JPH07116057B2 - Immune enhancer and enhancing antigen - Google Patents
Immune enhancer and enhancing antigenInfo
- Publication number
- JPH07116057B2 JPH07116057B2 JP63114441A JP11444188A JPH07116057B2 JP H07116057 B2 JPH07116057 B2 JP H07116057B2 JP 63114441 A JP63114441 A JP 63114441A JP 11444188 A JP11444188 A JP 11444188A JP H07116057 B2 JPH07116057 B2 JP H07116057B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- antibody
- present
- cells
- immunization
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗原の免疫原性を強化し、生体内での人為的
に行われる免疫反応を活性化させる免疫増強剤に関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an immunopotentiator that enhances the immunogenicity of an antigen and activates an artificial immune reaction in vivo.
また本発明は、免疫原性を調製したワクチンとして用い
たり、モノクローナル抗体及び各種の抗体等を製造する
際に用いる強化抗原に関する。The present invention also relates to an enhanced antigen that is used as a vaccine having adjusted immunogenicity, or used for producing monoclonal antibodies and various antibodies.
更に本発明は、その強化抗原を使用して、予防接種や抗
体の製造を目的として動物を免疫する方法に関する。Further, the present invention relates to a method of immunizing an animal using the enhanced antigen for the purpose of vaccination and production of antibody.
モノクローナル抗体は、蛋白質を中心とする様々な生体
物質の検出・単離・同定・精製といった目的に学術研
究、商業目的を問わず、繋用されている。このモノクロ
ーナル抗体の作成は、現在次のように行われている。Monoclonal antibodies have been used for the purpose of detecting, isolating, identifying, and purifying various biological substances such as proteins, regardless of academic research or commercial purposes. The production of this monoclonal antibody is currently carried out as follows.
まず実験動物（通常はマウス又はラット）を目的の抗原
物質で免疫し動物の体内で抗体を作らせた後、動物体内
から抗体産生細胞を取り出して、ミエローマと呼ばれる
癌細胞と融合させる。こうして得られたハイブリドーマ
細胞は、癌細胞同様に半永久的に増殖しつつ目的の抗体
を細胞培養液中に分泌する。First, an experimental animal (usually a mouse or a rat) is immunized with a target antigenic substance to make an antibody in the animal body, and then antibody-producing cells are taken out from the animal body and fused with a cancer cell called myeloma. The hybridoma cells thus obtained secrete the antibody of interest into the cell culture medium while proliferating semipermanently like cancer cells.
このモノクローナル抗体製造に際して抗原物質の免疫原
性を高め、免疫反応を活性化して目的とするモノクロー
ナル抗体産生細胞を良好な収率で得るために、従来抗原
をアジュバントと混合し、動物体内に注射して免疫反応
を高める方法が取られていた。このアジュバントを用い
ることにより注射された局所において全般的な免疫反応
の上昇がもたらされ、免疫担当細胞の凝集が促進される
という効果が得られた。また抗原とアジュバントのエマ
ルジョンを形成させることにより、抗原が長期間にわた
って分解されずに注射部位に存在することができた。In order to enhance the immunogenicity of the antigenic substance during the production of this monoclonal antibody and activate the immune reaction to obtain the desired monoclonal antibody-producing cells in a good yield, the conventional antigen was mixed with an adjuvant and injected into the animal body. The method of increasing the immune response was taken. The use of this adjuvant has the effect of increasing the overall immune response in the injected local area and promoting the aggregation of immunocompetent cells. In addition, by forming an emulsion of the antigen and the adjuvant, the antigen could be present at the injection site without being decomposed for a long period of time.
また、この他抗原の免疫原性を増強させる方法として、
ハプテンをキャリアー蛋白質と結合させたり、特定のペ
プチドに対する抗体を作るためにペプチドを蛋白質に結
合させたりする方法が知られていた。In addition, as a method of enhancing the immunogenicity of other antigens,
Methods have been known in which a hapten is linked to a carrier protein, or a peptide is linked to a protein to make an antibody against a specific peptide.
しかしアジュバントを用いる場合、比較的大量の抗原と
混合してエマルジョンにしてから使用せねばならなかっ
たので、必要な抗原が微量しか得られていない場合には
動物体内で免疫が成立せず、目的とする抗原産生細胞も
得られなかった。例えばフロイントのコンプリートアジ
ュバントを用いてマウスを免疫する場合には100μｇ程
度の精製抗原が必要である。このため生体微量成分のモ
ノクローナル抗体を得ることは極めて困難であった。However, when an adjuvant was used, it had to be mixed with a relatively large amount of antigen to form an emulsion and then used, so if only a small amount of the required antigen was obtained, immunity could not be established in the animal body, and No antigen-producing cells were obtained. For example, when immunizing a mouse with Freund's complete adjuvant, about 100 μg of purified antigen is required. For this reason, it has been extremely difficult to obtain a monoclonal antibody which is a trace component of a living body.
また現在使用されているアジュバントの多くはそれ自身
抗原となるようなバクテリアの菌体成分を含むため、目
的としていない非特異的抗体ができることが多く、目的
とする抗体産生細胞が得られる割合も低かった。活性炭
やアルミナ等のアジュバントが20年程前まで使用されて
おり、それらは抗原を吸着するものであるが、抗原に対
する吸着能が低く、また細胞毒性が強いので免疫系の細
胞を殺してしまうことがあり現在では使用されていな
い。In addition, since most of the adjuvants currently used contain bacterial cell components that themselves serve as antigens, unspecific non-specific antibodies are often produced, and the ratio of the desired antibody-producing cells is low. It was Adjuvants such as activated carbon and alumina have been used until about 20 years ago, and they adsorb antigens, but they have low ability to adsorb antigens and strong cytotoxicity, so they kill the cells of the immune system. There is no longer used.
また蛋白質を担体として用いる場合、抗原と蛋白質を結
合させる工程が煩雑であり、抗原が生体内で消失する速
度が速く、さらに非特異的抗体の産生を誘導する場合が
多かった。In addition, when a protein is used as a carrier, the step of binding the antigen to the protein is complicated, the rate of disappearance of the antigen in vivo is high, and the production of nonspecific antibodies is often induced.
そこで本発明の目的は、次のような技術的課題の全てを
満足する免疫増強剤、強化抗原及び免疫法を提供するこ
とにある。Therefore, an object of the present invention is to provide an immunopotentiator, an enhanced antigen, and an immunization method that satisfy all of the following technical problems.
ｉ）極微量の抗原を用いて動物を免疫する技術。i) A technique of immunizing an animal with a very small amount of antigen.
ii）ハプテン等のように免疫原性が低い抗原を用いて免
疫する技術。ii) A technique of immunizing with an antigen having low immunogenicity such as hapten.
iii）非特異的な抗体の合成を誘導せず、目的とする特
異抗体のみの合成を誘導する技術。iii) A technique for inducing the synthesis of only the target specific antibody without inducing the synthesis of non-specific antibody.
iv）簡便な操作によって、抗原を担体に結合せしめる技
術。iv) A technique for binding an antigen to a carrier by a simple operation.
ｖ）担体に結合せしめられた抗原が、生体内で分解消失
することを防ぐ技術。v) A technique for preventing the antigen bound to the carrier from being decomposed and lost in the living body.
本発明は、セルロース質材料の網目状構造体粒子からな
る免疫増強剤に関する。The present invention relates to an immunopotentiator comprising reticulated particles of a cellulosic material.
また本発明は、セルロース質材料がニトロセルロースで
ある上記の免疫増強剤に関する。The present invention also relates to the above-mentioned immunopotentiator, wherein the cellulosic material is nitrocellulose.
また本発明は、上記の免疫増強剤からなる担体と、該担
体に吸着せしめられた抗原とからなる強化抗原に関す
る。The present invention also relates to a reinforced antigen comprising a carrier comprising the above immunopotentiator and an antigen adsorbed on the carrier.
更に本発明は、上記の強化抗原を用いて動物を免疫する
方法に関する。Furthermore, the present invention relates to a method of immunizing an animal with the above-mentioned enriched antigen.
以下、本発明について更に詳細に説明する。Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
ｉ）本発明の原理的説明 一般に分子量の大きな抗原の方が抗原として免疫系に認
識されやすいことが知られている。この点に着目し、本
発明では抗原を、蛋白質抗原吸着能力の大きいニトロセ
ルロース等に吸着させて抗原分子を担体と結合させた後
に動物に注射して免疫を行い、目的の抗原に対する抗体
産生を誘導している。またニトロセルロース等の担体は
生体内には存在しないため免疫担当細胞により異物とし
て認識され、免疫担当細胞の凝集が促進されるので、そ
の表面に吸着されている抗原も異物として認識されやす
くなる。更にセルロース質の材料は細胞毒性が低いの
で、免疫系を阻害することがない。i) Principle of the present invention It is generally known that an antigen having a large molecular weight is more easily recognized as an antigen by the immune system. Focusing on this point, in the present invention, an antigen is adsorbed to nitrocellulose or the like having a large protein antigen adsorbing ability to bind an antigen molecule to a carrier, and then injected into an animal for immunization to produce an antibody against the target antigen. It is inducing. In addition, since carriers such as nitrocellulose do not exist in the living body, they are recognized as foreign substances by the immunocompetent cells, and aggregation of the immunocompetent cells is promoted, so that the antigen adsorbed on the surface thereof is easily recognized as foreign substances. In addition, cellulosic materials have low cytotoxicity and therefore do not interfere with the immune system.
ii）免疫増強剤 本発明者が免疫増強剤として必要であるか又は望ましい
と考えた条件は次の通りである。ii) Immune enhancer The conditions that the present inventor considered necessary or desirable as an immune enhancer are as follows.
抗体産生者に対して異質な材料であること。 Being a foreign material to the antibody producer.
抗原に免疫原性を生ぜしめるか、又は抗原の免疫原
性を高めるのに十分な大きさ、即ち抗原と結合した際の
大きさが分子量10,000以上となるような大きさを有する
材料であること。A material that is large enough to produce immunogenicity to the antigen or enhance the immunogenicity of the antigen, that is, a size such that the size when bound to the antigen is 10,000 or more. .
非特異的な抗体の合成を誘導しない材料であるこ
と。Materials that do not induce the synthesis of nonspecific antibodies.
抗原を吸着する能力が高く、抗原と接触する際、抗
原を変成させない材料であること。A material that has a high ability to adsorb an antigen and does not denature the antigen when it comes into contact with it.
細胞毒性が極めて低いこと。Extremely low cytotoxicity.
本発明においては、上記の条件を満たす免疫増強剤とし
て、セルロース質材料の網目状構造体粒子を用いる。In the present invention, the reticulated structure particles of a cellulosic material are used as the immunopotentiator satisfying the above conditions.
本発明においてセルロース質材料とは、セルロース又は
セルロース誘導体を主成分とする材料をいう。In the present invention, the cellulosic material means a material containing cellulose or a cellulose derivative as a main component.
セルロース誘導体としては、ニトロセルロース、リン酸
セルロース、カルボキシメチルセルロース、ジエチルア
ミノエチルセルロース等を挙げることが出来る。この中
で、ニトロセルロースは、ニトロ基があるため、特に抗
原が蛋白質である場合に抗原を吸着する能力に優れてお
り、好適である。Examples of the cellulose derivative include nitrocellulose, cellulose phosphate, carboxymethyl cellulose, diethylaminoethyl cellulose and the like. Among these, nitrocellulose is preferable because it has a nitro group and therefore has an excellent ability to adsorb the antigen, particularly when the antigen is a protein.
本発明において、網目状構造体とは、繊維が立体的に結
合した綿状の構造体や、繊維が平面的に結合した編状物
を立体的に積層した構造体を含み、各繊維の配向性を問
わない。本発明の免疫増強剤の形状が網目状構造である
理由は、それによって溶液中の抗原に対する物理的な吸
引力が増加し、またセルロース質材料と抗原との接触す
る表面積が極めて増加するとともに、網目状構造体内部
に抗原が物理的に保持されることにより、生体内での代
謝による抗原の分解消失を阻害することができるからで
ある。In the present invention, the network structure includes a cotton-like structure in which fibers are three-dimensionally bonded and a structure in which knitted products in which fibers are two-dimensionally bonded are three-dimensionally laminated, and the orientation of each fiber Regardless of gender. The reason why the shape of the immunopotentiator of the present invention is a network structure is that it increases the physical attraction to the antigen in the solution, and the surface area in contact with the cellulosic material and the antigen is extremely increased. This is because the physical retention of the antigen inside the mesh structure can inhibit the decomposition and disappearance of the antigen due to metabolism in the living body.
ここで抗原を吸着するとは、該構造体粒子が粒子表面又
は粒子中に抗原を物理的に拘束すること及び／又は構造
体材料がその表面において抗原と化学的に結合すること
を意味する。Here, adsorbing an antigen means that the structural particles physically bind the antigen on the surface of or in the particles, and / or the structural material chemically binds to the antigen on the surface.
抗原を吸着させる方法としては、溶液中に本発明の免疫
増強剤と抗原とを添加し、撹拌するだけでよい。As a method for adsorbing the antigen, it suffices to add the immunopotentiator of the present invention and the antigen to a solution and stir.
本発明において好ましい網目状構造体粒子は、直径50〜
200μｍ程度であることが好ましく、直径100〜200μｍ
程度であることが特に好ましい。また網目の孔の大きさ
は0.1〜0.6μｍ程度であることが好ましい。In the present invention, preferred network structure particles have a diameter of 50 to
It is preferable that the diameter is about 200 μm, and the diameter is 100 to 200 μm.
The degree is particularly preferable. The size of the mesh holes is preferably about 0.1 to 0.6 μm.
本発明の免疫増強剤として具体的に好ましいものは、例
えばニトロセルロースを原料としたメンブランフィルタ
ーを細かく切断し、すりつぶして粉末状としたものを挙
げることが出来る。Specific preferred examples of the immunopotentiator of the present invention include those obtained by finely cutting a membrane filter made of nitrocellulose as a raw material and crushing it into a powder form.
ii）強化抗原 イ）抗原 本発明の強化抗原を製造するために用いる抗原は、抗原
抗体反応を生じうるものであれば特に制限はないが、従
来免疫原性が極めて低いかあるいは免疫原性が存在しな
かったために免疫に用いられなかった物質、例えば分子
量が小さく、約10,000以下であるために免疫原性を発現
することのできなかったハプテン等の物質でも、本発明
の強化抗原の原料として用いれば免疫原性を発現するこ
とができる。ii) Enriched antigen a) Antigen The antigen used for producing the enhanced antigen of the present invention is not particularly limited as long as it is capable of causing an antigen-antibody reaction, but is conventionally extremely low in immunogenicity or immunogenic Substances that were not used for immunization because they did not exist, such as substances such as haptens that could not express immunogenicity due to small molecular weight, about 10,000 or less, were used as raw materials for the enhanced antigen of the present invention. When used, immunogenicity can be expressed.
また、従来微量しか得られなかったために免疫に用いる
ことが困難であるような物質も、本発明の強化抗原の形
態で用いれば、有効に免疫を行うことができる。そのよ
うな抗原の例としては、種々のリンホカイン、細胞中の
各種酵素、各種の制御蛋白を始めとして、生体に微量し
か存在しない蛋白因子等を挙げることが出来る。Further, a substance which has been difficult to be used for immunization since only a small amount was conventionally obtained can be effectively immunized when used in the form of the enhanced antigen of the present invention. Examples of such antigens include various lymphokines, various enzymes in cells, various regulatory proteins, and protein factors that are present only in trace amounts in the living body.
本発明に用いる抗原は、化学的には、通常免疫原として
用いられる蛋白質、多糖体、糖蛋白、糖脂質、リポ蛋
白、ポリグリセロールリン酸塩などを例示することが出
来る。Chemically, the antigen used in the present invention can be exemplified by proteins, polysaccharides, glycoproteins, glycolipids, lipoproteins, polyglycerol phosphates and the like which are usually used as immunogens.
また抗原は生物学的に、菌体、ウィルス等の形態であっ
てもよく、これまで免疫原性がないかあるいは低いため
にワクチンの製造が困難であったようなウィルスを上記
担体に吸着せしめ、強化抗原としてワクチンに用いるこ
とができる。The antigen may be biologically in the form of a bacterium, virus, etc., and a virus that has been difficult to produce a vaccine due to lack of immunogenicity or low immunogenicity should be adsorbed on the carrier. , Can be used in vaccines as enhancing antigens.
iii）強化抗原の使用法 本発明の強化抗原は、各種の免疫反応を、免疫原性の弱
い、または微量の抗原を用いて行うことが出来る。例と
して、次のような使用方法を挙げることができる。iii) Method of Using Enhanced Antigen The enhanced antigen of the present invention can carry out various immune reactions by using a weakly immunogenic antigen or a very small amount of antigen. For example, the following usage can be mentioned.
イ）各種のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体
を製造するために動物を免疫する際使用する方法。B) A method used for immunizing animals to produce various monoclonal or polyclonal antibodies.
ロ）動物又は人間に対するワクチンとして使用する方
法。B) A method of using as a vaccine against animals or humans.
人間及び動物に対してワクチンとして用いる際の投与方
法、投与量、製剤化の方法は、従来公知のワクチンを用
いる方法に準じて行えばよい。ただし投与量は、従来の
100〜1000分の１程度で足りる。When used as a vaccine for humans and animals, the administration method, dose, and formulation method may be carried out in accordance with conventionally known methods using vaccines. However, the dose is
About 100 to 1/1000 is sufficient.
現在、ハイブリドーマ並びにモノクローナル抗体はライ
フサイエンスの種々の領域において蛋白因子の検出・同
定・精製はもとより感染症の診断といった多様な目的に
利用されている。モノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞を樹立するためには通常マウス又はラット
を抗原で免疫する必要があるが、従来の免疫法ではかな
り大量の抗原が必要とされた。このため生体微量成分の
モノクローナル抗体を得ることは極めて困難であった。
本発明を利用することにより、これまでにはモノクロー
ナル抗体を得られなかった生体微量成分についても、抗
原が比較的簡単に得られる物質同様、抗体による検出・
同定・単離・精製が可能となる。また免疫する際の抗原
量を少なくすることができ、その結果抗原の精製を行う
際の出発材料をこれまでより少なくできるため、モノク
ローナル抗体の作製コストを低減することができる。ま
た、これまで免疫原性が低いためにワクチンを製造する
ことのできなかったウィルスに対しても、ワクチンを製
造することができる。At present, hybridomas and monoclonal antibodies are used in various fields of life science for various purposes such as detection, identification and purification of protein factors as well as diagnosis of infectious diseases. In order to establish a hybridoma cell producing a monoclonal antibody, it is usually necessary to immunize a mouse or rat with an antigen, but the conventional immunization method required a considerably large amount of the antigen. For this reason, it has been extremely difficult to obtain a monoclonal antibody which is a trace component of a living body.
By using the present invention, even for a trace amount of biological components for which a monoclonal antibody has not been obtained so far, detection by an antibody can be performed in the same manner as a substance in which an antigen can be obtained relatively easily.
It enables identification, isolation and purification. In addition, the amount of antigen for immunization can be reduced, and as a result, the starting material for purifying the antigen can be reduced, so that the production cost of the monoclonal antibody can be reduced. In addition, a vaccine can be produced against a virus for which a vaccine could not be produced due to its low immunogenicity.
以下実施例により本発明を更に説明する。 The present invention will be further described below with reference to examples.
実施例１（トポイソメラーゼ強化抗原の製造） 孔径0.45μｍのニトロセルロース製メンブランフィルタ
ー〔SandS社製、商品名:0.45μｍメンブランフィルタ
ー〕を2mm角程度に細かく切断した後乳鉢ですりつぶ
し、粒度を20ゲージ注射針を通る程度に調整して本発明
の免疫増強剤を得た。Example 1 (Production of topoisomerase-enhanced antigen) A nitrocellulose membrane filter having a pore size of 0.45 μm (manufactured by SandS, trade name: 0.45 μm membrane filter) was finely cut into 2 mm squares, ground in a mortar, and injected with a 20 gauge particle size. The immunopotentiator of the present invention was obtained by adjusting the amount to pass through a needle.
次いで子牛胸腺より採取精製したトポイソメラーゼII・
１を50μｇ得てリン酸緩衝液中で免疫増強剤と混合する
ことにより、免疫増強剤に吸着させた。こうして得た強
化抗原を、0.9％食塩水で洗浄し、同食塩水で50％（v/
v）の懸濁液にして注射液とした。Next, topoisomerase II collected and purified from calf thymus
50 μg of 1 was obtained and mixed with an immunopotentiating agent in a phosphate buffer solution to be adsorbed on the immunopotentiating agent. The enriched antigen thus obtained was washed with 0.9% saline and 50% (v / v
The suspension of v) was made into an injection solution.
実施例２（免疫及びモノクローナル抗体製造） この実施例では、アジュバント法において使用する抗原
と同程度の量の抗原を用いて、本発明の方法によりハイ
ブリドーマが得られることを示す。Example 2 (Immunization and Monoclonal Antibody Production) This example shows that a hybridoma can be obtained by the method of the present invention using an amount of the antigen that is similar to that used in the adjuvant method.
ｉ）免疫処理 実施例１で製造した注射液を用いて、表１に示すよう
に、１匹当たり１〜100μｇの原料抗原を含む強化抗原
を５週齢のBalb/cマウス（雄）６匹の腹腔内に注射し
た。投与量は、注射液の量によって調整した。i) Immunization Using the injection solution prepared in Example 1, as shown in Table 1, 6-week-old Balb / c mice (male) containing 5 to 100 μg of the enhanced antigen containing 1 to 100 μg of the raw material antigen per mouse were used. Intraperitoneally. The dose was adjusted according to the amount of injection solution.
４週間後、同様の方法により、各マウス１匹当たり10μ
ｇの原料抗原を含む強化抗原を用いて追加免疫を行っ
た。After 4 weeks, in the same manner, 10μ per mouse
Booster immunizations were performed with fortified antigens containing g of source antigen.
次いでその１週間後にマウスの尾静脈より採血し、血液
を凝固させた後遠心分離にかけて血清を得た。One week after that, blood was collected from the tail vein of the mouse, and the blood was coagulated and then centrifuged to obtain serum.
更に、血清を１％の牛血清アルブミン溶液で、希釈度30
〜1000に希釈し、トポイソメラーゼIIを50ngアッセイ用
96穴プレートに吸着させてこの抗原に対する反応を測定
し、常法に従った間接法による酵素抗体法で抗体価の測
定を行った。結果を第１表に示す。Furthermore, the serum was diluted with 1% bovine serum albumin solution to a dilution of 30.
Dilute to ~ 1000 and use 50 ng topoisomerase II for assay
The reaction with this antigen was measured by adsorbing it on a 96-well plate, and the antibody titer was measured by the indirect enzyme antibody method according to the usual method. The results are shown in Table 1.
第１表の数値は、アルカリホスファターゼ30分反応後の
405nmの吸光度を示し、（＋）は、吸光度が対照（抗原
量０のマウスの血清）の値の５倍以上のものを、（−）
は、それ以下のものを示す。The values in Table 1 are after 30 minutes reaction with alkaline phosphatase.
Absorbance at 405 nm is shown, and (+) indicates that the absorbance is 5 times or more the value of the control (serum of mouse with 0 antigen),
Indicates less than that.
ii）モノクローナル抗体の製造 第１表のうち100μｇの原料抗原を含む強化抗原で免疫
し、10μｇの原料抗原を含む強化抗原で追加免疫をした
マウスより、採血した翌日、脾臓細胞を単離して、ミエ
ローマ細胞（P3-X63,Ag8.653）と2:1に混合し、ポリエ
チレングリコール（50％w/v）により融合して96穴プレ
ートに植え込み、HAT培地によって融合細胞を選択し
た。融合細胞が96穴プレートで増殖してきたウェルか
ら、融合細胞334株の培養上清を取り出し、第１表と同
様に抗体価の測定を行い、結果を第２表に示した。アル
カリフォスファターゼ１時間反応後405nmの吸光度の測
定を行い、その値が0.07以上0.01未満のものを±、0.1
以上のものを＋として表にした。尚、このときバックグ
ラウンドの値（杯溶液のみ）は、0.01程度であった。 ii) Production of Monoclonal Antibody From Table 1, spleen cells were isolated the day after blood collection from mice immunized with the enhanced antigen containing 100 μg of the raw material antigen and boosted with the enhanced antigen containing 10 μg of the raw material antigen, The cells were mixed 2: 1 with myeloma cells (P3-X63, Ag8.653), fused with polyethylene glycol (50% w / v) and seeded in a 96-well plate, and the fused cells were selected by HAT medium. The culture supernatant of the fused cell line 334 was taken out from the wells in which the fused cells grew in the 96-well plate, and the antibody titer was measured in the same manner as in Table 1. The results are shown in Table 2. After reacting with alkaline phosphatase for 1 hour, the absorbance at 405 nm is measured. If the value is 0.07 or more and less than 0.01, ±, 0.1
The above is tabulated as +. At this time, the background value (only the cup solution) was about 0.01.
第２表に示すように、融合細胞334株のうち特異的な抗
体産生を行うものは22株あったが、そのなかで特に強い
反応を示したのは７株であった。この７株の産生する抗
体のクラスを酵素抗体法で決定してみたところ、５株が
IgM抗体の産生を行っていた。 As shown in Table 2, 22 of the 334 fused cells produced specific antibodies, and 7 of them showed a particularly strong reaction. When the class of antibody produced by these 7 strains was determined by the enzyme antibody method, 5 strains were found.
He was producing IgM antibody.
このように本発明の強化抗原により免疫したマウスから
ハイブリドーマが得られることが明らかとなり、また産
生する抗体も、従来のアジュバントを用いる方法で比較
的少ない回数免疫した場合と同様IgMであることが示さ
れた。Thus, it was revealed that hybridomas can be obtained from mice immunized with the enhanced antigen of the present invention, and that the antibody produced is also IgM as in the case of immunization with a relatively small number of times by the method using a conventional adjuvant. Was done.
実施例３（免疫及びモノクローナル抗体製造） この実施例においては、アジュバント法の約百分の一程
度の量の抗原を用いて本発明の免疫法を実施した場合
に、ハイブリドーマが得られることを示す。Example 3 (Immunization and Monoclonal Antibody Production) This example shows that a hybridoma is obtained when the immunization method of the present invention is carried out using an antigen in an amount of about one-hundredth of that of the adjuvant method. .
ｉ）免疫処理 実施例１で製造した注射液を用いて、実施例３と同様に
して免疫処理を行った。（ただし強化抗原が含む原料抗
原の投与量は、次の通りである。i) Immunization Immunization was performed in the same manner as in Example 3 using the injection solution prepared in Example 1. (However, the dose of the raw material antigen contained in the enhanced antigen is as follows.
処理 投与量 第１回 １μｇ 第２回（第１回の４週間後） 10μｇ 第３回（第２回の１週間後） 10μｇ 第４回（第３回の１週間後） 10μｇ 次いで、第４回投与の１週間後、尾静脈より採血し、実
施例２と同様に酵素抗体法によるマウス血清中の抗体価
の測定を行った。結果を第３表に示す。Treatment Dose 1st 1 μg 2nd (4 weeks after 1st) 10 μg 3rd (1 week after 2nd) 10 μg 4th (1 week after 3rd) 10 μg Then, 4th One week after the repeated administration, blood was collected from the tail vein, and the antibody titer in mouse serum was measured by the enzyme antibody method as in Example 2. The results are shown in Table 3.
ii）モノクローナル抗体の製造 上記の免疫したマウスを用いて、実施例２と同様にして
モノクローナル抗体を製造し、酵素抗体法により融合細
胞の上清の抗体価を測定した。結果を第４表に示す。 ii) Production of Monoclonal Antibody A monoclonal antibody was produced using the above-mentioned immunized mouse in the same manner as in Example 2, and the antibody titer of the supernatant of the fused cells was measured by the enzyme antibody method. The results are shown in Table 4.
第４表に示すように、融合細胞575株のうち96株が特異
的な抗体産生を行い、58株が特に強い反応を示した。こ
の58株のうち特に抗体価のよい10株を選択して限界希釈
法でクローニングを行った。 As shown in Table 4, 96 out of 575 fused cells produced specific antibodies, and 58 exhibited particularly strong reaction. Of these 58 strains, 10 strains with particularly high antibody titers were selected and cloned by the limiting dilution method.
クローニングの後10株の産生する抗体のクラスを酵素抗
体法で決定したところ９株がIgM抗体の産生を、１株がI
gG抗体の産生を行っていた。After cloning, the antibody classes produced by 10 strains were determined by the enzyme antibody method, and 9 strains produced IgM antibodies and 1 strain produced I
It was producing gG antibody.
実施例４（アジュバント法と本発明の方法の比較） HeLa細胞より精製したトポイソメラーゼＩを原料抗原と
して、実施例１と同様の方法で強化抗原を製造し、実施
例２と同様にして18匹のマウスの免疫処理を行った。た
だし強化抗原が含む原料抗原の投与量は、第１回目に第
５表に記載の通り行い、その４週間後に原料抗原１μｇ
を含む強化抗原によって追加免疫を行い、その１週間後
にマウスの眼静脈より採血し、３倍の血清希釈系列を調
製して実施例２と同様に酵素抗体法による測定をおこな
った。Example 4 (Comparison between the adjuvant method and the method of the present invention) Using Topoisomerase I purified from HeLa cells as a starting antigen, an enhanced antigen was produced in the same manner as in Example 1, and 18 animals were prepared in the same manner as in Example 2. Mice were immunized. However, the dose of the raw material antigen contained in the enriched antigen was as shown in Table 5 at the first time, and 4 weeks after that, 1 μg of the raw material antigen was given.
A booster immunization was carried out with a booster antigen containing 1 week later, and 1 week later, blood was collected from the ocular vein of the mouse, a 3-fold serum dilution series was prepared, and measurement was carried out by the enzyme antibody method as in Example 2.
第５表に、免疫していないマウスの抗体価の５倍以上上
回る値を示したものを、抗体産生プラスとして個体数で
示した。In Table 5, those showing a value that is 5 times or more higher than the antibody titer of the non-immunized mouse are shown as the antibody production plus by the number of individuals.
また同様にして、本発明の方法と比較するために、フロ
イントのコンプリートアジュバントを用いて免疫及び抗
体価の測定を行い、その結果を第６表に示した。Similarly, for comparison with the method of the present invention, immunity and antibody titer were measured using Freund's complete adjuvant, and the results are shown in Table 6.
第５表及び第６表の比較から明らかなように、同量の原
料抗原を投与したアジュバント法では抗体価の上昇が見
られなかったのに対して、本発明の方法では0.3μｇと
いう極めて微量の原料抗原を投与した個体においても、
抗体価の上昇がみられた。As is clear from the comparison of Tables 5 and 6, the antibody titer was not increased by the adjuvant method in which the same amount of the raw material antigen was administered, whereas the method of the present invention showed an extremely small amount of 0.3 μg. In individuals who were administered the raw material antigen of
The antibody titer increased.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 井川 洋二 茨城県つくば市高野台３―１―１ 理化学 研究所ライフサイエンス筑波研究センター 内 (56)参考文献 Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，Ｖｏｌ．106，Ｎｏ．11，ａｂｓｔｒ ａｃｔ Ｎｏ．82758ｘ ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Yoji Ikawa 3-1-1-1, Takanodai, Tsukuba, Ibaraki Prefectural Institute of Physical and Chemical Research, Life Science Tsukuba Research Center (56) References Chemical Abstracts, Vol. 106, No. 11, abstr act No. 82758x
Claims (2)
なる免疫増強剤。1. An immunopotentiator comprising nitrocellulose network particles.
体と、該担体に吸着せしめられた抗原とからなる強化抗
原。2. A reinforced antigen comprising a carrier comprising the immunopotentiator according to claim 1 and an antigen adsorbed on the carrier.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63114441A JPH07116057B2 (en) | 1988-05-11 | 1988-05-11 | Immune enhancer and enhancing antigen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63114441A JPH07116057B2 (en) | 1988-05-11 | 1988-05-11 | Immune enhancer and enhancing antigen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01287032A JPH01287032A (en) | 1989-11-17 |
| JPH07116057B2 true JPH07116057B2 (en) | 1995-12-13 |
Family
ID=14637811
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63114441A Expired - Lifetime JPH07116057B2 (en) | 1988-05-11 | 1988-05-11 | Immune enhancer and enhancing antigen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07116057B2 (en) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6613332B1 (en) | 1991-06-21 | 2003-09-02 | The University Of Cincinnati | Oral administration of therapeutic proteins |
| US6328967B1 (en) * | 1998-03-12 | 2001-12-11 | Allergenics, Inc. | Delivery system to modulate immune response |
| WO2005053740A1 (en) * | 2003-12-02 | 2005-06-16 | Bio Matrix Research Inc. | Immune enhancer and enhanced antigen obtained therewith |
-
1988
- 1988-05-11 JP JP63114441A patent/JPH07116057B2/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ，Ｖｏｌ．１０６，Ｎｏ．１１，ａｂｓｔｒａｃｔＮｏ．８２７５８ｘ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01287032A (en) | 1989-11-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5871747A (en) | Antigen-carrying microparticles and their use in the indication of humoral or cellular responses | |
| US6004763A (en) | Antigen-carrying microparticles and their use in the induction of humoral or cellular responses | |
| US4372945A (en) | Antigen compounds | |
| JP4716350B2 (en) | Antibodies against latency membrane proteins and their use | |
| US4816253A (en) | Novel mutant strain of Listeria monocytogenes and its use in production of IgM antibodies and as an immunotherapeutic agent | |
| AU645552B2 (en) | Idiotypic vaccination against B cell lymphoma | |
| EP0222415A2 (en) | Viral glycoprotein subunit vaccine | |
| AU623106B2 (en) | Diagnostic system | |
| JPH07508498A (en) | Staphylococcus epidermidis-associated type I and II surface antigens | |
| US4567041A (en) | Mutant strain of Listeria monocytogenes and its use in production of IgM antibodies and as an immunotherapeutic agent | |
| Borrebaeck | In vitro immunization for production of murine and human monoclonal antibodies: present status | |
| CA1213828A (en) | Purified and antigenically selective vaccines for domestic animals | |
| JPH0351692B2 (en) | ||
| EP0003173A1 (en) | Process for producing human antibodies and composition containing them | |
| Dorfman | The optimal technological approach to the development of human hybridomas | |
| GB2153364A (en) | Lymphokine, monoclonal antibody specific to the lymphokine, and their production and uses | |
| EP0153871A2 (en) | Antibody enhancement of immunogenicity of antigen | |
| WO1988000472A1 (en) | Immunogens and improved methods of making immunogens | |
| JPH07116057B2 (en) | Immune enhancer and enhancing antigen | |
| US4572834A (en) | Biologic and method of preparing same | |
| Bhoopalam et al. | Surface immunoglobulins of lymphocytes in plasmacytoma. V. The effect of RNA-rich extract from mouse plasmacytoma MOPC 104E on the immune response. | |
| AT410636B (en) | METHOD FOR PRODUCING A VACCINE | |
| Kawakami et al. | Transfer Agent of Immunity III. Autoantibody Formation by Mouse Spleen Cells Treated with Immune Ribonucleic Acid Preparation | |
| JPS59116224A (en) | Immunological reaction controlling composition and manufacture | |
| JPH04500003A (en) | Porcine polyclonal and monoclonal antibodies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081213 Year of fee payment: 13 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081213 Year of fee payment: 13 |