JPH0680695A - Peptide - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide a novel peptide having specific amino acid sequences isolated from the skin of Nigromaculata, etc., having a strong histamine- releasing activity and an antibacterial activity against gram-positive bacteria, gram-negative bacteria, etc., and useful as an antibacterial agent. CONSTITUTION:The skin of Nigromaculata, Rana.brevipoda, etc., is extracted with a 1M acetic acid solution under boiling, and they filtered. The filtrate is dialyzed through a dialytic membrane cutting molecules having mol.wts. of >=1000 with a 1M acetic acid solution for 12hr to remove salts and low mol.wt. amines. The solution inside the dialytic membrane is passed through a gel filtration column and subsequently eluted with a pyridine-acetic acid solution. The eluted fraction is concentrated and dried under vacuum, dissolved in water, and subsequently subjected to a reverse phase high performance liquid chromatography, followed by separating an elusion fraction having an antibacterial activity to provide the objective peptide having amino acid sequences of formulas I and II, the brevinin-1 of formula I having an antibacterial activity against gram-positive bacteria, and the brevinin-2 of formula II having an antibacterial activity against gram-positive bacteria and gram-negative bacteria.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】この発明は新規なペプチドに関
し、例えば、この発明のペプチドは抗菌剤として有用で
ある。The present invention relates to a novel peptide, for example, the peptide of the present invention is useful as an antibacterial agent.

【０００２】[0002]

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】近年、
動物に対し生理活性を示す物質が天然物より単離されて
いるが、その中にペプチドがある。これらのペプチド類
は現在まで、そのアミノ酸配列等の構造解析や構造活性
相関等の検討が行われ、医学、薬学の分野で広く利用さ
れているものも多い。2. Description of the Related Art In recent years,
A substance that exhibits physiological activity to animals has been isolated from natural products, and peptides are among them. Until now, many of these peptides have been widely used in the fields of medicine and pharmacy, for which structural analysis of the amino acid sequences and the like and examination of structure-activity relationship have been conducted.

【０００３】カエルの皮膚には多くの分泌腺が存在する
ことはよく知られており、これまでに、ボンベシン、ゼ
ノブシン、カエルレイン、ブラジキニン等の生理活性物
質が単離されている（Charles L. Bevins (1990) Annu.
Rev. Biochem. 59: 395) 。これらの物質は哺乳類の体
内にも一次構造の類似した物質が存在することが明らか
となってきたことから、生命科学の分野において生体系
の情報伝達機構を研究する際の有用なツールとして、現
在盛んに利用されている。It is well known that many secretory glands are present in the skin of frogs, and physiologically active substances such as bombesin, zenobosine, frog rein and bradykinin have been isolated so far (Charles L. Bevins (1990) Annu.
Rev. Biochem. 59: 395). Since it has been clarified that these substances have similar primary structures in the body of mammals, they are currently being used as useful tools for studying the information transmission mechanism of biological systems in the field of life science. It is being actively used.

【０００４】これら生理活性物質の中で抗菌作用を有す
るペプチドとしては、これまでにミッチェルらにより、
ヨーロピアンボンビーナ類からボンビニンが単離されて
おり（A. Csordas H. Michel (1970) Monatshefte fur
Chemie 101: 182)、またザスロスらによりアフリカツメ
ガエルからマガイニンが単離されている（Michel Zaslo
ff (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5449)。Among these physiologically active substances, as peptides having an antibacterial action, Mitchell et al.
Bombinins have been isolated from European bombinas (A. Csordas H. Michel (1970) Monatshefte fur
Chemie 101: 182), and Magainin was isolated from Xenopus laevis by Zasros et al. (Michel Zaslo
ff (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5449).

【０００５】一方、哺乳類の組織中からも抗菌活性を有
するペプチドの存在が確認されている。うさぎの肺のマ
クロファージからＭＣＰ−１及びＭＣＰ−２が、牛の好
中球からＢａｃ−１及びＢａｃ−２が単離されている
（Michel Zasloff (1983) J. Biol. Chem. 258, 23: 14
485 /Ming-Der Kuo (1988) J. Biol. Chem. 263, 20: 9
573 /Rainer W. Frank (1990) J. Biol. Chem. 265, 3
1: 18871)。これらのペプチドは活性酸素と共に外界の
バクテリアから生体を保護する役目を担っていると考え
られる。On the other hand, the presence of peptides having antibacterial activity has been confirmed in mammalian tissues. MCP-1 and MCP-2 have been isolated from rabbit lung macrophages and Bac-1 and Bac-2 from bovine neutrophils (Michel Zasloff (1983) J. Biol. Chem. 258, 23: 14
485 / Ming-Der Kuo (1988) J. Biol. Chem. 263, 20: 9
573 / Rainer W. Frank (1990) J. Biol. Chem. 265, 3
1: 18871). It is considered that these peptides play a role of protecting the living body from bacteria in the outside world together with active oxygen.

【０００６】また、昆虫類においても、例えば、ウジの
体内にもこれらとかなり相同性のある構造を有するペプ
チドの存在が確認されており（Jean Lambert (1989) Pr
oc.Natl. Acad. Sci. USA 86: 262) 、やはり生体を保
護していると考えられている。カエルの皮膚由来の抗菌
性ペプチドの生物学的意義は明らかにされていないが、
これらのことからやはり生体保護の役割を担っていると
考えられる。よって、カエルの皮膚から新たな物質を探
索すれば、単に抗菌性だけでなく予期せぬ効果も期待で
きる。[0006] In insects, for example, in the body of maggot, it has been confirmed that peptides having a structure highly homologous thereto (Jean Lambert (1989) Pr.
oc.Natl. Acad. Sci. USA 86: 262), which is also believed to protect the living body. Although the biological significance of antimicrobial peptides derived from frog skin has not been clarified,
From these facts, it is considered that they also play a role of biological protection. Therefore, if a new substance is searched for from the skin of a frog, not only antibacterial properties but also unexpected effects can be expected.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】発明者らは、日本に広く
棲息するトノサマガエル（ニグロマキュラタ；Nigromac
ulata)、ダルマガエル（ラナ・ブレビポーダ；Rana bre
vipoda）等の皮膚からグラム陽性菌及びグラム陰性菌に
対する抗菌活性を指標に精製を進め、新しい構造を持つ
抗菌活性を有するペプチドを単離するに至った。そし
て、得られたペプチドは、それぞれ下記の式であること
を見出し、それぞれ、ブレビニン−１、ブレビニン−２
と命名した。さらに、このペプチドはマスト細胞からの
ヒスタミン放出活性を有することから、免疫細胞に作用
し、その作用を増強させることも考えられる。また、ブ
レビニン−１は、Ｎ末端側が走化性ペプチドと類似して
いることから、白血球等の走化性を促し、抗炎症作用を
持つ可能性もある。We Means for Solving the Problems] is inhabiting widely in Japan frog (Niguromakyurata; Nigromac
ulata ), Dharma frog (Rana brebipoda; Rana bre
Purification was carried out from skins such as vipoda ) with antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria as an index, and peptides having antibacterial activity with a new structure were isolated. Then, it was found that the obtained peptides have the following formulas, respectively, and brevinin-1 and brevinin-2, respectively.
I named it. Furthermore, since this peptide has a histamine-releasing activity from mast cells, it may act on immune cells to enhance its action. Further, since brevinin-1 is similar to the chemotactic peptide on the N-terminal side, it may promote chemotaxis of leukocytes and the like and may have an anti-inflammatory effect.

【０００８】かくして、この発明によれば式、Thus, according to the invention, the equation

【０００９】[0009]

【化３】 及び[Chemical 3] as well as

【００１０】[0010]

【化４】 で表されるペプチドが提供される。この発明のペプチド
は、基本的にトノサマガエル（ニグロマキュラタ；Nigr
omaculata)、ダルマガエル（ラナ・ブレビポーダ；Rana
brevipoda）等の皮膚からの抽出工程と精製工程とから
得ることができる。以下に、この発明のペプチドの抽
出、精製方法について説明する。[Chemical 4] A peptide represented by is provided. The peptide of this invention is basically a frog (Nigroma curata; Nigr).
omaculata ), Dharma Frog (Rana Brevipoda; Rana
brevipoda ) and the like, and can be obtained from the extraction and purification steps from the skin. The method for extracting and purifying the peptide of the present invention will be described below.

【００１１】抽出は弱酸性水溶液で行なう。この際、例
えば、１〜２Ｍ程度の酢酸水溶液等を用いることが望ま
しい。また、抽出は常温で皮膚を希酸水溶液中に長時間
静置しておいてもよいし、煮沸しながら短時間で行って
もよい。抽出物の精製は、複数の塩や低分子アミノ酸が
混在しているため、分子量１０００以下の物質を除去す
ることができるような透析膜を用いて、弱酸性水溶液、
例えば、抽出の際に用いた溶媒系で透析することが好ま
しい。また、その後さらに透析液をゲルろ過に付しても
よい。そして、得られた溶液を分離能に優れた逆相高速
液体クロマトグラフィに付す。逆相系カラムでの精製に
使用する溶媒としては、抽出の際に用いた溶媒系でよい
が、有機溶媒としてはアセトニトリルが最も望ましい。
溶離液中の成分は、紫外検出器による２１０ｎｍ〜２８
０ｎｍでの吸光度測定により、各ピークに相当する溶出
部分を分取することで得られる。The extraction is carried out with a weakly acidic aqueous solution. At this time, for example, it is desirable to use an acetic acid aqueous solution of 1 to 2 M or the like. The extraction may be carried out by leaving the skin in a dilute aqueous acid solution at room temperature for a long time, or by boiling it for a short time. For purification of the extract, since a plurality of salts and low molecular weight amino acids are mixed, a dialysis membrane capable of removing a substance having a molecular weight of 1,000 or less is used, and a weakly acidic aqueous solution is used.
For example, dialysis is preferably performed with the solvent system used for extraction. Further, the dialysate may be further subjected to gel filtration after that. Then, the obtained solution is subjected to reverse-phase high performance liquid chromatography having excellent resolution. The solvent used for purification in the reversed-phase column may be the solvent system used in the extraction, but acetonitrile is most preferable as the organic solvent.
The components in the eluent are 210 nm to 28 nm by an ultraviolet detector.
It can be obtained by fractionating the eluted portion corresponding to each peak by measuring the absorbance at 0 nm.

【００１２】精製された成分は、アミノ酸組成分析なら
びに自動シークエンサーによるアミノ酸配列分析により
化学構造を決定することができる。また、上記の方法で
得られるペプチドは、公知のペプチド合成装置により、
例えば、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、オルト−クロ
ロベンジルオキシカルボニル（ＣｌＺ）、ベンジル（Ｂ
ｚｌ）、シクロヘキシルオキシ（ＯｃＨｅｘ）又はｔ−
ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）等の保護基を用いて、公
知のペプチド合成方法を利用して合成することができ
る。The chemical structure of the purified component can be determined by amino acid composition analysis as well as amino acid sequence analysis by an automatic sequencer. Further, the peptide obtained by the above method, by a known peptide synthesizer,
For example, acetamidomethyl (Acm), ortho-chlorobenzyloxycarbonyl (ClZ), benzyl (B
zl), cyclohexyloxy (OcHex) or t-
It can be synthesized using a known peptide synthesis method using a protecting group such as butoxycarbonyl (Boc).

【００１３】この発明におけるペプチドであるブレビニ
ン−１及びブレビニン−２は抗菌作用を有しており、感
染症の予防・治療に用いることができる。さらに、免疫
増強剤または抗炎症剤として有用であると思われる。ま
た、ブレビニン−１及びブレビニン−２における疎水性
アミノ酸（例えば、Leu 、Ile 、Val 又はPhe 等）はそ
れらの中で変換可能であり、そのようなペプチドも本発
明の範囲に含まれる。The peptides of the present invention, blebinin-1 and brevinin-2, have antibacterial activity and can be used for the prevention / treatment of infectious diseases. In addition, it appears to be useful as an immune enhancer or anti-inflammatory agent. Further, hydrophobic amino acids (eg, Leu, Ile, Val or Phe) in brevinin-1 and brevinin-2 are convertible therein, and such peptides are also included in the scope of the present invention.

【００１４】この発明におけるペプチドは、粉末、顆
粒、錠剤、カプセル剤、注射剤等の医薬組成物として、
ヒトに経口的又は非経口的に安全に投与することができ
る。この発明におけるペプチドは、担体もしくは賦形
剤、例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビ
トール、トラガントゴム、ポリビニルピロリドン等、充
填剤、例えばラクトース、糖類、とうもろこし澱粉、燐
酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等、滑沢剤、例
えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレン
グリコール、シリカ等、崩壊剤、例えば馬鈴薯澱粉等又
は湿潤剤、例えばナトリウムラウリルサルフェート等と
適宜混合したのち、経口投与用の粉末、顆粒、錠剤、カ
プセル剤とすることができる。錠剤、顆粒等は自体公知
の方法によってフィルムコーティングすることもでき
る。経口用製剤は、水性又は油性懸濁液、溶液、乳濁
液、シロップ、エリキシル等の液状製剤として用いても
よい。また、これらの製剤に、例えば公知の酸化防止
剤、防腐剤、結合剤、湿潤剤、滑沢剤、粘稠剤又は風味
剤等の成分を混合してもよい。The peptide according to the present invention is used as a pharmaceutical composition such as powder, granules, tablets, capsules and injections.
It can be safely administered to humans orally or parenterally. The peptide in this invention is a carrier or excipient, for example, syrup, acacia, gelatin, sorbitol, tragacanth, polyvinylpyrrolidone, etc., filler, for example, lactose, saccharides, corn starch, calcium phosphate, sorbitol, glycine, lubricants, etc. , For example, magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, etc., and appropriately mixed with a disintegrating agent, such as potato starch, etc. or a wetting agent, such as sodium lauryl sulfate, to obtain powder, granules, tablets or capsules for oral administration. be able to. The tablets, granules and the like can be film-coated by a method known per se. The oral preparation may be used as a liquid preparation such as an aqueous or oily suspension, a solution, an emulsion, a syrup and an elixir. In addition, components such as known antioxidants, preservatives, binders, wetting agents, lubricants, thickeners, flavors and the like may be mixed with these preparations.

【００１５】注射用製剤は、アンプル又は防腐剤を添加
した容器の使用形態で提供し得る。該製剤は、油性又は
水性溶媒中の懸濁液、溶液又は乳濁液であってもよく、
公知の懸濁剤、安定剤及び（又は）分散剤等の補助剤を
適宜含有していてもよい。また、この発明のペプチド
は、粉末剤、散剤として使用直前に適当な溶媒、例えば
殺菌した発熱性物質を含有していない水で溶解したのち
使用に供することができる。The injectable preparation may be provided in the form of use in an ampoule or a container to which a preservative is added. The formulation may be a suspension, solution or emulsion in an oily or aqueous solvent,
A known auxiliary agent such as a suspension agent, a stabilizer and / or a dispersant may be appropriately contained. Further, the peptide of the present invention can be used as a powder or a powder after being dissolved in a suitable solvent, for example, sterilized water containing no pyrogen, immediately before use.

【００１６】投与量は疾病の状態、投与ルートによって
も異なるが、例えば、成人（体重５０ｋｇ）患者に投与
する場合、約０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ／日、好まし
くは約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日である。さらに、こ
の発明のペプチドは、外用殺菌剤としても用いることが
できる。例えばワセリン、ラノリンを基剤として、１ｇ
あたり通常約０．１〜１００ｍｇ含有する軟膏剤とし
て、皮膚あるいは粘膜等に塗布することができる。ま
た、この発明のペプチドを、必要に応じて液体の希釈剤
に溶解、あるいは懸濁させて用いることができる。この
際、この製剤に公知の溶解補助剤、吸収促進剤、懸濁
剤、安定剤及び（又は）分散剤等の補助剤を適宜含有し
ていてもよい。The dose varies depending on the condition of the disease and the route of administration, but when administered to an adult (body weight 50 kg) patient, for example, about 0.01 to 200 mg / kg / day, preferably about 0.1 to 50 mg / day. kg / day. Further, the peptide of the present invention can be used as an external germicide. For example, based on petrolatum and lanolin, 1g
It can be applied to the skin, mucous membranes, etc. as an ointment usually containing about 0.1 to 100 mg. Further, the peptide of the present invention can be used by dissolving or suspending it in a liquid diluent, if necessary. At this time, the formulation may appropriately contain known auxiliary agents such as a dissolution aid, an absorption promoter, a suspension, a stabilizer and / or a dispersant.

【００１７】[0017]

【実施例】以下実施例によりこの発明を詳細に説明す
る。 トウキョウダルマガエル（ラナ・ブレビポーダ・ポル
サ；Rana brevipoda porsa）からのペプチドの抽出、精
製 トウキョウダルマガエル（ラナ・ブレビポーダ・ポル
サ；Rana brevipoda porsa）６匹の皮膚を１Ｍ酢酸溶液
８０ｍｌで煮沸下抽出し、ろ過後、抽出液を分子量１０
００カットの透析膜（スペクトラポア６：フナコシ社
製）を用い、１Ｍ酢酸溶液２リットルに対して１２時間
透析をかけて、塩及び低分子量アミンを除去した。透析
膜内液７０ｍｌを１Ｍ酢酸溶液で充填したＳＰ−セファ
デックスＣ−５０（ファルマシア製）２５ｍｌに付し、
１Ｍ酢酸溶液及び２Ｍピリジン溶液各７５ｍｌで洗浄
後、２ｍｌピリジン−酢酸溶液（ｐＨ５．０）７５ｍｌ
で溶出した。この溶出分画を減圧下濃縮乾固し、１．５
ｍｌの水に溶解後、以下の条件で逆相高速液体クロマト
グラフィを行った。 カラム：ＴＳＫ−ゲル（東ソー社製）、ＯＤＳ−８０Ｔ
Ｍ(250×4.6 mm I.D.) 移動相：Ａ；H₂O/MeCN(95/5), 0.05%TFA、Ｂ；H₂O/MeCN
(40/60), 0.05%TFA 勾配：Ａ／Ｂ；１００／０→０／１００（６０分）→０
／１００（１０分） 流速：０．７ｍｌ／分 カラム温度：４０℃ 検出：２１５ｎｍ（ＵＶ） 上記の条件下で行った逆相高速液体クロマトグラフィの
結果、図１に示すようなクロマトグラフィが得られた。
図中に示したピーク及びピークのない溶出液の抗菌活性
を調べたところ、図１中、No. ６（以下「Ｐ−６」と記
載）及びNo. ９（以下「Ｐ−９」と記載）に抗菌活性が
見られた。そこで、これらの画分を分取し、Ｐ−６を３
１ｎｍｏｌ（１０１．４μｇ）、Ｐ−９を２６ｎｍｏｌ
（６５．７μｇ）得た（アミノ酸分析の結果による）。
これらについて、アミノ酸組成分析、アミノ酸配列分
析、Ｃ末端構造分析を行った。The present invention will be described in detail with reference to the following examples. Tokyo Daruma Frog (Rana Burebipoda-Porusa; Rana brevipoda porsa) of the peptide from the extraction, purification Tokyo Daruma Frog (Rana Burebipoda-Porusa; Rana brevipoda porsa) Six skin boiled under extracted with 1M acetic acid solution 80 ml, filtered , The molecular weight of the extract is 10
Using a 00-cut dialysis membrane (Spectrapore 6: manufactured by Funakoshi Co., Ltd.), 2 liters of a 1M acetic acid solution was dialyzed for 12 hours to remove salts and low molecular weight amines. 70 ml of the dialysis membrane solution was applied to 25 ml of SP-Sephadex C-50 (made by Pharmacia) filled with a 1 M acetic acid solution,
After washing with 75 ml each of 1M acetic acid solution and 2M pyridine solution, 2 ml pyridine-acetic acid solution (pH 5.0) 75 ml
Eluted at. The eluate fraction was concentrated to dryness under reduced pressure to give 1.5
After dissolving in ml of water, reverse phase high performance liquid chromatography was performed under the following conditions. Column: TSK-gel (manufactured by Tosoh Corporation), ODS-80T
M (250 × 4.6 mm ID) Mobile phase: A; H ₂ O / MeCN (95/5), 0.05% TFA, B; H ₂ O / MeCN
(40/60), 0.05% TFA Gradient: A / B; 100/0 → 0/100 (60 minutes) → 0
/ 100 (10 minutes) Flow rate: 0.7 ml / minute Column temperature: 40 ° C. Detection: 215 nm (UV) As a result of reverse phase high performance liquid chromatography performed under the above conditions, a chromatography as shown in FIG. 1 was obtained. .
When the antibacterial activity of the eluate shown in the figure with and without a peak was examined, it was found in FIG. 1 that it was No. 6 (hereinafter referred to as “P-6”) and No. 9 (hereinafter referred to as “P-9”). ) Showed antibacterial activity. Therefore, these fractions were collected and P-6 was
1 nmol (101.4 μg), P-9 at 26 nmol
(65.7 μg) was obtained (according to the result of amino acid analysis).
For these, amino acid composition analysis, amino acid sequence analysis, and C-terminal structure analysis were performed.

【００１８】ペプチドの構造解析 １．Ｐ−９の構造解析 まず、このペプチドの一部を取り、６ＮＨＣｌ／ＨＳＣ
Ｈ₂ ＣＯＯＨ（１００／４）液中、１１０℃、２０時間
加水分解した後、ＩＥＸ−２１５（50×4.6 mmI.D. ；
東ソー社製）を用いたアミノ酸組成分析を行った。その
結果、Ｐ−９画分はシステイン残基を有することが判明
した。Structural analysis of peptides 1. Structural analysis of P-9 First, a part of this peptide was taken, and 6NHCl / HSC was used.
After hydrolysis in H ₂ COOH (100/4) solution at 110 ° C. for 20 hours, IEX-215 (50 × 4.6 mmI.D .;
Amino acid composition analysis was performed using Tosoh Corporation. As a result, it was revealed that the P-9 fraction had a cysteine residue.

【００１９】そこで、ペプチド３ｎｍｏｌの乾固物に、
０．３Ｍジチオスレイトールを３．５μｌ、５Ｍ塩酸グ
アニジンを３５μｌ加え、４５℃で１４時間反応させた
のち、１Ｍヨード酢酸（ｐＨ８．０）３５μｌ、２−メ
ルカプトエタノール２．５μｌを順次加え、Ｐ−９の還
元カルボキシメチル化を行った。そして、前述の高速液
体クロマトグラフィ条件により精製し、還元カルボキシ
メチル体約２．４ｎｍｏｌを得た。この還元カルボキシ
メチル体を約８００ｐｍｏｌずつ用いて、それぞれトリ
プシン、キモトリプシン等で酵素処理後、そのフラグメ
ントを高速液体クロマトグラフィで分取し、各フラグメ
ントについてアミノ酸組成分析、アミノ酸配列分析を行
った。アミノ酸配列分析には、ＡＢＩ４７７Ａプロテイ
ン・シークエンサーを用いた。アミノ酸組成分析、アミ
ノ酸配列分析については、表１及び図２に示した。Then, in a dry matter of 3 nmol of the peptide,
After adding 3.5 μl of 0.3 M dithiothreitol and 35 μl of 5 M guanidine hydrochloride and reacting at 45 ° C. for 14 hours, 35 μl of 1 M iodoacetic acid (pH 8.0) and 2.5 μl of 2-mercaptoethanol were sequentially added, and P Reductive carboxymethylation of -9 was performed. And it refine | purified on the above-mentioned high performance liquid chromatography conditions, and about 2.4 nmol of reduced carboxymethyl body was obtained. About 800 pmol of this reduced carboxymethyl derivative was treated with trypsin, chymotrypsin, etc., respectively, and the fragments were separated by high performance liquid chromatography. The amino acid composition analysis and amino acid sequence analysis were performed on each fragment. ABI477A protein sequencer was used for amino acid sequence analysis. The amino acid composition analysis and amino acid sequence analysis are shown in Table 1 and FIG.

【００２０】[0020]

【表１】 これらを組み合わせて、以下に示す一次構造を決定し
た。なお、ＦＡＢ−ＭＡＳＳによるこのペプチドの分子
量は２５２８であった。[Table 1] These were combined to determine the primary structure shown below. The molecular weight of this peptide by FAB-MASS was 2528.

【００２１】[0021]

【化５】 Ｃ末端についてはトリプシン処理によりリジルシステイ
ンが生成されることが予備検討の結果判明したため、過
蟻酸酸化したＰ−９をトリプシン処理した。Ｃ末端のリ
ジルシステイン酸は、短いペプチドフラグメントである
こと、極性が高いこと等から、逆相高速液体クロマトグ
ラフィでの分取は不可能であると考え、酵素処理液フラ
グメントミクスチャーのままマニュアルエドマン分解を
行い、そのまま２０μｌの０．２５Ｍ炭酸水素ナトリウ
ム溶液（ｐＨ８．０）中で、ダンシルクロリド（６ｍｇ
／ｍｌ）アセトン溶液２０μｌを加え、２０℃、２４時
間反応させてダンシル化を行った。以下の条件で逆相高
速液体クロマトグラフィ分析を行って、Ｃ末端を同定し
たところ、Ｃ末端はカルボン酸タイプであることが明ら
かとなった。 カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ（東ソー社製）、ＯＤＳ−８０
ＴＭ(250×4.6 mm I.D.) 移動相：Ａ；10 mM NaOAc (pH 4.0)/MeCN(95/5) Ｂ；10 mM NaOAc (pH 4.0)/MeCN(30/70) 勾配：Ａ／Ｂ；１００／０→０／１００（７０分） 流速：１．０ｍｌ／分 カラム温度：４０℃ 検出器：励起波長；３５０ｎｍ、蛍光波長；５３０ｎｍ また、分取したＰ−９のペプチド画分を還元カルボキシ
メチル化をせず、そのままトリプシン処理し、その高速
液体クロマトグラフィ分取フラグメントをアミノ酸配列
分析した。その結果、２つのシステイン残基はジスルフ
ィド結合によりつながっていることが判明した。[Chemical 5] As for the C-terminal, it was found as a result of preliminary examination that lysyl cysteine was produced by trypsin treatment, and therefore, formic acid-oxidized P-9 was treated with trypsin. Since the C-terminal lysyl cysteic acid is a short peptide fragment and has high polarity, it is considered impossible to fractionate by reversed-phase high-performance liquid chromatography. Then, in 20 μl of 0.25 M sodium hydrogen carbonate solution (pH 8.0), dansyl chloride (6 mg) was added.
(/ Ml) Acetone solution (20 μl) was added and reacted at 20 ° C. for 24 hours to perform dansylation. When the C-terminal was identified by performing reverse phase high performance liquid chromatography analysis under the following conditions, it was revealed that the C-terminal was a carboxylic acid type. Column: TSK-GEL (manufactured by Tosoh Corporation), ODS-80
TM (250 × 4.6 mm ID) Mobile phase: A; 10 mM NaOAc (pH 4.0) / MeCN (95/5) B; 10 mM NaOAc (pH 4.0) / MeCN (30/70) Gradient: A / B; 100 / 0 → 0/100 (70 minutes) Flow rate: 1.0 ml / minute Column temperature: 40 ° C. Detector: excitation wavelength; 350 nm, fluorescence wavelength; 530 nm Further, the fractionated peptide fraction of P-9 is reduced carboxymethyl. It was treated with trypsin without modification, and the high performance liquid chromatography preparative fragment was subjected to amino acid sequence analysis. As a result, it was revealed that the two cysteine residues are linked by a disulfide bond.

【００２２】このペプチドを、以下に示した合成品と逆
相高速液体クロマトグラフィを用いて比較したところ、
溶出時間が一致した。 ２．Ｐ−６の構造解析 まず、Ｐ−９と同様の方法でアミノ酸組成分析を行うこ
とによりＰ−６画分はシステイン残基を有することが判
明したので、ペプチド２．９ｎｍｏｌに、２−メルカプ
トエタノール１．５μｌ、５Ｍ塩酸グアニジンを２０μ
ｌ加え、３０℃で１４時間反応させたのち、０．０２％
ＨＣｌを５μｌ、１Ｍヨード酢酸（ｐＨ８．０）２０μ
ｌ、２−メルカプトエタノール１．５μｌを順次加え、
Ｐ−６の還元カルボキシメチル化を行った。この一部を
それぞれトリプシン、キモトリプシン等で酵素処理後、
そのフラグメントを高速液体クロマトグラフィで分取
し、各フラグメントについてアミノ酸組成分析、アミノ
酸配列分析を行った。アミノ酸配列分析には、ＡＢＩ４
７７Ａプロテイン・シークエンサーを用いた。アミノ酸
組成分析、アミノ酸配列分析については、表２及び図３
に示した。This peptide was compared with the synthetic product shown below using reverse phase high performance liquid chromatography.
The elution times matched. 2. Structural analysis of P-6 First, it was found that the P-6 fraction had a cysteine residue by performing an amino acid composition analysis in the same manner as in P-9. Therefore, 2.9 nmol of peptide was added to 2-mercaptoethanol. 1.5μl, 5M guanidine hydrochloride 20μ
After adding 1 liter and reacting at 30 ° C for 14 hours, 0.02%
HCl 5 μl, 1M iodoacetic acid (pH 8.0) 20 μl
1, 2-mercaptoethanol (1.5 μl) were sequentially added,
Reductive carboxymethylation of P-6 was performed. After treating part of this with trypsin, chymotrypsin, etc., respectively,
The fragments were separated by high performance liquid chromatography, and amino acid composition analysis and amino acid sequence analysis were performed on each fragment. For amino acid sequence analysis, ABI4
A 77A protein sequencer was used. For amino acid composition analysis and amino acid sequence analysis, see Table 2 and FIG.
It was shown to.

【００２３】[0023]

【表２】 これらを組み合わせて、以下に示す一次構造を決定し
た。[Table 2] These were combined to determine the primary structure shown below.

【００２４】[0024]

【化６】 なお、分取したペプチド、画分をそのままトリプシンで
処理し、アミノ酸配列分析した結果、２つのシステイン
残基はジスルフィド結合によりつながっていることが判
明した。また、ＦＡＢ−ＭＡＳＳによるこのペプチドの
分子量は３２５０であった。[Chemical 6] The separated peptides and fractions were treated with trypsin as they were, and amino acid sequence analysis revealed that the two cysteine residues were linked by a disulfide bond. The molecular weight of this peptide by FAB-MASS was 3250.

【００２５】Ｃ末端については、過蟻酸酸化したＰ−６
をトリプシン処理したところ、スレオニルシステイン酸
が生成したことが判明したので、この反応液を１Ｍ酢酸
で充填したダウエックス５０ＷＸ８約４００μｌに付し
た。１Ｍ酢酸溶出フラクションを自動シーケンサーにか
けたところ、スレオニルシステイン酸が溶出されていた
ため、この画分をマニュアルエドマン分解後、ダンシル
化を行った。そして、Ｐ−９と同様の条件下、逆相高速
液体クロマトグラフィ分析によりＣ末端分析（Ken'ichi
Hagiwara (1991) Biomedical Res. 12, 6:357参照）を
行ったところ、Ｃ末端はカルボン酸タイプであることが
明らかとなった。As for the C-terminal, P-6 oxidized with formate
When it was treated with trypsin, it was found that threonyl cysteic acid was produced. Therefore, this reaction solution was applied to about 400 μl of Dowex 50WX8 filled with 1M acetic acid. When the 1 M acetic acid elution fraction was applied to an automatic sequencer, threonyl cysteic acid was eluted. Therefore, this fraction was subjected to manual Edman degradation and then dansylated. Then, C-terminal analysis (Ken'ichi) by reverse-phase high performance liquid chromatography analysis under the same conditions as P-9.
Hagiwara (1991) Biomedical Res. 12, 6: 357)), it was revealed that the C-terminal was of a carboxylic acid type.

【００２６】また、分取したＰ−６のペプチド画分を還
元カルボキシメチル化をせず、そのままトリプシン処理
し、その高速液体クロマトグラフィ分取フラグメントを
アミノ酸配列分析した。その結果、Ｐ−６もやはり、ジ
スルフィド結合により２つのシステイン残基はつながっ
ていることが判明した。このペプチドを以下に示す合成
品と逆相高速液体クロマトグラフィを用いて比較したと
ころ、溶出時間が一致した。Further, the fractionated P-6 peptide fraction was treated with trypsin as it was without reducing carboxymethylation, and the high performance liquid chromatography fractionation fragment was subjected to amino acid sequence analysis. As a result, it was revealed that also in P-6, the two cysteine residues are linked by a disulfide bond. When this peptide was compared with the synthetic product shown below using reverse phase high performance liquid chromatography, the elution times were the same.

【００２７】ペプチドの合成 １．Ｐ−９の合成 自動合成装置（アプライド・バイオシステム・モデル４
３０Ａ）を用い、固相法によって合成した。Ｃｙｓ（Ａ
ｃｍ）、Ｌｙｓ（ＣｌＺ）及びＴｈｒ（Ｂｚｌ）のよう
な、側鎖が保護されたＢｏｃ−アミノ酸を用い、これら
Ｂｏｃ−アミノ酸誘導体をＨＯＢｔ活性エステル法によ
り、４倍過剰でＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｏレジン
（１．３９ｇ、０．５ｍｍｏｌ）に反応させ、Ｂｏｃ−
Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ＣｌＺ）−Ｖ
ａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙ
ｓ（Ａｃｍ）−Ｌｙｓ（ＣｌＺ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（Ｂ
ｚｌ）−Ｌｙｓ（ＣｌＺ）−Ｌｙｓ（ＣｌＺ）−Ｃｙｓ
（Ａｃｍ）−Ｏレジン（２．９８ｇ、９８．９％）を得
た。Synthesis of peptides 1. Synthesis of P-9 Automatic synthesizer (Applied Biosystems Model 4
30A) and was synthesized by the solid phase method. Cys (A
cm), Lys (ClZ) and Thr (Bzl), and using Boc-amino acids with protected side chains, these Boc-amino acid derivatives were subjected to 4-fold excess Boc-Cys (Acm) by the HOBt active ester method. Boc- was reacted with -O resin (1.39 g, 0.5 mmol).
Phe-Leu-Pro-Val-Leu-Ala-G
ly-Ile-Ala-Ala-Lys (ClZ) -V
al-Val-Pro-Ala-Leu-Phe-Cy
s (Acm) -Lys (ClZ) -Ile-Thr (B
zl) -Lys (ClZ) -Lys (ClZ) -Cys
(Acm) -O resin (2.98 g, 98.9%) was obtained.

【００２８】次いで、保護ペプチドレジン（１．０ｇ、
０．１６６ｍｍｏｌ）を１時間、氷浴中でＨＦ（１８ｍ
ｌ）及びアニソール（２ｍｌ）で処理して、レジン及び
システイン（Ｃｙｓ）の保護基であるＡｃｍ以外の保護
基を除去する。ＨＦを留去した後、得られたペプチドを
酢酸溶液で抽出、ろ過する。そして、得られた溶液をセ
ファデックスＧ−１５（６００×３０ｍｍ Ｉ．Ｄ．）
に付し、１Ｍ酢酸溶液で溶出し、逆相中圧カラムクロマ
トグラフィにより精製する。カラムはＹＭＣ−ゲルＯＤ
Ｓ−ＡＭ１２０−Ｓ５０（５００×２０ｍｍＩ．Ｄ．）
を用い、流速１２ｍｌ／分で、０．１％トリフルオロ酢
酸を含む２０％アセトニトリルから、０．１％トリフル
オロ酢酸を含む６０％アセトニトリル水溶液への直線濃
度勾配法（３時間）により溶出、精製した。精製された
分画を集め、凍結乾燥してＰ−９〔Ｃｙｓ（Ａｃｍ）〕
₂ （７４ｍｇ、１６．７％）を得た。Then, the protected peptide resin (1.0 g,
0.166 mmol) for 1 hour in an ice bath with HF (18 m
1) and anisole (2 ml) to remove protecting groups other than Acm, which is a protecting group for resin and cysteine (Cys). After distilling off HF, the obtained peptide is extracted with an acetic acid solution and filtered. And the obtained solution is Sephadex G-15 (600x30mm ID).
Then, elute with 1 M acetic acid solution and purify by reverse phase medium pressure column chromatography. Column is YMC-gel OD
S-AM120-S50 (500 × 20 mm ID)
Elution and purification by linear gradient method (3 hours) from 20% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid to 60% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% trifluoroacetic acid at a flow rate of 12 ml / min. did. The purified fractions were collected, freeze-dried and then P-9 [Cys (Acm)].
₂ (74 mg, 16.7%) was obtained.

【００２９】さらに、Ｐ−９〔Ｃｙｓ（Ａｃｍ）〕
₂ （５６ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）を８０％メタノー
ル１００ｍｌに溶解し、それに０．１Ｍ沃素のメタノー
ル溶液３．１ｍｌ（１５モル当量）を室温で加える。１
０時間攪拌した後、その溶液を１０ｍｌに濃縮し、セフ
ァデックスＧ−１５に付し、１Ｍ酢酸溶液で溶出する。
そして、逆相中圧カラムクロマトグラフィにより精製す
る。カラムはＹＭＣ−ゲルＯＤＳ−ＡＭ１２０−Ｓ５０
（５００×２０ｍｍＩ．Ｄ．）を用い、流速１２ｍｌ／
分で、０．１％トリフルオロ酢酸を含む３５％アセトニ
トリルから、０．１％トリフルオロ酢酸を含む６５％ア
セトニトリル水溶液への直線濃度勾配法（３時間）によ
り溶出、精製する。精製された分画を集め、凍結乾燥し
て、ペプチドを得た（２６ｍｇ、４８．９％）。Further, P-9 [Cys (Acm)]
₂ (56 mg, 0.021 mmol) is dissolved in 100 ml of 80% methanol and 3.1 ml of 0.1 M iodine solution in methanol (15 molar equivalents) is added at room temperature. 1
After stirring for 0 hours, the solution is concentrated to 10 ml, applied to Sephadex G-15 and eluted with 1M acetic acid solution.
Then, it is purified by reverse phase medium pressure column chromatography. The column is YMC-gel ODS-AM120-S50.
(500 × 20 mm ID) with a flow rate of 12 ml /
In minutes, elution and purification are performed by a linear concentration gradient method (3 hours) from 35% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid to 65% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% trifluoroacetic acid. The purified fractions were collected and lyophilized to give the peptide (26 mg, 48.9%).

【００３０】そして、得られたペプチドの同一性を、逆
相高速液体クロマトグラフィで確認した。その際、カラ
ムはＹＭＣ−パックＯＤＳ−ＡＭ（２５０×４．６ｍｍ
Ｉ．Ｄ．）を用い、流速１．０ｍｌ／分で、０．１％ト
リフルオロ酢酸を含む３５％アセトニトリルから、０．
１％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリル水溶
液への直線濃度勾配法（３０分）により行った。検出は
２１５ｎｍで行った。ＦＡＢ−ＭＡＳＳ〔Ｍ＋Ｈ〕によ
る分子量は２５２９．９であった。また、その際の計算
値はＣ₁₂₁ Ｈ₂₀₂ Ｎ₂₈Ｏ₂₆Ｓ₂ （２５２９．３）であっ
た。従って、上記により得られたペプチドは以下に示す
ブレビニン−１であることが確認された。Then, the identity of the obtained peptide was confirmed by reverse phase high performance liquid chromatography. At that time, the column was YMC-pack ODS-AM (250 × 4.6 mm
I. D. ) From 35% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid at a flow rate of 1.0 ml / min.
It was carried out by a linear concentration gradient method (30 minutes) into an 80% acetonitrile aqueous solution containing 1% trifluoroacetic acid. Detection was at 215 nm. The molecular weight by FAB-MASS [M + H] was 2529.9. The calculated value at that time was C ₁₂₁ H ₂₀₂ N ₂₈ O ₂₆ S ₂ (2529.3). Therefore, it was confirmed that the peptide obtained above was Brevinin-1 shown below.

【００３１】[0031]

【化７】 ２．Ｐ−６の合成 上記と同様の自動合成装置を用い、同様の方法によって
合成した。Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ｃｙｓ（Ａｃｍ）、
Ｌｙｓ（ＣｌＺ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）及びＴｈｒ（Ｂｚ
ｌ）のような、側鎖が保護されたＢｏｃ−アミノ酸を用
い、これらＢｏｃ−アミノ酸誘導体を上記と同様の方法
によりＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｏレジン（０．７３
ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）に反応させ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−Ｓｅｒ（Ｂｚ
ｌ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ＣｌＺ）−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｙｓ（ＣｌＺ）−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｓ
ｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−
Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ａｌａ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｃｙｓ
（Ａｃｍ）−Ｌｙｓ（ＣｌＺ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙ
ｓ（ＣｌＺ）−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−
Ｏレジン（１．６９ｇ、９０．１％）を得た。[Chemical 7] 2. Synthesis of P-6 Using the same automatic synthesizer as described above, synthesis was carried out by the same method. Asp (OcHex), Cys (Acm),
Lys (ClZ), Ser (Bzl) and Thr (Bz
1), a Boc-amino acid with a protected side chain is used, and these Boc-amino acid derivatives are treated in the same manner as described above with Boc-Cys (Acm) -O resin (0.73).
g, 0.25 mmol) and reacted with Boc-Gly-
Leu-Leu-Asp (OcHex) -Ser (Bz
l) -Leu-Lys (ClZ) -Gly-Phe-A
la-Ala-Thr (Bzl) -Ala-Gly-L
ys (ClZ) -Gly-Val-Leu-Gln-S
er (Bzl) -Leu-Leu-Ser (Bzl)-
Thr (Bzl) -Ala-Ser (Bzl) -Cys
(Acm) -Lys (ClZ) -Leu-Ala-Ly
s (ClZ) -Thr (Bzl) -Cys (Acm)-
O resin (1.69 g, 90.1%) was obtained.

【００３２】次いで、保護ペプチドレジン（１．０ｇ、
０．１３３ｍｍｏｌ）を１時間、氷浴中でＨＦ（１８ｍ
ｌ）及びアニソール（２ｍｌ）で処理して、レジン及び
システイン（Ｃｙｓ）の保護基であるＡｃｍ以外の保護
基を除去する。ＨＦを留去した後、得られたペプチドを
酢酸溶液で抽出、ろ過する。そして、得られた溶液をセ
ファデックスＧ−１５（６００×３０ｍｍ Ｉ．Ｄ．）
に付し、１Ｍ酢酸溶液で溶出し、逆相中圧カラムクロマ
トグラフィにより精製する。カラムはＹＭＣ−ゲルＯＤ
Ｓ−ＡＭ１２０−Ｓ５０（５００×２０ｍｍＩ．Ｄ．）
を用い、流速１２ｍｌ／分で、０．１％トリフルオロ酢
酸を含む３０％アセトニトリルから、０．１％トリフル
オロ酢酸を含む６０％アセトニトリル水溶液への直線濃
度勾配法（３時間）により溶出、精製した。精製された
分画を集め、凍結乾燥してＰ−６〔Ｃｙｓ（Ａｃｍ）〕
₂ （９８ｍｇ、２１．７％）を得た。Then, the protected peptide resin (1.0 g,
0.133 mmol) for 1 hour in an ice bath with HF (18 m
1) and anisole (2 ml) to remove protecting groups other than Acm, which is a protecting group for resin and cysteine (Cys). After distilling off HF, the obtained peptide is extracted with an acetic acid solution and filtered. And the obtained solution is Sephadex G-15 (600x30mm ID).
Then, elute with 1 M acetic acid solution and purify by reverse phase medium pressure column chromatography. Column is YMC-gel OD
S-AM120-S50 (500 × 20 mm ID)
By using a linear concentration gradient method (3 hours) from 30% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid to 60% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% trifluoroacetic acid at a flow rate of 12 ml / min. did. The purified fractions were collected, freeze-dried and then P-6 [Cys (Acm)].
₂ (98 mg, 21.7%) was obtained.

【００３３】さらに、Ｐ−６〔Ｃｙｓ（Ａｃｍ）〕
₂ （９８ｍｇ、０．０２８８ｍｍｏｌ）を８０％メタノ
ール１５０ｍｌに溶解し、それに０．１Ｍ沃素のメタノ
ール溶液４．３ｍｌ（１５モル当量）を室温で加える。
３時間攪拌した後、その溶液を１０ｍｌに濃縮し、セフ
ァデックスＧ−１５に付し、１Ｍ酢酸溶液で溶出する。
そして、逆相中圧カラムクロマトグラフィにより精製す
る。カラムはＹＭＣ−ゲルＯＤＳ−ＡＭ１２０−Ｓ５０
（５００×２０ｍｍＩ．Ｄ．）を用い、流速１２ｍｌ／
分で、０．１％トリフルオロ酢酸を含む３５％アセトニ
トリルから、０．１％トリフルオロ酢酸を含む５０％ア
セトニトリル水溶液への直線濃度勾配法（３時間）によ
り溶出、精製する。さらに、上記と同様の条件で、０．
１％トリフルオロ酢酸を含む３５％アセトニトリルか
ら、０．１％トリフルオロ酢酸を含む４５％アセトニト
リルへの直線濃度勾配法（３時間）により再精製する。
精製された分画を集め、凍結乾燥して、ペプチドを得た
（１３．５ｍｇ、１４．４％）。Further, P-6 [Cys (Acm)]
₂ (98 mg, 0.0288 mmol) is dissolved in 150 ml of 80% methanol and 4.3 ml (15 molar equivalents) of 0.1 M iodine solution in methanol is added thereto at room temperature.
After stirring for 3 hours, the solution is concentrated to 10 ml, applied to Sephadex G-15 and eluted with 1M acetic acid solution.
Then, it is purified by reverse phase medium pressure column chromatography. The column is YMC-gel ODS-AM120-S50.
(500 × 20 mm ID) with a flow rate of 12 ml /
In minutes, elution and purification are performed by a linear concentration gradient method (3 hours) from 35% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid to 50% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% trifluoroacetic acid. Furthermore, under the same conditions as above, 0.
Repurify by linear gradient method (3 hours) from 35% acetonitrile containing 1% trifluoroacetic acid to 45% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid.
The purified fractions were collected and lyophilized to give the peptide (13.5 mg, 14.4%).

【００３４】そして、得られたＰ−６の同一性を、逆相
高速液体クロマトグラフィで確認した。その際、カラム
はＹＭＣ−パックＯＤＳ−ＡＭ（２５０×４．６ｍｍ
Ｉ．Ｄ．）を用い、流速１．０ｍｌ／分で、０．１％ト
リフルオロ酢酸を含む３５％アセトニトリルから、０．
１％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリルへの
直線濃度勾配法（３０分）により行った。検出は２１５
ｎｍで行った。ＦＡＢ−ＭＡＳＳ〔Ｍ＋Ｈ〕による分子
量は３２５１．８であった。また、その際の計算値はＣ
₁₄₂ Ｈ₂₄₄ Ｎ₃₈Ｏ₄₄Ｓ₂ （３２５１．８）であった。従
って、上記により得られたペプチドは以下に示すブレビ
ニン−２であることが確認された。The identity of the obtained P-6 was confirmed by reverse phase high performance liquid chromatography. At that time, the column was YMC-pack ODS-AM (250 × 4.6 mm
I. D. ) From 35% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid at a flow rate of 1.0 ml / min.
It was performed by a linear gradient method (30 minutes) to 80% acetonitrile containing 1% trifluoroacetic acid. Detection is 215
nm. The molecular weight by FAB-MASS [M + H] was 3251.8. The calculated value at that time is C
_{It was 142} H ₂₄₄ N ₃₈ O ₄₄ S ₂ (3251.8). Therefore, it was confirmed that the peptide obtained above was Brevinin-2 shown below.

【００３５】[0035]

【化８】 生物活性 １．抗菌活性 Ｐ−６、Ｐ−９の抗菌活性を寒天培地を用いたパルプア
ッセイ法により検討した。抗菌プレートの培地にはＬＢ
（１％トリプトン、０．５％イーストエキス、０．５％
塩化ナトリウム、１．５％寒天）を用い、バクテリア
は、グラム陽性菌としてスタフィロコッカス・アウレウ
ス（Staphylococcus aureus 209P JC-1 ）及びバチルス
・サブチリス（Bacillus subtilis ATCC 6633 ）、グラ
ム陰性菌としてエスチェリチア・コリ（Escherichia co
li NIHJ JC-2）を用いた。その結果を表３に示す。[Chemical 8] Biological activity 1. Antibacterial activity The antibacterial activities of P-6 and P-9 were examined by a pulp assay method using an agar medium. LB is used as the antibacterial plate medium
(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5%
Sodium chloride, 1.5% agar) was used, and bacteria were Staphylococcus aureus 209P JC-1 and Bacillus subtilis ATCC 6633 as Gram-positive bacteria, and Escherichia coli as Gram-negative bacteria. ( Escherichia co
li NIHJ JC-2) was used. The results are shown in Table 3.

【００３６】[0036]

【表３】 Ｐ−９については、グラム陰性菌に対してあまり強い活
性を示さないのに対し、グラム陽性菌に対しては１０μ
ｇ／ｍｌ以下という強い活性を示した。一方、Ｐ−６に
ついてはグラム陽性菌、グラム陰性菌両方に対し、比較
的強い活性を示した。 ２．マスト細胞からヒスタミンの放出活性 １０週齢ウィスター系ラット（３００〜３５０ｇ）の腹
腔内マスト細胞を用いて、ヒスタミンの放出活性を調べ
た。対照薬剤として、ハチ毒から単離されたマストパラ
ン（Y. Hirai, T. Yasuhara, H. Yoshida, T. Nakajim
a, M. Fujino and C. Katada (1979) Chem. Pharm. Bul
l. 27: 1942）を用いた。[Table 3] P-9 does not show a very strong activity against Gram-negative bacteria, whereas it has 10 μm against Gram-positive bacteria.
It showed a strong activity of g / ml or less. On the other hand, P-6 showed a relatively strong activity against both Gram-positive and Gram-negative bacteria. 2. Histamine-releasing activity from mast cells Histamine-releasing activity was examined using intraperitoneal mast cells of 10-week-old Wistar rats (300 to 350 g). Mastoparan (Y. Hirai, T. Yasuhara, H. Yoshida, T. Nakajim isolated from bee venom as a control drug)
a, M. Fujino and C. Katada (1979) Chem. Pharm. Bul
l. 27: 1942).

【００３７】（１）ＭＣＭ (Mast Cell Medium) の調製 150mM NaCl 、3.7mM KCl、3.0mM Na₂HPO₄、3.5mM K
H₂PO₄ 、0.9mM CaCl₂にグルコース0.1%及びBSA 0.2%
を加え、調製した。 （２）ヒスタミン定量用緩衝液（ＨＰＬＣ）（Ｂ、Ｃは
ポストカラムの溶媒）の調製 Ａ： 0.4M クエン酸ナトリウム 0.06M ホウ酸 ＮａＯＨでｐＨ１０．２３とする Ｂ： 0.2M ホウ酸緩衝液（ホウ酸11.2g KOH11.2g/L)
中、 0.1% ＯＰＡ（オルトフタルアルデヒド） 0.2% エタンチオール 0.25% Ｂｒｉｇ３５ Ｃ： 0.75M Ｎａ₂ ＣＯ₃ 0.25M ＮａＨＣＯ₃ （３）ラット腹腔内マスト細胞の調製 １２週齢ウィスター系ラット（約３２０ｇ）をデカピテ
ートし、脱血した後、腹腔内に上記マストセルメデイウ
ム（ＭＣＭ）２０ｍｌを注入する。約３分間マッサージ
した後、腹部を開き、駒込ピペットで腹腔内のマスト細
胞のＭＣＭ懸濁液約１７ｍｌを吸い出し、４℃で１００
０ｒｐｍ、５分間遠心分離する。沈査をさらに、２、３
回、４ｍｌのＭＣＭで洗浄し、活性測定に用いる。血球
計算板〔萱垣製作所：Neubauer型〕を用いて細胞数を数
え、ＭＣＭで５×１０⁵ 個／ｍｌに調製する。(1) Preparation of MCM (Mast Cell Medium) 150 mM NaCl, 3.7 mM KCl, 3.0 mM Na ₂ HPO ₄ , 3.5 mM K
H ₂ PO ₄ , 0.9 mM CaCl ₂ with glucose 0.1% and BSA 0.2%
Was added to prepare. (2) Preparation of histamine quantification buffer (HPLC) (B and C are post-column solvents) A: 0.4M sodium citrate 0.06M borate pH adjusted to 10.23 with NaOH B: 0.2M borate buffer ( (Boric acid 11.2 g KOH 11.2 g / L)
Medium, 0.1% OPA (orthophthalaldehyde) 0.2% ethanethiol 0.25% Brig35 C: 0.75M Na ₂ CO ₃ 0.25M NaHCO ₃ (3) Preparation of rat peritoneal mast cells 12-week-old Wistar rats (about 320 g) After decapitating and removing blood, 20 ml of the above mast cell medium (MCM) is injected into the abdominal cavity. After massaging for about 3 minutes, open the abdomen, and aspirate about 17 ml of MCM suspension of mast cells in the abdominal cavity with a Komagome pipette to 100 at 4 ° C.
Centrifuge at 0 rpm for 5 minutes. Further detention, a few
Wash 4 times with 4 ml of MCM and use for activity measurement. The number of cells is counted using a hemocytometer (Kayagaki Seisakusho: Neubauer type) and adjusted to 5 × 10 ⁵ cells / ml with MCM.

【００３８】（４）検定 マスト細胞調製液２０μｌに、ＭＣＭに溶解したサンプ
ル２０μｌを加え、３７℃で静置する。５分後すぐ水冷
し、室温にて３０００ｒｐｍ５分間遠心し、上清３０μ
Ｌをエッペンドルフチューブにとる。これに５５％トリ
クロル酢酸５μｌを加え、１００００ｒｐｍで５分間遠
心した後、上清中のヒスタミン量を定量する。ヒスタミ
ン定量は、ＯＰＡポストカラム検出法を用いて高速液体
クロマトグラフィにより行う。高速液体クロマトグラフ
ィの条件は以下の通りである。 カラム：ＩＥＸ−２１５（東ソー社製）50×4.6 mm I.
D. 流速：Ａ液：０．７ｍｌ／分、Ｂ・Ｃ液：０．２ｍｌ／
分 カラム温度：８０℃ 検出器：励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４５５ｎｍ 各検体の活性は、マスト細胞を２０μｌの０．１％トリ
トンＸ−１００と、上記のように処理した際のヒスタミ
ン量を１００とし、百分率で表す。また、陽性コントロ
ールとしてコンパウンド４８／８０（シグマ製）１０μ
ｇ／ｍｌ及びマストパラン１０μＭを用いた。その結果
を図４に示す。(4) Assay 20 μl of the sample dissolved in MCM is added to 20 μl of the mast cell preparation solution, and the mixture is allowed to stand at 37 ° C. Immediately after 5 minutes, cool with water, centrifuge at room temperature at 3000 rpm for 5 minutes, and supernatant 30μ
Transfer L to an Eppendorf tube. After adding 5 μl of 55% trichloroacetic acid to this and centrifuging at 10,000 rpm for 5 minutes, the amount of histamine in the supernatant is quantified. Histamine quantification is performed by high performance liquid chromatography using the OPA post column detection method. The conditions of high performance liquid chromatography are as follows. Column: IEX-215 (manufactured by Tosoh Corporation) 50 × 4.6 mm I.
D. Flow rate: Solution A: 0.7 ml / min, Solution B / C: 0.2 ml /
Min Column temperature: 80 ° C. Detector: Excitation wavelength 340 nm, fluorescence wavelength 455 nm The activity of each sample is 20 μl of 0.1% Triton X-100, and the amount of histamine when treated as described above is 100. , Expressed as a percentage. As a positive control, compound 48/80 (made by Sigma) 10μ
g / ml and mastoparan 10 μM were used. The result is shown in FIG.

【００３９】図４より明らかなように、Ｐ−６、Ｐ−９
両ペプチドともマストパランと同程度か、やや劣る程度
のヒスタミン放出活性を持つことがわかった。As is apparent from FIG. 4, P-6 and P-9
Both peptides were found to have histamine-releasing activity that was similar to or slightly inferior to that of mastoparan.

【００４０】[0040]

【発明の効果】この発明のペプチドは、これまでにカエ
ルの皮膚から単離された抗菌性ペプチド、ボンビニンや
マガイニンとは全く異なる一次構造を持つものであり、
ブレビニン−１については、特にグラム陽性菌に対し
て、ブレビニン−２についてはグラム陽性菌、グラム陰
性菌両方に対し、比較的強い活性を示した。The peptide of the present invention has a completely different primary structure from the antibacterial peptides, bombinin and magainin, which have been isolated from frog skin.
Brevinin-1 showed a relatively strong activity, especially against Gram-positive bacteria, and Brevinin-2 showed a relatively strong activity against both Gram-positive and Gram-negative bacteria.

【００４１】また、ブレビニン−１及びブレビニン−２
はいづれも、かなり強いヒスタミン放出活性を示した。Brevinin-1 and brevinin-2
Each of them showed a fairly strong histamine-releasing activity.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明に係わるペプチドを抽出した際のＳＰ−
セファデックスＣ−５０溶出分画の逆相高速液体クロマ
トグラムである。FIG. 1 SP-when a peptide according to the present invention is extracted
It is a reverse phase high performance liquid chromatogram of the Sephadex C-50 elution fraction.

【図２】本発明に係わるペプチドであるブレビニン−１
のアミノ酸配列を示す図である。FIG. 2 Brebinin-1 which is a peptide according to the present invention
It is a figure which shows the amino acid sequence of.

【図３】本発明に係わるペプチドであるブレビニン−２
のアミノ酸配列を示す図である。FIG. 3: Brebinin-2, a peptide according to the present invention
It is a figure which shows the amino acid sequence of.

【図４】本発明に係わるペプチドのマスト細胞からのヒ
スタミン放出活性を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing the histamine-releasing activity of peptides of the present invention from mast cells.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 式 【化１】 及び 【化２】 で表されるペプチド。1. The formula: And The peptide represented by.