JPH07143899A - Enhancing of chemiluminescence - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To reduce background luminescence and increase the intensity of sample-response luminescence by adding an oxidizing agent, a peroxidase, a chemiluminescence sensitizer and a specified compound to a chemiluminescent substance. CONSTITUTION:A chemiluminescent substance is allowed to emit light by an oxidizing agent, a peroxidase, a chemiluminescent sensitizer and a compound of the formula (R) is hydroxyl Group or its alkali salt, etc.; R2 to R5 are each independently H or a halogen. R2 and R3 or R4 and R5 may respectively bonded to each other to form a benzene ring; R5 and R7 are independently H, a lower alkyl, etc.).

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は化学発光増強法に関す
る。更に詳しくは、本発明は化学発光物質の検出方法に
係わり、化学発光の計測を基とする各種測定法、特に免
疫定量、酵素定量の感度向上に好適な、化学発光の増強
法に関するものである。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a chemiluminescence enhancing method. More specifically, the present invention relates to a method for detecting a chemiluminescent substance, and more particularly to a method for enhancing chemiluminescence, which is suitable for improving the sensitivity of immunoassay and enzyme quantification, based on various measurements based on the measurement of chemiluminescence. .

【０００２】[0002]

【従来の技術】化学発光反応に基づく分析方法は、極め
て高感度な測定方法となる可能性があるため、これまで
活発な研究がなされている。この分析方法は特に免疫学
的測定の分野で注目されており、ルミノールやアクリジ
ニウムエステルのような化学発光物質を直接抗体に標識
して用いる化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、ＥＩ
Ａの標識酵素の活性の測定に化学発光を利用する化学発
光酵素イムノアッセイ（ＣＬＥＩＡ）等の様々な測定方
法が実用化されている〔今井利夫、メディカル・テクノ
ロジー（Medical Technology），21(1),6-13(1993)〕。2. Description of the Related Art Analytical methods based on chemiluminescent reactions have a possibility of becoming extremely sensitive measuring methods, and thus have been actively studied so far. This analysis method has been particularly attracting attention in the field of immunological measurement, and chemiluminescent immunoassay (CLIA), EI, in which a chemiluminescent substance such as luminol or acridinium ester is directly labeled on an antibody, is used.
Various measurement methods such as chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA), which utilizes chemiluminescence to measure the activity of the labeling enzyme of A, have been put to practical use [Toshio Imai, Medical Technology, 21 (1), 6-13 (1993)].

【０００３】化学発光法が上記のような測定に応用され
てきた背景には、増感剤（エンハンサー）の発見があ
る。即ち、本来極めて短時間で終了する化学発光反応の
系に、p-ヨードフェノールのような増感剤を共存させる
ことによって、発光反応の遅延、発光量の増大を図るこ
とが可能になった。また測定感度の向上のためにさらに
優れた増感剤が探索され、例えば、特開昭５９−１７１
８３９号、特開平２−１７４６９４号、特開平２−２９
１２９９号などに開示されている。これら増感剤は、パ
ーオキシダーゼの活性を増幅するもの、ラジカルを安定
化させるもの、あるいは自ら蛍光を発して増感するもの
など様々である。The background to which the chemiluminescence method has been applied to the above-described measurement is the discovery of a sensitizer (enhancer). That is, coexistence of a sensitizer such as p-iodophenol in a chemiluminescence reaction system which originally ends in an extremely short time makes it possible to delay the luminescence reaction and increase the amount of luminescence. Further, more excellent sensitizers have been searched for in order to improve the measurement sensitivity, and for example, JP-A-59-171.
839, JP-A-2-174694, JP-A-2-29
No. 1299 and the like. These sensitizers include those that amplify the activity of peroxidase, those that stabilize radicals, and those that sensitize by emitting fluorescence by themselves.

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、増感剤
を用いて化学発光反応を増強する場合、非特異的な発光
（バックグラウンド）も増大し、結果として検出下限値
が依然高く、目的とする成分の検出を充分に行えない場
合がある。本発明は、化学発光物質に酸化剤、パーオキ
シダーゼおよび増感剤を共存させた化学発光系におい
て、酸化剤、パーオキシダーゼおよび化学発光増感剤の
他に第４の化合物を添加して、バックグラウンド発光を
低減させ、かつ試料応答の発光強度を増強させることが
可能な化学発光増強法を提供することを目的とする。However, when the chemiluminescence reaction is enhanced by using a sensitizer, nonspecific luminescence (background) also increases, and as a result, the lower limit of detection is still high, and the objective is to be achieved. In some cases, the components cannot be detected sufficiently. The present invention provides a chemiluminescent system in which an oxidant, a peroxidase and a sensitizer coexist in a chemiluminescent substance, and a fourth compound is added to the chemiluminescent system in addition to the oxidant, the peroxidase and the chemiluminescent sensitizer. It is an object of the present invention to provide a chemiluminescence enhancing method capable of reducing the ground emission and enhancing the emission intensity of sample response.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明者らは様々な化学発光反応系を検討した結
果、第４の化合物として一般式（Ｉ）で表される化合物
を化学発光反応系に共存させると、バックグラウンド発
光が低下し、かつ試料応答の発光強度が増強されること
を見いだし、本発明を完成した。In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have studied various chemiluminescent reaction systems, and as a result, have chemically synthesized a compound represented by the general formula (I) as a fourth compound. It was found that coexistence in a luminescence reaction system reduces background luminescence and enhances luminescence intensity of sample response, and completed the present invention.

【０００６】即ち、本発明によれば、化学発光物質を酸
化剤、パーオキシダーゼおよび化学発光増感剤（エンハ
ンサー）を用いて発光させる系において、下記一般式
（Ｉ）で表される化合物を共存させることを特徴とする
化学発光増強法が提供される。That is, according to the present invention, a compound represented by the following general formula (I) coexists in a system in which a chemiluminescent substance emits light using an oxidizing agent, a peroxidase and a chemiluminescent sensitizer (enhancer). A method for enhancing chemiluminescence is provided.

【化２】 （式中Ｒ₁ は水酸基または水酸基のアルカリ塩、置換ま
たは無置換のアミノ基、またはアシルオキシ基を、
Ｒ₂ ，Ｒ₃ ，Ｒ₄ およびＲ₅ はそれぞれ独立して水素原
子、またはハロゲン原子を、あるいはＲ₂ とＲ₃ または
Ｒ₄ とＲ₅ がそれぞれ結合してベンゼン環を、またＲ₆
とＲ₇ はそれぞれ独立して水素原子、置換または無置換
の低級アルキル基または低級アルコキシ基を示す。）[Chemical 2] (In the formula, R ₁ represents a hydroxyl group, an alkali salt of a hydroxyl group, a substituted or unsubstituted amino group, or an acyloxy group,
R ₂ , R ₃ , R ₄ and R ₅ each independently represent a hydrogen atom or a halogen atom, or R ₂ and R ₃ or R ₄ and R ₅ respectively bond to form a benzene ring, and R ₆
And R ₇ each independently represent a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower alkyl group or a lower alkoxy group. )

【０００７】本発明の化学発光増強法に用いる前記一般
式（Ｉ）の化合物は、市販品を容易に入手することがで
きる。カラムクロマトグラフィー法、再結晶等により精
製した純度の高い試薬が好ましく用いられる。The compound of the general formula (I) used in the chemiluminescence enhancing method of the present invention can be easily obtained as a commercial product. A highly pure reagent purified by a column chromatography method, recrystallization or the like is preferably used.

【０００８】本発明で用いる化学発光物質（以後しばし
ば発光基質と称する）としてはルミノール、イソルミノ
ールまたはそれらの誘導体、ロフィン、ルシゲニンなど
各種用いることができるが、好ましくはルミノール、イ
ソルミノールおよびそれらの誘導体であり、誘導体とし
てはＮ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノール、Ｎ
−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソルミノールなどを用
いることができる。さらにこれら発光基質が間接的に生
成される系でも良い。As the chemiluminescent substance (hereinafter often referred to as a luminescent substrate) used in the present invention, various kinds of luminol, isoluminol or their derivatives, lophine, lucigenin and the like can be used, but preferably luminol, isoluminol and their derivatives. And as a derivative, N-aminobutyl-N-ethylisoluminol, N
-Aminohexyl-N-ethylisoluminol and the like can be used. Further, a system in which these luminescent substrates are indirectly produced may be used.

【０００９】本発明で用いる酸化剤としては、化学発光
反応において光を生じさせることのできる酸化剤でよ
く、例えば過酸化水素、過ほう酸塩等を用いることがで
きる。さらに、酸化剤が間接的に生成される系でもよ
く、例えばグルコースオキシダーゼのような酵素を用い
てグルコースから過酸化水素を生成させる系を用いても
よい。好ましくは過酸化水素である。The oxidizing agent used in the present invention may be an oxidizing agent capable of producing light in a chemiluminescent reaction, and for example, hydrogen peroxide, perborate and the like can be used. Further, a system in which an oxidant is indirectly produced may be used, and a system in which hydrogen peroxide is produced from glucose by using an enzyme such as glucose oxidase may be used. Hydrogen peroxide is preferred.

【００１０】前記一般式（Ｉ）で表される化合物を具体
的に例示すると、フェノールインドフェノール、２，６
−ジクロロフェノールインドフェノールナトリウム、イ
ンドフェノールブルー、インドフェノールナトリウム、
酢酸インドフェノール、２，６−ジクロロインド−Ｏ−
クレゾール、Ｎ，Ｎ−ジメチルインドアニリン等が挙げ
られるが、これらに限定されるものではない。これらの
一般式（Ｉ）で表される化合物の使用濃度は、反応液の
最終濃度で０．０５〜５００μＭ，好ましくは０．４〜
４０μＭとする。０．０５μＭ未満では化学発光増強効
果が少なく、５００μＭを越すと化学発光反応が妨害さ
れる。Specific examples of the compound represented by the general formula (I) include phenol indophenol, 2,6
-Dichlorophenol indophenol sodium, indophenol blue, indophenol sodium,
Indophenol acetate, 2,6-dichloroindo-O-
Examples include, but are not limited to, cresol and N, N-dimethylindoaniline. The use concentration of the compound represented by the general formula (I) is 0.05 to 500 μM, preferably 0.4 to
40 μM. If it is less than 0.05 μM, the chemiluminescence enhancing effect is small, and if it exceeds 500 μM, the chemiluminescent reaction is disturbed.

【００１１】本発明で用いることのできる化学発光増感
剤は特に限定されないが、好ましく用いることのできる
例として、４−［２’−（４’−メチル）チアゾリル］
フェノール、４−（２’−チエニル）フェノール、ｐ−
ヨードフェノールおよび４−［４’−（２’−メチル）
チアゾリル］フェノールからなる群から選ばれる少なく
とも一種を挙げることができる。また、これら増感剤が
間接的に生成される系でもよい。The chemiluminescent sensitizer which can be used in the present invention is not particularly limited, but an example which can be preferably used is 4- [2 '-(4'-methyl) thiazolyl].
Phenol, 4- (2'-thienyl) phenol, p-
Iodophenol and 4- [4 '-(2'-methyl)
At least one selected from the group consisting of thiazolyl] phenol can be mentioned. A system in which these sensitizers are indirectly produced may also be used.

【００１２】これらの増感剤が使用される際は、前記一
般式（Ｉ）で示される化合物は、フェノールインドフェ
ノール（Ｒ₁ ＝ＯＨ；Ｒ₂ ，Ｒ₃ ，Ｒ₄ ，Ｒ₅ ，Ｒ₆ ，
Ｒ₇＝Ｈ）、２，６−ジクロロフェノールインドフェノ
ールナトリウム（Ｒ₁ ＝ＯＮａ；Ｒ₂ ，Ｒ₄ ，Ｒ₆ ，Ｒ
₇ ＝Ｈ；Ｒ₃ ，Ｒ₅ ＝Ｃｌ）、インドフェノールブルー
（Ｒ₁ ＝Ｎ (ＣＨ₃)₂ ；Ｒ₂ ，Ｒ₃ ，Ｒ₆ ，Ｒ₇ ＝Ｈ；
Ｒ₄ とＲ₅ ＝ベンゼン環）、インドフェノールナトリウ
ム（Ｒ₁ ＝ＯＮａ；Ｒ₂ ，Ｒ₃ ，Ｒ₄ ，Ｒ₅，Ｒ₆ ，Ｒ
₇ ＝Ｈ）および酢酸インドフェノール（Ｒ₁ ＝ＯＣＯＣ
Ｈ₃ ；Ｒ₂ ，Ｒ₃ ，Ｒ₄ ，Ｒ₅ ，Ｒ₆ ，Ｒ₇ ＝Ｈ）から
なる群から選ばれる少なくとも一種（以後しばしばイン
ドフェノール化合物と称する）であることが好ましい。When these sensitizers are used, the compound represented by the general formula (I) is phenol indophenol (R ₁ ═OH; R ₂ , R ₃ , R ₄ , R ₅ , R ₆ ，
R ₇ = H), 2,6- dichlorophenol indophenol sodium _{(R 1 = ONa; R 2} , R 4, R 6, R
_{7 = H; R 3, R} 5 = Cl), the indophenol blue _{(R 1 = N (CH 3} ) 2; R 2, R 3, R 6, R 7 = H;
R ₄ and R ₅ = benzene ring), sodium indophenol (R ₁ = ONa; R ₂ , R ₃ , R ₄ , R ₅ , R ₆ , R)
₇ = H) and indophenol acetate (R ₁ = OCOC)
_{H 3; R 2, R 3} , R 4, R 5, R 6, at least one member selected from the group consisting of R ₇ = H) (hereinafter sometimes referred to as indophenol compound) is preferably.

【００１３】パーオキシダーゼは、測定系によって遊離
（非結合）型として用いられるが、抗原、ハプテン、抗
体等と結合させて、標識型として免疫化学的測定に用い
ることができる。Peroxidase is used as a free (unbound) type in the assay system, but it can be used as a labeled type for immunochemical measurement by binding with an antigen, a hapten, an antibody and the like.

【００１４】本発明は、パーオキシダーゼまたはパーオ
キシダーゼで標識した免疫化学的活性物質、酸化剤、発
光基質、増感剤から選ばれる測定対象を検出する際に利
用できる。本発明を実施する場合、測定系に応じて測定
条件を最適化しなければならないのは勿論であるが、手
順としては次のようにされるのが望ましい。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be used to detect a measurement target selected from peroxidase or an immunochemically active substance labeled with peroxidase, an oxidizing agent, a luminescent substrate, and a sensitizer. When carrying out the present invention, it is needless to say that the measurement conditions must be optimized according to the measurement system, but the procedure is preferably as follows.

【００１５】本発明による化学発光の反応温度としては
０〜６０℃、特に室温付近が望ましい。反応は緩衝液を
溶媒として行われるのがよく、緩衝液のｐＨは中性付近
からアルカリ性の領域がよい。緩衝液としてはほう酸緩
衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、
グリシン緩衝液等が有効に利用できるが、ほう酸緩衝
液、トリス塩酸緩衝液およびグリシン緩衝液が好まし
い。試薬としては、遊離型または標識型パーオキシダー
ゼ、酸化剤、増感剤およびインドフェノール化合物溶液
をそれぞれ所定の濃度で調製し、各液を共存させて化学
発光反応を行わせる。反応溶液から生じた光は、例えば
光電子倍増管を備えた自作または市販の測定装置で検出
することができる。好ましくは反応を行わせる容器の形
状に応じてルミノメーター、化学発光計、蛍光光度計を
用いるのが望ましい。The reaction temperature for chemiluminescence according to the present invention is preferably 0 to 60 ° C., particularly around room temperature. The reaction is preferably carried out using a buffer solution as a solvent, and the pH of the buffer solution is preferably in the vicinity of neutral to alkaline. As the buffer solution, borate buffer solution, phosphate buffer solution, carbonate buffer solution, Tris-HCl buffer solution,
Glycine buffer and the like can be effectively used, but borate buffer, Tris-HCl buffer and glycine buffer are preferable. As reagents, free or labeled peroxidase, an oxidizing agent, a sensitizer, and an indophenol compound solution are prepared at respective predetermined concentrations, and each solution is allowed to coexist to cause a chemiluminescent reaction. The light generated from the reaction solution can be detected by, for example, a self-made or commercially available measuring device equipped with a photomultiplier tube. It is desirable to use a luminometer, chemiluminometer, or fluorometer depending on the shape of the container in which the reaction is performed.

【００１６】尚、本発明の適用分野は免疫学的測定に限
られるものでは当然なく、例えば環境分析における過酸
化水素の定量等にも適用が可能である。The field of application of the present invention is not limited to immunological measurement, and can be applied to, for example, quantification of hydrogen peroxide in environmental analysis.

【００１７】[0017]

【実施例】次に実施例により本発明を詳細に説明する。
下記の例では、次の試薬と装置を用いた。なお、表１〜
３中の略号は下記を意味する。 ＰＩＰ ：フェノ−ルインドフェノ−ル ＤＣＩＰ：２，６−ジクロロフェノ−ルインドフェノ−
ルナトリウム ＩＰＢ ：インドフェノ−ルブル− ＩＰＮａ：インドフェノ−ルナトリウム ＩＰＡ ：酢酸インドフェノ−ル試薬 ルミノールは市販品を２３ｍＭＮａＯＨ水溶液に溶解し
て用いた。パーオキシダーゼは抗体との結合体で、抗エ
ンドセリン１ＨＲＰ標識抗体〔アイビーエル（ＩＢＬ）
社製１６１５５〕を用いた。酸化剤として市販の３０％
過酸化水素溶液（和光純薬工業社製）を適宜希釈して用
いた。増感剤には４−［２’−（４’−メチル）チアゾ
リル］フェノール（マスト社製）、４−（２’−チェニ
ル）フェノール（マスト社製）、ｐ−ヨードフェノール
（和光純薬工業社製）および４−［４’−（２’−メチ
ル）チアゾリル］フェノール（マスト社製）の各ＤＭＳ
Ｏ溶液を用いた。フェノールインドフェノール、２，６
−ジクロロインドフェノールナトリウム、インドフェノ
ールナトリウムおよび酢酸インドフェノールは市販品
（酢酸インドフェノールはコダック社製、他は関東化学
社製）を水に適宜溶解して用いた。またインドフェノー
ルブルーは市販品（関東化学社製）をアセトニトリルに
溶解して用いた。その他の添加剤は市販の試薬グレード
を用いた。The present invention will be described in detail with reference to examples.
The following reagents and equipment were used in the examples below. In addition, Table 1
Abbreviations in 3 mean the following. PIP: phenol indophenol DCIP: 2,6-dichlorophenol indophenol
Sodium IPB: Indophenol Blu-IPNa: Indophenol sodium IPA: Indophenol acetate reagent Luminol was a commercially available product dissolved in a 23 mM NaOH aqueous solution. Peroxidase is a conjugate with an antibody, and is an anti-endothelin 1HRP labeled antibody [IBL (IBL)].
16155] manufactured by the same company was used. 30% commercially available as oxidizer
A hydrogen peroxide solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was appropriately diluted and used. As the sensitizer, 4- [2 '-(4'-methyl) thiazolyl] phenol (manufactured by Mast Co.), 4- (2'-phenyl) phenol (manufactured by Mast Co.), p-iodophenol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Each) and 4- [4 '-(2'-methyl) thiazolyl] phenol (Mast) DMS
O solution was used. Phenol indophenol, 2,6
-Sodium dichloroindophenol, sodium indophenol and indophenol acetate were commercially available products (indophenol acetate manufactured by Kodak Co., Ltd. and others manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) were used after being appropriately dissolved in water. As for indophenol blue, a commercially available product (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) was dissolved in acetonitrile and used. Commercially available reagent grades were used as the other additives.

【００１８】装置 化学発光反応は９６穴マイクロタイタプレート〔ナンク
（Ｎｕｎｃ）社製〕の各ウェルにおいて行った。発光は
ルミノメータ（コロナ電気社製、ＭＬＲ−１００）を用
いて測定した。The apparatus chemiluminescence reaction was carried out in each well of a 96-well microtiter plate [manufactured by Nunc]. Luminescence was measured using a luminometer (MLR-100 manufactured by Corona Electric Co., Ltd.).

【００１９】実施例１ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、０．１
％ミルク含有ＰＢＳ溶液によって所定の濃度に希釈して
用いた。増感剤溶液として、３．２ｍＭ４−［２’−
（４’−メチル）チアゾリル］フェノールおよび所定の
濃度の各インドフェノール化合物の５０ｍＭグリシン緩
衝液（ｐＨ９）を調製して用いた。ルミノール溶液は２
３ｍＭＮａＯＨ溶液で２０ｍＭに調製した。Example 1 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM glycine buffer (pH 9),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml) was 0.1
It was used after diluting to a predetermined concentration with a PBS solution containing% milk. As a sensitizer solution, 3.2 mM 4- [2'-
A 50 mM glycine buffer solution (pH 9) containing (4′-methyl) thiazolyl] phenol and each indophenol compound at a predetermined concentration was prepared and used. Luminol solution is 2
It was adjusted to 20 mM with a 3 mM NaOH solution.

【００２０】（化学発光測定）９６穴マイクロタイタプ
レートのウェルに、１０μｌの１０³ 倍希釈の抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体、次いで１００μｌの過酸化水
素溶液、５０μｌのルミノール溶液、５０μｌの増感剤
溶液を加えて混合し、１０分後、ルミノメータにより４
３５ｎｍの発光量（ルミカウント）を測定した。また同
時に標識抗体を加えないブランクの測定を行った。表１
には添加物としてインドフェノール化合物を共存させた
場合とさせない場合におけるブランク値（バックグラウ
ンド）、試料発光量および信号／ブランク比（Ｓ／Ｎ
比）を比較して示した。(Chemiluminescence measurement) In a well of a 96-well microtiter plate, 10 μl of 10 ³ -fold diluted anti-endothelin 1HRP labeled antibody, 100 μl of hydrogen peroxide solution, 50 μl of luminol solution, and 50 μl of sensitizer solution were added. Add and mix, and after 10 minutes, add 4 by luminometer.
The amount of light emitted at 35 nm (Lumicount) was measured. At the same time, a blank measurement was performed without adding the labeled antibody. Table 1
, A blank value (background), a sample emission amount and a signal / blank ratio (S / N) with and without an indophenol compound as an additive.
The ratio) is shown in comparison.

【００２１】[0021]

【表１】 添加物による化学発光増強効果 ──────────────────────────────────── 添加物 濃度（μＭ） ブランク値 試料発光量 Ｓ／Ｎ比 ──────────────────────────────────── なし（従来法） 0 386 227,990 591 ＰＩＰ 1.6 321 229,354 715 ＤＣＩＰ 3.2 305 219,948 720 ＩＰＢ 1.6 123 155,840 1267 ＩＰＮａ 3.2 230 191,130 831 ＩＰＡ 16 207 204,142 986 ────────────────────────────────────[Table 1] Chemiluminescence enhancing effect of additives ───────────────────────────────────── Additive concentration (ΜM) Blank value Sample emission S / N ratio ───────────────────────────────────── None ( Conventional method) 0 386 227,990 591 PIP 1.6 321 229,354 715 DCIP 3.2 305 219,948 720 IPB 1.6 123 155,840 1267 IPNa 3.2 230 191,130 831 IPA 16 207 204,142 986 ────────────────── ──────────────────

【００２２】表１の結果の様に各インドフェノール化合
物の添加物を共存させるとバックグラウンド発光が抑制
され、また試料発光量も増加する場合があり、Ｓ／Ｎ比
が改善される結果となった。As shown in the results of Table 1, coexistence of additives of each indophenol compound suppresses background luminescence and may increase sample luminescence, resulting in improvement of S / N ratio. It was

【００２３】実施例２ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ９．５）に０．１％ミル
ク、０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗エ
ンドセリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、
０．１％ミルク含有ＰＢＳ溶液によって所定の濃度に希
釈して用いた。増感剤溶液として、０．１６ｍＭ４−
（２’−チエニル）フェノールおよび所定の濃度の各イ
ンドフェノール化合物の５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ
９．５）を調製して用いた。ルミノール溶液は２３ｍＭ
ＮａＯＨ溶液で２０ｍＭに調製した。Example 2 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk, 0.05% egg albumin, 0.1% Tween in 50 mM borate buffer (pH 9.5)
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing 20 was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml)
It was diluted to a predetermined concentration with a PBS solution containing 0.1% milk and used. As a sensitizer solution, 0.16 mM 4-
50 mM borate buffer solution (pH) of (2'-thienyl) phenol and each indophenol compound at a predetermined concentration
9.5) was prepared and used. Luminol solution is 23 mM
It was adjusted to 20 mM with a NaOH solution.

【００２４】（化学発光測定）９６穴マイクロタイタプ
レートのウェルに、１０μｌの１０⁴ 倍希釈の抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体、次いで１００μｌの過酸化水
素溶液、５０μｌのルミノール溶液、５０μｌの増感剤
溶液を加えて混合し、６分後、ルミノメータにより４３
５ｎｍの発光量（ルミカウント）を測定した。また同時
に標識抗体を加えないブランクの測定を行った。表２に
は添加物としてインドフェノール化合物を共存させた場
合とさせない場合におけるブランク値（バックグラウン
ド）、試料発光量および信号／ブランク比（Ｓ／Ｎ比）
を比較して示した。(Chemiluminescence measurement) In a well of a 96-well microtiter plate, 10 μl of 10 ⁴ -fold diluted anti-endothelin 1HRP-labeled antibody, 100 μl of hydrogen peroxide solution, 50 μl of luminol solution, and 50 μl of sensitizer solution were added. Add and mix, and after 6 minutes 43
The amount of light emission (Lumicount) at 5 nm was measured. At the same time, a blank measurement was performed without adding the labeled antibody. In Table 2, the blank value (background), the sample luminescence amount and the signal / blank ratio (S / N ratio) with and without coexistence of the indophenol compound as an additive
Are shown in comparison.

【００２５】[0025]

【表２】 添加物による化学発光増強効果 ──────────────────────────────────── 添加物 濃度（μＭ） ブランク値 試料発光量 Ｓ／Ｎ比 ──────────────────────────────────── なし（従来法） 0 305 10,570 34 ＰＩＰ 1.6 277 11,016 40 ＤＣＩＰ 3.2 275 10,779 39 ＩＰＮａ 3.2 300 11.300 38 ＩＰＡ 32 268 11,150 42 ────────────────────────────────────[Table 2] Chemiluminescence enhancing effect of additives ───────────────────────────────────── Additive concentration (ΜM) Blank value Sample emission S / N ratio ───────────────────────────────────── None ( Conventional method) 0 305 10,570 34 PIP 1.6 277 11,016 40 DCIP 3.2 275 10,779 39 IPNa 3.2 300 11.300 38 IPA 32 268 11,150 42 ───────────────────────── ─────────────

【００２６】表２の結果の様に各インドフェノール化合
物の添加物を共存させるとバックグラウンド発光が抑制
され、また試料発光量も増加し、Ｓ／Ｎ比が改善される
結果となった。As shown in the results of Table 2, the coexistence of the additives of each indophenol compound suppressed the background luminescence, increased the luminescence amount of the sample, and improved the S / N ratio.

【００２７】実施例３ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に０．１％ミ
ルク、０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗
エンドセリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、
０．１％ミルク含有ＰＢＳ溶液によって所定の濃度に希
釈して用いた。増感剤溶液として、３．２ｍＭｐ−ヨー
ドフェノールおよび所定の濃度の各インドフェノール化
合物の５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９）を調製して用
いた。ルミノール溶液は２３ｍＭＮａＯＨ溶液で２０ｍ
Ｍに調製した。Example 3 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
50% Tris-HCl buffer (pH 8.5) with 0.1% milk, 0.05% egg albumin, 0.1% Tween
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing n20 was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml)
It was diluted to a predetermined concentration with a PBS solution containing 0.1% milk and used. As a sensitizer solution, a 50 mM glycine buffer solution (pH 9) containing 3.2 mM p-iodophenol and each indophenol compound at a predetermined concentration was prepared and used. Luminol solution is 20m with 23mM NaOH solution
Prepared to M.

【００２８】（化学発光測定）９６穴マイクロタイタプ
レートのウェルに、１０μｌの１０³ 倍希釈の抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体、次いで１００μｌの過酸化水
素溶液、５０μｌのルミノール溶液、５０μｌの増感剤
溶液を加えて混合し、１２分後、ルミノメータにより４
３５ｎｍの発光量（ルミカウント）を測定した。また同
時に標識抗体を加えないブランクの測定を行った。表３
には添加物としてインドフェノール化合物を共存させた
場合とさせない場合におけるブランク値（バックグラウ
ンド）、試料発光量および信号／ブランク比（Ｓ／Ｎ
比）を比較して示した。(Chemiluminescence measurement) In a well of a 96-well microtiter plate, 10 μl of 10 ³ -fold diluted anti-endothelin 1HRP-labeled antibody, 100 μl of hydrogen peroxide solution, 50 μl of luminol solution, and 50 μl of sensitizer solution were added. Add and mix, and after 12 minutes, add 4 by luminometer.
The amount of light emitted at 35 nm (Lumicount) was measured. At the same time, a blank measurement was performed without adding the labeled antibody. Table 3
, A blank value (background), a sample emission amount and a signal / blank ratio (S / N) with and without an indophenol compound as an additive.
The ratio) is shown in comparison.

【００２９】[0029]

【表３】 添加物による化学発光増強効果 ──────────────────────────────────── 添加物 濃度（μＭ） ブランク値 試料発光量 Ｓ／Ｎ比 ──────────────────────────────────── なし（従来法） 0 34 54,911 1615 ＰＩＰ 8 28 68,639 2451 ＤＣＩＰ 16 25 56,751 2270 ＩＰＢ 1.6 34 55,778 1640 ＩＰＮａ 16 32 58,820 1838 ＩＰＡ 32 18 57,174 3176 ────────────────────────────────────[Table 3] Chemiluminescence enhancing effect of additives ───────────────────────────────────── Additive concentration (ΜM) Blank value Sample emission S / N ratio ───────────────────────────────────── None ( Conventional method) 0 34 54,911 1615 PIP 8 28 68,639 2451 DCIP 16 25 56,751 2270 IPB 1.6 34 55,778 1640 IPNa 16 32 58,820 1838 IPA 32 18 57,174 3176 ────────────────── ──────────────────

【００３０】表３の結果の様に各インドフェノール添加
物を共存させるとバックグラウンド発光が抑制され、ま
た試料発光量も増加し、Ｓ／Ｎ比が改善される結果とな
った。As shown in the results of Table 3, the coexistence of each indophenol additive suppressed the background luminescence, increased the luminescence amount of the sample, and improved the S / N ratio.

【００３１】実施例４ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、０．１
％ミルク含有ＰＢＳ溶液によって所定の濃度に希釈して
用いた。増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’−
（２’−メチル）チアゾリル］フェノールおよび１．６
μＭ−８μＭフェノールインドフェノールの５０ｍＭほ
う酸緩衝液（ｐＨ１０）を調製して用いた。ルミノール
溶液は２３ｍＭＮａＯＨ溶液で２０ｍＭに調製した。Example 4 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml) was 0.1
It was used after diluting to a predetermined concentration with a PBS solution containing% milk. As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4'-
(2'-methyl) thiazolyl] phenol and 1.6
A 50 mM borate buffer solution (pH 10) of μM-8 μM phenol indophenol was prepared and used. The luminol solution was adjusted to 20 mM with a 23 mM NaOH solution.

【００３２】（フェノールインドフェノールを用いた化
学発光測定）９６穴マイクロタイタプレートのウェル
に、１０μｌの１０⁴ 倍希釈の抗エンドセリン１ＨＲＰ
標識抗体、次いで１００μｌの過酸化水素溶液、５０μ
ｌのルミノール溶液、５０μｌの増感剤溶液を加えて混
合し、１０分後、ルミノメータにより４３５ｎｍの発光
量（ルミカウント）を測定した。また同時に標識抗体を
加えないブランクの測定を行った。表４にはフェノール
インドフェノールを添加した場合と添加しない場合にお
けるブランク値（バックグラウンド）、試料発光量およ
び信号／ブランク比（Ｓ／Ｎ比）を比較して示した。(Chemical luminescence measurement using phenol indophenol) 10 μl of 10 ⁴ -fold diluted anti-endothelin 1HRP was added to the well of a 96-well microtiter plate.
Labeled antibody, then 100 μl hydrogen peroxide solution, 50 μl
1 l of the luminol solution and 50 μl of the sensitizer solution were added and mixed, and after 10 minutes, the amount of light emission (luminous count) at 435 nm was measured by a luminometer. At the same time, a blank measurement was performed without adding the labeled antibody. Table 4 shows a comparison of the blank value (background), the luminescence amount of the sample, and the signal / blank ratio (S / N ratio) with and without the addition of phenol indophenol.

【００３３】[0033]

【表４】 フェノールインドフェノールを共存させた場合の化学発光増強効果 ──────────────────────────────────── 濃度（μＭ） ブランク値 試料発光量 Ｓ／Ｎ比 ──────────────────────────────────── ０（従来法） ７９ １６，９７８ ２１６ １．６ ４３ ２２，７１７ ５２８ ８．０ ４７ ２１，１８５ ４４６ ────────────────────────────────────[Table 4] Phenol Indophenol A chemiluminescence enhancing effect when coexisting with ────────────────────────────────── ─── Concentration (μM) Blank value Sample emission amount S / N ratio ──────────────────────────────────── ── 0 (conventional method) 79 16,978 216 1.6 43 22,22 717 528 8.0 47 21,185 446 ──────────────────────── ──────────────

【００３４】表４の結果の様にフェノールインドフェノ
ールを添加させるとバックグラウンド発光が抑制され、
また試料発光量が増加し、Ｓ／Ｎ比が改善される結果と
なった。As shown in the results of Table 4, addition of phenol indophenol suppresses background luminescence,
Further, the light emission amount of the sample increased and the S / N ratio was improved.

【００３５】実施例５ （化学発光の経時変化の測定）化学発光量を精度よく測
定するためには、用いる化学発光反応が長時間にわたり
安定していなければならない。そこで実施例４と同様に
化学発光溶液を調製し、混合後直ちに測定を開始して経
時変化を調べた。尚、フェノールインドフェノールは
１．６μＭに調製した。その結果、図１に示すように約
１０分で発光量はプラトーに達し、以後発光が安定して
持続した。また特にフェノールインドフェノールを共存
させた場合、共存させない場合に比べて高い発光量で安
定性を示した。また図２に示したようにＳ／Ｎ比にも同
様の傾向が観測された。Example 5 (Measurement of change in chemiluminescence with time) In order to measure the chemiluminescence amount with high accuracy, the chemiluminescence reaction used must be stable for a long time. Therefore, a chemiluminescent solution was prepared in the same manner as in Example 4, and measurement was started immediately after mixing to examine the change with time. Phenol indophenol was prepared at 1.6 μM. As a result, as shown in FIG. 1, the amount of light emission reached a plateau in about 10 minutes, and the light emission was stably maintained thereafter. In particular, when phenol indophenol coexisted, the stability was shown at a higher luminescence amount than when coexisted. Further, as shown in FIG. 2, a similar tendency was observed in the S / N ratio.

【００３６】実施例６ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、０．１
％ミルク含有ＰＢＳ溶液を用いて希釈系列を作製した。
増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’−（２’−
メチル）チアゾリル］フェノールおよび０．１６ｍＭフ
ェノールインドフェノールの５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐ
Ｈ１０）を調製して用いた。ルミノール溶液は２３ｍＭ
ＮａＯＨ溶液で２０ｍＭに調製した。Example 6 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml) was 0.1
Dilution series were made using PBS solution containing% milk.
As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4 '-(2'-
Methyl) thiazolyl] phenol and 0.16 mM phenol indophenol in 50 mM borate buffer (p
H10) was prepared and used. Luminol solution is 23 mM
It was adjusted to 20 mM with a NaOH solution.

【００３７】（パーオキシダーゼ活性の測定）抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体の各希釈系列に対して上記の反
応溶液を用いて、実施例４と同様に化学発光の測定を行
い、用量作用曲線を作製した。図３にその結果を示す。(Measurement of peroxidase activity) The chemiluminescence was measured in the same manner as in Example 4 using the above reaction solution for each dilution series of the anti-endothelin 1HRP-labeled antibody to prepare a dose action curve. The results are shown in FIG.

【００３８】実施例７ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する過酸化水素溶液の濃度系列を調製した。抗エ
ンドセリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、
０．１％ミルク含有ＰＢＳ溶液を用いて１／１０³ 倍に
希釈した。増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’
−（２’−メチル）チアゾリル］フェノールおよび１．
６μＭフェノールインドフェノールの５０ｍＭほう酸緩
衝液（ｐＨ１０）を調製して用いた。ルミノール溶液は
２３ｍＭＮａＯＨ溶液で２０ｍＭに調製した。Example 7 (Preparation of chemiluminescent reaction solution) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A concentration series of hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml)
It was diluted 1/10 ³ with a PBS solution containing 0.1% milk. As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4 '
-(2'-methyl) thiazolyl] phenol and 1.
A 50 mM borate buffer solution (pH 10) of 6 μM phenol indophenol was prepared and used. The luminol solution was adjusted to 20 mM with a 23 mM NaOH solution.

【００３９】（過酸化水素の測定）過酸化水素の濃度系
列に対して上記の反応溶液を用いて、実施例４と同様に
化学発光の測定を行い、用量作用曲線を作製した。図４
にその結果を示す。(Measurement of hydrogen peroxide) Using the above reaction solution with respect to the hydrogen peroxide concentration series, chemiluminescence was measured in the same manner as in Example 4 to prepare a dose action curve. Figure 4
The results are shown in.

【００４０】実施例８ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、０．１
％ミルク含有ＰＢＳ溶液を用いて１／１０³ 倍希釈し
た。増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’−
（２’−メチル）チアゾリル］フェノールおよび１．６
μＭフェノールインドフェノールの５０ｍＭほう酸緩衝
液（ｐＨ１０）を調製して用いた。ルミノール溶液は２
３ｍＭＮａＯＨ溶液で濃度系列を調製した。Example 8 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml) was 0.1
It diluted 1/10 ³ times using the PBS solution containing% milk. As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4'-
(2'-methyl) thiazolyl] phenol and 1.6
A 50 mM borate buffer solution (pH 10) of μM phenol indophenol was prepared and used. Luminol solution is 2
A concentration series was prepared with a 3 mM NaOH solution.

【００４１】（ルミノールの測定）ルミノールの濃度系
列に対して上記の反応溶液を用いて、実施例４と同様に
化学発光の測定を行い、用量作用曲線を作製した。図５
にその結果を示す。(Measurement of Luminol) Using the above reaction solution with respect to the luminol concentration series, chemiluminescence was measured in the same manner as in Example 4 to prepare a dose action curve. Figure 5
The results are shown in.

【００４２】実施例９ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、０．１
％ミルク含有ＰＢＳ溶液によって所定の濃度に希釈して
用いた。増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’−
（２’−メチル）チアゾリル］フェノールおよび３．２
μＭ−３２μＭ２，６−ジクロフェノールインドフェノ
ールナトリウムの５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）を
調製して用いた。ルミノール溶液は２３ｍＭＮａＯＨ溶
液で２０ｍＭに調製した。Example 9 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml) was 0.1
It was used after diluting to a predetermined concentration with a PBS solution containing% milk. As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4'-
(2'-methyl) thiazolyl] phenol and 3.2
A 50 mM borate buffer solution (pH 10) of sodium μM-32 μM 2,6-dichlorophenolindophenol was prepared and used. The luminol solution was adjusted to 20 mM with a 23 mM NaOH solution.

【００４３】（２，６−ジクロフェノールインドフェノ
ールナトリウムを用いた化学発光測定）９６穴マイクロ
タイタプレートのウェルに、１０μｌの１０⁴ 倍希釈の
抗エンドセリン１ＨＲＰ標識抗体、次いで１００μｌの
過酸化水素溶液、５０μｌのルミノール溶液、５０μｌ
の増感剤溶液を加えて混合し、１０分後、ルミノメータ
により４３５ｎｍの発光量（ルミカウント）を測定し
た。また同時に標識抗体を加えないブランクの測定を行
った。表５には２，６−ジクロフェノールインドフェノ
ールナトリウムを添加した場合と添加しない場合におけ
るブランク値（バックグラウンド）、試料発光量および
信号／ブランク比（Ｓ／Ｎ比）を比較して示した。(Chemical Luminescence Measurement Using 2,6-Dichlorophenolindophenol Sodium) In a well of a 96-well microtiter plate, 10 μl of 10 ⁴ -fold diluted anti-endothelin 1HRP-labeled antibody, and then 100 μl of hydrogen peroxide solution, 50 μl luminol solution, 50 μl
The sensitizer solution of was added and mixed, and after 10 minutes, the amount of light emission (lumine count) at 435 nm was measured by a luminometer. At the same time, a blank measurement was performed without adding the labeled antibody. In Table 5, the blank value (background), the luminescence amount of the sample and the signal / blank ratio (S / N ratio) with and without the addition of 2,6-dichlorophenolindophenol sodium are shown.

【００４４】[0044]

【表５】 ２，６−ジクロフェノールインドフェノールナトリウムを共存させた場 合の化学発光増強効果 ──────────────────────────────────── 添加濃度（μＭ） ブランク値 試料発光量 Ｓ／Ｎ比 ──────────────────────────────────── ０（従来法） ７９ １６，９７８ ２１６ ３．２ ６９ ２０，０４７ ２９１ １６ ５７ １９，３４９ ３４２ ３２ ６１ １９，７１４ ３２３ ────────────────────────────────────[Table 5] Chemiluminescence enhancing effect when 2,6-dichlorophenolindophenol sodium is allowed to coexist ─────────────────────────── ────────── Additive concentration (μM) Blank value Sample emission S / N ratio ──────────────────────────── ────────── 0 (conventional method) 79 16, 978 216 3.2 69 20,047 291 16 57 19, 349 342 32 61 61,714 323 ────────── ───────────────────────────

【００４５】表５の結果の様に２，６−ジクロフェノー
ルインドフェノールナトリウムを添加させるとバックグ
ラウンド発光が抑制され、また試料発光量が増加し、Ｓ
／Ｎ比が改善される結果となった。As shown in the results of Table 5, the addition of 2,6-dichlorophenolindophenol sodium suppresses background luminescence and increases the amount of luminescence of the sample.
The result is that the / N ratio is improved.

【００４６】実施例１０ （化学発光の経時変化の測定）化学発光量を精度よく測
定するためには、用いる化学発光反応が長時間にわたり
安定していなければならない。そこで実施例９と同様に
化学発光用溶液を調製し、混合後直ちに測定を開始して
経時変化を調べた。尚、２，６−ジクロフェノールイン
ドフェノールナトリムは３２μＭに調製した。その結
果、図６に示すように約１０分で発光量はプラトーに達
し、以後発光が安定して持続した。また特に２，６−ジ
クロフェノールインドフェノールナトリウムを共存させ
た場合、共存させない場合に比べて高い発光量で安定性
を示した。また図７に示したようにＳ／Ｎ比にも同様の
傾向が観測された。Example 10 (Measurement of Change in Chemiluminescence over Time) In order to accurately measure the chemiluminescence amount, the chemiluminescence reaction to be used must be stable for a long time. Therefore, a chemiluminescence solution was prepared in the same manner as in Example 9, and measurement was started immediately after mixing to examine the change with time. In addition, 2,6-dichlorophenol indophenol sodium was adjusted to 32 μM. As a result, as shown in FIG. 6, the amount of luminescence reached a plateau in about 10 minutes, and thereafter luminescence continued stably. In particular, when 2,6-dichlorophenolindophenol sodium was made to coexist, stability was shown with a higher luminescence amount than when not coexisted. Further, as shown in FIG. 7, a similar tendency was observed in the S / N ratio.

【００４７】実施例１１ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、０．１
％ミルク含有ＰＢＳ溶液を用いて希釈系列を作製した。
増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’−（２’−
メチル）チアゾリル］フェノールおよび３２μＭ２，６
−ジクロフェノールインドフェノールナトリウムの５０
ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）を調製して用いた。ルミ
ノール溶液は２３ｍＭＮａＯＨ溶液で２０ｍＭに調製し
た。Example 11 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml) was 0.1
Dilution series were made using PBS solution containing% milk.
As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4 '-(2'-
Methyl) thiazolyl] phenol and 32 μM 2,6
-Dichlorophenol sodium indophenol 50
A mM borate buffer solution (pH 10) was prepared and used. The luminol solution was adjusted to 20 mM with a 23 mM NaOH solution.

【００４８】（パーオキシダーゼ活性の測定）抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体の各希釈系列に対して上記の反
応溶液を用いて、実施例９と同様に化学発光の測定を行
い、用量作用曲線を作製した。図８にその結果を示す。(Measurement of peroxidase activity) Chemiluminescence was measured in the same manner as in Example 9 by using the above reaction solution for each dilution series of the anti-endothelin 1HRP-labeled antibody to prepare a dose action curve. The result is shown in FIG.

【００４９】実施例１２ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する過酸化水素溶液の濃度系列を調製した。抗エ
ンドセリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍ）は、０．
１％ミルク含有ＰＢＳ溶液を用いて１／１０³ 倍に希釈
した。増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’−
（２’−メチル）チアゾリル］フェノールおよび１６μ
Ｍ２，６−ジクロフェノールインドフェノールナトリウ
ムの５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）を調製して用い
た。ルミノール溶液は２３ｍＭＮａＯＨ溶液で２０ｍＭ
に調製した。Example 12 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A concentration series of hydrogen peroxide solution containing was prepared. The anti-endothelin 1HRP-labeled antibody (60 μg / m) was added at 0.
It was diluted 1/10 ³ with a PBS solution containing 1% milk. As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4'-
(2'-methyl) thiazolyl] phenol and 16μ
A 50 mM boric acid buffer solution (pH 10) of M2,6-dichlorophenolindophenol sodium was prepared and used. Luminol solution is 20mM with 23mM NaOH solution
Was prepared.

【００５０】（過酸化水素の測定）過酸化水素の濃度系
列に対して上記の反応溶液を用いて、実施例９と同様に
化学発光の測定を行い、用量作用曲線を作製した。図９
にその結果を示す。(Measurement of hydrogen peroxide) Using the above reaction solution for the concentration series of hydrogen peroxide, chemiluminescence was measured in the same manner as in Example 9 to prepare a dose action curve. Figure 9
The results are shown in.

【００５１】実施例１３ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、０．１
％ミルク含有ＰＢＳ溶液を用いて１／１０³ 倍に希釈し
た。増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’−
（２’−メチル）チアゾリル］フェノールおよび１６μ
Ｍ２，６−ジクロフェノールインドフェノールナトリウ
ムの５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）を調製して用い
た。ルミノール溶液は２３ｍＭＮａＯＨ溶液で濃度系列
を調製した。Example 13 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml) was 0.1
It diluted 1/10 ³ times with the PBS solution containing% milk. As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4'-
(2'-methyl) thiazolyl] phenol and 16μ
A 50 mM boric acid buffer solution (pH 10) of M2,6-dichlorophenolindophenol sodium was prepared and used. A concentration series of luminol solution was prepared with a 23 mM NaOH solution.

【００５２】（ルミノールの測定）ルミノールの濃度系
列に対して上記の反応溶液を用いて、実施例９と同様に
化学発光の測定を行い、用量作用曲線を作製した。図１
０にその結果を示す。(Measurement of Luminol) Using the above reaction solution for the concentration series of luminol, chemiluminescence was measured in the same manner as in Example 9 to prepare a dose action curve. Figure 1
The result is shown in 0.

【００５３】実施例１４ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、０．１
％ミルク含有ＰＢＳ溶液によって所定の濃度に希釈して
用いた。増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’−
（２’−メチル）チアゾリル］フェノールおよび３．２
μＭインドフェノールブルーの５０ｍＭほう酸緩衝液
（ｐＨ１０）を調製して用いた。ルミノール溶液は２３
ｍＭＮａＯＨ溶液で２０ｍＭに調製した。Example 14 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml) was 0.1
It was used after diluting to a predetermined concentration with a PBS solution containing% milk. As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4'-
(2'-methyl) thiazolyl] phenol and 3.2
A 50 mM borate buffer solution (pH 10) of μM indophenol blue was prepared and used. Luminol solution is 23
It was adjusted to 20 mM with a mM NaOH solution.

【００５４】（インドフェノールブルーを用いた化学発
光測定）９６穴マイクロタイタプレートのウェルに、１
０μｌの１０⁴ 倍希釈の抗エンドセリン１ＨＲＰ標識抗
体、次いで１００μｌの過酸化水素溶液、５０μｌのル
ミノール溶液、５０μｌの増感剤溶液を加えて混合し、
１０分後、ルミノメータにより４３５ｎｍの発光量（ル
ミカウント）を測定した。また同時に標識抗体を加えな
いブランクの測定を行った。表６にはインドフェノール
ブルーを添加した場合と添加しない場合におけるブラン
ク値（バックグラウンド）、試料発光量および信号／ブ
ランク比（Ｓ／Ｎ比）を比較して示した。(Chemiluminescence measurement using indophenol blue) 1 in a well of a 96-well microtiter plate
0 μl of 10 ⁴ -fold diluted anti-endothelin 1HRP labeled antibody, then 100 μl of hydrogen peroxide solution, 50 μl of luminol solution, 50 μl of sensitizer solution were added and mixed,
After 10 minutes, the amount of luminescence at 435 nm (Lumicount) was measured with a luminometer. At the same time, a blank measurement was performed without adding the labeled antibody. Table 6 shows a comparison of the blank value (background), the sample luminescence amount, and the signal / blank ratio (S / N ratio) with and without addition of indophenol blue.

【００５５】[0055]

【表６】 インドフェノールブルーを共存させた場合の化学発光増強効果 ──────────────────────────────────── 添加濃度（μＭ） ブランク値 試料発光量 Ｓ／Ｎ比 ──────────────────────────────────── ０（従来法） ７９ １６，９７８ ２１６ ３．２ ６２ １９，１５７ ３０９ ────────────────────────────────────[Table 6] Chemiluminescence enhancement effect when indophenol blue coexists ────────────────────────────────── ─── Additive concentration (μM) Blank value Light emission of sample S / N ratio ────────────────────────────────── ─── 0 (conventional method) 79 16,978 216 3.2 62 19,157 309 ─────────────────────────────── ───────

【００５６】表６の結果の様にインドフェノールブルー
を添加させるとバックグラウンド発光が抑制され、また
試料発光量が増加し、Ｓ／Ｎ比が改善される結果となっ
た。As shown in the results of Table 6, the addition of indophenol blue suppressed the background luminescence, increased the luminescence amount of the sample, and improved the S / N ratio.

【００５７】実施例１５ （化学発光の経時変化の測定）化学発光量を精度よく測
定するためには、用いる化学発光反応が長時間にわたり
安定していなければならない。そこで実施例１４と同様
に化学発光用溶液を調製し、混合後直ちに測定を開始し
て経時変化を調べた。尚、インドフェノールブルーは
１．６μＭに調製した。その結果、図１１に示すように
約１０分で発光量はプラトーに達し、以後発光が安定し
て持続した。また特にインドフェノールブルーを共存さ
せた場合、共存させない場合に比べて高い発光量で安定
性を示した。また図１２に示したようにＳ／Ｎ比にも同
様の傾向が観測された。Example 15 (Measurement of Change in Chemiluminescence over Time) In order to measure the chemiluminescence amount with high accuracy, the chemiluminescence reaction used must be stable for a long time. Therefore, a chemiluminescence solution was prepared in the same manner as in Example 14, and measurement was started immediately after mixing to examine the change with time. Indophenol blue was prepared at 1.6 μM. As a result, as shown in FIG. 11, the light emission amount reached a plateau in about 10 minutes, and thereafter, the light emission was stably maintained. In addition, in the case of coexisting with indophenol blue, the stability was shown at a higher luminescence amount than in the case of not coexisting. Further, as shown in FIG. 12, a similar tendency was observed in the S / N ratio.

【００５８】実施例１６ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、０．１
％ミルク含有ＰＢＳ溶液を用いて希釈系列を作製した。
増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’−（２’−
メチル）チアゾリル］フェノールおよび３．２μＭイン
ドフェノールブルーの５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１
０）を調製して用いた。ルミノール溶液は２３ｍＭＮａ
ＯＨ溶液で２０ｍＭに調製した。Example 16 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml) was 0.1
Dilution series were made using PBS solution containing% milk.
As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4 '-(2'-
Methyl) thiazolyl] phenol and 3.2 μM indophenol blue in 50 mM borate buffer (pH 1
0) was prepared and used. Luminol solution is 23 mM Na
It was adjusted to 20 mM with an OH solution.

【００５９】（パーオキシダーゼ活性の測定）抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体の各希釈系列に対して上記の反
応溶液を用いて、実施例１４と同様に化学発光の測定を
行い、用量作用曲線を作製した。図１３にその結果を示
す。(Measurement of peroxidase activity) The chemiluminescence was measured in the same manner as in Example 14 using the above reaction solution for each dilution series of the anti-endothelin 1HRP-labeled antibody to prepare a dose action curve. The result is shown in FIG.

【００６０】実施例１７ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する過酸化水素溶液の濃度系列を調製した。抗エ
ンドセリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、
０．１％ミルク含有ＰＢＳ溶液を用いて１／１０³ 倍に
希釈した。増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’
−（２’−メチル）チアゾリル］フェノールおよび１．
６μＭインドフェノールブルーの５０ｍＭほう酸緩衝液
（ｐＨ１０）を調製して用いた。ルミノール溶液は２３
ｍＭＮａＯＨ溶液で２０ｍＭに調製した。Example 17 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A concentration series of hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml)
It was diluted 1/10 ³ with a PBS solution containing 0.1% milk. As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4 '
-(2'-methyl) thiazolyl] phenol and 1.
6 μM indophenol blue 50 mM borate buffer (pH 10) was prepared and used. Luminol solution is 23
It was adjusted to 20 mM with a mM NaOH solution.

【００６１】（過酸化水素の測定）過酸化水素の濃度系
列に対して上記の反応溶液を用いて、実施例１４と同様
に化学発光の測定を行い、用量作用曲線を作製した。図
１４にその結果を示す。(Measurement of Hydrogen Peroxide) Using the above reaction solution for the concentration series of hydrogen peroxide, chemiluminescence was measured in the same manner as in Example 14 to prepare a dose action curve. The result is shown in FIG.

【００６２】実施例１８ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、０．１
％ミルク含有ＰＢＳ溶液を用いて１／１０³ 倍に希釈し
た。増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’−
（２’−メチル）チアゾリル］フェノールおよび１．６
μＭインドフェノールブルーの５０ｍＭほう酸緩衝液
（ｐＨ１０）を調製して用いた。ルミノール溶液は２３
ｍＭＮａＯＨ溶液で濃度系列を調製した。Example 18 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml) was 0.1
It diluted 1/10 ³ times with the PBS solution containing% milk. As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4'-
(2'-methyl) thiazolyl] phenol and 1.6
A 50 mM borate buffer solution (pH 10) of μM indophenol blue was prepared and used. Luminol solution is 23
A concentration series was prepared with mM NaOH solution.

【００６３】（ルミノールの測定）ルミノールの濃度系
列に対して上記の反応溶液を用いて、実施例１４と同様
に化学発光の測定を行い、用量作用曲線を作製した。図
１５にその結果を示す。(Measurement of Luminol) Using the above reaction solution for the concentration series of luminol, chemiluminescence was measured in the same manner as in Example 14 to prepare a dose action curve. The results are shown in FIG.

【００６４】実施例１９ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、０．１
％ミルク含有ＰＢＳ溶液によって所定の濃度に希釈して
用いた。増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’−
（２’−メチル）チアゾリル］フェノールおよび３．２
μＭ−３２μＭインドフェノールナトリウムの５０ｍＭ
ほう酸緩衝液（ｐＨ１０）を調製して用いた。ルミノー
ル溶液は２３ｍＭＮａＯＨ溶液で２０ｍＭに調製した。Example 19 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml) was 0.1
It was used after diluting to a predetermined concentration with a PBS solution containing% milk. As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4'-
(2'-methyl) thiazolyl] phenol and 3.2
μM-32 μM Sodium indophenol 50 mM
A borate buffer solution (pH 10) was prepared and used. The luminol solution was adjusted to 20 mM with a 23 mM NaOH solution.

【００６５】（インドフェノールナトリウムを用いた化
学発光測定）９６穴マイクロタイタプレートのウェル
に、１０μｌの１０⁴ 倍希釈の抗エンドセリン１ＨＲＰ
標識抗体、次いで１００μｌの過酸化水素溶液、５０μ
ｌのルミノール溶液、５０μｌの増感剤溶液を加えて混
合し、１０分後、ルミノメータにより４３５ｎｍの発光
量（ルミカウント）を測定した。また同時に標識抗体を
加えないブランクの測定を行った。表７にはインドフェ
ノールナトリウムを添加した場合と添加しない場合にお
けるブランク値（バックグラウンド）、試料発光量およ
び信号／ブランク比（Ｓ／Ｎ比）を比較して示した。(Chemiluminescence measurement using sodium indophenol) 10 μl of 10 ⁴ -fold diluted anti-endothelin 1HRP was added to the well of a 96-well microtiter plate.
Labeled antibody, then 100 μl hydrogen peroxide solution, 50 μl
1 l of the luminol solution and 50 μl of the sensitizer solution were added and mixed, and after 10 minutes, the amount of light emission (luminous count) at 435 nm was measured by a luminometer. At the same time, a blank measurement was performed without adding the labeled antibody. In Table 7, the blank value (background), the sample luminescence amount, and the signal / blank ratio (S / N ratio) with and without addition of sodium indophenol are shown in comparison.

【００６６】表７の結果の様にインドフェノールナトリ
ウムを添加させるとバックグラウンド発光が抑制され、
また試料発光量が増加し、Ｓ／Ｎ比が改善される結果と
なった。As shown in the results of Table 7, addition of indophenol sodium suppresses background luminescence,
Further, the light emission amount of the sample increased and the S / N ratio was improved.

【００６７】[0067]

【表７】 インドフェノールナトリウムを共存させた場合の化学発光増強効果 ──────────────────────────────────── 添加濃度（μＭ） ブランク値 試料発光量 Ｓ／Ｎ比 ──────────────────────────────────── ０（従来法） ７９ １６，９７８ ２１６ ３．２ ７１ ２２，２９８ ３１４ １６ ５３ １９，１７７ ３６２ ３２ ５２ １７，３６０ ３３７ ────────────────────────────────────[Table 7] Chemiluminescence enhancement effect when coexisting with indophenol sodium ────────────────────────────────── ─── Additive concentration (μM) Blank value Light emission of sample S / N ratio ────────────────────────────────── ─── 0 (conventional method) 79 16,978 216 3.2 71 22,22 98 314 16 53 53 19,177 362 32 52 52 17,360 337 ───────────────── ────────────────────

【００６８】実施例２０ （化学発光の経時変化の測定）化学発光量を精度よく測
定するためには、用いる化学発光反応が長時間にわたり
安定していなければならない。そこで実施例１９と同様
に化学発光用溶液を調製し、混合後直ちに測定を開始し
て経時変化を調べた。尚、インドフェノールナトリウム
は３．２μＭに調製した。その結果、図１６に示すよう
に約１０分で発光量はプラトーに達し、以後発光が安定
して持続した。また特にインドフェノールナトリウムを
共存させた場合、共存させない場合に比べて高い発光量
で安定性を示した。また図１７に示したようにＳ／Ｎ比
にも同様の傾向が観測された。Example 20 (Measurement of Change in Chemiluminescence over Time) In order to accurately measure the chemiluminescence amount, the chemiluminescence reaction to be used must be stable for a long time. Therefore, a chemiluminescent solution was prepared in the same manner as in Example 19, and measurement was started immediately after mixing to examine the change with time. The sodium indophenol was adjusted to 3.2 μM. As a result, as shown in FIG. 16, the amount of luminescence reached a plateau in about 10 minutes, and luminescence continued steadily thereafter. In addition, in particular, in the case of coexisting indophenol sodium, the stability was shown with a higher luminescence amount than in the case of not coexisting. Further, as shown in FIG. 17, a similar tendency was observed in the S / N ratio.

【００６９】実施例２１ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、０．１
％ミルク含有ＰＢＳ溶液を用いて希釈系列を作製した。
増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’−（２’−
メチル）チアゾリル］フェノールおよび１６μＭインド
フェノールナトリウムの５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１
０）を調製して用いた。ルミノール溶液は２３ｍＭＮａ
ＯＨ溶液で２０ｍＭに調製した。Example 21 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml) was 0.1
Dilution series were made using PBS solution containing% milk.
As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4 '-(2'-
Methyl) thiazolyl] phenol and 16 μM sodium indophenol in 50 mM borate buffer (pH 1
0) was prepared and used. Luminol solution is 23 mM Na
It was adjusted to 20 mM with an OH solution.

【００７０】（パーオキシダーゼ活性の測定）抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体の各希釈系列に対して上記の反
応溶液を用いて、実施例１９と同様に化学発光の測定を
行い、用量作用曲線を作製した。図１８にその結果を示
す。(Measurement of peroxidase activity) The chemiluminescence was measured in the same manner as in Example 19 using the above reaction solution for each dilution series of the anti-endothelin 1HRP-labeled antibody to prepare a dose action curve. The results are shown in FIG.

【００７１】実施例２２ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する過酸化水素溶液の濃度系列を調製した。抗エ
ンドセリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、
０．１％ミルク含有ＰＢＳ溶液を用いて１／１０³ 倍に
希釈した。増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’
−（２’−メチル）チアゾリル］フェノールおよび３．
２μＭインドフェノールナトリウムの５０ｍＭほう酸緩
衝液（ｐＨ１０）を調製して用いた。ルミノール溶液は
２３ｍＭＮａＯＨ溶液で２０ｍＭに調製した。Example 22 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A concentration series of hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml)
It was diluted 1/10 ³ with a PBS solution containing 0.1% milk. As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4 '
-(2'-methyl) thiazolyl] phenol and 3.
A 50 mM borate buffer solution (pH 10) of 2 μM sodium indophenol was prepared and used. The luminol solution was adjusted to 20 mM with a 23 mM NaOH solution.

【００７２】（過酸化水素の測定）過酸化水素の濃度系
列に対して上記の反応溶液を用いて、実施例１９と同様
に化学発光の測定を行い、用量作用曲線を作製した。図
１９にその結果を示す。(Measurement of hydrogen peroxide) Using the above reaction solution with respect to the hydrogen peroxide concentration series, chemiluminescence was measured in the same manner as in Example 19 to prepare a dose action curve. The results are shown in FIG.

【００７３】実施例２３ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、０．１
％ミルク含有ＰＢＳ溶液を用いて１／１０³ 倍に希釈し
た。増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’−
（２’−メチル）チアゾリル］フェノールおよび３．２
μＭインドフェノールナトリウムの５０ｍＭほう酸緩衝
液（ｐＨ１０）を調製して用いた。ルミノール溶液は２
３ｍＭＮａＯＨ溶液で濃度系列を調製した。Example 23 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml) was 0.1
It diluted 1/10 ³ times with the PBS solution containing% milk. As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4'-
(2'-methyl) thiazolyl] phenol and 3.2
A 50 mM borate buffer solution (pH 10) of sodium μM indophenol was prepared and used. Luminol solution is 2
A concentration series was prepared with a 3 mM NaOH solution.

【００７４】（ルミノールの測定）ルミノールの濃度系
列に対して上記の反応溶液を用いて、実施例１９と同様
に化学発光の測定を行い、用量作用曲線を作製した。図
２０にその結果を示す。(Measurement of Luminol) Using the above reaction solution for luminol concentration series, chemiluminescence was measured in the same manner as in Example 19 to prepare a dose action curve. The result is shown in FIG.

【００７５】実施例２４ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、０．１
％ミルク含有ＰＢＳ溶液によって所定の濃度に希釈して
用いた。増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’−
（２’−メチル）チアゾリル］フェノールおよび１６μ
ｍ−１６０μＭ酢酸インドフェノールの５０ｍＭほう酸
緩衝液（ｐＨ１０）を調製して用いた。ルミノール溶液
は２３ｍＭＮａＯＨ溶液で２０ｍＭに調製した。Example 24 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml) was 0.1
It was used after diluting to a predetermined concentration with a PBS solution containing% milk. As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4'-
(2'-methyl) thiazolyl] phenol and 16μ
A 50 mM borate buffer solution (pH 10) of m-160 μM indophenol acetate was prepared and used. The luminol solution was adjusted to 20 mM with a 23 mM NaOH solution.

【００７６】（酢酸インドフェノールを用いた化学発光
測定）９６穴マイクロタイタプレートのウェルに、１０
μｌの１０⁴ 倍希釈の抗エンドセリン１ＨＲＰ標識抗
体、次いで１００μｌの過酸化水素溶液、５０μｌのル
ミノール溶液、５０μｌの増感剤溶液を加えて混合し、
１０分後、ルミノメータにより４３５ｎｍの発光量（ル
ミカウント）を測定した。また同時に標識抗体を加えな
いブランクの測定を行った。表８には酢酸インドフェノ
ールを添加した場合と添加しない場合におけるブランク
値（バックグラウンド）、試料発光量および信号／ブラ
ンク比（Ｓ／Ｎ比）を比較して示した。(Chemical luminescence measurement using indophenol acetate) Into a well of a 96-well microtiter plate, 10
μl of 10 ⁴ -fold diluted anti-endothelin 1HRP-labeled antibody, then 100 μl of hydrogen peroxide solution, 50 μl of luminol solution, 50 μl of sensitizer solution were added and mixed,
After 10 minutes, the amount of luminescence at 435 nm (Lumicount) was measured with a luminometer. At the same time, a blank measurement was performed without adding the labeled antibody. In Table 8, the blank value (background), the sample luminescence amount, and the signal / blank ratio (S / N ratio) with and without the addition of indophenol acetate are shown in comparison.

【００７７】[0077]

【表８】 酢酸インドフェノールを共存させた場合の化学発光増強効果 ──────────────────────────────────── 添加濃度（μＭ） ブランク値 試料発光量 Ｓ／Ｎ比 ──────────────────────────────────── ０（従来法） ７９ １６，９７８ ２１６ １６ ６５ ２０，９４１ ３２５ ３２ ６２ ２０，３４８ ３２８ １６０ ５２ １８，８９０ ３６７ ────────────────────────────────────[Table 8] Chemiluminescence-enhancing effect when coexisting with indophenol acetate ────────────────────────────────── ─── Additive concentration (μM) Blank value Light emission of sample S / N ratio ────────────────────────────────── ─── 0 (conventional method) 79 16,978 216 16 65 20 20,941 325 32 62 20,20 348 328 160 160 52 18,890 367 ─────────────────── ─────────────────

【００７８】表８の結果の様に酢酸インドフェノールを
添加させるとバックグラウンド発光が抑制され、また試
料発光量が増加し、Ｓ／Ｎ比が改善される結果となっ
た。As shown in the results of Table 8, when indophenol acetate was added, the background luminescence was suppressed, the luminescence amount of the sample was increased, and the S / N ratio was improved.

【００７９】実施例２５ （化学発光の経時変化の測定）化学発光量を精度よく測
定するためには、用いる化学発光反応が長時間にわたり
安定していなければならない。そこで実施例２４と同様
に化学発光用溶液を調製し、混合後直ちに測定を開始し
て経時変化を調べた。尚、酢酸インドフェノールは１６
μＭに調製した。その結果、図２１に示すように約１０
分で発光量はプラトーに達し、以後発光が安定して持続
した。また特に酢酸インドフェノールを共存させた場
合、共存させない場合に比べて高い発光量で安定性を示
した。また図２２に示したようにＳ／Ｎ比にも同様の傾
向が観測された。Example 25 (Measurement of Change in Chemiluminescence over Time) In order to accurately measure the chemiluminescence amount, the chemiluminescence reaction to be used must be stable for a long time. Therefore, a chemiluminescence solution was prepared in the same manner as in Example 24, and measurement was started immediately after mixing to examine the change with time. Indophenol acetate is 16
μM. As a result, as shown in FIG.
The luminescence amount reached a plateau in minutes, and thereafter, the luminescence continued stably. In particular, when indophenol acetate was allowed to coexist, stability was shown at a higher luminescence amount than when not coexisted. Further, as shown in FIG. 22, a similar tendency was observed in the S / N ratio.

【００８０】実施例２６ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、０．１
％ミルク含有ＰＢＳ溶液を用いて希釈系列を作製した。
増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’−（２’−
メチル）チアゾリル］フェノールおよび３２μＭ酢酸イ
ンドフェノールの５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）を
調製して用いた。ルミノール溶液は２３ｍＭＮａＯＨ溶
液で２０ｍＭに調製した。Example 26 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml) was 0.1
Dilution series were made using PBS solution containing% milk.
As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4 '-(2'-
A 50 mM borate buffer (pH 10) of methyl) thiazolyl] phenol and 32 μM indophenol acetate was prepared and used. The luminol solution was adjusted to 20 mM with a 23 mM NaOH solution.

【００８１】（パーオキシダーゼ活性の測定）抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体の各希釈系列に対して上記の反
応溶液を用いて、実施例２４と同様に化学発光の測定を
行い、用量作用曲線を作製した。図２３にその結果を示
す。(Measurement of peroxidase activity) Chemiluminescence was measured in the same manner as in Example 24 using the above reaction solution for each dilution series of the anti-endothelin 1HRP-labeled antibody to prepare a dose action curve. The result is shown in FIG.

【００８２】実施例２７ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する過酸化水素溶液の濃度系列を調製した。抗エ
ンドセリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、
０．１％ミルク含有ＰＢＳ溶液を用いて１／１０³ 倍に
希釈した。増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’
−（２’−メチル）チアゾリル］フェノールおよび１６
μＭ酢酸インドフェノールの５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐ
Ｈ１０）を調製して用いた。ルミノール溶液は２３ｍＭ
ＮａＯＨ溶液で２０ｍＭに調製した。Example 27 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A concentration series of hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml)
It was diluted 1/10 ³ with a PBS solution containing 0.1% milk. As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4 '
-(2'-methyl) thiazolyl] phenol and 16
μM Indophenol acetate 50 mM borate buffer (p
H10) was prepared and used. Luminol solution is 23 mM
It was adjusted to 20 mM with a NaOH solution.

【００８３】（過酸化水素の測定）過酸化水素の濃度系
列に対して上記の反応溶液を用いて、実施例２４と同様
に化学発光の測定を行い、用量作用曲線を作製した。図
２４にその結果を示す。(Measurement of Hydrogen Peroxide) Using the above reaction solution for hydrogen peroxide concentration series, chemiluminescence was measured in the same manner as in Example 24 to prepare a dose action curve. The result is shown in FIG.

【００８４】実施例２８ （化学発光反応用溶液の調製）過酸化水素溶液として、
５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．１％ミルク、
０．０５％エッグアルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有する２ｍＭ過酸化水素溶液を調製した。抗エンド
セリン１ＨＲＰ標識抗体（６０μｇ／ｍｌ）は、０．１
％ミルク含有ＰＢＳ溶液を用いて１／１０³ 倍に希釈し
た。増感剤溶液として、０．３２ｍＭ４−［４’−
（２’−メチル）チアゾリル］フェノールおよび１６μ
Ｍ酢酸インドフェノールの５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ
１０）を調製して用いた。ルミノール溶液は２３ｍＭＮ
ａＯＨ溶液で濃度系列を調製した。Example 28 (Preparation of solution for chemiluminescence reaction) As a hydrogen peroxide solution,
0.1% milk in 50 mM borate buffer (pH 10),
0.05% egg albumin, 0.1% Tween20
A 2 mM hydrogen peroxide solution containing was prepared. Anti-endothelin 1HRP labeled antibody (60 μg / ml) was 0.1
It diluted 1/10 ³ times with the PBS solution containing% milk. As a sensitizer solution, 0.32 mM 4- [4'-
(2'-methyl) thiazolyl] phenol and 16μ
50 mM boric acid buffer solution of M indophenol acetate (pH
10) was prepared and used. Luminol solution is 23 mMN
A concentration series was prepared with aOH solution.

【００８５】（ルミノールの測定）ルミノールの濃度系
列に対して上記の反応溶液を用いて、実施例２４と同様
に化学発光の測定を行い、用量作用曲線を作製した。図
２５にその結果を示す。(Measurement of Luminol) Using the above reaction solution for luminol concentration series, chemiluminescence was measured in the same manner as in Example 24 to prepare a dose action curve. The result is shown in FIG.

【００８６】[0086]

【発明の効果】本発明により化学発光の計測を基とする
各種測定法、特に免疫定量、酵素定量の感度向上に好適
な化学発光の増強方法を提供することができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can provide various measuring methods based on the measurement of chemiluminescence, particularly methods for enhancing chemiluminescence suitable for improving the sensitivity of immunoassay and enzyme quantification.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】実施例５の化学発光反応における化学発光量の
経時変化を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing a change with time in chemiluminescence amount in a chemiluminescence reaction of Example 5.

【図２】実施例５の化学発光反応におけるＳ／Ｎ比の経
時変化を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing changes with time of S / N ratio in the chemiluminescence reaction of Example 5.

【図３】実施例６のパーオキシダーゼ活性測定における
用量作用曲線を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing a dose action curve in the peroxidase activity measurement of Example 6.

【図４】実施例７の過酸化水素濃度測定における用量作
用曲線を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing a dose action curve in hydrogen peroxide concentration measurement of Example 7.

【図５】実施例８のルミノール濃度測定における用量作
用曲線を示すグラフである。FIG. 5 is a graph showing a dose-effect curve in measuring luminol concentration in Example 8.

【図６】実施例１０の化学発光反応における化学発光量
の経時変化を示すグラフである。6 is a graph showing a change with time in chemiluminescence amount in a chemiluminescence reaction of Example 10. FIG.

【図７】実施例１０の化学発光反応におけるＳ／Ｎ比の
経時変化を示すグラフである。FIG. 7 is a graph showing changes with time of S / N ratio in the chemiluminescence reaction of Example 10.

【図８】実施例１１のパーオキシダーゼ活性測定におけ
る用量作用曲線を示すグラフである。FIG. 8 is a graph showing a dose-effect curve in the peroxidase activity measurement of Example 11.

【図９】実施例１２の過酸化水素濃度測定における用量
作用曲線を示すグラフである。FIG. 9 is a graph showing a dose action curve in hydrogen peroxide concentration measurement of Example 12.

【図１０】実施例１３のルミノール濃度測定における用
量作用曲線を示すグラフである。FIG. 10 is a graph showing a dose-effect curve in measurement of luminol concentration in Example 13.

【図１１】実施例１５の化学発光反応における化学発光
量の経時変化を示すグラフである。FIG. 11 is a graph showing the change over time in the chemiluminescence amount in the chemiluminescence reaction of Example 15.

【図１２】実施例１５の化学発光反応におけるＳ／Ｎ比
の経時変化を示すグラフである。FIG. 12 is a graph showing changes with time in S / N ratio in the chemiluminescence reaction of Example 15.

【図１３】実施例１６のパーオキシダーゼ活性測定にお
ける用量作用曲線を示すグラフである。FIG. 13 is a graph showing a dose-effect curve in the peroxidase activity measurement of Example 16.

【図１４】実施例１７の過酸化水素濃度測定における用
量作用曲線を示すグラフである。FIG. 14 is a graph showing a dose action curve in hydrogen peroxide concentration measurement of Example 17.

【図１５】実施例１８のルミノール濃度測定における用
量作用曲線を示すグラフである。FIG. 15 is a graph showing a dose-effect curve in measurement of luminol concentration in Example 18.

【図１６】実施例２０の化学発光反応における化学発光
量の経時変化を示すグラフである。16 is a graph showing a change with time in chemiluminescence amount in a chemiluminescence reaction of Example 20. FIG.

【図１７】実施例２０の化学発光反応におけるＳ／Ｎ比
の経時変化を示すグラフである。FIG. 17 is a graph showing the change with time of the S / N ratio in the chemiluminescent reaction of Example 20.

【図１８】実施例２１のパーオキシダーゼ活性測定にお
ける用量作用曲線を示すグラフである。FIG. 18 is a graph showing a dose-effect curve in the peroxidase activity measurement of Example 21.

【図１９】実施例２２の過酸化水素濃度測定における用
量作用曲線を示すグラフである。FIG. 19 is a graph showing a dose action curve in hydrogen peroxide concentration measurement of Example 22.

【図２０】実施例２３のルミノール濃度測定における用
量作用曲線を示すグラフである。FIG. 20 is a graph showing a dose-effect curve in measurement of luminol concentration in Example 23.

【図２１】実施例２５の化学発光反応における化学発光
量の経時変化を示すグラフである。FIG. 21 is a graph showing a change with time in chemiluminescence amount in a chemiluminescence reaction of Example 25.

【図２２】実施例２５の化学発光反応におけるＳ／Ｎ比
の経時変化を示すグラフである。22 is a graph showing changes over time in the S / N ratio in the chemiluminescent reaction of Example 25. FIG.

【図２３】実施例２６のパーオキシダーゼ活性測定にお
ける用量作用曲線を示すグラフである。FIG. 23 is a graph showing a dose-effect curve in the peroxidase activity measurement of Example 26.

【図２４】実施例２７の過酸化水素濃度測定における用
量作用曲線を示すグラフである。FIG. 24 is a graph showing a dose action curve in hydrogen peroxide concentration measurement of Example 27.

【図２５】実施例２８のルミノール濃度測定における用
量作用曲線を示すグラフである。FIG. 25 is a graph showing a dose-effect curve in measurement of luminol concentration in Example 28.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

○ インドフェノール化合物を共存させない場合 ● インドフェノール化合物を共存させた場合 Anti-ET-HRP:抗エンドセリン１ＨＲＰ標識抗体 ○ When indophenol compound does not coexist ● When indophenol compound coexists Anti-ET-HRP: Anti-endothelin 1HRP labeled antibody

Claims (4)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 化学発光物質を酸化剤、パーオキシダー
ゼおよび化学発光増感剤（エンハンサー）を用いて発光
させる系において、下記一般式（Ｉ）で表される化合物
を共存させることを特徴とする化学発光増強法。 【化１】 （式中Ｒ₁ は水酸基または水酸基のアルカリ塩、置換ま
たは無置換のアミノ基、またはアシルオキシ基を、
Ｒ₂ ，Ｒ₃ ，Ｒ₄ およびＲ₅ はそれぞれ独立して水素原
子、またはハロゲン原子を、あるいはＲ₂ とＲ₃ または
Ｒ₄ とＲ₅ がそれぞれ結合してベンゼン環を、またＲ₆
とＲ₇ はそれぞれ独立して水素原子、置換または無置換
の低級アルキル基または低級アルコキシ基を示す。）1. A system for causing a chemiluminescent substance to emit light using an oxidizing agent, a peroxidase and a chemiluminescent sensitizer (enhancer), wherein a compound represented by the following general formula (I) is allowed to coexist. Chemiluminescence enhancement method. [Chemical 1] (In the formula, R ₁ represents a hydroxyl group, an alkali salt of a hydroxyl group, a substituted or unsubstituted amino group, or an acyloxy group,
R ₂ , R ₃ , R ₄ and R ₅ each independently represent a hydrogen atom or a halogen atom, or R ₂ and R ₃ or R ₄ and R ₅ respectively bond to form a benzene ring, and R ₆
And R ₇ each independently represent a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower alkyl group or a lower alkoxy group. ) 【請求項２】 化学発光物質としてルミノールまたはイ
ソルミノールまたはそれらの誘導体、酸化剤として過酸
化水素を用いることを特徴とする請求項１に記載の化学
発光増強法。2. The chemiluminescence enhancing method according to claim 1, wherein luminol or isoluminol or a derivative thereof is used as the chemiluminescent substance, and hydrogen peroxide is used as the oxidizing agent. 【請求項３】 化学発光増感剤として、４−［２’−
（４’−メチル）チアゾリル］フェノール、４−（２’
−チエニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノールおよび
４−［４’−（２’−メチル）チアゾリル］フェノール
からなる群から選ばれる少なくとも一種を用いることを
特徴とする請求項１または２に記載の化学発光増強法。3. As a chemiluminescent sensitizer, 4- [2'-
(4'-Methyl) thiazolyl] phenol, 4- (2 '
-Thienyl) phenol, p-iodophenol and 4- [4 '-(2'-methyl) thiazolyl] phenol are used, at least one selected from the group consisting of: -the chemiluminescence according to claim 1 or 2. Augmentation method. 【請求項４】 前記一般式（Ｉ）で表される化合物が、
フェノールインドフェノール、２，６−ジクロロフェノ
ールインドフェノールナトリウム、インドフェノールブ
ルー、インドフェノールナトリウムおよび酢酸インドフ
ェノールからなる群から選ばれる少なくとも一種である
ことを特徴とする請求項３に記載の化学発光増強法。4. The compound represented by the general formula (I) is
The chemiluminescence enhancing method according to claim 3, wherein the chemiluminescence is at least one selected from the group consisting of phenol indophenol, 2,6-dichlorophenol indophenol sodium, indophenol blue, indophenol sodium and indophenol acetate. .