JPH07104347B2 - ホスホリル化されたチロシンを含有する蛋白質を検出する方法及び組み合せ試薬 - Google Patents
ホスホリル化されたチロシンを含有する蛋白質を検出する方法及び組み合せ試薬Info
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Description
ロシンを含有する蛋白質の検出法及びそれに好適な組み
合せ試薬に関する。
ホスホリル化である。その場合、燐含有基は、プロティ
ンキナーゼの作用によって蛋白質上の好適な場所へ運ば
れる。その際、しばしばヒドロキシル基含有アミノ酸及
び主にセリン又はトレオニンがホスホリル化される。セ
リン及びトレオニンのホスホリル化は、チロシンのホス
ホリル化に比べ正常細胞中で著しく有利であり、その場
合ホスフェート基の99%より多くがセリン及びトレオ
ニンのところに存在する。
スホチロシンキナーゼ−活性の発生の増加が確認され
た。従って形質転換された細胞中のホスホチロシン分は
係数5〜70だけ上昇できる。従ってホスホチロシン含
有蛋白質の発生が細胞の形質転換と連結される。ホスホ
リル化度が細胞の悪性度をどの程度指示するかも論じら
れている。
キナーゼ−活性を有し、即ちそれらが、それ自体及び他
の蛋白質がチロシンのところでホスホリル化されうるこ
とが観察された。このような腫瘍遺伝子蛋白質は細胞形
質膜の所でも、細胞質的にも現われる。ところで一般
に、腫瘍遺伝子は、正常細胞中の原腫瘍遺伝子と同じ機
能を有するが、変化された、又はもはや存在しない調節
を有する因子であるので、相応する生成物は、細胞中に
増大して現われる。ところでこの酵素活性の生成物を検
出することは既に試みられた。そのために、放射性燐32
Pを用いる検査が実施されているが、これは細胞培養中
でのみ可能であり、動物又は人間での検査は全く不可能
である。
白質を免疫法で検出することも既に提案されていた。し
かしながら、従来公知の方法は、交差反応によって、ホ
スホリル化されたチロシンを含有しない蛋白質も検出し
てしまうので失敗であった。
は、それを用いて、体液中のチロシンの所でホスホリル
化された蛋白質を簡単でより迅速な方法でその種類及び
量について測定できる方法を提供することであった。
化されたチロシンを含有する蛋白質の検出法により解決
され、これは体液試料を少なくとも2個の受容体(Re
zeptor)R1及びR2と共に恒温保持し、その際少
くとも受容体R1及びR2と試料液中の検出すべき物質と
の結合によって、信号変化を得、かつ各々両受容体の1
方は、検出すべき蛋白質と特異的に結合しうる抗体又は
その誘導体を含有し、他方は、ホスホリル化されたチロ
シンと特異的に結合しうる抗体又はその誘導体を含有し
かつその結合によってひきおこされた試料中の信号変化
を測定することよりなる。
されたチロシンを含有する蛋白質を正確にかつ体液中で
再現可能に検出することができる。異なる抗体2種の組
み合わせにより、ホスホリル化された蛋白質のホスホリ
ル化度及び種類を迅速かつ簡単に測定することができ
る。
る。本発明により意図された免疫測定法の実施に関して
は、非常に多くの変法が公知であり、そのすべてがここ
では好適である。例えば受容体2個又は3個以上を使用
でき、かつ個々の受容体と一緒の恒温保持を種々異なる
順序で同質相又は異質相中で行なう。これらの変法は当
業者に公知であり、ここでは、詳細な説明は必要としな
い。
き物質との結合により生じる信号の変化を各々評価す
る。この信号変化は使用系に依存し、例えば変色、混濁
変化又は蛍光変化である。各々の場合に少くとも2個の
受容体が使用され、その場合信号変化は、R1もR2も検
出すべき物質と結合している場合にのみ生じる。検出
は、均一法で、例えば凝集反応検定法を用いて行なうこ
とができ、その際受容体として、検出すべき物質への結
合により架橋し、従って凝集する被覆された粒子、例え
ばラテックス粒子又は赤血球を使用するか、又は不均一
法で、例えばサンドイッチ−免疫検定法(Sandwi
ch−Immunoassay)を用いて行なうことが
できる。
うちの1方は、検出すべき蛋白質と特異的に結合しうる
抗体又はその誘導体を含有し、他方は、ホスホリル化さ
れたチロシンと結合しうる抗体又はその誘導体を含有す
る。
出すべき蛋白質に対向する抗体もしくはその誘導体であ
るのが有利である。蛋白質としては、腫瘍組織中にしば
しば生じ、ホスホチロシンキナーゼに対する基質である
ものが本発明により検出される。例として、次のものが
挙げられる:自己触媒的ホスホリル化を伴なうプロテオ
ホルモンの受容体、例えば表皮成長因子−R.、血小板
由来増殖因子−R.、インシュリン−R.、インシュリ
ン様成長因子−R.、神経成長因子等;糖分解酵素例え
ばエノラーゼの同位酵素;ホスホグリセロムターゼ;乳
酸デヒドロゲナーゼ(Nature302,218〜2
23,1983);ベシケル蛋白質(Vesikelp
roteine)例えばシナプトフィジン(Synap
tophysin);分子量30kD,94kD及び1
05kDを有する蛋白質(PNAS85,762〜76
6,1988);ホスホリル化された腫瘍遺伝子、例え
ばv−fms(gp140)、pp60C−src、H
ER−2/neu、ポリオーマウィルスmiddle
T蛋白質(56kD)(Mol.Cell Biol.
8,176〜185,1988)並びにホルモン受容体
の誘導体である他の腫瘍遺伝子蛋白質;細胞骨格蛋白質
例えばビンクリン(Vinculin;Sci.Am.
246,68〜78,1982)又はカルパクチン(C
alpactin;Mol.Cell.Biol.6,
2745〜2751,1986);腫瘍細胞系中の蛋白
質、例えば次の分子量を有するもの:150kD、13
0kD、110kD、170kD、100kD、80k
D、210kD、70kD、60kD、(Int.J.
Cancer39,482〜487,1987)。その
測定のために、その中でホスホチロシンが安定であるよ
うな蛋白質を選択するのが有利である。それというの
も、血清中に存在するホスファターゼは多くの蛋白質中
のホスホチロシンを脱燐酸化することができるからであ
る。安定で良好に検出される蛋白質としては、シナプト
フィジン、小胞膜にしっかり結合していて、通例神径分
泌及び神径内分泌細胞中に存在するN−グリコシル化さ
れた蛋白質、クロモグラニンA(Chromogran
in A)、しばしば分泌性細胞の顆粒中に存在する酸
性の可溶性蛋白質及びシトケラチン、上皮細胞の細胞骨
格成分である中間−フィラメント−蛋白質(Inter
mediaer−Filament−Protein
e)が特に好適である。従って、本発明により、これら
の蛋白質に対向している抗体を使用するのが有利であ
る。
されるので、不均一免疫検定法(heterogene
n Immunoassay)である場合は、固相への
結合を仲介し、あるいは、均一免疫検定法(homog
enen Immunoassay)である場合は、他
の方法で、例えばラテックス粒子又は調節物質への結合
により誘導体化される。
検定法として行なうのが有利である。そのために、受容
体R1を固定化し、かつ同時に又は連続して試料液と反
応させる。引き続いて、受容体R2を添加する。固定化
された受容体R1、検出すべき物質並びに受容体R2から
錯体が形成される。固相に結合されかつ標識を有する錯
体のみを評価する。
より使用される抗体双方のうちの1つもしくはその誘導
体を含有し、かつ固相への結合を仲介する。そのため、
受容体R1は、直接に又はスペーサーを介して固相に結
合されているか、又は固定化されていてよい。有利な実
施形では、受容体R1は、抗体及び特異的に結合しうる
物質からの接合体である。特異的に結合しうる物質と結
合可能である成分が固相に結合している。特異的に結合
しうるペアーとして、例えば抗原−抗体;ハプテン−抗
体;ビオチン−抗ビオチン−抗体;ビオチン−アビジ
ン;ビオチン−ストレプトアビジン;蛋白質A−免疫−
γ−グロブリンが挙げられる。この実施形では、R1と
して抗体とビオチンとの接合体を、かつ固相として、そ
の表面にストレプトアビジンを有するマトリックス(M
atrix)を使用するのが特に有利である。ついでビ
オチンとストレプトアビジンとの結合により、モノクロ
ーナル抗体の固定化を行なう。固相の表面に、使用モノ
クローナル抗体のFc−部に対する抗体又は蛋白質−A
−分子が結合される実施形も有利であり、この場合、つ
いでモノクローナル抗体のFc−部の結合により、固定
化を行なう。
スにビオチン分子を結合させ、かつ受容体R1として、
ビオチンと抗体からの接合体を使用する。ついで固定化
は免疫反応の実施後にストレプトアビジンの添加により
行なうことができる。
質が好適である。例えば、ポリマー物質又はセルロース
含有物質並びにガラスを使用することもできる。ポリス
チレン、ポリメタクリレート、テフロン、ポリアミド、
スチレンとアクリルニトリルからのコポリマー、ガラス
製品及びセルロース製品が特に好適であると判明した。
マトリックスは任意の形で、例えば細管、マイクロ滴定
板、球、フィルム、粉末、小粒又は繊維フリースとして
存在してよい。例えば欧州特許(EP−A)第0269
092号明細書中に記載の方法により得られた固相が好
適である。
る他の抗体又はその誘導体を含有する。更に、受容体R
2は、信号変化に寄与できるように構成される。標識の
使用下での均一又は不均一免疫検定法のために使用する
際に、受容体R2は標識付けられる。標識として放射性
物質、酵素、蛍光性及び化学的発光性物質が好適であ
る。その場合、標識の検出は公知法により行なう。標識
として酵素を使用するのが有利である。酵素として好適
なのは、特にペルオキシダーゼ、アルカリホスホターゼ
及びβ−ガラクトシダーゼである。酵素の検出は、基質
の添加及び生じた色の測定により行なう。他の免疫検定
法の変法では、受容体R2は被覆された粒子に結合され
ている。
されたチロシンと特異的に結合しうる抗体を含有するの
が有利である。ホスホリル化されたチロシンと特異的に
結合しうる抗体は、適当な有機体をホスホチラミンで公
知法により免疫性にし、公知法により骨髄細胞と融合さ
れる脾臓細胞を得、ついでホスホチロシンと結合しうる
クローンを選択し、培養することにより得られる。免疫
化のために、ホスホチラミンをコハク酸化された担体蛋
白質に結合させ、その際、キーホール・リンペット・ヘ
モシアニン(keyhole limpet hemo
cyanin:KLH)及び牛血清アルブミンを担体蛋
白質として使用するのが有利である。細胞系ECACC
90031904から産生されたモノクローナル抗体3
−365−10を使用するのが特に有利である。
と、R1、ホスホリル化されたチロシンを含有する蛋白
質及びR2から錯体が生じる。その中で3成分すべてが
結合している錯体のみが、信号変化に作用できる。この
方法では、一方では特定の種類の蛋白質のみが、他方で
はそれらのチロシンと結合した燐含有基のみが、特異的
に感知される。それというのも、相応する蛋白質のみが
双方の特異的な抗体と結合可能であるからである。サン
ドイッチ−免疫検定法の有利な実施形では、R1がそれ
に結合されている錯体のみが固定化され得、それに更に
R2が結合されている錯体のみが標識化を介して評価さ
れ得る。
合可能である2個のエピトープを有する特定の蛋白質の
存在を検出することができる。このようなフラグメント
は、主として腫瘍組織中に生じる。
されたチロシンを含有する蛋白質の検出のための試薬で
あり、これは、それが少くとも2個の受容体R1及びR2
を含有し、その際双方の受容体の1方は、測定すべき蛋
白質と結合しうる抗体又はその誘導体を含有し、かつ他
方の受容体は、ホスホリル化されたチロシンと特異的に
結合しうる抗体又はその誘導体を含有することよりな
る。
ロシンと特異的に結合しうる抗体を製造する、ヨーロピ
アン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチュ
アズ、ポート・ダウン(GB)(European C
ollection ofAnimal Cell C
ultures,Port Down(GB))に寄託
された細胞培養液ECACC90031904でもあ
る。
ドイッチ−酵素−免疫検定法で、シナプトフィジン−特
異性捕捉抗体及びホスホチロシン−特異性検出抗体を用
いて検出した。欧州特許(EP−A)第0269092
号明細書と同様にしてストレプトアビジンで被覆された
マイクロ滴定プレートは、ビオチン接合体(抗体とD−
ビオチン−ε−アミノカプロン酸−N−ヒドロキシ−サ
クシンイミドエステルとの反応により製造)としての、
細胞系ECACC89112801から産生されたシナ
プトフィジン−特異性MAK SY38(2μg/m
l)で、1カップ当りの試料5μlを含有するPBS
(NaCl8g/l、KCl0.2g/l、Na2HP
O4×2H2O1.44g/l、KH2PO40.2g
/l)100nlの量中で室温で2時間にわたり被覆し
た。0.05%トゥィーン(Tween)20/PBS
で3回洗浄後にペルオキシダーゼに接合した抗−ホスホ
チロシン−抗体の接合体(インキュベーション濃度16
6U/L)と共にPBS中で恒温保持を行った。
05%トゥィーン20/PBSで3回洗浄した。室温で
酵素基質ABTS(2,2′−アジノ−ジ−[3−エチ
ル−ベンズチアゾリン−スルホン酸(6)]−ジアンモ
ニウム塩,ABTS9.1mmol/l、過ホウ酸ナト
リウム1.47mmol/l、ホスフェート−シトレー
ト−緩衝剤100mmol/l pH5.0)と共に引
き続き恒温保持(60分)した後、分析質濃度の尺度と
しての吸光度を405nmで測定した。
ン(Am.J.SurgicalPathology8
(1984)607〜614と同様にして製造)(2μ
g/ml)、寄託番号ECACC89030302の抗
−シトケラチン(Cytokeratin)−MAK
(3μg/ml)並びに抗−カルパクチン(Calpa
ctin)−MAK(Biochemistry27
(1988)2069〜2076と同様にして製造)を
用いる検査を行った。
Claims (3)
- 【請求項1】 ホスホリル化されたチロシンを含有する
蛋白質の検出法において、体液試料を少なくとも2個の
受容体R1及びR2と共に恒温保持し、その際少くとも受
容体R1及びR2と試料液中の検出すべき物質との結合に
よって信号変化を生じ、かつ各々両受容体の1方は、検
出すべき蛋白質と特異的に結合しうる抗体又はその誘導
体を含有し、他方は、ホスホリル化されたチロシンと特
異的に結合しうる抗体又はその誘導体を含有し、かつ結
合によってひきおこされた試料中の信号変化を測定する
ことを特徴とする、ホスホリル化されたチロシンを含有
する蛋白質の検出法。 - 【請求項2】 ホスホリル化されたチロシンに対する抗
体として、ホスホチラミンを用いる免疫化により得られ
るモノクローナル抗体を使用する、請求項1記載の方
法。 - 【請求項3】 ホスホリル化されたチロシンを含有する
蛋白質の検出のための組み合せ試薬において、これは、
少くとも2個の受容体R1及びR2を含有し、その際、両
受容体の一方は測定すべき蛋白質と特異的に結合しうる
抗体又はその誘導体を含有し、他方の受容体はホスホリ
ル化されたチロシンと特異的に結合しうる抗体又はその
誘導体を含有することを特徴とする、ホスホリル化され
たチロシンを含有する蛋白質の検出のための組み合せ試
薬。
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DE4009848A DE4009848A1 (de) | 1990-03-27 | 1990-03-27 | Verfahren zum nachweis von phosphoryliertes tyrosin enthaltenden proteinen |
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Family Applications (1)
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---|---|---|---|
JP3060058A Expired - Lifetime JPH07104347B2 (ja) | 1990-03-27 | 1991-03-25 | ホスホリル化されたチロシンを含有する蛋白質を検出する方法及び組み合せ試薬 |
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