JPH0670630B2 - 分析法 - Google Patents
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- JPH0670630B2 JPH0670630B2 JP60007298A JP729885A JPH0670630B2 JP H0670630 B2 JPH0670630 B2 JP H0670630B2 JP 60007298 A JP60007298 A JP 60007298A JP 729885 A JP729885 A JP 729885A JP H0670630 B2 JPH0670630 B2 JP H0670630B2
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- particles
- reagent
- magnetically attractable
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- assay
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
- G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
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- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は液体相および固体相の間でのラベル付き試薬の
分配を含む方法によつて液体媒体中のアナライト（anal
yte）を分析する種類の分析に関する。典型的には、分
析試薬は粒状または例えば分析管上の被覆の如く一体化
された形でありうる固体相試薬、および始め液体相中の
ラベル付き試薬を含む。この種の分析は非常に良く知ら
れており、免疫検定法（immunoassay）および免疫定量
分析法（immunometric assay）を含む。
分配を含む方法によつて液体媒体中のアナライト（anal
yte）を分析する種類の分析に関する。典型的には、分
析試薬は粒状または例えば分析管上の被覆の如く一体化
された形でありうる固体相試薬、および始め液体相中の
ラベル付き試薬を含む。この種の分析は非常に良く知ら
れており、免疫検定法（immunoassay）および免疫定量
分析法（immunometric assay）を含む。
大部分の分析においては、試薬の温置後固体相を液体相
から分離し、固体相または液体相の何れかのラベルの量
の測定をしている。粒状固体を使用するとき、２相の分
離は一般に沈降（遅い）により、または遠心分離（かな
り迅速であるが自動化することが困難である）によつて
行なわれている。最近液体相中に懸濁しうるが不溶性で
ある磁気的に吸引しうる粒子を試薬キヤリヤーとして使
用されている；これらは、磁石を使用することによりそ
して遠心分離の必要なしにそれらを液体相から分離でき
る利点を有する。
から分離し、固体相または液体相の何れかのラベルの量
の測定をしている。粒状固体を使用するとき、２相の分
離は一般に沈降（遅い）により、または遠心分離（かな
り迅速であるが自動化することが困難である）によつて
行なわれている。最近液体相中に懸濁しうるが不溶性で
ある磁気的に吸引しうる粒子を試薬キヤリヤーとして使
用されている；これらは、磁石を使用することによりそ
して遠心分離の必要なしにそれらを液体相から分離でき
る利点を有する。
ヨーロツパ特許第30086A号明細書には磁気的に吸引しう
る粒子を利用する分析において使用するための試料管集
合体が記載されている、これは平面支持部材中に装着さ
れた複数の試験管を含み、平面基板部材料が磁石を有
し、磁石が管中の磁気的に吸引しうる粒子を引きつけか
つ保持するような方法で支持部材が基板部材に取りはず
ししうるようにとりつけできるようにしてある。集合体
は管内に磁気的に吸引しうる粒子を保有している間に管
から液体を傾瀉するため転倒できるようにしてある。
る粒子を利用する分析において使用するための試料管集
合体が記載されている、これは平面支持部材中に装着さ
れた複数の試験管を含み、平面基板部材料が磁石を有
し、磁石が管中の磁気的に吸引しうる粒子を引きつけか
つ保持するような方法で支持部材が基板部材に取りはず
ししうるようにとりつけできるようにしてある。集合体
は管内に磁気的に吸引しうる粒子を保有している間に管
から液体を傾瀉するため転倒できるようにしてある。
一つの具体例において、分析は懸濁しうる磁気的に吸引
しうる粒子に結合した別の試薬および始め液体中の放射
能的にラベル付けした試薬の使用を含む。試薬は、支持
部材中の試験管中にアナライトを含有する試料と共に温
置される。これを次いで基板部材に結合させて粒子を沈
降させるようにする。集合体は上層液体を除くため転倒
させる。管中の粒子を洗浄し、再び上層液を除去する。
最後に支持部材中の試験管を多頭カウンター中に挿入し
て各管中の放射能を測定する。
しうる粒子に結合した別の試薬および始め液体中の放射
能的にラベル付けした試薬の使用を含む。試薬は、支持
部材中の試験管中にアナライトを含有する試料と共に温
置される。これを次いで基板部材に結合させて粒子を沈
降させるようにする。集合体は上層液体を除くため転倒
させる。管中の粒子を洗浄し、再び上層液を除去する。
最後に支持部材中の試験管を多頭カウンター中に挿入し
て各管中の放射能を測定する。
この例は多くの方法において便利なものであるが、放射
能的にラベル付けした試薬を使用する欠点を悩まされて
いる。放射能を取り扱うことは、別の分析を行なわなけ
ればならぬ研究室では常に容易に入手できない特別の装
置と特別の注意を必要とする。また放射能の多頭カウン
ターはかなり大きく、近くの計数ウエルからの放射線か
ら各カウンターヘツドを遮へいする必要があるため装置
の厄介な問題がある。
能的にラベル付けした試薬を使用する欠点を悩まされて
いる。放射能を取り扱うことは、別の分析を行なわなけ
ればならぬ研究室では常に容易に入手できない特別の装
置と特別の注意を必要とする。また放射能の多頭カウン
ターはかなり大きく、近くの計数ウエルからの放射線か
ら各カウンターヘツドを遮へいする必要があるため装置
の厄介な問題がある。
ヨーロツパ特許明細書では非放射性の光学的例えば螢光
ラベルの使用を意図している。しかしこの中に記載され
ている唯一の方法は、磁気粒子を沈澱させ、次いで形成
される上層液体中の光学的性質例えば螢光を観測するこ
とを含む。かかる観測は、沈澱を観測からスクリーニン
グするため、分析容器の側面から必ずする必要がある。
このための多頭装置は普通に入手できるものでなく、何
れの場合においても高価であり厄介なものである。光学
ラベルを使用する実際的な分析法は記載されていない。
ラベルの使用を意図している。しかしこの中に記載され
ている唯一の方法は、磁気粒子を沈澱させ、次いで形成
される上層液体中の光学的性質例えば螢光を観測するこ
とを含む。かかる観測は、沈澱を観測からスクリーニン
グするため、分析容器の側面から必ずする必要がある。
このための多頭装置は普通に入手できるものでなく、何
れの場合においても高価であり厄介なものである。光学
ラベルを使用する実際的な分析法は記載されていない。
本発明は螢光または発光信号を放出または発生すること
ができる結合したラベル付き試薬を担持する磁気的に吸
引しうる粒子を液体媒体中に再懸濁されたとき、懸濁液
中のラベル付き試薬によつて発せられる信号を観測でき
ることを見出したことにある。更に信号の強さはラベル
付き試薬の濃度に明確な関係を有する。この発見は、磁
気的に吸引しうる粒子が例えばポリアクリルアミドの従
来の固体粒子と異なり、必ず不透明であることから驚く
べきことである。不透明粒子の結果として観測しうる信
号が懸濁液中のラベル付けされた試薬によつて発生され
ないか殆んど発生されないと期待するのが当然であつ
た。
ができる結合したラベル付き試薬を担持する磁気的に吸
引しうる粒子を液体媒体中に再懸濁されたとき、懸濁液
中のラベル付き試薬によつて発せられる信号を観測でき
ることを見出したことにある。更に信号の強さはラベル
付き試薬の濃度に明確な関係を有する。この発見は、磁
気的に吸引しうる粒子が例えばポリアクリルアミドの従
来の固体粒子と異なり、必ず不透明であることから驚く
べきことである。不透明粒子の結果として観測しうる信
号が懸濁液中のラベル付けされた試薬によつて発生され
ないか殆んど発生されないと期待するのが当然であつ
た。
この驚くべき発見は重要な実際的結果を有する。それは
螢光または発光信号を含む分析を行なうための分析容器
の固定配列を使用できるようにする。信号は上または下
から観測でき、放射線遮へいを必要とせず、従つて分析
容器は非常に小さくすることができ、非常に近接して一
緒に置くことができる。事実微小滴定板を使用できる。
螢光または発光信号を含む分析を行なうための分析容器
の固定配列を使用できるようにする。信号は上または下
から観測でき、放射線遮へいを必要とせず、従つて分析
容器は非常に小さくすることができ、非常に近接して一
緒に置くことができる。事実微小滴定板を使用できる。
本発明に従えば、（ｉ）相互に固定関係にある個々の分
析容器又は分析容器の配列、 （ii）液体媒体に可溶性である分析用ラベル付き試薬、 （iii）液体媒体中に懸濁できるが不溶性である磁気的
に吸引しうる粒子に結合した分析用の別の試薬 の使用を含む液体媒体中のアナライトの分析を行う方法
において、 （ａ）分析容器中で、前記ラベル付き試薬及び前記磁気
的に吸引し得る粒子に結合した試薬とアナライトを含有
する試料とを温置し、これによって蛍光又は発光系の成
分である或る量のラベル付き試薬が、試料中のアナライ
トの濃度によって決まる割合で、磁気的に吸引しうる粒
子に結合するようにし、 （ｂ）前記磁気的に吸引しうる粒子から液体相を分離
し、そして分析容器からこの液体相を除去し、 （ｃ）前記磁気的に吸引しうる粒子を別の液体媒体中に
再懸濁し、その粒子上のラベル付き試薬によって発生さ
れる信号を測定する ことを特徴とする方法が提供される。
析容器又は分析容器の配列、 （ii）液体媒体に可溶性である分析用ラベル付き試薬、 （iii）液体媒体中に懸濁できるが不溶性である磁気的
に吸引しうる粒子に結合した分析用の別の試薬 の使用を含む液体媒体中のアナライトの分析を行う方法
において、 （ａ）分析容器中で、前記ラベル付き試薬及び前記磁気
的に吸引し得る粒子に結合した試薬とアナライトを含有
する試料とを温置し、これによって蛍光又は発光系の成
分である或る量のラベル付き試薬が、試料中のアナライ
トの濃度によって決まる割合で、磁気的に吸引しうる粒
子に結合するようにし、 （ｂ）前記磁気的に吸引しうる粒子から液体相を分離
し、そして分析容器からこの液体相を除去し、 （ｃ）前記磁気的に吸引しうる粒子を別の液体媒体中に
再懸濁し、その粒子上のラベル付き試薬によって発生さ
れる信号を測定する ことを特徴とする方法が提供される。
本発明方法は相互に固定関係にある分析容器の配列を使
用するのが好ましい。かかる配列の使用は取り扱いの容
易なことと速度の実際的利点を有し、これは多数の繰返
し作業を行なわなければならない場合重要である。個々
の分析容器の取り扱いはなくする。異なる試薬の自動分
配は容易にする。容器を個々に取り扱うとき避けられな
い分析容器間の混同が避けられる。
用するのが好ましい。かかる配列の使用は取り扱いの容
易なことと速度の実際的利点を有し、これは多数の繰返
し作業を行なわなければならない場合重要である。個々
の分析容器の取り扱いはなくする。異なる試薬の自動分
配は容易にする。容器を個々に取り扱うとき避けられな
い分析容器間の混同が避けられる。
分析容器の配列は規則的に列および欄の形で配置した個
々の分析容器で平面にするのが好ましい。前述した如
く、微小滴定板を有利に使用できる。市場で入手しうる
微小滴定板は、12個の８列で配置した各約0.3ml容の96
個のウエルを含有する射出成形したプラスチツクのもの
である。透明および不透明（白または黒）の両方の板を
利用できる。
々の分析容器で平面にするのが好ましい。前述した如
く、微小滴定板を有利に使用できる。市場で入手しうる
微小滴定板は、12個の８列で配置した各約0.3ml容の96
個のウエルを含有する射出成形したプラスチツクのもの
である。透明および不透明（白または黒）の両方の板を
利用できる。
微滴定板は微生物学的に広く使用されており、本発明が
関係する種類の分析を行なうためには少ししか使用され
ていない。しかしかかる使用は液体相から固体試薬を分
離する問題によつて限定されていた。固体相試薬でウエ
ルの側面を被覆することは原理的には可能であるが、各
ウエル中に固体相試薬の同じ量を導入することが実際上
困難なことが証明された、そして正確な分析のため、各
管中の各試薬の量は正確に同じであることが必要であ
る。克服されなかつたこの困難は、板を作るため使用さ
れる成形技術から生じ、幾つかのウエルは他よりも試薬
に対し本来より受入れ易い。
関係する種類の分析を行なうためには少ししか使用され
ていない。しかしかかる使用は液体相から固体試薬を分
離する問題によつて限定されていた。固体相試薬でウエ
ルの側面を被覆することは原理的には可能であるが、各
ウエル中に固体相試薬の同じ量を導入することが実際上
困難なことが証明された、そして正確な分析のため、各
管中の各試薬の量は正確に同じであることが必要であ
る。克服されなかつたこの困難は、板を作るため使用さ
れる成形技術から生じ、幾つかのウエルは他よりも試薬
に対し本来より受入れ易い。
粒状固体相試薬を使用すると、このと二つの問題が生ず
る。遠心分離する微小定量板は不便である。また固体材
料のペレツトは、懸濁液外に粒状試薬をもたらすことを
生ぜしめ、ペレツトから発生した光学信号の有用な測定
をすることが困難である。本発明は、信号を観測する前
液体中に再懸濁される磁気的に吸引しうる粒子を使用す
ることにより、これらの問題を全て克服し、免疫分析の
ための微小定量板の広い使用を可能にする。
る。遠心分離する微小定量板は不便である。また固体材
料のペレツトは、懸濁液外に粒状試薬をもたらすことを
生ぜしめ、ペレツトから発生した光学信号の有用な測定
をすることが困難である。本発明は、信号を観測する前
液体中に再懸濁される磁気的に吸引しうる粒子を使用す
ることにより、これらの問題を全て克服し、免疫分析の
ための微小定量板の広い使用を可能にする。
本発明方法は、始め液体相中にあるが、液体および固体
相間で分配されるようになるラベル付き試薬の使用を含
む。ラベルの種類に厳密な規制はないが、この方法は特
に螢光および発光系に良く適している。従つてラベルは
適当に処理したとき螢光または発光信号を生ずる群が好
ましい。螢光および発光系は当業者に良く知られてお
り、それ自体は本発明の一部を形成しない。一つの既知
の化学発光系はルミノール型基質を用いるペルオキシダ
ーゼ酵素を含む。一つの既知の螢光系はメチルウンベリ
フエロンホスフエート基質を用いるアルカリ性ホスフア
ターゼ酵素を含む。信号系が数種の成分から作られると
き、成分の何れか一つがラベル付き試薬のラベルを構成
するとよいことが判るであろう。
相間で分配されるようになるラベル付き試薬の使用を含
む。ラベルの種類に厳密な規制はないが、この方法は特
に螢光および発光系に良く適している。従つてラベルは
適当に処理したとき螢光または発光信号を生ずる群が好
ましい。螢光および発光系は当業者に良く知られてお
り、それ自体は本発明の一部を形成しない。一つの既知
の化学発光系はルミノール型基質を用いるペルオキシダ
ーゼ酵素を含む。一つの既知の螢光系はメチルウンベリ
フエロンホスフエート基質を用いるアルカリ性ホスフア
ターゼ酵素を含む。信号系が数種の成分から作られると
き、成分の何れか一つがラベル付き試薬のラベルを構成
するとよいことが判るであろう。
「ラベル付き試薬」なる語は分析試料と温置した後ラベ
ル付けされる試薬を含む。同様に「磁気的に吸引しうる
粒子に結合した試薬」なる語は、分析試料と温置後かく
結合される試薬を含む。この種の分析法は知られてお
り、その幾つかを以下に論ずる。
ル付けされる試薬を含む。同様に「磁気的に吸引しうる
粒子に結合した試薬」なる語は、分析試料と温置後かく
結合される試薬を含む。この種の分析法は知られてお
り、その幾つかを以下に論ずる。
本発明方法で使用する磁気的吸引しうる粒子には幾つか
の要件がある。これらの粒子は、液体相中で始め存在す
る別の試薬を結合できる試薬を担持していなければなら
ない。粒子は少なくとも分析の温置時間だけは、好まし
くは振とうすることなく、液体相中に懸濁できなければ
ならない。この要件は液体相の密度に近似した密度およ
び小さい大きさの粒子を示唆する。一方で粒子は、好ま
しくは液体相から磁石によつて急速かつ容易に分離でき
る程度に磁気的に吸引できるものでなければならない。
この要件は必ずかなり高密度の強磁性材料の高割合を示
唆する。これらの矛盾した要件は合致させることが幾分
困難であることは明らかであるが、1.15〜1.2の比重を
有し、プラスチツクマトリツクス中に埋め込まれた粉末
酸化鉄またはマグネタイトからなるミクロンの大きさの
市場で現在入手しうる粒子がある。
の要件がある。これらの粒子は、液体相中で始め存在す
る別の試薬を結合できる試薬を担持していなければなら
ない。粒子は少なくとも分析の温置時間だけは、好まし
くは振とうすることなく、液体相中に懸濁できなければ
ならない。この要件は液体相の密度に近似した密度およ
び小さい大きさの粒子を示唆する。一方で粒子は、好ま
しくは液体相から磁石によつて急速かつ容易に分離でき
る程度に磁気的に吸引できるものでなければならない。
この要件は必ずかなり高密度の強磁性材料の高割合を示
唆する。これらの矛盾した要件は合致させることが幾分
困難であることは明らかであるが、1.15〜1.2の比重を
有し、プラスチツクマトリツクス中に埋め込まれた粉末
酸化鉄またはマグネタイトからなるミクロンの大きさの
市場で現在入手しうる粒子がある。
使用する磁気的に吸引しうる粒子の正確な種類は本発明
にとつて厳密な規制はない。しかしながら粒子は高濃度
の選択した試薬を担持することが望ましい。粒子上の試
薬濃度が低すぎると、そのときには分的中に粒子に結合
するようになるラベル付き試薬の濃度は必ず低いであろ
う。ラベルによつて発せられる信号の部分が粒子によつ
て必ず不明瞭になるため、発せられる信号の程度はかな
り高いことが必要である。粒子に結合できる試薬の濃度
は、分析において有用信号を発生させることができる程
充分に高いことは驚くべきである。一般的な指標とし
て、磁気的に吸引し得る粒子はその上のラベル付き試薬
によって発生される信号の減衰が90％以下、好ましくは
50％以下である必要がある。
にとつて厳密な規制はない。しかしながら粒子は高濃度
の選択した試薬を担持することが望ましい。粒子上の試
薬濃度が低すぎると、そのときには分的中に粒子に結合
するようになるラベル付き試薬の濃度は必ず低いであろ
う。ラベルによつて発せられる信号の部分が粒子によつ
て必ず不明瞭になるため、発せられる信号の程度はかな
り高いことが必要である。粒子に結合できる試薬の濃度
は、分析において有用信号を発生させることができる程
充分に高いことは驚くべきである。一般的な指標とし
て、磁気的に吸引し得る粒子はその上のラベル付き試薬
によって発生される信号の減衰が90％以下、好ましくは
50％以下である必要がある。
ラベル付き試薬が液体相および固体相の間で分配される
ようなるような種々の分析が文献に記載されている。こ
れらはアナライトおよびアナライトのたの特別の結合剤
の間の反応を含む。代表的なアナライト／特定結合剤組
合せには、抗原／抗体、ハプテン／抗体および抗体／抗
原を含む。本発明が特に適用しうる分析の一群は競争分
析または免疫分析として知られている。この群でラベル
付き試薬は、信号発生基に結合したアナライトまたはそ
の誘導体である。特定結合剤は、分析試料と共に温置す
る前、温置中または温置後磁気的に吸引しうる粒子に結
合する。分析中、分析試料中のアナライトおよびラベル
付きアナライト誘導体は固体相特定結合剤の既知量との
反応に対し競争する。固体相に結合するようになるラベ
ル付きアナライト誘導体の割合は、試料中のアナライト
の濃度の測度である。この分析において、固体相特定結
合剤の量は一つの分析容器から次の分析容器へと一定で
あることが重量であり、キヤリヤーとして磁気的に吸引
しうる粒子はこれを達成するのを容易にする。
ようなるような種々の分析が文献に記載されている。こ
れらはアナライトおよびアナライトのたの特別の結合剤
の間の反応を含む。代表的なアナライト／特定結合剤組
合せには、抗原／抗体、ハプテン／抗体および抗体／抗
原を含む。本発明が特に適用しうる分析の一群は競争分
析または免疫分析として知られている。この群でラベル
付き試薬は、信号発生基に結合したアナライトまたはそ
の誘導体である。特定結合剤は、分析試料と共に温置す
る前、温置中または温置後磁気的に吸引しうる粒子に結
合する。分析中、分析試料中のアナライトおよびラベル
付きアナライト誘導体は固体相特定結合剤の既知量との
反応に対し競争する。固体相に結合するようになるラベ
ル付きアナライト誘導体の割合は、試料中のアナライト
の濃度の測度である。この分析において、固体相特定結
合剤の量は一つの分析容器から次の分析容器へと一定で
あることが重量であり、キヤリヤーとして磁気的に吸引
しうる粒子はこれを達成するのを容易にする。
別の分析、二部位免疫定量分析（2-site immunometric
assay）においては、分析試料は、全体的に固体相中に
あるか、或いは温置中または温置後不溶性化される過剰
の抗体と共に温置する、これによつて試料中のアナライ
トは固体相に結合されるようになる。アナライトに対す
るラベル付き抗体或いは後で抗体に結合するためのラベ
ル付き試薬を加えるアナライトに対する抗体は、液体相
に加え、固体相に（アナライトを介して）結合するよう
になるラベルの量は、分析試料中のアナライトの濃度に
正比例する。
assay）においては、分析試料は、全体的に固体相中に
あるか、或いは温置中または温置後不溶性化される過剰
の抗体と共に温置する、これによつて試料中のアナライ
トは固体相に結合されるようになる。アナライトに対す
るラベル付き抗体或いは後で抗体に結合するためのラベ
ル付き試薬を加えるアナライトに対する抗体は、液体相
に加え、固体相に（アナライトを介して）結合するよう
になるラベルの量は、分析試料中のアナライトの濃度に
正比例する。
アナライトの種類に厳密な規制はない。本発明は、液体
相と固体相の間でラベル付き試薬の分配を含む方法によ
つて分析できる全ての液体相アナライトに関連して使用
する。方法はアナライトに対する通常の分析に従う時
間、全部一緒にしてまたは順次各試薬を温置することを
含む。温置後固体相は懸濁液の外へ沈降させ、上層液体
を除去する。固体相は洗浄してもよく、次いでラベル付
き試薬によつて発せられる信号を観測する前に流体媒体
中に再懸濁する。微小定量板を使用するとき工程の順序
は典型的には次の通りである： A.試料、基準、ラベル付き試薬、固体相試薬を担持する
磁気的に吸引しうる粒子、および任意所望の他の試薬を
板の各ウエルに分配する。
相と固体相の間でラベル付き試薬の分配を含む方法によ
つて分析できる全ての液体相アナライトに関連して使用
する。方法はアナライトに対する通常の分析に従う時
間、全部一緒にしてまたは順次各試薬を温置することを
含む。温置後固体相は懸濁液の外へ沈降させ、上層液体
を除去する。固体相は洗浄してもよく、次いでラベル付
き試薬によつて発せられる信号を観測する前に流体媒体
中に再懸濁する。微小定量板を使用するとき工程の順序
は典型的には次の通りである： A.試料、基準、ラベル付き試薬、固体相試薬を担持する
磁気的に吸引しうる粒子、および任意所望の他の試薬を
板の各ウエルに分配する。
B.ウエル中の反応混合物を温置する時間所望温度で板を
維持する。
維持する。
C.磁気的に吸引しうる粒子が懸濁液の沈降する時間平面
磁石装置上に板を置く。
磁石装置上に板を置く。
D.板／磁石集合体を転倒して上層液体を傾瀉し、または
アスピレーシヨンで液体を除去する。
アスピレーシヨンで液体を除去する。
E.磁石装置を除き、粒子を再懸濁するため洗浄バツフア
ーを加える。
ーを加える。
F.磁石装置を用いて粒子を再沈澱させ、上層液体を除去
する。
する。
G.磁石装置を除き、粒子を再懸濁するため液体を加え
る、液体には信号を発生させるためラベル付き試薬と反
応させるのに要する別の試薬を含有させる。
る、液体には信号を発生させるためラベル付き試薬と反
応させるのに要する別の試薬を含有させる。
H.必要ならば温置後、微小定量板の各ウエル中で発生す
る信号を観測する。
る信号を観測する。
螢光または化学発光を測定するため、各ウエルはその隣
接するものから光学的に遮蔽することが必要である。標
準不透明黒色微小定量板の個々のウエル中の螢光を測定
するための装置は市場で入手できる。使用する化学系に
よつて、化学発光信号は光の短命「フラツシ」としてま
たは実質的に一定の光放出として放出されうる。
接するものから光学的に遮蔽することが必要である。標
準不透明黒色微小定量板の個々のウエル中の螢光を測定
するための装置は市場で入手できる。使用する化学系に
よつて、化学発光信号は光の短命「フラツシ」としてま
たは実質的に一定の光放出として放出されうる。
下記実施例は本発明を説明するものである。
実施例 １ 化学発光を用いる全チロキシンの免疫分析 1.下記試薬を一緒にして37℃で60分間白色微小定量板
（ビリングシヤーストのダイナテク・ラボラトリーズ・
リミテツド）のウエル中で温置した： ヒト血清中のチロキシンの標準溶液25μｌ。
（ビリングシヤーストのダイナテク・ラボラトリーズ・
リミテツド）のウエル中で温置した： ヒト血清中のチロキシンの標準溶液25μｌ。
結合性蛋白質ブロツキング剤を含有するトリスバツフア
ー、pH8.3中のワサビダイコンペルオキシダーゼに結合
したチロキシンの溶液125μｌ。
ー、pH8.3中のワサビダイコンペルオキシダーゼに結合
したチロキシンの溶液125μｌ。
10mMホスフエートバツフアー、pH7.6中のヒツジ抗チロ
キシン血清で被覆した磁化しうるラテツクス粒子の懸濁
液125μｌ（約0.15mgの粒子を含有）。
キシン血清で被覆した磁化しうるラテツクス粒子の懸濁
液125μｌ（約0.15mgの粒子を含有）。
2.温置後、フエライト磁石の配列を含む磁気板上に微小
定量板を置いて磁化しうる粒子を沈降させた。
定量板を置いて磁化しうる粒子を沈降させた。
3.磁気板と微小定量板の間に接触を保ちながら、転倒し
て微小定量板のウエルから上層液体を傾瀉した。
て微小定量板のウエルから上層液体を傾瀉した。
4.各ウエル中の粒子を0.1Mトリスバツフアー、pH8.0の2
00μｌ中に懸濁させて洗浄し、磁気板上で粒子を沈降さ
せ、上層液体を傾瀉した。
00μｌ中に懸濁させて洗浄し、磁気板上で粒子を沈降さ
せ、上層液体を傾瀉した。
5.次いで各ウエル中の粒子を、0.1Mトリスバツフアー、
pH8.0中に25ml／のルミノール、160mg／の過硼酸ナ
トリウムおよび20mg／のヨーロツパ特許第87959A号に
記載された増強剤を含有する、磁化しうる粒子に結合し
たペルオキシダーゼの化学発光検出用試薬200μｌ中に
再懸濁した。
pH8.0中に25ml／のルミノール、160mg／の過硼酸ナ
トリウムおよび20mg／のヨーロツパ特許第87959A号に
記載された増強剤を含有する、磁化しうる粒子に結合し
たペルオキシダーゼの化学発光検出用試薬200μｌ中に
再懸濁した。
6.約１分後、微小定量板を各ウエルから発する光を測定
するための装置中に置いた。
するための装置中に置いた。
実施例 ２ 化学発光を用いる遊離チロキシンの免疫分析 1.下記試薬を一緒にして37℃で60分間白色微小定量液の
ウエル中で温置した： ヒト血清中の遊離チロキサンの標準溶液25μｌ。
ウエル中で温置した： ヒト血清中の遊離チロキサンの標準溶液25μｌ。
0.1％脂肪酸不含ウシ血清アルブミンおよび0.9％塩化ナ
トリウムを含有する、50mMホスフエートバツフアー、pH
7.4中のワサビダイコンペルオキシターゼとチロキシン
の好適な結合物の溶液125μｌ。
トリウムを含有する、50mMホスフエートバツフアー、pH
7.4中のワサビダイコンペルオキシターゼとチロキシン
の好適な結合物の溶液125μｌ。
10mMのホスフエートバツフアー、pH7.6中のヒツジ抗チ
ロキシン血清で被覆した磁化しうるラテツクス粒子の懸
濁液125μｌ（約0.25mgの粒子を含有）。
ロキシン血清で被覆した磁化しうるラテツクス粒子の懸
濁液125μｌ（約0.25mgの粒子を含有）。
2.温置後、粒子を実施例１に記載した如く洗浄し、ペル
オキシターゼの化学発光測定用試薬中に懸濁した。次い
で各ウエルから放出される光を約１分後に測定した。
オキシターゼの化学発光測定用試薬中に懸濁した。次い
で各ウエルから放出される光を約１分後に測定した。
実施例 ３ 化学発光を用いる非共役エストリオールの免疫分析 1.下記試薬を一緒に室温で30分間一連の55mm×12mm試験
管中で温置した。
管中で温置した。
ヒト血清中の非共役エストリオールの標準溶液25μｌ。
0.1％脂肪酸不含ウシ血清アルブミンおよび0.9％塩化ナ
トリウムを含有する、50mMホスフエートバツフアー、pH
7.4中のワサビダイコンペルオキシダーゼに結合したエ
ストリオールの溶液100μｌ。
トリウムを含有する、50mMホスフエートバツフアー、pH
7.4中のワサビダイコンペルオキシダーゼに結合したエ
ストリオールの溶液100μｌ。
10mMホスフエートバツフアー、pH7.6中のウサギ抗エス
トリオール血清で被覆した磁化しうるラテツクス粒子の
懸濁液500μｌ。
トリオール血清で被覆した磁化しうるラテツクス粒子の
懸濁液500μｌ。
2.温置後、フエライト磁石の配列上に管を置いて磁化し
うる粒子を沈降させ、上層液体を除去した。
うる粒子を沈降させ、上層液体を除去した。
3.各層中の粒子を次いで0.1Mトリスバツフアー、pH8.0
の1.0ml中に懸濁して洗浄し、磁石上で粒子を沈降さ
せ、上層液体を除去した。
の1.0ml中に懸濁して洗浄し、磁石上で粒子を沈降さ
せ、上層液体を除去した。
4.次いで各管中の粒子を実施例１に記載した如きペルオ
キシダーゼの化学発光測定用試薬1.0ml中に再懸濁し
た。約10分後、各管から放出される光を10秒の間でルミ
ノメーター（オランダ、ルマツクBV）を用いて測定し
た。
キシダーゼの化学発光測定用試薬1.0ml中に再懸濁し
た。約10分後、各管から放出される光を10秒の間でルミ
ノメーター（オランダ、ルマツクBV）を用いて測定し
た。
実施例 ４ 化学発光を用いるフエリチンの免疫定量分析 1.下記試薬を一緒に室温で30分間白色微小定量板のウエ
ル中で温置した。
ル中で温置した。
４％ウシ血清アルブミン、0.9％塩化ナトリウムおよび
0.05％ハイアミンを含有する、50mMホスフエートバツフ
アー、pH7.4中のフエリチンの標準溶液100μｌ。
0.05％ハイアミンを含有する、50mMホスフエートバツフ
アー、pH7.4中のフエリチンの標準溶液100μｌ。
0.9％塩化ナトリウムおよび0.1％脂肪酸不含ウシ血清ア
ルブミンを含有し、50mMホスフエートバツフアー、pH7.
4中のワサビダイコンペルオキシダーゼに結合したフフ
リチンに対するウサギ抗体の溶液100μｌ。
ルブミンを含有し、50mMホスフエートバツフアー、pH7.
4中のワサビダイコンペルオキシダーゼに結合したフフ
リチンに対するウサギ抗体の溶液100μｌ。
10mMホスフエートバツフアー、pH7.6中のウサギ抗フエ
リチン血清で被覆した磁化しうるラテツクス粒子の懸濁
液25μｌ（約0.25mg粒子を含有）。
リチン血清で被覆した磁化しうるラテツクス粒子の懸濁
液25μｌ（約0.25mg粒子を含有）。
2.温置後、実施例１に記載した如く磁化しうる粒子を洗
浄し、ペルオキシダーゼの化学発光測定用試薬中に懸濁
した。
浄し、ペルオキシダーゼの化学発光測定用試薬中に懸濁
した。
実施例 ５ 螢光を用いる全チロキシンの免疫分析 1.下記試薬を一緒に室温で60分黒色微小定量板（ダイナ
テク）のウエル中で温置した。
テク）のウエル中で温置した。
チロキシンの標準溶液50μｌ。
結合性蛋白質ブロツキング剤を含有する、ホスフエート
／食塩水バツフアー、pH7.4中のアルカリホスフアター
ゼに結合したチロキシンの溶液100μｌ。
／食塩水バツフアー、pH7.4中のアルカリホスフアター
ゼに結合したチロキシンの溶液100μｌ。
0.15M塩化ナトリウムおよび1.0g／のウシ血清アルブ
ミンを含有する、50mMホスフエートバツフアー、pH7.6
中のヒツジ抗チロキシン血清で被覆した磁化しうるラテ
ツクス粒子の懸濁液100μｌ（約0.25mg粒子を含有）。
ミンを含有する、50mMホスフエートバツフアー、pH7.6
中のヒツジ抗チロキシン血清で被覆した磁化しうるラテ
ツクス粒子の懸濁液100μｌ（約0.25mg粒子を含有）。
2.温置後、粒子を実施例１に記載した如く、沈降させ、
1.0mM塩化マグネシウムを含有する0.2Mトリスバツフア
ー、pH9.0の200μｌ中で洗浄した。
1.0mM塩化マグネシウムを含有する0.2Mトリスバツフア
ー、pH9.0の200μｌ中で洗浄した。
3.次いで各ウエル中の粒子を、1.0mM塩化マグネシウム
および0.37mMメチルウムベリフエリルホスフエートを含
有する、0.2Mトリスバツフアー、pH9.0の200μｌ中に懸
濁する。室温で10分温置後、各ウエル中で発生した螢光
をマイクロフルアー（タイナテク）で測定した。
および0.37mMメチルウムベリフエリルホスフエートを含
有する、0.2Mトリスバツフアー、pH9.0の200μｌ中に懸
濁する。室温で10分温置後、各ウエル中で発生した螢光
をマイクロフルアー（タイナテク）で測定した。
実施例 ６ 螢光を用いる非共役エストリオールの免疫分析 1.下記試薬を一緒に室温で60分黒色微小定量板のウエル
中で温置した。
中で温置した。
ヒト血清のエストリオールの標準溶液50μｌ。0.15M塩
化ナトリウムおよび1g／のゼラチンを含有する20mMホ
スフエートバツフアー、pH7.0中のアルカリホスフアタ
ーゼに結合したエストリオールの溶液100μｌ。0.15M塩
化ナトリウムを含有し、20mMホスフエートバツフアー、
pH7.0中のウサギ抗エストリオールで被覆した磁化しう
るラテツクス粒子の懸濁液100μｌ（約0.25mg粒子を含
有）。
化ナトリウムおよび1g／のゼラチンを含有する20mMホ
スフエートバツフアー、pH7.0中のアルカリホスフアタ
ーゼに結合したエストリオールの溶液100μｌ。0.15M塩
化ナトリウムを含有し、20mMホスフエートバツフアー、
pH7.0中のウサギ抗エストリオールで被覆した磁化しう
るラテツクス粒子の懸濁液100μｌ（約0.25mg粒子を含
有）。
2.温置後、実施例５に記載した如く粒子を沈降させ、洗
浄した。
浄した。
3.各ウエル中の粒子を、10mM塩化マグネシウルおよび0.
37mMメチルウムベリフエリルホスフエートを含有する、
0.2Mトリスバツフアー、pH9.0の200μｌ中に再懸濁し
た。室温で20分温置後、各ウエルに発生した螢光をマイ
クロフルアーで測定した。
37mMメチルウムベリフエリルホスフエートを含有する、
0.2Mトリスバツフアー、pH9.0の200μｌ中に再懸濁し
た。室温で20分温置後、各ウエルに発生した螢光をマイ
クロフルアーで測定した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジヨン・キングスレイ・マーチン 英国バツキンガムシヤイア、ウエンドオー ヴアー、ライオナル、アヴエニユー ８ (72)発明者 ステフアン・アレキサンダー・チヤールズ 英国バツキンガムシヤイア、グレイト、ミ センデン、リトル、キングスヒル、リト ル、ピーターレイ（番地なし) (56)参考文献 特開 昭52−46884（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−141697（ＪＰ，Ａ) 欧州特許公開30086（ＥＰ，Ａ)
Claims (8)
- 【請求項１】（ｉ）相互に固定関係にある個々の分析容
器又は分析容器の配列、 （ii）液体媒体に可溶性である分析用ラベル付き試薬、 （iii）液体媒体中に懸濁できるが不溶性である磁気的
に吸引しうる粒子に結合した分析用の別の試薬 の使用を含む液体媒体中のアナライトの分析を行う方法
において、 （ａ）分析容器中で、前記ラベル付き試薬及び前記磁気
的に吸引し得る粒子に結合した試薬とアナライトを含有
する試料とを温置し、これによって蛍光又は発光系の成
分である或る量のラベル付き試薬が、試料中のアナライ
トの濃度によって決まる割合で、磁気的に吸引しうる粒
子に結合するようにし、 （ｂ）前記磁気的に吸引しうる粒子から液体相を分離
し、そして分析容器からこの液体相を除去し、 （ｃ）前記磁気的に吸引しうる粒子を別の液体媒体中に
再懸濁し、その粒子上のラベル付き試薬によって発生さ
れる信号を測定する ことを特徴とする方法。 - 【請求項２】分析容器の平面配列を使用する特許請求の
範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】分析容器の配列が微小定量板である特許請
求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 - 【請求項４】各分析容器をその隣接容器から光学的に遮
蔽する特許請求の範囲第１項〜第３項の何れか１項に記
載の方法。 - 【請求項５】工程（ｃ）でラベル付き試薬によって発生
される信号の測定を分析容器の上又は下から行う特許請
求の範囲第１項〜第４項の何れか１項に記載の方法。 - 【請求項６】磁気的に吸引しうる粒子が、分析の少なく
とも温置時間振とうすることなく液体相中に懸濁しうる
特許請求の範囲第１項〜第５項の何れか１項に記載の方
法。 - 【請求項７】磁気的に吸引しうる粒子はその粒子上のラ
ベル付き試薬によって発生される信号の減衰が50％以下
である特許請求の範囲第１項〜第６項の何れか１項に記
載の方法。 - 【請求項８】分析が競合分析もしくは免疫分析又は二部
位免疫定量分析である特許請求の範囲第１項〜第７項の
何れか１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| GB848401368A GB8401368D0 (en) | 1984-01-19 | 1984-01-19 | Assay method |
| GB8401368 | 1984-01-19 |
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|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| JP (1) | JPH0670630B2 (ja) |
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