JPH07139931A - レーザ走査顕微鏡のレーザ照射装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 試料に照射するレーザ光の光量を試料面上の
走査範囲内の全ての位置で一様とするレーザ走査顕微鏡
のレーザ照射装置を提供することである。 【構成】 レーザ発振器１と、そのレーザ光量を調整す
る光量調整器２と、レーザビームを偏向するレーザビー
ム偏向部３と、レーザビームを分割するビームスプリッ
タ４と、走査レーザビームをスライドグラス７上の試料
８上に集光照射する、瞳５を有する対物レンズ６と、ビ
ームスプリッタ４で分割された光を通過させる開口９
と、開口９を通過した光を受ける光検出手段１０と、光
検出手段１０からの電気信号が入力される制御部１１と
を備える。 【作用】 光検出手段１０に入射する光量がレーザビー
ムの偏向走査中も一定となるように、制御部１１により
光量調整器２のレーザビームの透過率が調整される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、レーザ走査顕微鏡のレ
ーザ照射装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来のレーザ走査顕微鏡のレーザ照射装
置の一例を図３に示す。図３において、光源であるレー
ザ発振器５０から放射したレーザビーム７０は、光偏向
素子である音響光学偏向素子（ＡＯＤ）５１により、図
３では紙面に平行に偏向光ビーム７１，７２のように一
次元方向に偏向され、リレーレンズ５２、波長選択ミラ
ー５３、リレーレンズ５４を順に透過し、ガルバノ式偏
向用ミラー５５に入射する。偏向用ミラー５５は、図３
に示す例では紙面に平行な軸について回転可能になって
いる。偏向用ミラー５５で偏向されたレーザビームは、
リレーレンズ５６で結像面Ｌ上に結像した後、対物レン
ズ５９の瞳５８を経て、対物レンズ５９でスライドグラ
ス上の試料６０に集光照射される。なお、試料６０とし
ては、通常蛍光染色した細胞等が用いられる。

【０００３】二次元レーザスポットで走査された、スラ
イドグラス上の試料６０からの蛍光は、対物レンズ５９
で集光され、レーザビームと同じ経路を進行し、リレー
レンズ５４を透過した後、波長選択ミラー５３で反射さ
れて、蛍光検出器６１で電気信号に変換される。なお、
この例において、対物レンズ５９の瞳５８、偏向用ミラ
ー５５及びＡＯＤ５１の位置は互いに共役である。従っ
て、ＡＯＤ５１、偏向用ミラー５５で偏向されたレーザ
ビームは常に対物レンズ５９の瞳５８に入射する構成と
なっている。又、この例では、レーザビームの二次元の
偏向走査に音響光学偏向素子（ＡＯＤ）５１とガルバノ
式偏向用ミラー５５を用いているが、偏向素子としてＡ
ＯＤ、ガルバノ式偏向ミラー、ポリゴンミラー、レゾナ
ント式偏向ミラー、ホログラム式スキャナー等を用いて
二次元走査する形式のレーザ顕微鏡もある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記従来のレーザ走査
顕微鏡のレーザ照射装置では、特に光偏向素子としてＡ
ＯＤ５１を用いる場合、ＡＯＤ５１の特性としてレーザ
ビームの回折効率が偏向角によって変化するため、スラ
イドグラス上の試料６０に照射されるレーザ強度が走査
位置により変化するという問題がある。

【０００５】図４は従来例でのスライドグラス上のレー
ザスポット強度を示す図である。図４において、Ｚ軸は
レーザスポットの光強度、Ｘ軸はＡＯＤによる走査方向
位置、Ｙ軸はガルバノ式偏向ミラーによる走査方向位置
を示す。図４から分かるように、Ｘ軸上の位置ａに比べ
て位置ｂのレーザスポット強度が強いため、Ｘ＝ｂ軸の
近くにある細胞からの蛍光強度は、Ｘ＝ａ軸の近くの細
胞より強くなり、細胞の発する蛍光量を正確に測定する
ことができないという問題点がある。

【０００６】従って、本発明は、上記問題点に鑑みなさ
れたもので、レーザ走査顕微鏡において試料に照射する
レーザ光の光量を試料面上の走査範囲内の全ての位置で
一様とするレーザ照射装置を提供することを目的とす
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明のレーザ走査顕微鏡のレーザ照射装置は、光
源であるレーザ発振器と、このレーザ発振器からのレー
ザを走査するレーザビーム偏向部と、走査レーザビーム
を試料に集光照射する対物レンズとを備えたレーザ走査
顕微鏡のレーザ照射装置において、前記対物レンズに入
射するレーザビームの一部を取り出す光分割手段と、こ
の光分割手段によって取り出されたレーザビームの強度
をモニタするための光検出手段と、この光検出手段によ
るモニタ結果に基づいて前記対物レンズに入射するレー
ザビームの強度を調整するレーザ光量調整手段とを備え
ることを特徴とする。

【０００８】

【作用】このレーザ照射装置によると、対物レンズに入
射するレーザビームの一部が光分割手段により取り出さ
れ、この取り出されたレーザビームの強度を光検出手段
でモニタし、モニタ出力が一定となるようにレーザ光量
調整手段によって、光検出手段に入射するレーザビーム
の強度、即ち対物レンズに入射するレーザビームの強度
を調整することにより、試料面上のレーザ走査範囲内の
全ての位置でのレーザ強度が一定となる。このため、測
定精度が高くなり、正確な画像が得られる。

【０００９】

【実施例】以下、本発明のレーザ照射装置を実施例に基
づいて説明する。図１に、本発明の装置の原理図を示
す。図１において、レーザ発振器１からのレーザビーム
１５は、光量調整器２に入射し、その後にレーザビーム
偏向部３により結像面Ｌで二次元走査されるように偏向
される。更に、レーザビーム１５は、ビームスプリッタ
（光分割手段）４で分割され、ビームスプリッタ４を透
過したレーザビームは、対物レンズ６の瞳５に入射し、
対物レンズ６でスライドグラス７上の試料８上に集光走
査される。

【００１０】一方、ビームスプリッタ４で反射したレー
ザビームは、開口９を経て、光検出手段１０で電気信号
に変換される。光検出手段１０の出力信号は制御部１１
に入力され、光検出手段１０に入射する光量がレーザビ
ームの偏向走査中も一定となるように、制御部１１によ
り光量調整器２のレーザビームの透過率が調整される。
但し、ここでは、光量調整器２と制御部１１でレーザ光
量調整手段が構成される。

【００１１】ここで、開口９は、対物レンズ６の瞳５と
等価な位置、即ち対物レンズ６の瞳５に入射するレーザ
ビームの瞳５の面上の強度分布が、開口９の面上の強度
分布と絶対強度を除いて同じ形状となる位置に配置され
ているため、試料８上を照射するレーザスポットの強度
も走査中一定となる。上記構成で、光源であるレーザ発
振器１としては、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、Ａｒレーザ等のガ
スレーザ、Ｎｅ−ＹＡＧレーザのような固体レーザ、或
いは色素レーザ、レーザダイオード等を適用できる。光
源として半導体レーザを用いた場合は、直接変調が可能
となり、専用の光量調整器２が不要となるので、装置の
構成が簡略となる。光量調整器２としては、音響光度調
素子（ＡＯＭ）、電気光学変調素子（ＥＯＭ）、液晶を
利用した光変調素子等を適用できる。レーザビーム偏向
部３としては、ＡＯＤ、ポリゴンミラー、ガルバノ式ミ
ラー、ホログラフィック素子、レゾナント式ミラー等を
適用できる。

【００１２】又、ビームスプリッタ４、即ち光分割手段
としては、プレートビームスプリッタ、キュービックプ
リズム式ビームスプリッタ、ペリクル等を適用できる。
光検出手段１０としては、シリコンフォトダイオード、
アバランチフォトダイオード等の半導体光検出素子が安
価で望ましい。更に、図１においては、開口９の大きさ
は特に限定していないが、対物レンズ６の瞳５に入射す
るレーザビームの径が瞳５の大きさより大きい場合は、
開口９の大きさは対物レンズ６の瞳５の大きさと等価で
あることが望ましい。又、開口９と光検出手段１０の検
出面とは、密着又はできるだけ接近していることが望ま
しい。

【００１３】次に、図２を参照してより具体的な実施例
を説明する。但し、この実施例では、試料として蛍光染
色した細胞を用いる。図２において、レーザ発振器（こ
の実施例では空冷Ａｒレーザ）２０からのレーザビーム
４７は、光量調整器としての音響光度調素子２２を経
て、ビームエキスパンダー２３に入射し、ビーム径が適
正な寸法に拡大される。更に、レーザビーム４７は、シ
リンドリカルレンズ２４、音響光偏向素子２５、補正シ
リンドリカルレンズ２６、シリンドリカルレンズ２７、
及び球面レンズ２８より構成される一次元偏向光学系に
より、図２の矢印ｍ方向に集光且つ一次元走査される。
続いて、レーザビーム４７は、波長選択ミラー２９、リ
レーレンズ３０を透過し、ガルバノ式偏向用ミラー３１
に入射する。

【００１４】偏向用ミラー３１はガルバノメータ３２に
連結されており、ガルバノメータ３２の駆動により矢印
ｐの方向に回転可能である。偏向用ミラー３１で偏向走
査されたレーザビームは、リレーレンズ３３で結像面Ｌ
上に結像された後、ビームスプリッタ（この実施例では
プリズムビームスプリッタ）３４に入射する。この実施
例では、ビームスプリッタ３４は、これに入射するレー
ザビームの８０％を透過するものである。ビームスプリ
ッタ３４を透過したレーザビームの成分は、対物レンズ
３６の瞳３５に入射し、対物レンズ３６でスライドグラ
ス３７上の試料３８上に集光走査される。

【００１５】一方、ビームスプリッタ３４で反射された
レーザビームは、開口３９を経て、光減衰用フィルタ４
０で光量が減衰された後、光検出手段（この実施例では
シリコンフォトダイオード）４１に入射し、電気信号に
変換される。シリコンフォトダイオード４１の出力電気
信号は制御部４２に入力される。この制御部４２によ
り、音響光度調素子２２のレーザビーム透過率が調節さ
れ、シリコンフォトダイオード４１に入射する光量、即
ち試料３８上に集光されるレーザスポットの強度が走査
中一定となるように制御される。この実施例では、レー
ザスポットは試料３８を二次元走査している。

【００１６】試料３８の発する蛍光は対物レンズ３６で
集光され、ビームスプリッタ３４を透過した成分は、結
像面Ｌで結像した後、偏向用ミラー３１で反射され、波
長選択ミラー２９で蛍光成分が選択透過され、透過され
た蛍光成分が蛍光検出器４３で電気信号に変換される。
この実施例では、蛍光成分は蛍光検出器４３上を図２の
矢印ｎ方向に一次元走査される。

【００１７】蛍光検出器４３からの出力電気信号は、デ
ータ処理装置（図示せず）のメモリにレーザスポットの
走査位置に対応して記憶され、データ処理後にＣＲＴ等
に蛍光画像として表示される。図２に示す構成におい
て、対物レンズ３６の瞳３５とガルバノ式偏向用ミラー
３１は、リレーレンズ３３について互いに共役な位置に
あり、また偏向用ミラー３１と音響光偏向素子２５も、
コリメートレンズ２８，３０について互いに共役な位置
にある。従って、音響光偏向素子２５、ガルバノ式偏向
用ミラー３１、対物レンズ３６の瞳３５を通るレーザビ
ームの位置は、レーザビームを走査しても不動である。

【００１８】又、この実施例では、対物レンズ３６で集
光した蛍光のうち、ビームスプリッタ３４で反射した成
分は、試料３８から反射したレーザビームをカットする
フィルタ４４を透過し、接眼レンズ４５に入射して、肉
眼で蛍光像を観察するのに供されている。勿論、蛍光像
は肉眼ではなく、ＴＶカメラ等で観察してもよいし、ビ
ームスプリッタ３４は波長選択性を有していても差し支
えない。

【００１９】なお、上記実施例では、蛍光信号は蛍光検
出器４３上を一次元走査されるが、蛍光検出器４３の検
出面上に、一次元走査する蛍光信号のみを通過させるス
リットを設置して、一次元共焦点レーザ顕微鏡の構成と
する場合は、より高分解能の蛍光画像を得ることができ
る。

【００２０】

【発明の効果】本発明のレーザ照射装置は、以上説明し
たように光分割手段、光検出手段及びレーザ光量調整手
段を備えるため、下記の効果を有する。 （１）試料に照射するレーザスポット強度が走査位置に
よらず一定となるため、蛍光染色した試料を観測する場
合、試料本来の強度分布の蛍光画像を得ることができ
る。 （２）試料の観察面上を等しいレーザスポット強度で走
査するため、試料の蛍光画像は試料本来の蛍光強度を正
確に反映している。従って、レーザ照射の不均一さを補
正するための標準サンプルの測定と蛍光画像取得後の補
正が不要になり、最終画像を得るまでの時間が短縮され
る。 （３）特に細胞の蛍光像から個々の細胞に含まれるＤＮ
Ａ量を求める等の試料の蛍光量を測定する場合は、精度
の高い測定結果を得ることができる。 （４）蛍光色素がレーザ励起強度に依存して退色した
り、蛍光強度がレーザ励起に対し飽和を示したりする場
合でも、レーザ照射強度が走査範囲内で一定であるの
で、試料の蛍光物質の分布を正確に反映した画像を得る
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のレーザ照射装置の原理を説明するため
の図である。

【図２】一実施例に係るレーザ照射装置の構成図であ
る。

【図３】従来例に係るレーザ照射装置の構成図である。

【図４】従来のレーザ照射装置における試料上の走査レ
ーザスポットの強度分布を示す図である。

【符号の説明】

１ レーザ発振器 ２ 光量調整器 ３ レーザビーム偏向部 ４ ビームスプリッタ（光分割手段） ５ 対物レンズの瞳 ６ 対物レンズ ８ 試料 ９ 開口 １０ 光検出手段 １１ 制御部

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】光源であるレーザ発振器と、このレーザ発
   振器からのレーザを走査するレーザビーム偏向部と、走
   査レーザビームを試料に集光照射する対物レンズとを備
   えたレーザ走査顕微鏡のレーザ照射装置において、 前記対物レンズに入射するレーザビームの一部を取り出
   す光分割手段と、この光分割手段によって取り出された
   レーザビームの強度をモニタするための光検出手段と、
   この光検出手段によるモニタ結果に基づいて前記対物レ
   ンズに入射するレーザビームの強度を調整するレーザ光
   量調整手段とを備えることを特徴とするレーザ走査顕微
   鏡のレーザ照射装置。
2. 【請求項２】前記光分割手段は、前記レーザビーム偏向
   部と対物レンズの瞳との間に配置されていることを特徴
   とする請求項１記載のレーザ走査顕微鏡のレーザ照射装
   置。
3. 【請求項３】前記対物レンズの瞳と等価な位置に開口を
   備え、この開口は前記光分割手段と光検出手段との間に
   配置されていることを特徴とする請求項１又は請求項２
   記載のレーザ走査顕微鏡のレーザ照射装置。