JPH06510035A - 細胞を収容する生物学的適合性カプセルを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞を　７する生物党的ｉ畦　カプセルを製造する　注水発明は、成る種の細胞 の正常な機能を欠いている身体に移植するための、その細胞を収容した生物学的 適合性カプセルを製造する方法に関する。

外部の細胞および組織を移植することによって生じる共通の問題は、免疫学的な 拒絶反応である。この問題を克服する試みでは、普通、免疫抑制薬で患者を治療 する。しかしながら、これがこの種の薬が多くの副作用を持っているために危険 であることは知られている。あるいは、組織を成る種の方法で処理して免疫反応 を誘発しないようにしてもよい。

後者の方法に関しては、比較的非抗原性の物質（Ｉ、ｉｍ　ａｎｄ　Ｓｕｍ、　 １９９０．５ｃｉｅｎｃｅ。

２１０、９０８−９１０；　Ｌｉｍ、　ＵＳ　４，４０９，３３１）を用いて、 細胞、特に島細胞をカプセルにつめる手段が免疫学的保護法として開発されてい る。この方法では、アルギン酸すトリウム溶液内に島細胞を浮遊させた懸濁液を 小滴に形成し、ポリ−１−リシンで被覆してグルコースやインスリンのような小 分子に対しては透過性であるが、免疫グロブリンや免疫系細胞のような大きい分 子にとっては不透過性である薄膜を形成している。

この方法は、０　’　５ｂｅａ等（１９８４、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、　８０４．１３３（３６）によって修正さオ］ た。この修正では、カプセルをアルギン酸ナトリウムの付加的な外層で被覆して 炎症反応をさらに抑えている。

カプセル収容細胞の成る種の移植には適度に成功している。たとえば、カプセル 収容島細胞の移植後２週間糖尿病のマウスが正常血糖値を示した（Ｃａｌａｆｉ ｏｒｅ　ｅｆ−ａｌ、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｒｅ５ｅ、ｙｃｈ　ａｎｄ　Ｃ１１ ｎｉｃａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　１９８８．５．５ｕｐｐＬ　１．５R３４； 　Ｔ ｚｅ　ａｎｄ　Ｔａｉ、１９８２．　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、３３． 　５６３−５６４；　Ｒｉｃｋｅｒ　ａｎｄ　Ｓｔｏｃｋｂ■窒■■秩B １９８６、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ、　３５．５ｕｐｐｌ　Ｌ　６１Ａ）　。取り出 し時、カプセルは単核白血球およびマクロファージの浸潤、すなわぢ、激しい炎 症反応を示していた。

移植した空のカプセルに対するラットの免疫反応をテストする最近の研究（（： １ａｙｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９９０ １４１２７−１３２）では、カプセル外層の組成が反応の激しさに影響を与え、 Ｍ−アルギン酸塩（高マンヌロン酸アルギン酸ナトリウム）が免疫反応を最低に 抑えることを示している。しかしながら、反応は低下しても、はんの３週間後に はマクロファージと繊維芽細胞の浸潤が生じた。

本発明は、このような問題を克服あるいは少な（とも軽減する。

本発明によれば、細胞を収容する生物学的適合性カプセルを製造する方法は、１ ）複数の陰イオン成分を有し、はぼ蛋白質がない予め透析した水溶性ガムを含有 する水性媒体内に細胞を浮遊させる段階と、ｊｉ）　この懸濁液を細胞を収容し た小滴に形成する段階と、１ｉｉ１　これらの小滴を多価性の生理学的に適合性 のある陽イオンの溶液に触れさせて小滴をゲル化し、前記細胞をカプセルに収容 する段階と、ｉｖ）　これらゲル化した小滴を、前記陽イオン・グループと架橋 結合する陰イオン・グループを含むポリマーに触れさせて半透膜を形成する段階 と、Ｖ）　この半透膜を前記予め透析した水溶性ガムの層で被覆する段階とから なる。

水溶性ガムは、アルギン酸ナトリウムまたは他の水溶性アルギン酸塩（たとえば 、アルギン酸カリウム）であってもよい。

アルギン酸塩は、中に存在するジスルフィド結合を破壊することによって任意の 結合蛋白質を分解する助けをするジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む燐酸緩衝 食塩水（ＰＢＳ）で予め透析してもよい。アルギン酸塩は、結合蛋白質、たとえ ば、ジチオエリトリトール、２−メルカプトエタノール等のジスルフィド結合を 減らすことのできる任意の化学物質を含むＰＢＳで予透析してもよい。

本明細書における「はぼ蛋白質がない」という表現は、アルギン酸塩その他のガ ムと結合した蛋白質を完全に除去するということを必ずしも意味しない。予想外 に、結合蛋白質のジスルフィド結合を壊せば充分であることがわかった。

ジチオトレイトール濃度は、０．１　ｍｇ／ｍｌより大きく、好ましくは、０． ６　ｍｇ／ｍｌより太き（、他の化学成分はそれ相当の量であるとよい。

アルギン酸塩は、１時間より長く、好ましくは、その二倍の時間透析するとよい 。ＤＴＴを含むＰＢＳあるいはジスルフィド結合を減らすことのできる任意の化 学物質に対しては２時間、ＰＢＳのみの場合には６５時間より長い時間にわたっ て透析して汚染源の抗原性蛋白質を効率よく除去してもよい。

細胞は精製アルギン酸塩を含むノーマルセーラインに浮遊させてもよい。

細胞！！！濁液は、予透析精製アルギン酸塩を１％　ｗ／ｖより多く、好ましく は、１．５％　Ｗ／Ｖより多く含んでいてもよい。

カプセル収容しようとしている細胞は、糖尿病患者に移植するのに有用な、咄乳 動物細胞、たとえば、インスリン分泌ランゲルハンス島細胞であってもよい。

ランゲルハンス島細胞を移植に使用しようとする場合、１個または２個の全島細 胞をカプセルにつめてもよい。

細９包およびアルギン酸塩の懸濁液は、小滴をゲル化する陰イオンを含む溶液内 へ注射器から落下させることによって０．３ｍｍ〜Ｌ　０ｍｍ直径の小滴状に形 成し、前記細胞をカプセル収容するようにしてもよい。

陰イオ〉を含む溶液は、０．５％　ｗ／ｖ、好ましくは、１．１％　ｗ／ｖより 大きい濃度の塩化カルシウムであってもよい。

ゲル化した小滴を触れさせる陰イオン・グループを含むポリマーはポリ−１−塩 化リシンであってもよい。

ポリ−１−塩化リシンの分子量は、３０００より大きい、好ましくは、２０，０ ００より大きいとよい。

ポリ−１−塩化リジンは、００１％ｗ／ｖより大きい濃度、好ましくは、００５ ％Ｗ／Ｖの濃度でノーマルセーライン溶液に溶解させてもよい。

ゲル化小滴は、１分間以上に２つたって、好ましくは、６分間にわたってポリ− １−塩化リシン消液に触れさせて半透膜を形成してもよい。

こうして形成した半透膜は、０．１％　ｗ／ｖより多いガムを含む溶液に１分間 よりも長い時間にわたって触れさせることによって子透析水溶性ガムの層で被覆 してもよい。

ン容液は、ノーマルセーライ〉内に０．１５％ｗ／ｖの予透析アルギン酸ナトリ ウムを含むものであってもよい。

半透膜は４分間にわたって溶液にさらしてもよい。

本発明は、また、ここに説明した方法によって作った細胞収容生物学的適合性カ プセルも包含する。

本発明は、また、水溶性アルギン酸塩（たとえば、アルギン酸ナトリウム、アル ギン酸カリウム）のような水溶性ガムを精製する方法であって、このガムをジス ルフィド結合低減剤を含む溶液で予透析することを特徴とする方法も包含し、さ らにまた、この方法で作ったガムも包含する。

本明細書における「精製」なる用語は、結合蛋白性物質による生物活性を排除ま たは実質的に低下させてガム（それ自体は見掛は上生物学的適合性である）に意 図した最終用途にとって充分な生物学的適合性を与えることを意味する。

糖尿病患者に移植するためのランゲルハンス島細胞をカプセルにつめるという用 途に加えて、本発明の方法で精製したアルギン酸塩（または他の生物学的適合性 水溶性ガム）は、アルギン酸塩が血液を含めて体液と直接接触する任意の状況で 使用できる。

包帯、綿棒、縫合材、縫合糸等を手術中に身体内へ導入し、術後そこに残す場合 、本発明の方法で精製したアルギン酸塩は特に有用である。包帯はアルギン酸塩 繊維で作った織成布または編成布であってもよい。また、掻き裂いたアルギン酸 塩繊維で作った不織布パッド、たとλば、脱脂綿、あるいは、アルギン酸塩ゲル またはアルギン酸塩フィルムで作った湿潤シートまたは成形スラブあるいは造形 品であってもよい。綿棒はアルギン酸塩繊維の不織組立体であってもよい。縫合 材および縫合糸はアルギン酸塩の単フィラメントまたは複フィラメント紡績糸で 作ったものであってもよい。

開放面創傷を覆うのに用いられる同様の包帯も、本発明の方法で精製したアルギ ン酸塩を用いて製作することができる。アルギン酸塩包帯は、湿潤創傷管理のた めに止血物質として用いられる。アルギン酸塩粉末も開放創傷の止血剤として使 用できる（たとえば、スポーツ用途で急速凝固を促進するために用いられる）皮 膚の下に移植される、活性成分を含む包帯およびパッチも、本発明の方法によっ て精製されたアルギン酸塩を用いて製作できる。

通常の消化器系を通して投与するのではなくて身体に移植あるいは注射する制御 放出装置または徐放装置も、本発明の方法によって精製したアルギン酸塩を用い て製作できる。

身体内へ移植する装置を含めて、アルギン酸塩が分子サイズをふるい分け、カプ セル内外への化学成分の流れを制御する薄膜を提供するアルギン酸塩含有カプセ ルその他の装置も本発明の方法によって精製されたアルギン酸塩を用いて作成で きる。

これらのアルギン酸塩は、患者に移植される人工血管移植片（たとえば、Ｄａｃ ｒｏｎ　（ＲＴＭＩ移植片）を被覆するのにも使用できる。

本発明は、ここに詳細に説明する実験に関連した以下の説明からさらに明らかと なろう。なお、この実験は、本発明を実施して細胞を収容した生物学的適合性カ プセルを製造する方法の一形態を例示するものである。

ランゲルハンス　を４　する 生　−・′４　カプセルをパ告　るプロトコル１、アルギン酸ナトリウムの精製 アルギン酸ナトリウム（Ｋｅｌｃｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによって供給 されるＪをノーマルセーライン（０９％ｖ／ｖ塩化ナトリウム）の１．５％（Ｗ ／Ｖ）溶液に調製した。この溶液、１０ｍ１を透析サック（Ｓｉｇｍａ、　ｆｌ ：ａｔ、　Ｎｏ、　２５０−１１）に入れた。この透析サックは１２．０００よ り大きい分子量の蛋白質を保持する。アルギン酸ナトリウムは、ジチオトレイト ール（ＤＴＴ）を含有する燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；　１４０　ｍＭ　Ｎａ Ｃ１，３５ｍＭ　Ｋ２ＰＯ４，ｐＨ７，３）に対して２時間透析し、新鮮なＰＢ Ｓ＋ＤＴＴに対してさらに２時間透析した。その後、ＰＢＳのみに対して全部で 約７０時間透析し、新鮮なＰＢＳを１時間と６５時間で透析した。

アルギン酸ナトリウムをポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法によって汚染源の 抗原性蛋白質の存在について分析した。この分析では、アルギン酸ナトリウムが 実際に無蛋白質であることが確認された。上述の方法と同じ方法でＤＴＴのない ＰＢＳについて透析したときには蛋白質はアルギン酸ナトリウムから除去されな かった。このことは、アルギン酸ナトリウムから蛋白質を効果的に除去するには ＤＴＴが必須であることを示唆している。

２、カプセル詰めプロトコル 高細胞をラットあるいは人間から採取し、それをノーマルセーラインの精製（す なわち、無蛋白質）アルギン酸ナトリウム１．５％ｗ／ｖｉＩ液に浮遊させた。

この溶液を混ぜ合わせてから、キルを経て２ｍｌ注射器に吸い上げ、注射ポンプ に取り付けた。注射ポンプは所望の率、通常、１　ｍｌ／ｍｉｎにセットし、ア ルギン酸ナトリウム／島細胞懸濁液の小滴を７ｃｍの高さから塩化カルシウムの １．１％ｗ／ｖ溶液に落下させた。小滴は塩化カルシウム溶液に入るときには球 形であった。溶液に入った際、アルギン酸ナトリウムのゲルが高細胞を包み込ん だ（通常、１カプセルあたり１．２個の高細胞である）。カプセルの直径は０． ３−１．０ｍｍであった。ゲル化したカプセルは、２５ｍ１の体積の０．５５％ Ｃａ１１．；　０．２７％ＣａＣ１ｚ；　０．８５％ＮａＣ１で洗浄した。次に 、カプセルを３分間にわたって０．１％（：ＨＥＳ　（ｐＨ８，２ｉｎ　ＮａＣ １１内に置き、６分間にわたってＮａＣ１に入れた０、０５％のポリ−１−塩酸 リシン（Ｄ　２０．０００１の２５ｍ１に浮遊させ、撹拌した。ポリ−１−リシ ン上の陰イオン・グループがアルギン酸ナトリウム・カプセル上の陽イオン・グ ループと架橋結合して半透膜を形成する。ポリ−１−リシンの分子量は所望の透 過性を持つ半透膜を形成するように選ぶ。本件の場合、所望透過性とは、インス リンの通過は許すが、免疫グロブリンや免疫系の他の細胞の通過は許さない性質 である。

次に、カプセルは２５ｍ１の０．１％ＣＨＥＳで洗浄し、２５ｍ１の０．８５％ ＮａＣ１で洗浄してから、精製したアルギン酸ナトリウムの外側コートをカプセ ルに加えて生物学的適合性をさらに向上させた。これは、攪拌しながら４分間に わたって０．１５％ｗ／ｖアルギン酸ナトリウム溶液（ノーマルセーライン内） に洗浄済みのカプセルを浮遊させることによって行った。被覆したカプセルを次 に２５ｍ１の０．９％ＮａＣ，ｌで洗浄し、６分間１０ｍ１の５５　ｍＭクエン 酸ナトリウムに浮遊させ、再び２５ｍ１の０．９％ＮａＣ１で洗浄し、細胞培地 で２回洗浄してから移植前に細胞培地に浮遊させた。

ラットのカプセルにつめた高細胞を移植に用いた最初の結果は、「精製した」ア ルギン酸ナトリウムを用いてカプセルのかなり向上した生物学的適合性を確認し た。このことは、将来糖尿病患者への人間の高細胞の移植が可能となるという大 きな希望を与える。このことは、自分自身のインスリンを産生じ、毎日注射する 必要をな（し得るということを意味する。

注射インスＩルに比して移植した高細胞によってグルコースの制御が高まること により、成る割合のインスリン依存性糖尿病患者を襲う失明や腎臓障害のような 合併症を避は得るという潜在性を得ることができる。

国際調査報告　。、ア、。。。？／ｎ＋ｒ、Ｈ、　、、　ＰＣＴ／ＧＢ　９２１ ０１５１１国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　 ＣＨ，Ｃ３゜ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、 　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、Ｓ Ｄ、ＳＥ、　ＵＳ （７２）発明者　ロンドン　ニコラス　ジョン　ミルトンイギリス国　レイセス タ−エルイー５ ５エヌアール　ハザレイ　ロード　４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞を収容する生物学的適合性カプセルを製造する方法であって、ｉ）複数 の陰イオン成分を有し、ほぼ蛋白質がない予め透析した水溶性ガムを含有する水 性媒体内に細胞を浮遊させる段階と、ｉｉ）この懸濁液を細胞を収容した小滴に 形成する段階と、ｉｉｉ）これらの小滴を多価性の生理学的に適合性のある陽イ オンの溶液に触れさせて小滴をゲル化し、前記細胞をカプセルに収容する段階と 、ｉｖ）これらゲル化した小滴を、前記陽イオン・クループと架橋結合する陰イ オン・グループを含むポリマーに触れさせて半透膜を形成する段階と、ｖ）この 半透膜を前記予め透析した水溶性ガムの層で被覆する段階とからなることを特徴 とする方法。 ２．請求の範囲第１項に従った方法において、水溶性ガムがアルギン酸ナトリウ ムのような水溶性アルギン酸塩であることを特徴とする方法。 ３．請求の範囲項に従った方法において、アルギン酸塩を、ジスルフィド結合低 減剤を含む燐酸緩衝生理食塩水で子透析することを特徴とする方法。 ４．請求の範囲第３項に従った方法において、低減剤がジチオトレイトールから なることとを特徴とする方法。 ５．請求の範囲第３項に従った方法において、低減剤がジチオエリトリトールか らなることを特徴とする方法。 ６．請求の範囲第３項に従った方法において、低減剤が２−メルカプトエタノー ルからなることを特徴とする方法。 ７．請求の範囲第４項に従った方法において、ジチオトレイトール濃度が０．１ ｍｇ／ｍｌより大きいことを特徴とする方法。 ８．請求の範囲第７項に従った方法において、ジチオトレイトール濃度が０．６ ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする方法。 ９．請求の範囲第２項から第８項に従った方法において、アルギン酸塩を１時間 より長い時間にわたって少なくとも１回透析することを特徴とする方法。 １０．請求の範囲第９項に従った方法において、アルギン酸塩は２回、各回２時 間にわたって透析することを特徴とする方法。 １１．請求の範囲第１項に従った方法におし、て、細胞がノーマルセーラインに 浮遊していることを特徴とする方法。 １２．請求の範囲第１項から第１１項に従った方法において、細胞懸濁液が１％ ｗ／ｖより多い子透析アルギン酸塩を含有していることを特徴とする方法。 １３．請求の範囲第１２項に従った方法において、懸濁液が１．５％ｗ／ｖ予透 析アルギン酸塩を含有することを特徴とする方法。 １４．請求の範囲第１項に従った方法において、カプセルにつめようとしている 細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする方法。 １５．請求の範囲第１４項に従った方法において、細胞がランゲルハンス島細胞 であることを特徴とする方法。 １６．請求の範囲第１５項に従った方法において、１つから２つの島細胞をカプ セルにつめるようにしたことを特徴とする方法。 １７．請求の範囲第１項から第１６項に従った方法において、懸濁液を０．３− １．０ｍｍ直径の小滴に形成するために、注射器から小滴をゲル化する陰イオン を含有している溶液内へ落下させ、細胞をカプセルにつめることを特徴とする方 法。 １８．請求の範囲第１７項に従った方法において、陰イオンを含有する溶液が０ ．５％ｗ／ｖより大きい濃度の塩化カルシウムであることを特徴とする方法。 １９．請求の範囲第１８項に従った方法において、塩化カルシウム溶液が１．１ ％ｗ／ｖであることを特徴とする方法。 ２０．請求の範囲第１項に従った方法において、ゲル化小滴を触れさせる陰イオ ン・クループを含有するポリマーがポリ−１−塩化リシンであることを特徴とす る方法。 ２１．請求の範囲第２０項に従った方法において、ポリ−１−塩化リシンの分子 量が３０００より大きいことを特徴とする方法。 ２２．請求の範囲第２１項に従った方法において、ポリ−１−塩化リシンの分子 量が２０，０００であることを特徴とする方法。 ２３．請求の範囲第２０項から第２２項に従った方法において、ポリ−１−塩化 リシンが０．０１％ｗ／ｖより大きい濃度のノーマルセーライン溶液内にあるこ とを特徴とする方法。 ２４．請求の範囲第２３項に従った方法において、ポリ−１−塩化リシンの濃度 が０．０５％ｗ／ｖであることを特徴とする方法。 ２５．請求の範囲第１項から第２４項に従った方法において、ゲル化小滴を１分 間より長い時間にわたってポリ−１−塩化リシン溶液に触れさせて半透膜を形成 することを特徴とする方法。 ２６．請求の範囲第２５項に従った方法において、ゲル化小滴を６分間にわたっ てポリ−１−塩化リシン溶液に触れさせることを特徴とする方法。 ２７．請求の範囲第１項から第２６項に従った方法において、０．１％ｗ／ｖよ り多いガムを含有する溶液に１分間より長い時間にわたって半透膜を触れさせる ことによって、半透膜を子透析した水溶性ガムの層で被覆することを特徴とする 方法。 ２８．請求の範囲第２７項に従った方法において、溶液が０．１５％ｗｔ／ｖ子 透析アルギン酸ナトリウムを含有することを特徴とする方法。 ２９．請求の範囲第２７項、第２８項に従った方法において、半透膜を４分間溶 液に触れさせることを特徴とする方法。 ３０．請求の範囲第１項から第２９項に従った方法によって製造した細胞収容生 物学的適合性カプセル。 ３１．水溶性アルギン酸塩（たとえば、アルギン酸ナトリウムおよびアルギン酸 カリウム）のような水溶性ガムを精製する方法であって、ジスルフィド結合低減 剤を含有する溶液でガムを子透析することを特徴とする方法。 ３２．請求の範囲第３１項に従った方法において、ジスルフィド結合低減剤が燐 酸緩衝生理食塩水に含有させてあることを特徴とする方法。 ３３．請求の範囲第３１項に従った方法において、低減剤がジチオトレイトール であることを特徴とする方法。 ３４．請求の範囲第３１項に従った方法において、低減剤がジチオエリトリトー ルからなることを特徴とする方法。 ３５．請求の範囲第３１項に従った方法において、低減剤が２−メルカプトエタ ノールからなることを特徴とする方法。 ３６．請求の範囲第３３項に従った方法において、ジチオトレイトール濃度が０ ．１ｍｇ／ｍｌより大きいことを特徴とする方法。 ３７．請求の範囲第３６項に従った方法において、ジチオトレイトール濃度が０ ．６ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする方法。 ３８．請求の範囲第３１項に従った方法において、アルギン酸塩を１時間より長 い時間にわたって少なくとも１回透析されることを特徴とする方法。 ３９．請求の範囲第３８項に従った方法において、アルギン酸塩は２回、各回２ 時間にわたって透析されることを特徴とする方法。 ４０．請求の範囲第３１項から第３９項のうちいずれか１つに従った方法におい て、アルギン酸塩が無蛋白質であるかどうかを確認する分析を後に行うことを特 徴とする方法。 ４１．請求の範囲第４０項に従った方法において、分析をポリアクリルアミド・ ゲル電気泳動法によって実施することを特徴とする方法。 ４２．請求の範囲第３１項から第４１項のうちいずれか１つに従った方法によっ て精製した水溶性アルギン酸塩（たとえば、アルギン酸ナトリウムまたはアルギ ン酸カリウム）のような水溶性ガム。