JPH0662843A - Serum-free medium for tissue culture containing tissue inhibitor of metalloproteinase - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide a process for proliferating anchorage-dependent and floating cells in a shortened time using a serum-free culture medium containing a tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2). CONSTITUTION:The culture of an anchorage-dependent or-independent cell which has been separated from a mammalian animal and established as a line or a floating cell such as human or mouse cyncytium is carried out using a serum-free medium containing TIMP-2 and the proliferation can be attained in a shortened time.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【技術分野】本発明は、ティシュ・インヒビター・オブ
・メタロプロテイナーゼ−２（以下、ＴＩＭＰ−２と記
す）を含有せしめた接着性細胞および浮遊細胞培養用の
無血清培地に関するものであり、また、この培地を用い
て接着性細胞および浮遊細胞を短期間に増殖させる方法
に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a serum-free medium for culturing adherent cells and suspension cells containing tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (hereinafter referred to as TIMP-2), and The present invention relates to a method for growing adherent cells and floating cells in a short period using this medium.

【０００２】さらに詳しくは、本発明は、１０−１５％
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有せしめた組織培養用培地
に代えて有効に用い得るＴＩＭＰ−２含有組織培養用無
血清培地に関するものであり、また、この無血清培地を
用いて、哺乳類から分離、樹立した接着性細胞あるい
は、非接着性細胞あるいはヒト型あるいはマウス型の融
合細胞等の浮遊細胞その他を培養する方法に関するもの
である。More specifically, the present invention is 10-15%.
The present invention relates to a TIMP-2 containing serum-free medium for tissue culture that can be effectively used in place of a tissue-culture medium containing fetal calf serum (FCS), and is separated from mammals using this serum-free medium, The present invention relates to a method for culturing established adherent cells, non-adherent cells, floating cells such as human type or mouse type fused cells, and the like.

【０００３】[0003]

【背景技術】ティシュ・インヒビター・オブ・メタロプ
ロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）はヒトおよびその他の動物の
培養細胞（繊維芽細胞、腫瘍細胞、軟骨細胞、平骨筋細
胞、内皮細胞など）や血小板、単球、マクロファージ、
歯髄などが産生する分子量約３０ｋＤａの糖蛋白質であ
る。従来、ＴＩＭＰは間質コラゲナーゼ活性を阻害する
ことからコラゲナーゼ・インヒビターと呼ばれていた
が、間質コラゲナーゼ以外に種々のメタロプロテイナー
ゼ（７２ｋＤａゼラチナーゼ、９２ｋＤａゼラチナー
ゼ、ストロムライシン−１）を阻害することが明らかに
なり、ＴＩＭＰ（ティシュ・インヒビター・オブ・メタ
ロプロテイナーゼ）と改名された。（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ
ら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．，４９，４６９〜４
７９、１９９０： Ｃａｗｓｔｏｎ ｉｎ“Ｐｒｏｔｅ
ｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”、ｅｄ．ｂｙ Ｂ
ａｒｒｅｔｔら、Ｅｌｓｅｖｉｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａ
ｍ，１９８６，ｐ５８９．参照）。BACKGROUND ART Tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP) is a cultured cell (fibroblast, tumor cell, chondrocyte, skeletal muscle cell, endothelial cell, etc.) of human and other animals, platelet, monocyte, Macrophages,
It is a glycoprotein with a molecular weight of about 30 kDa produced by dental pulp and the like. Conventionally, TIMP was called a collagenase inhibitor because it inhibits interstitial collagenase activity, but it is clear that it inhibits various metalloproteinases (72 kDa gelatinase, 92 kDa gelatinase, stromlysin-1) in addition to interstitial collagenase. And was renamed TIMP (Tissue Inhibitor of Metalloproteinases). (Docherty
Et al., Ann. Rheum. Dis. , 49, 469-4
79, 1990: Cawston in “Prote”
inase Inhibitors ”, ed.by B
arrett et al., Elsevir, Amsterda
m, 1986, p589. reference).

【０００４】最近、上述のＴＩＭＰとは分子量の異なる
ティシュ・インヒビター・オブ・メタロプロテイナーゼ
−２（ＴＩＭＰ−２，約２１ｋＤａ）と呼ばれるメタロ
プロテイナーゼ・インヒビターが発見された（Ｓｔｅｔ
ｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２４６，１７３７４〜１７３７８、１９８９；Ｇ
ｏｌｄｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２０７〜８２１１、１９８９；
Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２６
８，２６７〜２７４、１９９０参照）。Recently, a metalloproteinase inhibitor called tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2, about 21 kDa) having a molecular weight different from that of TIMP was discovered (Stet).
Ler-Stevenson et al. Biol. Che
m. , 246, 17374-17378, 1989; G
oldberg et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 86, 8207-8221, 1989;
Williamson et al., Biochem. J. , 26
8, 267-274, 1990).

【０００５】ＴＩＭＰ−２と従来のＴＩＭＰとの違い
は、分子量の他に、Ｃｏｎ−Ａ−セファロースカラムに
結合しないということにより区別される。ヒトＴＩＭＰ
−２はｃＤＮＡクローニングによりその一次構造が明ら
かにされている（Ｂｏｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２８００〜２８０
４、１９９０参照）。それによると、ヒトＴＩＭＰ−２
は、１９４個のアミノ酸残基からなり、ヒトＴＩＭＰと
３８％の相同性を有している。The difference between TIMP-2 and conventional TIMPs is distinguished by the fact that, in addition to their molecular weight, they do not bind to the Con-A-Sepharose column. Human TIMP
-2 has its primary structure elucidated by cDNA cloning (Boone et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 87, 280 to 280
4, 1990). According to it, human TIMP-2
Consists of 194 amino acid residues and has 38% homology with human TIMP.

【０００６】また、ヒトＴＩＭＰ−２は、ヒトＴＩＭＰ
と同じ１２個のシステイン残基を持ち、その位置もよく
保存されている。Human TIMP-2 is human TIMP-2.
It has the same 12 cysteine residues as, and its position is well conserved.

【０００７】一方、ＴＩＭＰはプロ９２ｋＤａゼラチナ
ーゼおよびその活性型ゼラチナーゼと複合体を形成し、
また、ＴＩＭＰ−２はプロ７２ｋＤａゼラチナーゼと複
合体を形成していることが認められている。（Ｗｉｌｈ
ｅ１ｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７２
１３〜１７２２１、１９８９；Ｗａｒｄら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．，２７８，１７９〜１８７、１９９１参
照）。On the other hand, TIMP forms a complex with pro-92 kDa gelatinase and its active gelatinase,
It is also recognized that TIMP-2 forms a complex with pro72kDa gelatinase. (Wilh
e1m et al., J. Biol. Chem. , 264,172
13-17221, 1989; Ward et al., Bioch.
em. J. , 278, 179-187, 1991).

【０００８】ＴＩＭＰ−２はヒトおよびその他の動物の
培養細胞（ヘパトーマ細胞、気管支上皮細胞、線維芽細
胞、黒色腫細胞、骨肉腫細胞、大動脈内皮細胞、神経鞘
腫細胞、直腸癌細胞、リウマチ滑膜細胞など）や胎盤、
羊水、血液、軟骨、関節液などで合成、分泌され、ＴＩ
ＭＰと同様に細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ
の共通のインヒビターとして生物活性を有している。本
発明者らは、先にヒトＴＩＭＰが広範囲の細胞に増殖活
性を示すことを明らかにしたが（Ｈａｙａｋａｗａら、
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２９８，２９〜３２，１９９
２）、このたび、ヒトＴ１ＭＰ−２に対するマウスモノ
クローナル抗体の作製に成功し、それらの抗体の組合せ
によるサンドイッチ酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によりヒ
トおよびウシ組織体液および血液中のＴＩＭＰ−２濃度
を高感度で測定することに成功した。TIMP-2 is a cultured cell of human and other animals (hepatoma cells, bronchial epithelial cells, fibroblasts, melanoma cells, osteosarcoma cells, aortic endothelial cells, schwannoma cells, rectal cancer cells, rheumatoid synovium). Membrane cells) and placenta,
Synthesized and secreted by amniotic fluid, blood, cartilage, joint fluid, etc., TI
Like MP, it has biological activity as a common inhibitor of extracellular matrix metalloproteinases. The present inventors have previously revealed that human TIMP exhibits proliferative activity on a wide range of cells (Hayakawa et al.,
FEBS Lett. , 298, 29 to 32, 199
2) We have succeeded in producing a mouse monoclonal antibody against human T1MP-2, and increased the TIMP-2 concentration in human and bovine tissue body fluids and blood by sandwich enzyme immunoassay (EIA) using a combination of these antibodies. Succeeded in measuring with sensitivity.

【０００９】従来、組織培養用培地にウシ胎児血清（Ｆ
ＣＳ）を添加すると細胞増殖が促進されることはよく知
られている。先に本発明者らは、ヒトＴＩＭＰを組織培
養用無血清培地に添加すると細胞増殖が促進されること
を明らかにした（特願平４−１８８５２８号）が、それ
以外にこれまでに、細胞増殖を促進する因子について
は、何ら報告されていない。Conventionally, fetal bovine serum (F
It is well known that addition of CS) promotes cell proliferation. Previously, the present inventors revealed that addition of human TIMP to a serum-free medium for tissue culture promotes cell growth (Japanese Patent Application No. 4-188528). There is no report on factors that promote proliferation.

【００１０】本発明者らは、上記のヒトＴＩＭＰ−２に
対するモノクローナル抗体を用いたアフィニティカラム
でヒト胎盤からＴＩＭＰ−２を分離、精製したものを組
織培養用無血清培地に添加し、ヒト歯肉線維芽細胞、パ
ーキットリンパ細胞およびヒト慢性赤血球性白血病細胞
を培養したところ、ＴＩＭＰ−２濃度１０ｎｇ／ｍｌで
最大細胞増殖効果が認められた。また、マウス由来ハイ
ブリドーマやマウス由来コロン２６細胞の増殖用培地に
ヒトＴＩＭＰ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したところ
細胞増殖効果が認められた。上記２種のマウス由来細胞
にヒトＴＩＭＰを添加しても増殖効果は認められなかっ
た。The present inventors have isolated and purified TIMP-2 from human placenta by an affinity column using the above-mentioned monoclonal antibody against human TIMP-2 and added the purified product to a serum-free medium for tissue culture to obtain human gingival fibers. When blast cells, Purkitt lymphocytes and human chronic erythroid leukemia cells were cultured, the maximum cell proliferation effect was observed at a TIMP-2 concentration of 10 ng / ml. Further, when human TIMP-2 (10 ng / ml) was added to the growth medium for mouse-derived hybridoma or mouse-derived colon 26 cells, a cell growth effect was observed. No proliferative effect was observed when human TIMP was added to the above-mentioned two types of mouse-derived cells.

【００１１】これらの知見に基づき、本発明者らは、細
胞培養に対するＴＩＭＰ−２の成長因子としての効果を
確認し、ＴＩＭＰ−２を無血清培地中に添加して用いる
ことによって、接着性細胞および浮遊細胞を培養するた
めの極めて優れた無血清培地を提供することに成功し
た。Based on these findings, the present inventors have confirmed the effect of TIMP-2 as a growth factor on cell culture, and added TIMP-2 to a serum-free medium to use the adhesive cells. And it has succeeded in providing an extremely excellent serum-free medium for culturing suspension cells.

【００１２】[0012]

【発明の開示】本発明はティシュ・インヒビター・オブ
・メタロプロテイナーゼ−２を含有せしめたことを特徴
とする組織培養用無血清培地を提供するものであり、さ
らにティシュ・インヒビター・オブ・メタロプロテイナ
ーゼ−２を細胞増殖因子として用いて、動物組織細胞あ
るいは動物由来の融合細胞をティシュ・インヒビター・
オブ・メタロプロテイナーゼ−２含有組織培養用無血清
培地中で増殖させる方法を提供するものである。本発明
の組織培養用培地に添加するＴＩＭＰ−２としては、哺
乳類の組織、血液、体液および哺乳類より分離された正
常細胞、腫瘍細胞からの精製品を使用することができる
が、リコンビナントＤＮＡ法などによって作製されたも
のも使用することができる。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention provides a serum-free medium for tissue culture, which is characterized by containing tissue inhibitor of metalloproteinase-2. Further, tissue inhibitor of metalloproteinase- 2 is used as a cell growth factor to transform animal tissue cells or animal-derived fused cells into tissue inhibitors.
Provided is a method for growing in a serum-free medium for tissue culture containing of metalloproteinase-2. As TIMP-2 to be added to the tissue culture medium of the present invention, a purified product from mammalian tissue, blood, body fluid and normal cells or tumor cells isolated from mammals can be used, such as the recombinant DNA method. Those produced by can also be used.

【００１３】本発明により、組織培養用無血清培地にＴ
ＩＭＰ−２を一定量添加した培地が提供され、また、こ
のＴＩＭＰ−２含有無血清培地を用いて哺乳類より分
離、樹立した接着性細胞、非接着性細胞およびヒト、マ
ウス型融合浮遊細胞などを増殖させるという極めて有用
な培養法が提供される。According to the present invention, T-free serum-free medium for tissue culture is prepared.
A medium to which a fixed amount of IMP-2 is added is provided, and adherent cells, non-adherent cells and human- and mouse-type fused floating cells that have been isolated and established from mammals using this TIMP-2 containing serum-free medium are provided. An extremely useful culturing method of growing is provided.

【００１４】本発明により、現在通常のウシ胎児血清添
加培養液の使用による培養コストを大巾に低減すること
ができ、かつ培養液中の希薄な産生たん白質の精製を容
易にすることができるなど、本発明による産業的貢献は
極めて大きいものであり、また、本発明により、最近の
動物愛護運動からのウシ胎児血清生産に対する批判にも
耐え得るという利点がもたらされる。According to the present invention, it is possible to greatly reduce the culture cost by using the usual culture medium containing fetal bovine serum, and it is possible to easily purify the diluted protein produced in the culture medium. As described above, the industrial contribution of the present invention is extremely large, and the present invention provides an advantage that it can endure the criticism of fetal bovine serum production from the recent animal welfare movement.

【００１５】以下に実施例を示し、本発明を具体的に説
明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではな
い。なお、下記の実施例中で用いられているヒトＴＩＭ
Ｐ−２およびヒトＴＩＭＰは、下記の如くして調製され
たものである。The present invention will be specifically described with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to this. The human TIM used in the following examples
P-2 and human TIMP were prepared as follows.

【００１６】ヒトＴＩＭＰ−２（ｈＴＩＭＰ−２）の調
製 （ａ） ヒトＴＩＭＰ−２ポリペプチドの調製 Ｂｏｏｎｅらは、ヒトＴＩＭＰ−２ポリペプチドの配列
を、ｃＤＮＡの配列から予測している（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７；２８００〜２
８０４、１９９０）。その予測されたアミノ酸配列構造
中より、表１に示した３種のポリペプチド（Ｐ−１、Ｐ
−２、Ｐ−３）をそれぞれペプチドシンセサイザー９６
００（ミリジェン／バイオサーチ）を用いて合成し、続
いて、それらの各ポリペプチドのＣ末端にシステイン残
基を導入した。Preparation of human TIMP-2 (hTIMP-2) (a) Preparation of human TIMP-2 polypeptide Boone et al. Predicted the sequence of human TIMP-2 polypeptide from the sequence of cDNA (Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 87; 2800-2
804, 1990). From the predicted amino acid sequence structures, the three types of polypeptides (P-1, P
-2, P-3) is a peptide synthesizer 96
00 (Milligen / Biosearch) and subsequently introduced a cysteine residue at the C-terminus of each of their polypeptides.

【００１７】得られた３種の粗ポリペプチドは、それぞ
れ、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ（Ｗａｔｅｒｓ，５μ、
Ｃ１８−１００Å、３．９×１５０ｍｍ）カラムを用い
て高速液体クロマトグラフィーにより精製した。The three kinds of crude polypeptides thus obtained were respectively produced by μBondasphere (Waters, 5μ,
It was purified by high performance liquid chromatography using a C18-100Å, 3.9 × 150 mm) column.

【００１８】[0018]

【表１】 [Table 1]

【００１９】（ｂ） ヒトＴＩＭＰ−２ポリペプチドと
キーホールリンペットヘモシアニン複合体の調製 （ａ）で得られた３種のポリペプチドについて、それぞ
れ下記のとおりにして複合体を調製した。２ｍｇキーホ
ールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ．）を１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ７．
５に溶解したものと１．８５ｍｇＮ−（ε−ｍａｌｅｉ
ｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ
ｅを２００μｌのジメチルホルムアミドに溶解したもの
とを混合し、３０℃、３０分間インキュベーションし
た。次に上記の混合液を０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ
７．０で平衡化したＰＤ−１０（ファルマシア）でゲル
濾過した。(B) Preparation of human TIMP-2 polypeptide and keyhole limpet hemocyanin complex A complex was prepared for each of the three kinds of polypeptides obtained in (a) as follows. 2mg keyhole limpet hemocyanin (KLH, Calbioc
hem. ) To 1 ml of 0.1 M phosphate buffer, pH 7.
Dissolved in 5 and 1.85 mg N- (ε-malei
midocaproloxy) succinimid
e dissolved in 200 μl of dimethylformamide was mixed and incubated at 30 ° C. for 30 minutes. Then, add the above mixture to 0.1M phosphate buffer, pH.
Gel filtered on PD-10 (Pharmacia) equilibrated to 7.0.

【００２０】マレイミドが結合されたＫＬＨを分取し、
１．５ｍｌ以下に濃縮した。マレイミドが結合されたＫ
ＬＨに対し５０倍モル量の前記（ａ）で合成した各ポリ
ペプチドを１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ７．０
に溶解したものと混合した。４℃、２０時間インキュベ
ーションし、３種のポリペプチドーＫＬＨ複合体を調製
した。The maleimide-bound KLH is collected and
It was concentrated to 1.5 ml or less. K bound with maleimide
A 50-fold molar amount of each polypeptide synthesized in (a) above LH was added to 1 ml of 0.1 M phosphate buffer, pH 7.0.
It was mixed with that dissolved in. After incubation at 4 ° C. for 20 hours, 3 kinds of polypeptide-KLH complexes were prepared.

【００２１】（ｃ） 抗体産生細胞の調製 前記（ｂ）の方法により調製した各複合体２５０μｇを
完全フロイントアジュバントと共に８週令Ｂａｌｂ／ｃ
雌マウスにそれぞれ腹腔内投与し、初回免疫した。１５
日後に０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ６．０に溶解した各
複合体２００μｇを初回免疫したそれぞれのマウスに腹
腔内投与し追加免疫した。さらに、３８日後に追加免疫
時と同様に各複合体７０μｇを静脈内および１３０μｇ
を腹腔内投与し、最終免疫とした。その３日後に脾臓を
摘出し、脾細胞懸濁液を調製した。(C) Preparation of antibody-producing cells 250 μg of each complex prepared by the method of (b) above was combined with complete Freund's adjuvant for 8 weeks old Balb / c.
Each female mouse was intraperitoneally administered for the first immunization. 15
After 200 days, 200 μg of each complex dissolved in 0.1 M phosphate buffer, pH 6.0 was intraperitoneally administered to each mouse to which the first immunization was given, to perform additional immunization. After 38 days, 70 μg of each complex was intravenously and 130 μg similarly to the case of boosting.
Was administered intraperitoneally for the final immunization. Three days after that, the spleen was removed to prepare a splenocyte suspension.

【００２２】（ｄ） 細胞融合 （１） 以下の材料および方法を用いた。 ＲＰＭＩ １６４０培地：ＲＰＭＩ １６４０（Ｆｌｏ
ｗ Ｌａｂ．）に重炭酸ナトリウム（２４ｍＭ）、ピル
ビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリンＧカリウム
（５０Ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（５０μｇ
／ｍｌ）および硫酸アミカシン（１００μｇ／ｍｌ）を
加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．２μｍ東
洋メンブレンフィルターで除菌濾過した。(D) Cell fusion (1) The following materials and methods were used. RPMI 1640 medium: RPMI 1640 (Flo
w Lab. ) To sodium bicarbonate (24 mM), sodium pyruvate (1 mM), potassium penicillin G (50 U / ml), streptomycin sulfate (50 μg)
/ Ml) and amikacin sulfate (100 μg / ml) were added, pH was adjusted to 7.2 with dry ice, and sterilization filtration was performed with a 0.2 μm Toyo Membrane filter.

【００２３】ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ １６４０培
地に除菌濾過した仔牛胎児血清（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ）を１５％（ｖ／ｖ）の濃度になるように加
えた。 ＰＥＧ ４，０００溶液：ＲＰＭＩ １６４０培地にポ
リエチレングリコール４，０００（ＰＥＧ ４，００
０、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．）を５０％（ｗ／ｗ）になるよ
うに加え、無血清溶液を調製した。８−アザグアニン耐
性ミエローマ細胞ＳＰ２（ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４）との
融合は、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅ
ｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｍｉｓ
ｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅ
ｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ ３５１〜３７２、１
９８０に記載のＯｉらの方法を若干改変して行った。NS-1 medium: Calf fetal bovine serum (MA Biopro) obtained by sterilizing and filtering the above RPMI 1640 medium.
Ducts) was added to a concentration of 15% (v / v). PEG 4,000 solution: Polyethylene glycol 4,000 (PEG 4,000) in RPMI 1640 medium
0, Merck & Co. ) Was added to 50% (w / w) to prepare a serum-free solution. Fusion with 8-azaguanine-resistant myeloma cells SP2 (SP2 / O-Ag14) was performed using the Selected Method in Ce method.
Illular Immunology (eds. Mis
Hell and Shiigi), W. H. Free
man and Company 351-372, 1
The method of Oi et al. Described in 980 was slightly modified.

【００２４】（２） 前記（ｃ）で調製した各有核牌臓
細胞（生細胞率１００％）について、それぞれ、ミエロ
ーマ細胞（生細胞率１００％）と５：１の割合で融合し
た。なお、この場合、脾蔵細胞とミエローマ細胞とは別
々に前記のＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄しておき、次
に両者を同じＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁し、上記の
割合で混合した。混合した各培地に対し、新たにＲＰＭ
Ｉ １６４０培地を前記のペプチドＰ−１，Ｐ−２，Ｐ
−３の各複合体の場合につき、各２５．８ｍｌ、２８．
５ｍｌ、３４．５ｍｌ加え、容量５０ｍｌのポリプロピ
レン製遠沈管（岩城硝子）を用いて、４００×ｇで１０
分間遠心し、上清を完全に吸引除去した。得られた各沈
殿細胞に３７℃加温ＰＥＧ ４，０００溶液を、ペプチ
ドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の場合につき、そ
れぞれ、２．３ｍｌ、４．８ｍｌ、５．０ｍｌの量をも
って、穏やかに撹拌しながら、１分間で滴下し、さらに
１分間撹拌し各細胞を再懸濁、分散させた。得られた各
懸濁液に対し、３７℃加温ＲＰＭＩ １６４０培地を、
ペプチドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の場合につ
いて、それぞれ、４．６ｍｌ、９．６ｍｌ、１０．０ｍ
ｌの量を用いて、２分間、滴下した後、さらに、新たな
同じ培地をペプチドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体
の場合につき、それぞれ、１６．０ｍｌ、３３．６ｍ
ｌ、３５．０ｍｌを用いて、２〜３分間において、常に
撹拌しながら滴下し細胞を分散させた。(2) Each of the nucleated spleen cells (viable cell rate 100%) prepared in (c) above was fused with myeloma cells (viable cell rate 100%) at a ratio of 5: 1. In this case, spleen cells and myeloma cells were separately washed with the RPMI 1640 medium described above, and then both were suspended in the same RPMI 1640 medium and mixed at the above ratio. RPM for each mixed medium
I 1640 medium with the peptides P-1, P-2, P
-3 for each complex, 25.8 ml each, 28.
Add 5 ml and 34.5 ml, and use a polypropylene centrifuge tube (Iwaki glass) with a volume of 50 ml to give 10 at 400 × g.
After centrifuging for a minute, the supernatant was completely removed by suction. To each of the obtained precipitated cells, a PEG 4,000 solution heated at 37 ° C. was added to each of the complexes of peptides P-1, P-2, and P-3 in an amount of 2.3 ml, 4.8 ml, and 5. With a volume of 0 ml, the mixture was added dropwise over 1 minute with gentle stirring, and further stirred for 1 minute to resuspend and disperse each cell. To each of the obtained suspensions, 37 ° C warmed RPMI 1640 medium was added.
For each complex of peptides P-1, P-2, P-3, 4.6 ml, 9.6 ml, 10.0 m, respectively.
1 drops of the same medium for 2 minutes, and then 16.0 ml and 33.6 m of the same new medium for the respective complexes of peptides P-1, P-2 and P-3.
1 and 35.0 ml were added dropwise for 2-3 minutes with constant stirring to disperse the cells.

【００２５】得られた各懸濁液を、４００×ｇで７分間
遠心分離し、上清を完全に吸引除去した。次に得られた
各沈殿細胞に対し、３７℃加温ＮＳ−１培地をペプチド
Ｐ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の各場合につき、そ
れぞれ、２２．７ｍｌ、４０．０ｍｌ、４０．０ｍｌ速
やかに加え、細胞の大きい塊を１０ｍｌのピペットを用
いて注意深くピペッティングして分散した。得られた各
分散液に対し、さらに新たに、３７℃加温ＮＳ−１培地
をペプチドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の各場合
につき、それぞれ、４５．３ｍｌ、１０４ｍｌ、１１０
ｍｌ加えて希釈し、ポリスチレン製９６穴マイクロウエ
ル（岩城硝子）にウエル当り６．０×１０^５個／０．１
ｍｌの細胞を加えた。次いで、これを７％炭酸ガス／９
３％空気中で温度３７℃、湿度１００％下で培養した。The obtained suspensions were centrifuged at 400 × g for 7 minutes, and the supernatant was completely removed by suction. Next, to each of the precipitated cells obtained, 23.7 ml and 40.0 ml of 37 ° C. warmed NS-1 medium were added in each case of each complex of peptides P-1, P-2 and P-3. 40.0 ml was added immediately and the large clumps of cells were dispersed by careful pipetting with a 10 ml pipette. To each of the obtained dispersions, 37 ° C.-warmed NS-1 medium was newly added in each case of each complex of peptides P-1, P-2, and P-3 to 45.3 ml and 104 ml, respectively. , 110
Dilute by adding ml to a polystyrene 96-well microwell (Iwaki Glass), and per well 6.0 × 10 ⁵ cells / 0.1
ml cells were added. Then, add this to 7% carbon dioxide / 9
The cells were cultured in 3% air at a temperature of 37 ° C and a humidity of 100%.

【００２６】（ｅ） 選択培地によるハイブリドーマの
選択的増殖 （１） 使用する培地は以下のとおりである。 ＨＡＴ培地：前記（ｄ）で述べたＮＳ−１培地にさらに
ヒポキサンチン（１００μＭ）アミノプテリン（０．４
μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加えた。 ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。(E) Selective growth of hybridoma by selective medium (1) The medium used is as follows. HAT medium: In addition to the NS-1 medium described in (d) above, hypoxanthine (100 μM) aminopterin (0.4
μM) and thymidine (16 μM). HT medium: HAT described above except that aminopterin was removed
It has the same composition as the medium.

【００２７】（２） 前記（ｄ）の培養開始後翌日（１
日目）、細胞に１０ｍｌピペットでＨＡＴ培地２滴（約
０．１ｍｌ）を加えた。２、３、５、８、１１日目に培
地の半分（０．１ｍｌ）を新しいＨＡＴ培地で置き換
え、１１日目に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換え
た。通常約２週間で充分なハイブリドーマの生育が観察
される。ハイブリドーマ生育全ウエルについて次項
（ｆ）記載の固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）に
より陽性ウエルをチェックした。(2) The following day (1) after the start of culture in (d) above
On day one, 2 drops (about 0.1 ml) of HAT medium was added to the cells with a 10 ml pipette. Half of the medium (0.1 ml) was replaced with fresh HAT medium on days 2, 3, 5, 8, 11 and half of the medium was replaced with fresh HT medium on day 11. In about 2 weeks, sufficient growth of hybridoma is usually observed. For all wells in which hybridomas grew, positive wells were checked by the solid phase-antibody binding test method (ELISA) described in the next section (f).

【００２８】次にフィーダーとして１０^７個のマウス胸
腺細胞を含むＨＴ培地１ｍｌをポリスチレン製２４穴セ
ルウエル（岩城硝子）に加えたものを用い、上記で検出
された各陽性ハイブリドーマの全内容物を移した。これ
を前記（ｄ）におけると同様に７％炭酸ガス存在下、３
７℃で約２〜３日培養に付した。ハイブリドーマの充分
生育した時点でＥＬＩＳＡ法により陽性を再確認し、そ
れぞれについて次項（ｇ）記載の限界希釈法によるクロ
ーニングを行った。なお、クローニングに使用後の残液
をポリスチレン製２５ｃｍ^２組織培養フラスコ（岩城硝
子）に移し、凍結保存用試料を調製した。Next, 1 ml of HT medium containing 10 ⁷ mouse thymocytes was added to a polystyrene 24-well cell well (Iwaki Glass) as a feeder, and the whole contents of each positive hybridoma detected above were transferred. did. In the same manner as in (d) above, in the presence of 7% carbon dioxide gas, 3
The cells were cultured at 7 ° C for about 2 to 3 days. When the hybridomas were sufficiently grown, the positiveness was confirmed again by the ELISA method, and each of them was cloned by the limiting dilution method described in the following item (g). The residual liquid used for cloning was transferred to a polystyrene 25 cm ² tissue culture flask (Iwaki Glass) to prepare a sample for cryopreservation.

【００２９】（ｆ） ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトＴＩＭ
Ｐ−２抗体産生ハイブリドーマの検索 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，２０５〜２１４、
１９８０に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若干改変し
た方法を用いた。この方法は、ハイブリドーマ抗体の検
出に適している。９６穴ミクロタイトレーションプレー
ト（ＦｌｏｗＬａｂ．）を前記（ａ）で得られた各ポリ
ペプチド５０ｎｇでコートした。(F) Anti-human TIM by ELISA method
Search for hybridoma producing P-2 antibody Anal. Biochem. 104, 205-214,
A method obtained by slightly modifying the method of Rennard et al. Described in 1980 was used. This method is suitable for detecting hybridoma antibodies. A 96-well microtitration plate (FlowLab.) Was coated with 50 ng of each polypeptide obtained in the above (a).

【００３０】これに前記（ｅ）で得られたハイブリドー
マ生育ウエルの上清の一部を加えて室温で約１時間イン
キュベートした。２次抗体として西洋わさびペルオキシ
ダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ
Ｌａｂ．）を加え、さらに室温で約１時間インキュベ
ートした。次に基質である過酸化水素とｏ−フェニレン
ジアミンを加え生成した褐色の程度をマイクロプレート
リーダー（ＭＰＲ−Ａ４、東洋ソーダ）を用いて４９２
ｎｍの吸光度を測定し判定した。A part of the supernatant of the hybridoma growing well obtained in the above (e) was added thereto and incubated at room temperature for about 1 hour. As a secondary antibody, goat anti-mouse immunoglobulin labeled with horseradish peroxidase (Cappel)
Lab. ) Was added and the mixture was further incubated at room temperature for about 1 hour. Next, using a microplate reader (MPR-A4, Toyo Soda), the degree of brown color produced by adding hydrogen peroxide and o-phenylenediamine as a substrate to the substrate was 492.
The absorbance at nm was measured and judged.

【００３１】（ｇ） クローニング 前記（ｅ）の操作後、各ウエル中には、２種以上のハイ
ブリドーマが生育している可能性があるので、限界希釈
法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを取得する。ＮＳ−１培地１ｍｌ当りフ
ィーダーとして１０^７個のマウス胸腺細胞を含むクロー
ニング培地を調製し、９６穴マイクロウエルの３６ウエ
ル、３６ウエルおよび２４ウエルにウエル当り５個、１
個および０．５個のハイブリドーマを加えた。５日目に
全ウエルに各約０．１ｍｌのＮＳ−１培地を追加した。(G) Cloning Since there is a possibility that two or more kinds of hybridomas grow in each well after the operation of (e), cloning is performed by the limiting dilution method to obtain the monoclonal antibody-producing hybridomas. get. A cloning medium containing 10 ⁷ mouse thymocytes as a feeder per 1 ml of NS-1 medium was prepared, and 5 wells per well in 36 wells, 36 wells and 24 wells of 96-well microwells.
And 0.5 hybridomas were added. On day 5, all wells were supplemented with about 0.1 ml of NS-1 medium.

【００３２】クローニング開始後１１〜１４日で充分な
ハイブリドーマの生育が認められ、コロニーを形成して
いるウエルを１２個選びＥＬＩＳＡ法を行った。テスト
した全ウエルが陽性でない場合、抗体陽性ウエル中のコ
ロニー数を確認し、ウエル中に１コロニーが確認された
ウエルを２個選びその内１ウエルを再クローニングす
る。最終的に表２に示したようにＰ１−ペプチド、Ｐ２
−ペプチド、Ｐ３−ペプチドのそれぞれに対するモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマ計５１クローンを得
た。Sufficient hybridoma growth was observed 11 to 14 days after the start of cloning, and 12 wells forming colonies were selected and subjected to an ELISA method. When all the tested wells are not positive, the number of colonies in the antibody-positive wells is confirmed, two wells in which one colony is confirmed are selected, and one of them is recloned. Finally, as shown in Table 2, P1-peptide, P2
-A total of 51 clones of monoclonal antibody-producing hybridomas for the peptide and P3-peptide were obtained.

【００３３】（ｈ） モノクローナル抗体の生体外増殖
および生体内増殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、得
られた各ハイブリドーマをＮＳ−１培地などの適当な培
養液で培養（生体外増殖）し、その培養上清から１０〜
１００μｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を得るこ
とができた。一方、大量に抗体を得るためには脾細胞と
ミエローマ細胞の由来動物と同系の動物（Ｂａｌｂ／ｃ
マウス）にマウス１匹当り０．５ｍｌの腫瘍形成促進剤
プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）を腹腔内
投与した。１〜３週間後に、各ハイブリドーマ１×１０
^７個を同じく腹腔内投与し、さらにその１〜２週間後に
生体内で産生された４〜７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル
抗体を含む腹水を得ることができた。(H) In Vitro and In Vitro Proliferation of Monoclonal Antibody Proliferation of the monoclonal antibody is carried out by a conventional method. That is, each of the obtained hybridomas was cultured (in vitro growth) in an appropriate culture medium such as NS-1 medium, and 10 to 10
It was possible to obtain a monoclonal antibody at a concentration of 100 μg / ml. On the other hand, in order to obtain a large amount of antibody, an animal syngeneic with the origin of splenocytes and myeloma cells (Balb / c
To each mouse, 0.5 ml of a tumor formation promoter pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane, Aldrich Chem. Co.) was intraperitoneally administered to each mouse. 1 to 10 times each hybridoma after 1-3 weeks
^{Seven of} them were also intraperitoneally administered, and 1-2 weeks later, ascites containing 4 to 7 mg / ml of the monoclonal antibody produced in vivo could be obtained.

【００３４】（ｉ） モノクローナル抗体の重鎖および
軽鎖 前述したＥＬＩＳＡ法に従って、前述のＰ１−ペプチ
ド、Ｐ２−ペプチド、Ｐ３−ペプチドそれぞれをコート
したミクロタイトレーションプレートに、前記（ｇ）で
得られた各モノクローンの培養上清を加えた。次にＰＢ
Ｓにより洗浄した後、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウ
スＩｇ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ．）を加えた。ＰＢＳ
による洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基質と
して過酸化水素および２，２′−アジノ−ジ（３−エチ
ルベンゾチアゾリン硫酸）を用いてそれぞれの重鎖およ
び軽鎖を判定した。その結果をまとめて後掲の表２に示
した。(I) Heavy chain and light chain of monoclonal antibody According to the above-mentioned ELISA method, the above-mentioned P1-peptide, P2-peptide and P3-peptide were coated on a microtitration plate to obtain the above-mentioned (g). The culture supernatant of each monoclone was added. Then PB
After washing with S, an isotype-specific rabbit anti-mouse Ig antibody (Zymed Lab.) Was added. PBS
Washed with horseradish peroxidase (POD)
Labeled goat anti-rabbit IgG (H + L) antibody was added and the respective heavy and light chains were determined using hydrogen peroxide and 2,2'-azino-di (3-ethylbenzothiazoline sulfate) as substrates. The results are summarized in Table 2 below.

【００３５】（ｊ） モノクローナル抗体の精製 前記（ｈ）で得られた各腹水を４０％飽和硫酸アンモニ
ウムで分画した後、ＩｇＧクラスの抗体について０．５
Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝
液，ｐＨ８．９で平衡化したプロテインＡアフィゲル
（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂ．）カラムに吸着させ、上記洗
浄液で洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液，ｐＨ５．０で
溶出することにより精製した。(J) Purification of Monoclonal Antibodies Each ascites fluid obtained in the above (h) was fractionated with 40% saturated ammonium sulfate, and then 0.5% for IgG class antibodies.
Adsorbed on a Protein A Affigel (Bio-RadLab.) Column equilibrated with 1.5 M glycine-NaOH buffer containing M sodium chloride, pH 8.9, washed with the above washing solution, and then washed with 0.1 M citrate buffer, pH 5. Purified by eluting at 0.

【００３６】なお、クローン番号６７−４Ｈ１１のハイ
ブリドーマは、微工研菌寄第１２６９０号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２６９０）の受託番号をもって、微生物工業技術
研究所に寄宅されており、また、同クローン番号６８−
６Ｈ４のハイプリドーマは、微工研菌寄第１２６９１号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６９１）の受託番号をもって、同
研究所に寄託されている。The hybridoma of the clone number 67-4H11 was obtained from Microcosm Research Institute No. 12690 (FERM).
P-12690), and is visiting the Institute for Microbial Science and Technology, and the clone number 68-
The 6H4 hybridoma has been deposited at the institute with the accession number of Microorganism Research Institute No. 12691 (FERM P-12691).

【００３７】[0037]

【表２】 [Table 2]

【００３８】（ｋ） ｎＴＩＭＰ−２の精製 ヒト胎盤に１ｍＭ塩酸カルシウム、０．１Ｍ塩化ナトリ
ウム、１ｍＭＮ−エチルマレイミド、５ｍＭＥＤＴＡ、
５ｍＭベンザミジンおよび０．００５％ブリッジ３５含
有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．４を加え、Ｔ
ＩＭＰ−２を抽出した。遠心後、その上清をｐＨ７．１
に調整し、前記（ｊ）項で精製したヒトＴＩＭＰ−２モ
ノクローナル抗体（クローン番号６７−４Ｈ１１）結合
セファロース４Ｂアフィニティー・カラムを用いて精製
し、最後に、３５℃、３０分間、４Ｍ塩酸グアニジン中
で処理した後、ウルトロゲルＡｃＡ５４カラムでゲル濾
過し、ＴＩＭＰ−２に結合している可能性のある細胞成
長因子を解離、分画により、除去した（表３）。(K) Purification of nTIMP-2 On human placenta, 1 mM calcium chloride, 0.1 M sodium chloride, 1 mM N-ethylmaleimide, 5 mM EDTA,
20 mM Tris-HCl buffer containing 5 mM benzamidine and 0.005% bridge 35, pH 7.4 was added, and T was added.
IMP-2 was extracted. After centrifugation, the supernatant is adjusted to pH 7.1.
And purified using a human TIMP-2 monoclonal antibody (clone No. 67-4H11) -conjugated Sepharose 4B affinity column purified in (j) above, and finally, in 35 ° C. for 30 minutes in 4 M guanidine hydrochloride. After treatment with, the cells were subjected to gel filtration using an Ultrogel AcA54 column, and the cell growth factor possibly binding to TIMP-2 was removed by dissociation and fractionation (Table 3).

【００３９】精製により得られたｈＴＩＭＰ−２は、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８０，５７９〜５９９，１９
７３記載のＬａｅｍｍｌｉらの方法に従いドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動で調べたとこ
ろ分子量約２１ｋＤａの単一バンドを示した。なお、各
精製段階のｈＴＩＭＰ−２濃度は後記（１）項記載の１
ステップサンドイッチＥＩＡにより測定した。HTIMP-2 obtained by purification is
J. Mol. Biol. , 80,579 to 599,19
When examined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis according to the method of Laemmli et al. Described in No. 73, a single band with a molecular weight of about 21 kDa was shown. The hTIMP-2 concentration at each purification step is 1 as described in (1) below.
It was measured by step sandwich EIA.

【００４０】（ｌ） １ステップサンドイッチＥＩＡ 前記（ｊ）項で精製したモノクローナル抗体（固相クロ
ーン番号６８−６Ｈ４、複合体：クローン番号６７−４
Ｈ１１）と上記（ｋ）項で調製したヒト胎盤を用いて表
４に示す方法で標準曲線を作成した。得られた標準曲線
の定量感度は約１６ｐｇであり、６．３−５０ｎｇ／ｍ
ｌ（６３−５００ｐｇ／アッセイ）の範囲で直線性が認
められた。(L) One-step sandwich EIA Monoclonal antibody purified in the above (j) (solid phase clone No. 68-6H4, complex: clone No. 67-4)
H11) and the human placenta prepared in (k) above were used to prepare a standard curve by the method shown in Table 4. The quantitative sensitivity of the obtained standard curve is about 16 pg, and is 6.3-50 ng / m.
Linearity was observed in the range of 1 (63-500 pg / assay).

【００４１】[0041]

【表３】 [Table 3]

【００４２】[0042]

【表４】 [Table 4]

【００４３】１） １μｇ／ｍｌＩｇＧ−ＰＯＤ複合体
溶液（溶解緩衝液：１％ＢＳＡ、０．１Ｍ塩化ナトリウ
ムおよび１０ｍＭＥＤＴＡ含有３０ｍＭリン酸緩衝液，
ｐＨ７．０） ２） 生理食塩液 ３） ２ｍｇ／ｍｌｏ−フェニレンジアミン溶液（溶解
緩衝液：０．０２％過酸化水素含有クエン酸−リン酸緩
衝液，ｐＨ４．６） ４） ２Ｎ硫酸1) 1 μg / ml IgG-POD complex solution (lysis buffer: 30 mM phosphate buffer containing 1% BSA, 0.1 M sodium chloride and 10 mM EDTA,
pH 7.0) 2) Physiological saline solution 3) 2 mg / ml o-phenylenediamine solution (dissolution buffer solution: citric acid-phosphate buffer solution containing 0.02% hydrogen peroxide, pH 4.6) 4) 2N sulfuric acid

【００４４】ヒトＴＩＭＰ（ｈＴＩＭＰ）の調製 （ａ） 抗ｈＴＩＭＰモノクローナル抗体の調製 特開昭６３−２１９３９２号公報記載の方法に従ってウ
シ歯髄ＴＩＭＰに対するマウスモノクローナル抗体を調
製した。得られた１７種のクローンの内、ｈＴＩＭＰと
交差反応を示すクローン番号、７−６Ｃ１、７−２１Ｂ
１２および７−２３Ｇ９の融合細胞をＢａｌｂ／ｃマウ
スに投与し腹水を得た。得られた各腹水中のモノクロー
ナル抗体をＣｏｌｌａｇｅｎ Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．，７，
３４１−３５０，１９８７に記載のＫｏｄａｍａらの方
法に従って精製した。Preparation of human TIMP (hTIMP) (a) Preparation of anti-hTIMP monoclonal antibody A mouse monoclonal antibody against bovine dental pulp TIMP was prepared according to the method described in JP-A-63-219392. Of the 17 clones obtained, clone numbers 7-6C1 and 7-21B showing cross-reactivity with hTIMP.
The fused cells of 12 and 7-23G9 were administered to Balb / c mice to obtain ascites. The obtained monoclonal antibody in each ascites fluid was collected from Collagen Rel. Res. , 7,
Purified according to the method of Kodama et al., 341-350, 1987.

【００４５】（ｂ） ｈＴＩＭＰの精製 ｈＴＩＭＰはヒト歯肉線維芽細胞（Ｇｉｎ−１細胞）の
コンディション培養液より、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ
−４４、Ｃｏｎ Ａセファロース、抗ｈＴＩＭＰモノク
ローナル抗体（クローン番号，７−２１Ｂ１２）−セフ
ァロース・アフィニティー・カラムを用いて精製し、最
後に、３５℃、３０分間、４Ｍ塩酸グアニジン中で処理
した後、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ６０カラムにかけて、ｈＴ
ＩＭＰに結合している可能性のある細胞成長因子を解
離、分画によって除去した。(B) Purification of hTIMP hTIMP was purified from human gingival fibroblast (Gin-1 cell) conditioned medium by using Ultrogel AcA.
-44, Con A Sepharose, anti-hTIMP monoclonal antibody (clone number, 7-21B12) -purified using Sepharose affinity column, and finally treated with 4M guanidine hydrochloride at 35 ° C for 30 minutes, and then Bio. -On a Gel P60 column, hT
Cell growth factors possibly bound to IMP were removed by dissociation and fractionation.

【００４６】[0046]

【実施例】【Example】

実施例１ Ｇｉｎ−１細胞増殖に対するｈＴＩＭＰ−２濃度の影響 ヒト歯肉線維芽細胞（Ｇｉｎ−１）の増殖に対してダル
ベッコ変法イーグル（Ｄ−ＭＥＭ）培地にｈＴＩＭＰ濃
度を段階的に変えてその増殖程度をＡｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，３９，１９７−２０１，１９７１に記載のＨ
ｉｎｅｇａｒｄｎｅｒの方法に従って細胞中のＤＮＡ量
より調べた。後掲図１に示したように７日目の培養期間
中、ｈＴＩＭＰ−２濃度１０ｎｇ／ｍｌで最大活性を示
している。なお、１００ｎｇ／ｍｌ以上では逆にｈＴＩ
ＭＰ−２による増殖抑制がみられた。Example 1 Effect of hTIMP-2 Concentration on Gin-1 Cell Proliferation With respect to proliferation of human gingival fibroblasts (Gin-1), the hTIMP concentration was changed stepwise in Dulbecco's modified Eagle (D-MEM) medium. The degree of proliferation is anal. Bioc
hem. , 39, 197-201, 1971
The amount of DNA in the cells was examined according to the method of Inegardner. As shown in FIG. 1 below, the maximum activity was shown at a hTIMP-2 concentration of 10 ng / ml during the 7th day of culture. In addition, at 100 ng / ml or more, on the contrary, hTI
Growth inhibition by MP-2 was observed.

【００４７】実施例２、３ Ｋ−５６２細胞およびＲａｊｉ細胞に対するｈＴＩＭＰ
−２濃度の影響 ヒト慢性赤血球性白血病細胞（Ｋ−５６２）およびヒト
パーキットリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ）の増殖に対してＡ
ＳＦ１０４無血清培地にｈＴＩＭＰ濃度を段階的に変え
てその影響を調べたところ、後掲図２および図３に示し
たように７日目の培養期間中、ｈＴＩＭＰ−２濃度１０
ｎｇ／ｍｌで最大活性を示している。なお、１００ｎｇ
／ｍｌ以上では逆にｈＴＩＭＰ−２による増殖抑制がみ
られ、実施例３のＧｉｎ−１細胞の場合と同様な結果が
得られた。Examples 2, 3 hTIMP on K-562 cells and Raji cells
-2 Effect of concentration A on proliferation of human chronic erythroid leukemia cells (K-562) and human Parkit lymphoma cells (Raji) A
When the hTIMP concentration was changed stepwise in SF104 serum-free medium and its effect was examined, as shown in FIGS. 2 and 3 below, during the culture period on the 7th day, the hTIMP-2 concentration was 10%.
Maximum activity is shown at ng / ml. 100 ng
On the contrary, at a concentration of not less than 1 ml / ml, growth inhibition by hTIMP-2 was observed, and the same results as in the case of Gin-1 cells of Example 3 were obtained.

【００４８】実施例４ マウス由来ハイブリドーマ増殖に対するｈＴＩＭＰおよ
びｈＴＩＭＰ−２の効果 マウス抗ヒトトロンボモジュリンモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ（クローン番号、２１−４Ｇ３，ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１２２０１）増殖に対するｈＴＩＭＰ（１０
０ｎｇ／ｍｌ）およびｈＴＩＭＰ−２（１０ｎｇ／ｍ
ｌ）添加効果を調べたところ、図４に示したようにｈＴ
ＩＭＰでは効果を認められなかったが、ｈＴＩＭＰ−２
では増殖効果が有意に増大していることが認められる。Example 4 Effect of hTIMP and hTIMP-2 on proliferation of mouse-derived hybridoma Hybridoma producing mouse anti-human thrombomodulin monoclonal antibody (clone number, 21-4G3, FE)
HTIMP (10 for RM P-12201) proliferation
0 ng / ml) and hTIMP-2 (10 ng / m)
l) When the effect of addition was examined, as shown in FIG.
No effect was observed with IMP, but hTIMP-2
In, it is recognized that the proliferative effect is significantly increased.

【００４９】実施例５ マウス由来コロン２６細胞の増殖に対するｈＴＩＭＰ、
ｂＴＩＭＰおよびｈＴＩＭＰ−２の効果 マウスコロン２６細胞（マウス直腸癌コロン２６細胞）
の増殖に対してｈＴＩＭＰ（１００ｎｇ／ｍｌ）および
ｈＴＩＭＰ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加しその効果を
調べた。図５に示したようにｈＴＩＭＰでは効果は認め
られなかったが、ｈＴＩＭＰ−２で増殖効果が有意に増
大していることが認められた。Example 5 hTIMP on proliferation of mouse-derived colon 26 cells,
Effects of bTIMP and hTIMP-2 Mouse colon 26 cells (mouse rectal cancer colon 26 cells)
The effect of hTIMP (100 ng / ml) and hTIMP-2 (10 ng / ml) was added to the growth of Escherichia coli. As shown in FIG. 5, no effect was observed with hTIMP, but it was found that the proliferation effect was significantly increased with hTIMP-2.

【００５０】以上から明らかなように、上記の実験結果
は、ＴＩＭＰ−２が明らかに広い範囲の細胞の増殖に深
い関わりをもっていることを示しているものである。特
にｈＴＩＭＰは、マウス由来細胞やマウス由来ハイブリ
ドーマにその増殖効果をもたなかったが、ｈＴＩＭＰ−
２でその効果が認められた。As is clear from the above, the above experimental results clearly show that TIMP-2 is deeply involved in the proliferation of cells in a wide range. In particular, hTIMP had no proliferative effect on mouse-derived cells or mouse-derived hybridomas, but hTIMP-
The effect was recognized in 2.

【００５１】本発明は、天然のＴＩＭＰ−２またはリコ
ンビナントＴＩＭＰ−２を単独であるいはＴＩＭＰと組
み合わせて合成人口培養液中に加えることにより、これ
まで、合成人工培養液中では細胞増殖が困難であった
り、細胞増殖が制限されていた細胞の増殖を行うことを
可能にしたものであり、細胞培養を用いる諸研究や、さ
らに、工業レベルへの応用等、これらの分野での進歩に
大きな貢献をするものである。According to the present invention, natural TIMP-2 or recombinant TIMP-2, alone or in combination with TIMP, is added to a synthetic artificial culture medium, and thus it has been difficult to grow cells in a synthetic artificial culture medium. In addition, it has made it possible to grow cells whose cell growth was limited, and contributes greatly to progress in these fields such as various studies using cell culture and further application to industrial level. To do.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】Ｄ−ＭＥＭ無血清培養液中でのヒトＧｉｎ−１
細胞増殖に対するｈＴＩＭＰ−２のもたらす添加効果を
示す図であり、FIG. 1 Human Gin-1 in D-MEM serum-free medium
It is a figure which shows the addition effect which hTIMP-2 brings to cell proliferation.

【図２】ＡＳＦ１０４無血清培養液中でのヒトＫ−５６
２細胞増殖に対するｈＴＩＭＰ−２のもたらす添加効果
を示す図であり、FIG. 2. Human K-56 in ASF104 serum-free medium.
FIG. 2 is a graph showing the effect of addition of hTIMP-2 on the proliferation of 2 cells,

【図３】ＡＳＦ１０４無血清培養液中でのヒトＲａｊｉ
細胞増殖に対するｈＴＩＭＰ−２のもたらす添加効果を
示す図であり、FIG. 3. Human Raji in ASF104 serum-free medium.
It is a figure which shows the addition effect which hTIMP-2 brings to cell proliferation.

【図４】ＰＲＭＩ１６４０無血清培養液中でのマウス抗
ヒトトロンボモジュリンモノクローナル抗体産生細胞ハ
イブリドーマ増殖に対するｈＴＩＭＰおよびｈＴＩＭＰ
−２のもたらす添加効果を示す図であり、FIG. 4 hTIMP and hTIMP against proliferation of mouse anti-human thrombomodulin monoclonal antibody-producing cell hybridomas in PRMI1640 serum-free medium.
2 is a diagram showing an addition effect brought by -2;

【図５】マウスコロン２６細胞増殖に対するｈＴＩＭ
Ｐ、ｂＴＩＭＰおよびｈＴＩＭＰ−２の添加効果を示す
図である。FIG. 5: hTIM on mouse colon 26 cell proliferation
It is a figure which shows the addition effect of P, bTIMP, and hTIMP-2.

【００５２】[0052]

【表５】 [Table 5]

【００５３】[0053]

【表６】 [Table 6]

【００５４】[0054]

【表７】 [Table 7]

【００５５】[0055]

【表８】 [Table 8]

【００５６】[0056]

【表９】 [Table 9]

【００５７】[0057]

【表１０】 [Table 10]

【００５８】[0058]

【表１１】 [Table 11]

【００５９】[0059]

【表１２】 [Table 12]

【００６０】[0060]

【表１３】 [Table 13]

【００６１】[0061]

【表１４】 [Table 14]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification code Office reference number FI technical display location C12R 1:91)

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ティシュ・インヒビター・オブ・メタロ
プロテイナーゼ−２を含有せしめたことを特徴とする組
織培養用無血清培地。1. A serum-free medium for tissue culture, which contains tissue inhibitor of metalloproteinase-2. 【請求項２】 ティシュ・インヒビター・オブ・メタロ
プロテイナーゼ−２を細胞増殖成長因子として用いて、
動物組織細胞あるいは動物由来の融合細胞をティシュ・
インヒビター・オブ・メタロプロテイナーゼ−２含有組
織培養用無血清培地中で増殖させることを特徴とする細
胞増殖方法。2. Using tissue inhibitor of metalloproteinase-2 as a cell growth growth factor,
Tissue tissue cells or animal-derived fused cells
A method for cell proliferation, which comprises proliferating in a serum-free medium for tissue culture containing inhibitor of metalloproteinase-2.