polylysine conjugate and DNA was prepared according to the method described in the literature (Curiel, DT, et al:
Hum. Gene Ther. , 3,147-154
(1992)). That is, the above conjugate and pSV2CAT
After incubating with the plasmid DNA at room temperature for 30 minutes, the resulting complex was allowed to grow in the DMEM containing 10% FCS at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 5 × 10 5 NA cells.
Individual tissue culture dishes. After culturing the cells at 37 ° C. for 24 hours and washing with 10% FCS / DMEM, 6
It was left for 0 hours. As shown in FIG. 1, it can be seen that the obtained complex shows a migration pattern distinct from that of the DNA itself by agarose electrophoresis. DN obtained
The A / conjugate complex was made in proportion to DNA concentration.
【００３２】レポータージーン発現を評価するために、
細胞ライゼート（溶菌液）を文献記載の方法で作製し
（Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６２，４４２９−４４３２（１９８７））、そ
のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（ＣＡＴ）活性を測定するために文献記載の方法でアッ
セイした（Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ：Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１０４４−１０５１
（１９８２））。つまり、細胞抽出物を、［１４Ｃ］ク
ロラムフェニコールを４ｍＭアセチルコエンザイムＡ添
加の０．２５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解し
て、３７℃で６０分間培養した。その薄層クロマトグラ
フィープレートをイメージングプレートを用いて室温で
２時間オートラジオグラフに掛けて分析した。そのＣＡ
Ｔ活性測定の結果、この複合体で処理されたＮＡ細胞で
は、著しいＣＡＴ活性が発現したのに対して、ＤＮＡの
みおよび抗体と、ポリリジンと、ＤＮＡとの混合物で処
理したＮＡ細胞にはかかる活性は発現していなかった
（図３）。また、このＣＡＴ活性は、図４に示すよう
に、トランスフェクションのために２倍のＤＮＡを複合
させた結合体を使用したときに増加した。つまり、ＣＡ
ＴジーンＤＮＡは、ＥＧＦレセプターを介してモノクロ
ーナル抗体によって細胞中に導入されて、トランスフェ
クションされた細胞中で発現した。To assess reporter gene expression,
A cell lysate (lysate) was prepared by the method described in the literature (Wu, G. Y. et al: J. Biol. Che.
m. , 262, 4429-4432 (1987)), and assayed for its chloramphenicol acetyltransferase (CAT) activity by methods described in the literature (Gorman, CM et al: Mo).
l. Cell. Biol. , 2,1044-1051
(1982)). That is, the cell extract was dissolved in 0.25 M Tris-HCl (pH 7.5) supplemented with 4 mM acetylcoenzyme A containing [ 14 C] chloramphenicol and incubated at 37 ° C. for 60 minutes. The thin layer chromatography plate was autoradiographed for 2 hours at room temperature using an imaging plate and analyzed. That CA
As a result of T activity measurement, remarkable CAT activity was expressed in NA cells treated with this complex, whereas such activity was observed in NA cells treated with only DNA or a mixture of antibody, polylysine and DNA. Was not expressed (Fig. 3). Also, this CAT activity was increased when a conjugate with double DNA complex was used for transfection, as shown in FIG. That is, CA
T-gene DNA was introduced into cells by a monoclonal antibody via the EGF receptor and expressed in transfected cells.
【００３３】結合アッセイおよび競合阻害アッセイ モノクローナル抗体を、ヨードビーズを用いて１２５Ｉ
で標識した。得られた結合体を文献記載の方法でアッセ
イした（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，３６
００−３６０４（１９８０））。２４穴プラスチック皿
で密集細胞培養された細胞を、氷上で冷却しながら、氷
冷ＥＢＳＳ１ｍｌで２度洗浄した後、１２５Ｉ（約３０
０００ｃｐｍ）で標識したモノクローナル抗体と共に、
標識していないモノクローナル抗体、モノクローナル抗
体とポリリジンとの結合体、ならびにモノクローナル抗
体−ポリリジン結合体／ＤＮＡ複合体を種々の濃度にＥ
ＢＳＳバッファー１ｍｌに溶解した溶液で２時間処理し
た。次いで、細胞をＥＢＳＳ１ｍｌで２度洗浄して、１
ＮＮａＯＨ中に可溶化した。細胞の放射能強度をガンマ
コウンターで測定した。得られたモノクローナル抗体−
ポリリジン結合体／ＤＮＡ複合体は、１２５Ｉ−モノク
ローナル抗体の細胞への結合を阻害するから、ＥＧＦレ
セプターに結合していることは明白である（図２）。Binding and Competitive Inhibition Assays Monoclonal antibody was bound to 125 I using iodo beads.
Labeled with. The resulting conjugates were assayed by methods described in the literature (Shimizu, N. et al .: Pro.
c. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 36
00-3604 (1980)). The cells, which had been subjected to confluent cell culture in a 24-well plastic dish, were washed twice with 1 ml of ice-cold EBSS while cooling on ice, and then 125 I (about 30
000 cpm) with a labeled monoclonal antibody,
Unlabeled monoclonal antibody, conjugates of monoclonal antibodies with polylysine, and monoclonal antibody-polylysine conjugates / DNA complexes were added at various concentrations.
It was treated with a solution dissolved in 1 ml of BSS buffer for 2 hours. The cells were then washed twice with 1 ml EBSS and 1
Solubilized in NNaOH. The radioactivity intensity of the cells was measured with a gamma counter. The obtained monoclonal antibody-
It is clear that the polylysine conjugate / DNA complex binds to the EGF receptor as it inhibits the binding of 125 I-monoclonal antibody to cells (FIG. 2).
【００３４】[0034]
【発明の効果】本発明に係る結合体および複合体は、そ
の成分であるモノクローナル抗体として、ＥＧＦレセプ
ターに対して特異的であって、種々の型の細胞のうちで
も、ＥＧＦレセプターを過剰に産生する細胞だけを標的
として認識することができる。また本発明に係る結合体
に使用されているポリリジンなどのは、アフィニテイー
による結合によってその成分である遺伝子を複合体に導
入することができるので、本発明に係る方法を応用すれ
ば、いかなる遺伝子をも細胞中に導入することができ、
極めて有用なものである。INDUSTRIAL APPLICABILITY The conjugate and the complex according to the present invention are specific to the EGF receptor as a monoclonal antibody, which is a component thereof, and excessively produce the EGF receptor among various types of cells. Only target cells can be recognized as targets. Further, since polylysine and the like used in the conjugate according to the present invention can introduce the gene that is a component thereof into the complex by binding by affinity, any gene can be obtained by applying the method according to the present invention. Can also be introduced into cells,
It is extremely useful.
【図１】図１は、モノクローナル抗体−ポリリジン／Ｄ
ＮＡ複合体のアガロースゲル電気泳動のパターンを示す
泳動図 モノクローナル抗体−ポリリジンの結合体（０．２μ
ｇ）を、ｐＳＶ２ＣＡＴプラスミドＤＮＡ（０．２、１
または２μｇ）と混合して、アガロースゲルを用いて電
気泳動を行なった。ＤＮＡの存在はＵＶ発色下でエチジ
ウムブロマイドで可視することができた。ＤＮＡマーカ
ーはＢｓｔＰＩで消化されたλＤＮＡである。FIG. 1 is a monoclonal antibody-polylysine / D.
Electrophoresis diagram showing agarose gel electrophoresis pattern of NA complex Monoclonal antibody-polylysine conjugate (0.2 μm)
g) to pSV2CAT plasmid DNA (0.2, 1
Alternatively, it was mixed with 2 μg) and subjected to electrophoresis using agarose gel. The presence of DNA was visible with ethidium bromide under UV development. The DNA marker is λDNA digested with BstPI.
【図２】図２は、モノクローナル抗体−ポリリジン／Ｄ
ＮＡ複合体による１２５Ｉ−モノクローナル抗体結合の
競合阻害を示すグラフ。１２５Ｉ−モノクローナル抗体
のＡ５４９細胞への結合は、モノクローナル抗体−ポリ
リジン結合体またはそのＤＮＡ複合体の量を増加しなが
ら測定した。FIG. 2 is a monoclonal antibody-polylysine / D.
FIG. 6 is a graph showing competitive inhibition of 125 I-monoclonal antibody binding by NA complex. Binding of 125 I-monoclonal antibody to A549 cells was measured with increasing amounts of monoclonal antibody-polylysine conjugate or its DNA complex.
【図３】図３は、モノクローナル抗体−ポリリジン／Ｄ
ＮＡ複合体によるＣＡＴジーントランスフェクションを
示す図であって、複合体形成によるＣＡＴジーンの導入
を示している。ＮＡ細胞を、ＤＮＡだけ、モノクローナ
ル抗体と、ポリリジンと、ＤＮＡとの混合物、およびモ
ノクローナル抗体−ポリリジン／ＤＮＡ複合体と共に、
培養した。ＣＡＴ活性は、３−ＡｃＣＭの産生として検
出した。FIG. 3 is a monoclonal antibody-polylysine / D.
FIG. 7: CAT gene transfection with NA complex showing introduction of CAT gene by complex formation. NA cells were treated with DNA alone, a mixture of monoclonal antibody, polylysine, and DNA, and a monoclonal antibody-polylysine / DNA complex,
Cultured. CAT activity was detected as production of 3-AcCM.
【図４】図４は、モノクローナル抗体−ポリリジン／Ｄ
ＮＡ複合体によるＣＡＴジーントランスフェクションを
示す図であって、用量依存性発現を示している。ＮＡ細
胞を、モノクローナル抗体−ポリリジン結合体（１０μ
ｇ）と、ｐＳＶ２ＣＡＴプラスミドＤＮＡ（１０または
２０μｇ）との複合体で処理した。FIG. 4 is a monoclonal antibody-polylysine / D.
FIG. 6 shows CAT gene transfection with NA complex, showing dose-dependent expression. NA cells were treated with a monoclonal antibody-polylysine conjugate (10 μm).
g) with pSV2CAT plasmid DNA (10 or 20 μg).
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｚ // Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Office reference number FI technical display area C07H 21/04 Z // C12P 21/08 9161-4B
Claims (14)
ノクローナル抗体と、スペーサーとからなることを特徴
とする上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノクロー
ナル抗体の結合体。1. A conjugate of a monoclonal antibody against an epidermal growth factor receptor, which comprises a monoclonal antibody against the epidermal growth factor receptor and a spacer.
ノクローナル抗体と、遺伝子とが、スペーサーを介しま
たは介さずに結合して複合体を形成していることを特徴
とする上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノクロー
ナル抗体の複合体。2. A monoclonal antibody against an epidermal growth factor receptor, wherein a monoclonal antibody against the epidermal growth factor receptor and a gene are bound to each other with or without a spacer to form a complex. Complex.
セプターに対するモノクローナル抗体の結合体におい
て、前記モノクローナル抗体が上皮細胞増殖因子レセプ
ターを特異的に認識するモノクローナル抗体であるこ
と。3. The conjugate of a monoclonal antibody against the epidermal growth factor receptor according to claim 1, wherein the monoclonal antibody is a monoclonal antibody that specifically recognizes the epidermal growth factor receptor.
セプターに対するモノクローナル抗体の結合体におい
て、前記スペーサーがポリリジンであること。4. In the conjugate of the monoclonal antibody against the epidermal growth factor receptor according to claim 1, the spacer is polylysine.
セプターに対するモノクローナル抗体の複合体におい
て、前記モノクローナル抗体が上皮細胞増殖因子レセプ
ターを特異的に認識するモノクローナル抗体であるこ
と。5. The complex of a monoclonal antibody against the epidermal growth factor receptor according to claim 2, wherein the monoclonal antibody is a monoclonal antibody that specifically recognizes the epidermal growth factor receptor.
セプターに対するモノクローナル抗体の複合体におい
て、前記遺伝子が癌遺伝子であること。6. The complex of the monoclonal antibody against the epidermal growth factor receptor according to claim 2, wherein the gene is an oncogene.
セプターに対するモノクローナル抗体の複合体におい
て、前記癌遺伝子がチミジンキナーゼ遺伝子、癌抑制遺
伝子またはオンコジンであること。7. The complex of a monoclonal antibody against an epidermal growth factor receptor according to claim 6, wherein the oncogene is a thymidine kinase gene, a tumor suppressor gene or oncodin.
セプターに対するモノクローナル抗体の複合体におい
て、前記スペーサーがポリリジンであること。8. The complex of the monoclonal antibody against the epidermal growth factor receptor according to claim 2, wherein the spacer is polylysine.
ノクローナル抗体と、遺伝子とを、スペーサーを介して
または介さずに結合させてなる上皮細胞増殖因子レセプ
ターに対するモノクローナル抗体の複合体を、ＥＧＦレ
セプターを介して細胞中に導入する方法。9. A complex of a monoclonal antibody against an epidermal growth factor receptor, which is obtained by binding a monoclonal antibody against an epidermal growth factor receptor and a gene via a spacer or not, is a cell via an EGF receptor. How to introduce inside.
複合体が導入される細胞が上皮細胞増殖因子レセプター
を過剰産生する細胞であること。10. The method according to claim 9, wherein the cells into which the complex is introduced are cells that overproduce epidermal growth factor receptor.
記細胞が癌細胞であること。11. The method according to claim 10, wherein the cells are cancer cells.
細胞に癌遺伝子をエンドサイトーシスすること。12. The method according to claim 9, wherein the cell is endocytosed with an oncogene.
ノクローナル抗体と、スペーサーとを結合させることを
特徴とする上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノク
ローナル抗体の結合体の製法。13. A method for producing a conjugate of a monoclonal antibody against an epidermal growth factor receptor, which comprises binding a monoclonal antibody against the epidermal growth factor receptor and a spacer.
ノクローナル抗体に遺伝子を、スペーサーを介してまた
は介さずに結合することを特徴とする上皮細胞増殖因子
レセプターに対するモノクローナル抗体の複合体の製
法。14. A method for producing a complex of a monoclonal antibody against an epidermal growth factor receptor, which comprises binding a gene to a monoclonal antibody against an epidermal growth factor receptor with or without a spacer.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04032694A JP3825815B2 (en) | 1994-01-31 | 1994-01-31 | Conjugates of monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor and their complexes and methods for their insertion into cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04032694A JP3825815B2 (en) | 1994-01-31 | 1994-01-31 | Conjugates of monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor and their complexes and methods for their insertion into cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07216000A true JPH07216000A (en) | 1995-08-15 |
| JP3825815B2 JP3825815B2 (en) | 2006-09-27 |
Family
ID=12577491
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04032694A Expired - Lifetime JP3825815B2 (en) | 1994-01-31 | 1994-01-31 | Conjugates of monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor and their complexes and methods for their insertion into cells |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3825815B2 (en) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6613564B2 (en) | 1999-12-22 | 2003-09-02 | Nichirei Corporation | Enzyme-protein complex |
| JP2012533738A (en) * | 2009-07-15 | 2012-12-27 | ネステク ソシエテ アノニム | Drug selection for gastric cancer therapy using antibody-based arrays |
| US9250243B2 (en) | 2006-09-21 | 2016-02-02 | Nestec S.A. | Drug selection for lung cancer therapy using antibody-based arrays |
| US9274116B2 (en) | 2008-02-25 | 2016-03-01 | Nestec S.A. | Drug selection for breast cancer therapy using antibody-based arrays |
| US9285369B2 (en) | 2006-09-21 | 2016-03-15 | Nestec S.A. | Antibody-based arrays for detecting multiple signal transducers in rare circulating cells |
| US9664683B2 (en) | 2011-09-02 | 2017-05-30 | Pierian Holdings, Inc. | Profiling of signal pathway proteins to determine therapeutic efficacy |
| US9719995B2 (en) | 2011-02-03 | 2017-08-01 | Pierian Holdings, Inc. | Drug selection for colorectal cancer therapy using receptor tyrosine kinase profiling |
-
1994
- 1994-01-31 JP JP04032694A patent/JP3825815B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6613564B2 (en) | 1999-12-22 | 2003-09-02 | Nichirei Corporation | Enzyme-protein complex |
| US7235369B2 (en) | 1999-12-22 | 2007-06-26 | Nichirei Biosciences Inc. | Enzyme-protein complex |
| US9575066B2 (en) | 2006-09-21 | 2017-02-21 | Nestec S.A. | Antibody-based arrays for detecting multiple signal transducers in rare circulating cells |
| US9250243B2 (en) | 2006-09-21 | 2016-02-02 | Nestec S.A. | Drug selection for lung cancer therapy using antibody-based arrays |
| US9285369B2 (en) | 2006-09-21 | 2016-03-15 | Nestec S.A. | Antibody-based arrays for detecting multiple signal transducers in rare circulating cells |
| US10473640B2 (en) | 2006-09-21 | 2019-11-12 | Société des Produits Nestlé S.A. | Drug selection for gastric cancer therapy using antibody-based arrays |
| US10527622B2 (en) | 2006-09-21 | 2020-01-07 | Société des Produits Nestlé S.A. | Antibody-based arrays for detecting multiple signal transducers in rare circulating cells |
| US9274116B2 (en) | 2008-02-25 | 2016-03-01 | Nestec S.A. | Drug selection for breast cancer therapy using antibody-based arrays |
| US10436786B2 (en) | 2008-02-25 | 2019-10-08 | Société des Produits Nestlé S.A. | Methods for detecting truncated receptors using antibody-based arrays |
| JP2012533738A (en) * | 2009-07-15 | 2012-12-27 | ネステク ソシエテ アノニム | Drug selection for gastric cancer therapy using antibody-based arrays |
| US9719995B2 (en) | 2011-02-03 | 2017-08-01 | Pierian Holdings, Inc. | Drug selection for colorectal cancer therapy using receptor tyrosine kinase profiling |
| US10401364B2 (en) | 2011-02-03 | 2019-09-03 | Soiété Des Produits Nestlé S.A. | Drug selection for colorectal cancer therapy using receptor tyrosine kinase profiling |
| US9664683B2 (en) | 2011-09-02 | 2017-05-30 | Pierian Holdings, Inc. | Profiling of signal pathway proteins to determine therapeutic efficacy |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3825815B2 (en) | 2006-09-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hannan et al. | Endothelial cells synthesize basic fibroblast growth factor and transforming growth factor beta | |
| Richardson et al. | A role for platelet-derived growth factor in normal gliogenesis in the central nervous system | |
| US6150168A (en) | Nucleic acid transporter systems and methods of use | |
| Mansson et al. | Heparin-binding growth factor gene expression and receptor characteristics in normal rat prostate and two transplantable rat prostate tumors | |
| Chen et al. | A novel gene delivery system using EGF receptor‐mediated endocytosis | |
| Schaefer et al. | γ-Heregulin: a novel heregulin isoform that is an autocrine growth factor for the human breast cancer cell line, MDA-MB-175 | |
| Huckett et al. | Evidence for targeted gene transfer by receptor-mediated endocytosis: Stable expression following insulin-directed entry of neo into HepG2 cells | |
| AU676502B2 (en) | HER4 human receptor tyrosine kinase | |
| Sizeland et al. | Anti-sense transforming growth factor alpha oligonucleotides inhibit autocrine stimulated proliferation of a colon carcinoma cell line. | |
| EP0273085A1 (en) | A method for internalizing nucleic acids into eukaryotic cells | |
| JPH06510524A (en) | Targeted delivery of genes encoding immunogenic proteins | |
| JP2002114710A (en) | Treating agent to use monoclonal antibody together with antitumor agent | |
| CN109453187B (en) | Antibody nucleic acid drug conjugate with dual enzyme sensitivity characteristics and preparation method and application thereof | |
| Eccles et al. | Regression of Established Breast Carcinoma Xenografts with Antibody-directed Enzyme Prodrug Therapy against c-erb B2 p185 | |
| EP3854418A1 (en) | Treatment of her3 mutant cancer by administration of anti-her3 antibody-drug conjugate | |
| CN106810610A (en) | Anti-EpCAM and the double targeting antibodies of CD3 specificity and its preparation method and application, the minicircle dna containing this pair of targeting antibodies expression cassette and application | |
| JP3825815B2 (en) | Conjugates of monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor and their complexes and methods for their insertion into cells | |
| CN106084062B (en) | Bridged bispecific fusion proteins | |
| EP1824879B1 (en) | HYBRID PROTEINS WITH ErbB4 EXTRACELLULAR DOMAIN AND NEUREGULIN HEPARIN-BINDING DOMAIN FOR TARGETING | |
| NZ231837A (en) | Platelet-derived endothelial cell growth factor, fragments, antibodies, recombinant production and pharmaceutical compositions | |
| Dini et al. | Overexpression of the 18 kDa and 22/24 kDa FGF‐2 isoforms results in differential drug resistance and amplification potential | |
| JPH01503518A (en) | Polypeptides with growth factor activity encoded by oncogenes and methods for their production and use | |
| Cao et al. | Intracellular localization and sustained prodrug cell killing activity of TAT-HSVTK fusion protein in hepatocelullar carcinoma cells | |
| CN107556386A (en) | Anti- EGFRvIII and CD3 specificity double targeting antibodies, the minicircle dna containing double targeting antibodies expression cassettes and applications | |
| US5804412A (en) | Nucleic acids encoding sorting nexins and methods of using same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20040106 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A521 | Written amendment |
Effective date: 20040302 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041115 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050215 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050418 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20050418 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20050613 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20050613 Effective date: 20050613 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 |
|
| A521 | Written amendment |
Effective date: 20050803 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Effective date: 20060606 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060703 |
|
| R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100707 Year of fee payment: 4 |