JPH07104347B2 - ホスホリル化されたチロシンを含有する蛋白質を検出する方法及び組み合せ試薬 - Google Patents
ホスホリル化されたチロシンを含有する蛋白質を検出する方法及び組み合せ試薬Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ホスホリル化されたチ
ロシンを含有する蛋白質の検出法及びそれに好適な組み
合せ試薬に関する。
ロシンを含有する蛋白質の検出法及びそれに好適な組み
合せ試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】蛋白質の最も重要な変性の１つは、その
ホスホリル化である。その場合、燐含有基は、プロティ
ンキナーゼの作用によって蛋白質上の好適な場所へ運ば
れる。その際、しばしばヒドロキシル基含有アミノ酸及
び主にセリン又はトレオニンがホスホリル化される。セ
リン及びトレオニンのホスホリル化は、チロシンのホス
ホリル化に比べ正常細胞中で著しく有利であり、その場
合ホスフェート基の９９％より多くがセリン及びトレオ
ニンのところに存在する。
ホスホリル化である。その場合、燐含有基は、プロティ
ンキナーゼの作用によって蛋白質上の好適な場所へ運ば
れる。その際、しばしばヒドロキシル基含有アミノ酸及
び主にセリン又はトレオニンがホスホリル化される。セ
リン及びトレオニンのホスホリル化は、チロシンのホス
ホリル化に比べ正常細胞中で著しく有利であり、その場
合ホスフェート基の９９％より多くがセリン及びトレオ
ニンのところに存在する。
【０００３】ところで、形質転換された細胞中では、ホ
スホチロシンキナーゼ−活性の発生の増加が確認され
た。従って形質転換された細胞中のホスホチロシン分は
係数５〜７０だけ上昇できる。従ってホスホチロシン含
有蛋白質の発生が細胞の形質転換と連結される。ホスホ
リル化度が細胞の悪性度をどの程度指示するかも論じら
れている。
スホチロシンキナーゼ−活性の発生の増加が確認され
た。従って形質転換された細胞中のホスホチロシン分は
係数５〜７０だけ上昇できる。従ってホスホチロシン含
有蛋白質の発生が細胞の形質転換と連結される。ホスホ
リル化度が細胞の悪性度をどの程度指示するかも論じら
れている。
【０００４】更に、多くの腫瘍遺伝子蛋白質がチロシン
キナーゼ−活性を有し、即ちそれらが、それ自体及び他
の蛋白質がチロシンのところでホスホリル化されうるこ
とが観察された。このような腫瘍遺伝子蛋白質は細胞形
質膜の所でも、細胞質的にも現われる。ところで一般
に、腫瘍遺伝子は、正常細胞中の原腫瘍遺伝子と同じ機
能を有するが、変化された、又はもはや存在しない調節
を有する因子であるので、相応する生成物は、細胞中に
増大して現われる。ところでこの酵素活性の生成物を検
出することは既に試みられた。そのために、放射性燐32
Ｐを用いる検査が実施されているが、これは細胞培養中
でのみ可能であり、動物又は人間での検査は全く不可能
である。
キナーゼ−活性を有し、即ちそれらが、それ自体及び他
の蛋白質がチロシンのところでホスホリル化されうるこ
とが観察された。このような腫瘍遺伝子蛋白質は細胞形
質膜の所でも、細胞質的にも現われる。ところで一般
に、腫瘍遺伝子は、正常細胞中の原腫瘍遺伝子と同じ機
能を有するが、変化された、又はもはや存在しない調節
を有する因子であるので、相応する生成物は、細胞中に
増大して現われる。ところでこの酵素活性の生成物を検
出することは既に試みられた。そのために、放射性燐32
Ｐを用いる検査が実施されているが、これは細胞培養中
でのみ可能であり、動物又は人間での検査は全く不可能
である。
【０００５】ホスホリル化されたチロシンを含有する蛋
白質を免疫法で検出することも既に提案されていた。し
かしながら、従来公知の方法は、交差反応によって、ホ
スホリル化されたチロシンを含有しない蛋白質も検出し
てしまうので失敗であった。
白質を免疫法で検出することも既に提案されていた。し
かしながら、従来公知の方法は、交差反応によって、ホ
スホリル化されたチロシンを含有しない蛋白質も検出し
てしまうので失敗であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、それを用いて、体液中のチロシンの所でホスホリル
化された蛋白質を簡単でより迅速な方法でその種類及び
量について測定できる方法を提供することであった。
は、それを用いて、体液中のチロシンの所でホスホリル
化された蛋白質を簡単でより迅速な方法でその種類及び
量について測定できる方法を提供することであった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この課題は、ホスホリル
化されたチロシンを含有する蛋白質の検出法により解決
され、これは体液試料を少なくとも２個の受容体（Ｒｅ
ｚｅｐｔｏｒ）Ｒ1及びＲ2と共に恒温保持し、その際少
くとも受容体Ｒ1及びＲ2と試料液中の検出すべき物質と
の結合によって、信号変化を得、かつ各々両受容体の１
方は、検出すべき蛋白質と特異的に結合しうる抗体又は
その誘導体を含有し、他方は、ホスホリル化されたチロ
シンと特異的に結合しうる抗体又はその誘導体を含有し
かつその結合によってひきおこされた試料中の信号変化
を測定することよりなる。
化されたチロシンを含有する蛋白質の検出法により解決
され、これは体液試料を少なくとも２個の受容体（Ｒｅ
ｚｅｐｔｏｒ）Ｒ1及びＲ2と共に恒温保持し、その際少
くとも受容体Ｒ1及びＲ2と試料液中の検出すべき物質と
の結合によって、信号変化を得、かつ各々両受容体の１
方は、検出すべき蛋白質と特異的に結合しうる抗体又は
その誘導体を含有し、他方は、ホスホリル化されたチロ
シンと特異的に結合しうる抗体又はその誘導体を含有し
かつその結合によってひきおこされた試料中の信号変化
を測定することよりなる。
【０００８】本発明による方法を用いて、ホスホリル化
されたチロシンを含有する蛋白質を正確にかつ体液中で
再現可能に検出することができる。異なる抗体２種の組
み合わせにより、ホスホリル化された蛋白質のホスホリ
ル化度及び種類を迅速かつ簡単に測定することができ
る。
されたチロシンを含有する蛋白質を正確にかつ体液中で
再現可能に検出することができる。異なる抗体２種の組
み合わせにより、ホスホリル化された蛋白質のホスホリ
ル化度及び種類を迅速かつ簡単に測定することができ
る。
【０００９】この検出法を体液中、特に血清中で実施す
る。本発明により意図された免疫測定法の実施に関して
は、非常に多くの変法が公知であり、そのすべてがここ
では好適である。例えば受容体２個又は３個以上を使用
でき、かつ個々の受容体と一緒の恒温保持を種々異なる
順序で同質相又は異質相中で行なう。これらの変法は当
業者に公知であり、ここでは、詳細な説明は必要としな
い。
る。本発明により意図された免疫測定法の実施に関して
は、非常に多くの変法が公知であり、そのすべてがここ
では好適である。例えば受容体２個又は３個以上を使用
でき、かつ個々の受容体と一緒の恒温保持を種々異なる
順序で同質相又は異質相中で行なう。これらの変法は当
業者に公知であり、ここでは、詳細な説明は必要としな
い。
【００１０】受容体少くとも２個と試料液中の検出すべ
き物質との結合により生じる信号の変化を各々評価す
る。この信号変化は使用系に依存し、例えば変色、混濁
変化又は蛍光変化である。各々の場合に少くとも２個の
受容体が使用され、その場合信号変化は、Ｒ1もＲ2も検
出すべき物質と結合している場合にのみ生じる。検出
は、均一法で、例えば凝集反応検定法を用いて行なうこ
とができ、その際受容体として、検出すべき物質への結
合により架橋し、従って凝集する被覆された粒子、例え
ばラテックス粒子又は赤血球を使用するか、又は不均一
法で、例えばサンドイッチ−免疫検定法（Ｓａｎｄｗｉ
ｃｈ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を用いて行なうことが
できる。
き物質との結合により生じる信号の変化を各々評価す
る。この信号変化は使用系に依存し、例えば変色、混濁
変化又は蛍光変化である。各々の場合に少くとも２個の
受容体が使用され、その場合信号変化は、Ｒ1もＲ2も検
出すべき物質と結合している場合にのみ生じる。検出
は、均一法で、例えば凝集反応検定法を用いて行なうこ
とができ、その際受容体として、検出すべき物質への結
合により架橋し、従って凝集する被覆された粒子、例え
ばラテックス粒子又は赤血球を使用するか、又は不均一
法で、例えばサンドイッチ−免疫検定法（Ｓａｎｄｗｉ
ｃｈ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を用いて行なうことが
できる。
【００１１】各々の場合に、受容体２個を使用し、その
うちの１方は、検出すべき蛋白質と特異的に結合しうる
抗体又はその誘導体を含有し、他方は、ホスホリル化さ
れたチロシンと結合しうる抗体又はその誘導体を含有す
る。
うちの１方は、検出すべき蛋白質と特異的に結合しうる
抗体又はその誘導体を含有し、他方は、ホスホリル化さ
れたチロシンと結合しうる抗体又はその誘導体を含有す
る。
【００１２】受容体Ｒ1のために使用される抗体は、検
出すべき蛋白質に対向する抗体もしくはその誘導体であ
るのが有利である。蛋白質としては、腫瘍組織中にしば
しば生じ、ホスホチロシンキナーゼに対する基質である
ものが本発明により検出される。例として、次のものが
挙げられる：自己触媒的ホスホリル化を伴なうプロテオ
ホルモンの受容体、例えば表皮成長因子−Ｒ．、血小板
由来増殖因子−Ｒ．、インシュリン−Ｒ．、インシュリ
ン様成長因子−Ｒ．、神経成長因子等；糖分解酵素例え
ばエノラーゼの同位酵素；ホスホグリセロムターゼ；乳
酸デヒドロゲナーゼ（Ｎａｔｕｒｅ３０２，２１８〜２
２３，１９８３）；ベシケル蛋白質（Ｖｅｓｉｋｅｌｐ
ｒｏｔｅｉｎｅ）例えばシナプトフィジン（Ｓｙｎａｐ
ｔｏｐｈｙｓｉｎ）；分子量３０ｋＤ，９４ｋＤ及び１
０５ｋＤを有する蛋白質（ＰＮＡＳ８５，７６２〜７６
６，１９８８）；ホスホリル化された腫瘍遺伝子、例え
ばｖ−ｆｍｓ（ｇｐ１４０）、ｐｐ６０Ｃ−ｓｒｃ、Ｈ
ＥＲ−２／ｎｅｕ、ポリオーマウィルスｍｉｄｄｌｅ
Ｔ蛋白質（５６ｋＤ）（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
８，１７６〜１８５，１９８８）並びにホルモン受容体
の誘導体である他の腫瘍遺伝子蛋白質；細胞骨格蛋白質
例えばビンクリン（Ｖｉｎｃｕｌｉｎ；Ｓｃｉ．Ａｍ．
２４６，６８〜７８，１９８２）又はカルパクチン（Ｃ
ａｌｐａｃｔｉｎ；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，
２７４５〜２７５１，１９８６）；腫瘍細胞系中の蛋白
質、例えば次の分子量を有するもの：１５０ｋＤ、１３
０ｋＤ、１１０ｋＤ、１７０ｋＤ、１００ｋＤ、８０ｋ
Ｄ、２１０ｋＤ、７０ｋＤ、６０ｋＤ、（Ｉｎｔ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ３９，４８２〜４８７，１９８７）。その
測定のために、その中でホスホチロシンが安定であるよ
うな蛋白質を選択するのが有利である。それというの
も、血清中に存在するホスファターゼは多くの蛋白質中
のホスホチロシンを脱燐酸化することができるからであ
る。安定で良好に検出される蛋白質としては、シナプト
フィジン、小胞膜にしっかり結合していて、通例神径分
泌及び神径内分泌細胞中に存在するＮ−グリコシル化さ
れた蛋白質、クロモグラニンＡ（Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎ
ｉｎ Ａ）、しばしば分泌性細胞の顆粒中に存在する酸
性の可溶性蛋白質及びシトケラチン、上皮細胞の細胞骨
格成分である中間−フィラメント−蛋白質（Ｉｎｔｅｒ
ｍｅｄｉａｅｒ−Ｆｉｌａｍｅｎｔ−Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｅ）が特に好適である。従って、本発明により、これら
の蛋白質に対向している抗体を使用するのが有利であ
る。
出すべき蛋白質に対向する抗体もしくはその誘導体であ
るのが有利である。蛋白質としては、腫瘍組織中にしば
しば生じ、ホスホチロシンキナーゼに対する基質である
ものが本発明により検出される。例として、次のものが
挙げられる：自己触媒的ホスホリル化を伴なうプロテオ
ホルモンの受容体、例えば表皮成長因子−Ｒ．、血小板
由来増殖因子−Ｒ．、インシュリン−Ｒ．、インシュリ
ン様成長因子−Ｒ．、神経成長因子等；糖分解酵素例え
ばエノラーゼの同位酵素；ホスホグリセロムターゼ；乳
酸デヒドロゲナーゼ（Ｎａｔｕｒｅ３０２，２１８〜２
２３，１９８３）；ベシケル蛋白質（Ｖｅｓｉｋｅｌｐ
ｒｏｔｅｉｎｅ）例えばシナプトフィジン（Ｓｙｎａｐ
ｔｏｐｈｙｓｉｎ）；分子量３０ｋＤ，９４ｋＤ及び１
０５ｋＤを有する蛋白質（ＰＮＡＳ８５，７６２〜７６
６，１９８８）；ホスホリル化された腫瘍遺伝子、例え
ばｖ−ｆｍｓ（ｇｐ１４０）、ｐｐ６０Ｃ−ｓｒｃ、Ｈ
ＥＲ−２／ｎｅｕ、ポリオーマウィルスｍｉｄｄｌｅ
Ｔ蛋白質（５６ｋＤ）（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
８，１７６〜１８５，１９８８）並びにホルモン受容体
の誘導体である他の腫瘍遺伝子蛋白質；細胞骨格蛋白質
例えばビンクリン（Ｖｉｎｃｕｌｉｎ；Ｓｃｉ．Ａｍ．
２４６，６８〜７８，１９８２）又はカルパクチン（Ｃ
ａｌｐａｃｔｉｎ；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，
２７４５〜２７５１，１９８６）；腫瘍細胞系中の蛋白
質、例えば次の分子量を有するもの：１５０ｋＤ、１３
０ｋＤ、１１０ｋＤ、１７０ｋＤ、１００ｋＤ、８０ｋ
Ｄ、２１０ｋＤ、７０ｋＤ、６０ｋＤ、（Ｉｎｔ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ３９，４８２〜４８７，１９８７）。その
測定のために、その中でホスホチロシンが安定であるよ
うな蛋白質を選択するのが有利である。それというの
も、血清中に存在するホスファターゼは多くの蛋白質中
のホスホチロシンを脱燐酸化することができるからであ
る。安定で良好に検出される蛋白質としては、シナプト
フィジン、小胞膜にしっかり結合していて、通例神径分
泌及び神径内分泌細胞中に存在するＮ−グリコシル化さ
れた蛋白質、クロモグラニンＡ（Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎ
ｉｎ Ａ）、しばしば分泌性細胞の顆粒中に存在する酸
性の可溶性蛋白質及びシトケラチン、上皮細胞の細胞骨
格成分である中間−フィラメント−蛋白質（Ｉｎｔｅｒ
ｍｅｄｉａｅｒ−Ｆｉｌａｍｅｎｔ−Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｅ）が特に好適である。従って、本発明により、これら
の蛋白質に対向している抗体を使用するのが有利であ
る。
【００１３】受容体Ｒ１は、使用法に依存して誘導体化
されるので、不均一免疫検定法（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅ
ｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）である場合は、固相への
結合を仲介し、あるいは、均一免疫検定法（ｈｏｍｏｇ
ｅｎｅｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）である場合は、他
の方法で、例えばラテックス粒子又は調節物質への結合
により誘導体化される。
されるので、不均一免疫検定法（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅ
ｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）である場合は、固相への
結合を仲介し、あるいは、均一免疫検定法（ｈｏｍｏｇ
ｅｎｅｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）である場合は、他
の方法で、例えばラテックス粒子又は調節物質への結合
により誘導体化される。
【００１４】本発明による測定は、サンドイッチ−免疫
検定法として行なうのが有利である。そのために、受容
体Ｒ1を固定化し、かつ同時に又は連続して試料液と反
応させる。引き続いて、受容体Ｒ2を添加する。固定化
された受容体Ｒ1、検出すべき物質並びに受容体Ｒ2から
錯体が形成される。固相に結合されかつ標識を有する錯
体のみを評価する。
検定法として行なうのが有利である。そのために、受容
体Ｒ1を固定化し、かつ同時に又は連続して試料液と反
応させる。引き続いて、受容体Ｒ2を添加する。固定化
された受容体Ｒ1、検出すべき物質並びに受容体Ｒ2から
錯体が形成される。固相に結合されかつ標識を有する錯
体のみを評価する。
【００１５】この実施形では、受容体Ｒ１は、本発明に
より使用される抗体双方のうちの１つもしくはその誘導
体を含有し、かつ固相への結合を仲介する。そのため、
受容体Ｒ１は、直接に又はスペーサーを介して固相に結
合されているか、又は固定化されていてよい。有利な実
施形では、受容体Ｒ１は、抗体及び特異的に結合しうる
物質からの接合体である。特異的に結合しうる物質と結
合可能である成分が固相に結合している。特異的に結合
しうるペアーとして、例えば抗原−抗体；ハプテン−抗
体；ビオチン−抗ビオチン−抗体；ビオチン−アビジ
ン；ビオチン−ストレプトアビジン；蛋白質Ａ−免疫−
γ−グロブリンが挙げられる。この実施形では、Ｒ１と
して抗体とビオチンとの接合体を、かつ固相として、そ
の表面にストレプトアビジンを有するマトリックス（Ｍ
ａｔｒｉｘ）を使用するのが特に有利である。ついでビ
オチンとストレプトアビジンとの結合により、モノクロ
ーナル抗体の固定化を行なう。固相の表面に、使用モノ
クローナル抗体のＦｃ−部に対する抗体又は蛋白質−Ａ
−分子が結合される実施形も有利であり、この場合、つ
いでモノクローナル抗体のＦｃ−部の結合により、固定
化を行なう。
より使用される抗体双方のうちの１つもしくはその誘導
体を含有し、かつ固相への結合を仲介する。そのため、
受容体Ｒ１は、直接に又はスペーサーを介して固相に結
合されているか、又は固定化されていてよい。有利な実
施形では、受容体Ｒ１は、抗体及び特異的に結合しうる
物質からの接合体である。特異的に結合しうる物質と結
合可能である成分が固相に結合している。特異的に結合
しうるペアーとして、例えば抗原−抗体；ハプテン−抗
体；ビオチン−抗ビオチン−抗体；ビオチン−アビジ
ン；ビオチン−ストレプトアビジン；蛋白質Ａ−免疫−
γ−グロブリンが挙げられる。この実施形では、Ｒ１と
して抗体とビオチンとの接合体を、かつ固相として、そ
の表面にストレプトアビジンを有するマトリックス（Ｍ
ａｔｒｉｘ）を使用するのが特に有利である。ついでビ
オチンとストレプトアビジンとの結合により、モノクロ
ーナル抗体の固定化を行なう。固相の表面に、使用モノ
クローナル抗体のＦｃ−部に対する抗体又は蛋白質−Ａ
−分子が結合される実施形も有利であり、この場合、つ
いでモノクローナル抗体のＦｃ−部の結合により、固定
化を行なう。
【００１６】もう１つの有利な実施形では、マトリック
スにビオチン分子を結合させ、かつ受容体Ｒ1として、
ビオチンと抗体からの接合体を使用する。ついで固定化
は免疫反応の実施後にストレプトアビジンの添加により
行なうことができる。
スにビオチン分子を結合させ、かつ受容体Ｒ1として、
ビオチンと抗体からの接合体を使用する。ついで固定化
は免疫反応の実施後にストレプトアビジンの添加により
行なうことができる。
【００１７】固相としては、免疫法で通例使用される物
質が好適である。例えば、ポリマー物質又はセルロース
含有物質並びにガラスを使用することもできる。ポリス
チレン、ポリメタクリレート、テフロン、ポリアミド、
スチレンとアクリルニトリルからのコポリマー、ガラス
製品及びセルロース製品が特に好適であると判明した。
マトリックスは任意の形で、例えば細管、マイクロ滴定
板、球、フィルム、粉末、小粒又は繊維フリースとして
存在してよい。例えば欧州特許（ＥＰ−Ａ）第０２６９
０９２号明細書中に記載の方法により得られた固相が好
適である。
質が好適である。例えば、ポリマー物質又はセルロース
含有物質並びにガラスを使用することもできる。ポリス
チレン、ポリメタクリレート、テフロン、ポリアミド、
スチレンとアクリルニトリルからのコポリマー、ガラス
製品及びセルロース製品が特に好適であると判明した。
マトリックスは任意の形で、例えば細管、マイクロ滴定
板、球、フィルム、粉末、小粒又は繊維フリースとして
存在してよい。例えば欧州特許（ＥＰ−Ａ）第０２６９
０９２号明細書中に記載の方法により得られた固相が好
適である。
【００１８】受容体Ｒ2は、各々本発明により必要であ
る他の抗体又はその誘導体を含有する。更に、受容体Ｒ
2は、信号変化に寄与できるように構成される。標識の
使用下での均一又は不均一免疫検定法のために使用する
際に、受容体Ｒ2は標識付けられる。標識として放射性
物質、酵素、蛍光性及び化学的発光性物質が好適であ
る。その場合、標識の検出は公知法により行なう。標識
として酵素を使用するのが有利である。酵素として好適
なのは、特にペルオキシダーゼ、アルカリホスホターゼ
及びβ−ガラクトシダーゼである。酵素の検出は、基質
の添加及び生じた色の測定により行なう。他の免疫検定
法の変法では、受容体Ｒ2は被覆された粒子に結合され
ている。
る他の抗体又はその誘導体を含有する。更に、受容体Ｒ
2は、信号変化に寄与できるように構成される。標識の
使用下での均一又は不均一免疫検定法のために使用する
際に、受容体Ｒ2は標識付けられる。標識として放射性
物質、酵素、蛍光性及び化学的発光性物質が好適であ
る。その場合、標識の検出は公知法により行なう。標識
として酵素を使用するのが有利である。酵素として好適
なのは、特にペルオキシダーゼ、アルカリホスホターゼ
及びβ−ガラクトシダーゼである。酵素の検出は、基質
の添加及び生じた色の測定により行なう。他の免疫検定
法の変法では、受容体Ｒ2は被覆された粒子に結合され
ている。
【００１９】受容体Ｒ2は、抗体としてのホスホリル化
されたチロシンと特異的に結合しうる抗体を含有するの
が有利である。ホスホリル化されたチロシンと特異的に
結合しうる抗体は、適当な有機体をホスホチラミンで公
知法により免疫性にし、公知法により骨髄細胞と融合さ
れる脾臓細胞を得、ついでホスホチロシンと結合しうる
クローンを選択し、培養することにより得られる。免疫
化のために、ホスホチラミンをコハク酸化された担体蛋
白質に結合させ、その際、キーホール・リンペット・ヘ
モシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏ
ｃｙａｎｉｎ：ＫＬＨ）及び牛血清アルブミンを担体蛋
白質として使用するのが有利である。細胞系ＥＣＡＣＣ
９００３１９０４から産生されたモノクローナル抗体３
−３６５−１０を使用するのが特に有利である。
されたチロシンと特異的に結合しうる抗体を含有するの
が有利である。ホスホリル化されたチロシンと特異的に
結合しうる抗体は、適当な有機体をホスホチラミンで公
知法により免疫性にし、公知法により骨髄細胞と融合さ
れる脾臓細胞を得、ついでホスホチロシンと結合しうる
クローンを選択し、培養することにより得られる。免疫
化のために、ホスホチラミンをコハク酸化された担体蛋
白質に結合させ、その際、キーホール・リンペット・ヘ
モシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏ
ｃｙａｎｉｎ：ＫＬＨ）及び牛血清アルブミンを担体蛋
白質として使用するのが有利である。細胞系ＥＣＡＣＣ
９００３１９０４から産生されたモノクローナル抗体３
−３６５−１０を使用するのが特に有利である。
【００２０】体液を双方の受容体と共に恒温保持する
と、Ｒ1、ホスホリル化されたチロシンを含有する蛋白
質及びＲ2から錯体が生じる。その中で３成分すべてが
結合している錯体のみが、信号変化に作用できる。この
方法では、一方では特定の種類の蛋白質のみが、他方で
はそれらのチロシンと結合した燐含有基のみが、特異的
に感知される。それというのも、相応する蛋白質のみが
双方の特異的な抗体と結合可能であるからである。サン
ドイッチ−免疫検定法の有利な実施形では、Ｒ1がそれ
に結合されている錯体のみが固定化され得、それに更に
Ｒ2が結合されている錯体のみが標識化を介して評価さ
れ得る。
と、Ｒ1、ホスホリル化されたチロシンを含有する蛋白
質及びＲ2から錯体が生じる。その中で３成分すべてが
結合している錯体のみが、信号変化に作用できる。この
方法では、一方では特定の種類の蛋白質のみが、他方で
はそれらのチロシンと結合した燐含有基のみが、特異的
に感知される。それというのも、相応する蛋白質のみが
双方の特異的な抗体と結合可能であるからである。サン
ドイッチ−免疫検定法の有利な実施形では、Ｒ1がそれ
に結合されている錯体のみが固定化され得、それに更に
Ｒ2が結合されている錯体のみが標識化を介して評価さ
れ得る。
【００２１】本発明方法を用いて、双方の使用抗体と結
合可能である２個のエピトープを有する特定の蛋白質の
存在を検出することができる。このようなフラグメント
は、主として腫瘍組織中に生じる。
合可能である２個のエピトープを有する特定の蛋白質の
存在を検出することができる。このようなフラグメント
は、主として腫瘍組織中に生じる。
【００２２】本発明のもう１つの目的は、ホスホリル化
されたチロシンを含有する蛋白質の検出のための試薬で
あり、これは、それが少くとも２個の受容体Ｒ1及びＲ2
を含有し、その際双方の受容体の１方は、測定すべき蛋
白質と結合しうる抗体又はその誘導体を含有し、かつ他
方の受容体は、ホスホリル化されたチロシンと特異的に
結合しうる抗体又はその誘導体を含有することよりな
る。
されたチロシンを含有する蛋白質の検出のための試薬で
あり、これは、それが少くとも２個の受容体Ｒ1及びＲ2
を含有し、その際双方の受容体の１方は、測定すべき蛋
白質と結合しうる抗体又はその誘導体を含有し、かつ他
方の受容体は、ホスホリル化されたチロシンと特異的に
結合しうる抗体又はその誘導体を含有することよりな
る。
【００２３】本発明の目的物は、ホスホリル化されたチ
ロシンと特異的に結合しうる抗体を製造する、ヨーロピ
アン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチュ
アズ、ポート・ダウン（ＧＢ）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅｓ，Ｐｏｒｔ Ｄｏｗｎ（ＧＢ））に寄託
された細胞培養液ＥＣＡＣＣ９００３１９０４でもあ
る。
ロシンと特異的に結合しうる抗体を製造する、ヨーロピ
アン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチュ
アズ、ポート・ダウン（ＧＢ）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅｓ，Ｐｏｒｔ Ｄｏｗｎ（ＧＢ））に寄託
された細胞培養液ＥＣＡＣＣ９００３１９０４でもあ
る。
【００２４】
【実施例】次の例により本発明を説明する。
【００２５】例１抗原としてのシナプトフィジンを用いる検査 体液中のホスホリル化されたシナプトフィジンを、サン
ドイッチ−酵素−免疫検定法で、シナプトフィジン−特
異性捕捉抗体及びホスホチロシン−特異性検出抗体を用
いて検出した。欧州特許（ＥＰ−Ａ）第０２６９０９２
号明細書と同様にしてストレプトアビジンで被覆された
マイクロ滴定プレートは、ビオチン接合体（抗体とＤ−
ビオチン−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシ−サ
クシンイミドエステルとの反応により製造）としての、
細胞系ＥＣＡＣＣ８９１１２８０１から産生されたシナ
プトフィジン−特異性ＭＡＫ ＳＹ３８（２μｇ／ｍ
ｌ）で、１カップ当りの試料５μｌを含有するＰＢＳ
（ＮａＣｌ８ｇ／ｌ、ＫＣｌ０．２ｇ／ｌ、Ｎａ２ＨＰ
Ｏ４×２Ｈ２Ｏ１．４４ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．２ｇ
／ｌ）１００ｎｌの量中で室温で２時間にわたり被覆し
た。０．０５％トゥィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０／ＰＢＳ
で３回洗浄後にペルオキシダーゼに接合した抗−ホスホ
チロシン−抗体の接合体（インキュベーション濃度１６
６Ｕ／Ｌ）と共にＰＢＳ中で恒温保持を行った。
ドイッチ−酵素−免疫検定法で、シナプトフィジン−特
異性捕捉抗体及びホスホチロシン−特異性検出抗体を用
いて検出した。欧州特許（ＥＰ−Ａ）第０２６９０９２
号明細書と同様にしてストレプトアビジンで被覆された
マイクロ滴定プレートは、ビオチン接合体（抗体とＤ−
ビオチン−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシ−サ
クシンイミドエステルとの反応により製造）としての、
細胞系ＥＣＡＣＣ８９１１２８０１から産生されたシナ
プトフィジン−特異性ＭＡＫ ＳＹ３８（２μｇ／ｍ
ｌ）で、１カップ当りの試料５μｌを含有するＰＢＳ
（ＮａＣｌ８ｇ／ｌ、ＫＣｌ０．２ｇ／ｌ、Ｎａ２ＨＰ
Ｏ４×２Ｈ２Ｏ１．４４ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．２ｇ
／ｌ）１００ｎｌの量中で室温で２時間にわたり被覆し
た。０．０５％トゥィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０／ＰＢＳ
で３回洗浄後にペルオキシダーゼに接合した抗−ホスホ
チロシン−抗体の接合体（インキュベーション濃度１６
６Ｕ／Ｌ）と共にＰＢＳ中で恒温保持を行った。
【００２６】室温で１時間の恒温保持後にあらたに０．
０５％トゥィーン２０／ＰＢＳで３回洗浄した。室温で
酵素基質ＡＢＴＳ（２，２′−アジノ−ジ−［３−エチ
ル−ベンズチアゾリン−スルホン酸（６）］−ジアンモ
ニウム塩，ＡＢＴＳ９．１ｍｍｏｌ／ｌ、過ホウ酸ナト
リウム１．４７ｍｍｏｌ／ｌ、ホスフェート−シトレー
ト−緩衝剤１００ｍｍｏｌ／ｌ ｐＨ５．０）と共に引
き続き恒温保持（６０分）した後、分析質濃度の尺度と
しての吸光度を４０５ｎｍで測定した。
０５％トゥィーン２０／ＰＢＳで３回洗浄した。室温で
酵素基質ＡＢＴＳ（２，２′−アジノ−ジ−［３−エチ
ル−ベンズチアゾリン−スルホン酸（６）］−ジアンモ
ニウム塩，ＡＢＴＳ９．１ｍｍｏｌ／ｌ、過ホウ酸ナト
リウム１．４７ｍｍｏｌ／ｌ、ホスフェート−シトレー
ト−緩衝剤１００ｍｍｏｌ／ｌ ｐＨ５．０）と共に引
き続き恒温保持（６０分）した後、分析質濃度の尺度と
しての吸光度を４０５ｎｍで測定した。
【００２７】同様に、捕捉体−ＭＡＫ抗−クロモグラニ
ン（Ａｍ．Ｊ．ＳｕｒｇｉｃａｌＰａｔｈｏｌｏｇｙ８
（１９８４）６０７〜６１４と同様にして製造）（２μ
ｇ／ｍｌ）、寄託番号ＥＣＡＣＣ８９０３０３０２の抗
−シトケラチン（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）−ＭＡＫ
（３μｇ／ｍｌ）並びに抗−カルパクチン（Ｃａｌｐａ
ｃｔｉｎ）−ＭＡＫ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７
（１９８８）２０６９〜２０７６と同様にして製造）を
用いる検査を行った。
ン（Ａｍ．Ｊ．ＳｕｒｇｉｃａｌＰａｔｈｏｌｏｇｙ８
（１９８４）６０７〜６１４と同様にして製造）（２μ
ｇ／ｍｌ）、寄託番号ＥＣＡＣＣ８９０３０３０２の抗
−シトケラチン（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）−ＭＡＫ
（３μｇ／ｍｌ）並びに抗−カルパクチン（Ｃａｌｐａ
ｃｔｉｎ）−ＭＡＫ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７
（１９８８）２０６９〜２０７６と同様にして製造）を
用いる検査を行った。
【００２８】 表 血清評価 ＳＹ３８ｘＰＴｙｒ ＣＡｘＰＴｙｒ 正 検査 正 検査 健康 ０ ６ ０ ６ 良性の病気 ０ １０ ０ １０ 悪性の病気 ９ ５０ ９ ５０ ＣＫｘＰＴｙｒ Ｃａｌｐ．ｘＰＴｙｒ 正 検査 正 検査 健康 ０ ５ ０ ６ 良性の病気 ０ １３ ０ １０ 悪性の病気 ４ １９ ２ １２ ＰＴｙｒ ＝抗ホスホチロシン−ＭＡＫ（ＥＣＡＣＣ ９００３１９０４） ＳＹ３８ ＝抗シナプトフィジン−ＭＡＫ（ＥＣＡＣＣ ８９１１２８０１） ＣＡ ＝抗クロモグラニン−ＭＡＫ ＣＫ ＝抗シトケラチン−ＭＡＫ（ＥＣＡＣＣ ８９０３０３０２） Ｃａｌｐ．＝抗カルパクチン−ＭＡＫ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アンドレアス デスザウアー ドイツ連邦共和国 トゥッツィンク ヘレ −シュトラーセ １ (56)参考文献 特開 昭57−45454（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−126856（ＪＰ，Ａ) 米国特許4543439（ＵＳ，Ａ)
Claims (3)
- 【請求項１】 ホスホリル化されたチロシンを含有する
蛋白質の検出法において、体液試料を少なくとも２個の
受容体Ｒ1及びＲ2と共に恒温保持し、その際少くとも受
容体Ｒ1及びＲ2と試料液中の検出すべき物質との結合に
よって信号変化を生じ、かつ各々両受容体の１方は、検
出すべき蛋白質と特異的に結合しうる抗体又はその誘導
体を含有し、他方は、ホスホリル化されたチロシンと特
異的に結合しうる抗体又はその誘導体を含有し、かつ結
合によってひきおこされた試料中の信号変化を測定する
ことを特徴とする、ホスホリル化されたチロシンを含有
する蛋白質の検出法。 - 【請求項２】 ホスホリル化されたチロシンに対する抗
体として、ホスホチラミンを用いる免疫化により得られ
るモノクローナル抗体を使用する、請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 ホスホリル化されたチロシンを含有する
蛋白質の検出のための組み合せ試薬において、これは、
少くとも２個の受容体Ｒ1及びＲ2を含有し、その際、両
受容体の一方は測定すべき蛋白質と特異的に結合しうる
抗体又はその誘導体を含有し、他方の受容体はホスホリ
ル化されたチロシンと特異的に結合しうる抗体又はその
誘導体を含有することを特徴とする、ホスホリル化され
たチロシンを含有する蛋白質の検出のための組み合せ試
薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4009848.6 | 1990-03-27 | ||
| DE4009848A DE4009848A1 (de) | 1990-03-27 | 1990-03-27 | Verfahren zum nachweis von phosphoryliertes tyrosin enthaltenden proteinen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04223270A JPH04223270A (ja) | 1992-08-13 |
| JPH07104347B2 true JPH07104347B2 (ja) | 1995-11-13 |
Family
ID=6403171
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3060058A Expired - Lifetime JPH07104347B2 (ja) | 1990-03-27 | 1991-03-25 | ホスホリル化されたチロシンを含有する蛋白質を検出する方法及び組み合せ試薬 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5580742A (ja) |
| EP (1) | EP0449269B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07104347B2 (ja) |
| AT (1) | ATE138205T1 (ja) |
| DE (2) | DE4009848A1 (ja) |
| DK (1) | DK0449269T3 (ja) |
| ES (1) | ES2089048T3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993003377A1 (en) * | 1991-07-31 | 1993-02-18 | Ziltener Hermann J | Method for the detection of phosphotyrosine residues |
| DE69222909T2 (de) * | 1991-08-16 | 1998-03-12 | Toshiba Kawasaki Kk | Monoklonaler Antikörper gegen ein Synaptophysin |
| DE4208422A1 (de) * | 1992-03-16 | 1993-09-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum Nachweis von Mikrometastasen ekto- oder entodermaler Tumoren |
| US5763198A (en) * | 1994-07-22 | 1998-06-09 | Sugen, Inc. | Screening assays for compounds |
| EP0898709A2 (en) * | 1996-04-18 | 1999-03-03 | Ariad Pharmaceuticals, Inc. | $i(IN VITRO) FLUORESCENCE POLARIZATION ASSAY |
| US6071707A (en) * | 1996-05-07 | 2000-06-06 | Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. | Phosphotyrosine mimics and method for identifying and using same |
| FR2778744B1 (fr) * | 1998-05-14 | 2000-06-23 | Cis Bio Int | Dosage immunologique de la chromogranine a humaine (cga) anticorps, reactifs et trousses utilisables pour ce dosage |
| US6150123A (en) * | 1998-09-03 | 2000-11-21 | Centre Integre De Recherches Biocliniques Sur Le Sida (Cirbs) | Affinity biotinylation |
| US6309863B1 (en) * | 1999-01-25 | 2001-10-30 | Brookhaven Science Associates | Methods for generating phosphorylation site-specific immunological reagents |
| US7460960B2 (en) * | 2002-05-10 | 2008-12-02 | Epitome Biosystems, Inc. | Proteome epitope tags and methods of use thereof in protein modification analysis |
| US7618788B2 (en) | 2002-05-10 | 2009-11-17 | Millipore Corporation | Proteome epitope tags and methods of use thereof in protein modification analysis |
| WO2007002483A1 (en) * | 2005-06-24 | 2007-01-04 | Beckman Coulter, Inc. | Immunoassay of phosphorylated proteins |
| US7855057B2 (en) * | 2006-03-23 | 2010-12-21 | Millipore Corporation | Protein splice variant/isoform discrimination and quantitative measurements thereof |
| WO2007117507A1 (en) * | 2006-04-03 | 2007-10-18 | Osi Pharmaceuticals, Inc. | A method for the assay of rock kinase activity in cells |
| US20130052669A1 (en) * | 2010-04-30 | 2013-02-28 | Amanda G. Paulovich | Compositions and methods for reliably detecting and/or measuring the amount of a modified target protein in a sample |
| WO2011137388A2 (en) * | 2010-04-30 | 2011-11-03 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Identification and use of biomarkers for detection and quantification of the level of radiation exposure in a biological sample |
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Citations (1)
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Family Cites Families (8)
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|---|---|---|---|---|
| DE2953610C1 (de) * | 1979-03-19 | 1985-04-11 | International Diagnostic Technology, Inc., Santa Clara, Calif. | Verfahren zum Bestimmen eines immunologisch aktiven Stoffs |
| JPS5745454A (en) * | 1980-09-02 | 1982-03-15 | Fuji Photo Film Co Ltd | Immunochemical measuring method for various minor components |
| US4758522A (en) * | 1985-03-08 | 1988-07-19 | The Regents Of The University Of California | Immunoassay for human chromogranin A |
| JPH01115641A (ja) * | 1987-10-27 | 1989-05-08 | Internatl Business Mach Corp <Ibm> | サーマル式ドロツプ・オン・デマンド型インクジエツト印刷ヘツド |
| CH676362A5 (ja) * | 1987-12-24 | 1991-01-15 | Nippon Shinyaku Co Ltd | |
| DE3804244A1 (de) * | 1987-12-24 | 1989-07-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung einer immunologisch aktiven substanz |
| EP0353895A1 (en) * | 1988-07-18 | 1990-02-07 | MITSUI TOATSU CHEMICALS, Inc. | Immunoassay method |
| DE3829245A1 (de) * | 1988-08-29 | 1990-03-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz |
-
1990
- 1990-03-27 DE DE4009848A patent/DE4009848A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-03-25 JP JP3060058A patent/JPH07104347B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-27 DE DE59107797T patent/DE59107797D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-27 ES ES91104912T patent/ES2089048T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-27 AT AT91104912T patent/ATE138205T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-03-27 DK DK91104912.0T patent/DK0449269T3/da active
- 1991-03-27 EP EP91104912A patent/EP0449269B1/de not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-01-21 US US08/183,898 patent/US5580742A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| US4543439A (en) | 1982-12-13 | 1985-09-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Production and use of monoclonal antibodies to phosphotyrosine-containing proteins |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5580742A (en) | 1996-12-03 |
| JPH04223270A (ja) | 1992-08-13 |
| ES2089048T3 (es) | 1996-10-01 |
| EP0449269B1 (de) | 1996-05-15 |
| DK0449269T3 (da) | 1996-09-16 |
| EP0449269A1 (de) | 1991-10-02 |
| DE59107797D1 (de) | 1996-06-20 |
| DE4009848A1 (de) | 1991-10-02 |
| ATE138205T1 (de) | 1996-06-15 |
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