JPH06510850A - Ｍｈｃ−分子のペプチドモチーフの決定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｍ　Ｍ　Ｃ−分子のペプチドモチーフの決定本発明は、主要組織適合遺伝子複合 体（ＭＨＣ）の分子のペプチドモチーフもしくは一エピトープの決定法、並びに 、これにより決定されたペプチドモチーフ、及び診断薬又は治療薬を製造するた めのその使用に関する。

細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、ＭＨＣ−コードされた分子と結合した抗原 ペプチドモチ−フを認識する。この現象を、ＭＨＣ−拘束（ＭＨＣ−Ｒｅｓｔｒ ｉｋｔｉｏｎ）という（文献、１〜５）、ヒトＭＨＣクラスＩ−分子、ＨＬ　Ａ 　−２Ａ　ｗ　６８の結晶学は、重鎖のα１−及びα２−ドメインにより形成さ れるスリット（Ｓｐａｌｔ）を生じた（文献：３．６）、このスリットは、抗原 ペプチドエピトープに関する結合部位であると思われる。それというのも、この 双方の結晶は、ＭＨＣ−配列と適合せずに、このスリットに接して存在している 大きさのペプチドの構造を有するからである（文献、６）。

細胞障害性Ｔリンパ球が、異常な特徴に関して細胞を試験することができるため には、これらのペプチドが細胞内タンパク質に由来し、かつ細胞表面に存在して いると考えられている。Ｔ−細胞エピトープを表出する、予めＭ　ＨＣ−会合さ れた（ａｓｓｏｚｉｉｅｒｔｅ）　ヘブチドを、普通の又はウィルス感染した細 胞から抽出した（文献：２．４．５．７．８）。相当する方法で、ＭＨＣクラス ＩＩ拘束Ｔ細胞により認識される抗原も、合成ペプチドにより模倣され得（文献 ；９）、ＭＨＣ−会合された抗原ペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩ−分子から溶離 した（文献、１０）。Ｔ−細胞受容体、ペプチド及びＭＭＣ−分子からなる３分 子複合体（文献；１１）の真中のその位置に基づいて、Ｔ−細胞エピトープは、 特異的免疫系の中心点であり、がっ従って、その発生の法則性の理解並びに決定 法に対する多くの必要性がある（文献、１２〜１５）。

本発明による課題は、 （ａ）ＭＨＣ−分子を含有する細胞の溶解により細胞抽出物を得、 （ｂ）ＭＭＣ−分子を、その上に存在するペプチド混合物と共に、免疫沈降によ り細胞抽出物から分離し、（Ｃ）ペプチド混合物を、ＭＭＣ−分子及びその他の タンパク質成分から分離し、 （ｄ）個々のペプチド又は／及びその混合物を配列決定し、かつ （ｅ）得られた、殊に混合物の配列決定又は一連の個々のペプチドの配列決定の 情報から、対立遺伝子特異性ペプチドモチーフ（ａｌｌｅｓｐｅｚｉｆｉｓｃｈ ｅ　Ｐｅｐｔｉｄｍｏｔｉｖ）を引き出すことを特徴とする、 クラス■又はＩＩの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の対立遺伝子特異性ペ プチドモチーフを決定する方法により解決される。

本発明方法により、法則性を有し、そのＭＨＣ−分子に応じてペプチドを選択し 、かつ提示する、ペプチドモチーフが決定される。

本発明の方法は、クラスＩのＭＨＣ−分子を用いても、クラスＩＩのＭＨＣ−分 子を用いても実施することができ、その際、クラス■のＭＭＣ−分子が有利であ る。Ｈ−２に’−５Ｈ−にゝ−１Ｈ−２Ｄ’−１Ｈ−２に’、Ｈ−２Ｋ”又ｉ＊ ＨＬＡ−Ａ＊０２０１又ＧｔＡ＊０２０５−分子は、殊に有利である。

本発明方法によるＭＨＣ−分子の免疫沈降の際に、それぞれ、所望のＭＨＣ−分 子に関して特異的である適当な抗体を使用する０本発明の使用のために有利なＭ ＨＣ−クラス■−分子は、分子Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ９、Ａｌ０１Ａｌ　１．Ａ ２８、Ａ２９、Ａ　ｗ　１９、Ｂ５、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１２〜８１８、Ｂ２１、Ｂ ３５及びＢ３７を包含するが、これらに限定されない０本発明による使用のため に有利なＭＭＣ−クラスＩＩ−分子は、分子ＤＲ１，ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４、 ＤＲ５、ＤＲｗ６、ＤＲ７、Ｄｗｌ、Ｄｗ２及びＤｗ３を包含するが、これらに 限定されない。Ｈ−２に’−又はＨ−２Ｄ’−分子の決定のためには、例えば、 Ｋ’−特異性抗体（文献、２５）又はＤｌ−特異性抗体（文献：２６）を使用す る。有利には、モノクロナール抗体を使用するが、相当する精製したポリクロナ ール抗血清の使用も可能である。本発明により使用することができる抗体は、当 業者によく知られた標準技術を用いて、新たに製造することができる０本発明で 使用することができる抗体の例は、Ａ　Ｔ　ＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｒｙｐｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　 Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ２０８５２）の「カタログ・オブ・セ ル・ライング・バイブリド−マス（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉ ｎｅｓ　ａｎｄ　Ｈｙｄｒｉｄｏｍａｓ）　Ｊ中に記載されているＨＬＡ−抗原 に対する全ての抗体を包含するが、これらに限定されない。

有利な例（ＡＴＣＣ−命名法）は、ＨＢ８２．１１７．１６６．５４．１２２． １６４．９５．１２０．１１６．１１８．９４．１５２．１７８．５６．１１５ ．１５７．１１．９．５９．１０５．１６５．１４４．１８０．１０３．１１０ ．１０９．１５１及び１０４を包含する。カタログ中に記載されているマウス− Ｈ−２−抗原に対する全ての抗体は、同様に、本発明で使用することができる。

固相結合した抗体による免疫沈降は、殊に有利に行なわれる。固相結合した抗体 は、当業者に公知の方法で、例えば抗体と、ブロムシアン活性化されたセファロ ース４Ｂ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　Ｌ　Ｋ　Ｂ　）とを結合させ ることにより製造することができる。本発明で使用するための抗体に結合させる ことができる他の固相の例は、アガロース、セルロース、セファデックス、プロ ティンＡ−セファロース及びプロティン−〇−セファロースを包含するが、これ らに限定されない、免疫沈降の有利な方法は、臭化シアン活性化されたセファロ ース４Ｂ（例１参照）から製造された小球に結合している抗体を用いる、吸着ク ロマトグラフィーである。

ＭＨＣ−分子及びその他のタンパク質成分がらの、決定すべきペプチド混合物の 分離は、クロマトグラフィー法により、特に逆相−ＨＰＬＣにより行なうのが有 利である。その際、トリフルオロ酢酸／　Ｈ２０−トリフルオロ酢酸／アセトニ トリル−勾配で分離を行なうことは、有利であることが判明した。ＭＭＣ−分子 からペプチド混合物を分離するための本発明により使用することができる他の方 法は、イオン交換、ゲル濾過、電気焦点泳動、高性能毛管電気泳動（ＨＰＣＥ） 及びゲル電気泳動（ＨＰＣＥ）を包含するが、これらに限定されない。分離を実 施するためのもう１つの方法は、超遠心分離であり、その際、３０００Ｄａ又は ５０００Ｄａ又は１００００Ｄａの透過性を有する膜を使用する。ＨＰＬＣを用 いる分離が、有利に実施される。

ペプチド混合物のクロマトグラフィー分離の際に、多くの場合に、固有のペプチ ド種を単離することができる。従って、本発明方法の工程（ｄ）は、ペプチド混 合物の配列決定（これにより、それぞれのＭＨＣ−分子のペプチドモチーフに関 する共通配列が決定される）又は／及び明確なペプチドの配列決定よりなる。

ペプチドモチーフの決定に関する出発物質として、正常細胞、腫瘍細胞も、ウィ ルス又はこのような病原体により感染した細胞も、並びに試験管内で培養したヒ ト又は動物の細胞も使用することができる０本発明で使用することができる正常 細胞は、新しい細胞、例えば抹消血液リンパ球、牌臓、肺、胸腺の細胞又はＭＭ 　Ｃ−分子を表現する他の組織の細胞を包含するが、これらに限定されるもので はない１本発明で使用した腫瘍細胞系には、腫瘍細胞ＥＬ４及びＰ８１５を包含 するが、同様に、これらに限定されるものではない。

本発明により使用することができるウィルス感染した細胞は、これらに限定され るものではないが、エプスタイン−バール−ウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒ ｒ−Ｖｉｒｕｓ）により形質転換されたヒトＢ−細胞であるＪＹ−細胞を包含す る。本発明方法により決定されたペプチドモチーフは、次の基本原理に相当する ・ ａ）これらは、ＭＨＣ−クラス■−分子の場合には、アミノ酸８．９．１０又は １１個、並びにＭＨＯ−クラスＩＩ−分子の場合には、アミノ酸８〜１５個の対 立遺伝子特異性ペプチドの長さを有する。

ｂ）これらは、２個のアンカー位置（Ａｎｋｅｒｐｏｓｉｔｉｏｎ）（「アンカ ー位置」なる名称は、位置が固有のアミノ酸残基の強いシグナルを示すか、又は 位置が非常によく類似した側鎖を有する僅かなアミノ酸残基で占められる場合に 使用する）を有し、そのうち、１個のアンカー位置は、常にＣ−末端に存在し、 かつしばしば脂肪性であり、かつ Ｃ）ペプチドは、もちろん、正常の、ウィルス感染した、他の方法で感染した、 又は遺伝子を用いて形質転換したか、又は抗原を負荷した細胞のＭＨＣ−分子上 に提示される。

ＭＭＣ−クラスニー分子Ｈ２に’、Ｈ２Ｋ”、Ｈ２Ｄ５及びＨＬＡ−Ａ２からの 自己ペプチド混合物の配列決定は、クラスニー分子のそれぞれにより提示される 、それぞれ異なる対立遺伝子特異性ペプチドモチーフを示す、に６、Ｄｂ及びＡ ２により提示されたペプチドは、９量体である一方、Ｋ５−提示ペプチドは８量 体であり、その際、相当するペプチドモチーフは、固有のアミノ酸残基又はよく 類似した側鎖を有する僅かな数のアミノ酸残基で占められている、２個のアンカ ー位置を含有する。これらのアンカー位置は、異なるモチーフの場合には、同じ 位置に存在せず、これらは、例えば位置５及び９　（Ｄ″）又は位置２及び８（ Ｋ６、Ａ２）又は位置５及び８（Ｋ１′）に存在しうる。全てのモチーフのＣ− 末端アンカー基は、疎水性アミノ酸である。

アンカー位置に存在しないアミノ酸残基は、かなり可変性であってよいが、いく つかは特に特定のアミノ酸で占められ、例えば、Ｋｄ−モチーフの位置４にＰｒ ｏ、Ｋ５−モチーフの位置３にＴｙｒが見られ、かつ疎水性基は、Ｄ５−モチー フの位置３及びＡ２モチーフの位置６で優勢である。Ｈ−２Ｌ’のためには、ア ンカー基は、位置２のプロリンであった。

本発明方法により得られた結果は、ＭＨＣ−クラスニー分子で結晶学的に見られ たスリットの構造に非常に良好に相当する（文献；３．６）。異なるＭＭＣ−ク ラスニ一対立遺伝子は、このスリットのところの、異なるポケット（Ｔａｓｃｈ ｅｎ）の存在により異なっている。

このことは、おそらく、ポケットが、それぞれ異なるアミノ酸を収容しうろこと に起因する。従って、ＭＨＣ−結晶中の対立遺伝子特異性ポケットと対立遺伝子 特異性アンカー基の側鎖とは、おそらく相補的構造を示す。

本発明のもう１つの課題は、診断薬又は治療薬の製法における、本発明によるペ プチドモチーフの使用である。このペプチドモチーフの可能な使用範囲は、ＭＨ Ｃ−分子の診断学的証明である。ＭＨＣ−分子は、ペプチドのその個々の特異な 結合により特徴付けられるので、［２基のペプチドを介しての結合証明を行なう ことができ、その際、標識基として、例えばビオチン基又は蛍光基をペプチドと 結合させる。当業者に公知の他の標識は、同様に、本発明で使用することができ る。この標識は、これらに限定されるものではないが、例えばペプチドのチロシ ン基に結合したＩｌｌ　ｌ又はＩｌｌ　ｌ、又は３Ｈ又は１°Ｃ（双方は、合成 の間にペプチド中に取り込まれる）のような放射性標識を包含する。標識のペプ チドへの結合は、当業者に公知の方法により達成することができる。標識は、非 −アンカー位置で行なうのが有利である。このような方法で分かった、自己免疫 疾患の発生と、疾病特異性ペプチドモチーフを有するＭＨＣ−分子の表現との間 の相関関係を、診断学的に使用することができる０本発明のペプチド配列の試験 管内での診断学的使用の例は、これらに限定されないが、次のものを包含する。

ＭＨＣ−分子の結合特異性の測定、ＭＭＣ−分子の結合特異性と疾病との相関関 係付け、及び興味深いＭＨＣ−分子をペプチド−パンク（試験したモチーフに合 うペプチドの混合物）のＨＰＬＣ−フラクションで表現する、適当な細胞のイン キュベーションによる未知の起源のＴ−細胞エピトープの配列の決定、及び天然 のＴ−細胞エピトープとＴ−細胞エピトープとして認識された合成ペプチドとの クロマトグラフィー比較により行なわれる、Ｔ−細胞により認識されたペプチド の決定（Ｎａｔｕｒｅ　３４８：２５２−２５４（＋９９０））。

本発明のもう１つの課題は、免疫系の障害又は腫瘍疾病を治療するための医薬の 製法における本発明によるペプチドモチーフの使用である。殊に、本発明のペプ チドモチーフは、自己免疫疾患における干渉（予防及び治療）のために、例えば 一定のＭＨＣ−分子の遮断並びにＴ−細胞のペプチド特異的非−反応性の誘導に より使用することができる。更に、移植拒絶反応及び移植片対宿主反応（Ｇｒａ ｆ　ｔ−ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ−Ｒｅａｋｔ　１ｏｎｅｎ）における干渉が、 同様の方法で可能である。更に、本発明によるペプチドは、腫瘍細胞に対するＴ −細胞の誘導又は強化もしくは増強のために、殊に腫瘍疾病に対するワクチン化 及び存在する腫瘍疾病の治療のために、試験管内及び生体内で使用することがで き、その際、殊に、いわゆる移植片対白血病作用（Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ− Ｌｅｕｋａｅｍ　ｉ　ａ−Ｅｆ　ｆ　ｅｋｔ）　（Ｓｕ　Ｉ　ｌ　１ｖａｎ等、 Ｎ、Ｅｎｇ１．Ｊ、Ｍｅｄ、３２０：８２８〜８３４）を利用することができる 。本発明によるペプチドは、同様に、感染方法（ｉｎｆｅｋｔｉｏｅｓｅ　Ｍｉ ｔｔｅｌ）又は腫瘍に関して特異的であるＭＨＣ−結合ペプチドを生体内で使用 することにより、感染性又は悪性疾病に対するＴ−細胞応答を強化するために使 用することができる。三者選択的に、Ｔ−細胞は、動物から得ることができ、そ の数を、試験管内で、ペプチドの使用及びサイトカイン、例えばインターロイキ ン２、インターロイキン４又はインターロイキン６を包含する適当な成長条件の 使用により増加させ、かつ引き続き、患者に戻すことができる。本発明によるペ プチドは、更に、Ｔ−細胞により攻撃可能な抗原を発現する、次のものを包含す るがこれらに限定されない全ての腫瘍。

黒色腫、乳癌、ウィルス起源の腫瘍、例えばバーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｉｔ ｔｓｌｙｍｐｈｏｍ）、及びヒト乳頭腫ウィルスによるような腫瘍、例えば頚部 ガン腫及び他の生殖器（ａｎｏｇｅｎｉｔａｌｅ）腫瘍を治療するために使用す ることができる。Ｔ−細胞受容体一分子又は抗体分子に起因するペプチドは、更 に、免疫調節的機構の、目的とする処置のために、殊に、自己免疫疾病及び移植 拒絶反応並びに移植片対宿主反応の治療のために使用することができる。予防の ための、本発明によるタンパク質の生体内使用において、その使用は、これらに 限定されるものではないが、次のものを包含する；感染性又は悪性疾病に対する ペプチドワクチンとして、及び組換え接種物質（ウィルス、例えばワクシニア菌 又はバクテリア、例えばサルモネラ又はマイコバクテリアを含む）及び組換えバ クテリア（例えばＥ、コリ）又は他の細胞（酵母−１昆虫−、マウス−又はヒト 細胞を含む）の使用により製造されたタンパク質を含む他の全ての種類の接種物 質中への本発明によるタンパク質の導入のための適当なＴ−細胞エピトープに関 する本発明で集められた情報の使用。

本発明のペプチドの用量又は濃度は、当業者により常法で決めることができる。

これらは、生体内で、ｌＯμｇ〜１ｇの範囲で予想することができる。試験管内 濃度は、１フ工ムトモル〜１マイクロモルの範囲で予想することができる。生体 内投与は、これらに限定されないが、皮下、筋向、静脈内、腸管内及び経口法を 包含する。

治療的使用において、本発明によるペプチドモチーフに相当し、Ｎ−又は／及び Ｃ−末端が親油性もしくは両親媒性基、殊に親油性ペプチド−へソックスと共有 結合するペプチドが有利である。このような基の例は、トリバルミトイル−８− グリセリルシステイニル−セリルセリンである。

本発明を、次の例により、図１と結び付けて、明らかにする。

次のものを示す。

図１ａは、Ｐ８１５ライゼート（Ｌｙｓｓａｔ）からの抗−に６−抗体を用いて 分離した物質のＨＰＬＣ−特徴、図１ｂは、１ａからのクロマトグラムの１部拡 大部分（フラクション１５〜３５）、 図１ｃは、ｌｂ中の矢印を付した部分の自己ペプチドの再クロマトグラフィー。

例Ｉ Ｐ８１５−腫瘍細胞（Ｈ−２に’）１０〜２０×１０９をベレット化し、かつ０ ．５％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ２Ｏ２５０ｍ１と共に、フェニルメチル スルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）Ｏ，１ミリモル／ｌを有するリン酸塩緩衝さ れた塩溶液（ＰＢＳ）中で、３０分間、４℃で撹拌した。上澄を、２５０ｇで５ 分間及び１５００００ｇ及び４°Ｃで３０分間で遠心分離し、次いで、吸着クロ マトグラフィー装置に導いた。この吸着クロマトグラフィー装置は、それぞれ約 １ｍｌの層容量を有するカラム３個からなった。カラム物質は、製造元の記録に よりブロムシアン−活性化されたセファロース４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　 ＬＫＢ）がら製造された、抗体−結合したもしくはグリシン−結合した小粒から なった。抗体としては、Ｋ６−特異性抗体２０２０−８−４８（Ｉ　２ａ、ｋａ ｐｐａ；２５）又はＤ−一特異性抗体Ｂ２２−２４９それぞれ５ｍｇを小球１　 ｍ　ｌに結合させた。細胞抽出物の上澄を、先ず、グリシン−結合した小球を有 するカラムに、次いで、抗−に６−小球を有するカラムに、かつ次いで、偽沈降 （Ｓｃｈｅｉｎｐｒａｅｚｉｐｉｔａｔｉｏｎ）のために抗−Ｄ５−小球上に導 いた。

小球を、全ての３個のカラムがら除去し、がっ０゜１％トリフルオロ酢酸と共に １５分間渦動させた（文献、７）。上澄を真空遠心分離により乾燥させ、がっ逆 相ＨＰＬＣにより、スーパーバック（Ｓｕｐｅｒｐａｃ）　ＰｅｐＳカラム（Ｃ ２／Ｃｌ　８　；　５μｍ粒子、４．ＯＸ２５０ｍｍ、７フルマシア（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）　Ｌ　Ｋ　Ｂ　）及びファルマシアＬＫＢ−装置の使用下で分離し た（文献：４）。溶離剤　溶液Ａ　Ｈ，０中のＯ，１％トリフルオロ酢酸（ｖ／ ｖ）、溶液Ｂ　アセトニトリル中の０゜１％トリフルオロ酢酸。

図１ａ及びｂ中に示したクロマトグラフィー分離のために、次の勾配を使用した 。

０〜５分、Ａ１００％ ５〜４０分、８６０％まで直線的に増大４０〜４５分、Ｂ６０％ ４５〜５０分、ＢＯ３まで減少 流速：　１ｍｌ／分、フラクション量：１ｍｌ。

個々のフラクションを集め、がっ真空遠心分離により乾燥させた。

図１は、免疫沈降され、かつトリフルオロ酢酸処理されたに６−分子のＨＰＬＣ −分離を示す９図１ａは、抗−に’（実線）もしくは抗−Ｄ”（点線）を用いて Ｐ８１５−ライゼートから沈降させた、ＴＦＡ処理した物質のＨＰＬＣ−特徴を 示す、フラクション２０〜２８の間で、目標対立遺伝子特異性ペプチド混合物で ある不均一物質が、僅かな量溶離する。

フラクション２０〜２８は、Ｋ１−バッチ（Ａｎｓａｔｚ）からも、偽沈降によ っても集められた。双方のバッチを、エドマン分解法の使用下で自動的に配列決 定した（　Ｅｄｍａｎｎ等、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ｌ：８Ｏ−９１（１ ９６７））　、このエドマン分解を、オンラインＰＴＨ−アミノ酸分析機１２０ 　Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ　（：ｉｔｙ、Ｃ ：Ａ、９４４０４゜ＵＳＡ　）を備えたタンパク質シークエンサー４７７Ａ中で 実施した。ガラス繊維フィルターを、バイオブレーン・プラス（ＢｉｏＰｒｅｎ ｅ　Ｐｌｕｓ）　１　ｍ　ｇで被覆し、がっ前復環（ｐｒａｅｚｙｋｌｉｓｉｅ ｒｔ）させなかった。この配列決定を、標準プログラム　ＢＥＧＩＮ−１及びＮ 　ＯＲＭ　Ａ　Ｌ　−１（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の使用下に 実施した。システィンは修飾されず、かつ従って確認されながった。

エドマン法は、それぞれクロマトグラフィーにより同定されるＮ−末端の逐次誘 導体化及びアミノ酸除去を包含する。ペプチドの錯体混合物を配列決定すること は異例であるので、配列決定結果がら直接得られたデータを提示する。第１ａ表 及びｂは、Ｋ６−溶離したペプチドに関する、２種の配列決定試験がらの結果を 示す。第１ｃ表は、Ｐ８１５−ライゼートのＤｂ−特異性抗体での偽溶離の配列 決定結果を示す、Ｋａ−溶離したペプチドは、１〜９の各位置に明らかなアミノ 酸形を１個有し、偽溶離した物質は、それぞれの基の吸収量を減少しながら、そ れぞれのサイクルにおいて、例外なく、同じ形のアミノ酸形を示している。に６ −溶離したペプチドにおいては、前又は前の前のサイクルと比較して５０％より 多いピークが絶対量で示され、重要とみなされ、かつ下線を引いた。最初の位置 は、評価することが困難である。それというのも、前のサイクルが存在せず、が っ更に、ＨＰＬＣ−プール（Ｐｏｏｌ）中に存在する、全ての遊離アミノ酸がこ の位置で確認されるからである。第２の位置に関して、以前のサイクルと比較し てその頻度が明らかに高い固有の基は、チロシン（例えば第１ａ表で６０．９ｐ ｍ。

ｌから８７５．６ｐｍｏｌに）である。（僅がな）ピークを示す他の固有の基は 、Ｔｙｒに類似した側鎖を有するフェニルアラニンである。このことは、天然の に６−拘束インフルエンザ−エピトープ（ＴＹＱＲＴＲＡＬＶの配列を有する） と他のに６−拘束ペプチドとの比較から、位置２のチロシン基を考慮した場合に 得られる仮定を裏付けする。これに反して、続く位置３〜８に関して特徴的であ る、定義されたアミノ酸基は存在しない。個々の位置において、１４個までの種 々異なる基が見つけられる。位置９には、Ｉｌｅ及びＬｅｕが見つけられる。位 置１０にシグナルピークはな（、このことは、多くのに６−結合した自己ペプチ ドが９個より長い基でないことを示唆している。従って、天然のに６−拘束イン フルエンザ−エピトープは、ノナペプチド（Ｎｏｎａｐｅｐｔｉｄ）　（文献： ４）である、この結果から、由来する共通配列形を、第１ｃ表中に示す。

大抵、目に付くのは、位置２のＴｙｒ、及び位置９のＴｉｅ又はＬｅｕであり、 他の全ての位置には、より多数の基が見られる。このモチーフと、Ｋ６−拘束エ ピトープを含有するペプチド配列との比較は、そのほとんどかに６−拘束共通子 ツマーモチーフに良好に合致することを示す（第１ｄ表）。

図１ｂのフラクション２９中で矢印を付したピーク及び偽沈降の相当するフラク ションを、高い溶解性下に新たにクロマトグラフィーにかけたが、その際、ワラ クシ３ン容量は０．５ｍｌであった（図１ｃ）。急な特異的なピークは、直接配 列決定により決定されたアミノ酸配列５ＹＦＰＥＩＴＨＩを有するペプチドであ った。合成５ＹＦＰＥ　ＩＴＨ［−ペプチドとの天然細胞ペプチドの同一性は、 共溶層（Ｃｏｅｌｕｔｉｏｎ）によりＨＰＬＣで証明された（図１ｃ）。この配 列は、フラクション２０〜２８のプールがらの共通モチーフに合致しく図１ａ、 ｂ）、このことにより、特異なに’−拘束ベブチドモチーフ（第１ｄ表）の存在 が証明される。

〉ヨ；；ｉｔ”￥ｉ＋；；−二＝；二ｉ１四市：；Ｉ：二’ｉ”：　：：　ｊ　 Ｆ；　：二＝・バ電叶＝；四；≧１；：′″：ｌ：：ｌ：：　：：：：二本：： ：・ミ＝＋：；；；’旨：ｔ１ドコ：：：　：：：：：；：：：ス：ニ第１ｄ表 に６−拘束ペプチドモチーフ 位　置 優性アンカー基　Ｙ　Ｉ 強い　ＮＰＭＫＴ Ｉ　ＦＮ 弱い　Ｋ　Ｆ　Ａ　Ａ　Ｖ　ＨＰ　Ｈ Ａ　ＨＥＮＩＨＥ ＲＶＳＤＭＤＫ Ｓ　ＲＤＩＹＥＶ Ｖ　Ｓ　ＨＬＶＱＶ Ｔ　ＦＮＳＲ３Ｆ 公知のエピトープ＊　タンパク賃源　文献箇所ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ　−１’　ン Ｖルｘンザ　ＰＲ８ＮＰ　１４７−１５４　４．２９ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ　自己 ペプチド　Ｐ８１５ＩＹＡＴＶＡＧＳＬ　インフルエンザ　ＪＡＰ　ＨＡ　５２ ３−５４９　３０，３１ＶＹＱＩ　ＬＡＩＹＡ　インフルエンザ　ＪＡＰ　ＨＡ 　５２３−５４９　３０．３１１ＹＳＴＶＡＳＳＬ　インフルエンザ　ＰＲ８Ｈ Ａ　５１８−５２８　３２ＬＹＱＮＶＧＴＹＶ　インフルｘン４１’　ＪＡＰ　 ＨＡ　２０２−２２１　３０，３１ＲＹＬＥＮＧＫＥＴＬ　）ＩＬ＾−＾２４１ ７０−１８２３３　３３ＲＹＬＫＮＧＫＥＴＬ　）ＩＬ＾−Ｃｗ３１７０−＋８ ６　３４ＫＹＱＡＶＴＴＴＬ　Ｐ８１５　ｍ瘍−抗体　３５ＳＹＩＰＳＡＥＫＩ 　プラスモジウム・ペルゲイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｂｅｒｇｈｅｉ）ＣＳＰ 　２４９−２６０　３６ ＳＹＶＰＳＡＥＱＩ　プラスモジウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｙｏｅ ｌｉ）ＣＳＰ　２７６−２８８　３７ ＊に６−拘束Ｔ−細胞エピトープを含有することで知られているペプチドを、そ のＴｙｒ−基により合致させた。自然にプロセシングされることが知られている ペプチドには下線を引いた。

例２ に′−及びＤ５−分子からのペプチドの溶離Ｅ　Ｌ　４−１ｍ瘍細胞（Ｈ−２″ ′）からのデタージェントーライゼート（Ｄｅｔｅｒｇｅｎｚ−Ｌｙｓａｔｅ） を、例えば例１で記載したようなに５−特異性及びＤｌ−特異性抗体を用いて免 疫沈降させた。ＤＩ′−抗体としてはＢ２２−２４９（例１参照）を、及びに５ −抗体としてはに９−１７８　（ＩｇＧ　２ａ、Ｋ、２７）を使用した０ＭＨＣ −分子から解離したペプチドを、逆相ＨＰＬＣにより分離した。Ｋｂ−もＤ５− 物質も、例１からのに’−物質にいくらか相当する特徴を有して溶離され、その 際、しかしながら、フラクション２０〜２８の間で溶離された不均一物質は明ら かな相違を生じた。

Ｄ５−拘束ペプチドモチーフ Ｄｂ−パッチからの集めたフラクション２０〜２８を配列決定した（第２ａ、ｂ 表）。位置２〜４は、多くの基を含有した。これに反して、サイクル５は、Ａｓ ｎに関する強いシグナルを示した。従って、Ｄｂ−溶離された自己ペプチドの位 置５の優勢基は、Ａ　ｓ　ｎである。Ａ　ｓ　ｐに関する弱いシグナルは、配列 決定条件下でＡｓｎがＡｓｐへ加水分解することに起因する。

位置６〜８は、異なる証明可能な基５〜１４個を含有した。位置９は、Ｍｅｔに 関する強いシグナルを有し、１１ｅに関する中間のシグナル及びＬｅｕに関する 弱いシグナルを有した（全て疎水性）。（Ｄ”−拘束エビトープ中のＭｅｔ又は Ｉｌｅの条件は、既に記載されている。１７参照）、、位置ＩＯにはシグナルが なく、このことは、ＤＩ′−提示された自己ペプチドがノナペプチドであること を示唆している。この結果により決定された共通モチーフを第２ｃ表中に示す。

このモチーフと、天然のＤ５−拘束ペプチド及びＤｌ−拘束エピトープを含有す る他のペプチドとの比較は、位置５のＡ　Ｓ　ｎが、Ｄｌ−拘束ペプチドモチー フの不変のアンカー基でありうることを示す、Ｄｌ−拘束エピトープの他の基は 、第２のアンカー位置のように見える（Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕを有する）位 置９以外、著しく異なっている。

−６’、：：、、：１，１．１’；ｌ：：’　ご：：：：：ｌ　：ｌゴ：二−ａ ；’；”−；ｌ：’；Ｅ’ｌ：：：　東：：ｌ：：：Ｉ：；ｌ：’ｌ’；：：、 　：　；　：：　：コ″：　、；Ｉ　：　：’　；　、：　；　：；　：　：” ｌ　：’　；ｌ　：’　：１≦：　ｉ＋　；　’ｌ：　’ｉｌ　：ｉ　：：：： 　、ｍ　：’　：；ｌ　’：　’；　；目：；ニー弓：：：：”、−：：：　； ：＝：’：：’ｌ：ｌ：＝：’：：；　Ｗ：　５　；　：　：ニー＝に：’ｌ： ：　；：；：’：ｌ；’ｌ：：’：Ｆ第２ｃ表 Ｄｌ−拘束ペプチドモチーフ 位　置 優性アンカー基　Ｎ　Ｍ 強い　ＭＩＫ　Ｌ　１ 弱い　ＡＡＧＤ　ＡＤＦＬ ＮＱ　Ｔ　ＹＥＨ 公知のエピトープ　タンパク質源　文献箇所ＡＳＮＥＮＭＥＴＭ　インフルエン ザＮＰ　３６６−３７４１５４　４，２ＳＧＰＳＮＴＰＰＥ　Ｉ　アデノウィル ス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）　ＥＩＡ　３８ＳＧＶＥＮＰＧＧＹＣＬ　リンパ球 性脈絡髄膜炎ウィルス（ｌｙｍｐｈｏｚｙｔｅｎＣｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔ ｉｓ　Ｖｉｒｕｓ）　ＧＰ　２７２−２９３　３９ＳＡＩＮＮＹ、、、　シミア ンウィルス（Ｓｉｍｉａｎ　Ｖｉｒｕｓ）４０　Ｔ　１９３−２１１　４０ に５−拘束ペプチドモチーフ に″′−バッチからの集めたフラクション２０〜２８を配列決定した（第３ａ、 ｂ表）、位置３は、Ｔｙｒに関する強いシグナル及びＰｒｏに関する弱いシグナ ルを有する０位置４は、５個の基に関する弱いシグナルを示した。Ｐｈｅ及びＴ ｙｒに関する強いシグナルが、これらの双方の基を位置５で優勢にする１次の双 方の位置は、５個もしくは３個のシグナルを含有する。

位置８はＬｕｅに関する強いシグナル、Ｍｅｔに関する中間のシグナル及びＩｌ ｅ及びＶａｌに関する弱いシグナルを示した。位置９は、何かの基に関するピー クは示さず、このことは、８量体である（文献；５）公知のＫｂ−拘束天然のペ プチドの長さと合致する。

Ｋゝ−拘束共通モチーフの分析及びエピトープとの比較は、２個のアンカー基を 示す　位置５のＴｙｒ又はＰｈｅ（双方とも蔑似の芳脣族側鎖を有する）及び位 置８のＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｉ　ｌｅ又はＶａｌ（全て同様の疎水性側鎖を有する） 。

＞ミ舅さ￥３！マ１１１　ＦＩ　Ｆ；　ｃ；　：　ガー；＝工：＝に＝＞ξ２； ；；＋；：＋＝＝＝″：：：二；に；１に＝＝：の謂り崗７　ｉ　ｃｒ：　ｊ　 ｗ　ｅ；　ｅ；　：：　ｅ６とに１：：コニ−Ｎ　！− ・ｌｔ＝某を、：：　：　＝二に；ｌ：”：：：＝　＊　ｉ　’；　’：ｊ、　 ；二：：；呵＝：　ニニｊ　ｊ　ｃ；　ｅ；　ｃ；二（二：第３ｃ表 に１′−拘束ペプチドモチーフ 位　置 優性アンカー基　Ｆ　Ｌ 強ｐｌ　Ｙ　Ｍ 弱い　ＲＮＰＲＴＮＩ 公知のエピトープ　タンパク質源　文献箇所Ｓ　Ｉ　Ｉ　ＮＦＥＫＬ　オバルブ ミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）　２５８−２７６　４１ＡＰＧＮＹＰＡＬ　センダ イ・ウィルス（Ｓｅｎｄａｉ　Ｖｉｒｕｓ）ＮＰ　３２１−３３２　４２ 例３ ＨＬＡ−Ａ２．１−拘束ペプチドモチーフＨＬＡ−Ａ２．１−ＭＨＣ−分子（文 献；４５）を有するヒトＪＹ−細胞のデタージェントーライゼートを、Ａ２−特 異性抗体（ＢＢ７．２、ＩｇＧ２ｂ、文献箇所２８）を用いて免疫沈降させた。

Ａ２−分子から解離されたペプチドを、ＨＰＬＣにより分離した。

フラクション２０〜２８を集め、かつ前記のように配列決定した（第４表）、第 ２の位置は、Ｌｅｕに関する強いシグナル及びＭｅｔに関する中間のシグナルを 有した。位置３〜５には、それぞれ６〜８個の基が見られた０位置６は、Ｖａｌ 、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｈｒを有した。引き続く２個の位置は、それぞれ３個の シグナルを示した０位置９は、強いＶａｌ−及び弱いＬ　ｅ　ｕ−シグナルを示 した。位置１０は、１個の基のピークも示さず、このことは、Ａ２−拘束エビト ープがノナペプチドであることを示唆している０位置２のＬｅｕ又はＭｅｔ及び 位置９のＶａｌ又はＬｅｕは、アンカー基であるように見える。Ａ２−拘束エピ トープを有する公知のペプチドのいくつかが、モチーフと合致しうる一方、これ は、他のものにおいては部分的に可能であるに過ぎない（第４ｃ表）、Ａ２−分 子の多くの変法の現存は、いくつかのペプチドとモチーフとのこの劣悪な合致の 原因である。

・＝ｉ；；；；ｉｌ；；；ｌ；　；；；：；；ｌ某１＝＝＝じＢ−＝；”ｉ；ｌ ”；ｌ”柑；＝二　：；　：ｌ：　＝ｌ　：　：ｌ：ｌ二＝ＩＺ＝［−ａ　：、 ｌ？　”　；１■；ｌ＝：：；：”：　：；：：＝”：二；＝＝、　；　；　； 　：　：　：：　：ｌ　：　：　；　：　：ｌ　：：：　：：　：ｍ　：・；ｉ ”；；ｌバ：：＝：：　；：’Ｆｌ−ｆｆ；；：：：−Ｚ　；　Ｈａ　：　：ｌ ：：　：二：：　苫会１：；１−二：：第４ｃ表 ＨＬＡ−Ａ２．ｌ−拘束ペプチド（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１　）位　置 優性アンカー基　Ｌ　Ｖ 強い　ＭＥＶＫ 弱い　Ｉ　ＡＧＩＩＡＥＬ 公知のエピトープ　タンパク質源　文献箇所ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ　旧■逆転写酵 素　４６１−４８５　４３ＦＬＱＳＲＰＥＰＴ　ＨＩＶＧａｇタンパク質　４４ ６−４６０　４６ＡＭＱＭＬＫＥ、、　Ｈ［ＶＧａｇタンパク質　１９３−２０ ３　４６Ｐ　Ｉ　ＡＰＧＱＭＲＥ　ＨＩＶ　Ｇａｇタンパク質　２１９−２３３ 　４６ＱＭＫＤＣＴＥＲＱ　ＨＩＶＧａｇタンパク質　４１８−４４３　４６第 　５　表 ＨＬＡ−Ａ＊０２０５−拘束ペプチドモチーフ位　置 ａ）Ａ＊０２０５　１　２　３　４　５　６　７　８　９第　６　表 Ｈ−２に’−掬束ペプチドモチーフ 位　置 優性アンカー基　６１ 強い　Ｋ 第　７　表 Ｈ−２Ｋｋ’″゛−拘束されたペプチドモチーフ位　置 優性アンカー基　、 強い　ＥＫ 弱い　ＱＮＰＡ　Ｒ 文献箇所 フラクション　ｎｏ・ フラクション　ｎ。

溶離時間［ｍ１ｎ１ １＋＋＋＋＋＋＋＋１ｎ−１１，＋＋−、ＰＣＴ／ＥＰ　９２１０ＩＱ７２、、 ｌ＋＋、＋＋、、、、、、−−，ＰＣＴ／ＥＰ　９２１０１０７２国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ５，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ 、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　ＮＯ，ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、　ＳＤ、　Ｓ Ｅ、　ＵＳ （７２）発明者　レチュケ、オーラフ ドイツ連邦共和国　Ｄ−７４００チュービンゲン　フンツカプフクリンゲ　４２ （７２）発明者　ステファノヴイッチ、シュテファンドイツ連邦共和国　Ｄ　− ７４００チュービンゲン　シュールシュトラーセ　１８ （７２）発明者　ユング、ギュンター ドイツ連邦共和国　Ｄ−７４００チュービンゲン　オプ　デア　グラーフェンハ ルデ

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．クラスＩ又はＩＩの主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子の対立遺 伝子特異性ベブチドモチーフを決定する方法において、 （ａ）ＭＨＣ−分子を含有する細胞の細胞溶解により細胞抽出物を得、 （ｂ）ＭＨＣ−分子を、その上に存在するベブチド混合物と共に、免疫沈降によ り細胞抽出物から分離し、 （ｃ）ＭＨＣ−分子及び他のタンパク質成分からのべブチド混合物を分離し、 （ｄ）個々のベブチド又は／及びその混合物を配列決定し、かつ （ｅ）得られた、殊に混合物の配列決定、又は−連の固有ベブチドの配列決定の 情報から、対立遺伝子特異性ベブチドモチーフを引き出すことを特徴とする、ク ラスＩ又はＩＩの主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子の対立遺伝子特 異性ベブチドモチーフを決定する方法。
2. ２．クラスＩのＭＨＣ−分子上のベブチドモチーフを決定する、請求項１記載の 方法。
3. ３．Ｈ−２Ｋａ−、Ｈ−Ｋｂ−、Ｈ−２Ｄｂ−、Ｈ−２Ｋｋ、Ｈ−２Ｋｍ又はＨ しＡ＊０２０１又はＨＬＡ−Ａ＊０２０５−分子のベブチドモチーフを決定する 、請求項２記載の方法。
4. ４．免疫沈降のために、ＭＨＣ−分子に対して特異的である抗体を使用する、請 求項１から３のいずれか１項記載の方法。
5. ５．固相結合した抗体を使用する、請求項４記載の方法。
6. ６．ＭＨＣ−分子及び他のタンパク質成分からのペプチド混合物の分離をクロマ トグラフィーにより行う、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
7. ７．分離を逆相−ＨＰＬＣで行う、請求項６記載の方法。
8. ８．分離を、トリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏ−トリフルオロ酢酸／アセトニトリル− 勾配で行う、請求項７記載の方法。
9. ９．請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法により得られる、ベブチド モチーフ。
10. １０．診断薬又は治療薬の製法における、請求項９記載のベブチドモチーフの使 用。
11. １１．ＭＨＣ−分子の診断証明のための、請求項１０記載の使用。
12. １２．ベブチドモチーフに相当するベブチドを、標識基、殊にビオチン基又は蛍 光基と結合させる、請求項１１記載の使用。
13. １３．免疫系の障害又は腫瘍疾病の治療のための請求項１１記載の使用。
14. １４．自己免疫疾患、移植拒絶反応又は／及び移植片対宿主反応の治療のための 請求項１３記載の使用。
15. １５．ベブチドモチーフに相当し、Ｎ−又は／及びＣ−末端が、親油性もしくは 両親媒性基、殊に更に親油性ベブチドヘリックスと共有結合するベブチドの請求 項１０又は１４記載の使用。
16. １６．親油性もしくは両親媒性基はトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイ ン−セリルセリンである、請求項１５記載の使用。