JPH0687893A

JPH0687893A - Hiv antigen

Info

Publication number: JPH0687893A
Application number: JP4362196A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Saito; 敦齊藤; Hideo Shinagawa; 日出夫品川; Tokuo Nakada; 篤男中田
Original assignee: HANDAI BISEIBUTSUBIYOU KENKYUKAI; Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Current assignee: HANDAI BISEIBUTSUBIYOU KENKYUKAI; Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Priority date: 1992-06-04
Filing date: 1992-12-09
Publication date: 1994-03-29

Abstract

PURPOSE:To obtain a pure and high-quality HIV antigen useful as an examination reagent for AIDS, an antigen for a diagnostic agent or the preparation of an antibody and an antigen free from immunologically non-specific reaction and useful as AIDS vaccine in high efficiency at a low cost. CONSTITUTION:An essentially pure HIV antigen containing a Gag-Env fused protein which contains Gag peptide fused to Env peptide at its C-terminal. The Gag peptide is composed of at least 10 consecutive amino acids in an amino acid sequence expressed by Gag (308-437) and the Env peptide is composed of at least a part of the amino acid sequence expressed by Env (512-699) and contains at least one epitope reactive with HIV antibody. An HIV antigen composed of Gag protein and obtained by the expression of the whole region of gag gene can be produced from the antigen.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上利用の分野】本発明は、エイズウイルス（ＨＩ
Ｖ）抗原に関する。更に詳細には、特定のＧａｇペプチ
ドがそのＣ末端において特定のＥｎｖペプチドと融合し
てなるＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白よりなり、優れたＨＩＶ
抗原性を有するのみならず、従来達成されなかった高い
生産性をもって得ることができる、実質的に純粋なＨＩ
Ｖ抗原、及びその製造方法に関する。本発明のＨＩＶ抗
原は、エイズの診断剤、ワクチンの有効成分、抗体作
製、治療薬の開発等において有用である。The present invention relates to the AIDS virus (HI
V) Regarding the antigen. More specifically, it comprises a Gag-Env fusion protein obtained by fusing a specific Gag peptide with a specific Env peptide at its C-terminus,
Substantially pure HI that is not only antigenic but can be obtained with high productivity that has never been achieved before.
V antigen and its manufacturing method. The HIV antigen of the present invention is useful in diagnostics for AIDS, active ingredients of vaccines, antibody production, development of therapeutic agents, and the like.

【０００２】[0002]

【従来の技術】周知の通り、１９８１年に最初のエイズ
患者が報告されて依頼、患者数は級数的に増加の一途を
辿り、１９９２年４月現在、既に約５０万例にも達して
いる。しかし、その予防と治療に関する研究と開発が全
世界で精力的に展開されているにも拘らず、未だ決定的
な治療法も予防法も実用化されていない。そのため、斯
かる現状でのエイズのグローバルな蔓延は、全世界を震
撼させている。一方、エイズの病原体が１９８３年には
じめて分離同定され、ウイルス学分野の基礎と臨床の両
側からの研究が活発になるに伴い（Ｎａｔｕｒｅ，３２
６，４３５−４３６，１９８７）、その診断法が長足の
進歩を遂げ、それに用いる免疫学的診断剤とその製法も
急速に改良されつつある。エイズの病原体は、ヒト、サ
ル、ネコ等において知られており、これ等のうちヒトに
ついては、ヒト免疫不全ウイルス［human immunodefici
ency virus（ＨＩＶ）]と命名されている。また、ＨＩ
Ｖは、米国、欧州、中央アフリカ及びその他の諸国で世
界的に蔓延のＨＩＶ１型（ＨＩＶ−１）と西アフリカで
主に流行のＨＩＶ２型（ＨＩＶ−２）とに２大別され分
類されている。ＨＩＶはエンベロープ（Ｅｎｖ）を有す
る直径１００〜１４０ｎｍの球形のウイルスであり、そ
のＥｎｖはトランスメンブランプロテイン（ｇｐ４１）
とウイルス粒子の表面に存在する７０〜８０個の直径１
５ｎｍ、高さ約９ｎｍの桿状突起物、ｐｅｐｌｏｍｅｒ
（ｇｐ１２０）からなる。このウイルス粒子のコア内部
には、ウイルスゲノムである１本鎖ＲＮＡ２分子が、逆
転写酵素及びウイルスコアの構造蛋白質と複合体を形成
し、プライマーｔＲＮＡと共に存在する。ウイルスゲノ
ムは、９ｋｂ以上の長さがあり、約１０種類の遺伝子で
構成されている。基本的には、ウイルス増殖に必須のウ
イルス粒子成分をコードする３つの主要な遺伝子、即
ち、（１）ウイルス・コアの３種類の構造蛋白質ｐ１７，ｐ
２４及びｐ１５の前駆蛋白ｐ５５をコードするｇａｇ
（ｇｒｏｕｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ）遺
伝子；（２）３種類の酵素、プロテアーゼ、逆転写酵素及びイ
ンテグラーゼの前駆体をコードするｐｏｌ（ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ）遺伝子；及び（３）エンベロープの２種類の糖蛋白質ｇｐ１２０とｇ
ｐ４１の前駆物質ｇｐ１６０をコードするｅｎｖ（ｅｎ
ｖｅｌｏｐｅ）遺伝子からなる。これ等の遺伝子は、５’末端から３’末端の方向へｇａ
ｇ・ｐｏｌ‥‥ｅｎｖの状態で順に配列している。な
お、残りの他の約７種類の遺伝子は、いわゆるａｃｃｅ
ｓｓｏｒｙｇｅｎｅｓであり、主にＨＩＶの感染、増
殖、成熟、発症等の調節に関与していると考えられてい
る。BACKGROUND OF THE INVENTION As is well known, the first AIDS in 1981.
Patients were reported and requested, and the number of patients continued to increase exponentially
As of April 1992, we have already reached about 500,000 cases
There is. However, all research and development related to its prevention and treatment is complete.
Despite being vigorously developed in the world, it is still definitive
Neither cure nor preventive method has been put to practical use. Therefore,
The global prevalence of AIDS in the current state of affairs has shook the world
I'm straining. On the other hand, the pathogen of AIDS
Firstly isolated and identified, both basic and clinical in the field of virology
With the active research from the side (Nature,32
6, 435-436, 1987), the diagnostic method
Progress has been made and the immunological diagnostic agents used
It is improving rapidly. AIDS pathogens are
It is known to humans, among them
Regarding the human immunodeficiency virus
ency virus (HIV)]. Also, HI
V is world-class in the United States, Europe, Central Africa and other countries.
Worldwide prevalence of HIV-1 (HIV-1) in West Africa
Mainly divided into two types, the epidemic HIV type 2 (HIV-2)
It is classified. HIV has an envelope (Env)
It is a spherical virus with a diameter of 100 to 140 nm.
Env is a transmembrane protein (gp41)
70-80 diameters on the surface of virus particles 1
5nm, about 9nm high rod-shaped protrusion, peplomer
(Gp120). Inside the core of this virus particle
Contains two single-stranded RNA molecules, which are the viral genome,
Forms a complex with transcriptase and viral core structural proteins
And is present with the primer tRNA. Virus Geno
The mum has a length of 9 kb or more and is composed of about 10 types of genes.
It is configured. Basically, it is essential for virus growth.
Immediately the three major genes that code for the Irs particle component
(1) Three types of viral core structural proteins p17 and p
Encodes the precursor protein p55 of 24 and p15gag
(Group-specific antigen)
Gene; (2) Three kinds of enzymes, protease, reverse transcriptase and a
Encode the precursor of integrasepol(Polym
(erase) gene; and (3) two types of envelope glycoproteins gp120 and g
encodes the precursor gp160 of p41env(En
velop) gene. These genes move from the 5'end to the 3'endga
g・pol‥‥‥envAre arranged in order. Na
Oh, the other seven genes are the so-called
It is a third-generation, mainly HIV infection and increase.
It is thought to be involved in the regulation of reproduction, maturation, onset, etc.
It

【０００３】エイズの基礎研究、治療薬の開発、診断
剤、ワクチン等において必須のＨＩＶ各種抗原や酵素の
生産は、ＨＩＶの直接培養により達成できる。しかし、
これには致命的なバイオハザードを伴うため、ＨＩＶを
直接培養かつ取扱うことなくその各種抗原や酵素を量産
する技術が、遺伝子工学を駆使することにより、様々に
工夫されかつ検討されてきた。例えば、ｇａｇ及びｐｏ
ｌ両遺伝子については、大腸菌により発現させると同時
にプロセッシングさせる技術により量産したＨＩＶの各
種抗原及び酵素、即ち、Ｇａｇ蛋白抗原のｐ１７，ｐ２
４及びｐ１５（特開平４−１１７２８９），ｐｏｌ遺伝
子産物のプロテアーゼ、逆転写酵素及びインテグラーゼ
（特開平２−２６５４８１）等が既に完成され、その一
部は実用化されている。The production of various HIV antigens and enzymes essential for basic research on AIDS, development of therapeutic agents, diagnostic agents, vaccines, etc. can be achieved by direct culture of HIV. But,
Since this involves a fatal biohazard, techniques for mass-producing various antigens and enzymes without directly culturing and handling HIV have been variously devised and studied by making full use of genetic engineering. For example, gag and po
For both genes, various HIV antigens and enzymes mass-produced by the technology of simultaneously expressing and processing in E. coli, that is, p17 and p2 of Gag protein antigen
4 and p15 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 4-117289), pol gene product protease, reverse transcriptase, integrase (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2-265481), and the like, and some of them have been put into practical use.

【０００４】一方、ＨＩＶのｅｎｖ遺伝子の発現につい
ては、ｅｎｖ遺伝子単独の多量発現が、ｇａｇやｐｏｌ
等の遺伝子の場合に比べ、その理由は不明ではあるが、
非常に困難であり、ｅｎｖ遺伝子を異種遺伝子との融合
蛋白として間接発現させている例が多い。例えば、ポリ
オウイルス抗原との融合蛋白としてｅｎｖ遺伝子を発現
させる（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，６
５，２８７５−２８８３，１９９１）；大腸菌の発現プ
ラスミドｐＥＶ−ｖｒｆによるＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白
の発現（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，１６１，３７０−３７９，１９８７）等が知られ
ている。この場合、用いた異種遺伝子、または用いたプ
ロモーターの下流を占める構造遺伝子がコードする異種
蛋白がＥｎｖ蛋白に融合する。そして、斯かる異種蛋白
の融合は検体血清との間で非特異的反応を生じることが
あるので、純正のＨＩＶ抗原に比べ、異種蛋白との融合
産物は品質や純度の点で劣る。また、生産収量も良好で
はない。又、量産したＥｎｖ蛋白と異種蛋白との融合蛋
白から、Ｅｎｖ蛋白と異種蛋白間の結合部（ｊｕｎｃｔ
ｉｏｎ）を開裂して融合蛋白を除去かつ精製し、異種蛋
白を有さない純正のＥｎｖ蛋白を高収率で回収すること
は容易ではなく、かつ、生産コストが高くなり不経済で
ある。又、或る株のＨＩＶのＧａｇ蛋白との融合蛋白と
してＥｎｖ蛋白をも発現させている例も知られている
（特開平１−１７９６８７；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８
０，８１１−８１３，１９９１及び欧州公開特許公報第
３０７１４９号）。しかし、これらの融合蛋白は、生産
収量の点で良好ではなく、製造コストが高い傾向にあ
る。換言すれば、従来技術には、品質や経済性・信頼性
に関する欠陥が見られるため、実用性や産業上利用の観
点から、斯かる欠陥の解消は待望かつ急務の課題であ
る。[0004] On the other hand, the expression of the env gene of HIV, a large amount expression of the env gene alone, gag and pol
The reason for this is unknown, compared to the case of genes such as
It is very difficult, and in many cases, the env gene is indirectly expressed as a fusion protein with a heterologous gene. For example, the env gene is expressed as a fusion protein with a poliovirus antigen (Journal of Virology, 6
5 , 2875-2883, 1991); Expression of Gag-Env fusion protein by E. coli expression plasmid pEV-vrf (Analytical Biochemist).
ry, 161 , 370-379, 1987) and the like are known. In this case, the heterologous gene used or the heterologous protein encoded by the structural gene occupying the downstream of the promoter used is fused to the Env protein. Since the fusion of such a heterologous protein may cause a non-specific reaction with the sample serum, the fusion product with the heterologous protein is inferior in terms of quality and purity as compared with the genuine HIV antigen. Also, the production yield is not good. In addition, from the mass-produced fusion protein of the Env protein and the heterologous protein, the junction (junct) between the Env protein and the heterologous protein is obtained.
Ion) is cleaved to remove and purify the fusion protein, and it is not easy to recover a pure Env protein having no heterologous protein in a high yield, and the production cost is high, which is uneconomical. There is also known an example in which an Env protein is also expressed as a fusion protein with a Gag protein of HIV of a certain strain (Japanese Unexamined Patent Publication No. 179687; Virology, 18).
0 , 811-813, 1991 and European Patent Publication No. 307149). However, these fusion proteins are not good in terms of production yield and tend to have high production costs. In other words, the prior art has defects in quality, economy and reliability, and therefore, elimination of such defects is a long-awaited and urgent task from the viewpoint of practicality and industrial use.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の従
来技術に伴う種々の困難、即ち、（１）Ｅｎｖ蛋白は異
種蛋白との融合蛋白として量産可能ではあるが、得られ
た抗原は、非特異的な抗原抗体反応を呈する危険があ
る。従って、斯かる融合蛋白は、その品質や信頼性につ
いて疑問があり、エイズ診断用の抗原として厳密には不
適当であり、実用性に欠けると判断される；及び（２）
ｇａｇとｅｎｖ両遺伝子を、遺伝子工学に係る通常の知
識と常套手段を以て単純に発現させても、Ｇａｇ−Ｅｎ
ｖ融合蛋白は期待の通りには量産できない；等の問題を
克服すべく鋭意研究を重ねた結果、品質や信頼性・生産
性に優れており、実用性や産業上利用の観点から極めて
有利な新規なＨＩＶ抗原の開発に成功した。特に、本発
明者らは、意外にもＧａｇ（３０８−４３７）（但し、
上記括弧内の番号は図１のＧａｇ蛋白の全アミノ酸配列
のアミノ酸番号を示す）で表わされるアミノ酸配列の少
なくとも１０個の連続するアミノ酸よりなる特定のＧａ
ｇペプチドがそのＣ末端においてＥｎｖ（５１２−６９
９）（但し、上記の各々の括弧内の番号は図２のＥｎｖ
蛋白の全アミノ酸配列のアミノ酸番号を示す）で表わさ
れるアミノ酸配列の少なくとも一部よりなり且つ該一部
のアミノ酸配列はＨＩＶ抗体に対し反応性を示す少なく
とも１つのエピトープを含有している特定のＥｎｖペプ
チドが融合してなるＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白を含む特定
の実質的に純粋なＨＩＶ抗原が、優れた抗原性を有する
のみならず、従来では達成し得なかった極めて多量の生
産量で得られることを知見した。Means for Solving the Problems The present inventors have various difficulties associated with the above-mentioned conventional techniques, namely, (1) Env protein can be mass-produced as a fusion protein with a heterologous protein, but the obtained antigen is obtained. Are at risk of developing nonspecific antigen-antibody reactions. Therefore, such a fusion protein has doubts about its quality and reliability, is strictly unsuitable as an antigen for AIDS diagnosis, and is judged to be impractical; and (2).
Even if both the gag and env genes are simply expressed by ordinary knowledge and conventional means related to genetic engineering, Gag-En
The v-fusion protein cannot be mass-produced as expected; as a result of intensive research to overcome such problems, it has excellent quality, reliability, and productivity, and is extremely advantageous from the viewpoint of practicality and industrial use. We succeeded in developing a new HIV antigen. In particular, the present inventors have surprisingly found that Gag (308-437) (however,
The number in the above parentheses indicates the amino acid number of the entire amino acid sequence of the Gag protein of FIG. 1), which is a specific Ga consisting of at least 10 consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by
The g-peptide is Env (512-69 at its C-terminus.
9) (However, the numbers in the parentheses above are the Env of FIG.
Specific Env comprising at least a part of the amino acid sequence represented by (indicating the amino acid number of the entire amino acid sequence of protein), and the part of the amino acid sequence contains at least one epitope reactive with HIV antibody. Specific Substantially Pure HIV Antigens Containing Gag-Env Fusion Proteins Containing Peptides Fused Not Only Have Excellent Antigenicity, and Obtained in Extremely Large Production Yields Unachievable by Conventional Methods I found out.

【０００６】更に、本発明者らは、上記の特定のＧａｇ
−Ｅｎｖ融合蛋白を含むＨＩＶ抗原を設計する過程にお
いて、未熟蛋白であるＧａｇ蛋白の全アミノ酸配列をコ
ードするｇａｇ遺伝子全領域を発現させ、得られるＧａ
ｇ蛋白のＨＩＶ抗体に対する反応性を調べたところ、意
外にも、成熟蛋白であって、従来診断用抗原としての有
用性が知られていた、Ｇａｇ蛋白の部分領域（ｐ１７、
ｐ２４、ｐ１５）に較べて、ＨＩＶ抗体に体する反応性
スペクトルが広く且つ強い反応を示すことを知見した。
本発明は上記の知見に基いて完成したものである。Furthermore, the present inventors have found that the above-mentioned specific Gag is used.
-In the process of designing an HIV antigen containing an Env fusion protein, a Gag gene obtained by expressing the entire region of the gag gene encoding the entire amino acid sequence of the immature protein Gag protein is obtained.
When the reactivity of the g protein with the HIV antibody was examined, surprisingly, it was a mature protein, and a partial region of the Gag protein (p17, which was known to be useful as a diagnostic antigen in the past) (p17,
It was found that the reactivity spectrum of HIV antibody is broader and stronger than that of p24, p15).
The present invention has been completed based on the above findings.

【０００７】従って、本発明の目的は、エイズの試験
薬、抗体作製、診断剤、ワクチン等に用いる抗原とし
て、免疫学的に非特異的反応を生じない、純正かつ高品
質のＨＩＶ抗原を提供することにある。Therefore, an object of the present invention is to provide a genuine and high-quality HIV antigen that does not cause non-specific immunological reaction as an antigen used for AIDS test drug, antibody preparation, diagnostic agent, vaccine, etc. To do.

【０００８】本発明の他の１つの目的は、上記のＧａｇ
−Ｅｎｖ融合蛋白を含むＨＩＶ抗原を効率よく且つ多量
に生産するための製造方法を提供することにある。本発
明の更に他の１つの目的は、上記のＨＩＶ抗原の量産に
優れて有用な組換えＤＮＡをも提供することにある。本
発明のまた更に他の１つの目的は、エイズ診断剤を提供
することである。本発明のまた更に他の１つの目的は、
エイズワクチンを提供することである。Another object of the present invention is the above-mentioned Gag.
-To provide a production method for efficiently producing a large amount of HIV antigen containing an Env fusion protein. Still another object of the present invention is to provide a recombinant DNA which is excellent in mass production of the above HIV antigen and is useful. Still another object of the present invention is to provide an AIDS diagnostic agent. Yet another object of the present invention is to
It is to provide AIDS vaccine.

【０００９】上記の本発明の諸特徴及び諸利益は、添付
の図面を参照しながら以下の詳細な説明から明らかにな
ろう。The features and benefits of the present invention described above will become apparent from the following detailed description with reference to the accompanying drawings.

【００１０】即ち、本発明の１つの態様によれば、Ｇａ
ｇペプチドがそのＣ末端においてＥｎｖペプチドと融合
してなるＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白を含む実質的に純粋な
ＨＩＶ抗原が提供される。上記のＧａｇペプチドは、Ｇ
ａｇ(３０８−４３７)で表わされるアミノ酸配列の少な
くとも１０個の連続したアミノよりなり（但し、上記括
弧内の番号は図１のＧａｇ蛋白の全アミノ酸配列のアミ
ノ酸番号を示す）、上記のＥｎｖペプチドは、Ｅｎｖ
（５１２−６９９）で表わされるアミノ酸配列の少なく
とも一部よりなり且つ該一部のアミノ酸配列はＨＩＶ抗
体に対し反応性を示す少なくとも１つのエピトープを含
有している（但し、上記の各々の括弧内の番号は図２の
Ｅｎｖ蛋白の全アミノ酸配列のアミノ酸番号を示す）。That is, according to one aspect of the present invention, Ga
A substantially pure HIV antigen is provided that comprises a Gag-Env fusion protein in which the g peptide is fused at its C-terminus to the Env peptide. The above Gag peptide is G
Env peptide consisting of at least 10 consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by ag (308-437) (provided that the numbers in the above parentheses indicate the amino acid numbers of the entire amino acid sequence of the Gag protein of FIG. 1). Is Env
(512-699) consisting of at least a part of the amino acid sequence, and the part of the amino acid sequence contains at least one epitope showing reactivity with an HIV antibody (provided that each of the above parentheses is in parentheses). Indicates the amino acid number of the entire amino acid sequence of Env protein in FIG. 2).

【００１１】本発明において、各種のＧａｇペプチド及
びＥｎｖペプチドの各アミノ酸領域は、上記のように括
弧内に示し、括弧内の番号は、Ｇａｇペプチドについて
は図１のＧａｇ蛋白の全アミノ酸配列のアミノ酸番号を
示し、Ｅｎｖペプチドについては図２のＥｎｖ蛋白の全
アミノ酸配列のアミノ酸番号を示す。又、特にことわり
のない限り、アミノ酸配列の左端と右端は、それぞれＮ
末端とＣ末端であり、アミノ酸残基については、Ａｓｐ
はアスパラギン酸、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｌｙｓはリ
ジン、Ａｒｇはアルギニン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ａｓ
ｎはアスパラギン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｓｅｒはセリ
ン、Ｔｈｒはトレオニン、Ｔｙｒはチロシン、Ｃｙｓは
システイン、Ｔｒｐはトリプトファン、Ｐｈｅはフェニ
ルアラニン、Ｇｌｙはグリシン、Ａｌａはアラニン、Ｖ
ａｌはバリン、Ｌｅｕはロイシン、Ｉｌｅはイソロイシ
ン、Ｐｒｏはプロリン、Ｍｅｔはメチオニンを示す。In the present invention, the amino acid regions of various Gag peptides and Env peptides are shown in parentheses as described above, and the numbers in the parentheses are the amino acids of the entire amino acid sequence of the Gag protein of FIG. 1 for Gag peptides. No. is shown, and for Env peptide, the amino acid number of the entire amino acid sequence of Env protein in FIG. 2 is shown. Unless otherwise specified, the left and right ends of the amino acid sequence are N
It is the terminal and C-terminal, and Asp for amino acid residues
Is aspartic acid, Glu is glutamic acid, Lys is lysine, Arg is arginine, His is histidine, As.
n is asparagine, Gln is glutamine, Ser is serine, Thr is threonine, Tyr is tyrosine, Cys is cysteine, Trp is tryptophan, Phe is phenylalanine, Gly is glycine, Ala is alanine, V
al represents valine, Leu represents leucine, Ile represents isoleucine, Pro represents proline, and Met represents methionine.

【００１２】上記のＥｎｖペプチドに含まれるエピトー
プは、Ｅｎｖ（５１２−６９９）で表わされるアミノ酸
配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸よりなること
が好ましい。The epitope contained in the above Env peptide preferably consists of at least 5 consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by Env (512-699).

【００１３】本発明のＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白のＧａｇ
ペプチドは、Ｇａｇ（３０８−４３７）で表わされるア
ミノ酸配列の少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含
んでいるが、好ましくはＧａｇ（３０８−４３７）で表
わされるアミノ酸配列の少なくとも３０個、更に好まし
くは少なくとも５０個、更に好ましくは少なくとも７０
個の連続したアミノ酸を含むことができる。最も好まし
いＧａｇペプチドは、Ｇａｇ（３０８−４０６）とＧａ
ｇ（３０８−４３７）で表わされるアミノ酸配列からな
るものである。また、一方、本発明のＧａｇ−Ｅｎｖ融
合蛋白において、ＧａｇペプチドがＧａｇ蛋白の全アミ
ノ酸配列の第３０７番目のアミノ酸からＮ端側の領域を
有する、及び／又はＧａｇ蛋白の全アミノ酸配列の第４
３８番目のアミノ酸からＣ端側の領域を有すると、Ｇａ
ｇ−Ｅｎｖ融合蛋白の産生量が低下するので好ましくな
い。Gag of the Gag-Env fusion protein of the present invention
The peptide comprises at least 10 consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by Gag (308-437), but preferably at least 30 of the amino acid sequence represented by Gag (308-437), more preferably at least 50, more preferably at least 70
It can include a contiguous number of amino acids. The most preferred Gag peptides are Gag (308-406) and Ga.
It consists of the amino acid sequence represented by g (308-437). On the other hand, in the Gag-Env fusion protein of the present invention, the Gag peptide has a region from the 307th amino acid to the N-terminal side of the entire amino acid sequence of the Gag protein, and / or the fourth amino acid sequence of the entire Gag protein.
If the region at the C-terminal side from the 38th amino acid is present, Ga
It is not preferable because the production amount of the g-Env fusion protein decreases.

【００１４】本発明において、Ｇａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白
の優れた抗原性及び生産性を達成するために、Ｅｎｖペ
プチドは、Ｅｎｖ（５１２−６９９）で表わされるアミ
ノ酸配列の少なくとも一部よりなり且つ該一部のアミノ
酸配列がＨＩＶ抗体に対し反応性を示す少なくとも一つ
のエピトープを含んでいるペプチドであることが必要で
ある。上記のＥｎｖペプチドのエピトープは、Ｅｎｖ
（５１２−６９９）で表わされるアミノ酸配列の少なく
とも５個、好ましくは少なくとも１０個、また更に好ま
しくは少なくとも１５個の連続したアミノ酸よりなる。In the present invention, in order to achieve excellent antigenicity and productivity of the Gag-Env fusion protein, the Env peptide consists of at least a part of the amino acid sequence represented by Env (512-699), and It is necessary that the partial amino acid sequence is a peptide containing at least one epitope reactive with HIV antibody. The above-mentioned Env peptide epitope is Env
It consists of at least 5, preferably at least 10, and more preferably at least 15 contiguous amino acids of the amino acid sequence represented by (512-699).

【００１５】このような本発明のＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋
白は、上記の特定のＧａｇペプチドをコードするｇａｇ
遺伝子の下流に、ＨＩＶ抗原の少なくとも１つのエピト
ープを含む上記の特定のＥｎｖペプチドをコードするｅ
ｎｖ遺伝子を連係して、ｇａｇ−ｅｎｖ融合遺伝子を含
む組換えＤＮＡを作製し、発現させることによって、遺
伝子工学的に有利に製造することができる。即ち、本発
明によれば、上記の特定の該ｇａｇ−ｅｎｖ融合遺伝子
を発現させることにより、ＨＩＶ抗体を極めて高い確率
で検出できる高いＨＩＶ抗原性を有するのみならず、従
来では達成し得なかった高い生産性をもってＨＩＶ抗原
を量産することのできるＨＩＶ抗原の実現に初めて成功
したのである。Such a Gag-Env fusion protein of the present invention is a gag encoding the above specific Gag peptide.
Downstream of the gene, e encoding the above specific Env peptide containing at least one epitope of the HIV antigen
The recombinant DNA containing the gag - env fusion gene is produced by linking the nv gene, and the recombinant DNA is expressed, whereby it can be advantageously produced in genetic engineering. That is, according to the present invention, by expressing the above-mentioned specific gag - env fusion gene, not only has a high HIV antigenicity capable of detecting an HIV antibody with an extremely high probability, but it could not be achieved in the past. For the first time, we have succeeded in realizing an HIV antigen that can be mass-produced with high productivity.

【００１６】このように、本発明のＨＩＶ抗原のＧａｇ
−Ｅｎｖ融合蛋白は、種々のＨＩＶ抗体に対し１００％
の反応性を示すことから、診断用抗原として極めて有用
であるのみならず、ＨＩＶワクチンの有効成分としても
有用である。Thus, the HIV antigen Gag of the present invention is
-Env fusion protein is 100% against various HIV antibodies
Therefore, it is not only extremely useful as a diagnostic antigen, but also as an active ingredient of an HIV vaccine.

【００１７】Ｇａｇ蛋白抗原としては、前記したよう
に、Ｇａｇ蛋白の部分的なペプチドについての有用性が
報告されているが（特開平４−１１７２８９等）、Ｇａ
ｇ蛋白全体（ｐ５５）、即ちＧａｇの全アミノ酸配列の
診断用抗原としての有用性は今だ報告されていない。こ
れは、ｐ５５がＨＩＶ粒子の形成過程において非常に不
安定で未熟な存在であり、通常は直ちにプロセッシング
されて、成熟したｐ１７、ｐ２４及びｐ１５に分化して
しまうため、そのような未熟なものを抗原として用いる
ことは思いもよらなかったからである。ところが本発明
者らが後述の実施例２のステップ２に示すように、遺伝
子工学的に作製したｐ５５とｐ１７、ｐ２４及びｐ１５
とのＨＩＶキャリアー血清中のそれぞれの抗体との反応
性を比較したところ、ｐ５５が最も検出率が高く、また
他の抗原に較べ少量でその抗体と反応することを意外に
も知見した。即ち、ｐ５５は単独でもＡＩＤＳ診断用抗
原として用いることもできるし、上記の本発明のＧａｇ
−Ｅｎｖ融合蛋白と混合すれば、その反応性が更に信頼
性のおけるものになる。As described above, the usefulness of a partial peptide of Gag protein has been reported as a Gag protein antigen (Japanese Patent Laid-Open No. 4-117289, etc.),
The utility of the whole g protein (p55), ie, the entire amino acid sequence of Gag, as a diagnostic antigen has not been reported yet. This is because immature p55 is a very unstable and immature entity in the process of forming HIV particles and is usually processed immediately to differentiate into mature p17, p24 and p15. It was because I never expected to use it as an antigen. However, as shown in step 2 of Example 2 described later by the present inventors, p55 and p17, p24 and p15 which were genetically engineered were prepared.
As a result of comparison of the reactivity with each antibody in the HIV carrier serum with p., It was surprisingly found that p55 has the highest detection rate and reacts with the antibody in a small amount as compared with other antigens. That is, p55 can be used alone or as an AIDS diagnostic antigen, and the above-mentioned Gag of the present invention can be used.
When mixed with the -Env fusion protein, its reactivity becomes more reliable.

【００１８】即ち、本発明の他の態様によれば、上記の
Ｇａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白を含むＨＩＶ抗原と、図１のＧ
ａｇ蛋白の全アミノ酸配列であるＧａｇ（１−５００）
で表わされるアミノ酸配列を含むＧａｇ蛋白との混合物
を含む実質的に純粋なＨＩＶ抗原が提供される。That is, according to another embodiment of the present invention, an HIV antigen containing the above-mentioned Gag-Env fusion protein and G in FIG.
Gag (1-500), which is the entire amino acid sequence of the ag protein
There is provided a substantially pure HIV antigen containing a mixture with a Gag protein containing the amino acid sequence represented by:

【００１９】又、本発明の更に他の態様によれば、図１
のＧａｇ蛋白の全アミノ酸配列であるＧａｇ（１−５０
０）で表わされるアミノ酸配列を含み実質的に単離され
た形のＧａｇ蛋白からなる実質的に純粋なＨＩＶ抗原が
提供される。According to still another aspect of the present invention, FIG.
Of the entire amino acid sequence of the Gag protein of Gag (1-50
There is provided a substantially pure HIV antigen comprising a Gag protein in a substantially isolated form, which comprises the amino acid sequence represented by 0).

【００２０】以下、本発明につき更に詳述する。本質的
に、本発明は次のＩ〜IIIの手順からなされたものであ
る。手順I. Ｅｎｖ蛋白について、ＨＩＶ抗体に対して反応
性を有する部分領域の決定：種々のｅｎｖ遺伝子断片を
多量発現遺伝子、例えば、ｌａｃＺ遺伝子の下流に連係
し、各種Ｅｎｖ領域をＬａｃＺ蛋白（β−ガラクトシダ
ーゼ）との融合蛋白として発現させる。次いで、斯かる
発現産物につき、エイズ患者、無症候性ＨＩＶキャリア
ー（ＡＣ）、及びエイズ関連症候群（ＡＲＣ）に由来す
る各種血清の多数種の血清との間で免疫学的反応を行
い、陽性を呈するＥｎｖ蛋白エピトープ領域を同定す
る。手順II. Ｇａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白の生産及びＨＩＶ抗体
との反応性の確認:上記の手順Iで決定した、エピトープ
を含むＥｎｖペプチドをコードするｅｎｖ遺伝子断片群
と、Ｇａｇペプチドをコードするｇａｇ遺伝子断片群と
の種々の組合せについて、生産性及び抗原性の面から好
ましいＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白を決定するために、各ｇ
ａｇ遺伝子の下流に、ｅｎｖ遺伝子各種領域をコードす
る遺伝子を融合させ、プロモーター制御下でｇａｇ−ｅ
ｎｖ融合遺伝子を発現させ、ＥｎｖペプチドをＧａｇ−
Ｅｎｖ融合蛋白の形で産生し、最も多量に産生されるＧ
ａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白についてＨＩＶ抗体との反応性を
確認する。手順III. Ｇａｇ蛋白の全アミノ酸配列を有するＧａｇ
蛋白ｐ５５の反応性の確認：上記の手順IIと同様にして
ｐ５５と、ｐ１７、ｐ２４及びｐ１５を産生させ、ＨＩ
Ｖ患者血清中とのそれぞれの抗体との反応性を比較し、
ｐ５５が最も反応性が強く且つ検出率も高いことを確認
する。The present invention will be described in more detail below. In essence, the invention is made up of the following steps I-III. Procedure I. Determining partial region of Env protein having reactivity with HIV antibody: Various env gene fragments are linked downstream of a highly expressed gene, for example, lacZ gene, and various Env regions are linked to LacZ protein (β- It is expressed as a fusion protein with galactosidase). Then, an immunological reaction is performed between the expression product and many types of sera derived from AIDS patients, asymptomatic HIV carriers (AC), and AIDS-related syndromes (ARC), and a positive result is obtained. The presenting Env protein epitope region is identified. . Procedure II Gag-Env fusion protein production and confirmation of reactivity with HIV antibody: determined above procedure I, the env gene fragments which encode Env peptides containing epitope, gag gene fragment encoding the Gag peptide In order to determine the preferred Gag-Env fusion protein in terms of productivity and antigenicity for various combinations with groups, each g
Genes encoding various regions of the env gene were fused downstream of the ag gene, and gag - e under the control of a promoter.
The nv fusion gene was expressed, and the Env peptide was labeled with Gag-
Produced in the form of Env fusion protein, the most abundant G
The reactivity of the ag-Env fusion protein with the HIV antibody is confirmed. Procedure III. Gag with the complete amino acid sequence of Gag protein
Confirmation of reactivity of protein p55: p55, p17, p24 and p15 were produced in the same manner as in the above procedure II, and HI
The reactivity with each antibody in V patient serum was compared,
Confirm that p55 is the most reactive and has a high detection rate.

【００２１】次に、上述のＩ〜IIIの手順を行う上で必
要な諸技術について述べる。（１）ＨＩＶのｇａｇ及び／又はｅｎｖ遺伝子のｃＤＮ
Ａ断片の調製：ＨＩＶのｇａｇ遺伝子の全領域またはそ
の部分断片、及びｅｎｖ遺伝子の全領域またはその部分
断片が使用できる。斯かる全領域またはその部分断片
は、多量発現ベクター内に解読粋を一致させて挿入連係
することにより使用する。尚、組換えＤＮＡ技術による
遺伝子発現では、ＨＩＶゲノムがＲＮＡであるため、上
記各遺伝子は、これと相補的なｃＤＮＡ断片に変換して
使用する。斯かるｃＤＮＡ断片は、宿主染色体に組み込
まれているプロウイルスゲノムやクローン化された非組
込み型の環状ＤＮＡから調製することができる。また、
ウイルス粒子から抽出したゲノムＲＮＡを鋳型として使
用し、逆転写酵素を用いる公知の常法により作製したｃ
ＤＮＡライブラリーから選別し調製することも可能であ
る。しかしながら、上述の調製では危険度の高いＨＩＶ
を直接取り扱うため、生物災害防止の観点から、必ずし
も容易でない。従って、該ウイルスによる生物災害を回
避すると共に、上記調製工程の省力化を図るには、公知
かつ既製のＨＩＶ遺伝子ｃＤＮＡクローンの使用が推奨
される。即ち、現在既に、ＨＩＶ遺伝子に係るクローニ
ング、制限酵素地図の作製、塩基配列の決定等が世界各
地の研究者により報告されているので、これ等の成果の
活用が安全かつ簡便であり、望ましい。例えば、ＨＩＶ
−１プロウイルスゲノムクローンであるプラスミドｐＮ
Ｌ３−１、ＰＮＬ３−２、及びｐＮＬ４−３（Ｊｏｕｒ
ｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，第５９巻、２８４−
２９１ページ、１９８６年；ＰＮＬ４−３についてはＧ
ｅｎＢａｎｋｄａｔａｆｉｌｅＨＩＶＮＬ４３；
米国ＮＩＨより入手可能である）がある。これより作製
した、ＨＩＶ−１遺伝子部分断片を有するプラスミドを
保有している寄託菌株としては、以下のものが挙げられ
る。ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子中央領域を有するＥ．ｃｏｌ
ｉＪＭ１０９／ｐＣＶ９１（微工研条寄第３１９５
号）、ｇａｇ遺伝子５’末端側１／２領域を有するＥ．
ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＮＬＨ１２２（微工研条寄第
３１９６号）、ｇａｇ遺伝子全領域を有するＥ．ｃｏｌ
ｉＪＭ１０９／ｐＴＧ５８１（微工研条寄第３９２７
号）、ｅｎｖ遺伝子全領域を有するＥ．ｃｏｌｉＪＭ
１０９／ｐＮＳ２１０（微工研条寄第３９２０号）、Ｅ
ｎｖ蛋白のＥｎｖ（５１２−６１１）領域をコードする
ｃＤＮＡを有するＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＴＥ１
９２（微工研条寄第３９２５号）、及びＧａｇ−Ｅｎｖ
融合蛋白のＧａｇ（３０８−４０６）−Ｅｎｖ（５１２
−６１１）領域をコードするｃＤＮＡを有するＪＭ１０
９／ｐＧＥ３３（微工研条寄第３９２３号）等が使用で
きる。ｃＤＮＡ断片の調製は、公知の常法、例えば、上
述のクローンから必要領域のＤＮＡを制限酵素で切出し
た後、フェノール抽出、クロロホルム処理、エタノール
沈澱等により精製し行うことができる。尚、ＤＮＡ断片
の切出しに使用する制限酵素は、各クローンの制限酵素
地図を参考にして適宜選択できる。Next, various techniques necessary for carrying out the above procedures I to III will be described. (1) HIV gag and / or env gene cDNA
Preparation of A fragment: The entire region of HIV gag gene or a partial fragment thereof, and the entire region of env gene or a partial fragment thereof can be used. The entire region or a partial fragment thereof is used by inserting and coordinating the encoded fragments in the large expression vector. In the gene expression by the recombinant DNA technique, the HIV genome is RNA, so the above genes are used after being converted into cDNA fragments complementary thereto. Such a cDNA fragment can be prepared from a provirus genome integrated into the host chromosome or a cloned non-integrated circular DNA. Also,
Using genomic RNA extracted from virus particles as a template and prepared by a known conventional method using reverse transcriptase c
It is also possible to select and prepare from a DNA library. However, in the above-mentioned preparation, high-risk HIV
Is directly handled, so it is not always easy from the viewpoint of preventing biological disasters. Therefore, it is recommended to use a known and ready-made HIV gene cDNA clone in order to avoid the biohazard caused by the virus and to save labor in the above-mentioned preparation process. That is, since cloning of the HIV gene, construction of restriction enzyme maps, determination of nucleotide sequences, etc. have already been reported by researchers all over the world, it is safe and convenient to utilize these results, and it is desirable. For example, HIV
-1 Provirus genomic clone, plasmid pN
L3-1, PNL3-2, and pNL4-3 (Jour
nal of Virology, Volume 59, 284-
291 p. 1986; G for PNL4-3
enBank data file HIVNL43;
(Available from NIH, USA). The deposited strains carrying the plasmid having the HIV-1 gene partial fragment prepared therefrom include the following. E. coli having the central region of the gag - pol gene . col
i JM109 / pCV91
No.), E. coli having a 5 ′ terminal half region of the gag gene .
E. coli JM109 / pNLH122 (Ministry of Industrial Science and Technology No. 3196), E. coli having the entire gag gene region . col
i JM109 / pTG581
No.), E. having env gene all areas coli JM
109 / pNS210 (Ministry of Industrial Science, Article No. 3920), E
E. coli having a cDNA encoding the Env (512-611) region of the nv protein . coli JM109 / pTE1
92 (Ministry of Mechanical Engineering, Article 3925), and Gag-Env
The fusion protein Gag (308-406) -Env (512
-611) JM10 having a cDNA encoding the region
9 / pGE33 (Microtechnical Laboratory No. 3923) can be used. The preparation of the cDNA fragment can be carried out by a known conventional method, for example, by cutting out the DNA of the required region from the above-mentioned clone with a restriction enzyme and then purifying it by phenol extraction, chloroform treatment, ethanol precipitation and the like. The restriction enzyme used for excising the DNA fragment can be appropriately selected with reference to the restriction enzyme map of each clone.

【００２２】（２）ｇａｇ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子及びｇ
ａｇ−ｅｎｖ融合遺伝子の発現プラスミドの構築、及び
該プラスミドを移入した形質転換体の作製：上述に従っ
て調製したＨＩＶ遺伝子ｃＤＮＡ断片を、公知の常法、
例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて多量発現遺伝子内
または遺伝子直接発現ベクター内に挿入連係することに
より、ＨＩＶ遺伝子発現プラスミドを構築する。尚、本
発明に係る上記用語「プラスミド」は便宜的表記のため
に使用されており、実質的には広くＨＩＶ遺伝子を発現
するレプリコンを意味する。従って、斯かるプラスミド
の構築には、公知または市販の発現用のベクター、例え
ば、腸内細菌科のプラスミドベクターｐＳＮ５０８系列
（米国特許第４，７０３，００５号）、酵母のプラスミ
ドベクターｐＪＭ１０５（特開昭６２−２８６９３０）
とｐＢＨ１０３系列（特開昭６３−２２０９８）、弱毒
水痘ウイルス・ベクター（特開昭５３−４１２０２）、
弱毒マレック病ウイルス・ベクター（欧州公開特許第３
３４５３０号）、大腸菌のプラスミドベクターｐＵＲ２
９０系列（ｐＵＲ２９０，２９１及び２９２）（ＥＭＢ
ＯＪｏｕｒｎａｌ、第２巻、１７９１−１７９４、１
９８３年）、ｐＳＮ５１８２（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１５７巻、９０９−９１
７ページ、１９８４年）及びｐＴ７系列（Ｐｒｏｃｅｅ
ｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａ
ｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ［ＵＳＡ］、第８
２巻、１０７４−１０７８ページ、１９８５年）等が使
用できる。発現ベクターの構築に於いて重要なことは、
上述の遺伝子を強力なプロモーターの制御下に挿入連係
すること、または発現量の多い遺伝子と連係することで
ある。例えば、上述のｐＵＲ２９０系列を用いる場合に
はｌａｃＺの遺伝子の下流に、ｐＳＮ５１８２ではｐｓ
ｔＳ遺伝子の下流に、また、上記ｐＴ７系列のｐＴ７−
７ではＴ７プロモーター下流にあるマルチクローニング
部位に夫々、該遺伝子を挿入連係することが好ましい。
ｐＴ７−７は、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子及
びｇａｇ−ｅｎｖ融合遺伝子の発現に関し、相性が特に
よく、そのＴ７プロモーターは極めて強力なプロモータ
ーであるので、本発明において特に好ましく用いること
ができる。尚、斯かる遺伝子の挿入連係に際し、注意す
べき点は、制限酵素で開裂した後のプラスミドについて
はＢＡＰ（ｂａｃｔｅｒｉａｌａｌｋａｌｉｎｅｐｈ
ｏｓｐｈａｔａｓｅ）で前処理しリン酸基を除去するこ
とにより、そのｓｅｌｆｌｉｇａｔｉｏｎを防止す
る；翻訳が円滑に進行するようプラスミドと挿入遺伝子
相互のコドン解読枠を一致させる等である。特に、挿入
するＨＩＶ遺伝子の解読枠が多量発現遺伝子のそれと一
致するように連係することにより、ＨＩＶ遺伝子の発現
量は保証される。尚、上記解読枠の一致は、制限酵素、
ヌクレアーゼＢａｌ３１、マングビーン（ｍｕｎｇｂ
ｅｅｎ）ヌクレアーゼ等の酵素を用いる公知の常法によ
り達成できる。また、構築した発現ベクターを移入し形
質転換体を得る目的で用いる最適な受容細胞は、その発
現ベクターの複製と発現とを許容する感受性宿主細胞か
ら選択し、同時に、斯かる宿主細胞のうち、構築した発
現ベクターの移入が容易かつ確実に検出できる細胞を厳
選して使用する。例えば、発現用ベクターとして上述の
ｐＳＮ系列を用いる場合には受容菌として、該ベクター
移入による形質転換体を薬剤耐性をマーカーとして選別
できる大腸菌Ｃ７５株（微工研菌寄第１０１９１号）の
使用が好ましく、また、ｐＵＲ２９０系列及びｐＴ７系
列を用いる場合には、このベクターが移入された形質転
換体をアンピシリン耐性をマーカーとして選別できる大
腸菌ＵＴ４８１株（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ、第１６３巻、第１号、３７６−３８４
ページ、１９８５年）及び大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株
（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏ
ｌｏｇｙ、第１８９巻、第１号、１１３−１３０ペー
ジ、１９８６年）、ＪＭ１０９(ＤＥ３)株(Ｊｏｕｒｎ
ａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１
８９(１)，１１３−１３０，１９８６；Ｇｅｎｅ，３３
(１)，１０３−１１９，１９８５)、ＪＭ１０３株（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，第９
巻、３０９−３２１ページ、１９８１年）等が、夫々、
使用できる。斯かる受容細胞への発現ベクターの移入
は、公知の常法、例えば、塩化カルシウム化法（Ｊｏｕ
ｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ
ｙ、第５３巻、１５４−１６２ページ、１９７０年）に
より行うことができる。また、ｇａｇ遺伝子、ｅｎｖ遺
伝子またはｇａｇ−ｅｎｖ融合遺伝子発現プラスミドが
移入された形質転換体は、上記マーカーが陽性のコロニ
ーから選別する。次に、選別された形質転換体コロニー
から該発現ベクターＤＮＡを抽出の後、制限酵素で切断
し、これをアガロースゲル電気泳動にかけ、挿入連係さ
れたＤＮＡ断片のサイズを測定すると共に、該遺伝子Ｄ
ＮＡ断片の存在が確認されたコロニーを、ＨＩＶ遺伝子
発現の形質転換体クローンとして採用する。(2) gag gene, env gene and g
Construction of expression plasmid of ag - env fusion gene and preparation of transformant into which the plasmid was introduced: HIV gene cDNA fragment prepared as described above was prepared by a known conventional method,
For example, an HIV gene expression plasmid is constructed by using T4 DNA ligase and inserting and linking it in a gene for large expression or a gene direct expression vector. The term “plasmid” according to the present invention is used for the sake of convenience and substantially means a replicon that broadly expresses the HIV gene. Therefore, for the construction of such a plasmid, a known or commercially available expression vector, for example, the plasmid vector pSN508 series of Enterobacteriaceae (US Pat. No. 4,703,005), the yeast plasmid vector pJM105 (JP 62-286930)
And pBH103 series (JP-A-63-22098), attenuated chickenpox virus vector (JP-A-53-41202),
Attenuated Marek's disease virus vector (European published patent No. 3
34530), a plasmid vector pUR2 of E. coli.
90 series (pUR290, 291 and 292) (EMB
O Journal, Volume 2, 1791-1794, 1
983), pSN5182 (Journal of
Bacterology, Volume 157, 909-91.
7 pages, 1984) and pT7 series (Procee)
dings of the National Aca
demy of Sciences [USA], 8th
Volume 2, pages 1074-1078, 1985) and the like can be used. What is important in constructing an expression vector is
Insertion linkage of the above-mentioned genes under the control of a strong promoter, or linkage with a gene with high expression level. For example, when the above-mentioned pUR290 series is used, it is located downstream of the lacZ gene, and when pSN5182 contains ps.
Downstream of the tS gene, and pT7- of the pT7 series described above.
In 7, it is preferable that the gene is inserted and linked to each of the multiple cloning sites downstream of the T7 promoter.
pT7-7 is particularly compatible with the expression of the HIV gag gene, env gene and gag - env fusion gene, and the T7 promoter is an extremely strong promoter and therefore can be particularly preferably used in the present invention. In addition, regarding the insertion linkage of such a gene, a point to be noted is that BAP (bacterial alkaline ph
by pretreatment with osphatase) to remove the phosphate group and prevent its self ligation; for example, the codon reading frames of the plasmid and the inserted gene should be aligned so that translation proceeds smoothly. In particular, the expression level of the HIV gene is guaranteed by linking the HIV gene to be inserted so that the reading frame of the HIV gene matches that of the highly expressed gene. In addition, the agreement of the above-mentioned reading frame is the restriction enzyme,
Nuclease Bal31, mung bean
een) It can be achieved by a known conventional method using an enzyme such as nuclease. Further, the optimal recipient cell used for the purpose of obtaining a transformant by transfecting the constructed expression vector, is selected from susceptible host cells that allow replication and expression of the expression vector, and at the same time, among such host cells, Cells are selected carefully so that the constructed expression vector can be easily and reliably detected. For example, in the case of using the above-mentioned pSN series as an expression vector, use of Escherichia coli C75 strain (Microtechnology Research Institute No. 10191) capable of selecting a transformant obtained by transfection of the vector with drug resistance as a marker is used as a recipient bacterium. Preferably, when using the pUR290 series and the pT7 series, E. coli UT481 strain (Journal of Bacte) capable of selecting a transformant into which this vector has been transferred using ampicillin resistance as a marker.
riology, Volume 163, Issue 1, 376-384
Page, 1985) and E. coli BL21 (DE3) strain (Journal of Molecular Bio).
, 189, No. 1, pp. 113-130, 1986, JM109 (DE3) strain (Journ.
al of Molecular Biology, 1
89 (1), 113-130, 1986; Gene, 33.
(1), 103-119, 1985), JM103 strain (N
ucleic Acids Research, No. 9
Vol. 309-321, 1981), etc., respectively.
Can be used. Transfer of the expression vector into such a recipient cell is known in the art, for example, calcium chloride method (Jou.
rnal of Molecular Biolog
y, 53, pp. 154-162, 1970). In addition, a transformant into which the gag gene, env gene or gag - env fusion gene expression plasmid has been transferred is selected from colonies positive for the above marker. Next, the expression vector DNA is extracted from the selected transformant colonies, cleaved with a restriction enzyme, and subjected to agarose gel electrophoresis to measure the size of the DNA fragment linked with the insertion of the gene D.
A colony confirmed to have the NA fragment is adopted as a transformant clone for HIV gene expression.

【００２３】（３）ＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）
−Ｅｎｖ融合蛋白の量産：上記（２）の要領にて、例え
ば、下記（５）の各種Ｅｎｖペプチドをコードするｅｎ
ｖ遺伝子断片（表１）をｐＵＲ２９０，ｐＵＲ２９１ま
たはｐＵＲ２９２のいずれかを用いてクローニングする
ことにより、融合蛋白の多量発現が可能である。このＬ
ａｃＺ−Ｅｎｖ融合蛋白において、そのβ−ガラクトシ
ダーゼ（ＬａｃＺ）は、一部の無症候性ＨＩＶキャリア
ーや非感染者の血清と反応し、疑陽性を呈する場合があ
る。しかし、例えば、公知の方法により、あらかじめＬ
ａｃＺ蛋白で血清中の抗ＬａｃＺ抗体を吸収するか、融
合蛋白のＬａｃＺ部位を抗ＬａｃＺ抗体でマスクすれば
上記の弱い凝集反応を押さえることができ、エイズ診断
用の抗原として用いることができる。(3) LacZ (β-galactosidase)
-Mass production of Env fusion protein: As described in (2) above, for example, en encoding various Env peptides in (5) below.
By cloning the v gene fragment (Table 1) using either pUR290, pUR291 or pUR292, a large amount of fusion protein can be expressed. This L
In the acZ-Env fusion protein, its β-galactosidase (LacZ) reacts with some asymptomatic HIV carriers and the serum of non-infected individuals, and may give a false positive. However, for example, by a known method, L
If the anti-LacZ antibody in the serum is absorbed by the acZ protein or the LacZ site of the fusion protein is masked by the anti-LacZ antibody, the above weak agglutination reaction can be suppressed and it can be used as an antigen for AIDS diagnosis.

【００２４】（４）形質転換体クローンによるｇａｇ遺
伝子、ｅｎｖ遺伝子及びｇａｇ−ｅｎｖ融合遺伝子の発
現の確認：上記（２）で得た形質転換体クローンによる
遺伝子発現の確認は、例えば、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＰＡＧＥ）やウェスタンブロット法等を用い
て、該クローン培養物の粗抽出液を分析して行うことが
できる。粗抽出液は、例えば、形質転換体を公知の培地
中で培養の後、低速遠心により集菌し、これをドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と２−メルカプトエタノール
で処理し、次いで、高速遠心にかけ、その上清を採取す
ることにより調製できる。斯かる上清は、例えば、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにかけて分画の後、分画バンドをＣＢＢ
（クーマシーブリリアント青）で染色し多量発現の有無
を確認できる。また、ウェスタンブロット法を用いる場
合には、多種多様に市販されている各種材料を用い、常
法に従って、次の順序で行うことができる：上記粗抽出
液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける；分画した蛋白質バンド
をトランスブロットセルを用いてニトロセルロース膜や
ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ
膜上に転移させる；該膜をゼラチン液やスキムミルク液
に浸しブロッキングする。そして以下、例えば、斯かる
膜上の被検体がＨＩＶの遺伝子産物の場合には、無症候
性ＨＩＶキャリアー血清と一次反応させる；これを洗浄
の後、更に、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体と
二次反応させる；これを洗浄の後、過酸化水素液と発色
剤で発色させ、ＨＩＶキャリアー血清と特異的に反応す
るバンドを検出することにより、上記クローンでのＨＩ
Ｖのｇａｇ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子及びｇａｇ−ｅｎｖ融
合遺伝子の発現を確認する。(4) Confirmation of expression of gag gene, env gene and gag - env fusion gene by transformant clone: Confirmation of gene expression by the transformant clone obtained in the above (2) can be carried out by, for example, polyacrylamide gel. The crude extract of the clone culture can be analyzed and analyzed by electrophoresis (PAGE), Western blotting, or the like. The crude extract is obtained by, for example, culturing the transformant in a known medium, collecting the cells by low-speed centrifugation, treating this with sodium dodecyl sulfate (SDS) and 2-mercaptoethanol, and then subjecting it to high-speed centrifugation, It can be prepared by collecting the supernatant. Such a supernatant is, for example, SD
After fractionation by S-PAGE, the fractionation band is CBB
(Coomassie Brilliant Blue) can be stained to confirm the presence or absence of large amounts of expression. When the Western blotting method is used, various commercially available materials can be used, and can be performed in the following order according to a conventional method: The above crude extract is subjected to SDS-PAGE; The protein band was analyzed by a transblot cell using a nitrocellulose membrane or polyvinylidene difluoride.
Transfer to the membrane; block the membrane by immersing it in gelatin or skim milk. Then, for example, in the case where the analyte on such a membrane is a gene product of HIV, it is subjected to a primary reaction with asymptomatic HIV carrier serum; this is washed, and then a peroxidase-labeled anti-human IgG antibody and a secondary antibody are added. React; after washing, this is developed with a hydrogen peroxide solution and a coloring agent, and a band that specifically reacts with the HIV carrier serum is detected to detect HI in the above clones.
The expression of V gag gene, env gene and gag - env fusion gene is confirmed.

【００２５】（５）Ｅｎｖペプチドについて、ＨＩＶ抗
体に対して反応性を示すエピトープを含む部分領域の決
定：例えば、上記（３）のＬａｃＺ−Ｅｎｖ融合蛋白の
イムノブロット法（４）における反応性を調べることに
より行うことができる。この方法によれば、図２に記載
のアミノ酸配列からなるＥｎｖ蛋白において、ＨＩＶ抗
体に対して反応性を示すエピトープを含む部分領域は、
次のアミノ酸配列群Ｅｎｖ（１４−２４４），Ｅｎｖ（１４−４３７），Ｅ
ｎｖ（１４−６１１），Ｅｎｖ（１７５−３６３），Ｅ
ｎｖ（２２４−５１０），Ｅｎｖ（２４４−６１１），
Ｅｎｖ（２４４−４３４），Ｅｎｖ（２４４−４３
７），Ｅｎｖ（２４４−７７２），Ｅｎｖ（２４４−８
２６），Ｅｎｖ（４３７−５１０），Ｅｎｖ（４３７−
６１１），Ｅｎｖ（４３７−７２２），Ｅｎｖ（４３７
−８２６），Ｅｎｖ（５１２−６１１），Ｅｎｖ（５１
２−６９９），Ｅｎｖ（６１０−７２２），Ｅｎｖ（６
１０−８２６），及びＥｎｖ（７２１−８２６）にある。上記ペプチド群の中でも特にＨＩＶ抗体に対し
て反応性の強い下記のアミノ酸配列がＥｎｖ蛋白エピト
ープ領域を含有すると同定される。Ｅｎｖ（１４−２４４），Ｅｎｖ（２４４−４３４），
Ｅｎｖ（２４４−５１０），Ｅｎｖ（５１２−６１
１），Ｅｎｖ（５１２−６９９），Ｅｎｖ（６１０−７
２２），Ｅｎｖ（７２１−８２６）。本発明のＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白の優れた抗原性及び生
産性を達成するために、これら７個のアミノ酸配列のう
ち、上記したように、Ｅｎｖ（５１２−６９９）で表わ
されるアミノ酸配列の少なくとも一部よりなり且つＨＩ
Ｖ抗体に対し反応性を示す少なくとも１つのエピトープ
を含有している配列が用いられる。また、上記のＥｎｖ
ペプチドに含まれるエピトープは、好ましくはＥｎｖ
（５１２−６９９）で表わされるアミノ酸配列の少なく
とも５個の連続したアミノ酸よりなる。(5) Determining the partial region of the Env peptide containing the epitope showing reactivity with HIV antibody: For example, the reactivity of the LacZ-Env fusion protein in (3) above in the immunoblotting method (4) was determined. It can be done by investigating. According to this method, in the Env protein consisting of the amino acid sequence shown in FIG. 2, the partial region containing the epitope showing reactivity with the HIV antibody is:
The following amino acid sequence group Env (14-244), Env (14-437), E
nv (14-611), Env (175-363), E
nv (224-510), Env (244-611),
Env (244-434), Env (244-43)
7), Env (244-772), Env (244-8)
26), Env (437-510), Env (437-
611), Env (437-722), Env (437
-826), Env (512-611), Env (51
2-699), Env (610-722), Env (6
10-826), and Env (721-826). Among the above peptide groups, the following amino acid sequences having particularly strong reactivity with HIV antibodies are identified as containing the Env protein epitope region. Env (14-244), Env (244-434),
Env (244-510), Env (512-61)
1), Env (512-699), Env (610-7)
22), Env (721-826). In order to achieve excellent antigenicity and productivity of the Gag-Env fusion protein of the present invention, at least one of the amino acid sequences represented by Env (512-699) among these 7 amino acid sequences is used as described above. Part and HI
A sequence containing at least one epitope reactive with the V antibody is used. Also, the above Env
The epitope contained in the peptide is preferably Env
It consists of at least 5 consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by (512-699).

【００２６】（６）Ｇａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白の構成に好
ましいＧａｇペプチドの決定：Ｇａｇ蛋白は、Ｅｎｖ蛋
白を多量に産生させるためのキャリアーとして、Ｌａｃ
Ｚのかわりに用いるので、Ｇａｇ蛋白に関しては、抗原
性よりも、むしろ産生量が重要である。従って、例え
ば、上記（２）の要領によりｇａｇ遺伝子発現ベクター
を構築の後、上記（４）と同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
りＧａｇ蛋白の産生量を確認した。多量産生に成功した
領域は、次のアミノ酸配列群Ｇａｇ（１−１１９），Ｇａｇ（１−１３２），Ｇａｇ
（１−１５４），Ｇａｇ（１−２１０），Ｇａｇ（１−
３０９），Ｇａｇ（１−４０５），Ｇａｇ（１−４０
６），Ｇａｇ（１−４３７），Ｇａｇ（１−５００），
Ｇａｇ（１２１−４０５），Ｇａｇ（１２１−４０
６），Ｇａｇ（１２１−４３７），Ｇａｇ（３０８−４
０５），Ｇａｇ（３０８−４０６），Ｇａｇ（３０８−
４３５），Ｇａｇ（３０８−４３６），Ｇａｇ（３０８
−４３７），及びＧａｇ（３０８−５００）である。このうち、本発明のＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白の
生産性の向上に役立つ、特に蓄積されやすい遺伝子にコ
ードされている領域は、Ｇａｇ（３０８−４３７）であ
る。Ｇａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白のＧａｇペプチドとして
は、前述のように、このＧａｇ（３０８−４３７）の少
なくとも１０個、更に好ましくは少なくとも３０個、更
に好ましくは少なくとも５０個、更に好ましくは少なく
とも７０個の連続したアミノ酸を含んでいるが、Ｇａｇ
（３０８−４０６）及びＧａｇ（３０８−４３７）で表
わされるアミノ酸配列を有するペプチドが最も好ましく
用いられる。(6) Determination of Gag peptide preferable for constructing Gag-Env fusion protein: Gag protein is Lac as a carrier for producing a large amount of Env protein.
Since it is used instead of Z, the production amount of Gag protein is more important than the antigenicity. Therefore, for example, after constructing a gag gene expression vector according to the procedure of (2) above, the production amount of Gag protein was confirmed by SDS-PAGE similar to that of (4) above. The regions that were successfully produced in a large amount are the following amino acid sequence groups Gag (1-119), Gag (1-132), Gag.
(1-154), Gag (1-210), Gag (1-
309), Gag (1-405), Gag (1-40
6), Gag (1-437), Gag (1-500),
Gag (121-405), Gag (121-40
6), Gag (121-437), Gag (308-4)
05), Gag (308-406), Gag (308-
435), Gag (308-436), Gag (308
-437), and Gag (308-500). Of these, the region encoded by a gene that is particularly likely to accumulate and is useful for improving the productivity of the Gag-Env fusion protein of the present invention is Gag (308-437). As the Gag peptide of the Gag-Env fusion protein, as described above, at least 10, more preferably at least 30, more preferably at least 50, and even more preferably at least 70 of this Gag (308-437) are consecutive. Contains the amino acid
The peptides having the amino acid sequences represented by (308-406) and Gag (308-437) are most preferably used.

【００２７】（７）Ｇａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白の産生：望
ましいＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白は、上記（６）で選ばれ
るＧａｇペプチドと、上記（５）で選ばれるＥｎｖペプ
チドより構成されている。斯かる融合蛋白の発現プラス
ミドは、例えば、前記の（１）〜（２）に記載の要領に
て、上記（６）の単独のＧａｇ蛋白を単独で発現するベ
クターまたは、例えばｇａｇ−ｐｏｌ融合遺伝子から作
製するｇａｇ遺伝子含有プラスミドに、上述（５）のＥ
ｎｖペプチドをコードする遺伝子を挿入連係することに
より構築できる。この際、挿入するｅｎｖ遺伝子の解読
枠が一致するように連係するが、これは制限酵素、ヌク
レアーゼＢａ１３１、マングビーン（ｍｕｎｇｂｅｅ
ｎ）ヌクレアーゼ等の酵素を用いる公知の常法により達
成できる。この操作により、発現するＧａｇ−Ｅｎｖ融
合蛋白においてＧａｇ蛋白とＥｎｖ蛋白は数個のアミノ
酸からなる結合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を介して結合す
ることもあるが、これは上記の様な操作のために従来一
般に融合蛋白と言われているものにもほとんど存在する
ものであり、本発明のＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白の抗原性
に影響するものではない。従って、“Ｇａｇペプチドと
ＥｎｖペプチドとからなるＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白”の
ような表現は、ＧａｇペプチドとＥｎｖペプチド、そし
てその間に存在し得る結合部とからなると解釈すべきで
ある。また、多量発現の確認は、上述（４）と同様にし
て行うことができる。(7) Production of Gag-Env fusion protein: A desirable Gag-Env fusion protein is composed of the Gag peptide selected in (6) above and the Env peptide selected in (5) above. The expression plasmid of such a fusion protein is, for example, a vector expressing the single Gag protein of the above (6) alone or a gag - pol fusion gene, for example, as described in (1) to (2) above. The gag gene-containing plasmid prepared from
It can be constructed by inserting and linking a gene encoding the nv peptide. At this time, the env genes to be inserted are linked so that they have the same reading frames, which are the restriction enzyme, nuclease Ba131, and mung bean.
n) It can be achieved by a known conventional method using an enzyme such as nuclease. By this operation, in the expressed Gag-Env fusion protein, the Gag protein and the Env protein may be bonded via a junction consisting of several amino acids, which is conventionally used for the above operation. It is almost present in what is generally called a fusion protein, and does not affect the antigenicity of the Gag-Env fusion protein of the present invention. Therefore, an expression such as "Gag-Env fusion protein consisting of Gag peptide and Env peptide" should be construed to consist of Gag peptide and Env peptide, and a binding part which may exist therebetween. In addition, confirmation of large-scale expression can be performed in the same manner as in the above (4).

【００２８】（８）ｇａｇ又はｇａｇ−ｅｎｖ遺伝子の
発現が確認された形質転換体の培養によるＧａｇ蛋白又
はＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白の産生：例えば、次のように
行うことができる：形質転換体の本培養用シードを調製
するため、例えば、形質転換体が大腸菌の場合、ＬＢ培
地中で、菌体濃度が２×１０⁹〜８×１０⁹細胞／ｍｌに
達するまで、３０〜４０℃で１２〜３５時間培養する；
次に、予め調製した培養用培地１０００リットルに対
し、斯かるシード１〜１０リットルを接種混合の後、前
培養と後培養からなる２段階培養を行う。前培養は、シ
ード細胞の増殖並びに発現ベクターの増幅を目的として
行うものであり、１０〜４０℃で１〜２４時間、好まし
くは、１５〜３７℃で２〜１２時間行い、例えば、大腸
菌の場合、培養下の菌体濃度、即ち、培養液濁度ＯＤ
₆₀₀ｎｍ＝０．１〜２．０を目安として前培養を終了す
る。次いで、斯かる前培養の完了に伴い、該培養系を後
培養へ移行させる。後培養は、発現ベクターにクローニ
ングした遺伝子の転写と翻訳を確保すると同時に、翻訳
後の遺伝子産物が宿主細胞に由来のタンパク分解酵素に
より無秩序に分解され失活することを避けるため、細心
の注意と創意の下で設定されるべきである。尚、後培養
は、前培養に比べ相対的に低温の方が望ましく、１０〜
４０℃で１〜４０時間、好ましくは、１５〜３７℃で３
〜３５時間行う。また、使用する発現ベクターの性質を
考慮し、例えば、後培養開始時に、培地中のリン酸の飢
餓化や、培地中へのインデューサー、例えば、ＩＰＴＧ
（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔ
ｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）の添加混合等を行うことによ
り、発現の促進や誘導を図ることができる。なお、上述
の２段階培養を行うことにより、Ｇａｇ蛋白またはＧａ
ｇ−Ｅｎｖ融合蛋白がそれぞれ、通常、培地１リットル
当たり約１〜５０ｍｇ産生される。上記のＧａｇペプチ
ドとＥｎｖペプチドとの組み合わせのうち、多量に産生
され且つ抗原性が特に高いのは、Ｇａｇ（３０８−４０
６）−Ｅｎｖ（５１２−６１１）、Ｇａｇ（３０８−４
３７）−Ｅｎｖ（５１２−６１１）、及びＧａｇ（３０
８−４０６）−Ｅｎｖ（５１２−６９９）で表わされる
アミノ酸配列を有するＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白である。(8) Production of Gag protein or Gag-Env fusion protein by culturing a transformant in which expression of the gag or gag - env gene was confirmed: For example, it can be carried out as follows: To prepare a seed for main culture, for example, when the transformant is Escherichia coli, 12 at 30 to 40 ° C. in LB medium until the cell concentration reaches 2 × 10 ⁹ to 8 × 10 ⁹ cells / ml. Incubate for ~ 35 hours;
Next, 1 to 10 liters of the seeds are inoculated and mixed with 1000 liters of the culture medium prepared in advance, and then two-stage culture including pre-culture and post-culture is performed. The pre-culture is performed for the purpose of growing seed cells and amplifying the expression vector, and is performed at 10 to 40 ° C. for 1 to 24 hours, preferably at 15 to 37 ° C. for 2 to 12 hours. , Cell concentration in culture, that is, turbidity OD of culture solution
Pre-culture is completed with ₆₀₀ nm = 0.1 to 2.0 as a guide. Then, upon completion of such pre-culture, the culture system is transferred to post-culture. Post-culturing should be performed with great care in order to ensure the transcription and translation of the gene cloned into the expression vector, and at the same time to avoid inactivating the post-translational gene product by disorderly degradation by proteolytic enzymes derived from host cells. It should be set up ingenuity. Incidentally, the post-culture is preferably at a relatively low temperature as compared with the pre-culture,
1 to 40 hours at 40 ° C, preferably 3 to 15 to 37 ° C
~ 35 hours. In consideration of the properties of the expression vector to be used, for example, at the start of the post-culture, starvation of phosphate in the medium or an inducer into the medium, such as IPTG.
(Isopropyl β-D-thiogalact
The expression can be promoted or induced by adding and mixing oxyranoside). In addition, by performing the above-mentioned two-step culture, Gag protein or Ga
Each g-Env fusion protein is normally produced in an amount of about 1 to 50 mg per liter of medium. Among the combinations of Gag peptide and Env peptide described above, Gag (308-40) is produced in a large amount and has particularly high antigenicity.
6) -Env (512-611), Gag (308-4)
37) -Env (512-611), and Gag (30.
8-406) -Env (512-699), which is a Gag-Env fusion protein.

【００２９】（９）量産されたＧａｇ蛋白またはＧａｇ
−Ｅｎｖ融合蛋白の精製：この工程は、公知の常法を組
み合わせて用いることにより達成できる。例えば、沈澱
剤、遠心、濾過等による形質転換体培養物の採取；超音
波処理、加圧減圧処理、ホモジナイザー等により形質転
換体細胞の破壊ないしは破砕による粗抽出液の調製；珪
酸や活性炭による吸脱着処理、塩析、有機溶媒による沈
澱等による精製、超遠心法、カラムクロマトグラフィ
ー、電気泳動法等を用いる分画による高度精製；また、
珪酸及び活性炭に吸脱着の後、密度勾配遠心にて分画す
る遺伝子発現産物の精製法（特開昭６３−２９７）等の
常法により、上記各蛋白ないしは各酵素の精製が可能で
ある。(9) Mass-produced Gag protein or Gag
-Purification of Env fusion protein: This step can be achieved by using a combination of known conventional methods. For example, a transformant culture is collected by a precipitant, centrifugation, filtration, etc .; a crude extract is prepared by disrupting or crushing transformant cells by ultrasonic treatment, pressure reduction treatment, homogenizer, etc .; absorption by silicic acid or activated carbon. Purification by desorption, salting out, precipitation with an organic solvent, etc., advanced purification by fractionation using ultracentrifugation, column chromatography, electrophoresis, etc .;
The above proteins or enzymes can be purified by a conventional method such as a method for purifying a gene expression product by fractionation by density gradient centrifugation after adsorption / desorption on silicic acid and activated carbon (JP-A-63-297).

【００３０】即ち、本発明の更に他の態様によれば、（ａ）第１のデオキシリボ核酸を複製可能な発現ベクタ
ーに連係して、宿主細胞内で複製可能な第１の組換えＤ
ＮＡを得、上記の第１のデオキシリボ核酸は、Ｇａｇ
（３０８−４３７）で表わされるアミノ酸配列の少なく
とも１０個の連続したアミノ酸よりなるＧａｇペプチド
をコードしており（但し、上記括弧内の番号は図１のＧ
ａｇ蛋白の全アミノ酸配列のアミノ酸番号を示す）；（ｂ）第２のデオキシリボ核酸を、上記の第１の組換え
ＤＮＡの第１のデオキシリボ核酸の下流に連係して、第
２のデオキシリボ核酸が第１のデオキシリボ核酸に融合
するようにし、上記の第２のデオキシリボ核酸は、Ｅｎ
ｖ（５１２−６９９）で表わされるアミノ酸配列の少な
くとも一部よりなり且つ該一部のアミノ酸配列はＨＩＶ
抗体に対し反応性を示す少なくとも１つのエピトープを
包含するＥｎｖペプチドをコードしており（但し、上記
の各々の括弧内の番号は図２のＥｎｖ蛋白の全アミノ酸
配列のアミノ酸番号を示す），かくして、宿主細胞内で
複製可能な第２の組換えＤＮＡを得；（ｃ）上記の第２の組換えＤＮＡにより原核生物または
真核生物細胞を形質転換して形質転換体を形成し；（ｄ）該形質転換体を原核生物または真核生物の非形質
転換細胞から選別し；（ｅ）該形質転換体を培養して、該Ｇａｇペプチドがそ
のＣ末端において該Ｅｎｖペプチドと融合してなるＧａ
ｇ−Ｅｎｖ融合蛋白を含むＨＩＶ抗原を産生し；そして（ｆ）該Ｇａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白を含む該ＨＩＶ抗原を
形質転換体培養物から単離する、ことを特徴とする実質的に純粋なＨＩＶ抗原の製造方法
が提供される。That is, according to still another aspect of the present invention, (a) a first recombinant D replicable in a host cell by linking a first deoxyribonucleic acid to a replicable expression vector.
NA was obtained and the first deoxyribonucleic acid described above was Gag
It encodes a Gag peptide consisting of at least 10 consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by (308-437) (however, the numbers in the above parentheses indicate the G in FIG. 1).
(The amino acid number of the entire amino acid sequence of the ag protein is shown); (b) The second deoxyribonucleic acid is linked to the downstream side of the first deoxyribonucleic acid of the above-mentioned first recombinant DNA so that the second deoxyribonucleic acid is Fused to the first deoxyribonucleic acid, and the second deoxyribonucleic acid described above is En
v (512-699) consisting of at least a part of the amino acid sequence and the part of the amino acid sequence is HIV
It encodes an Env peptide that includes at least one epitope that is reactive to the antibody (where the numbers in brackets above indicate the amino acid numbers of the entire amino acid sequence of the Env protein in Figure 2), and thus Obtaining a second recombinant DNA replicable in the host cell; (c) transforming a prokaryotic or eukaryotic cell with the second recombinant DNA to form a transformant; A.) Selecting the transformant from prokaryotic or eukaryotic non-transformed cells; (e) culturing the transformant, wherein the Gag peptide is fused at its C-terminus to the Env peptide.
producing an HIV antigen containing a g-Env fusion protein; and (f) isolating the HIV antigen containing the Gag-Env fusion protein from a transformant culture. A method for producing an antigen is provided.

【００３１】上記の第２のデオキシリボ核酸は、Ｅｎｖ
（５１２−６９９）で表わされるアミノ酸配列の少なく
とも５個の連続したアミノ酸よりなるＥｎｖペプチドを
コードしていることが好ましい。The second deoxyribonucleic acid described above is Env
It preferably encodes an Env peptide consisting of at least 5 consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by (512-699).

【００３２】上記の第１のデオキシリボ核酸は、Ｇａｇ
（３０８−４３７）で表わされるアミノ酸配列の少なく
とも１０個の連続したアミノ酸からなるＧａｇペプチド
をコードしているが、好ましくはＧａｇ（３０８−４３
７）で表わされるアミノ酸配列の少なくとも３０個、更
に好ましくは少なくとも５０個、更に好ましくは少なく
とも７０個の連続したアミノ酸を含むＧａｇペプチドを
コードすることができる。また、Ｇａｇ（３０８−４０
６）とＧａｇ（３０８−４３７）で表わされるアミノ酸
配列からなるＧａｇペプチドをコードするものが最も好
ましく用いられる。The above-mentioned first deoxyribonucleic acid is Gag
It encodes a Gag peptide consisting of at least 10 consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by (308-437), preferably Gag (308-43).
It is possible to encode a Gag peptide containing at least 30, more preferably at least 50, and even more preferably at least 70 consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by 7). In addition, Gag (308-40
Most preferably, it encodes a Gag peptide consisting of the amino acid sequences represented by 6) and Gag (308-437).

【００３３】上記の第２のデオキシリボ核酸は、Ｅｎｖ
（５１２−６９９）で表わされるアミノ酸配列の少なく
とも５個よりなるＥｎｖペプチドをコードしているのが
好ましいが、更に好ましくはＥｎｖ（５１２−６９９）
で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１０個、最も好
ましくは少なくとも１５個の連続したアミノ酸よりなる
Ｅｎｖペプチドをコードすることができる。該発現ベク
ターは、ｐＴ７系列またはｐＵＲ２９０系列のベクター
であることが好ましく、特に、ｐＴ７−７であることが
最も好ましい。本発明の作成法により得られる発現ベク
ターはアンプル、バイアル瓶等の小型容器内で密閉され
た状態、または宿主に移入した状態で提供される。The second deoxyribonucleic acid described above is Env
It preferably encodes an Env peptide consisting of at least 5 amino acid sequences represented by (512-699), more preferably Env (512-699).
An Env peptide consisting of at least 10, and most preferably at least 15 contiguous amino acids of the amino acid sequence represented by can be encoded. The expression vector is preferably a pT7 series or pUR290 series vector, and most preferably pT7-7. The expression vector obtained by the production method of the present invention is provided in a sealed state in a small container such as an ampoule or a vial, or in a state transferred to a host.

【００３４】本発明の更に他の態様によれば、複製可能
な発現ベクター、その中に挿入された第１のデオキシリ
ボ核酸、及び第１のデオキシリボ核酸の下流に位置し且
つ第１のデオキシリボ核酸に融合している第２のデオキ
シリボ核酸を含む、宿主細胞内で複製可能な組換えＤＮ
Ａが提供される。上記の第１のデオキシリボ核酸は、Ｇ
ａｇ（３０８−４３７）で表わされるアミノ酸配列の少
なくとも１０個の連続したアミノ酸よりなるＧａｇペプ
チドをコードしており（但し、上記括弧内の番号は図１
のＨＩＶのＧａｇ蛋白の全アミノ酸配列のアミノ酸番号
を示す）、上記の第２のデオキシリボ核酸は、Ｅｎｖ
（５１２−６９９）で表わされるアミノ酸配列の少なく
とも一部よりなり且つ該一部のアミノ酸配列はＨＩＶ抗
体に対し反応性を示す少なくとも１つのエピトープを含
有するＥｎｖペプチドをコードしている（但し、上記の
各々の括弧内の番号は図２のＨＩＶのＥｎｖ蛋白の全ア
ミノ酸配列のアミノ酸番号を示す）。According to yet another aspect of the present invention, a replicable expression vector, a first deoxyribonucleic acid inserted therein, and a first deoxyribonucleic acid located downstream of the first deoxyribonucleic acid Recombinant DN replicable in a host cell comprising a fused second deoxyribonucleic acid
A is provided. The first deoxyribonucleic acid is G
It encodes a Gag peptide consisting of at least 10 consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by ag (308-437) (however, the numbers in the parentheses above refer to FIG.
The amino acid number of the entire amino acid sequence of the HIV Gag protein is shown), and the second deoxyribonucleic acid is Env.
(512-699) consisting of at least a part of the amino acid sequence, and the part of the amino acid sequence encodes an Env peptide containing at least one epitope reactive with HIV antibody (provided that The number in parentheses in each of the parentheses indicates the amino acid number of the entire amino acid sequence of the HIV Env protein in FIG. 2).

【００３５】上記の第２のデオキシリボ核酸は、Ｅｎｖ
（５１２−６９９）で表わされるアミノ酸配列の少なく
とも５個の連続したアミノ酸よりなるＥｎｖペプチドを
コードしていることが望ましい。上記の第１のデオキシ
リボ核酸及び第２のデオキシリボ核酸の更に好ましい態
様については、前述のＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白の製造方
法において説明した通りである。また、上記の発現ベク
ターは、ｐＴ７系列またはｐＵＲ２９０系列のベクター
であることが好ましく、特に、ｐＴ７−７であることが
最も好ましい。また、本発明により量産されるＧａｇ蛋
白及びＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白は、液状、乾燥粉末、ま
たは濾紙や膜等に吸着の状態で、アンプル、バイアル瓶
等の小型容器内に密封し、提供できる。液状の場合はそ
のまま必要量使用し、乾燥の場合は、蒸留水で溶解し乾
燥前の体積まで戻した後、必要量使用する。濾紙や膜等
に吸着の場合には、適切な溶液で湿潤させた後、使用す
る。The above second deoxyribonucleic acid is Env
It is desirable to encode an Env peptide consisting of at least 5 consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by (512-699). More preferable embodiments of the first deoxyribonucleic acid and the second deoxyribonucleic acid are as described in the method for producing the Gag-Env fusion protein. The expression vector is preferably a pT7 series or pUR290 series vector, and most preferably pT7-7. The Gag protein and Gag-Env fusion protein mass-produced according to the present invention can be provided in a liquid, dry powder, or in a state of being adsorbed on a filter paper, a membrane or the like, sealed in a small container such as an ampoule or a vial. In the case of a liquid, the required amount is used as it is, and in the case of drying, it is dissolved in distilled water and returned to the volume before drying, and then the required amount is used. In the case of adsorption to filter paper or membrane, use it after wetting with an appropriate solution.

【００３６】本発明の更に他の態様によれば、免疫学的
反応によってエイズを検知するための診断剤にして、上
記したＧａｇ蛋白、Ｇａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白のうち１種
または両方のＨＩＶ抗原を、免疫学的反応を呈するに十
分の量含有することを特徴とする診断剤が提供される。According to still another aspect of the present invention, one or both HIV antigens of the above-mentioned Gag protein and Gag-Env fusion protein are used as a diagnostic agent for detecting AIDS by an immunological reaction. A diagnostic agent is provided which is contained in an amount sufficient to exhibit an immunological reaction.

【００３７】本発明の更に他の態様によれば、上記した
Ｇａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白又はＧａｇ蛋白を含むＨＩＶ抗
原を免疫原性を奏するのに十分の量含有し、かつ少なく
とも１つの医薬的に許容されるアジュバント、稀釈剤ま
たは賦形剤を含有することを特徴とするエイズワクチン
が提供される。According to still another embodiment of the present invention, the HIV antigen containing the above-mentioned Gag-Env fusion protein or Gag protein is contained in an amount sufficient to exert immunogenicity, and at least one pharmaceutically acceptable An AIDS vaccine, characterized in that it comprises an adjuvant, diluent or excipient as defined above.

【００３８】このエイズワクチンは、成人への１回の接
種量は、一般に０．００１μｇ〜１０００μｇである。The adult dose of this AIDS vaccine is generally 0.001 μg to 1000 μg.

【００３９】以下、本発明の具体例につき、参考例及び
実施例を挙げて説明する。但し、本発明は、以下の実施
例にのみ限定されるものではない。Specific examples of the present invention will be described below with reference to reference examples and examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

【００４０】実施例１ステップ１（ＬａｃＺ−Ｅｎｖ融合蛋白を発現するプラ
スミドの作成）ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡクローンｐＮＬ４−３
（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，５９，２８
４−２９１，１９８６；ＧｅｎＢａｎｋｄａｔａｆ
ｉｌｅＨＩＶＮＬ４３；米国ＮＩＨより入手可能であ
る）をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切断し電気泳動後、ア
ガロースゲルから３．１ＫｂＤＮＡ断片（ＧｅｎＢａｎ
ｋｄａｔａｆｉｌｅＨＩＶＮＬ４３によるヌクレ
オチド番号(５７４３−８８８７）を、ＥｃｏＲＩ及び
ＳａｌIで切断しＢＡＰ処理したｐＨＳＧ３９８にクロ
ーニングし、ｐＮＳ２１０を作成した。ｐＮＳ２１０を
ＫｐｎＩで切断し、電気泳動後、アガロースゲルから
２．５５Ｋｂ断片を回収した。この断片をＨａｅＩＩＩ
で切断し、約５７０ｂのＨａｅＩＩＩ断片（同７８３４
−８４００）を同じく電気泳動により回収した。この断
片を、ＨｉｎｃＩＩで切断しＢＡＰ処理したｐＵＣ９に
クローニングし、ｐＥＨ２２を作成した。ｐＥＨ２２を
ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断して得た約５８０ｂの
断片を、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで開裂したｐＵＲ２
９２（EMBO Journal, 2, 1791-1794, 1983）にクローニ
ングしてｐＡＳ１８２（表１）を作成した。ｐＡＳ１８
２をＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、自己連結させてｐＡ
Ｓ１９２（表１）を作成した。ｐＡＳ１８２およびｐＡ
Ｓ１９２は、それぞれＬａｃＺ−Ｅｎｖ（５１２−６９
９）およびＬａｃＺ−Ｅｎｖ（５１２−６１１）融合蛋
白を発現する。その他、ＬａｃＺ−Ｅｎｖ融合蛋白を発
現するプラスミドを１５種作成した（表１）。Example 1 Step 1 (Construction of a plasmid expressing LacZ-Env fusion protein) HIV-1 provirus DNA clone pNL4-3
(Journal of Virology, 59, 28
4-291, 1986; GenBank data f.
ile HIV NL43; available from NIH, USA) was digested with Eco RI and Xho I and electrophoresed, then a 3.1 Kb DNA fragment (GenBan) was obtained from an agarose gel.
The nucleotide numbers according to k data file HIVNL43 (5743-8887) were replaced with Eco RI and
It was cloned into pHSG398 which had been cut with SalI and treated with BAP to prepare pNS210. pNS210
After cutting with Kpn I and electrophoresis, the 2.55 Kb fragment was recovered from the agarose gel. This fragment was designated Hae III
Cleaved with the Hae III fragment of about 570b (ibid.
-8400) was also recovered by electrophoresis. This fragment was cloned into pUC9 was BAP treatment was cut with Hin cII, to create PEH22. pEH22
A fragment of approximately 580b obtained by cutting with Bam HI and Pst I, were cleaved with Bam HI and Pst I PUR2
92 (EMBO Journal, 2, 1791-1794, 1983) and cloned into pAS182 (Table 1). pAS18
After cutting 2 with Hin dIII, and self-ligated pA
S192 (Table 1) was created. pAS182 and pA
S192 is LacZ-Env (512-69), respectively.
9) and LacZ-Env (512-611) fusion protein. In addition, 15 kinds of plasmids expressing the LacZ-Env fusion protein were prepared (Table 1).

【００４１】ステップ２（ＬａｃＺ−Ｅｎｖ融合蛋白の多量産生）ｐＡＳ１８２及びｐＡＳ１９２をはじめ表１に示した１
７種の発現プラスミドを大腸菌ＪＭ１０３株（Nucleic
Acids Research, 9, 309-321, 1981）に導入した。大腸
菌を、２ｍｌのＬＢ培地（２０μｇ／ｍｌアンピシリン
を含む）に植え、３７℃で一晩振とう培養し、翌日その
培養液０．０５〜０．１ｍｌを５ｍｌのＬＢ培地（２０
μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に植え継ぎ、３７℃で
振とう培養した。菌体濃度がＯＤ₆₀₀＝０．５となった
ときＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとなるように加え、融合
蛋白の発現を誘導した。３７℃で振とう培養を５時間続
けた後、１．５ｍｌの培養液から、遠心により菌体を集
め、１２０μｌの２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
７．５に懸濁し、６０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル
バッファーを加え、よく混ぜた。これを１００℃で３分
加熱した後、遠心（１２，０００ｒｐｍ，５分）し、上
清７．５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、分画
した。ゲルをＣＢＢで染色することにより、１７種のＬ
ａｃＺ−Ｅｎｖ融合蛋白の多量産生を確認することがで
きた。Step 2 (Large production of LacZ-Env fusion protein) 1 shown in Table 1 including pAS182 and pAS192.
E. coli JM103 strain (Nucleic
Acids Research, 9, 309-321, 1981). Escherichia coli was inoculated into 2 ml of LB medium (containing 20 μg / ml ampicillin) and shake-cultured overnight at 37 ° C. Next day, 0.05-0.1 ml of the culture solution was added to 5 ml of LB medium (20 ml).
(containing μg / ml ampicillin) and cultured at 37 ° C. with shaking. When the cell concentration reached OD ₆₀₀ = 0.5, IPTG was added so that the final concentration was 1 mM, and the expression of the fusion protein was induced. After shaking culture at 37 ° C. for 5 hours, cells were collected from 1.5 ml of the culture solution by centrifugation, and 120 μl of 20 mM Tris-HCl, pH was added.
The cells were suspended in 7.5, 60 μl of SDS-PAGE sample buffer was added, and they were mixed well. This was heated at 100 ° C. for 3 minutes and then centrifuged (12,000 rpm, 5 minutes), 7.5 μl of the supernatant was loaded on an SDS-PAGE gel and fractionated. By staining the gel with CBB, 17 kinds of L
It was possible to confirm the large-scale production of the acZ-Env fusion protein.

【００４２】ステップ３（ＨＩＶ感染者のＥｎｖ抗体が
認識するエピトープ領域の同定）１７種のＬａｃＺ−Ｅｎｖ融合蛋白（表１）及びＬａｃ
Ｚを多量産生した大腸菌（ＪＭ１０３株）の全蛋白を
（ステップ２）と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した
後、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｄｉｆｌｕｏｒｉ
ｄｅ膜にブロットした。スキムミルク（米国、Ｄｉｆｃ
ｏ社製）でブロッキングした後、２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０で１００倍希釈したＨＩＶ感染者
（無症候性キャリアー）３例の血清とそれぞれ反応させ
た。これらの３例の血清はいずれも、ＬａｃＺとは反応
しないことを確認した後に用いた。２次抗体には、ペル
オキシダーゼで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（米国、Ｂｉ
ｏＲａｄ社製）を用いた。このウエスタンブロットの
結果（表２）を解析することにより、血清Ａ，Ｂ，Ｃの
Ｅｎｖ抗体が認識するエピトープ領域を、それぞれ２ケ
所、３ケ所、５ケ所同定することができた（表３）。３
例の血清のいずれとも反応したのは、Ｅｎｖ（５１２−
６１１）及び／またはＥｎｖ（７２１−８２６）領域を
含むＬａｃＺ−Ｅｎｖ融合蛋白であった。Step 3 (Identification of Epitope Region Recognized by Env Antibody of HIV-Infected Person) 17 LacZ-Env Fusion Proteins (Table 1) and Lac
The total protein of E. coli (JM103 strain) that produced a large amount of Z was fractionated by SDS-PAGE in the same manner as in (Step 2), and then polyvinylidene difluori was fractionated.
Blotted on de membrane. Skim milk (Difc, USA
20 mM Tris-H after blocking with
Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05%
The sera of 3 HIV-infected persons (asymptomatic carriers) diluted 100 times with Tween 20 were reacted with each other. All of these three sera were used after confirming that they did not react with LacZ. The secondary antibody was goat anti-human IgG labeled with peroxidase (Bi, USA).
o Rad) was used. By analyzing the results of this Western blotting (Table 2), it was possible to identify the epitope regions recognized by the Env antibodies of serum A, B, and C at 2 sites, 3 sites, and 5 sites, respectively (Table 3). . Three
The reaction with any of the example sera was due to Env (512-
611) and / or LavZ-Env fusion protein containing the Env (721-826) region.

【００４３】ステップ４（ＬａｃＺ−Ｅｎｖ（５１２
−６１１）およびＬａｃＺ−Ｅｎｖ（７２１−８２６）
の診断用抗原としての有用性の確認）ＬａｃＺ−Ｅｎｖ（５１２−６１１）およびＬａｃＺ−
Ｅｎｖ（７２１−８２６）の診断用抗原としての有用性
を確認するため、ステップ３と同様の方法で更に４１例
の感染者血清（無症候性ＨＩＶキャリアー３６例、ＡＲ
Ｃ１例、発症者４例）を用いてウエスタンブロットを行
なった。この結果をステップ３の結果と合わせて表４に
示した。ＬａｃＺ−Ｅｎｖ（５１２−６１１）は４４例
すべてと反応した（１００％）。一方ＬａｃＺ−Ｅｎｖ
（７２１−８２６）は４４例中３５例（７９％）と反応
したのみであった。Ｅｎｖ（５１２−６１１）領域は診
断用抗原として有用と考えられる。Ｅｎｖ（７２１−８
２６）領域を単独で診断に用いることはできないが、他
の抗原例えばＥｎｖ（５１２−６１１）領域と併用する
ことは可能であるし、意味があると考えられる。しか
し、無症候性ＨＩＶキャリアー３９例のうち２例がＬａ
ｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）とも弱く反応したことか
ら、ＬａｃＺ−Ｅｎｖキメラ蛋白をそのまゝ診断に用い
るのは好ましくないと考えられる。しかし、上述したよ
うに、公知の方法によりＬａｃＺの部位を血清中のＬａ
ｃＺ抗体でマスクすることにより診断に用いることがで
きる。Step 4 (LacZ-Env (512
-611) and LacZ-Env (721-826).
Confirmation of Utility as a Diagnostic Antigen for LacZ-Env (512-611) and LacZ-
In order to confirm the usefulness of Env (721-826) as a diagnostic antigen, 41 sera of infected persons (36 asymptomatic HIV carriers, AR
Western blotting was performed using C1 cases and 4 cases. The results are shown in Table 4 together with the results of step 3. LacZ-Env (512-611) reacted with all 44 cases (100%). On the other hand, LacZ-Env
(721-826) only reacted with 35 of 44 cases (79%). The Env (512-611) region is considered to be useful as a diagnostic antigen. Env (721-8
Although the 26) region cannot be used alone for diagnosis, it can be used in combination with other antigens such as the Env (512-611) region, and is considered to be meaningful. However, 2 out of 39 asymptomatic HIV carriers were La
Since it also reacted weakly with cZ (β-galactosidase), it is considered unfavorable to use the LacZ-Env chimeric protein for the diagnosis as it is. However, as described above, the site of LacZ was detected by the known method.
It can be used for diagnosis by masking with cZ antibody.

【００４４】ステップ５（Ｔ７プロモーター支配下でＥ
ｎｖ蛋白を単独で発現するプラスミドの作成）合成オリゴヌクレオチド５’ＴＡＴＧＧＣＴＡＡＧ
３’と５’ＡＡＴＴＣＴＴＡＧＣＣＡ３’をアニール
し、これをＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで開裂した発現系
Ｔ７シリーズ（Proceedings of National Academy of S
ciences [USA], 82,1074-1078,1985）のプラスミドｐＴ
７−７に挿入し、ｐＴ７−７−１を作成した。ｐＴ７−
７−１はｐＴ７−７のマルチクローニング部位のＮｄｅ
Ｉ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に１塩基（Ａ）が挿入され
たものである。ｐＴ７−７−１をＢａｍＨＩおよびＰｓ
ｔＩで開裂し、ｐＥＨ２２（ステップ１）をＢａｍＨＩ
およびＰｓｔＩで切断して得た約５８０ｂの断片をクロ
ーニングしてｐＴＥ１８２（表５）を作成した。次い
で、このｐＴＥ１８２をＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、
自己連結させてｐＴＥ１９２（表５）を作成した。ｐＮ
Ｓ２１０（ステップ１）をＮｄｅＩで切断した後、Ｂｇ
ｌIIで部分切断して得たＮｄｅＩ−ＢｇｌII断片(GenBa
nk data file HIVNL43によるヌクレオチド番号６３９９
−７６１１)をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで開裂したｐＵ
Ｒ２９２(ステップ１)にクローニングしてｐＮＢ２１を
作成した。ｐＮＢ２１をＢｇｌIIおよびＣｌａIで切断
して得た約０．６ｋｂの断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａ
Iで開裂したｐＴ７−７にクローニングしてｐＴＥ３１
１（表５）を作成した。ｐＴＥ１８２、ｐＴＥ１９２及
びｐＴＥ３１１は、それぞれＥｎｖ（５１２−６９
９）、Ｅｎｖ（５１２−６１１）及びＥｎｖ（２４４−
４３７）領域を発現する。Ｔ７プロモーター支配下で、
Ｅｎｖ蛋白を単独で発現するプラスミドを表５に示し
た。発現の宿主として大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用
いた。菌の培養および蛋白の解析はステップ２、３に従
った。ｐＴＥ１８２、ｐＴＥ１９２及びｐＴＥ３１１が
発現するＥｎｖ蛋白は、全菌体蛋白に対し約１〜２％と
少なく、プラスミドを選んでも、Ｅｎｖ蛋白単独の実用
的収率での発現は困難であることが分かった。Step 5 (E under the control of the T7 promoter
Construction of a plasmid that expresses nv protein alone) Synthetic oligonucleotide 5'TATGGCTAAG
Expression system T7 series (Proceedings of National Academy of S) was prepared by annealing 3'and 5'AATTCTTAGCCA3 'and cleaving it with Nde I and Eco RI.
ciences [USA], 82,1074-1078,1985) plasmid pT
It was inserted into 7-7 to prepare pT7-7-1. pT7-
7-1 is Nde of the multiple cloning site of pT7-7
One base (A) is inserted between the I site and the Eco RI site. pT7-7-1 with Bam HI and Ps
Cleavage at t I and pEH22 (step 1) with Bam HI
And Pst and cloned a fragment of approximately 580b obtained by cutting in I was prepared pTE182 (Table 5). Then, after cutting the pTE182 with Hin dIII,
Self-ligated to create pTE192 (Table 5). pN
After cutting S210 (step 1) with Nde I, Bg
Nde obtained by partially digested with l II I- Bgl II fragment (GenBa
nk data file Nucleotide number 6399 by HIV NL43
-7611) pU cleaved with Nde I and Bam HI
It was cloned into R292 (step 1) to make pNB21. The fragment of about 0.6kb obtained by cutting with Bgl II and Cla I to pNB21 Bam HI and Cla
Cloning into pT7-7 cleaved with I
1 (Table 5) was prepared. pTE182, pTE192 and pTE311 are respectively Env (512-69).
9), Env (512-611) and Env (244-
437) region is expressed. Under the control of the T7 promoter,
Table 5 shows the plasmids that express the Env protein alone. E. coli BL21 (DE3) strain was used as a host for expression. Cultivation of the bacterium and analysis of the protein followed steps 2 and 3. The Env protein expressed by pTE182, pTE192 and pTE311 was as small as about 1 to 2% with respect to the total bacterial protein, and it was found that expression of Env protein alone in a practical yield is difficult even if a plasmid is selected. .

【００４５】ステップ６（Ｔ７プロモーター支配下でＧ
ａｇ蛋白を発現するプラスミドの作成）ｐＴＧ５９１
（特開平4-117289）をＮｄｅＩおよびＢｃｌＩで切断し
て得た約１．６ｋｂの断片をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ
で開裂したｐＴ７−７およびｐＴＥ−３ａ（Methods in
Enzymology, 185, 60-89, 1990)にクローニングして、
ｐＴＧ５８１およびｐＥＧ５８１（表６）をそれぞれ作
成した。これらはｇａｇ遺伝子全領域（＝ｐ５５）を発
現する。Step 6 (G under the control of the T7 promoter
Construction of plasmid expressing ag protein) pTG591
(JP-A-4-117289) was digested with Nde I and Bcl I to obtain a fragment of about 1.6 kb, which was digested with Nde I and Bam HI.
PT7-7 and pTE-3a (Methods in
Enzymology, 185, 60-89, 1990),
pTG581 and pEG581 (Table 6) were created respectively. These express the entire region of the gag gene (= p55).

【００４６】ｐＴＧ２１０、ｐＴＧ１１０およびｐＴＧ
５９１（以上特開平4-117289）をＡｐａＩおよびＣｌａ
Ｉで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理した後、自
己連結して、それぞれｐＴＧ２１０−２、ｐＴＧ１１０
−２、ｐＴＧ５６１（表６）を作成した。これらのプラ
スミドはそれぞれＧａｇ（３０８−４０５）、Ｇａｇ
（１２１−４０５）、Ｇａｇ（１−４０５）領域を産生
する。Ｔ７プロモーター支配下でＧａｇ蛋白を発現する
プラスミドを表６に示した。発現の宿主として大腸菌Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）株を用いた。菌の培養および蛋白の解
析はステップ２及び３に従った。PTG210, pTG110 and pTG
591 (above Japanese Unexamined Patent Publication No. 4-117289) to Apa I and Cla
Cleavage with I, treatment with T4 DNA polymerase, self-ligation, and pTG210-2 and pTG110, respectively.
-2, pTG561 (Table 6) was prepared. These plasmids are Gag (308-405) and Gag, respectively.
(121-405), producing the Gag (1-405) region. Table 6 shows the plasmids that express the Gag protein under the control of the T7 promoter. E. coli B as a host for expression
L21 (DE3) strain was used. Bacterial culture and protein analysis followed steps 2 and 3.

【００４７】ステップ７（Ｔ７プロモーター支配下でＧ
ａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白を発現するプラスミドの作成）ｐＡＳ１９２（ステップ１）をＢａｍＨＩ、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ、ＣｌａＩで順次処理して電気泳動した
後、アガロースゲルから約３１０ｂの断片を回収した。
この断片を、ＡｐａＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｌ
ａＩで順次処理したｐＴＧ２１０（特開平4-117289）に
クローニングし、ｐＧＥ３３（表７）を作成した。ｐＧ
Ｅ３３をＨｉｎｄIIIで切断して、電気泳動した後、ア
ガロースから約６００ｂの断片を回収した。この断片
を、ＨｉｎｄIIIで開裂し、ＢＡＰ処理したｐＴＧ１１
０およびｐＴＧ５９１(以上特開平4-117289）にそれぞ
れクローニングし、ｐＧＥ１１３３およびｐＧＥ５６３
３（表７）を作成した。ｐＧＥ３３、ｐＧＥ１１３３、
ｐＧＥ５６３３は融合蛋白Ｇａｇ（３０８−４０６）−
Ｅｎｖ（５１２−６１１）、Ｇａｇ（１２１−４０６）
−Ｅｎｖ（５１２−６１１）、及びＧａｇ（１−４０
６）−Ｅｎｖ（５１２−６１１）をそれぞれ発現する。
ｐＴ７−７−１（ステップ５）のマルチクローニング部
位（ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII）をｐＵＲ２９２（ステ
ップ１）のマルチクローニング部位（ＢａｍＨＩ−Ｈｉ
ｎｄIII）に変換してプラスミドｐＴ７−２９−１を作
成した。ｐＴ７−２９−１をＢａｍＨＩで切断し、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼで処理した後、自己連結させてｐＴ
７−２９−１４を作成した。上述のｐＧＥ３３をＨｉｎ
ｄIIIで切断して得た約０．６ｋｂの断片を、ＨｉｎｄI
IIで切断しＢＡＰ処理したｐＴ７−２９−１４にクロー
ニングしてｐＧＥ２１３３（表７）を作成した。Step 7 (G under the control of the T7 promoter
ag-Env creation of a plasmid expressing the fusion protein) PAS192 (Step 1) The Bam HI, T4 DNA
After sequential treatment with polymerase and Cla I and electrophoresis, a fragment of about 310b was recovered from the agarose gel.
This fragment was digested with Apa I, T4 DNA polymerase, Cl
It was cloned into pTG210 (JP-A-4-117289) sequentially treated with aI to prepare pGE33 (Table 7). pG
E33 was cut with Hin dIII and after electrophoresis to recover a fragment of about 600b from the agarose. This fragment was cleaved with Hin dIII, and BAP treatment pTG11
0 and pTG591 (above JP-A-4-117289), and cloned into pGE1133 and pGE563, respectively.
3 (Table 7) was prepared. pGE33, pGE1133,
pGE5633 is a fusion protein Gag (308-406)-
Env (512-611), Gag (121-406)
-Env (512-611), and Gag (1-40
6) -Env (512-611), respectively.
pT7-7-1 multiple cloning site of the multiple cloning site of (Step 5) (Bam HI- Hin dIII) pUR292 ( Step 1) (Bam HI- Hi
you create a plasmid pT7-29-1 converted to n dIII). pT7-29-1 was cut with Bam HI to give T4
After treatment with DNA polymerase, self-ligation and pT
7-29-14 was prepared. Hin the pGE33 of the above-mentioned
The approximately 0.6 kb fragment obtained by cleaving with dIII was used for Hin dI
It was cleaved with II and cloned into BAP-treated pT7-29-14 to prepare pGE2133 (Table 7).

【００４８】ｐＡＳ１８２(ステップ１)をＢａｍＨＩ及
びＣｌａＩで切断して得た約５９０ｂの断片を、Ｂａｍ
ＨＩ及びＣｌａＩで開裂した上記のｐＧＥ２１３３及び
ｐＧＥ１１３３にクロ−ニングし、それぞれｐＧＥ２１
８及びｐＧＥ１１８(表７)を作成した。ｐＧＥ２１８及
びｐＧＥ１１８は、融合蛋白Ｇａｇ(３０８−４０６)−
Ｅｎｖ(５１２−６９９)及びＧａｇ(１２１−４０６）
−Ｅｎｖ(５１２−６９９）をそれぞれ発現する。The approximately 590b fragment obtained by digesting pAS182 (step 1) with Bam HI and Cla I was digested with Bam.
The above pGE2133 and pGE1133 cleaved with HI and ClaI were cloned into pGE213 and pGE213, respectively.
8 and pGE118 (Table 7) were made. pGE218 and pGE118 are fusion proteins Gag (308-406)-
Env (512-699) and Gag (121-406)
-Env (512-699), respectively.

【００４９】ｐＴ７−７（ステップ５）をＢｇｌＩＩで
開裂し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理した後、自己連
結させてｐＴ７−７（ＢｇｌＩＩＸ）を作成した。ｐＴ
Ｇ２１０(特開平４−１１７２８９)をＮｄｅＩ及びＣｌ
ａＩで切断して得た約１ｋｂの断片を、ＮｄｅＩ及びＣ
ｌａＩで開裂したｐＴ７−７(ＢｇｌＩＩＸ)にクローニ
ングしてｐＴＧ２１０Ｘを作成した。The pT7-7 (steps 5) was cleaved with Bgl II, was treated with T4DNA polymerase, was created pT7-7 (BglIIX) and self-ligated. pT
G210 (Japanese Patent Laid-Open No. 4-117289) with Nde I and Cl
The approximately 1 kb fragment obtained by digesting with a I was digested with Nde I and C
It was cloned into pT7-7 (BglIIX) cleaved with la I to prepare pTG210X.

【００５０】ｐＡＳ１９２(ステップ１)をＢａｍＨＩ及
びＣｌａＩで切断して得た約３１０ｂの断片をＢｇｌＩ
Ｉ及びＣｌａＩで開裂したｐＴＧ２１０Ｘにクローニン
グしてｐＧＥ３１(表７)を作成した。ｐＧＥ３１は、融
合蛋白Ｇａｇ(３０８−４３７)−Ｅｎｖ(５１２−６１
１)を発現する。[0050] pAS192 fragments (Step 1) The Bam HI及<br/> beauty Cla about 310b obtained by cutting with I Bgl I
It was cloned into pTG210X cleaved with I and Cla I to create pGE31 (Table 7). pGE31 is a fusion protein Gag (308-437) -Env (512-61).
Expresses 1).

【００５１】Ｔ７プロモーター支配下でＧａｇ−Ｅｎｖ
融合蛋白を発現するプラスミドを表７に示した。発現の
宿主として大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いた。融合
蛋白を多量に産生させるための菌の培養および蛋白の解
析はステップ２及び３に従った。Gag-Env under control of T7 promoter
The plasmids expressing the fusion protein are shown in Table 7. E. coli BL21 (DE3) strain was used as a host for expression. Cultivation of the bacterium and protein analysis for producing a large amount of the fusion protein followed steps 2 and 3.

【００５２】表７に示した融合蛋白を産生した大腸菌の
全菌体蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ＣＢＢで
染色した。このゲルをデンシトメーターでスキャンする
ことにより産生された融合蛋白の全菌体蛋白に対する割
合を測定した。最も産生量が多かったのはｐＧＥ３３、
ｐＧＥ２１８及びｐＧＥ３１が発現する融合蛋白で、全
菌体蛋白に対する割合は約２０％であった。All the E. coli cell proteins producing the fusion proteins shown in Table 7 were fractionated by SDS-PAGE and stained with CBB. By scanning the gel with a densitometer, the ratio of the fusion protein produced to the total bacterial protein was measured. PGE33 was the most produced,
The fusion protein expressed by pGE218 and pGE31 was about 20% of the total cell protein.

【００５３】ステップ８（Ｇａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白とＨ
ＩＶ抗体との反応性の確認）ステップ７で作成したｐＧＥ３３、ｐＧＥ３１及びｐＧ
Ｅ２１８は宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）株においてＧａｇ−
Ｅｎｖ融合蛋白を多量に産生した。このうち特に多量に
産生されたのはＧａｇ（３０８−４０６）−Ｅｎｖ（５
１２−６１１）（ｐＧＥ３３)であった。この融合蛋白
の診断用抗原としての有用性を確認するため、ステップ
２及び３の方法に従って、融合蛋白とＨＩＶ感染者血清
４１例（無症候性ＨＩＶキャリアー３６例、ＡＲＣ１
例、発症者４例）の反応をウエスタンブロットで調べた
（表８）。その結果、４1例全てのＥｎｖ抗体を検出す
ることができ、診断用抗原としての有用性が分かった。Step 8 (Gag-Env fusion protein and H
Confirmation of reactivity with IV antibody) pGE33, pGE31 and pG prepared in step 7
E218 is Gag-in the host BL21 (DE3) strain.
A large amount of Env fusion protein was produced. Of these, a particularly large amount was produced by Gag (308-406) -Env (5
12-611) (pGE33). In order to confirm the usefulness of this fusion protein as a diagnostic antigen, the fusion protein and serum of 41 HIV-infected persons (36 asymptomatic HIV carriers, ARC1) were used according to the method of steps 2 and 3.
The reaction of each case (4 cases) was examined by Western blotting (Table 8). As a result, all 41 Env antibodies could be detected, and their usefulness as a diagnostic antigen was found.

【００５４】ステップ９（Ｇａｇ（３０８−４０６）−
Ｅｎｖ（５１２−６１１）融合蛋白の精製）Ｇａｇ（３０８−４０６）−Ｅｎｖ（５１２−６１１）
融合蛋白を多量産生した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の
培養液（２５０ｍｌ）を遠心（５，０００ｒｐｍ，１０
分）して集菌した。菌体を１０ｍｌのバッファー（５０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ２−
メルカプトエタノール）で懸濁し、超音波処理により、
菌体を破砕した。この溶菌液を遠心（１９，０００ｒｐ
ｍ、３０分）すると、Ｇａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白は沈澱に
含まれていた。上清を捨て、沈澱を１０ｍｌのバッファ
ー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１０ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール）で懸濁し、５ｍｌのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを加えてよく混ぜた
後、１００℃で５分加熱した。これを遠心（１２，００
０ｒｐｍ、５分）した後、モデル４９１ＰｒｅｐＣｅ
ｌｌ(米国、ＢｉｏＲａｄ社製)のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
に上清２ｍｌ（１回当たり）をアプライし、４０ｍＡで
電気泳動した。クロマトの条件は、流速１ｍｌ／ｍｉ
ｎ、分画サイズ：２．５ｍｌ／ｆｒａｃ．で行なった。Step 9 (Gag (308-406)-
Purification of Env (512-611) Fusion Protein) Gag (308-406) -Env (512-611)
A culture solution (250 ml) of Escherichia coli BL21 (DE3) strain which produced a large amount of fusion protein was centrifuged (5,000 rpm, 10
Min) and collected. Use 10 ml of buffer (50
mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM 2-
Mercaptoethanol) and then sonicate
The cells were crushed. This lysate was centrifuged (19,000 rp)
m, 30 minutes), the Gag-Env fusion protein was included in the precipitate. The supernatant is discarded, and the precipitate is mixed with 10 ml of buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 m
M2-mercaptoethanol) and suspended in 5 ml of SD
The sample buffer for S-PAGE was added and mixed well, and then heated at 100 ° C. for 5 minutes. Centrifuge this (12,000
0 rpm, 5 minutes), then model 491 PrepCe
11 ml (manufactured by BioRad, USA) of SDS-PAGE gel was applied with 2 ml (one time) of the supernatant and electrophoresed at 40 mA. Chromatography conditions are flow rate 1 ml / mi
n, fraction size: 2.5 ml / frac. I did it in.

【００５５】Ｇａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白のピーク画分を、
約２０倍濃縮して、通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥの後ＣＢＢ
で染色した。融合蛋白が高度に精製されており、他の蛋
白のバンドは認められなかった。大腸菌培養液１ｌ当た
り約５ｍｇの精製Ｇａｇ(３０８−４０６)−Ｅｎｖ(５
１２−６１１)蛋白が得られた。The peak fraction of the Gag-Env fusion protein was
Concentrate about 20 times and perform CDS after normal SDS-PAGE
Stained with. The fusion protein was highly purified, and no bands of other proteins were observed. About 5 mg of purified Gag (308-406) -Env (5
12-611) protein was obtained.

【００５６】ステップ１０（精製Ｇａｇ−Ｅｎｖ融合蛋
白の診断用抗原としての有用性）ステップ９で得たＧａｇ(３０８−４０６)−Ｅｎｖ(５
１２−６１１)融合蛋白の精製標品を希釈し、１０、２
０、４０、８０、１６０及び３２０ngの各融合蛋白をｐ
ｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ膜に
ドットした。これをスキムミルクでブロッキングした
後、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０
ｍＭ、ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１００
倍希釈した５５例のＨＩＶ感染者(無症候性キャリア−
５０例、エイズ関連症候群１例、発症者４例)及び８４
例の非感染者(健常者)血清と反応させた。２次抗体には
ペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ(米国、
ＢｉｏＲａｄ社製)を用い、発色は常法に従った。こ
のドットブロット法の結果を表９に示す。Step 10 (Usefulness of purified Gag-Env fusion protein as a diagnostic antigen) Gag (308-406) -Env (5
12-611) Dilute the purified preparation of the fusion protein,
0, 40, 80, 160 and 320 ng of each fusion protein
Dotting on an olivinelidene difluoride membrane. After blocking this with skim milk, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150
100 mM, NaCl, 0.05% Tween 20
Fifty-five HIV-infected individuals (symptomatic carriers
50 cases, AIDS related syndrome 1 case, onset 4 cases) and 84
Reacted with the sera of non-infected persons (healthy persons). The secondary antibody was goat anti-human IgG labeled with peroxidase (US,
Bio Rad) was used, and the color was developed according to a conventional method. The results of this dot blot method are shown in Table 9.

【００５７】融合蛋白は、２０ｎｇで５５例すべてのＨ
ＩＶ感染者血清と特異的に反応し、更に、５ｎｇでも無
症候性キャリア−２例を除く感染者血清との間で特異的
反応を呈した。しかし、各濃度の融合蛋白と８４例の非
感染者血清との間では、特異的並びに非特異的反応は何
も認められなかった。斯かる結果から、この精製融合蛋
白は診断用抗原として有用性が極めて高いと判定され
た。The fusion protein contained 20 ng of H in all 55 cases.
It showed a specific reaction with the serum of an IV-infected person, and even with 5 ng, it showed a specific reaction with the serum of an infected person except asymptomatic carrier-2 cases. However, no specific or non-specific reaction was observed between each concentration of the fusion protein and the serum of 84 non-infected persons. From these results, it was determined that this purified fusion protein is extremely useful as a diagnostic antigen.

【００５８】実施例２ステップ１(高度精製Ｇａｇ蛋白ｐ５５の生産) ｐ５５を多量産生した大腸菌［ＢＬ２１(ＤＥ３)／ｐＴ
Ｇ５８１］の培養液を遠心(５，０００ rpm、１０分)し
て集菌した。菌体を培養液の１／５０容量のリン酸バッ
ファー(２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．９、１０
ｍＭ２−メルカプトエタノール)で懸濁し、超音波処理
により菌体を破砕した。この溶菌液を遠心(１９，００
０ rpm、６０分)すると、ｐ５５は上清に含まれてい
た。この上清から２０％飽和硫安処理により得た沈澱
を、８Ｍ尿素を含むリン酸バッファーに溶かして、リン
酸バッファーで平衡化したＳ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ(フ
ァルマシア社［スウェーデン］製)に通した。０〜１Ｍ
の塩化ナトリウム勾配により溶出し、ｐ５５画分をプー
ルし、３００ｍＭＮａＣｌを含むリン酸バッファーに透
析し、遠心(１９，０００ rpm、２０分)した。この上清
をリン酸バッファーで平衡化したＨｅｐａｒｉｎ−ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ(ファルマシア社製)に通し
た。０〜１Ｍの塩化ナトリウム勾配により溶出し、ｐ５
５画分をプールし、濃縮した。これにＳＤＳ−ＰＡＧＥ
用サンプルバッファーを加え、よく混ぜた後、Ｐｒｅｐ
Ｃｅｌｌに調製したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにアプライ
した。クロマトの条件は実施例１のステップ９に従っ
た。ｐ５５画分を約２０倍濃縮し、通常のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの後ＣＢＢで染色した。ｐ５５は高度に精製されて
おり、他の蛋白のバンドは認められなかった。Example 2 Step 1 (Production of highly purified Gag protein p55) Escherichia coli [BL21 (DE3) / pT] which produced a large amount of p55
The culture solution of G581] was centrifuged (5,000 rpm, 10 minutes) to collect the cells. The bacterial cells were mixed with 1/50 volume of phosphate buffer (20 mM sodium phosphate, pH 6.9, 10).
The cells were suspended in mM2-mercaptoethanol) and sonicated to disrupt the cells. The lysate was centrifuged (19:00).
(0 rpm, 60 minutes), p55 was contained in the supernatant. A precipitate obtained by treating the supernatant with 20% saturated ammonium sulfate was dissolved in a phosphate buffer containing 8 M urea and passed through S-sepharose (manufactured by Pharmacia [Sweden]) equilibrated with the phosphate buffer. 0-1M
The eluate was eluted with a sodium chloride gradient, the p55 fractions were pooled, dialyzed against a phosphate buffer containing 300 mM NaCl, and centrifuged (19,000 rpm, 20 minutes). This supernatant was equilibrated with phosphate buffer Heparin-se
It was passed through pharose CL-6B (manufactured by Pharmacia). Elute with 0-1 M sodium chloride gradient, p5
Five fractions were pooled and concentrated. SDS-PAGE
Sample buffer is added and mixed well, then Prep
It was applied to SDS-PAGE gel prepared in Cell. The chromatographic conditions were in accordance with Step 9 of Example 1. The p55 fraction was concentrated about 20-fold and the normal SDS-PA was used.
It was stained with CBB after GE. p55 was highly purified and no other protein bands were observed.

【００５９】ステップ２(大腸菌で多量に産生させ、高
度に精製したＧａｇ蛋白ｐ１７、ｐ２４、ｐ１５、及び
ｐ５５とＨＩＶ感染者血清中の各抗体との反応性) 高度に精製したｐ１７、ｐ２４、ｐ１５(ＷＯ９１／１
８９９０）、及びｐ５５(実施例２のステップ１)を実施
例１のステップ１０と同様に膜にドットし、４０例のＨ
ＩＶ感染者(無症候性キャリアー３５例、ＡＲＣ１例、
発症者４例）及び１０例の非感染者(健常者)の血清と反
応させた。血清反応及び発色反応は実施例１のステップ
１０に従った。この結果を表１０に示す。ｐ１７、ｐ２
４、及びｐ１５はそれぞれ、感染者の９２．５％(３７
／４０)、８７．５％(３５／４０)、及び８５％(３４／
４０)の特異的抗体を検出することができた。ｐ５５は
感染者血清４０例すべてと特異的に反応し、かついずれ
も他のＧａｇ蛋白(ｐ１７、ｐ２４、及びｐ１５)より反
応が強かった。更に注目すべきは、ｐ１７、ｐ２４、及
びｐ１５のいずれとも反応しなかった１例の無症候性キ
ャリアーにおいて、ｐ５５との反応が認められたことで
ある。最も反応が弱かったのはｐ１５であった。Step 2 (reactivity of highly purified Gag proteins p17, p24, p15 and p55 produced in Escherichia coli with each antibody in the serum of HIV-infected persons) highly purified p17, p24, p15 (WO91 / 1
8990), and p55 (step 1 of Example 2) are dot-formed on the film in the same manner as in Step 10 of Example 1, and 40 cases of H
IV infected (35 asymptomatic carriers, 1 ARC,
It was made to react with the sera of 4 cases) and 10 non-infected (healthy). The serum reaction and the color development reaction followed step 10 of Example 1. The results are shown in Table 10. p17, p2
4 and p15 were 92.5% (37
/ 40), 87.5% (35/40), and 85% (34 /
It was possible to detect the specific antibody of 40). p55 reacted specifically with all 40 sera of infected individuals, and all of them were more reactive than the other Gag proteins (p17, p24, and p15). Of further note is the reaction with p55 in one asymptomatic carrier that did not react with p17, p24 or p15. The weakest reaction was p15.

【００６０】また、ｐ１７、ｐ２４、及びｐ５５に対す
る反応は、無症候性ＨＩＶキャリアーに比べて、ＡＲＣ
及び発症者で弱かった。この現象はｐ１５に関しては認
められなかった。非感染者１０例はいずれも反応しなか
った。以上の結果から、ＨＩＶ感染をスクリーニングす
るためのＧａｇ抗原としてｐ５５が最もすぐれていると
考えられる。The response to p17, p24, and p55 was higher than that of the asymptomatic HIV carrier in ARC.
And was weak in the onset. This phenomenon was not observed for p15. None of the 10 non-infected individuals responded. From the above results, p55 is considered to be the best Gag antigen for screening HIV infection.

【００６１】[0061]

【表１】ＬａｃＺ−Ｅｎｖ蛋白質発現用プラスミドプラスミドクローニン 5'クローニ 3'クローニ 3'クローニ産生物** グ部位* ング部位のング部位のング部位* 塩基数* 塩基数* pAS160 KpnI 6343 7031 BglII LacZ-Env (14-244) pAS210 KpnI 6343 7611 BglII LacZ-Env (14-437) pAS200 KpnI 6343 8131 HindIII LacZ-Env (14-611) pAS172 StuI 6822 7391 Scal LacZ-Env (175-363) pAS220 HaeIII 6969 7834 HaeIII LacZ-Env (224-510) pAS311 BglII 7031 7611 BglII LacZ-Env (244-437) pAS331 BglII 7031 8131 HindIII LacZ-Env (244-611) pAS111 BglII 7031 8465 BamHI LacZ-Env (244-722) pAS131 BglII 7031 8887 XhoI LacZ-Env (244-826) pAS342 BglII 7611 8131 HindIII LacZ-Env (437-611) pAS122 BglII 7611 8465 BamHI LacZ-Env (437-722) pAS142 BglII 7611 8887 XhoI LacZ-Env (437-826) pAS192 HaeIII 7834 8131 HindIII LacZ-Env (512-611) pAS182 HaeIII 7834 8400 HaeIII LacZ-Env (512-699) pAS351 HindIII 8131 8465 BamHI LacZ-Env (610-722) pAS151 HindIII 8131 8887 XhoI LacZ-Env (610-826) pAS451 BamHI 8465 8887 XhoI LacZ-Env (721-826) ＊塩基配列及び塩基数はGenBankデータファイ
ルHIVNL43による。 ** カッコ内の数字はEnv蛋白質(gp160)のN末端から数
えたアミノ酸番号を示す。[Table 1] LacZ-Env protein expression plasmid Plasmid Clonin 5'Kuroni 3'Kuroni 3'Kuroni Product ** Long site * Long site of Long site * Long site * Number of bases * pAS160 KpnI 6343 7031 BglII LacZ-Env (14-244) pAS210 KpnI 6343 7611 BglII LacZ-Env (14-437) pAS200 KpnI 6343 8131 HindIII LacZ-Env (14-611) pAS172 StuI 6822 7391 Scal LacZ-Env (175-363) pAS220 HaeIII 6969 7834 HaeIII LacZ-Env (224-510) pAS311 BglII 7031 7611 BglII LacZ-Env (244-437) pAS331 BglII 7031 8131 HindIII LacZ-Env (244-611) pAS111 BglII 7031 8465 BamHI LacZ-Env (244-722) pAS131 BglII 7031 8887 XhoI LacZ-Env (244-826) pAS342 BglII 7611 8131 HindIII LacZ-Env (437-611) pAS122 BglII 7611 8465 BamHI LacZ-Env (437-722) pAS142 BglII 7611 8887 XhoI LacZ-Env (437-826) pAS192 HaeIII 7834 8131 HindIII LacZ-Env (512- 611) pAS182 HaeIII 7834 8400 HaeIII LacZ-Env (512-699) pAS351 HindIII 8131 8465 BamHI LacZ-Env (610-722) pAS151 HindIII 8131 8887 XhoI LacZ-Env (610-826) pAS451 BamHI 8465 8887 XhoI LacZ-Env ( 721-826) * base Columns and the number of bases according to GenBank data file HIVNL43. ** Numbers in parentheses indicate amino acid numbers counted from the N-terminus of Env protein (gp160).

【００６２】[0062]

【表２】ＬａｃＺ−Ｅｎｖ蛋白質とＨＩＶ−１無症候性キャリアー血清とのウエスタンブロッティングによる反応性プラスミド産生物血清Ａ血清Ｂ血清Ｃ pUR290 LacZ − − − pAS160 LacZ-Env(14-244) − − ＋ pAS210 LacZ-Env(14-437) − − ＋ pAS200 LacZ-Env(14-611) ＋＋＋ pAS172 LacZ-Env(175-363) − − ＋ pAS220 LacZ-Env(224-510) − ＋＋ pAS311 LacZ-Env(244-437) − − ＋ pAS331 LacZ-Env(244-611) ＋＋＋ pAS111 LacZ-Env(244-722) ＋＋＋ pAS131 LacZ-Env(244-826) ＋＋＋ pAS342 LacZ-Env(437-611) ＋＋＋ pAS122 LacZ-Env(437-722) ＋＋＋ pAS142 LacZ-Env(437-826) ＋＋＋ pAS192 LacZ-Env(512-611) ＋＋＋ pAS182 LacZ-Env(512-699) ＋＋＋ pAS351 LacZ-Env(610-722) − − ＋ pAS151 LacZ-Env(610-826) ＋＋＋ pAS451 LacZ-Env(721-826) ＋＋＋ [Table 2] Reactivity of LacZ-Env protein with HIV-1 asymptomatic carrier serum by Western blotting Plasmid product Serum A Serum B Serum C pUR290 LacZ − − − pAS160 LacZ-Env (14-244) − − + pAS210 LacZ-Env (14-437) − − + pAS200 LacZ-Env (14-611) + + + pAS172 LacZ-Env (175-363) − − ＋ pAS220 LacZ-Env (224-510) − ＋ + pAS311 LacZ-Env (244-437) − − ＋ pAS331 LacZ-Env (244-611) ＋＋＋ pAS111 LacZ -Env (244-722) ＋＋＋＋ pAS131 LacZ-Env (244-826) ＋＋＋ pAS342 LacZ-Env (437-611) ＋＋＋＋ pAS122 LacZ-Env (437-722) ＋＋＋ pAS142 LacZ-Env (437-826) ＋＋＋ pAS192 LacZ-Env (512-611) ＋＋＋ pAS182 LacZ-Env (512-699) ＋＋＋ pAS351 LacZ-Env (610-722) − − ＋ pAS151 LacZ-Env (610 -826 ) ＋＋＋ pAS451 LacZ-Env (721-826) ＋＋＋

【００６３】[0063]

【表３】Ｅｎｖ蛋白質上で同定されたエピトープ領域血清Ａ血清Ｂ血清Ｃ Env(14-244) Env(224-510) エピトープ領域 Env(244-437) Env(512-611) Env(512-611) Env(512-611) Env(610-722) Env(721-826) Env(721-826) Env(721-826)Table 3 Epitope regions identified on the Env protein Serum A Serum B Serum C Env (14-244) Env (224-510) Epitope region Env (244-437) Env (512-611) Env (512-611) Env (512-611) Env (610-722) Env (721-826) Env (721-826) Env (721-826)

【００６４】[0064]

【表４】ＨＩＶ−１キャリアー血清中のＥｎｖ抗体の検出抗原血清＋＋− − 合計ＡＣ３９ − − ３９ LacZ-Env(512-611) ＡＲＣ１ − − １ＡＩＤＳ４ − − ４ＡＣ３４３２３９ LacZ-Env(721-826) ＡＲＣ − １ − １ＡＩＤＳ１３ − ４ Table 4 Detection of Env antibodies in HIV-1 carrier serum Antigen serum ＋＋－－ Total AC 39 − − 39 LacZ-Env (512-611) ARC 1 − − 1 AIDS 4 − − 4 AC 34 3 239 LacZ-Env (721-826) ARC -1 -1 AIDS 1 3 -4

【００６５】[0065]

【表５】ＨＩＶ−１のＥｎｖ蛋白質の発現用プラスミドプラスミド 5'クローニン 5'クローニ 3'クローニ 3'クローニ産生物** グ部位* ング部位のング部位のング部位* 塩基数* 塩基数* pTE160 KpnI 6343 7031 BglII Env(14-244) pTE210 KpnI 6343 7611 BglII Env(14-437) pTE200 KpnI 6343 8131 HindIII Env(14-611) pTE172 StuI 6822 7391 ScaI Env(175-363) pTE17-2 StuI 6822 7391 ScaI Env(175-363) pTE220 HaeIII 6969 7834 HaeIII Env(224-510) pTE311 BglII 7031 7611 BglII Env(244-437) pTE342 BglII 7611 8131 HindIII Env(437-611) pTS23 BglII 7611 8887 XhoI Env(437-826) pTE192 HaeIII 7834 8132 HindIII Env(512-611) pTE18-192 HaeIII 7834 8131 HindIII Env(512-611) pTE182 HaeIII 7834 8400 HaeIII Env(512-699) pTE18-182 HaeIII 7834 8400 HaeIII Env(512-699) pTS45 BamHI 8465 8887 XhoI Env(721-826) ＊塩基配列及び塩基数はGenBankデータファイルHIV
NL43による。 ** カッコ内の数字はEnv蛋白質(gp160)のN末端から数え
たアミノ酸番号を示す。なお、どのプラスミドにおいても、Ｅｎｖ蛋白単独の実
用的な収率での発現は困難であることが分かった。Table 5 HIV-1 Env protein expression plasmids Plasmid 5'clonin 5'cloni 3'cloni 3'cloni Product ** Long site * Long site Long site *Number of bases * Number of bases * pTE160 KpnI 6343 7031 BglII Env (14-244) pTE210 KpnI 6343 7611 BglII Env (14-437) pTE200 KpnI 6343 8131 HindIII Env (14-611) pTE172 StuI 6822 7391 ScaI Env (175-363) pTE17-2 StuI 6822 7391 ScaI Env (175-363) pTE220 HaeIII 6969 7834 HaeIII Env (224-510) pTE311 BglII 7031 7611 BglII Env (244-437) pTE342 BglII 7611 8131 HindIII Env (437-611) pTS23 BglII 7611 8887 XhoI Env (437-826) pTE192 HaeIII 7834 8132 HindIII Env (512-611) pTE18-192 HaeIII 7834 8131 HindIII Env (512-611) pTE182 HaeIII 7834 8400 HaeIII Env (512-699) pTE18-182 HaeIII 7834 8400 HaeIII Env (512-699) pTS45 BamHI 8465 8887 XhoI Env (721-826) * Base sequence and number of bases are GenBank data file HIV
According to NL43. ** Numbers in parentheses are from the N-terminus of Env protein (gp160)
The amino acid numbers are shown. In all plasmids, the Env protein alone
It has been found that expression in a reasonable yield is difficult.

【００６６】[0066]

【表６】ＨＩＶ−１のＧａｇ蛋白質の発現用プラスミドプラスミドクローニン 5'クローニ 3'クローニ 3'クローニ産生物*** グ部位* ング部位のング部位のング部位* 塩基数* 塩基数* pTG581 NdeI** 787 2429 BclI Gag(1-500) pEG581 NdeI** 787 2429 BclI Gag(1-500) pTG571 NdeI** 787 2096 BglII Gag(1-437) pEG571 NdeI** 787 2096 BglII Gag(1-437) pTG561 NdeI** 787 2006 Apal Gag(1-405) pTG551 NdeI** 787 1712 HindIII Gag(1-309) pTG541 NdeI** 787 1415 PstI Gag(1-210) pTG531 NdeI** 787 1247 NsiI Gag(1-154) pTG207 NdeI** 787 1415 PstI Gag(1-132)**** pTG521 NdeI** 787 1145 PvuII Gag(1-119) pTG121 PvuII 1145 2096 BglII Gag(121-437) pTG110-2 PvuII 1145 2006 ApaI Gag(121-405) pTG212 HindIII 1712 2429 BclI Gag(308-500) pTG221 HindIII 1712 2096 BglII Gag(308-437) pTG210-2 HindIII 1712 2006 ApaI Gag(308-405) * 塩基配列及び塩基数はGenBankデータファイルHIVN
L43による。 ** インビトロ突然変異によりGag遺伝子の開始コドン
部位にNdeI部位を導入した。 *** カッコ内の数字はgag蛋白質(p55)のN末端から数え
たアミノ酸番号を示す。 **** p17を発現させるため、p24の第1コドンを終止コド
ンに改変した。TABLE 6 HIV-1 Gag protein expression plasmids Plasmid Clonin 5'cloni 3'cloni 3'cloni Product *** Long site * Long site Long site *Number of bases * Number of bases * pTG581 NdeI ** 787 2429 BclI Gag (1-500) pEG581 NdeI ** 787 2429 BclI Gag (1-500) pTG571 NdeI ** 787 2096 BglII Gag (1-437) pEG571 NdeI ** 787 2096 BglII Gag (1-437) pTG561 NdeI ** 787 2006 Apal Gag (1-405) pTG551 NdeI ** 787 1712 HindIII Gag (1-309) pTG541 NdeI ** 787 1415 PstI Gag (1-210) pTG531 NdeI ** 787 1247 NsiI Gag (1-154) pTG207 NdeI ** 787 1415 PstI Gag (1-132) **** pTG521 NdeI ** 787 1145 PvuII Gag (1-119) pTG121 PvuII 1145 2096 BglII Gag (121-437) pTG110-2 PvuII 1145 2006 ApaI Gag (121-405) pTG212 HindIII 1712 2429 BclI Gag (308-500) pTG221 HindIII 1712 2096 BglII Gag (308-437) pTG210-2 HindIII 1712 2006 ApaI Gag (308-405) * Base sequence and number of bases are GenBank data file HIVN
According to L43. ** Start codon of Gag gene due to in vitro mutation
On the partNdeThe I site was introduced. *** Numbers in parentheses are counted from the N-terminus of gag protein (p55)
The amino acid numbers are shown. **** Stop the first codon of p24 to express p17.
It was changed to

【００６７】[0067]

【表７】Ｇａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白質の発現用プラスミド産生物プラスミドＧａｇ蛋白質領域Ｅｎｖ蛋白質領域（アミノ酸番号）（アミノ酸番号） pGE216 308-406 14-244 pGE116 121-406 14-244 pGE221 308-406 14-437 pGE217 308-406 175-363 pGE117 121-406 175-363 pGE231 308-406 244-437 pGE131 121-406 244-437 pGE223 308-406 437-510 pGE123 121-406 437-510 pGE523 1-406 437-510 pGE2134 308-406 437-611 pGE1134 121-406 437-611 pGE5634 1-406 437-611 pGE271 1-119 437-611 pGE2112 308-406 437-722 pGE1112 121-406 437-722 pGE5612 1-406 437-722 pGE2142 308-406 437-826 pGE1142 121-406 437-826 pGE5642 1-406 437-826 pGE30 308-436 437-826 pGE33 308-406 512-611 pGE1133 121-406 512-611 pGE5633 1-406 512-611 pGE281 1-119 512-611 pGE31 308-437 512-611 pGE218 308-406 512-699 pGE118 121-406 512-699 pGE280 1-119 512-699 pGE34 308-406 721-826 pGE1145 121-406 721-826 pGE5645 1-406 721-826 pGE290 1-119 721-826 pGE32 308-435 723-826 Table 7: Gag-Env fusion protein expression plasmids Product Plasmid Gag protein region Env protein region (Amino acid number) (Amino acid number) pGE216 308-406 14-244 pGE116 121-406 14-244 pGE221 308-406 14-437 pGE217 308-406 175-363 pGE117 121-406 175-363 pGE231 308-406 244-437pGE131 121-406 244-437 pGE223 308-406 437-510 pGE123 121-406 437-510pGE523 1-406 437-510 pGE2134 308-406 437-611 pGE1134 121-406 437-611 pGE5634 1-406 437-611pGE271 1-119 437-611 pGE2112 308-406 437-722 pGE1112 121-406 437-722pGE5612 1-406 437-722 pGE2142 308-406 437-826 pGE1142 121-406 437-826 pGE5642 1-406 437-826pGE30 308-436 437-826 pGE33 308-406 512-611 pGE1133 121-406 512-611 pGE5633 1-406 512-611 pGE281 1-119 512-611pGE31 308-437 512-611 pGE218 308-406 512-699 pGE118 121-406 512-699pGE280 1-119 512-699 pGE34 308-406 721-826 pGE1145 121-406 721-826 pGE5645 1-406 721-826 pGE290 1-119 721-826pGE32 308-435 723-826

【００６８】[0068]

【表８】ＨＩＶ−１キャリアー血清中のＥｎｖ抗体及びＧａｇ抗体の検出抗原血清＋＋− − 合計 AC 36 − − 36 Gag(308-406)-Env(512-611) ARC 1 − − 1 AIDS 4 − − 4 Table 8 Detection of Env and Gag antibodies in HIV-1 carrier serum Antigen serum + +-total AC 36 − − 36 Gag (308-406) -Env (512-611) ARC 1 − − 1 AIDS 4 − − 4

【００６９】[0069]

【表９】精製Ｇａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白のＨＩＶ−１キャリアー及び健常者血清との反応性血清 − ＋＋＋＋＋＋合計ＡＣ０１１５３５５ＡＲＣ０００１１ＡＩＤＳ０００４４非感染者８４０００８４ −：３２０ｎｇの精製融合蛋白との間で反応なし。＋、＋＋、＋＋＋：２０、１０及び５ｎｇ以上の精製融
合蛋白との間で反応あり。Table 9 Reactivity of purified Gag-Env fusion protein with HIV-1 carrier and serum of healthy subjects Blood serum − ＋＋＋＋＋＋ Total AC 0 1 1 53 55 ARC 0 0 0 1 1 AIDS 0 0 0 4 4 Non-infected 84 0 0 0 84 -: No reaction with 320 ng of purified fusion protein. +, ++, +++: Refining melt of 20, 10 and 5 ng or more
There is a reaction with synthetic protein.

【００７０】[0070]

【表１０】各種Ｇａｇ蛋白のＨＩＶ−１キャリアー血清抗体との反応性 (Ａ)抗ｐ５５抗体の検出血清抗体の検出限界検出数検体数 320 160 80 40 20 10 5(ng) ＡＣ 3 2 3 27 35 35 ＡＲＣ 1 1 1 ＡＩＤＳ 3 1 4 4 （Ｂ）抗ｐ１７抗体の検出血清抗体の検出限界検出数検体数 320 160 80 40 20 10 5(ng) ＡＣ 1 5 3 8 11 5 33 35 ＡＲＣ 1 1 1 ＡＩＤＳ 2 1 3 4 （Ｃ）抗ｐ２４抗体の検出血清抗体の検出限界検出数検体数 320 160 80 40 20 10 5(ng) ＡＣ 4 2 4 6 9 3 3 31 35 ＡＲＣ 0 1 ＡＩＤＳ 1 1 2 4 4 （Ｄ）抗ｐ１５抗体の検出血清抗体の検出限界検出数検体数 320 160 80 40 20 10 5(ng) ＡＣ 1 2 8 16 3 30 35 ＡＲＣ 1 1 1 ＡＩＤＳ 1 2 3 4Table 10 Reactivity of various Gag proteins with HIV-1 carrier serum antibody (A) Detection of anti-p55 antibody Detection limit detection number of serum antibody Number of samples 320 160 80 40 20 10 5 (ng) AC 3 2 3 27 35 35 ARC 1 1 1 AIDS 3 1 4 4 (B) Detection of anti-p17 antibody Serum antibody detection limit Detection number Number of samples 320 160 80 40 20 10 5 (ng) AC 1 5 3 8 11 5 33 35 ARC 1 1 1 AIDS 2 1 3 4 (C) Detection of anti-p24 antibody Serum antibody detection limit Detection number Number of samples 320 160 80 40 20 10 5 (ng) AC 4 2 4 6 9 3 3 31 35 ARC 0 1 AIDS 1 1 2 4 4 (D) Detection of anti-p15 antibody Detection limit detection number of serum antibody Number of samples 320 160 80 40 20 10 5 (ng) AC 1 2 8 16 3 30 35 ARC 1 1 1 AIDS 1 2 3 4

【００７１】[0071]

【発明の作用と効果】[Operation and effect of the invention]

（１）本発明に係るＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白及びＧａｇ
蛋白は、異種蛋白を有さない純正のＨＩＶ抗原であるた
め、ＨＩＶ抗体に対し極めて特異性が高く、また、エイ
ズ非感染者の血清とは非特異的な凝集反応を生じない。
即ち、高純度かつ高品質のＨＩＶ抗原が廉価かつ大量に
提供できるため、ＨＩＶとその関連感染症、成人Ｔ細胞
白血病等の基礎研究、特異的な治療剤や予防剤の開発、
診断等に長足の進歩をもたらすと共に、エイズ根絶の一
助かつ福音となる。（２）本発明によれば、極めて危険度の高いＨＩＶその
ものを使用しないで、組換えＤＮＡ技術によってＧａｇ
−Ｅｎｖ融合蛋白及びＧａｇ蛋白を製造できるため、製
造工程下でのバイオハザード対策の観点から、優れて安
全であり、且つ、製造も効率的に実施できる。（３）培養液１リットルからのＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白
及びＧａｇ蛋白の産生量は各々、蛋白量で約１〜５０ｍ
ｇであり、生産性は極めて高い。(1) Gag-Env fusion protein and Gag according to the present invention
Since the protein is a genuine HIV antigen having no heterologous protein, it has extremely high specificity for HIV antibody and does not cause a nonspecific agglutination reaction with the serum of non-AIDS patients.
That is, since high-purity and high-quality HIV antigens can be provided inexpensively and in large amounts, basic research on HIV and its related infectious diseases, adult T-cell leukemia, development of specific therapeutic agents and preventive agents,
Along with making great progress in diagnosis, it will help eliminate the AIDS and serve as a gospel. (2) According to the present invention, Gag can be obtained by recombinant DNA technology without using HIV itself, which is extremely dangerous.
Since the Env fusion protein and the Gag protein can be produced, they are excellent and safe from the viewpoint of biohazard countermeasures during the production process, and can be produced efficiently. (3) The production amount of Gag-Env fusion protein and Gag protein from 1 liter of the culture solution is about 1 to 50 m in terms of protein amount, respectively.
The productivity is extremely high.

【００７２】[0072]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１−１】図１−１〜図１−２は、ＨＩＶ−１全ゲノ
ムを有するプラスミドｐＮＬ４−３内のｇａｇ遺伝子全
領域がコードするＧａｇ蛋白の全アミノ酸配列を示す。FIGS. 1-1 and 1-2 show the entire amino acid sequence of the Gag protein encoded by the entire gag gene region in the plasmid pNL4-3 having the HIV-1 whole genome.

【図１−２】同上[Figure 1-2] Same as above

【図２−１】図２−１〜図２−３は、ＨＩＶ−１全ゲノ
ムを有するプラスミドｐＮＬ４−３内のｅｎｖ遺伝子全
領域がコードするＥｎｖ蛋白の全アミノ酸配列を示す。2-1 to 2-3 show the entire amino acid sequence of Env protein encoded by the entire env gene region in the plasmid pNL4-3 having the HIV-1 whole genome.

【図２−２】同上[Fig. 2-2] Same as above

【図２−３】同上[Fig. 2-3] Same as above

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/62 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/569 Ｈ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｒ 1:19） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification code Internal reference number FI Technical indication C12N 15/62 C12P 21/02 C 8214-4B G01N 33/53 D 8310-2J 33/569 H 9015 -2J // (C12P 21/02 C C12R 1:19)

Claims

【特許請求の範囲】[Claims]

【請求項１】ＧａｇペプチドがそのＣ末端においてＥ
ｎｖペプチドと融合してなるＧａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白を
含む実質的に純粋なＨＩＶ抗原。上記のＧａｇペプチド
は、Ｇａｇ(３０８−４３７)で表わされるアミノ酸配列
の少なくとも１０個の連続したアミノ酸よりなり（但
し、上記括弧内の番号は図１のＧａｇ蛋白の全アミノ酸
配列のアミノ酸番号を示す）、上記のＥｎｖペプチドは、Ｅｎｖ（５１２−６９９）で
表わされるアミノ酸配列の少なくとも一部よりなり且つ
該一部のアミノ酸配列はＨＩＶ抗体に対し反応性を示す
少なくとも１つのエピトープを含有している（但し、上
記の各々の括弧内の番号は図２のＥｎｖ蛋白の全アミノ
酸配列のアミノ酸番号を示す）。1. A Gag peptide is E at its C-terminus.
A substantially pure HIV antigen comprising a Gag-Env fusion protein fused to an nv peptide. The above-mentioned Gag peptide consists of at least 10 consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by Gag (308-437) (however, the numbers in the above parentheses indicate the amino acid numbers of the entire amino acid sequence of the Gag protein of FIG. 1). ), The above-mentioned Env peptide consists of at least a part of the amino acid sequence represented by Env (512-699), and the part of the amino acid sequence contains at least one epitope that is reactive to HIV antibody. (However, the number in each parenthesis above indicates the amino acid number of the entire amino acid sequence of the Env protein in FIG. 2).

【請求項２】上記のＥｎｖペプチドに含まれるエピト
ープが、Ｅｎｖ（５１２−６９９）で表わされるアミノ
酸配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸よりなる請
求項１に記載のＨＩＶ抗原。2. The HIV antigen according to claim 1, wherein the epitope contained in the Env peptide consists of at least 5 consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by Env (512-699).

【請求項３】請求項１に記載のＨＩＶ抗原と、図１の
Ｇａｇ蛋白の全アミノ酸配列であるＧａｇ（１−５０
０）で表わされるアミノ酸配列（但し、上記括弧内の番
号は図１のＧａｇ蛋白の全アミノ酸配列のアミノ酸番号
を示す）よりなるＧａｇ蛋白との混合物を含むＨＩＶ抗
原。3. The HIV antigen according to claim 1, and Gag (1-50) which is the entire amino acid sequence of the Gag protein of FIG.
HIV antigen containing a mixture with a Gag protein consisting of the amino acid sequence represented by 0) (however, the numbers in the above parentheses indicate the amino acid numbers of the entire amino acid sequence of the Gag protein of FIG. 1).

【請求項４】図１のＧａｇ蛋白の全アミノ酸配列であ
るＧａｇ（１−５００）で表わされるアミノ酸配列（但
し、上記括弧内の番号は図１のＧａｇ蛋白の全アミノ酸
配列のアミノ酸番号を示す）よりなる実質的に単離され
た形のＧａｇ蛋白からなる実質的に純粋なＨＩＶ抗原。4. An amino acid sequence represented by Gag (1-500), which is the entire amino acid sequence of the Gag protein of FIG. 1 (however, the numbers in the above parentheses indicate the amino acid numbers of the entire amino acid sequence of the Gag protein of FIG. 1). ) A substantially pure HIV antigen consisting of a Gag protein in a substantially isolated form consisting of

【請求項５】（ａ）第１のデオキシリボ核酸を複製可
能な発現ベクターに連係して、宿主細胞内で複製可能な
第１の組換えＤＮＡを得、上記の第１のデオキシリボ核酸は、Ｇａｇ（３０８−４
３７）で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１０個の
連続したアミノ酸よりなるＧａｇペプチドをコードして
おり（但し、上記括弧内の番号は図１のＧａｇ蛋白の全
アミノ酸配列のアミノ酸番号を示す）；（ｂ）第２のデオキシリボ核酸を、上記の第１の組換え
ＤＮＡの第１のデオキシリボ核酸の下流に連係して、第
２のデオキシリボ核酸が第１のデオキシリボ核酸に融合
するようにし、上記の第２のデオキシリボ核酸は、Ｅｎｖ（５１２−６
９９）で表わされるアミノ酸配列の少なくとも一部より
なり且つ該一部のアミノ酸配列はＨＩＶ抗体に対し反応
性を示す少なくとも１つのエピトープを含有するＥｎｖ
ペプチドをコードしており（但し、上記の各々の括弧内
の番号は図２のＨＩＶのＥｎｖ蛋白の全アミノ酸配列の
アミノ酸番号を示す），かくして、宿主細胞内で複製可
能な第２の組換えＤＮＡを得；（ｃ）上記の第２の組換えＤＮＡにより、原核生物また
は真核生物細胞を形質転換して形質転換体を形成し；（ｄ）該形質転換体を該原核生物または真核生物の非形
質転換細胞から選別し；（ｅ）該形質転換体を培養して、該Ｇａｇペプチドがそ
のＣ末端において該Ｅｎｖペプチドと融合してなるＧａ
ｇ−Ｅｎｖ融合蛋白を含むＨＩＶ抗原を産生し；そして（ｆ）該Ｇａｇ−Ｅｎｖ融合蛋白を含む該ＨＩＶ抗原を
形質転換体培養物から単離する、ことを特徴とする実質的に純粋なＨＩＶ抗原の製造方
法。5. (a) A first recombinant DNA replicable in a host cell is obtained by linking a first deoxyribonucleic acid to a replicable expression vector, wherein the first deoxyribonucleic acid is Gag. (308-4
37) which encodes a Gag peptide consisting of at least 10 consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by (37) (however, the numbers in the above parentheses indicate the amino acid numbers of the entire amino acid sequence of the Gag protein of FIG. 1); b) linking the second deoxyribonucleic acid downstream of the first deoxyribonucleic acid of the first recombinant DNA so that the second deoxyribonucleic acid is fused to the first deoxyribonucleic acid; The deoxyribonucleic acid of 2 is Env (512-6
99) which comprises at least a part of the amino acid sequence represented by 99) and which contains at least one epitope showing reactivity with HIV antibody.
A second recombinant that encodes a peptide (where the number in each bracket above indicates the amino acid number of the entire amino acid sequence of the HIV Env protein of Figure 2), and thus replicable in the host cell. (C) transforming a prokaryotic or eukaryotic cell with the second recombinant DNA to form a transformant; and (d) transforming the transformant into the prokaryotic or eukaryotic cell. (E) culturing the transformant so that the Gag peptide is fused at the C-terminus with the Env peptide.
producing an HIV antigen containing a g-Env fusion protein; and (f) isolating the HIV antigen containing the Gag-Env fusion protein from a transformant culture. Method for producing antigen.

【請求項６】上記の第２のデオキシリボ核酸が、Ｅｎ
ｖ（５１２−６９９）で表わされるアミノ酸配列の少な
くとも５個の連続したアミノ酸よりなるＥｎｖペプチド
をコードしている請求項５に記載の方法。6. The second deoxyribonucleic acid is En
The method according to claim 5, which encodes an Env peptide consisting of at least 5 consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by v (512-699).

【請求項７】該発現ベクターがｐＴ７系列またはｐＵ
Ｒ２９０系列のベクターである請求項５または６に記載
の方法。7. The expression vector is pT7 series or pU.
The method according to claim 5 or 6, which is an R290 series vector.

【請求項８】該ｐＴ７系列のベクターがｐＴ７−７で
ある請求項７に記載の方法。8. The method according to claim 7, wherein the pT7 series vector is pT7-7.

【請求項９】複製可能な発現ベクター、その中に挿入
された第１のデオキシリボ核酸、及び該第１のデオキシ
リボ核酸の下流に位置し且つ第１のデオキシリボ核酸に
融合している第２のデオキシリボ核酸を含む、宿主細胞
内で複製可能な組換えＤＮＡ。上記の第１のデオキシリ
ボ核酸は、Ｇａｇ（３０８−４３７）で表わされるアミ
ノ酸配列の少なくとも１０個の連続したアミノ酸よりな
るＧａｇペプチドをコードしており（但し、上記括弧内
の番号は図１のＨＩＶのＧａｇ蛋白の全アミノ酸配列の
アミノ酸番号を示す）、上記の第２のデオキシリボ核酸は、Ｅｎｖ（５１２−６
９９）で表わされるアミノ酸配列の少なくとも一部より
なり且つ該一部のアミノ酸配列はＨＩＶ抗体に対し反応
性を示す少なくとも１つのエピトープを含有するＥｎｖ
ペプチドをコードしている（但し、上記の各々の括弧内
の番号は図２のＨＩＶのＥｎｖ蛋白の全アミノ酸配列の
アミノ酸番号を示す）。9. A replicable expression vector, a first deoxyribonucleic acid inserted therein, and a second deoxyribonucleic acid located downstream of and fused to the first deoxyribonucleic acid. Recombinant DNA capable of replicating in a host cell, including nucleic acid. The above-mentioned first deoxyribonucleic acid encodes a Gag peptide consisting of at least 10 consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by Gag (308-437) (however, the numbers in the above parentheses indicate the HIV in FIG. 1). The amino acid number of the entire amino acid sequence of the Gag protein is shown), and the second deoxyribonucleic acid is Env (512-6).
99) which comprises at least a part of the amino acid sequence represented by 99) and which contains at least one epitope showing reactivity with HIV antibody.
It encodes a peptide (however, the number in each parenthesis above indicates the amino acid number of the entire amino acid sequence of the HIV Env protein in FIG. 2).

【請求項１０】上記の第２のデオキシリボ核酸が、Ｅ
ｎｖ（５１２−６９９）で表わされるアミノ酸配列の少
なくとも５個の連続したアミノ酸よりなるＥｎｖペプチ
ドをコードしている請求項９に記載の組換えＤＮＡ。10. The second deoxyribonucleic acid is E
The recombinant DNA according to claim 9, which encodes an Env peptide consisting of at least 5 consecutive amino acids of the amino acid sequence represented by nv (512-699).

【請求項１１】該発現ベクターがｐＴ７系列またはｐ
ＵＲ２９０系列のベクターである請求項９または１０に
記載の組換えＤＮＡ。11. The expression vector is pT7 series or p
The recombinant DNA according to claim 9 or 10, which is a UR290 series vector.

【請求項１２】該ｐＴ７系列のベクターがｐＴ７−７
である請求項１１に記載の組換えＤＮＡ。12. The pT7 series vector is pT7-7.
The recombinant DNA according to claim 11, which is

【請求項１３】免疫学的反応によってエイズを検知す
るための診断剤にして、請求項１〜４のいずれかに記載
のＨＩＶ抗原を免疫学的反応を呈するに十分の量含有す
ることを特徴とする診断剤。13. A diagnostic agent for detecting AIDS by an immunological reaction, which comprises the HIV antigen according to any one of claims 1 to 4 in an amount sufficient to exhibit an immunological reaction. And a diagnostic agent.

【請求項１４】請求項１〜４のいずれかに記載のＨＩ
Ｖ抗原を免疫原性を奏するのに十分の量含有し、かつ少
なくとも１つの医薬的に許容されるアジュバント、稀釈
剤または賦形剤を含有することを特徴とするエイズワク
チン。14. The HI according to any one of claims 1 to 4.
An AIDS vaccine comprising V antigen in an amount sufficient to be immunogenic, and at least one pharmaceutically acceptable adjuvant, diluent or excipient.