JPH0713083A - Scanning type optical microscope - Google Patents
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- JPH0713083A JPH0713083A JP5177595A JP17759593A JPH0713083A JP H0713083 A JPH0713083 A JP H0713083A JP 5177595 A JP5177595 A JP 5177595A JP 17759593 A JP17759593 A JP 17759593A JP H0713083 A JPH0713083 A JP H0713083A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、走査型光学顕微鏡に関
するものである。更に詳しくは走査落射蛍光像と同一試
料・同一部位の透過像を同時に観察することができる走
査型光学顕微鏡に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a scanning optical microscope. More specifically, the present invention relates to a scanning optical microscope capable of simultaneously observing a scanning epifluorescence image and a transmission image of the same sample / same site.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来、走査落射蛍光像と同一試料・同一
部位の光学像を同時に観察することができる走査型光学
顕微鏡は次のような構成であった。2. Description of the Related Art Conventionally, a scanning optical microscope capable of simultaneously observing a scanning epifluorescence image and an optical image of the same sample and the same portion has the following constitution.
【０００３】図６において、光源１から射出されたレー
ザ光はダイクロイックミラー２で反射し、対物レンズ３
に集光されて、試料４を光偏向器５による光束の振れに
より走査していた。そして励起され試料４から発した蛍
光６は逆進した後、固定ミラー１３で反射しダイクロイ
ックミラー２を透過し、集光レンズ７により集光され蛍
光像が得られていた。そして蛍光像は光検出器８で光電
変換され、画像ディスプレー９に蛍光像として写し出さ
れていた。In FIG. 6, the laser light emitted from the light source 1 is reflected by the dichroic mirror 2 and the objective lens 3
Then, the sample 4 was scanned by the deflection of the light beam by the optical deflector 5. Then, the fluorescence 6 emitted from the sample 4 after being excited travels backward, is reflected by the fixed mirror 13, is transmitted through the dichroic mirror 2, and is condensed by the condenser lens 7 to obtain a fluorescence image. The fluorescent image was photoelectrically converted by the photodetector 8 and displayed on the image display 9 as a fluorescent image.
【０００４】又試料４で強度変調され透過したレーザ光
は集光レンズ１０により集光されて、光検出器１１に入
力し光電変換され、電気回路１２で電気処理されてから
画像ディスプレー９に走査式の透過像として写し出され
ていた。このように画像ディスプレー９には、蛍光像と
走査式の透過像とを同一試料・同一部位につき同時に重
ねて、又は個別に観察することができた。The laser light intensity-modulated and transmitted by the sample 4 is condensed by the condenser lens 10, inputted to the photodetector 11, photoelectrically converted, electrically processed by the electric circuit 12, and then scanned on the image display 9. It was projected as a transmission image of the ceremony. As described above, on the image display 9, it was possible to observe the fluorescence image and the scanning transmission image on the same sample and the same region at the same time or individually.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述の
従来技術には下記のような問題があった。走査型光学顕
微鏡は普通顕微鏡として使用するときのために、一般に
透過照明像観察用に通常のハロゲンランプ光等の光源を
含む照明光学系１４ａと接眼レンズ又はＴＶカメラ等を
含む観察光学系１４ｂとが付設されている。この光源に
よる観察からレーザ光励起による蛍光観察に移行する
時、又は逆に移行する時、集光レンズ１０及び光検出器
１１と、照明１４ａとの交換ならびに全反射式の固定ミ
ラー１３を光路から取り外すという煩瑣な作業が必要で
あった。又、従来技術においては透過像観察のためにレ
ーザ光の照射を行っていた。即ち、レーザ走査型透過像
観察によるレーザ光の照射による試料の劣化や蛍光色素
の褪色等を免れることができず、特に生細胞等の観察で
は、蛍光像を撮る時にのみレーザ光を照射し、透過像観
察の際にはレーザ光の照射を極力避けたいという要望が
大きかった。更に、普通顕微鏡が具備する通常の照明光
学系及び観察光学系の他に、レーザ光による透過像観察
のために専用の集光レンズ１０、光検出器１１及び電気
回路１２が必要であり、装置全体の価格上昇を招いてい
た。However, the above-mentioned conventional technique has the following problems. The scanning optical microscope generally includes an illumination optical system 14a including a light source such as a halogen lamp light for observation of a transmitted illumination image and an observation optical system 14b including an eyepiece lens or a TV camera for use as an ordinary microscope. Is attached. When the observation by this light source shifts to the fluorescence observation by laser light excitation, or vice versa, the condenser lens 10 and the photodetector 11 are replaced with the illumination 14a, and the total reflection type fixed mirror 13 is removed from the optical path. It was necessary to do the complicated work. Further, in the prior art, laser light irradiation was performed for observing a transmitted image. That is, the deterioration of the sample due to the irradiation of the laser beam by laser scanning transmission image observation and the fading of the fluorescent dye cannot be escaped, especially in the observation of live cells, the laser beam is irradiated only when the fluorescent image is taken, There was a great demand for avoiding irradiation of laser light as much as possible when observing a transmission image. Furthermore, in addition to the usual illumination optical system and observation optical system that the ordinary microscope has, a dedicated condensing lens 10, a photodetector 11 and an electric circuit 12 are required for observation of a transmitted image by laser light. It has led to an increase in overall prices.
【０００６】本発明は上記の課題に鑑み、蛍光像観察と
光学像観察とが同時に行え、あるいは選択的に容易に切
換えられ、試料の劣化と蛍光色素の褪色が必要最小限に
抑制され、且つ低廉な走査型光学顕微鏡を提供すること
を目的とする。In view of the above problems, the present invention allows simultaneous observation of fluorescent image and optical image, or can be selectively and easily switched to suppress deterioration of a sample and discoloration of a fluorescent dye to a necessary minimum. An object is to provide an inexpensive scanning optical microscope.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明は、 励起光を射
出する励起用光源と、前記励起光とこの励起光の照射を
受けた試料より発光する蛍光とのいづれか一方を反射
し、他方を透過する第１ダイクロイックミラーと、前記
光源と前記試料との間に配置され、前記励起光を二次元
的に走査する光偏向器と、前記励起光を前記試料に収束
し、かつ、前記試料からの前記蛍光を集光する対物レン
ズと、前記対物レンズにより集光された前記蛍光を収束
する集光レンズと、前記集光レンズにより収束された前
記蛍光を検出する第１光検出器と、前記第１光検出器か
らの電気信号を受けて処理する第１電気回路と、前記第
１電気回路からの出力を受けて画像処理する第１画像処
理装置と、前記第１画像処理装置により画像処理された
画像を表示する第１画像ディスプレーとを有する走査型
蛍光像観察装置を具備する走査型光学顕微鏡において、
照明光を射出する照明用光源と、前記試料を介した前記
照明光を結像する結像レンズと、前記結像レンズにより
結像した前記照明光を検出する第２光検出器と、前記第
２光検出器からの電気信号を受けて処理する第２電気回
路と、前記第２電気回路からの出力を受けて画像処理す
る第２画像処理装置と、前記第２画像処理装置により画
像処理された画像を表示する第２画像ディスプレーとを
有する光学像観察装置と、前記対物レンズと前記光偏向
器との間に配置され、かつ前記励起光及び前記蛍光と前
記照明光とのいづれか一方を反射し他方を透過して、前
記走査型蛍光像観察装置の光軸の一部と前記光学像観察
装置の観察光軸との一部とを同軸に結合する第２ダイク
ロイックミラーとを具備するものである。According to the present invention, one of an excitation light source for emitting excitation light and the excitation light and fluorescence emitted from a sample irradiated with the excitation light is reflected, and the other is reflected. A first dichroic mirror that transmits light, an optical deflector that is disposed between the light source and the sample, and that two-dimensionally scans the excitation light, and the excitation light is converged on the sample, and An objective lens for condensing the fluorescence, a condensing lens for converging the fluorescence condensed by the objective lens, a first photodetector for detecting the fluorescence converging by the condensing lens, A first electric circuit that receives and processes an electric signal from a first photodetector, a first image processing device that receives an output from the first electric circuit and performs image processing, and an image processing by the first image processing device Screen that displays the displayed image In a scanning optical microscope equipped with a scanning fluorescent image observation device having an image display,
An illumination light source that emits illumination light, an imaging lens that images the illumination light through the sample, a second photodetector that detects the illumination light imaged by the imaging lens, and 2 a second electric circuit for receiving and processing an electric signal from a photodetector, a second image processing device for receiving an output from the second electric circuit and performing image processing, and an image processed by the second image processing device An optical image observation device having a second image display for displaying an image, and is disposed between the objective lens and the light deflector, and reflects one of the excitation light, the fluorescence, and the illumination light. And a second dichroic mirror that transmits the other and coaxially connects a part of the optical axis of the scanning fluorescent image observation device and a part of the observation optical axis of the optical image observation device. is there.
【０００８】前記光学像観察装置は、前記試料に対して
前記対物レンズと対向する側に配置され、前記照明用光
源からの照明光を集光し前記試料を照明するコンデンサ
レンズを有し、前記結像レンズは、前記対物レンズを介
し、かつ、前記第２ダイクロイックミラーを透過して、
前記試料を透過した照明光が入射するように配置されて
いることが望ましい。そして第１の画像処理装置と第２
の画像処理装置、ならびに第１の画像ディスプレーと第
２の画像ディスプレーがそれぞれ同一であることが好ま
しい。The optical image observation apparatus has a condenser lens which is arranged on the side of the sample facing the objective lens and which collects illumination light from the illumination light source to illuminate the sample. The imaging lens passes through the objective lens and also passes through the second dichroic mirror,
It is desirable that the illumination light transmitted through the sample is arranged to enter. The first image processing device and the second
It is preferable that the image processing device, and the first image display and the second image display are the same.
【０００９】[0009]
【作用】本発明で、蛍光像を観察するときは、励起光が
試料を走査し、励起された蛍光は集光レンズにより集光
され、第１の光検出器に入射する。そして蛍光像として
画像ディスプレーに写し出される。光学像を観察すると
きは、照明光は光源から射出し、試料をケーラー照明す
る。試料により位相変調された照明光は、結像レンズを
介して第２の光検出器に入射し、画像ディスプレーに光
学像が写し出される。同一試料・同一部位の蛍光像と光
学像とが同時に写し出され、同時に観察することができ
る。In the present invention, when observing a fluorescence image, the excitation light scans the sample, the excited fluorescence is condensed by the condenser lens and is incident on the first photodetector. Then, it is displayed on the image display as a fluorescent image. When observing an optical image, the illumination light is emitted from the light source to illuminate the sample with Koehler. The illumination light that has been phase-modulated by the sample enters the second photodetector through the imaging lens, and an optical image is projected on the image display. A fluorescence image and an optical image of the same sample / same part are simultaneously displayed, and can be observed at the same time.
【００１０】[0010]
【実施例】本発明の第１の実施例を図１乃至図３により
説明する。図１は第１の実施例の主として光学的構成を
示す構成図である。図１において、光源１は励起用の短
波長のレーザビーム１５を射出するレーザである。レー
ザビーム１５の光路には、ビーム径を必要な大きさに拡
大するビームエキスパンダ１６が配置されている。ビー
ムエキスパンダ１６により拡大された光束１７の光路に
は、光軸に対し４５°傾斜して配置されたダイクロイッ
クミラー２、光束１７を二次元に偏向して試料を走査す
る光偏向器５、リレーレンズ１８、光軸に対し４５°傾
斜して配置されたダイクロイックミラー１９、対物レン
ズ３が順次配置されている。対物レンズ３により集光さ
れた光が、ビームスポットを形成する位置に試料４が載
置されている。DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS A first embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. FIG. 1 is a configuration diagram mainly showing an optical configuration of the first embodiment. In FIG. 1, the light source 1 is a laser that emits a short-wavelength laser beam 15 for excitation. A beam expander 16 that expands the beam diameter to a required size is arranged in the optical path of the laser beam 15. In the optical path of the light beam 17 expanded by the beam expander 16, a dichroic mirror 2 arranged at an angle of 45 ° with respect to the optical axis, an optical deflector 5 that two-dimensionally deflects the light beam 17 and scans a sample, a relay A lens 18, a dichroic mirror 19 arranged at an angle of 45 ° with respect to the optical axis, and an objective lens 3 are sequentially arranged. The sample 4 is placed at a position where the light condensed by the objective lens 3 forms a beam spot.
【００１１】レーザビーム１５に励起され試料４から発
した蛍光６の光路は、レーザビーム１５の光路を一部逆
進するようになる。ダイクロイックミラー１９で反射し
た後、ダイクロイックミラー２を透過した蛍光６の光路
には、蛍光のみを透過するバリアフィルタ２０、バリア
フィルタ２０ａが配置されている。蛍光６の光束を集光
する集光レンズ７の焦点面にはピンホール２１が配置さ
れ、共焦点光学系が形成される。The optical path of the fluorescence 6 emitted from the sample 4 when excited by the laser beam 15 partially reverses the optical path of the laser beam 15. A barrier filter 20 and a barrier filter 20a that transmit only fluorescence are arranged in the optical path of the fluorescence 6 that has passed through the dichroic mirror 2 after being reflected by the dichroic mirror 19. A pinhole 21 is arranged on the focal plane of the condenser lens 7 for condensing the light flux of the fluorescent light 6 to form a confocal optical system.
【００１２】光検出器８は蛍光６を検出し電気信号を出
力する光電変換素子である。電気回路２２は出力した電
気信号をＡ／Ｄ変換等の処理をして画像処理装置２３に
出力し、画像処理装置２３は電気信号を画像処理し、画
像ディスプレー９に蛍光像として写し出す。The photodetector 8 is a photoelectric conversion element that detects the fluorescence 6 and outputs an electric signal. The electric circuit 22 processes the output electric signal such as A / D conversion and outputs it to the image processing device 23. The image processing device 23 image-processes the electric signal and displays it on the image display 9 as a fluorescent image.
【００１３】一方、光源２４は透過照明用の長波長の光
を射出するハロゲンランプである。観測の目的によって
は他のキセノンランプ等が使用される。光源２４から発
した光束２５はバンドパスフィルタ２６により、レーザ
ビーム１５及び蛍光６より長い波長の光２７のみが透過
する。光束２５の光路に配置されているコンデンサレン
ズ２８は試料４をケーラー照明するためのコンデンサレ
ンズである。試料４により強度変調され透過した照明光
は対物レンズ３により集光され、対物レンズ３の後には
照明光が透過するダイクロイックミラー１９が配置され
ている。光路にはバリアフィルタ２９及び投影レンズ３
０が順次配置されている。投影レンズ３０は対物レンズ
と協動して透過像を結像するレンズである。On the other hand, the light source 24 is a halogen lamp for emitting long-wavelength light for transmitted illumination. Other xenon lamps are used depending on the purpose of observation. The light beam 25 emitted from the light source 24 is transmitted by the bandpass filter 26 only by the light beam 27 having a wavelength longer than that of the laser beam 15 and the fluorescent light 6. The condenser lens 28 arranged in the optical path of the light flux 25 is a condenser lens for Koehler illumination of the sample 4. The illumination light intensity-modulated by the sample 4 and transmitted is condensed by the objective lens 3, and a dichroic mirror 19 through which the illumination light is transmitted is arranged after the objective lens 3. The barrier filter 29 and the projection lens 3 are provided in the optical path.
0s are sequentially arranged. The projection lens 30 is a lens that cooperates with the objective lens to form a transmission image.
【００１４】ＴＶカメラ３１は、投影レンズ３０により
結像された試料４の像を撮像し、像に応じた電気信号を
出力する光電変換素子が内蔵されていて、それから出力
した電気信号は画像処理装置２３に内蔵された電気回路
でＡ／Ｄ変換され、入力し画像処理される。画像ディス
プレー９は透過照明像を写し出す。The TV camera 31 has a built-in photoelectric conversion element for picking up an image of the sample 4 formed by the projection lens 30 and outputting an electric signal corresponding to the image. The electric signal output from the photoelectric conversion element is subjected to image processing. A / D conversion is performed by an electric circuit built in the device 23, input, and image processing is performed. The image display 9 displays a transmitted illumination image.
【００１５】ダイクロイックミラー１９は励起光及び蛍
光を透過せず反射し、透過照明光を透過するミラーであ
り、励起光及び蛍光が進行する蛍光観察光学系、ならび
に透過照明光が進行する透過像観察光学系の両者の光軸
に対して、それぞれ４５°傾斜して配置されている。両
光学系はダイクロイックミラー１９により光軸が互いに
同軸になるように結合されている。The dichroic mirror 19 is a mirror that reflects excitation light and fluorescence without transmitting them, and transmits transmitted illumination light. The dichroic mirror 19 is a fluorescence observation optical system in which excitation light and fluorescence travel, and a transmitted image observation in which transmission illumination light travels. They are arranged at an angle of 45 ° with respect to both optical axes of the optical system. Both optical systems are coupled by a dichroic mirror 19 so that their optical axes are coaxial with each other.
【００１６】次に、励起光、蛍光及び透過照明光ならび
にダイクロイックミラー１９の波長関係について説明す
る。図２は励起光、蛍光及び透過照明光の波長スペクト
ル図であり、横軸に波長を、縦軸に光の強度を定性的に
示している。励起光の波長は最も短く、波長幅は狭い。
蛍光の波長は励起光の波長より長い。例えばカルシウム
イオンの測定を行う場合は、波長４７０〜４９０ｎｍの
励起光の照射によりカルシウムイオンは蛍光試薬Ｆｌｕ
ｏ３と結合して波長５２０〜５６０ｎｍの蛍光を発す
る。蛍光はその性質上波長幅は広がっていて、光の強度
は励起光に比較して小さい。又場合により蛍光の波長範
囲は一部励起光と重複することがある。Next, the wavelength relationship between the excitation light, the fluorescent light, the transmitted illumination light, and the dichroic mirror 19 will be described. FIG. 2 is a wavelength spectrum diagram of excitation light, fluorescence, and transmitted illumination light, in which the horizontal axis represents wavelength and the vertical axis qualitatively represents light intensity. The wavelength of the excitation light is the shortest and the wavelength width is narrow.
The wavelength of fluorescence is longer than the wavelength of excitation light. For example, in the case of measuring calcium ions, the calcium ions are converted into fluorescent reagent Flu by irradiation with excitation light having a wavelength of 470 to 490 nm.
When combined with o3, it emits fluorescence having a wavelength of 520 to 560 nm. Due to its nature, fluorescence has a wide wavelength width, and the light intensity is smaller than that of excitation light. In some cases, the fluorescence wavelength range may partially overlap with the excitation light.
【００１７】透過照明光の波長スペクトルは、バンドパ
スフィルタ２６を透過した後のものを示しており、光源
２４とバンドパスフィルタ２６を適正に選択し、励起光
及び蛍光の波長より長い波長となっている。波長幅はバ
ンドパスフィルタ２６の仕様により定まる。波長範囲
は、蛍光の波長範囲を避けて重複しないように且つ、細
胞の劣化や蛍光色素の褪色が最小限に抑制可能な範囲で
選択される。上記した例では、透過照明光は波長５８０
ｎｍ程度以上の橙黄色乃至赤色光又は近赤外線である。The wavelength spectrum of the transmitted illumination light shows that after passing through the bandpass filter 26. The light source 24 and the bandpass filter 26 are properly selected, and the wavelength spectrum becomes longer than the wavelengths of the excitation light and the fluorescence. ing. The wavelength width is determined by the specifications of the bandpass filter 26. The wavelength range is selected so as not to overlap the fluorescence wavelength range and to be able to suppress the deterioration of cells and the fading of the fluorescent dye to the minimum. In the above example, the transmitted illumination light has a wavelength of 580.
It is orange-yellow to red light or near infrared light having a wavelength of about nm or more.
【００１８】図３はダイクロイックミラー１９の特性曲
線を示す図で、横軸に波長を、縦軸に光の透過率を定性
的に示す。実線はダイクロイックミラー１９の特性曲線
をそれぞれに示し、点線は励起光、蛍光及び透過照明光
の波長スペクトルを示している。ダイクロイックミラー
１９は、図３に示すように、励起光及び蛍光を透過せず
反射し、透過照明光を透過する。FIG. 3 is a diagram showing a characteristic curve of the dichroic mirror 19, in which the horizontal axis shows the wavelength and the vertical axis shows the light transmittance qualitatively. The solid lines show the characteristic curves of the dichroic mirror 19, and the dotted lines show the wavelength spectra of the excitation light, fluorescence, and transmitted illumination light. As shown in FIG. 3, the dichroic mirror 19 reflects the excitation light and the fluorescence without transmitting them, and transmits the transmitted illumination light.
【００１９】次に動作について説明する。蛍光像を観察
するときは、光源１を点灯する。光源１から射出された
レーザビーム１５はビームエキスパンダ１６によりビー
ム径が拡大され、ダイクロイックミラー２で反射して光
偏向器５に入射する。光偏向器５に入射した光束は、そ
の射出方向が二次元的に振られ、リレーレンズ１８によ
り一旦収束してから発散してから、ダイクロイックミラ
ーミラー１９を介し対物レンズ３に入射する。対物レン
ズ３により試料４の一点にビームスポットが形成され、
このビームスポットは光偏向器５による光束の振れに従
い試料４を二次元的に走査する。試料４が励起され蛍光
６が発光すると、蛍光６は対物レンズ３により集光さ
れ、励起光の光路を逆進し、ダイクロイックミラー１９
で反射し、光偏向器５で振られ、振られのない光束とな
ってダイクロイックミラー２を透過する。バリアフィル
タ２０及びバリアフィルタ２０ａにより励起光、透過照
明光を除いて、蛍光測定の精度が向上するように蛍光の
純度が高められる。そして集光レンズ１７により集光さ
れ、光検出器８に入射する。光検出器８で光電変換さ
れ、電気信号は電気回路２２を経て、画像処理装置２３
で画像処理が施された後、蛍光像として画像ディスプレ
ー９に写し出される。集光レンズ１７の焦点面にピンホ
ール２１が配置されているので共焦点光学系が形成さ
れ、光学的断層像が得られる。Next, the operation will be described. When observing the fluorescent image, the light source 1 is turned on. The laser beam 15 emitted from the light source 1 has its beam diameter expanded by the beam expander 16, is reflected by the dichroic mirror 2, and enters the optical deflector 5. The emission direction of the light beam that has entered the optical deflector 5 is two-dimensionally changed, and the light beam once converges by the relay lens 18 and then diverges, and then enters the objective lens 3 through the dichroic mirror mirror 19. A beam spot is formed at one point of the sample 4 by the objective lens 3,
This beam spot scans the sample 4 two-dimensionally according to the deflection of the light beam by the optical deflector 5. When the sample 4 is excited and the fluorescence 6 emits light, the fluorescence 6 is condensed by the objective lens 3 and moves backward in the optical path of the excitation light, and the dichroic mirror 19
Is reflected by the light deflector 5 and is deflected by the optical deflector 5 to form a non-fluctuated light beam which is transmitted through the dichroic mirror 2. The barrier filter 20 and the barrier filter 20a enhance the fluorescence purity so as to improve the accuracy of fluorescence measurement except for the excitation light and the transmitted illumination light. Then, it is condensed by the condenser lens 17 and enters the photodetector 8. The photoelectric signal is photoelectrically converted by the photodetector 8, and the electric signal passes through the electric circuit 22 and then the image processing device 23.
After being subjected to the image processing in (1), it is displayed on the image display 9 as a fluorescent image. Since the pinhole 21 is arranged on the focal plane of the condenser lens 17, a confocal optical system is formed and an optical tomographic image is obtained.
【００２０】透過像を観察するときは、光源２４を点灯
する。光源２４から発した光束２５は、バンドパスフィ
ルタ２６をレーザビーム１５及び蛍光６より長い波長の
光２７のみが透過し、コンデンサレンズ２８により試料
４をケーラー照明する。試料により強度変調された照明
光は、ダイクロイックミラー１９、バリアフィルタ２９
を経由し、投影レンズ３０によってＴＶカメラ３１に入
射する。入射した光は電気信号に変換され、画像ディス
プレー９に透過像が写し出される。When observing the transmission image, the light source 24 is turned on. The light beam 25 emitted from the light source 24 passes only the laser beam 15 and the light 27 having a longer wavelength than the fluorescence 6 through the bandpass filter 26, and the condenser lens 28 illuminates the sample 4 by Koehler illumination. The illumination light intensity-modulated by the sample is dichroic mirror 19, barrier filter 29.
And enters the TV camera 31 by the projection lens 30. The incident light is converted into an electric signal, and a transmission image is projected on the image display 9.
【００２１】蛍光像と透過像とは画像処理装置２３に設
けられた切換器（不図示）により、いずれかが選択さ
れ、又は同一試料・同一部位の両者が同時に写し出さ
れ、同時に観察することができる。尚、ＴＶカメラ３１
で得られた透過像は画像ディスプレー９と異なる他の画
像ディスプレー９で観察することもできる。Either one of the fluorescence image and the transmission image is selected by a switching device (not shown) provided in the image processing device 23, or both the same sample and the same portion are simultaneously imaged so that they can be observed at the same time. it can. The TV camera 31
The transmission image obtained in step 1 can also be observed on another image display 9 different from the image display 9.
【００２２】次に第２の実施例につき図４により説明す
る。尚第１の実施例と同一又は類似の点の記述は省略す
る。図４において、光源１からの励起光が試料４を照射
し、試料より発した蛍光がダイクロイックミラー１９で
反射し、ダイクロイックミラー２を透過した後、集光レ
ンズ２７から光検出器８に入射し、蛍光像が画像ディス
プレー９に写し出される。Next, a second embodiment will be described with reference to FIG. The description of the same or similar points as in the first embodiment will be omitted. In FIG. 4, the excitation light from the light source 1 illuminates the sample 4, the fluorescence emitted from the sample is reflected by the dichroic mirror 19, passes through the dichroic mirror 2, and then enters the photodetector 8 from the condenser lens 27. , A fluorescent image is displayed on the image display 9.
【００２３】光源２４から発した光束２５は、レーザビ
ーム１５及び蛍光６より長い波長の光２７のみが透過す
るバンドパスフィルタ２６を透過した後、リング絞り３
２を通り、コンデンサレンズ２８により試料４をケーラ
ー照明する。試料４により位相変調され透過した照明光
はリング絞り３２に対応する位相板を有する対物レンズ
３３により集光され、ダイクロイックミラー１９を透過
する。バリアフィルタ２９を介し投影レンズ３０により
集光され、ＴＶカメラ３１に入射し、透過位相差像が画
像ディスプレー９に写し出される。The light beam 25 emitted from the light source 24 passes through the bandpass filter 26 which transmits only the laser beam 15 and the light 27 having a wavelength longer than that of the fluorescent light 6, and then the ring diaphragm 3
The sample 4 is Koehler-illuminated through the condenser lens 28 through the line 2. The illumination light that has been phase-modulated by the sample 4 and is transmitted is condensed by the objective lens 33 having a phase plate corresponding to the ring diaphragm 32 and transmitted through the dichroic mirror 19. The light is condensed by the projection lens 30 via the barrier filter 29, enters the TV camera 31, and the transmission phase difference image is displayed on the image display 9.
【００２４】リング絞り３２及びリング絞り３２に対応
する位相板を有する対物レンズ３３により干渉コントラ
ストが生じて、明視野観察では見にくい位相物体でも、
位相差像として観察可能となる。この際画像処理装置２
３によって走査落射蛍光像、透過位相差像のいずれかが
選択される。An interference contrast is generated by the objective lens 33 having a ring diaphragm 32 and a phase plate corresponding to the ring diaphragm 32, and even a phase object which is difficult to see in bright field observation,
It can be observed as a phase difference image. At this time, the image processing device 2
Either the scanning epifluorescence image or the transmission phase difference image is selected by 3.
【００２５】次に第３の実施例につき図５により説明す
る。尚第１の実施例と同一又は類似の点の記述は省略す
る。図５において、光源２４から発した光束２５は、レ
ーザビーム１５及び蛍光６より長い波長の光２７のみが
透過するバンドパスフィルタ２６を透過した後、ポララ
イザ３４及びコンデンサレンズ２８を通り、ノルマルス
キープリズム３５を透過した後、試料４をケーラー照明
する。試料４により位相変調され透過した照明光は対物
レンズ３により集光され、ダイクロイックミラー１９を
透過する。バリアフィルタ２９を介し、ノルマルスキー
プリズム３６及びアナライザ３７を経て、投影レンズ３
０により集光され、ＴＶカメラ３１に入射し、透過微分
干渉像が画像ディスプレー９に写し出される。Next, a third embodiment will be described with reference to FIG. The description of the same or similar points as in the first embodiment will be omitted. In FIG. 5, a light beam 25 emitted from a light source 24 passes through a bandpass filter 26 that transmits only a laser beam 15 and a light 27 having a wavelength longer than that of the fluorescent light 6, and then passes through a polarizer 34 and a condenser lens 28 to pass through a normalski prism. After passing through 35, the sample 4 is Koehler illuminated. The illumination light that is phase-modulated by the sample 4 and is transmitted is condensed by the objective lens 3 and transmitted through the dichroic mirror 19. After passing through the barrier filter 29, the normalski prism 36 and the analyzer 37, the projection lens 3
The light is condensed by 0, enters the TV camera 31, and a transmission differential interference contrast image is projected on the image display 9.
【００２６】ポラライザ３４、ノルマルスキープリズム
３５、ノルマルスキープリズム３６及びアナライザ３７
によって干渉コントラストが生じて、明視野観察では見
にくい位相物体でも、微分干渉像として観察可能とな
る。この際画像処理装置２３によって走査落射蛍光像、
透過微分干渉像のいずれかが選択される。A polarizer 34, a normalski prism 35, a normalski prism 36 and an analyzer 37.
As a result, interference contrast occurs, and even a phase object that is difficult to see by bright-field observation can be observed as a differential interference image. At this time, the scanning epifluorescence image by the image processing device 23,
One of transmission differential interference contrast images is selected.
【００２７】以上の実施例によれば、倒立顕微鏡の対物
レンズ３と投影レンズ３０との間にダイクロイックミラ
ー１９を設けることによって、本発明の走査型顕微鏡を
形成することができるため、安価に形成できる。According to the above-described embodiment, the scanning microscope of the present invention can be formed by providing the dichroic mirror 19 between the objective lens 3 and the projection lens 30 of the inverted microscope, so that it can be formed at low cost. it can.
【００２８】又ダイクロイックミラーは、実施例と逆に
励起光をを透過し、蛍光を反射するものや、励起光や蛍
光ををを透過し、照明光の蛍光を除く可視光部分を反射
するものにしてもよい。又ダイクロイックミラーを変更
すれば、励起光源と検出器とを入替えることや、走査型
蛍光観察と光学像観察とを入替えることもできる。更に
実施例では透過像を観察したが、反射像を観察するよう
にしてもよい。The dichroic mirror, contrary to the embodiment, transmits the excitation light and reflects the fluorescence, or transmits the excitation light and the fluorescence and reflects the visible light portion except the fluorescence of the illumination light. You may If the dichroic mirror is changed, the excitation light source and the detector can be exchanged, or the scanning fluorescence observation and the optical image observation can be exchanged. Further, although the transmission image is observed in the embodiment, the reflection image may be observed.
【００２９】尚、いずれの実施例でもＴＶカメラ３１で
得られた光学像は画像ディスプレー９と異なる他の画像
ディスプレーで観察することもできる。In any of the embodiments, the optical image obtained by the TV camera 31 can be observed on another image display different from the image display 9.
【００３０】[0030]
【発明の効果】以上説明したように本発明の走査型光学
顕微鏡では、波長の長い透過光による観察からレーザ光
励起による蛍光観察に移行する時、又は逆に移行する
時、部材の交換又は取外しという煩瑣な作業が不要であ
ると共に照明光観察を蛍光観察と同時に行うこともで
き、又レーザ光の照射による試料の劣化や蛍光色素の褪
色は最小限に抑制され、更にレーザ光による透過像観察
に専用の部材を設けることが不要であり原価の低減がで
きる。As described above, in the scanning optical microscope of the present invention, when the observation by the transmitted light having a long wavelength shifts to the fluorescence observation by the laser light excitation, or vice versa, the member is replaced or removed. No complicated work is required, and illumination light observation can be performed at the same time as fluorescence observation, and deterioration of the sample and discoloration of the fluorescent dye due to laser light irradiation are suppressed to a minimum, and further observation of transmitted images by laser light is possible. It is not necessary to provide a dedicated member and the cost can be reduced.
【図１】本発明の第１の実施例の主として光学的構成を
示す構成図。FIG. 1 is a configuration diagram mainly showing an optical configuration of a first embodiment of the present invention.
【図２】本発明の第１の実施例の励起光、蛍光及び透過
照明光の波長スペクトル図。FIG. 2 is a wavelength spectrum diagram of excitation light, fluorescence, and transmitted illumination light according to the first embodiment of the present invention.
【図３】ダイクロイックミラーの波長−透過率曲線を示
す図。FIG. 3 is a diagram showing a wavelength-transmittance curve of a dichroic mirror.
【図４】本発明の第２の実施例の主として光学的構成を
示す構成図。FIG. 4 is a configuration diagram mainly showing an optical configuration of a second embodiment of the present invention.
【図５】本発明の第３の実施例の主として光学的構成を
示す構成図。FIG. 5 is a configuration diagram mainly showing an optical configuration of a third embodiment of the present invention.
【図６】従来例の主として光学的構成を示す構成図。FIG. 6 is a configuration diagram mainly showing an optical configuration of a conventional example.
１、２４・・・・光源 ２・・・・ダイクロイックミラー ３・・・・対物レンズ ５・・・・光偏向器 ７・・・・集光レンズ ８、１１・・・・光検出器 ９・・・・画像ディスプレー １０・・・・集光レンズ １２、２２・・・・電気回路 １３・・・・固定ミラー １９・・・・ダイクロイックミラー ２０、２０ａ・・・・バリアフィルタ ２３・・・・画像処理装置 ２６・・・・バンドパスフィルタ ２８・・・・コンデンサレンズ ２９・・・・バリアフィルタ ３０・・・・投影レンズ ３１・・・・ＴＶカメラ 1, 24 ... Light source 2 ... Dichroic mirror 3 ... Objective lens 5 ... Optical deflector 7 ... Condensing lens 8, 11 ... Photodetector 9 ...・ ・ ・ Image display 10 ・ ・ ・ Condenser lens 12, 22 ・ ・ ・ Electric circuit 13 ・ ・ ・ ・ Fixed mirror 19 ・ ・ ・ ・ Dichroic mirror 20, 20a ・ ・ ・ Barrier filter 23 ・ ・ ・Image processing device 26 ... Bandpass filter 28 ... Condenser lens 29 ... Barrier filter 30 ... Projection lens 31 ... TV camera
Claims (3)
光とこの励起光の照射を受けた試料より発光する蛍光と
のいづれか一方を反射し、他方を透過する第１ダイクロ
イックミラーと、前記光源と前記試料との間に配置さ
れ、前記励起光を二次元的に走査する光偏向器と、前記
励起光を前記試料に収束し、かつ、前記試料からの前記
蛍光を集光する対物レンズと、前記対物レンズにより集
光された前記蛍光を収束する集光レンズと、前記集光レ
ンズにより収束された前記蛍光を検出する第１光検出器
と、前記第１光検出器からの電気信号を受けて処理する
第１電気回路と、前記第１電気回路からの出力を受けて
画像処理する第１画像処理装置と、前記第１画像処理装
置により画像処理された画像を表示する第１画像ディス
プレーとを有する走査型蛍光像観察装置を具備する走査
型光学顕微鏡において、照明光を射出する照明用光源
と、前記試料を介した前記照明光を結像する結像レンズ
と、前記結像レンズにより結像した前記照明光を検出す
る第２光検出器と、前記第２光検出器からの電気信号を
受けて処理する第２電気回路と、前記第２電気回路から
の出力を受けて画像処理する第２画像処理装置と、前記
第２画像処理装置により画像処理された画像を表示する
第２画像ディスプレーとを有する光学像観察装置と、前
記対物レンズと前記光偏向器との間に配置され、かつ前
記励起光及び前記蛍光と前記照明光とのいづれか一方を
反射し他方を透過して、前記走査型蛍光像観察装置の光
軸の一部と前記光学像観察装置の観察光軸との一部とを
同軸に結合する第２ダイクロイックミラーとを具備する
ことを特徴とする走査型光学顕微鏡。1. An excitation light source that emits excitation light, and a first dichroic mirror that reflects one of the excitation light and fluorescence emitted from a sample irradiated with this excitation light and transmits the other. An optical deflector which is arranged between the light source and the sample and which two-dimensionally scans the excitation light, and an objective which converges the excitation light on the sample and collects the fluorescence from the sample. A lens, a condensing lens that converges the fluorescence collected by the objective lens, a first photodetector that detects the fluorescence collected by the condensing lens, and an electricity from the first photodetector. A first electric circuit that receives and processes a signal, a first image processing apparatus that receives an output from the first electric circuit and performs image processing, and a first image that displays an image that has been image processed by the first image processing apparatus Running with image display In a scanning optical microscope including a fluorescent image observation device, an illumination light source that emits illumination light, an imaging lens that images the illumination light through the sample, and an image formed by the imaging lens. A second photodetector that detects illumination light, a second electric circuit that receives and processes an electric signal from the second photodetector, and a second image that receives an output from the second electric circuit and performs image processing An optical image observation device having a processing device and a second image display for displaying an image processed by the second image processing device; and an optical image observation device disposed between the objective lens and the optical deflector, and the excitation. Either one of the light and the fluorescence and the illumination light is reflected and the other is transmitted, and a part of the optical axis of the scanning fluorescent image observation device and a part of the observation optical axis of the optical image observation device are provided. Second dichroic mirror that is coaxially coupled Scanning optical microscope, characterized by comprising and.
前記対物レンズと対向する側に配置され、前記照明用光
源からの照明光を集光し前記試料を照明するコンデンサ
レンズを有し、前記結像レンズは、前記対物レンズを介
し、かつ、前記第２ダイクロイックミラーを透過して、
前記試料を透過した照明光が入射するように配置されて
いることを特徴とする請求項１に記載の走査型光学顕微
鏡。2. The optical image observing device includes a condenser lens which is arranged on a side of the sample facing the objective lens and collects illumination light from the illumination light source to illuminate the sample. , The imaging lens, through the objective lens, and through the second dichroic mirror,
The scanning optical microscope according to claim 1, wherein the scanning optical microscope is arranged so that the illumination light transmitted through the sample is incident.
装置、ならびに前記第１画像ディスプレーと前記第２画
像ディスプレーがそれぞれ同一であることを特徴とする
請求項１に記載の走査型光学顕微鏡。3. The scanning optical system according to claim 1, wherein the first image processing device and the second image processing device, and the first image display and the second image display are the same. microscope.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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1993
- 1993-06-25 JP JP17759593A patent/JP3326881B2/en not_active Expired - Fee Related
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