JPH07170981A - Production of oligonucleotide - Google Patents
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- JPH07170981A JPH07170981A JP31855493A JP31855493A JPH07170981A JP H07170981 A JPH07170981 A JP H07170981A JP 31855493 A JP31855493 A JP 31855493A JP 31855493 A JP31855493 A JP 31855493A JP H07170981 A JPH07170981 A JP H07170981A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】この発明は、オリゴヌクレオチド
の製造法に関するものである。さらに詳しくは、この発
明は、ガンや難治性ウイルス疾患の遺伝子治療に用いる
アンチセンス分子として有用なホスホロチオエート型オ
リゴヌクレオチドの新規な製造法に関するものである。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing an oligonucleotide. More specifically, the present invention relates to a novel method for producing a phosphorothioate-type oligonucleotide useful as an antisense molecule used for gene therapy of cancer and intractable viral diseases.
【０００２】[0002]
【従来の技術】近年、組換えＤＮＡをはじめとする遺伝
子操作技術の進歩には目覚しいものがあり、生物学一般
のみならず、医学、工学、農学等への応用展開も急速に
拡大しつつある。また、遺伝子そのもについても、その
塩基配列と構造の解析から多数の知見が蓄積されてきて
おり、今日では、多くの原因不明の疾患が遺伝子に関係
することも明らかになってきている。例えばガン遺伝子
発見はガンもまた遺伝子病の１つとして考えるべきであ
ることを示し、また、ある種のウイルスは発ガンに強く
関与していることもわかってきた。こうした背景からガ
ンあるいは難治性ウイルス疾患を対象として、直接遺伝
子に作用する形で治療を行おうとする試み、すなわちア
ンチセンス技術による遺伝子治療が考え出されている。2. Description of the Related Art In recent years, there have been remarkable advances in gene manipulation techniques such as recombinant DNA, and their application to not only general biology but also medicine, engineering, agriculture, etc. is rapidly expanding. . In addition, regarding the gene itself, a large amount of knowledge has been accumulated from the analysis of its nucleotide sequence and structure, and it is now clear that many diseases of unknown cause are related to the gene. For example, oncogene discovery has shown that cancer should also be considered as one of genetic diseases, and it has also been found that certain viruses are strongly involved in carcinogenesis. Against this background, attempts have been made to treat cancer or intractable viral diseases by directly acting on genes, that is, gene therapy by antisense technology.
【０００３】すなわち、ＤＮＡの複製、転写（ＤＮＡか
らのＲＮＡ生産）、翻訳（ＲＮＡからのタンパク質生
産）などの遺伝子発現は、遺伝子と種々のタンパク質と
の相互作用によって行われる。その際遺伝子の特定領域
を何らかの分子で選択的に被覆あるいは切断することが
できれば、遺伝子の発現は選択的に制御されることにな
る。アンチセンス技術はその際用いられる分子（アンチ
センス分子）として核酸およびその誘導体を用いる方法
であり、この方法の基本的原理は原核細胞生物で実際に
機能していることが見いだされている。図１にアンチセ
ンス法の基本的原理を示す。遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）
の特定領域（１本鎖あるいは２本鎖）を、相補的な塩基
配列を持つＤＮＡ、ＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチド
（修飾体も含む）で被覆すれば（図１の→１、２、３、
４部分）、その部分の遺伝子発現は選択的に抑制され
る。この際の抑制メカニズムとして （１）物理的に調節分子（リプレサーなど）や合成酵素
類を遺伝子に結合できなくする、（２）対象遺伝子が切
断される、（３）アンチセンス分子と対象遺伝子との二
重鎖形成が内在性加水分解酵素群を活性化しＲＮＡなど
が不活性化される、などが考えられている。こうした機
構を機能させる目的で現在までに数多くのアンチセンス
分子が化学的、生物学的手法で開発されてきている。That is, gene expression such as DNA replication, transcription (RNA production from DNA) and translation (protein production from RNA) is carried out by the interaction between genes and various proteins. In that case, if the specific region of the gene can be selectively covered or cleaved with some molecule, the expression of the gene will be selectively controlled. The antisense technique is a method using a nucleic acid and its derivative as a molecule (antisense molecule) used at that time, and the basic principle of this method has been found to actually function in prokaryotic organisms. Figure 1 shows the basic principle of the antisense method. Gene (DNA, RNA)
If a specific region (single-stranded or double-stranded) of is coated with DNA, RNA, and oligonucleotides (including modified forms) having complementary nucleotide sequences (→ 1, 2, 3, in FIG. 1)
4 part), the gene expression of that part is selectively suppressed. As a suppression mechanism in this case, (1) it becomes impossible to physically bind regulatory molecules (repressor etc.) and synthases to the gene, (2) the target gene is cleaved, (3) antisense molecule and the target gene It is considered that the formation of the double strand of activating the endogenous hydrolase group and inactivating RNA and the like. To date, many antisense molecules have been developed by chemical and biological methods in order to make such a mechanism work.
【０００４】ところが、アンチセンス分子を生体内で作
用させるためにはつぎのような要件を考慮しなければな
らない。すなわち、（１）塩基配列特異性、（２）ハイ
ブリッド安定性、（３）化学的、生化学的安定性、
（４）免疫原性、（５）細胞膜透過性、（６）細胞毒
性、（７）代謝性、（８）調製法等であり、アンチセン
ス分子を化学的に合成する際は、それらに基づいて分子
設計、合成について考慮すべきである。However, in order for the antisense molecule to act in vivo, the following requirements must be considered. That is, (1) base sequence specificity, (2) hybrid stability, (3) chemical and biochemical stability,
(4) Immunogenicity, (5) Cell membrane permeability, (6) Cytotoxicity, (7) Metabolism, (8) Preparation method, etc., based on which antisense molecules are chemically synthesized. Consideration should be given to molecular design and synthesis.
【０００５】こうした理由から、現在実際に使用されて
いる合成アンチセンス分子は、リン酸結合を修飾したも
のが多い。また、リン酸ジエステル結合を持つ天然型の
オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の場合には、この化学合
成はホスホロアミダイト法を採用したＤＮＡ自動合成機
によって容易に行われる。ＯＤＮは対象ＤＮＡあるいは
ＲＮＡと安定な二重鎖を形成しアンチセンス分子として
の機能も高いが、反面リン酸ジエステル結合が細胞培養
液あるいは体液などに含まれるヌクレアーゼ類により容
易に加水分解される（半減期５分間程度）。従ってＯＤ
Ｎをそのまま体内投与することは実際上非常に困難であ
る。このため、体内での寿命を長くするために様々な工
夫がなされているが、分子としての安定性と対象ＤＮＡ
やＲＮＡとの２重鎖の安定性とが両立しない場合が多
い。For these reasons, many synthetic antisense molecules actually used at present are modified with phosphate bonds. Further, in the case of a natural type oligonucleotide (ODN) having a phosphodiester bond, this chemical synthesis is easily performed by an automatic DNA synthesizer adopting the phosphoramidite method. ODN forms a stable double strand with target DNA or RNA and has a high function as an antisense molecule, but on the other hand, phosphodiester bonds are easily hydrolyzed by nucleases contained in cell culture medium or body fluid ( Half-life of about 5 minutes). Therefore OD
It is practically very difficult to directly administer N into the body. Therefore, various measures have been taken to prolong the life in the body, but the stability as a molecule and the target DNA
In many cases, the stability of the double strand with RNA and RNA is not compatible.
【０００６】これに対して、アンチセンス分子が生理的
条件下で電気的に中性であればＤＮＡやＲＮＡとの相互
作用時に静電的斥力が働かないため二重鎖（ハイブリッ
ド）が安定に形成されるであろうとする考えから、トリ
エステル型（ＯＴＲ）、メチルホスホネート型（ＯＭ
Ｐ）、ホスホロチオエート（ＯＰＴ）、ホスホロアミデ
ード（ＯＰＡ）等のアンチセンス分子が開発されてい
る。On the other hand, if the antisense molecule is electrically neutral under physiological conditions, electrostatic repulsion does not work during interaction with DNA or RNA, so that the double strand is stable. From the idea that they will be formed, triester type (OTR), methylphosphonate type (OM
P), phosphorothioate (OPT), phosphoramidate (OPA) and other antisense molecules have been developed.
【０００７】なかでも次式にそのヌクレオチド構造を示
したＯＰＴ型オリゴヌクレオチドは、上記（１）〜
（８）の要件を最もよく満たすアンチセンス分子であ
り、現在、その作成と応用が広く検討されている。Among them, the OPT type oligonucleotides whose nucleotide structures are represented by the following formulas are
It is an antisense molecule that best meets the requirement of (8), and its preparation and application are currently being widely studied.
【０００８】[0008]
【化１】 [Chemical 1]
【０００９】[0009]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このＯ
ＰＴ型オリゴヌクレオチドはリン原子に対して立体異性
であり、各リン酸結合にそれぞれＳ型とＲ型の絶体配置
が存在するため（図２）、同一塩基配列のオリゴヌクレ
オチドであっても、ｎ量体では２n-1 個の異性体が出現
することになる。However, this O
The PT-type oligonucleotide is stereoisomeric to the phosphorus atom, and since there are S-type and R-type absolute configurations in each phosphate bond (FIG. 2), even if the oligonucleotides have the same base sequence, In the n-mer, 2 n-1 isomers will appear.
【００１０】たとえば４量体のオリゴヌクレオチドの場
合には、個々のインターヌクレオチド結合に関して、８
種類（ＲＲＲ、ＲＲＳ、ＲＳＳ、ＲＳＲ、ＳＲＲ、ＳＲ
Ｓ、ＳＳＲ、ＳＳＳ）の異性体が生成する。このため
に、ＯＰＴ型オリゴヌクレオチドからなるアンチセンス
分子は様々な立体異性体の混合物となり、対象遺伝子と
の結合力が弱くなるという欠点をもつ。For example, in the case of a tetrameric oligonucleotide, 8 for each internucleotide linkage.
Type (RRR, RRS, RSS, RSR, SRR, SR
S, SSR, SSS) isomers are produced. For this reason, the antisense molecule composed of the OPT type oligonucleotide has a drawback that it becomes a mixture of various stereoisomers and the binding force to the target gene is weakened.
【００１１】そこで、従来は、核酸と絶体配置について
莫大な組み合わせからなる立体異性体の混合物のなかか
ら、目的の機能を持った特定分子を選択しなければなら
ず、その調製作業には多大な時間と労力を必要とする。
このため、現在は、特定分子を選択せずに混合物のまま
のＯＰＴ型オリゴヌクレオチドを使用しているが、この
混合物は機能のない分子も多く含むため、目的とする効
果を得るためには過剰量のオリゴヌクレオチドを使用し
なければならない。しかしながら、ＯＰＴ型オリゴヌク
レオチドは数μｍｏｌの濃度を超えて細胞内に導入する
と毒性を示す。このため、ＯＰＴ型オリゴヌクレオチド
をアンチセンス療法に用いるためには、目的の機能を持
った特定分子のみを選択的に使用することが不可欠であ
る。Therefore, conventionally, it has been necessary to select a specific molecule having a desired function from a mixture of stereoisomers consisting of a huge combination of nucleic acids and absolute configurations, and it is very difficult to prepare the specific molecule. It takes a lot of time and effort.
For this reason, currently, OPT-type oligonucleotides that remain as a mixture without using a specific molecule are used, but since this mixture also contains many non-functional molecules, it is excessive to obtain the desired effect. Amount of oligonucleotide must be used. However, the OPT-type oligonucleotide is toxic when it is introduced into cells at a concentration exceeding several μmol. Therefore, in order to use the OPT type oligonucleotide for antisense therapy, it is indispensable to selectively use only a specific molecule having a desired function.
【００１２】この発明は、以上の通りの事情に鑑みてな
されたものであり、所望の塩基配列と絶体配置を有する
ＯＰＴ型オリゴヌクレオチドを、簡便かつ効率よく作製
するための方法を提供することを目的としている。The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a method for easily and efficiently producing an OPT-type oligonucleotide having a desired nucleotide sequence and an absolute configuration. It is an object.
【００１３】[0013]
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、所望の塩基配列と絶体配置とを
有するホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドの製造
法であって、（１）任意の塩基配列を有するホスホロチ
オエート型オリゴヌクレオチドを化学合成し、（２）逆
相クロマトグラフィー法によって、上記合成オリゴヌク
レオチドを５′末端保護のまま分離してホスホロチオエ
ート型オリゴヌクレオチドの各立体異性体集合を分取
し、（３）これらの立体異性体集合を、５′末端脱保護
ののち、逆相クロマトグラフィー法によってさらに分離
して各々の立体異性体を分取し、（４）得られた立体異
性体のなかから、所望の絶体配置を有するホスホロチオ
エート型オリゴヌクレオチドを選択し、それらの５′末
端をリン酸化して結合する、ことを特徴とするオリゴヌ
クレオチドの製造法を提供する。Means for Solving the Problems The present invention is, in order to solve the above problems, a method for producing a phosphorothioate-type oligonucleotide having a desired base sequence and an absolute configuration, which comprises (1) an arbitrary base A phosphorothioate-type oligonucleotide having a sequence is chemically synthesized, and (2) the above synthetic oligonucleotide is separated by 5'-terminal protection by a reverse phase chromatography method to separate each stereoisomer assembly of the phosphorothioate-type oligonucleotide. , (3) After deprotecting 5 ′ end of these stereoisomers, the stereoisomers are separated by reverse phase chromatography to separate each stereoisomer, and (4) Among them, phosphorothioate type oligonucleotides having a desired absolute configuration are selected, and their 5'ends are phosphorylated and linked. To, to provide a process for the preparation of oligonucleotides, characterized in that.
【００１４】またこの発明の製造法は、上記（１）にお
いて化学合成したホスホロチオエート型オリゴヌクレオ
チドが３−８量体であること、（２）および（３）の逆
相クロマトグラフィー法に用いる溶離液が酢酸アンモニ
ウム水溶液を主成分とすること、（４）におけるホスホ
ロチオエート型ヌクレオチドの結合を酵素的方法または
化学的方法により行なうこと、およびそのようにして結
合されたオリゴヌクレオチドが１０−３０量体であるこ
と、をそれぞれ好ましい態様としてもいる。Further, in the production method of the present invention, the phosphorothioate type oligonucleotide chemically synthesized in the above (1) is a 3-8-mer, and the eluent used in the reverse phase chromatography method of (2) and (3). Is an aqueous solution of ammonium acetate as a main component, the phosphorothioate type nucleotide in (4) is bound by an enzymatic method or a chemical method, and the oligonucleotide thus bound is a 10-30 mer. That is, each of them is also a preferred embodiment.
【００１５】[0015]
【作用】以下、この発明の製造法について詳しく説明す
る。 Ｉ．ＯＰＴ型オリゴヌクレオチドの合成 例えば、公知のホスホロアミダイト法固相自動合成と、
テトラエチルチウラムジスルフィド〔Ｅｔ2 ＮＣ（Ｓ）
ＳＳＣ（Ｓ）ＮＥｔ2 〕などのイオウ原子導入試薬を組
み合わせて、任意の塩基配列を有するＯＰＴ型オリゴヌ
クレオチドを合成する（図３）。ヌクレオチドの数は、
３〜８個（３〜８量体）、好ましくは４〜６個（４〜６
量体）とする。その結果、例えば５量体オリゴヌクレオ
チドの場合には、１６種類（２5-1 ）の立体異性体の集
合としてＯＰＴ型オリゴヌクレオチドが合成される。同
様に、４量体の場合には８種類（２4-1 ）、６量体の場
合には３２種類（２6-1 ）の異性体集合となる。The manufacturing method of the present invention will be described in detail below. I. Synthesis of OPT-type oligonucleotide For example, known phosphoramidite solid-phase automated synthesis,
Tetraethyl thiuram disulfide [Et 2 NC (S)
A sulfur atom introduction reagent such as SSC (S) NEt 2 ] is combined to synthesize an OPT type oligonucleotide having an arbitrary base sequence (FIG. 3). The number of nucleotides is
3 to 8 (3 to 8 mer), preferably 4 to 6 (4 to 6)
The quantity). As a result, for example, in the case of a pentamer oligonucleotide, the OPT type oligonucleotide is synthesized as a set of 16 types (2 5-1 ) of stereoisomers. Similarly, in the case of a tetramer, 8 kinds (2 4 -1 ) are formed, and in the case of a hexamer, 32 kinds (2 6-1 ) are formed.
【００１６】なお、塩基配列については特段の制限はな
く、アンチセンス分子としての用途に応じて適宜とする
ことができるが、例えば標的遺伝子の特定配列（発現調
節領域や構造遺伝子領域等）に対するハイブリッド安定
性等を考慮する。 II．異性体の分取（第１段階） まず、合成したＯＰＴ型オリゴヌクレオチドを逆相クロ
マトグラフィー法によって分離する。この時、各オリゴ
ヌクレオチドはその５′末端保護基を結合した状態でカ
ラムを通過させる。こうすることによって、例えば５量
体オリゴヌクレオチドの場合には、各異性体が４本の吸
光度（２５４ｎｍ）ピークとして分離される。同様に、
４量体の場合には、２本、６量体の場合には８本のピー
クとして分離される。なお、このような異性体分離は、
酢酸トリエチルアンモニウム水溶液を主成分とする溶離
液（ｐＨ７．０程度）をカラムに通液して行なうことが
できる。The base sequence is not particularly limited and may be appropriately set depending on the application as an antisense molecule. For example, a hybrid to a specific sequence of a target gene (expression control region, structural gene region, etc.) Consider stability etc. II. Isolation of isomers (first step) First, the synthesized OPT type oligonucleotides are separated by a reverse phase chromatography method. At this time, each oligonucleotide is passed through the column with its 5'end protecting group attached. By doing so, for example, in the case of a pentameric oligonucleotide, each isomer is separated as four absorbance (254 nm) peaks. Similarly,
In the case of a tetramer, two peaks are separated, and in the case of a hexamer, eight peaks are separated. In addition, such isomer separation is
It can be carried out by passing an eluent containing an aqueous solution of triethylammonium acetate as a main component (pH about 7.0) through the column.
【００１７】次に、分離した各異性体を分取する。これ
は公知の方法に従って行なうことができ、たとえば各ピ
ークに対応するカラム画分を切り出し、オリゴヌクレオ
チド分子を溶出、精製等すればよい。 III．異性体の分取（第２段階） 分取した各異性体を、上記IIと同様の逆相クロマトグラ
フィー法によってさらに分離する。ただし、この時に
は、各異性体オリゴヌクレオチドの５′末端保護基をは
ずした状態でカラムに流す。こうすることによって、上
記IIで分取された各異性体の集合が各々４本のピークと
して分離される。すなわち、４量体からは合計８本のピ
ーク（第１段階：２ピーク×第２段階：４ピーク）、５
量体からは１６ピーク（４×４）、６量体からは３２ピ
ーク（８×４）が得られ、それらを上記IIと同様に分取
することによって、各分子量に応じた数量の立体異性体
（すなわち、４量体→８個；５量体→１６個：６量体→
３２個）が得られる。 IV．各異性体の結合 上記 IIIで分取した各異性体についてその立体構造を分
析し、目的に応じて幾つかを選択し、各々の５′末端を
リン酸化して結合する。こうすることによって、所望の
塩基配列と、リン酸結合部位における所望の絶体配置と
を有するＯＴＰ型ヌクレオチドが得られる。Next, the separated isomers are separated. This can be performed according to a known method, for example, the column fraction corresponding to each peak is cut out, and the oligonucleotide molecule is eluted and purified. III. Fractionation of isomers (2nd step) Each isomer thus fractionated is further separated by the reverse phase chromatography method similar to the above II. However, at this time, the isomer oligonucleotide is applied to the column with the 5'end protecting group removed. By doing so, the collection of each isomer separated in II above is separated into four peaks. That is, a total of 8 peaks from the tetramer (1st stage: 2 peaks x 2nd stage: 4 peaks), 5
16 peaks (4 × 4) were obtained from the monomer and 32 peaks (8 × 4) were obtained from the hexamer, and by fractionating them in the same manner as in the above II, the stereoisomerism of the number corresponding to each molecular weight was obtained. Body (ie, tetramer → 8; pentamer → 16: hexamer →
32 pieces) are obtained. IV. Bonding of each isomer The three-dimensional structure of each isomer separated in the above III is analyzed, some of them are selected according to the purpose, and each 5'end is phosphorylated and bonded. By doing so, an OTP-type nucleotide having a desired nucleotide sequence and a desired absolute configuration at the phosphate binding site can be obtained.
【００１８】なお、このヌクレオチドは１０−３０量
体、好ましくは１５−２０量体程度となるように異性体
を結合して作成する。また、各異性体の結合は、例えば
Ｔ４ライゲースを用いた酵素的方法あるいは縮合剤を用
いた化学的方法を用いて行なうことができる。以下、実
施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明す
るが、この発明は以下の例に限定されるものではない。The nucleotide is prepared by combining isomers so that the nucleotide has a 10-30 mer, preferably a 15-20 mer. The isomers can be linked by an enzymatic method using T4 ligase or a chemical method using a condensing agent. Hereinafter, the present invention will be described in more detail and specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following examples.
【００１９】[0019]
【実施例】図３に示したように、ホスホロアミダイト法
固相自動合成とＥｔ2 ＮＣ（Ｓ）ＳＳＣ（Ｓ）ＮＥｔ2
によるイオウ原子の導入を組み合わせて、配列番号１記
載の塩基配列を有する５量体ＯＰＴ型オリゴヌクレオチ
ドを合成した。この合成オリゴヌクレオチドを、５′末
端の保護基（ＤＭＴｒ基）を結合した状態で市販の逆相
クロマトグラフィーカラム（４０℃）に注入し、０．１
Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）か
らなる溶離液（Ａ）と、等量の０．１Ｍ酢酸トリエチル
アンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）およびアセトニトリ
ルからなる溶離液（Ｂ）を流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで混
合比を変化させながら、順次カラムに通液し、２５４ｎ
ｍの吸光度を指標として異性体を分離した。その結果、
図４に示したように４本のピーク（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）が
得られた。EXAMPLE As shown in FIG. 3, phosphoramidite solid-phase automated synthesis and Et 2 NC (S) SSC (S) NEt 2
Was combined with the introduction of a sulfur atom to synthesize a pentameric OPT type oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. This synthetic oligonucleotide was injected into a commercially available reverse-phase chromatography column (40 ° C.) with a protecting group (DMTr group) at the 5 ′ end attached thereto, and 0.1
An eluent (A) consisting of M triethylammonium acetate aqueous solution (pH 7.0) and an eluent (B) consisting of an equal volume of 0.1 M triethylammonium acetate aqueous solution (pH 7.0) and acetonitrile (flow rate 1.0 ml / min). Flow through the column sequentially while changing the mixing ratio with 254n
Isomers were separated using the absorbance of m as an index. as a result,
As shown in FIG. 4, four peaks (A, B, C, D) were obtained.
【００２０】次いで、この４本のピークを分取し、それ
ぞれの５末端保護基を外したのち、上記と同様の逆相ク
ロマトグラフィー法により再度異性体を分離した。その
結果、図５に示したようにＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの各画分から
各々４本のピークが検出され、さらにこれら１６本のピ
ークについて分析した結果、各ピークが図５に示したＲ
／Ｓ異性体にそれぞれ対応することを確認した。Next, the four peaks were collected, the 5-terminal protecting groups were removed, and then the isomers were separated again by the reverse phase chromatography method similar to the above. As a result, four peaks were detected from each of A, B, C, and D fractions as shown in FIG. 5, and further analysis of these 16 peaks revealed that each peak had R shown in FIG.
It was confirmed to correspond to the / S isomers respectively.
【００２１】さらに、これら１６本のピークからそれぞ
れ異性体を分取し、５′末端をリン酸化したのち４個毎
に任意の組み合わせでＴ４ライゲース結合して４種類の
ＯＴＰ型オリゴヌクレオチドを作製した。これらのオリ
ゴヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列を反復する２
０量体（２０塩基）で、それぞれリン酸結合部位におけ
る絶体配置（Ｒ／Ｓ）が任意に設計されている。Further, isomers were respectively collected from these 16 peaks, the 5'ends were phosphorylated, and then each four were ligated with T4 ligase in any combination to prepare four kinds of OTP-type oligonucleotides. . These oligonucleotides repeat the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 2
It is a 0-mer (20 bases), and its absolute configuration (R / S) at each phosphate binding site is arbitrarily designed.
【００２２】[0022]
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
って、所望の分子量と、所望の塩基配列、および所望の
絶体配置を有するＯＰＴ型オリゴヌクレオチドを簡便か
つ計画的に作製することが可能となる。これによってＯ
ＰＴ型オリゴヌクレオチドのアンチセンス分子としての
有用性が一層拡大し、ガンや難治性ウイルス疾患に対す
る新たな治療法、治療薬の開発が促進される。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described in detail above, according to the present invention, an OPT type oligonucleotide having a desired molecular weight, a desired nucleotide sequence, and a desired absolute configuration can be simply and systematically produced. . This is O
The utility of PT type oligonucleotides as antisense molecules will be further expanded, and development of new therapeutic methods and therapeutic agents for cancer and intractable viral diseases will be promoted.
【００２３】[0023]
配列番号：１ 配列の長さ：５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＴＣＧ SEQ ID NO: 1 Sequence Length: 5 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid Synthetic DNA Sequence CATCG
【図１】アンチセンス法の基本原理を例示した模式図で
ある。FIG. 1 is a schematic view illustrating the basic principle of an antisense method.
【図２】各々、ＯＰＴ型オリゴヌクレオチドの異性体を
例示した構造図である。FIG. 2 is a structural diagram illustrating each isomer of an OPT type oligonucleotide.
【図３】自動合成によるＯＰＴ型オリゴヌクレオチドの
合成例を例示した模式図である。FIG. 3 is a schematic view illustrating a synthesis example of an OPT type oligonucleotide by automatic synthesis.
【図４】この発明方法における第１段階の異性体分離結
果を例示した吸光度（２５４ｎｍ）グラフである。FIG. 4 is an absorbance (254 nm) graph exemplifying the isomer separation result of the first step in the method of the present invention.
【図５】この発明方法における第２段階の異性体分離結
果を例示した吸光度（２５４ｎｍ）グラフである。FIG. 5 is an absorbance (254 nm) graph illustrating the isomer separation result in the second step in the method of the present invention.
Claims (5)
スホロチオエート型オリゴヌクレオチドの製造法であっ
て、 （１）任意の塩基配列を有するホスホロチオエート型オ
リゴヌクレオチドを化学合成し、 （２）逆相クロマトグラフィー法によって、上記合成オ
リゴヌクレオチドを５′末端保護のまま分離してホスホ
ロチオエート型オリゴヌクレオチドの各立体異性体集合
を分取し、 （３）これらの立体異性体集合を、５′末端脱保護のの
ち、逆相クロマトグラフィー法によってさらに分離して
各々の立体異性体を分取し、 （４）得られた立体異性体のなかから、所望の絶体配置
を有するホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドを選
択し、それらの５′末端をリン酸化して結合する、こと
を特徴とするオリゴヌクレオチドの製造法。1. A method for producing a phosphorothioate type oligonucleotide having a desired base sequence and an absolute configuration, which comprises (1) chemically synthesizing a phosphorothioate type oligonucleotide having an arbitrary base sequence, and (2) a reverse phase. By the chromatographic method, the above synthetic oligonucleotides were separated while the 5'ends were protected, and the stereoisomeric sets of phosphorothioate type oligonucleotides were collected. (3) These stereoisomeric sets were deprotected with 5'ends. After that, each of the stereoisomers is separated by further separation by the reverse phase chromatography method, and (4) a phosphorothioate-type oligonucleotide having a desired absolute configuration is selected from the obtained stereoisomers. A method for producing an oligonucleotide, which comprises phosphorylating and binding their 5'ends.
ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドが、３〜８量
体であるオリゴヌクレオチドの製造法。2. A method for producing an oligonucleotide, wherein the phosphorothioate-type oligonucleotide chemically synthesized in (1) of claim 1 is a trimer to octamer.
ロマトグラフィー法に用いる溶離液が、酢酸アンモニウ
ムおよび／または酢酸トリエチルアンモニウム水溶液を
主成分とするオリゴヌクレオチドの製造法。3. A method for producing an oligonucleotide, wherein the eluent used in the reverse phase chromatography method according to (2) and (3) of claim 1 contains ammonium acetate and / or triethylammonium acetate aqueous solution as a main component.
エート型オリゴヌクレオチドの結合を、酵素的方法また
は化学的方法により行うオリゴヌクレオチドの製造法。4. A method for producing an oligonucleotide, wherein the phosphorothioate type oligonucleotide according to (4) of claim 1 is bound by an enzymatic method or a chemical method.
スホロチオエート型オリゴヌクレオチドが、１０−３０
量体であるオリゴヌクレオチドの製造法。5. The phosphorothioate type oligonucleotide linked in (4) of claim 1 is 10-30.
A method for producing an oligonucleotide that is a monomer.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31855493A JPH07170981A (en) | 1993-12-17 | 1993-12-17 | Production of oligonucleotide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31855493A JPH07170981A (en) | 1993-12-17 | 1993-12-17 | Production of oligonucleotide |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07170981A true JPH07170981A (en) | 1995-07-11 |
Family
ID=18100433
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31855493A Pending JPH07170981A (en) | 1993-12-17 | 1993-12-17 | Production of oligonucleotide |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07170981A (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6265168B1 (en) | 1998-10-06 | 2001-07-24 | Transgenomic, Inc. | Apparatus and method for separating and purifying polynucleotides |
| US6642374B2 (en) | 1997-04-25 | 2003-11-04 | Transgenomic, Inc. | Process for separation of polynucleotide fragments |
| WO2021210409A1 (en) * | 2020-04-14 | 2021-10-21 | 住友化学株式会社 | Composition containing nucleic acid oligomer |
| WO2021210408A1 (en) * | 2020-04-14 | 2021-10-21 | 住友化学株式会社 | Method for producing nucleic acid oligomer |
-
1993
- 1993-12-17 JP JP31855493A patent/JPH07170981A/en active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6642374B2 (en) | 1997-04-25 | 2003-11-04 | Transgenomic, Inc. | Process for separation of polynucleotide fragments |
| US6419824B1 (en) | 1998-03-13 | 2002-07-16 | Transgenomic, Inc. | Apparatus and method for separating and purifying polynucleotides |
| US6265168B1 (en) | 1998-10-06 | 2001-07-24 | Transgenomic, Inc. | Apparatus and method for separating and purifying polynucleotides |
| WO2021210409A1 (en) * | 2020-04-14 | 2021-10-21 | 住友化学株式会社 | Composition containing nucleic acid oligomer |
| WO2021210408A1 (en) * | 2020-04-14 | 2021-10-21 | 住友化学株式会社 | Method for producing nucleic acid oligomer |
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