JPH0682446A - Diagnostic method for kidney disease - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide an diagnostic method of kidney disease in its early stages in which decomposed albumin in human urine is specifically detected using a decomposed antihuman albumin antibody. CONSTITUTION:To detect decomposed human albumin in the urine of a healthy person and in that of a kidney-diseased person, polycylonal and monoclonal antibodies whose immunogen is a decomposed albumin in urine derived from a kidney-diseased person and obtained by the chemical and enzymatic treatments of human albumin are sampled. Measuring methods using the polyclonal and monoclonal antibodies, such as RIA, EIA, gold colloidal particle method and latex coagulation method, are established. Kidney disease is diagnosed at an early stage by inspection of the urine of a subject using the various kinds of measuring methods. Early diagnosis of kidney disease is made possible by the method excellent in simplicity, quickness and specificity.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は尿中のアルブミン分解物
を検出することによって早期腎症を発見し診断に役立て
るものである。BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention is intended to detect early nephropathy by detecting a degradation product of albumin in urine and to be useful for diagnosis.

【０００２】[0002]

【従来の技術ならびに発明が解決すべき問題点】腎症、
特に糖尿病性腎症は腎生検が困難なことから持続性蛋白
尿、腎機能障害、高血圧等の知見から臨床診断がなされ
てきた。しかし、蛋白尿が出現すると治療が難しく、５
〜６年経過で末期腎不全に陥るのが通例である。そのた
め、通常の尿試験紙法で尿蛋白が陽性となる前に腎病変
を診断して早期治療を行なうことが臨床医学の立場から
強く望まれている。この目的で開発されたのが尿中アル
ブミンの微量測定法であり、近年腎症の診療にとって必
須の検査法になりつつある。[Prior Art and Problems to be Solved by the Invention] Nephropathy,
Particularly, for diabetic nephropathy, since renal biopsy is difficult, clinical diagnosis has been made based on findings such as persistent proteinuria, renal dysfunction, and hypertension. However, if proteinuria appears, it is difficult to treat.
It is customary to fall into end-stage renal failure after 6 years. Therefore, from the standpoint of clinical medicine, it is strongly desired to diagnose renal lesions and perform early treatment before urine protein becomes positive by the usual urine test strip method. A micrometric method for urinary albumin was developed for this purpose, and in recent years, it has become an essential test method for medical treatment of nephropathy.

【０００３】尿中の微量アルブミンは放射線免疫測定法
（以下ＲＩＡと略す）、酵素免疫測定法（以下ＥＩＡと
略す）や免疫沈澱法により、正確に定量できるが、最近
は簡易キットが市販されており、アルブシュア（登録商
標）（エーザイ株式会社）もその一つである。これは免
疫凝集阻止反応を原理としており、試薬はアルブミン感
作ラテックスとアルブミン抗体であり、尿中にアルブミ
ンが殆どなければ抗原抗体反応でラテックスが凝集する
が、尿中にアルブミンがあればこれを妨害して凝集が阻
止される。Microalbumin in urine can be accurately quantified by radioimmunoassay (hereinafter abbreviated as RIA), enzyme-immunoassay (hereinafter abbreviated as EIA) and immunoprecipitation method, but recently a simple kit has been commercially available. Arbushua (registered trademark) (Eisai Co., Ltd.) is one of them. This is based on the principle of immune agglutination inhibition reaction, the reagents are albumin-sensitized latex and albumin antibody, and if there is almost no albumin in urine, the latex will agglutinate due to antigen-antibody reaction, but if albumin is present in urine, Interfering to prevent agglomeration.

【０００４】このように微量のアルブミンを測定するこ
とにより腎疾患を診断する方法はあるが、さらに早期に
腎症の診断ができるものはない。すなわち、Ｍｏｇｅｎ
ｓｅｎら（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１０，３５
６，１９８４）の分類によると、微量アルブミン尿は糖
尿病発症６〜２０年の早期腎症の時期であり、第四期
（顕性腎症）へ移行する危険性が大きいのでさらに前期
の腎症診断の手法を開発することが望まれている。Although there is a method for diagnosing renal disease by measuring a minute amount of albumin as described above, there is no method for diagnosing nephropathy at an earlier stage. That is, Mogen
Sen et al. ( N. Engl . J. Med ., 310 , 35.
6, 1984), microalbuminuria is a stage of early nephropathy 6 to 20 years after the onset of diabetes, and there is a high risk of transition to the 4th stage (overt nephropathy). It is desired to develop a diagnostic method.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、先に糖尿
病性腎症を含めた各腎疾患の早期診断の立場から、尿中
アルブミンに着目しヒトアルブミンとは異なるアルブミ
ン分解物〔以下ｕＡＦと略す。ｕＡＦとはヒトアルブミ
ン（分子量６９ＫＤ，等電点４．９）と異なる分子量ま
たは等電点を示すすべてのヒトアルブミン断片をいう。
ｕＡＦは未還元条件下ではジスルフィド結合を有するも
のが多いため比較的分子量の大きいものが多いが、還元
処理を行うとジスルフィド結合が開裂してさらに低分子
化されるものが多い。〕をはじめて発見するに至り、そ
の検出方法としてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動法を用いた「腎疾患の診断法」特願平３−１４８０８
０の発明を完成させた。その後、ｕＡＦの検出方法を精
査した結果、セルロースアセテート膜電気泳動法や等電
点ゲル電気泳動法さらには高速液体クロマトグラフィー
による分析法によってもｕＡＦの検出や定量にも有効で
あることが判り、これらの方法をまとめて「腎疾患の診
断法」特願平４−１０５２１４の発明を完成させるに至
った。しかしながら、これらの方法を詳細に検討した結
果迅速性や簡便性に欠ており、またかなりの熟練と経験
を必要とするものであることが判り、いつでもどこでも
誰にでもｕＡＦの検出や定量を行い得ることが要望され
ていた。[Means for Solving the Problems] From the standpoint of early diagnosis of each renal disease including diabetic nephropathy, the present inventors have focused on urinary albumin, which is an albumin degradation product different from human albumin [hereinafter Abbreviated as uAF. uAF refers to all human albumin fragments showing a different molecular weight or isoelectric point from human albumin (molecular weight 69 KD, isoelectric point 4.9).
Since many uAFs have a disulfide bond under non-reducing conditions, many of them have a relatively large molecular weight, but many of them have a lower molecular weight due to cleavage of the disulfide bond when subjected to reduction treatment. ] For the first time, and as a detection method thereof, "Diagnosis method of renal disease" using SDS polyacrylamide gel electrophoresis Japanese Patent Application No. 3-14808
Completed 0 invention. After that, as a result of scrutinizing the detection method of uAF, it was found that it is also effective for the detection and quantification of uAF by a cellulose acetate membrane electrophoresis method, an isoelectric focusing gel electrophoresis method, and an analysis method by high performance liquid chromatography. These methods have been put together to complete the invention of Japanese Patent Application No. 4-105214 for "diagnosis of renal disease". However, as a result of examining these methods in detail, it was found that they lacked promptness and convenience, and required considerable skill and experience, and anytime, anywhere, anyone could detect and quantify uAF. It was desired to get.

【０００６】本発明はこれらの問題を解決するためにヒ
トアルブミン（６９ＫＤ）とは反応せずｕＡＦのみに反
応する抗体を用いて例えばＥＩＡ法、金コロイド粒子
法、ＲＩＡ法、ラテックス凝集法、逆受身赤血球凝集反
応（以下ＲＰＨＡと略す）法など抗原抗体反応を基本原
理としたあらゆる公知の方法を用いてｕＡＦを検出し定
量できる方法を見出し本発明の完成に至った。In order to solve these problems, the present invention uses an antibody that does not react with human albumin (69KD) but only uAF, for example, EIA method, colloidal gold particle method, RIA method, latex agglutination method, reverse method. The present invention has been completed by finding a method capable of detecting and quantifying uAF using any known method based on an antigen-antibody reaction such as a passive hemagglutination reaction (hereinafter abbreviated as RPHA) method.

【０００７】１） 免疫原の調製方法 （ａ） ヒトアルブミン分子の化学的切断によるアルブ
ミン分解物（以下ｃＡＦと略す）の調製 ヒトアルブミン分子は分子量６９ＫＤを有しアミノ酸残
基が５８５個からなり、かつ１７ケ所にわたってジスル
フィド結合をした強固な球状タンパク質であることはよ
く知られた事実である。ヒトアルブミン分子の化学的な
切断方法としては、1) Method for preparing immunogen (a) Preparation of albumin degradation product (hereinafter abbreviated as cAF) by chemical cleavage of human albumin molecule Human albumin molecule has a molecular weight of 69 KD and consists of 585 amino acid residues, It is a well-known fact that it is a strong globular protein having 17 disulfide bonds. As a method of chemically cleaving the human albumin molecule,

【０００８】・ ヒトアルブミン分子の一次配列中のメ
チオニンや一部アスパラギン酸−プロリン結合残基を選
択的に切断するＢｒＣＮ法 ・ システイン残基を選択的に切断する２−ニトロ−５
−チオシアノ安息香酸や１−シアノ−４−ジメチルアミ
ノピリジン塩を用いる方法 ・ アスパラギン−グリシン結合残基を選択的に切断す
るヒドロキシルアミンを用いる方法BrCN method that selectively cleaves methionine and some aspartic acid-proline binding residues in the primary sequence of human albumin molecule 2-Nitro-5 that selectively cleaves cysteine residues
-Method using thiocyanobenzoic acid or 1-cyano-4-dimethylaminopyridine salt-Method using hydroxylamine that selectively cleaves asparagine-glycine bond residue

【０００９】・ トリプトファン残基を選択的に切断す
る２−（２−ニトロフェニルスルフェニル）−３−メチ
ル−３−ブロモインドール−スカトール、ＤＭＳＯ−Ｈ
Ｃｌ−ＨＢｒ，氷酢酸−１２ＮＨＣｌ−ＤＭＳＯ，４８
％ＨＢｒ−ＤＭＳＯ，ＢｒＣＮ−ヘプタフオロ酪酸，ｏ
−ヨード安息香酸，Ｎ−ブロモコハク酸イミド，などが
良く知られている。2- (2-nitrophenylsulfenyl) -3-methyl-3-bromoindole-skatole, DMSO-H, which selectively cleaves tryptophan residues
Cl-HBr, glacial acetic acid-12N HCl-DMSO, 48
% HBr-DMSO, BrCN-heptafluorobutyric acid, o
-Iodobenzoic acid, N-bromosuccinimide, etc. are well known.

【００１０】ｃＡＦを得るためには上記いずれの試薬に
よる化学的な切断を行うことが可能であり、所期目的は
達成される。特にヒトアルブミン由来のｃＡＦの分子量
は抗体産生可能な長さのペプチド鎖を有していれば問題
はないが、余り分子量の小さいペプチド断片が得られる
化学的切断方法は一般的に好ましいとは云えない。In order to obtain cAF, it is possible to carry out chemical cleavage with any of the above reagents, and the intended purpose is achieved. In particular, the molecular weight of human albumin-derived cAF is not a problem as long as it has a peptide chain having a length capable of producing an antibody, but it can be said that a chemical cleavage method that can obtain a peptide fragment having a too small molecular weight is generally preferable. Absent.

【００１１】上記化学的切断法と単離精製に関する実施
方法は通常の化学的知識を有しておれば容易に目的を達
成しうるが、特に参考となる実験書としては続生化学実
験講座第２巻「タンパク質の化学」２７０〜２９２ペー
ジ（日本生化学会編、東京化学同人）に実験例を列挙し
て懇切丁寧に解説されている。化学的切断を終えた混合
物から、ｃＡＦの単離精製については一般に反応試薬を
不活性化し、これを反応系外へ取出すことが必要とな
り、また未反応のヒトアルブミンの除去も重要なポイン
トとなる。The above-mentioned chemical cleavage method and the method of implementation relating to isolation and purification can easily achieve the purpose if one has ordinary chemical knowledge. Volume 2 "Protein Chemistry" pages 270-292 (edited by the Japanese Biochemical Society, Tokyo Kagaku Dojin) enumerates experimental examples and explains them carefully. In order to isolate and purify cAF from the mixture after chemical cleavage, it is generally necessary to inactivate the reaction reagent and take it out of the reaction system, and removal of unreacted human albumin is also an important point. .

【００１２】通常の反応試薬は低分子化合物であるため
透析やゲルフィルトレーションクロマトグラフィーの手
法で容易に取り除くことができる。Since ordinary reaction reagents are low molecular weight compounds, they can be easily removed by a technique such as dialysis or gel filtration chromatography.

【００１３】ゲルフィルトレーションに用いる担体とし
てはセファデックス類（例えばセファデックス（登録商
標）Ｇ−１５，Ｇ−２５，Ｇ−５０などファルマシア社
製）や近年高速液体クロマトグラフィーに使用されてい
る有機ゲルの担体（例えばＴＳＫ−ｇｅｌ（登録商標）
３０００ＳＷなど、東ソー株式会社製）などが有効に利
用される。充分な反応時間と適切な温度管理のもとで反
応を制御することによりヒトアルブミンを完全に部分分
解へと導びくことが可能であるが、万一、未分解のヒト
アルブミンが分解液中に混入した場合は、先のゲルフィ
ルトレーションクロマトグラフィー法や通常汎用されて
いる電気泳動法、さらには、分子量の差で分離されるＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法や等電点の差
を利用して分離される等電点電気泳動法、各種イオン交
換クロマトグラフィーなどの方法を単独もしくは組合せ
によってｃＡＦを単離することが可能である。As a carrier used for gel filtration, it has been used in Sephadex (for example, Sephadex (registered trademark) G-15, G-25, G-50 manufactured by Pharmacia) and in recent years high performance liquid chromatography. Organic gel carrier (eg TSK-gel®)
3000SW, etc., manufactured by Tosoh Corporation) are effectively used. It is possible to completely decompose human albumin by controlling the reaction under sufficient reaction time and appropriate temperature control. When it is mixed, it is separated by the gel filtration chromatography method or the commonly used electrophoretic method described above, or by the difference in molecular weight.
CAF can be isolated by a single method or a combination of methods such as DS-polyacrylamide gel electrophoresis method, isoelectric focusing method in which the difference in isoelectric points is used for separation, and various ion exchange chromatography methods. is there.

【００１４】このようにして得られるｃＡＦ溶液を透析
後、凍結乾燥することにより容易にｃＡＦを取得するこ
とができる。以上、化学的切断によるｃＡＦの調製法に
ついて記載してきたが、いづれの化学的切断法を用いて
もｃＡＦを取得できるが、本出願の実施例１には、その
１例として「ＢｒＣＮによる切断法」を示したものであ
って、特にこの方法によって本出願は限定されるもので
はない。The cAF solution thus obtained is dialyzed and then freeze-dried to easily obtain cAF. Although the method for preparing cAF by chemical cleavage has been described above, cAF can be obtained by using any of the chemical cleavage methods. In Example 1 of the present application, as an example thereof, “the cleavage method by BrCN is used. The present application is not particularly limited by this method.

【００１５】（ｂ） ヒトアルブミン分子の酵素的切断
によるアルブミン分解物（以下ｅＡＦと略す）の調製 ヒトアルブミン分子の酵素的切断としては通常のタンパ
ク質の部分加水分解に使用されているプロテアーゼ類を
用いることができる。(B) Preparation of Albumin Degradation Product (Hereinafter abbreviated as eAF) by Enzymatic Cleavage of Human Albumin Molecule As the enzymatic cleavage of the human albumin molecule, proteases used for ordinary partial hydrolysis of protein are used. be able to.

【００１６】プロテアーゼ類はペプチド結合の切断方法
からみるとエキソ（ｅｘｏ）型とエンド（ｅｎｄｏ）型
に大別されるが、本目的となるｅＡＦの取得にはエンド
型のプロテアーゼを使用するのが好ましい。[0016] Proteases are roughly classified into exo type and endo type according to the method of cleaving peptide bond. However, endo type protease is used for the purpose of obtaining eAF. preferable.

【００１７】エンド型のプロテアーゼにはペプチド配列
の特定な配列を認識して選択的に切断することが可能で
あるため、先の化学的切断にくらべて副反応も少なく常
温、常圧で反応し、また高純度の酵素を同一条件下で使
用すれば極めて再現性に優れ、かつ高収率でペプチド断
片（ここではｅＡＦを云う）を得ることが可能である。Since the endo-type protease can recognize a specific sequence of peptide sequence and selectively cleave it, it has less side reaction than the above chemical cleavage and reacts at room temperature and atmospheric pressure. Moreover, if a high-purity enzyme is used under the same conditions, it is possible to obtain a peptide fragment (herein referred to as eAF) with excellent reproducibility and high yield.

【００１８】エンド型プロテアーゼの代表的な酵素は一
般に市販されているものが多く、容易に入手することが
できる。例えば、牛膵臓由来のトリプシンやキモトリプ
シン、牛胃液や豚胃粘膜由来のペプシン、微生物の産生
するサーモライシンやズブチリシン、さらには植物由来
のブロメラインやパパインなどが工業的にも良く用いら
れる酵素である。Many typical endo-type protease enzymes are commercially available and can be easily obtained. For example, trypsin and chymotrypsin derived from bovine pancreas, pepsin derived from bovine gastric juice and porcine gastric mucosa, thermolysin and subtilisin produced by microorganisms, and plant-derived bromelain and papain are industrially often used enzymes.

【００１９】また研究用に使用されているエンド型プロ
テアーゼとしてはリジン残基を特異的に認識して切断す
るＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ産生の
プロテアーゼＩ（和光純薬株式会社製）やＬｙｓｏｂａ
ｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ によって産生され
るセリンプロテアーゼの一種であるエンドプロティナー
ゼＬｙｓ−Ｃ（ベーリンガーマンハイム社製）がある。As endo-type proteases used for research, Protease I (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) produced by Achromobacter lyticus, which specifically recognizes and cleaves lysine residues, and Lysoba.
There is an endoproteinase Lys-C (manufactured by Boehringer Mannheim), which is a type of serine protease produced by Cter enzymogenes .

【００２０】その他、アルギニンを特異的に認識して切
断するセリンプロテアーゼの一種であるエンドプロティ
ナーゼＡｒｇ−Ｃ（ベーリンガーマンハイム社製）やＣ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍの産
生するチオールプロテアーゼの一種であるクロストリパ
イン（ベーリンガーマンハイム社製）、グルタミン酸お
よびアスパラギン酸を特異的に認識して切断するＳｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ産生のＶ８プロ
テアーゼ（メレス社製）、プロリンを特異的に認識して
切断するプロリン特異性エンドペプチダーゼなどがよく
知られており通常タンパク質の一次構造解析（アミノ酸
配列の決定）によく利用されているが、これらの酵素も
ｅＡＦの取得に使用することができる。In addition, endoproteinase Arg-C (manufactured by Boehringer Mannheim), which is a kind of serine protease that specifically recognizes and cleaves arginine, and C
Sta, which specifically recognizes and cleaves clostripain (manufactured by Boehringer Mannheim), which is a kind of thiol protease produced by L. tristidium histolyticum , glutamic acid and aspartic acid.
V8 protease (manufactured by Meles) produced by phylococcus aureus , proline-specific endopeptidase that specifically recognizes and cleaves proline, etc. are well known and are usually used for primary structure analysis (determination of amino acid sequence) of proteins. However, these enzymes can also be used to obtain eAF.

【００２１】上記酵素的切断法と単離精製に関する実施
方法は通常の化学的または生化学的知識を有しておれば
容易に目的を達成しうるが、特に参考となる実験書とし
ては続生化学実験講座第２巻「タンパク質の化学」２６
０〜２７０，２７８〜２９２ページ（日本生化学会編、
東京化学同人）に実験例を列挙して懇切丁寧に解説され
ている。[0021] The above-mentioned enzymatic cleavage method and the method for carrying out isolation and purification can easily achieve the purpose if one has ordinary chemical or biochemical knowledge. Chemistry Experiment Lecture Volume 2 "Chemistry of Proteins" 26
Pages 0-270 and 278-292 (edited by the Japanese Biochemical Society,
(Tokyo Kagaku Dojin) enumerates experimental examples and explains them carefully.

【００２２】酵素的切断を終えた混合物からｅＡＦの単
離、精製については使用した酵素を不活化しこれを反応
系外へ取出すことが必要である。通常使用する酵素はｅ
ＡＦより高分子化合物であるためゲルフィルトレーショ
ンクロマトグラフィーや各種電気泳動（通常の電気泳
動、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動）や各
種イオン交換クロマトグラフィー、などの手法を単独も
しくは組合せによってｅＡＦを単離することができる。For isolation and purification of eAF from the mixture which has been enzymatically cleaved, it is necessary to inactivate the used enzyme and take it out of the reaction system. The commonly used enzyme is e
Since it is a higher molecular compound than AF, methods such as gel filtration chromatography, various electrophoresis (normal electrophoresis, isoelectric focusing, SDS-PAGE electrophoresis), various ion exchange chromatography, etc. are used alone or in combination. EAF can be isolated by.

【００２３】また、実施例２に示すごとく使用する酵素
をいろいろな樹脂に固定化することによってバイオリア
クターとして利用すれば基質であるヒトアルブミンを効
率よく加水分解することができる。反応終了後は固定化
酵素（樹脂に結合した酵素＝不溶化酵素）を濾別した
り、遠心分離することによって容易に使用した酵素を除
くことができる。このようにして得られるｅＡＦ溶液を
透析後、凍結乾燥することによって容易にｅＡＦを取得
できる。Further, as shown in Example 2, by immobilizing the enzyme to be used on various resins and utilizing it as a bioreactor, human albumin as a substrate can be efficiently hydrolyzed. After completion of the reaction, the immobilized enzyme (enzyme bound to resin = insolubilized enzyme) can be filtered off or the enzyme used can be easily removed by centrifugation. The eAF solution thus obtained is dialyzed and then lyophilized to easily obtain eAF.

【００２４】以上、酵素的切断によるｅＡＦの調製法に
ついて記載してきたが、いずれの酵素的切断法を用いて
もｅＡＦを取得することができるが、本出願の実施例２
にはその１例として「トリプシンによる切断法」を示し
たものであって、特にこの方法によって本出願は限定さ
れるものではない。Although the method for preparing eAF by enzymatic cleavage has been described above, any of the enzymatic cleavage methods can be used to obtain eAF.
Shows the "cleavage method by trypsin" as an example thereof, and the present application is not particularly limited by this method.

【００２５】（ｃ） 腎症患者の尿中に含まれるｕＡＦ
の単離精製 糖尿病性腎症を含めた腎症患者の尿を多量に集尿し−８
０℃に凍結保存を行うか、適当なプロテアーゼ阻害剤や
アジ化ナトリウムを加えて低温保存を行って集尿する。(C) uAF contained in urine of patients with nephropathy
Isolation and purification of a large amount of urine collected from patients with nephropathy including diabetic nephropathy-8
Freeze-preserve at 0 ° C, or add appropriate protease inhibitor or sodium azide and store at low temperature to collect urine.

【００２６】これらの集尿した尿を例えば抗ヒトアルブ
ミン抗体をリガンドしたアフィニティークロマトグラフ
ィーに吸着せしめ、洗浄後溶離することによって効率よ
くヒトアルブミン及びｕＡＦの混合物の画分を得ること
ができる。このようにして得られる画分をさらにヒトア
ルブミンとｕＡＦを分離する手段としては先に記載した
（ａ）項の「化学的切断法によるｃＡＦの調製」で示し
たと同様な分離方法が適用できる。The collected urine is adsorbed on affinity chromatography using, for example, an anti-human albumin antibody as a ligand, washed and then eluted to efficiently obtain a fraction of a mixture of human albumin and uAF. As a means for further separating human albumin and uAF from the thus obtained fraction, the same separation method as described in the above-mentioned item (a) “Preparation of cAF by chemical cleavage method” can be applied.

【００２７】例えば、分子量の差で分離できるゲルフィ
ルトレーションクロマトグラフィーや調製用のＳＤＳ−
ＰＡＧＥ電気泳動あるいは等電点の差によって分離でき
る調製用の等電点電気泳動（アンホライン（登録商標）
ＬＫＢ社製、ファルマライト（登録商標）ファルマシア
社製など）、さらには通常の調製用アガロースゲル電気
泳動や各種イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を
単独もしくは組合せによってｕＡＦを単離することがで
きる。For example, gel filtration chromatography capable of separating by molecular weight difference or SDS-for preparation.
Preparative isoelectric electrophoresis (Amphoraine (registered trademark)) that can be separated by PAGE electrophoresis or isoelectric point difference
UAF can be isolated by a single method or a combination of methods such as LKB, Pharmalite (registered trademark) Pharmacia, etc.) and ordinary methods such as preparative agarose gel electrophoresis and various ion exchange chromatography.

【００２８】電気泳動に用いる装置のタイプとしてはデ
ィスク（円柱状）型とスラブ（平板状）型が主に汎用さ
れているが、目的とするｕＡＦの分離には特に限定する
ものではない。しかしながら、調製すると云う観点に立
てばスラブ電気泳動法の方が好ましい。その理由とし
て、泳動を終えたゲルからｕＡＦを単離するには、例え
ばスラブ型のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の場合スラブゲ
ルの両端の一部をそれぞれ切り取りクマシーブリリアン
トブルーで染色し、ヒトアルブミン（分子量６９ＫＤ）
と同じ移動度を示すバンドを切り捨て残りのゲルを集め
て例えばテフロン製のホモゲナイザーを用いてゲルを細
かく砕いた後に適当な緩衝液でｕＡＦを抽出することも
簡単に行い得るからである。Disk (cylindrical) type and slab (flat plate) type are mainly used as the type of apparatus used for electrophoresis, but the intended separation of uAF is not particularly limited. However, from the viewpoint of preparation, the slab electrophoresis method is preferable. The reason is that in order to isolate uAF from the gel after the electrophoresis, for example, in the case of slab-type SDS-PAGE electrophoresis, a part of each end of the slab gel is cut off and stained with Coomassie Brilliant Blue to stain human albumin (molecular weight 69 KD )
This is because it is also possible to simply cut out the band showing the same mobility as above, collect the remaining gel, finely crush the gel using, for example, a Teflon homogenizer, and then extract uAF with an appropriate buffer solution.

【００２９】また、スラブ型の調製用等電点電気泳動の
場合も泳動後調製用のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法と同
様にスラブゲルの両端の一部を切り取ってクマシーブリ
リアントブルーで染色し、ヒトアルブミン由来のｐＩ
４．９のバンドを切り捨て残りのゲルを集めて先に説明
した例えばテフロン製ホモゲナイザーを用いて細かく砕
いた後に適当な緩衝液でｕＡＦを抽出することもでき
る。Also, in the case of slab-type preparative isoelectric focusing, a portion of both ends of the slab gel is cut out and stained with Coomassie Brilliant Blue in the same manner as the post-preparation preparative SDS-PAGE electrophoresis method, and then human albumin is prepared. Origin pI
It is also possible to cut out the band of 4.9, collect the remaining gel, and finely grind it using, for example, a Teflon homogenizer described above, and then extract uAF with an appropriate buffer solution.

【００３０】一方、カラム型の等電点電気泳動の場合は
泳動後は容易に下部より一定量ずつ分画するこができる
のでｐＩ４．９附近のヒトアルブミンに由来する画分を
取り去ることによって容易にｕＡＦ画分を得ることがで
きる。このようにして得られるｕＡＦの抽出液または分
画液を透析後、凍結乾燥してｕＡＦを単離することがで
きる。On the other hand, in the case of column-type isoelectric focusing, it is possible to easily fractionate a fixed amount from the bottom after the electrophoresis, so it is easy to remove the fraction derived from human albumin near pI4.9. Then, uAF fraction can be obtained. The uAF extract or fraction thus obtained can be dialyzed and then lyophilized to isolate uAF.

【００３１】また、実施例２に示したごとく抗ヒトアル
ブミン抗体に反応しない抗ｕＡＦモノクロナール抗体を
収得しているので、このモノクロナール抗体をリガンド
したアフィニティークロマトグラフィーを利用すること
によって腎症患者の尿を処理すると一挙に目的とするｕ
ＡＦを得ることができる。この方法の詳細については実
施例３に記載した通りである。Further, as shown in Example 2, since anti-uAF monoclonal antibody which does not react with anti-human albumin antibody was obtained, the affinity chromatography using this monoclonal antibody as a ligand was used to detect renal disease patients. When urine is processed, the target u
AF can be obtained. Details of this method are as described in Example 3.

【００３２】２） 抗体の調製法 （ａ） ポリクロナール抗体の作製 本発明で用いるポリクロナール抗体はまず免疫原である
アルブミン分解物（以下ＡＦと略す。ＡＦとはｕＡＦ，
ｃＡＦ，ｅＡＦのいずれかを示す総称である。）をアジ
ュバントに混合し、他動物に免疫して抗血清を得ること
によりなされる。免疫法は通常の抗血清を得るための方
法であれば特に限定されるものではないが、Ｆｒｅｕｎ
ｄのコンプリートアジュバントが最適である。2) Method for Preparing Antibody (a) Preparation of Polyclonal Antibody The polyclonal antibody used in the present invention is first an albumin degradation product which is an immunogen (hereinafter abbreviated as AF. AF is uAF,
It is a generic term indicating either cAF or eAF. ) Is mixed with an adjuvant, and other animals are immunized to obtain antiserum. The immunization method is not particularly limited as long as it is a method for obtaining an ordinary antiserum, but Freun
The complete adjuvant of d is most suitable.

【００３３】他動物としてはウサギ、ラット、ヤギなど
が利用できるが抗血清の量的確保の問題、飼育条件など
を考慮するとウサギが適している。免疫方法としては、
例えばウサギに免疫する場合、皮下、腹腔内、静脈内、
筋肉内、皮内などのいずれでも可能であるが、主とし
て、皮下、腹腔内、静脈内に注入するのが好ましい。ま
た接種間隔、接種量についても特に限定されるものでは
ないが、例えば２週間隔で２〜１０回接種する方法が適
している。接種量は１回にＡＦ量１０μg 以上好ましく
は１００μg 〜１０mg用いることが望ましい。As other animals, rabbits, rats, goats and the like can be used, but rabbits are suitable in view of the problem of quantitative securing of antiserum, breeding conditions and the like. As an immunization method,
For example, when immunizing a rabbit, subcutaneously, intraperitoneally, intravenously,
It may be intramuscular or intradermal, but is preferably injected subcutaneously, intraperitoneally, or intravenously. The inoculation interval and inoculation amount are not particularly limited, but a method of inoculating 2 to 10 times at 2 week intervals is suitable. The inoculation dose is preferably 10 μg or more, and more preferably 100 μg to 10 mg of AF per dose.

【００３４】最終免疫後、３〜１０日目好ましくは７日
目に全採血を行ない、抗血清を得ることができる。得ら
れた抗血清はＡＦと反応する抗体の他にヒトアルブミン
とも反応する抗体を含有しているため、ヒトアルブミン
と反応する抗体を除去する必要がある。On the 3rd to 10th day, preferably on the 7th day after the final immunization, whole blood can be collected to obtain an antiserum. Since the obtained antiserum contains an antibody that also reacts with human albumin in addition to an antibody that reacts with AF, it is necessary to remove the antibody that reacts with human albumin.

【００３５】そこで、ＡＦに対する特異抗体を得る方法
は通常の抗体を精製する種々の方法を利用できるが、特
にアフィニティークロマトグラフィーが最適である。ア
フィニティークロマトグラフィーの担体としては種々の
市販品があり、特に限定されるものではないが、ＢｒＣ
Ｎ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）などが
適している。ＡＦ特異抗体を得る一例を示すと、まずヒ
トアルブミンをＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂに一定
量結合させ、ヒトアルブミン−セファロースカラムを作
製する。カラムを一定量の緩衝液（ｐＨ７．０〜８．
５）で平衡化させ、一定量の抗血清を吸着させる。吸着
後、平衡化に用いた緩衝液で洗浄を行ない、未吸着画分
を集める。Therefore, as a method for obtaining a specific antibody against AF, various methods for purifying an ordinary antibody can be used, but affinity chromatography is most suitable. There are various commercially available carriers for affinity chromatography, and the carrier is not particularly limited.
N-activated Sepharose 4B (Pharmacia) is suitable. To give an example of obtaining an AF-specific antibody, first, human albumin is bound to BrCN-activated Sepharose 4B in a fixed amount to prepare a human albumin-Sepharose column. Load the column with a fixed volume of buffer (pH 7.0-8.
Equilibrate in 5) and adsorb a certain amount of antiserum. After adsorption, washing is performed with the buffer solution used for equilibration, and unadsorbed fractions are collected.

【００３６】次にＡＦをＢｒＣＮ活性化セファロース４
Ｂに一定量結合させ、ＡＦ−セファロースカラムを作製
する。カラムを一定量の緩衝液（ｐＨ７．０〜８．５）
で平衡化させ、一定量のヒトアルブミン−セファロース
カラムより得られた未吸着画分を吸着させる。吸着後、
平衡化に用いた緩衝液で洗浄を行ない、溶離液（ｐＨ
２．０〜４．０）にて溶出を行ない、ＡＦ特異的抗体を
得ることができる。Next, AF was added to BrCN-activated Sepharose 4
A fixed amount is bound to B to prepare an AF-Sepharose column. A certain amount of buffer solution (pH 7.0-8.5)
And equilibrate with a fixed amount of non-adsorbed fraction obtained from the human albumin-Sepharose column. After adsorption,
Wash with the buffer used for equilibration, and eluate (pH
AF-specific antibody can be obtained by performing elution at 2.0 to 4.0).

【００３７】精製抗体は硫安塩析、限外濾過、イオン交
換クロマトグラフィー、凍結乾燥などを用いてｕＡＦ測
定に必要な濃度に濃縮する。The purified antibody is concentrated to a concentration necessary for uAF measurement using ammonium sulfate salting out, ultrafiltration, ion exchange chromatography, freeze-drying and the like.

【００３８】（ｂ） モノクロナール抗体の作製 本発明で用いるモノクロナール抗体はＫｏｅｈｉｅｒ
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１
９７５）によって示された免疫動物の脾臓細胞と同種動
物由来のミエローマ細胞との融合によってつくられる融
合細胞（ハイブリドーマ）から製造することができる。
免疫する動物としてはマウス、ラット、ハムスターなど
の実験動物が用いられるが、最も実績のあるマウスが適
している。細胞融合に用いられるミエローマ細胞として
は細胞融合の効率が高く、増殖性が良いマウスミエロー
マ細胞とくにヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ欠損株やチミジンキナーゼ欠損の
ようなマーカーをもったミエローマ（Ｐ３−ｘ６３−Ａ
ｇ８，ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３，ＳＰ２／０−Ａｇ
１４）が利用できる。(B) Preparation of Monoclonal Antibody The monoclonal antibody used in the present invention is Koehier.
Milstein ( Nature , 256 , 495, 1
975) and the fused cells (hybridomas) produced by fusing the spleen cells of the immunized animal with myeloma cells derived from the same species.
Experimental animals such as mice, rats, and hamsters are used as animals to be immunized, and the most proven mouse is suitable. As the myeloma cells used for cell fusion, mouse myeloma cells having high cell fusion efficiency and good proliferative ability, particularly myeloma cells having markers such as hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl transferase deficient strain and thymidine kinase deficiency (P3-x63 -A
g8, x63-Ag8-6.5.3, SP2 / 0-Ag
14) is available.

【００３９】モノクロナール抗体を収得するためには、
マウス、ラット、ハムスターなどの実験動物を利用する
ことができるがその中でもマウスが好適である。To obtain a monoclonal antibody,
Experimental animals such as mice, rats and hamsters can be used, among which mice are preferred.

【００４０】免疫方法としては、例えばマウスに免疫す
る場合、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内などのい
ずれでも可能であるが主として皮下、腹腔内、静脈内に
注入するのが好ましい。また接種間隔、接種量について
も特に限定されるものではないが、例えば１週間隔で２
〜１０回接種し、最終免疫後、１〜５日、好ましくは２
〜４日後の脾細胞を用いる方法が好適である。接種量は
１回にＡＦ量として１μg 以上好ましくは１００μg 〜
１０mg用いることが望ましい。When immunizing a mouse, for example, subcutaneous, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, or intradermal administration is possible, but it is preferable to inject mainly subcutaneously, intraperitoneally, or intravenously. . Also, the inoculation interval and inoculation amount are not particularly limited, but for example, at an interval of 1 week,
-10 times inoculation, 1-5 days after the last immunization, preferably 2
A method using spleen cells after 4 days is preferable. The inoculation amount is 1 μg or more, preferably 100 μg or more, as the AF amount per time.
It is desirable to use 10 mg.

【００４１】リンパ球とミエローマ細胞との細胞融合は
例えば、免疫したマウスのリンパ球（脾臓細胞由来のも
の）をヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ欠損やチミジン欠損のようなマーカーを
持った適当なミエローマとの間で融合させる。融合には
センダイウィルス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
などの融合剤が用いられる。The cell fusion between lymphocytes and myeloma cells is carried out, for example, by immunizing mouse lymphocytes (derived from spleen cells) with a suitable marker such as hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl transferase deficiency or thymidine deficiency. Fusion with Myeloma. Sendai virus, polyethylene glycol (PEG) for fusion
Fusion agents such as

【００４２】また、ＤＭＳＯその他の融合促進剤を加え
ることもできる。ＰＥＧの平均分子量は通常１，０００
〜１０，０００好ましくは１，０００〜５，０００、濃
度は１０％〜８０％などが利用されるが通常４０〜６０
％で行なった場合に効率よく融合させることができる。
融合細胞（ハイブリドーマ）はヒポキサンチン−アミノ
プテリン−チミジン培地（ＨＡＴ培地）などを用いて、
選択的に増殖させることができる。DMSO and other fusion promoters can also be added. The average molecular weight of PEG is usually 1,000
To 10,000, preferably 1,000 to 5,000, and a concentration of 10% to 80% is used, but usually 40 to 60
When it is performed in%, the fusion can be efficiently performed.
The fused cells (hybridomas) were prepared using hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium (HAT medium),
Can be selectively propagated.

【００４３】増殖した細胞の培養上清は目的とする抗体
を産生しているか否かをスクリーニングすることによっ
て達成されるが、特に本スクリーニングはヒトアルブミ
ンとＡＦに対する抗体の反応性の差異を調べ、ＡＦに対
してのみ特異性の高い抗体を得ることが重要である。The culture supernatant of the expanded cells can be achieved by screening whether or not the antibody of interest is produced. In particular, this screening examines the difference in the reactivity of the antibody to human albumin and AF, It is important to obtain an antibody with high specificity only for AF.

【００４４】すなわち、本反応性の差異を調べるに当っ
ては、ＥＩＡ法またはＲＩＡ法などの方法で調べること
ができるが、これらの方法についても種々の変法が可能
である。一例として、ＥＩＡ法を用いる方法について記
載する。That is, in order to examine the difference in reactivity, the method such as the EIA method or the RIA method can be used, but various variations of these methods are possible. As an example, a method using the EIA method will be described.

【００４５】ＡＦおよびヒトアルブミンを９６穴のマイ
クロタイタープレートに一定の蛋白濃度で常法に従って
固定化する。これに測定したい培養上清を一定量加え、
一定時間、一定温度で反応させる。ついで反応物をよく
洗浄後、酵素標識抗マウスＩｇＧを加え、一定時間、一
定温度で反応させる。反応物を洗浄後、基質を加え、一
定時間、一定温度で反応させ、その後反応生成発色物を
吸光度または蛍光強度などで測定することができる。AF and human albumin are immobilized on a 96-well microtiter plate at a constant protein concentration by a conventional method. Add a certain amount of culture supernatant to be measured to this,
The reaction is performed at a constant temperature for a fixed time. Then, the reaction product is thoroughly washed, enzyme-labeled anti-mouse IgG is added, and the reaction is allowed to proceed for a fixed time at a constant temperature. After washing the reaction product, a substrate is added, and the reaction product is reacted at a constant temperature for a predetermined time, and then a reaction product color product can be measured by absorbance or fluorescence intensity.

【００４６】選択培地で増殖を示し、ＡＦに対してのみ
抗体活性を示すウエルの細胞を限界希釈法などによりク
ローニングを行なう。クローン化された細胞の上清につ
いて同様にスクリーニングを行い、抗体価の高いウエル
の細胞を増やすことにより、目的とする本発明のモノク
ロナール抗体産生ハイブリドーマクローンが得られる。The cells in the wells which grow in the selective medium and show the antibody activity only to AF are cloned by the limiting dilution method or the like. By similarly screening the supernatant of the cloned cells and increasing the number of cells in wells having a high antibody titer, the objective monoclonal antibody-producing hybridoma clone of the present invention can be obtained.

【００４７】３） ｕＡＦの測定法について ｕＡＦの測定は得られたＡＦ特異抗体（モノクロナール
抗体、ポリクロナール抗体）を用いて、抗原抗体反応を
行なうことによりなされる。抗原抗体反応を利用した測
定は種々の方法が開発されているが、本測定の手法は特
に限定されるものではない。すなわち一般に対象物の測
定に用いられているラテックス凝集反応、ＲＰＨＡ法、
ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、金コロイド粒子法などが本測定に
も利用できる。3) Method for measuring uAF uAF is measured by carrying out an antigen-antibody reaction using the obtained AF-specific antibody (monoclonal antibody, polyclonal antibody). Various methods have been developed for the measurement using the antigen-antibody reaction, but the method of this measurement is not particularly limited. That is, the latex agglutination reaction, the RPHA method, which is generally used for measuring an object,
The EIA method, RIA method, colloidal gold particle method, etc. can also be used for this measurement.

【００４８】ｕＡＦの測定について２〜３の例を以下に
示す。ＥＩＡ法には競合法、非競合法など種々の反応様
式があり、本出願においても特に限定されるものではな
いが、一例として非競合法のサンドイッチ法を述べる。A few examples of the measurement of uAF are shown below. The EIA method has various reaction modes such as a competitive method and a non-competitive method and is not particularly limited in the present application, but the sandwich method of the non-competitive method will be described as an example.

【００４９】まず、精製抗ＡＦ抗体を一定量に希釈し、
９６穴マイクロタイタープレートのウエルに一定量添加
する。一定時間、一定温度で反応後、過剰の抗体液を除
去する。安定化剤（例えばウシ血清アルブミン、以下Ｂ
ＳＡと略す）を含むリン酸生理緩衝液（以下ＰＢＳと略
す）を各ウエルに一定量添加し、一定時間、一定温度で
マスキングを行なう。その後液を除去し、安定化剤を含
むＰＢＳを各ウエルに一定量添加し、ＡＦ抗体結合プレ
ートを作製する。First, the purified anti-AF antibody was diluted to a fixed amount,
Add a fixed amount to the wells of a 96-well microtiter plate. After reacting for a fixed time at a constant temperature, excess antibody solution is removed. Stabilizers (eg bovine serum albumin, hereinafter B
Phosphate physiological buffer solution (hereinafter abbreviated as PBS) containing SA is added to each well in a fixed amount, and masking is performed at a fixed temperature for a fixed time. After that, the liquid is removed and a fixed amount of PBS containing a stabilizer is added to each well to prepare an AF antibody-binding plate.

【００５０】次にＡＦ抗体結合プレートに尿検体の一定
量を添加し、一定時間攪拌した後、一定温度、一定時間
反応させる。反応後の液を除去した後、安定化剤を含む
ＰＢＳを各ウエルに一定量ずつ添加して洗浄を行なう。
洗浄を数回好ましくは３〜５回繰り返した後、酵素標識
抗ＡＦ抗体を各ウエルに一定量を添加し、数分間攪拌し
た後、一定温度で一定時間反応を行なう。反応後、洗浄
し、基質液を一定量ウエルに添加し、一定時間、一定温
度で反応させる。反応停止液を一定量添加し、酵素反応
を停止させる。その後、反応生成発色物を吸光度または
蛍光強度などで測定し、判定を行なうことができる。Next, a fixed amount of a urine sample is added to the AF antibody-bonded plate, stirred for a certain period of time, and then reacted at a certain temperature for a certain period of time. After removing the liquid after the reaction, PBS containing a stabilizer is added to each well in a fixed amount and washed.
After washing several times, preferably 3 to 5 times, a fixed amount of enzyme-labeled anti-AF antibody is added to each well, stirred for several minutes, and then reacted at a constant temperature for a fixed time. After the reaction, the plate is washed, a fixed amount of the substrate solution is added to the wells, and the mixture is reacted at a fixed temperature for a fixed time. A certain amount of reaction stop solution is added to stop the enzymatic reaction. Then, the reaction-produced colored product can be measured by measuring the absorbance or the fluorescence intensity to make the determination.

【００５１】次に金コロイド粒子を用いたｕＡＦの免疫
測定法を示す。金コロイド粒子は一般に２〜２０nm程度
のものが使用されるが本法においても粒子径は特に限定
されるものではないが好ましくは３〜１７nmが適してい
る。この粒子の調製法はＳｌｏｔ ＆ Ｇｅｕｚｅ（Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３８，８７，１９８
５）らによって報告されている方法により容易に調製す
ることができる。すなわち４倍容の塩化金酸（１％塩化
金酸を８０倍に蒸留水で希釈したもの）に１倍容の還元
液（１％クエン酸ナトリウムにタンニン酸の量を変化さ
せ、蒸留水で５倍希釈したもの）を一定温度で混合し、
淡黄色から紫ないし赤に変色したら、沸騰させ直ちに氷
冷することにより得ることができる。Next, an immunoassay method for uAF using gold colloid particles will be described. Generally, gold colloid particles having a particle size of about 2 to 20 nm are used, and the particle size is not particularly limited in this method, but 3 to 17 nm is preferable. The method for preparing these particles is described in Slot & Geuse ( E
ur . J. Cell Biol . , 38 , 87, 198
5) It can be easily prepared by the method reported by et al. In other words, 4 volumes of chloroauric acid (1% chloroauric acid diluted 80 times with distilled water) to 1 volume of reducing solution (1% sodium citrate with varying amounts of tannic acid) 5 times diluted) mixed at a constant temperature,
When the color changes from pale yellow to purple or red, it can be obtained by boiling and immediately cooling with ice.

【００５２】金コロイド粒子懸濁液の一定量を結合した
い抗体の等電点付近に調整し、抗ＡＦ抗体を一定量加え
る。数分間攪拌した後、数％のＢＳＡを一定量加え、メ
ンブランフィルターを用いて濾過を行い、抗ＡＦ抗体感
作金コロイド粒子を得ることができる。A certain amount of gold colloidal particle suspension is adjusted to near the isoelectric point of the antibody to be bound, and a fixed amount of anti-AF antibody is added. After stirring for several minutes, a certain amount of BSA of several% is added and filtration is performed using a membrane filter to obtain anti-AF antibody-sensitized gold colloid particles.

【００５３】金コロイド粒子着色法に用いる固相化シー
トとしてはニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビ
ニリデンなどの担体が用いられるが好ましくはニトロセ
ルロースが最適である。ニトロセルロースは種々市販さ
れているがＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ
社製が適している。担体への結合は容易になされる。す
なわち第１の領域として抗ＡＦ抗体をＰＢＳにて一定濃
度に調製したものを担体上に垂直方向に印字する。第２
の領域として同一担体上に抗マウスＩｇＧをＰＢＳにて
一定濃度に調製したものを水平方向に印字し、一定温度
で一定時間反応させ固相化する。次にスキムミルク、カ
ゼイン、ＢＳＡ、ブロックエースなどの安定化剤を用い
るが、好ましくはスキムミルクを一定濃度に調製し、一
定温度で一定時間含浸させ、マスキングを行なう。マス
キング後乾燥を行ない抗ＡＦ抗体固相化シートとして用
いることができる。A carrier such as nitrocellulose, nylon, or polyvinylidene fluoride is used as the solid-phased sheet used in the method of coloring gold colloid particles, but nitrocellulose is most preferable. Various types of nitrocellulose are commercially available, but Schleicher & Schuell
Made in-house is suitable. Attachment to the carrier is facilitated. That is, as the first region, an anti-AF antibody prepared with PBS at a constant concentration is printed vertically on the carrier. Second
As a region of 1., anti-mouse IgG prepared at a constant concentration with PBS on the same carrier is horizontally printed, and reacted at a constant temperature for a fixed time to immobilize. Next, a stabilizer such as skim milk, casein, BSA, or block ace is used. Preferably, skim milk is prepared at a constant concentration and impregnated at a constant temperature for a constant time to carry out masking. It can be used as an anti-AF antibody-immobilized sheet by drying after masking.

【００５４】測定は抗ＡＦ抗体固相化シートの断片を試
験管に入れ、尿検体液を一定量加え、一定温度で一定時
間反応させる。反応後、未反応液を除去し、洗浄剤とし
て界面活性剤などを用いるが、その中でも好ましくはＴ
ｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄するのが望まし
い。数回洗浄を行なった後、抗ＡＦ抗体感作金コロイド
粒子を一定量加え、一定温度で一定時間反応させる。次
に過剰の抗ＡＦ抗体感作金コロイド粒子を除去し、緩衝
液好ましくはＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄した後、＋印字さ
れたものを陽性、−印字されたものを陰性として肉眼判
定を行なうことができるが、陽性、陰性の表示はこれに
限定されるものではない。なお金コロイド粒子による検
出法の一例を上記に示したが、他に金コロイド粒子凝集
法を用いて、反応液の色調変化で測定を行なうことも可
能である。For the measurement, a fragment of the anti-AF antibody-immobilized sheet is put in a test tube, a fixed amount of a urine sample liquid is added, and the mixture is reacted at a fixed temperature for a fixed time. After the reaction, the unreacted liquid is removed, and a surfactant or the like is used as a cleaning agent.
It is desirable to wash with PBS containing ween-20. After washing several times, a fixed amount of anti-AF antibody-sensitized gold colloid particles is added and reacted at a fixed temperature for a fixed time. Then, after removing excess anti-AF antibody sensitized gold colloidal particles and washing with a buffer solution, preferably a HEPES buffer solution, it is possible to make a visual judgment as + printed ones are positive and −printed ones are negative. However, the indication of positive and negative is not limited to this. An example of the detection method using gold colloidal particles has been described above, but it is also possible to use the gold colloidal particle agglomeration method to measure the change in color tone of the reaction solution.

【００５５】次にラテックス凝集法によるｕＡＦ測定法
の一例を示す。ラテックス凝集法は種々の検査に利用さ
れているが、本出願はこれに限定されるものではない。
例えば抗ＡＦ抗体の一定量を緩衝液（ｐＨ７．０〜９．
０）の一定量に加え溶解する。これにラテックス粒子を
一定量加え、一定温度で一定時間反応させる。なお、ラ
テックス粒子径は特に限定されるものではないが通常
０．３〜０．５μm が好ましい。反応後、一定温度で遠
心分離を行ない、沈渣の抗ＡＦ抗体感作ラテックス粒子
に安定化剤（スキムミルク、カゼイン、ブロックエー
ス、ＢＳＡなど）好ましくはブロックエースを用いてマ
スキングを行ない、抗ＡＦ抗体感作ラテックスを調製す
ることができる。Next, an example of the uAF measurement method by the latex agglutination method will be shown. The latex agglutination method is used for various tests, but the present application is not limited thereto.
For example, a fixed amount of anti-AF antibody is added to a buffer solution (pH 7.0 to 9.
0) Add a fixed amount and dissolve. A certain amount of latex particles is added to this, and the mixture is reacted at a certain temperature for a certain time. The latex particle size is not particularly limited, but normally 0.3 to 0.5 μm is preferable. After the reaction, centrifugation is performed at a constant temperature, and the anti-AF antibody sensitized latex particles in the sediment are masked with a stabilizer (skim milk, casein, block ace, BSA, etc.), preferably block ace, to obtain anti-AF antibody sensitization. Made latex can be prepared.

【００５６】測定は一定量の尿検体を緩衝液（ｐＨ７．
０〜９．０）にて希釈し、試料とすることができる。次
にラテックス凝集板上に一定量の試料と一定量の抗ＡＦ
抗体感作ラテックス粒子懸濁液を加え、攪拌後、混合液
を円運動させながら数分間揺動し、凝集塊の有無により
判定を行なう。For the measurement, a fixed amount of urine sample was used as a buffer solution (pH 7.
The sample can be diluted with 0 to 9.0). Then place a fixed amount of sample and fixed amount of anti-AF on the latex agglomerate
The antibody-sensitized latex particle suspension is added, and after stirring, the mixed solution is oscillated for several minutes while making a circular motion, and the presence or absence of aggregates is evaluated.

【００５７】[0057]

【実施例】【Example】

実施例１ 〔ｃＡＦの調製法〕ＢｒＣＮ処理によるｃＡＦの調製は
ＭｃＭｅｎａｍｙらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２４６，４７４４−４７５０，１９７１）に準じ
て行なった。すなわち、ヒトアルブミン（フラクション
Ｖ，シグマ社製）１ｇを蒸留水４mlに溶解した後、蟻酸
１６ml，ＢｒＣＮ １ｇを加え、４℃、２４時間反応さ
せた。次にあらかじめ１％プロピオン酸で平衡化したセ
ファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）カラムに付
し、２８０nmの吸収を示す画分を集め、凍結乾燥してｃ
ＡＦ８００mgを得た。Example 1 [Preparation method of cAF] Preparation of cAF by treatment with BrCN was carried out according to the method of McMenamy et al. ( J. Biol . Che .
m . , 246, 4744-4750, 1971). That is, 1 g of human albumin (fraction V, manufactured by Sigma) was dissolved in 4 ml of distilled water, 16 ml of formic acid and 1 g of BrCN were added, and the mixture was reacted at 4 ° C. for 24 hours. Next, it was applied to a Sephadex G-25 (Pharmacia) column equilibrated with 1% propionic acid in advance, and the fractions showing absorption at 280 nm were collected and freeze-dried to give c.
AF800 mg was obtained.

【００５８】〔抗ｃＡＦポリクロナール抗体の調製〕ｃ
ＡＦを１０mg／mlに調製した抗原液とＦｒｅｕｎｄのコ
ンプリートアジュバント（カルビオケム社製）を等量混
合し、オイルエマルジョンとした。これを家兎（ニュー
ジーランドホワイト、１１週齢、雌）の四肢皮下に１ml
ずつ注射し、初回免疫とした。その後１４日目、２１日
目、２８日目に追加免疫をした。最終免疫から７日目に
採血を行い、抗血清３０mlを得た。[Preparation of Anti-cAF Polyclonal Antibody] c
An antigen solution prepared by adjusting AF to 10 mg / ml and Freund's complete adjuvant (manufactured by Calbiochem) were mixed in equal amounts to obtain an oil emulsion. 1 ml subcutaneously on the extremities of a rabbit (New Zealand White, 11 weeks old, female)
Each was injected to give the first immunization. After that, booster immunization was performed on the 14th, 21st and 28th days. Blood was collected 7 days after the final immunization to obtain 30 ml of antiserum.

【００５９】次にＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ（フ
ァルマシア社製）にヒトアルブミン（フラクションＶ、
シグマ社製）を結合したアルブミン−セファロースカラ
ム（３０ml）を５mMホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡
化し、抗血清１０mlを同ホウ酸緩衝液１０mlに混合し、
カラムに吸着させた。その後、カラムを同ホウ酸緩衝液
にて洗浄し、未吸着画分を集めた。Then, BrCN-activated Sepharose 4B (manufactured by Pharmacia) was added to human albumin (fraction V,
An albumin-Sepharose column (30 ml) bound with Sigma) was equilibrated with 5 mM borate buffer (pH 8.0), and 10 ml of antiserum was mixed with 10 ml of the same borate buffer.
Adsorbed on the column. Then, the column was washed with the same borate buffer solution, and the unadsorbed fraction was collected.

【００６０】次にＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ（フ
ァルマシア社製）にｃＡＦを結合したｃＡＦ−セファロ
ースカラム（５ml）を５mMホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）
で平衡化し、先の未吸着画分をカラムに吸着させた。そ
の後、同ホウ酸緩衝液にて洗浄後、０．５Ｍグリシン緩
衝液（ｐＨ３．０）にて溶出を行なった。２８０nmの吸
光値により活性画分を集め、６０％飽和硫安を加えた。
懸濁液を３，０００rpm で３０分間冷却下で遠心分離を
行ない、沈渣を集め、ＰＢＳで４℃、一晩透析を行なっ
た。その結果、精製抗ｃＡＦポリクロナール抗体０．５
mgを得た。Next, a cAF-Sepharose column (5 ml) in which cAF was bound to BrCN-activated Sepharose 4B (manufactured by Pharmacia) was added to a 5 mM borate buffer (pH 8.0).
Was equilibrated, and the previously unadsorbed fraction was adsorbed on the column. Then, after washing with the same borate buffer, elution was carried out with 0.5 M glycine buffer (pH 3.0). The active fraction was collected based on the absorbance value at 280 nm, and 60% saturated ammonium sulfate was added.
The suspension was centrifuged at 3,000 rpm for 30 minutes under cooling, the precipitate was collected, and dialyzed against PBS at 4 ° C. overnight. As a result, purified anti-cAF polyclonal antibody 0.5
to obtain mg.

【００６１】〔ｕＡＦの測定〕精製抗ｃＡＦポリクロナ
ール抗体をＰＢＳにて１０μg ／mlに希釈し、９６穴Ｅ
ＩＡプレート（コースター社製）に各ウエル２００μl
ずつ添加し、４℃で一晩反応させた。次に過剰の抗体液
を除去した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウエル２５
０μl 添加し、３７℃、１時間マスキングを行なった。
その後マスキング液を除去し、０．１％ＢＳＡを含むＰ
ＢＳを各ウエル２００μl 添加し、抗ｃＡＦポリクロナ
ール抗体固相化ＥＩＡプレートとした。[Measurement of uAF] The purified anti-cAF polyclonal antibody was diluted to 10 μg / ml with PBS, and 96-well E was added.
200 μl of each well on IA plate (made by Coaster)
Each and added and reacted overnight at 4 ° C. Then, after removing the excess antibody solution, PBS containing 1% BSA was added to each well 25
0 μl was added and masking was carried out at 37 ° C. for 1 hour.
After that, the masking solution was removed, and P containing 0.1% BSA was added.
200 μl of BS was added to each well to prepare an anti-cAF polyclonal antibody-immobilized EIA plate.

【００６２】次に抗ｃＡＦポリクロナール抗体固相化Ｅ
ＩＡプレートの保存液を除去した後、尿検体２００μl
を添加し、１分間攪拌した後、３７℃、１時間反応させ
た。反応後の液を除去した後、０．１％ＢＳＡを含むＰ
ＢＳを各ウエル２５０μl ずつ添加して洗浄を行なっ
た。洗浄を３回繰り返した後、ペルオキシダーゼ標識抗
ｃＡＦ抗体（１：２００）を各ウエル２００μl 添加
し、１分間攪拌した後、３７℃、１時間反応を行なっ
た。反応後、上記と同様に洗浄を行なった後基質液
（０．１Ｍ ｏ−フェニレンジアミンと０．０１２％過
酸化水素水）を各ウエル２００μl 添加し、室温で１５
分間反応させた。反応後、４Ｎ硫酸を各ウエル５０μl
添加し、酵素反応を停止した。次にマイクロプレート用
比色計で４９２nmの吸光値を測定し、判定を行なった。
吸光値０．３以上を示す検体を陽性とした。Next, anti-cAF polyclonal antibody immobilized E
After removing the stock solution from the IA plate, 200 μl of urine sample
Was added, the mixture was stirred for 1 minute, and then reacted at 37 ° C. for 1 hour. After removing the liquid after the reaction, P containing 0.1% BSA was added.
Washing was performed by adding 250 μl of BS to each well. After washing three times, 200 μl of peroxidase-labeled anti-cAF antibody (1: 200) was added to each well, stirred for 1 minute, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction, the plate was washed in the same manner as above, and 200 μl of a substrate solution (0.1 Mo -phenylenediamine and 0.012% hydrogen peroxide solution) was added to each well and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes.
Let react for minutes. After the reaction, 50 μl of 4N sulfuric acid was added to each well.
And the enzymatic reaction was stopped. Next, the light absorption value at 492 nm was measured with a colorimeter for microplates to make a judgment.
A sample showing an absorbance value of 0.3 or more was regarded as positive.

【００６３】健常者５名、ＩｇＡ腎症３名、糖尿病性腎
症３名、糖尿病患者９名について測定を行なったとこ
ろ、表１に示すように健常者では全例陰性を示したのに
対し、ＩｇＡ腎症および糖尿病性腎症では全例陽性であ
った。また糖尿病では９例中５例が陽性であった。When 5 healthy subjects, 3 IgA nephropathy, 3 diabetic nephropathy, and 9 diabetic patients were measured, as shown in Table 1, all healthy subjects were negative. , IgA nephropathy and diabetic nephropathy were all positive. As for diabetes, 5 out of 9 cases were positive.

【００６４】 [0064]

【００６５】実施例２ 〔ｅＡＦの調製法〕ＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ
（ファルマシア社製）にトリプシン（和光純薬社製）を
結合したトリプシン−セファロース４Ｂ（１０ml；１０
mgトリプシン／ml樹脂）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）に懸濁させ、ヒトアルブミン（フラクション
Ｖ、シグマ社製）１００mgを加え、室温で２時間攪拌し
た。その後、冷却下で遠心分離（３，０００rpm 、１０
分間）を行ない、樹脂を除去後、濾液を凍結乾燥して分
解物を５０mg得た。Example 2 [Method for preparing eAF] BrCN-activated Sepharose 4B
Trypsin-Sepharose 4B (10 ml; 10) obtained by binding trypsin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to (Pharmacia).
mg trypsin / ml resin to 0.1M phosphate buffer (pH)
It was suspended in 8.0), 100 mg of human albumin (fraction V, manufactured by Sigma) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Then, centrifuge under cooling (3,000 rpm, 10
After removing the resin, the filtrate was freeze-dried to obtain 50 mg of a decomposed product.

【００６６】〔抗ｅＡＦモノクロナール抗体の作製〕ｅ
ＡＦを滅菌蒸留水に溶解し、蛋白濃度１０mg／mlとした
抗原液とＦｒｅｕｎｄのコンプリートアジュバントを等
量混合し、オイルエマルジョンとした。これをＢＡＬＢ
／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｊｃｌ，７週齢、雌）背部
皮下に０．２mlずつ投与した。[Preparation of Anti-eAF Monoclonal Antibody] e
AF was dissolved in sterile distilled water, and an antigen solution having a protein concentration of 10 mg / ml and Freund's complete adjuvant were mixed in equal amounts to obtain an oil emulsion. This is BALB
/ C mouse (BALB / cAjcl, 7 weeks old, female) was subcutaneously administered to the back by 0.2 ml each.

【００６７】初回免疫後７日目と１６日目に追加免疫を
行い、さらに細胞融合３日前に抗原液を０．２５mg／
０．２mlずつ腹腔内投与した。最終免疫から３日目のマ
ウス脾細胞とミエローマ細胞（Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８−
６，５，３）を１０：１の割合で５０％ポリエチレング
リコール４０００を用いて融合し、ＨＡＴ培地により選
択した。細胞融合後、１４日目に培養上清中のヒトアル
ブミンとｅＡＦに対する抗体活性をＥＩＡ法により測定
した。すなわちヒトアルブミン及びｅＡＦを各々１００
μg ／mlの蛋白濃度で固相化した９６穴ＥＩＡプレート
（コースター社製）を用い、融合細胞の培養液を２００
μl 添加した。３７℃、１時間反応後、洗浄を行ない、
ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社
製、１：５００）２００μl を添加した。洗浄後、基質
液（０．１Ｍ ｏ−フェニレンジアミンと０．０１２％
過酸化水素水）を各ウエル２００μl 添加し、室温で１
５分間反応させた。反応後、４Ｎ硫酸を各ウエル５０μ
l 添加し、酵素反応を停止した。次に４９２nmにおける
吸光値を測定し、ｅＡＦにのみ陽性のクローンを限界希
釈法により、２回クローニングを行なった。その結果、
クローニング後腹水として得られたモノクロナール抗体
は２クローンであった。２クローンのイムノグロブリン
サブクラスはともにＩｇＧ₁ であり、Ｌ鎖はカッパー型
であった。得られた各々の腹水１mlに対して、ＰＢＳ１
mlで２倍に希釈し、飽和硫酸アンモニウム２mlを滴下
し、４℃で４時間放置後、３，０００rpm 、２０分間遠
心分離し、沈渣をＰＢＳ２mlに浮遊し、透析後、０．２
２μm のフィルターで濾過し、精製モノクロナール抗体
を得た。Booster immunization was performed on the 7th and 16th days after the first immunization, and 0.25 mg / antigen solution was added 3 days before cell fusion.
Each 0.2 ml was intraperitoneally administered. Three days after the final immunization, mouse splenocytes and myeloma cells (P3x63-Ag8-
6, 5, 3) were fused with 50% polyethylene glycol 4000 at a ratio of 10: 1 and selected by HAT medium. On the 14th day after cell fusion, the antibody activity against human albumin and eAF in the culture supernatant was measured by the EIA method. That is, human albumin and eAF are each 100
A 96-well EIA plate (manufactured by Coaster) immobilized at a protein concentration of μg / ml was used to prepare 200 cultures of fused cells.
μl was added. After reacting at 37 ° C for 1 hour, washing is performed,
200 μl of peroxidase-labeled anti-mouse IgG (Cappel, 1: 500) was added. After washing, the substrate solution (0.1 Mo -phenylenediamine and 0.012%
Hydrogen peroxide solution) was added to each well in an amount of 200 μl and
The reaction was carried out for 5 minutes. After the reaction, add 4N sulfuric acid to each well 50μ
l was added to stop the enzymatic reaction. Next, the absorbance value at 492 nm was measured, and a clone positive only to eAF was cloned twice by the limiting dilution method. as a result,
The monoclonal antibodies obtained as ascites after cloning were 2 clones. The immunoglobulin subclasses of the two clones were both IgG ₁ , and the L chain was of the kappa type. PBS1 for each 1 ml of ascites obtained
Dilute 2 times with ml, add 2 ml of saturated ammonium sulfate dropwise, leave at 4 ° C. for 4 hours, centrifuge at 3,000 rpm for 20 minutes, suspend the precipitate in 2 ml of PBS, dialyze, then 0.2
A purified monoclonal antibody was obtained by filtration through a 2 μm filter.

【００６８】＜金コロイド着色法＞抗ｅＡＦ抗体固相化シート 固相化シートとして、ニトロセルロースＢＡ−Ｓ−８５
（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社製、
０．４５μm ）を使用した。第１の領域として抗ｅＡＦ
モノクロナール抗体をＰＢＳにて０．５mg／mlになるよ
うに調製したものをニトロセルロースシートに垂直方向
に印字した。第２の領域として同一シート上にウサギ抗
マウスＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社製）をＰＢＳで０．５mg
／mlに調製したものを水平方向に印字し、室温にて一晩
反応させ、固相化した。これにＰＢＳで３％濃度に調製
したスキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）を３７℃にて３時
間含浸させ、マスキングを行ない、乾燥させたものを抗
ｅＡＦ固相化シートとした。<Gold colloid coloring method> Anti-eAF antibody solid-phased sheet As a solid-phased sheet, nitrocellulose BA-S-85
(Schleicher & Schuell,
0.45 μm) was used. Anti-eAF as the first area
Monoclonal antibody prepared with PBS to a concentration of 0.5 mg / ml was printed vertically on a nitrocellulose sheet. As the second region, 0.5 mg of rabbit anti-mouse IgG (manufactured by Cappel) with PBS on the same sheet.
What was adjusted to / ml was printed horizontally and reacted overnight at room temperature to immobilize. This was impregnated with skim milk (manufactured by DIFCO) adjusted to a concentration of 3% with PBS at 37 ° C. for 3 hours, masked, and dried to obtain an anti-eAF immobilized sheet.

【００６９】金コロイド粒子の調製 蒸留水３９５mlに１％塩化金酸（和光純薬社製）水溶液
５mlを混合し、６０℃に加熱した（溶液Ａ）。次に１％
クエン酸ナトリウム２０ml、１％タンニン酸（シグマ社
製）２５ml蒸留水７７．５mlを混合し、６０℃に加熱し
た（溶液Ｂ）。溶液Ａを攪拌しながら溶液Ｂを速やかに
混合し、溶液の色が薄い黄色から紫ないし赤色に変わる
まで攪拌した後、沸騰するまで加熱することにより目的
とする金コロイド粒子を得た。Preparation of Gold Colloid Particles 5 ml of a 1% aqueous solution of chloroauric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was mixed with 395 ml of distilled water and heated to 60 ° C. (solution A). Then 1%
20 ml of sodium citrate, 25 ml of 1% tannic acid (manufactured by Sigma) and 77.5 ml of distilled water were mixed and heated to 60 ° C. (solution B). Solution A was rapidly mixed while stirring solution A, and the solution was stirred until the color of the solution changed from pale yellow to purple or red, and then heated to boiling to obtain the desired gold colloid particles.

【００７０】抗ｅＡＦモノクロナール抗体感作金コロイ
ド粒子の調製 金コロイド粒子懸濁液１００mlを攪拌しながら、０．１
Ｍ炭酸カリウムでｐＨ７０に調整した。次に精製抗ｅＡ
Ｆモノクロナール抗体５００μg を加え、１０分間攪拌
した後、５％ＢＳＡ２５mlを加え、０．４５μm のメン
ブランフィルターで濾過し、２〜８℃で貯蔵した。 Anti-eAF Monoclonal Antibody Sensitized Gold Colloid
Preparation of de-particles While stirring 100 ml of gold colloidal particle suspension,
The pH was adjusted to 70 with M potassium carbonate. Then purified anti-eA
After adding 500 μg of F monoclonal antibody and stirring for 10 minutes, 25 ml of 5% BSA was added, and the mixture was filtered through a 0.45 μm membrane filter and stored at 2-8 ° C.

【００７１】金コロイド着色法による測定 抗ｅＡＦモノクロナール抗体固相化シート（１cm×１c
m）を試験管に入れ、尿検体０．５mlを加え、室温で５
分間反応させた。次にアスピレーターで尿検体液を除去
し、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ１mlで洗浄
を行った。３回繰り返し洗浄した後、抗ｅＡＦモノクロ
ナール抗体感作金コロイド粒子溶液（Ａ５４０nm＝５．
０）０．５mlを加え、室温で５分間反応させた。 Measurement by gold colloid coloring method Anti-eAF monoclonal antibody immobilized sheet (1 cm × 1 c
m) into a test tube, add 0.5 ml of urine sample,
Let react for minutes. Next, the urine sample solution was removed with an aspirator, and the sample was washed with 1 ml of PBS containing 0.1% Tween-20. After repeatedly washing three times, a solution of anti-eAF monoclonal antibody-sensitized gold colloidal particles (A540 nm = 5.
0) 0.5 ml was added and reacted at room temperature for 5 minutes.

【００７２】アスピレーターで過剰の抗ｅＡＦモノクロ
ナール抗体感作金コロイド粒子溶液を除去し、０．１％
ＮａＮ₃ を含む１０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄後、肉
眼判定を行なった。Excessive anti-eAF monoclonal antibody-sensitized gold colloid particle solution was removed with an aspirator,
After washing with 10 mM HEPES buffer containing NaN _3, it was subjected to the naked eye judgment.

【００７３】尿検体として健常者５名、ＩｇＡ腎症３
名、糖尿病患者９名について測定を行なったところ、表
２に示すように健常者では全例、第二の領域にのみ印字
され、陰性を示したのに対し、ＩｇＡ腎症および糖尿病
性腎症では全例、第一および第二の領域に印字され陽性
であった。また糖尿病では９例中４例が陽性であった。As urine samples, 5 healthy subjects and 3 IgA nephropathy
, And 9 diabetic patients, as shown in Table 2, in all healthy subjects, only the second region was printed and showed negative, whereas IgA nephropathy and diabetic nephropathy were shown. In all cases, the print was positive in the first and second areas and was positive. In diabetes, 4 out of 9 cases were positive.

【００７４】 [0074]

【００７５】実施例３ 〔ｕＡＦの調製法〕糖尿病性腎症の患者尿１ＬをｐＨ
８．０に調整し、実施例２で得られた抗ｅＡＦモノクロ
ナール抗体をＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ（ファル
マシア社製）に結合させた抗ｅＡＦモノクロナール抗体
結合セファロース４Ｂカラム（１０ml：５mgモノクロナ
ール抗体／ml樹脂）に吸着させた。５mMホウ酸緩衝液で
洗浄後、０．５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶
出を行なった。２８０nmの吸光値により活性画分を集め
た。ＰＢＳにて透析後、得られたｕＡＦは６mgであっ
た。Example 3 [Preparation of uAF] 1 L of urine from a diabetic nephropathy patient was adjusted to pH.
Adjusted to 8.0, the anti-eAF monoclonal antibody obtained in Example 2 was bound to BrCN-activated Sepharose 4B (Pharmacia) to bind to the anti-eAF monoclonal antibody Sepharose 4B column (10 ml: 5 mg monoclonal antibody). / Ml resin). After washing with 5 mM borate buffer, elution was performed with 0.5 M glycine buffer (pH 3.0). Active fractions were collected by absorbance at 280 nm. After dialysis with PBS, the obtained uAF was 6 mg.

【００７６】〔抗ｕＡＦポリクロナール抗体の調製〕ｕ
ＡＦ１mg／mlとした抗原液１mlとＦｒｅｕｎｄのコンプ
リートアジュバントを等量混合し、オイルエマルジョン
とした。これを家兎（ニュージーランドホワイト、１１
週齢、雌）の四肢皮下に初回免疫した。その後、１４日
目、２１日目、２８日目に追加免疫を行ない、最終免疫
から７日目に採血を行い抗血清３０mlを得た。[Preparation of Anti-uAF Polyclonal Antibody] u
1 ml of the antigen solution containing 1 mg / ml of AF was mixed with an equal amount of Freund's complete adjuvant to prepare an oil emulsion. This is a rabbit (New Zealand White, 11
(Week-old, female) was subcutaneously immunized in the extremities. After that, booster immunization was performed on the 14th, 21st, and 28th days, and blood was collected on the 7th day after the final immunization to obtain 30 ml of antiserum.

【００７７】次にＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ（フ
ァルマシア社製）にヒトアルブミン（フラクションＶ，
シグマ社製）を結合したアルブミン−セファロースカラ
ム（３０ml）を５mMホウ酸緩衝液で平衡化し、抗血清１
０mlを同ホウ酸緩衝液１０mlに混合しカラムに吸着させ
た。その後、同ホウ酸緩衝液にて洗浄し、未吸着画分を
集めた。Next, BrCN-activated Sepharose 4B (Pharmacia) was added to human albumin (fraction V,
Albumin-Sepharose column (30 ml) bound with Sigma) was equilibrated with 5 mM borate buffer, and antiserum 1 was added.
0 ml was mixed with 10 ml of the same borate buffer and adsorbed on the column. Then, it was washed with the same borate buffer and the unadsorbed fraction was collected.

【００７８】次にＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ（フ
ァルマシア社製）にｃＡＦをリガンドしてｃＡＦ−セフ
ァロース４Ｂカラム（５ml）を調製し、５mMホウ酸緩衝
液（ｐＨ８．０）で平衡化を行い、未吸着画分をカラム
に吸着させた。その後、同ホウ酸緩衝液にて洗浄後、
０．５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出を行な
った。２８０nmの吸光値により活性画分を集め、６０％
飽和硫安を加えた。懸濁液を３，０００rpm で３０分間
遠心分離を行ない沈渣を集め、ＰＢＳで４℃、一晩透析
を行なった。その結果、精製抗ｕＡＦポリクロナール抗
体１．５mgを得た。Then, cAF was used as a ligand on BrCN-activated Sepharose 4B (Pharmacia) to prepare a cAF-Sepharose 4B column (5 ml), which was equilibrated with 5 mM borate buffer (pH 8.0). The adsorption fraction was adsorbed on the column. Then, after washing with the same borate buffer,
Elution was performed with 0.5 M glycine buffer (pH 3.0). The active fraction was collected based on the absorbance value at 280 nm, and was 60%.
Saturated ammonium sulfate was added. The suspension was centrifuged at 3,000 rpm for 30 minutes, the precipitate was collected, and dialyzed against PBS at 4 ° C. overnight. As a result, 1.5 mg of purified anti-uAF polyclonal antibody was obtained.

【００７９】〔ラテックス法によるｕＡＦの測定〕抗ｕＡＦポリクロナール抗体感作ラテックス粒子の調製 抗ｕＡＦポリクロナール抗体０．５mgを０．２Ｍアンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．５mlに加え溶解した。
１０％ラテックス粒子（０．４μm 、積水化学工業社
製）０．５mlを加え、室温で１時間攪拌した。その後、
冷却下で遠心分離（１０，０００rpm ，３０分間）し、
沈渣の抗ヒトアルブミン分解物抗体結合ラテックス粒子
をブロックエース（大日本製薬社製）に懸濁させ、抗ｕ
ＡＦポリクロナール抗体感作ラテックス粒子が０．２％
になるように調製した。[Measurement of uAF by Latex Method] Preparation of Latex Particles Sensitized with Anti-uAF Polyclonal Antibody 0.5 mg of anti-uAF polyclonal antibody was added to 0.5 ml of 0.2 M ammonium buffer solution (pH 8.0) and dissolved.
0.5 ml of 10% latex particles (0.4 μm, manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. afterwards,
Centrifuge under cooling (10,000 rpm, 30 minutes),
The anti-human albumin degradation product antibody-bound latex particles in the precipitate are suspended in Block Ace (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) to obtain anti-u
AF polyclonal antibody-sensitized latex particles 0.2%
Was prepared.

【００８０】測定 尿検体０．１mlに０．２Ｍアンモニウム緩衝液（ｐＨ
８．０）０．４mlに加え、希釈尿検体液とした。ラテッ
ク凝集板上に希釈尿検体液０．０５mlと０．２％抗ｕＡ
Ｆポリクロナール抗体感作ラテックス懸濁液０．０５ml
を加え、攪拌後、混合液を円運動させながら、３分間揺
動し、凝集塊の有無により、判定を行なった。 Measurement 0.1 ml of a urine sample is supplemented with 0.2 M ammonium buffer (pH
8.0) 0.4 ml in addition to a diluted urine sample solution. 0.05 ml of diluted urine sample liquid and 0.2% anti-uA on a latex plate
F Polyclonal antibody-sensitized latex suspension 0.05 ml
Was added, and after stirring, the mixed solution was oscillated for 3 minutes while circularly moving, and the presence / absence of aggregates was evaluated.

【００８１】健常者５名、ＩｇＡ腎症３名、糖尿病性腎
症３名、糖尿病患者９名について測定を行なったとこ
ろ、ＩｇＡ腎症３名、糖尿病性腎症３名および糖尿病４
名について凝集塊が観察され、陽性と判定された。一方
健常者５名、糖尿病５名については凝集塊が観察され
ず、陰性と判定された。（表３）When 5 healthy subjects, 3 IgA nephropathy, 3 diabetic nephropathy and 9 diabetic patients were measured, 3 IgA nephropathy, 3 diabetic nephropathy and 4 diabetic
Aggregates were observed for the first name and were determined to be positive. On the other hand, no aggregate was observed in 5 healthy subjects and 5 diabetic subjects, and it was determined to be negative. (Table 3)

【００８２】 [0082]

Claims (4)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ヒト尿中のアルブミン分解物を検出する
ことによる腎疾患の診断方法。1. A method for diagnosing renal disease by detecting an albumin degradation product in human urine. 【請求項２】 抗ヒトアルブミン分解物抗体を用いるヒ
ト尿中のアルブミン分解物の検出方法。2. A method for detecting an albumin degradation product in human urine using an anti-human albumin degradation product antibody. 【請求項３】 ヒト尿中のアルブミン分解物と特異的に
反応する下記方法により調製される抗体を利用する検出
方法。 糖尿病、糖尿病性腎症および各腎疾患に罹病した患
者の尿より分離精製したアルブミン分解物に対するポリ
クロナール抗体およびモノクロナール抗体。 ヒトアルブミン（６９ＫＤ）をプロテアーゼ類で部
分加水分解して得られるアルブミン分解物に対するポリ
クロナール抗体およびモノクロナール抗体。 ヒトアルブミン（６９ＫＤ）を化学的に切断して得
られる分解物に対するポリクロナール抗体およびモノク
ロナール抗体。3. A detection method using an antibody prepared by the following method, which specifically reacts with a degradation product of albumin in human urine. A polyclonal antibody and a monoclonal antibody against an albumin degradation product isolated and purified from urine of patients suffering from diabetes, diabetic nephropathy and each renal disease. A polyclonal antibody and a monoclonal antibody against an albumin degradation product obtained by partially hydrolyzing human albumin (69KD) with proteases. A polyclonal antibody and a monoclonal antibody against a degradation product obtained by chemically cleaving human albumin (69KD). 【請求項４】 請求項３で得られた抗体を利用する検出
方法が酵素免疫測定法、放射線免疫測定法、ラテックス
凝集法、逆受身赤血球凝集反応、金コロイド粒子法であ
る請求項２記載の検出方法。4. The detection method using the antibody obtained in claim 3 is enzyme immunoassay, radioimmunoassay, latex agglutination, reverse passive hemagglutination, gold colloid particle method. Detection method.