JPH06509467A - Immortalization of endothelial cells - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 内皮細胞の不死化 発明の背景 主暉亘ユ！ 本発明は、全体として内皮細胞に関し、特にヒトの皮膚から得られる微小血管内 皮細胞の不死化に関する。[Detailed description of the invention] Immortalization of endothelial cells Background of the invention Lord Hanayu! The present invention relates generally to endothelial cells, and in particular to endothelial cells obtained from human skin. Concerning the immortalization of skin cells.

１ｌ皿ｊ この１０年はどで内皮に関する情報が非常に増え、内皮が単に傷害を受ける組織 であるばかりではなく、機能や代謝、構造における変化を繰り返すことにより、 血管傷害や炎症、移植に対する拒絶反応や腫瘍転移などの免疫反応を生起させそ の結果に直接影響することが分かってきた（Ｃｏｎｔｒａｎ、　Ｒ，（１９８７ ）　Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、　１２９゜３：　４０７−４１３）。第■因 子関連抗原は、血小板の凝集にかかわる内皮細胞の産物である。それ以外では巨 核球がこの抗原を表現することがわかっている唯一の細胞型である（Ｃｏｎｔｒ ａｎ、　Ｒ，（１９８７）　Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、　１２９．３：　４ ０７−４１３）。インターロイキン−１などの分子や腫瘍壊死因子などによって 活性化されると、これらの細胞はＩＣＡＭ−１やＥＬＡＭ−１などの白血球特異 付着分子の表現を高める（Ｐｏｂｅｒ、　Ｊ、Ｓ、　（１９８８）　Ａｍ、　Ｊ 、　Ｐａｔｈｏｌ、　１３３゜３：　４２Ｅｉ−４３３、Ｂｕｔｃｈｅｒ、　Ｅ 、Ｃ：、　ｅｔ　ａｔ、　（１９８Ｇ）　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ。1l plate In the last 10 years, information about the endothelium has increased tremendously, and the endothelium is simply the tissue that is injured. Not only that, but through repeated changes in function, metabolism, and structure, May cause immune reactions such as vascular injury, inflammation, transplant rejection, and tumor metastasis. (Contran, R. (1987)) ) Am, J. Pathol, 129°3: 407-413). #cause Child-associated antigens are products of endothelial cells involved in platelet aggregation. otherwise huge Karyocytes are the only cell type known to express this antigen (Contr an, R, (1987) Am, J, Pathol, 129.3: 4 07-413). by molecules such as interleukin-1 and tumor necrosis factor. Once activated, these cells develop leukocyte-specific proteins such as ICAM-1 and ELAM-1. Enhances expression of adhesion molecules (Pover, J, S, (1988) Am, J , Pathol, 133°3: 42Ei-433, Butcher, E , C:, et at, (198G) J, Ce1l.

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３０．２：　１２１−１３１）。γ−インターフェロンは、 クラスＨの主要な組織適合抗原の表現に関係している（Ｄｖｏｒａｋ、　Ｈ，Ｆ 、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８１１ｉ）　Ｈｕｍ、　Ｐａｔｈｏｌ、　１７．２： １２２−１２７）。形態学的には、ワイベルーバラード体や丸石形成長パターン など内皮細胞はその由来する組織の通性特質を表現することができる（Ｃｏｔｒ ａｎ、　Ｒ，（１９８７）Ａｍ。Biochem, 30.2: 121-131). γ-interferon is involved in the expression of class H major histocompatibility antigens (Dvorak, H,F , et al, (19811i) Hum, Pathol, 17.2: 122-127). Morphologically, Waibel-Ballard or cobblestone growth pattern Endothelial cells can express facultative characteristics of the tissues from which they are derived (Cotr an, R, (1987) Am.

Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、　１２９．３：　４０７−４１３、Ｋａｒａｓｅｋ、　Ｍ 、ム、　（１９８９）Ｊ。J, Pathol, 129.3: 407-413, Karasek, M , Mu, (1989) J.

Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　９３：　３３５−３８５）。Invest, Dermatol, 93: 335-385).

もともとのヒト微小血管内皮細胞は、約８から１０継代という限られた寿命であ り、特定の成長要件を有する。The original human microvascular endothelial cells have a limited lifespan of about 8 to 10 passages. and have specific growth requirements.

初期の組織培養の方法では、最適に成長させるには高濃度の血清や肉腫１８０調 整培地を使用しなければならず、幾つかの成長因子が必要であった。ヒト血清に ついての要件は、２％の分娩前母体血清を培地に組み込むことによって、ヒト血 清の量を少なくしたり、ウシ給仕血清で代替することができる（Ｋａｒａｓｅｋ 、　Ｍ、Ａ、　（１９８９）　Ｊ。Early tissue culture methods required high concentrations of serum and sarcoma 180 to achieve optimal growth. A culture medium had to be used and some growth factors were required. to human serum requirements for human blood by incorporating 2% prepartum maternal serum into the culture medium. The amount of serum can be reduced or it can be replaced with bovine serving serum (Karasek , M.A. (1989) J.

Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　９３：　３３５−３８５）。これらの細 胞はまた、成長と形成を長引かせるアデニル・シクラーゼを活性化させるコレラ ・トキシン、ジブチリル・ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ　Ｎ　インブチルメチルキサンチンの ような物質を加えることによっても活性化させることができる（Ｔｕｄｅｒ、　 Ｒ，Ｍ、　ｅｔ　ａｌ。Invest, Dermatol, 93: 335-385). These details Cholera cyclase also activates adenyl cyclase, which prolongs growth and formation. ・Toxin, dibutyryl ・c　M　P　N　inbutylmethylxanthine It can also be activated by adding substances such as (Tuder, R, M, et al.

（１９９０）　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｌｏｌ、　１４２：　２７２−２８３ ）。ｃＡＭＰがないと、培養血管内皮細胞には形態や機能特性に大きな変化が生 じる。つまり、細胞は上皮から紡錘形になり、γ−インターフェロンに反応して ＨＬＡ−ＤＲ抗原を表現する能力を一部失う（Ｔｕｄｅｒ、　Ｒ，Ｍ、　ｅｔ　 ａｌ、　（１９９０）　Ｊ。(1990) J, Ce1l Physlol, 142: 272-283 ). In the absence of cAMP, cultured vascular endothelial cells undergo significant changes in morphology and functional properties. Jiru. In other words, cells change from epithelial to spindle-shaped and respond to γ-interferon. loses some ability to express HLA-DR antigens (Tuder, R, M, et al. al, (1990) J.

Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、１４２：　２７２−２８３）。Ce1l Physiol, 142: 272-283).

ヒト由来のさまざまな正常細胞や新生物細胞、胎児の分化細胞が、ヒト制得の内 皮細胞を含む無処置ＳＶ４０ウィルスによって転換され、不死化されてきた（　 ５ａｃｋ　。A variety of human-derived normal cells, neoplastic cells, and fetal differentiated cells are It has been transformed and immortalized by an intact SV40 virus containing skin cells ( 5ack.

Ｇ、Ｈ，、Ｊｒ、　（１９８１）　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　１７．１：　１−１９、 Ｇｉｍｂｒｏｎｅ。G, H., Jr. (1981) In Vitro 17.1: 1-19, Gimbrone.

Ｍ、Ａ、、　Ｊｒ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９７Ｇ）　Ｃｅ１ｌ　９：　Ｇ３５− １１ｉ９３）。パポバウイルスは、ＤＮＡ腫瘍ウィルスの最も単純なグループの 一つをなしており、最も研究されている（Ａａｒｏｎｓｏｎ。M, A, Jr, et al, (197G) Ce1l 9: G35- 11i93). Papovaviruses are among the simplest group of DNA tumor viruses. It is one of the most studied (Aaronson).

Ｓ、Ａ、　（１９７Ｇ）　Ｊ、　Ｙｉｒｏｌ、　ｅ、　４：　４７０−４７５） 。ＳＶ４０導入ヒト内皮細胞は第■因子関連抗原表現を示さず、特徴的なワイベ ルーバラード体も示さなかった（Ｇｉ膳ｂｒｏｎｅ、　Ｍ。S, A, (197G) J, Yirol, e, 4: 470-475) . SV40-transduced human endothelial cells do not show factor II-related antigen expression and have a characteristic Nor did it show the Louvallard typeface (Gizenbrone, M.

Ａ、、　Ｊｒ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９７Ｇ）　Ｃｅ１ｌ　９：　８８５−８９ ３）。ヒトの請帯血管の内皮細胞もまた、ｒｖ−ｒａｓＪあるいはｒＶ−ｍ　ｏ 　ｓ　Ｊ腫瘍形成遺伝子を含むマウス肉腫ウィルスに暴露することにより不死化 されている（Ｆａｌｌｅｒ、　Ｄ、Ｖ、　ｅｔａｌ、　（１９８８）　Ｊ、　Ｃ ｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１３４：　４７−５Ｇ）。これらの細胞は、第■因 子関連抗原を表現し、ワイベルーバラード体を持っていた。マウス正常内皮細胞 の最も機能的な特性を維持しているマウスのリンパ節支質から得た内皮細胞系が 記載されている（０’Ｃｏｎｎｅｌｌ、　Ｋ、Ａ、、　ａｎｄ　Ｅｄｉｄｌｎ。A, Jr, et al, (197G) Ce1l 9: 885-89 3). Endothelial cells of human vasculature also contain rv-rasJ or rV-m Immortalized by exposure to mouse sarcoma virus containing the sJ oncogenic gene (Faller, D, V, etal, (1988) J, C e1l Physiol, 134: 47-5G). These cells are It expressed child-associated antigens and had a Waibel-Ballard body. Mouse normal endothelial cells An endothelial cell line derived from murine lymph node stroma that maintains the most functional properties of As described (0'Connell, K.A., and Editln.

Ｍ、　（１９９Ｇ）　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４４．２：　５２１−５２５ ）。全ウィルスＳＶ４０株４Ａを用いた一時的感染を行い、これらの細胞を不死 化した。M, (199G) J, Immunol, 144.2: 521-525 ). These cells were immortalized by transient infection with the whole virus SV40 strain 4A. It became.

本発明による細胞にはさまざまな用途がある。例えば、血管形成や動脈内膜切除 などの際の移植血管表面へのＨＤＭＥＣの即時付着性を調べたり、血管移植に先 立つ（内皮細胞による）コーティングに使用したりできる。Cells according to the invention have a variety of uses. For example, angioplasty or endarterectomy In order to investigate the immediate adhesion of HDMEC to the surface of transplanted blood vessels, etc., It can also be used for coating (with endothelial cells).

その他、脂質およびリポたんばくの代謝、アラキドン酸代謝、止血因子、エンド セリン（ＥＴ）などの内皮由来血管作動性物質の代謝試験に使用される。また、 脈管形成、傷の回復、白血球付着性、付着分子表現（および細胞内表現）などの 研究にも使用できる。さらに、内皮細胞特異遺伝子調節産物の分離や内皮細胞特 異遺伝子のためのｃＤＮＡ収集を作るのを目的にした遺伝学的研究に用いられる 。Other areas include lipid and lipoprotein metabolism, arachidonic acid metabolism, hemostatic factors, endo Used for metabolic testing of endothelium-derived vasoactive substances such as serine (ET). Also, angiogenesis, wound healing, leukocyte adhesion, adhesion molecule expression (and intracellular expression), etc. It can also be used for research. Furthermore, we will isolate endothelial cell-specific gene regulatory products and Used in genetic research aimed at creating cDNA collections for different genes .

当技術分野の熟練者であれば、本発明による細胞が、さまざまな物質をスクリー ニングするための基剤として、炎症抑制剤としであるいは細胞付着分子表現の調 節剤として薬理学試験に使用したり、化粧品業界で毒性試験に使用できることは 理解できるであろう。これらの細胞が、腫瘍形成性であれば、内皮細胞腫瘍形成 の研究にも使用できるし、特定の問題、例えばカポジ肉腫（あるいはヒト二倍体 細胞に対する化学物質やその他の物質の形質転換作用）研究などにも有用と思わ れる。また、ウィルス性）寄生性成長や検出にも使用できる。培地に分泌された り細胞表面から分離できる物質（例えばサイトカインあるいはリンフ才力イン） を産出するのに用いることができる。Those skilled in the art will appreciate that cells according to the invention screen a variety of substances. It can be used as a base for anti-inflammatory agents or for modulating the expression of cell adhesion molecules. It can be used as a moderating agent in pharmacological tests and in the cosmetics industry for toxicity tests. You will understand. If these cells are tumorigenic, endothelial cell tumorigenesis It can also be used to study specific problems, such as Kaposi's sarcoma (or human diploid It may also be useful for research on the transforming effects of chemicals and other substances on cells. It will be done. It can also be used for viral and parasitic growth and detection. secreted into the medium Substances that can be separated from the cell surface (e.g. cytokines or lymphocytes) It can be used to produce.

光ｊＦと良盾 本発明の目的は、大きくは微小血管内皮細胞を提供することにある。Light jF and good shield The main object of the present invention is to provide microvascular endothelial cells.

特に、不死化した霊長類微小血管内皮細胞を提供することにある。In particular, it is an object to provide immortalized primate microvascular endothelial cells.

本発明の他の目的は、不死化した霊長類微小血管内皮細胞系を提供することにあ る。Another object of the invention is to provide an immortalized primate microvascular endothelial cell line. Ru.

本発明のさらなる目的は、不死化した霊長類微小血管内皮細胞の細胞系を確立す る方法を提供することにある。A further object of the invention is to establish a cell line of immortalized primate microvascular endothelial cells. The goal is to provide a way to

本発明のその他の目的、利点は以下の記載から明らかとなる。Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following description.

一実施例では、本発明は細胞（または細胞系）が霊長類の皮膚から得られ不死化 されている微小血管内皮細胞（または細胞系）に関する。In one embodiment, the invention provides that the cells (or cell lines) are obtained from primate skin and immortalized. related to microvascular endothelial cells (or cell lines).

他の実施例では、本発明は不死化した霊長類微小血管内皮細胞の細胞系を確立す る方法に関しており、（１）ＳＶ４０大型Ｔ抗原を記号化するＤＮＡを細胞に導 入し、 （２）細胞系を培養する ことからなる。In other embodiments, the invention provides methods for establishing immortalized primate microvascular endothelial cell lines. (1) introducing DNA encoding the SV40 large T antigen into cells; Enter, (2) Cultivate the cell line Consists of things.

区」Ｂλ飼浬」らエコ 第１図（Ａ）は、典型的な「丸石」形を示す、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤ ＭＥＣ）の純培養株の位相差顕微鏡写真、（Ｂ）は５Ｖ４０Ｔ転換ヒト皮膚微小 血管内皮細胞の培養株の位相差顕微鏡写真を示す。（Ｂ）図の細胞も「丸石」形 を示し、非転換ヒト皮膚微小血管内皮細胞と区別がつかない。Ward "Bλ Kairan" et al. Figure 1 (A) shows human dermal microvascular endothelial cells (HD (B) is a phase contrast micrograph of a pure culture of MEC), (B) is a 5V40T transformed human skin micrograph. A phase contrast micrograph of a culture of vascular endothelial cells is shown. (B) The cells in the figure are also “cobblestone” shaped. and are indistinguishable from non-converted human dermal microvascular endothelial cells.

第２図（Ａ）は、アセチル化ＬＤＬを用いたヒト皮膚微小血管内皮細胞の直像免 疫蛍光顕微鏡写真を示す。細胞は、内皮細胞に典型的な、アセチル化ＬＤＬの取 込みを示す顆粒状細胞質染色を示す。第２図（Ｂ）は、ＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ −１の直像免疫蛍光顕微鏡写真を示す。Figure 2 (A) shows direct imaging of human skin microvascular endothelial cells using acetylated LDL. A photofluorescence micrograph is shown. Cells exhibit acetylated LDL uptake, typical of endothelial cells. Shows granular cytoplasmic staining indicative of contamination. Figure 2 (B) shows CDC/EU, HMEC A direct immunofluorescence micrograph of -1 is shown.

染色は内皮細胞に典型的なものであり、第２図（Ａ）に示した細胞と区別できな い。The staining is typical of endothelial cells and is indistinguishable from the cells shown in Figure 2 (A). stomach.

第３図（Ａ）は、マトリゲル上で増殖したヒト皮膚微小血管内皮細胞の位相差顕 微鏡写真を示す。培養８時間後に長い管状の細胞伸長が見られる。内皮細胞をこ のマトリックスで培養した時に典型的に見られる形態分化である。第３図（Ｂ） は、マトリゲル上で培養したＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１細胞の位相差顕微鏡写 真を示す。第３図（Ａ）と非常によく似た形態分化が認められる。Figure 3 (A) shows phase contrast microscopy of human skin microvascular endothelial cells grown on Matrigel. A microscopic photograph is shown. After 8 hours of culture, long tubular cell extensions are observed. The endothelial cells This is the morphological differentiation typically seen when cultured in this matrix. Figure 3 (B) are phase contrast micrographs of CDC/EU, HMEC-1 cells cultured on Matrigel. Show the truth. Morphological differentiation very similar to that in Figure 3 (A) is observed.

第４図は、ＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１（転換ＨＤＭＥＣ）細胞を異なる濃度の ヒト血清を添加したＨＤＭＥＣ培地で培養したものを示す。フラスコあたり１． ７×１０４個の細胞を接種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で８日間培養した後回 収し、計数した。細胞は、試験したいずれの濃度のヒト血清においても増殖した が、増殖には濃度依存性が認められた。（非転換ヒト皮膚微小血管内皮細胞は正 常ヒト血清が２０％以下では増殖しない。）第５図は、ＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ −１または非転換ヒト皮膚微小血管内皮細胞をフラスコ２５ｃ♂あたり５×１０ ３個の割合で接種し、３７℃、５％Ｃ０２雰囲気で、異なる濃度のヒト血清を添 加して１０日間培養した。細胞は２４時間ごとに１０日間回収し、計数した。（ オーブンボックス＝ＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１，３０％血清；ソリッドボック ス＝ＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１゜１％血清；オープンダイアモンド＝ＣＤＣ／ ＥＵ、ＨＭＥＣ−１，０％血清；ソリッドダイヤモンド＝ＨＤＭＥＣ。Figure 4 shows CDC/EU, HMEC-1 (transformed HDMEC) cells at different concentrations. The figure shows cells cultured in HDMEC medium supplemented with human serum. 1. per flask. After inoculating 7 x 104 cells and culturing for 8 days at 37°C in a 5% CO2 atmosphere, collected and counted. Cells grew in any concentration of human serum tested. However, concentration dependence of proliferation was observed. (Non-converted human skin microvascular endothelial cells are positive It will not grow if normal human serum is less than 20%. ) Figure 5 shows CDC/EU, HMEC -1 or non-converted human dermal microvascular endothelial cells at 5 x 10 per 25 c♂ flask. The cells were inoculated at a rate of 3 and incubated at 37°C in a 5% CO2 atmosphere with different concentrations of human serum. The cells were then cultured for 10 days. Cells were harvested every 24 hours for 10 days and counted. ( Oven box = CDC/EU, HMEC-1, 30% serum; solid box S = CDC/EU, HMEC-1゜1% serum; Open Diamond = CDC/ EU, HMEC-1,0% serum; solid diamond = HDMEC.

３０％血清。’）ＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１細胞は３０％のヒト血清を添加し たときに最もよく成長するが、まったく添加しなくても生存できる。30% serum. ’) CDC/EU, HMEC-1 cells were supplemented with 30% human serum. It grows best when added, but can survive without any addition at all.

第６図はＣＤＣ−ＨＭＥＣ−１でのＨＬＡ−ＤＲ表現を示す。細胞は、７日間γ −インターフェロンによる処置を行ったもの、あるいは処置を行わなかったもの であった。ＨＬＡ−ＤＲの表現はＰＥ結合抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ抗血清を用いてＦ ＡＣスキャン分析により行った。FIG. 6 shows HLA-DR expression in CDC-HMEC-1. Cells were grown in γ for 7 days. -Those treated with interferon or not treated Met. Expression of HLA-DR was determined using PE-conjugated anti-human HLA-DR antiserum. This was done by AC scan analysis.

光匪立韮鳳友１泗 本発明は、ヒト微小血管内皮細胞に関する。1 star of light The present invention relates to human microvascular endothelial cells.

一実施例では、本発明は霊長類の皮膚（好ましくはヒトの皮膚あるいは***）か ら得て不死化した微小血管内皮細胞に関する。好ましい実施例では、不死化は５ ｖ４０大型Ｔ抗原を記号化するＤＮＡを皮膚由来の内皮細胞に導入することによ り実現する。かかる不死化細胞からなるより好ましい細胞系をＣＤＣ／ＥＵ、Ｈ ＭＥＣ−１と呼ぶ。この細胞系はブダペスト条約により　１２３０１Ｐａｒｋｌ ａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　２０８５２．　ＵＳＡの Ａｍｅｒ　！ｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎにＡＴＣ ＣＤｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ　ＣＲＬ　１Ｏｆｌｉ３６として寄託された。本寄託 は１９９１年１月８日に受領され、この国際寄託機関により承認された。In one embodiment, the invention provides a method for treating primate skin (preferably human skin or foreskin). This invention relates to immortalized microvascular endothelial cells obtained from In a preferred embodiment, immortalization is 5 By introducing DNA encoding the v40 large T antigen into skin-derived endothelial cells. Realize it. A more preferred cell line comprising such immortalized cells is CDC/EU, H It is called MEC-1. This cell line is designated by the Budapest Treaty at 12301 Parkl. awn Drive, Rockville, MD 20852. of USA Amer! ATC for canType Culture Co11ection Deposited as CDsignation CRL 1Ofli36. Book deposit was received on January 8, 1991 and approved by this International Depositary.

寄託されたヒト***由来のヒト微小血管内皮細胞系は、ＳＶ４０ウィルス大型Ｔ 抗原の初期部分を含む真核ベクトルを持つ新しく分離された細胞を形質導入（ト ランスフェクション）することにより不死化された。これらの細胞（ＣＤＣ／Ｅ Ｒ，ＨＭＥＣ−１）はマトリゲル上で微小管を形成し、アセチル化低密度リポた んばくを取込み、第　因子関連抗原を表現し、γ−インターフェロンに暴露され るとＨＬＡ−ＤＲ抗原を表現する。これらの現象はすべて正常微小血管内皮細胞 に特徴的なものである。The deposited human foreskin-derived human microvascular endothelial cell line is SV40 virus large T Transduce freshly isolated cells with a eukaryotic vector containing the initial part of the antigen. immortalized by transfection). These cells (CDC/E R, HMEC-1) forms microtubules on Matrigel and acetylated low-density lipoproteins. absorbs radiation, expresses factor-related antigens, and is exposed to γ-interferon. and express the HLA-DR antigen. All of these phenomena occur in normal microvascular endothelial cells. It is characteristic of

さらに、これらの細胞は正常な微小血管内皮細胞と同様、上皮様の丸石成長パタ ーンを示す。正常ＨＤＭＥＣと異なり、この新規細胞系は、ヒトあるいはウシ給 仕血清なしに、あるいは低濃度の該血清で増殖し、ＨＤＭＥＣより倍加時間が短 く、増殖するのに表皮成長因子やヒドロコルチゾンを必要とせす、ゼラチンやフ ィブロネクチンでコーティ゛／グしていない面に付着する。形質導入されず、５ Ｖ−４０ＴのＤＮＡを含まない対照細胞は２継代後に死に絶えた。したがって、 不死化細胞とは、ＤＮＡ導入後１０継代たうても生存している細胞と定義される 。Furthermore, these cells exhibit an epithelial-like cobblestone growth pattern similar to normal microvascular endothelial cells. Indicates the tone. Unlike normal HDMEC, this new cell line can be derived from human or bovine sources. Proliferates without serum or with low concentration of serum, and has a shorter doubling time than HDMEC. gelatin and fluoride, which are slow and require epidermal growth factor and hydrocortisone to proliferate. It adheres to surfaces not coated with fibronectin. Not transduced, 5 Control cells without V-40T DNA died after two passages. therefore, Immortalized cells are defined as cells that remain viable even after 10 passages after DNA introduction. .

理想的には、無限に***あるいは分割し、由来の組織の形態学的、生理学的特徴 を維持し、より低い血清濃度、より高い細胞密度で増殖するのがよい。特に、該 ＤＮＡが５Ｖ−４０大型Ｔ抗原を記号化しており、形質導入により導入すること ができる。Ideally, the morphological and physiological characteristics of the tissue of origin should be divided or divided indefinitely. It is better to maintain and grow at lower serum concentrations and higher cell densities. In particular, The DNA encodes the 5V-40 large T antigen and can be introduced by transduction. Can be done.

別の実施例では、本発明は霊長類の皮膚（好ましくはヒトの皮膚あるいは***） から得て不死化した微小血管内皮細胞の細胞系を確立する方法に関する。該方法 は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原を記号化するＤＮＡを微小血管内皮細胞が不死化される 条件下で導入し、その細胞系を培養することからなる。In another embodiment, the invention provides a method for treating primate skin (preferably human skin or foreskin). A method for establishing a cell line of immortalized microvascular endothelial cells obtained from. The method Microvascular endothelial cells are immortalized with DNA encoding the SV40 large T antigen. It consists of introducing the cell line under conditions and culturing the cell line.

本発明を、以下の非制限的例によりさらに詳しく述べる。The invention is further illustrated by the following non-limiting examples.

実」【例 実施例は以下のプロトコルおよび実験内容にしたがって実施した。Illustration Examples were carried out according to the following protocols and experimental details.

ヒト　′ハ　ＨＤＭＥＣの　と立 ＨＤＭＥＣは次の方法でヒト***から分離した。***を３ミリ平方にカットし、 ０．３％トリプシン（ミズーリ州セントルイス、Ｓｉｇｏ＋ａ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏ、）と１％エチレンジアミン四酢酸（Ｓｉｇｍａ）を含むリン酸緩衝食 塩水に入れ、３７°Ｃで１０分間放置する。皮膚切片はＨＢＳＳで数回洗浄し、 角質化面を下にしてＨＢＳＳを入れたペトリ皿に入れる。解剖刀の腹でそれぞれ の切片を押さえ付け、皮膚の切断面から微小血管片（フラグメント）が現れるよ うにする。１ｍｌのＨＢＳＳに入れた微小血管のフラグメントを、あらかじめ４ ℃、３０，０００ｇで１０分間回転させたＰｅｒｃｏｌｌ（スウェーデン、ウプ サラ、Ｐｈａｒ＋５ａｃｌａ　ＡＢ）のＨＢＳＳ溶液にグラジェントを形成する ように積層する。次いで、そのグラジェントを４００　ｇ、室温で１５分間回転 させる。密度が１．０４８ｇ／ｍ１未満で、微小血管フラグメントが多い部分を 除去する。６０ｍｍ組織培養皿の中央に、直径１０ｍｍの節回にあらかじめヒト ・フィブロネクチン（メリーランド州シルバースプリング、Ａｄｖａｎｃｅｄ　 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を塗り、そこにグラジェントのうち、微小血 管セグメントを含む部分を塗布する。皿を湿培養器に入れ、３７°Ｃ１５％ＣＯ ２で一晩培養する。付着しない細胞はＨＢＳＳで洗って除去する。付着細胞を生 物学的フードの下で倒像位相差顕微鏡で観察し、非内皮細胞を２５ゲージ滅菌針 を用いて取り除く。これら細胞用成長培地の組成は、内皮基本培地ＭＣＤＢ１３ １（カリフォルニア州すンジエゴ、Ｃ１ｏｎｅｔｉｃｓ）　２００　ｍ　Ｌ　ヒ ト血清（カリフォルニア州すンタアナ、Ｉｒｖｌｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） 　７５　ｍ　Ｌ　ジブチリルｃ　ＡＭ　Ｐ　０．５　ｍＭ　（ミズーリ州セント ルイス、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、ｉ　Ｔｕｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、 　（１９９０）　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ。Humans and HDMEC HDMEC were isolated from human foreskin by the following method. Cut the foreskin into 3mm square pieces, 0.3% trypsin (Sigo+a Chemica, St. Louis, MO) Phosphate buffered diet containing 1% ethylenediaminetetraacetic acid (Sigma) Place in salt water and leave at 37°C for 10 minutes. Skin sections were washed several times with HBSS; Place keratinized side down in a Petri dish containing HBSS. Each with the belly of a dissecting knife Press down on the skin section until microvascular fragments emerge from the cut surface of the skin. I will do it. Microvessel fragments in 1 ml of HBSS were pre-incubated for 4 hours. Percoll (Uppu, Sweden) spun at 30,000 g for 10 min at Form a gradient in the HBSS solution of Sara, Phar+5acla AB) Stack them like this. The gradient was then spun at 400 g for 15 min at room temperature. let Areas with a density of less than 1.048 g/m1 and many microvascular fragments are Remove. In the center of a 60 mm tissue culture dish, place a 10 mm diameter human ・Fibronectin (Advanced, Silver Spring, Maryland) Biotechnologies) and apply micro blood in the gradient. Apply the area containing the tube segment. Place the dish in a humidified incubator at 37°C, 15% CO Incubate overnight at 2. Non-adherent cells are removed by washing with HBSS. Produce adherent cells Observe non-endothelial cells with an indirect phase-contrast microscope under a physics hood using a 25-gauge sterile needle. Remove using. The composition of the growth medium for these cells is endothelial basal medium MCDB13. 1 (C1onetics, Sun Diego, California) 200 m L Hi Serum (Irvlne 5 scientific, Suntaana, California) 75m L Dibutyryl c AM P 0.5mM (St., Missouri Lewis, Sigma Chemical Co, i Tuder et al. (1990) J, Ce1l.

Ｐｈｙｓｌｏｌ、　１４２：　２７２−２８３）、１％（最終濃度）抗生抗真菌 性溶液にューヨーク州グランドアイランド、Ｇｉｂｃｏ）、２μｍ（最終濃度） のヒドロコルチゾンおよび５ｎｇ／ｍｌ（最終濃度）の表皮細胞成長因子である 。形質導入した細胞を同じ培地でｃＡＭＰを添加せずに増殖させた。Physlol, 142: 272-283), 1% (final concentration) antibiotic antifungal (Gibco, Grand Island, NY), 2 μm (final concentration) of hydrocortisone and 5 ng/ml (final concentration) of epidermal growth factor. . Transduced cells were grown in the same medium without the addition of cAMP.

得られた細胞培養株は、形態学的、免疫化学的規準による評価では一貫して１０ ０％純粋である。正常細胞は連続して１０回継代培養できる。The resulting cell cultures consistently scored 10% as assessed by morphological and immunochemical criteria. 0% pure. Normal cells can be serially passaged 10 times.

ベクトル　形質導入に用いられるベクトルは、５Ｖ−４０Ｔと呼ばれる。５Ｖ− ４０大型Ｔ抗原の転換たんばくとＰＢＲ３２２プラスミドのＥｃｏ　Ｒ１部位に クローンされるＲ８Ｖ−ＬＴＲをコードする配列を有する。Vector The vector used for transduction is called 5V-40T. 5V- Conversion protein of 40 large T antigen and Eco R1 site of PBR322 plasmid It has a sequence encoding the R8V-LTR to be cloned.

形質導入　導入時、もともとのヒト***内皮細胞は分離から６度継代されたもの である。手順は、Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄｖａｎ　ｄｅｒ　ＥＢ　（Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ、　５２：　４５Ｂ−４６７、１９７３）に記載の手順に一部修正を加えて 用いた。内皮細胞が付着する面はすべてゼラチンの０．１％０．ＯＩＭリン酸緩 衝食塩水（ｐＨ７，４）溶液（ＰＢＳ）であらかじめコーティングした。形質導 入に先立ち、６穴（ウェル）プレートに１つのウェルにつき３．５Ｘ１０５個の 細胞を入れ、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。ベクトルＤＮＡ量はウェルあ たり５μｇであった。形質導入後、プレートを３７°Ｃ１５％ＣＯ□で培養し、 各ウェルの内容物をそれぞれ０．２μのフィルターキャップをつけた２５０ｍ２ のプラスチックフラスコ（Ｃｏ５ｔａｒ）に移した。幾つかのフラスコにはジブ チリルｃ　ＡＭＰ　０．５　ｍＭ　（最終濃度）を加えた。フラスコは、融合す ると１＝４に分割した。Transduction At the time of introduction, the original human foreskin endothelial cells were passaged 6 times after isolation. It is. The procedure is described by Graham and van der EB (Virolo gy, 52: 45B-467, 1973) with some modifications. Using. All surfaces to which endothelial cells attach are coated with 0.1% gelatin. OIM phosphoric acid Pre-coated with buffered saline (pH 7.4) solution (PBS). transduction Before entering, add 3.5 x 105 cells per well to a 6-well plate. Cells were added and cultured overnight at 37°C and 5% CO2. Vector DNA amount is well The amount was 5 μg. After transduction, plates were incubated at 37°C, 15% CO□, The contents of each well were filtered to 250 m2 each with a 0.2μ filter cap. The mixture was transferred to a plastic flask (Co5tar). Some flasks have jibs Tyril cAMP 0.5 mM (final concentration) was added. The flask is fused Then, it was divided into 1=4.

５Ｖ−４０Ｔウイルス　の　不死になった内皮細胞（ＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ− １）における５Ｖ−４０Ｔの表現を検出するため、酵素免疫測定を行った。５Ｖ −４０を感染させたＢａ　ｌ　ｂ／３Ｔ３マウス胚系である細胞系５Ｖ−Ｔ２を 陽性対照として用い、末梢リンパ球溶解質を陰性対照として用いた。無細胞溶解 質は、１平刃個の細胞にデオキシコール酸塩ＨＣＩの０．５％０．０１Ｍ１　ｐ Ｈ８，２のＰＢＳ溶液を０．５ｍｌと９５％エタノールに溶解したフェニルメチ ル５ｕｌｆｕｆｌｏｕｒｉｄｅの１ｍＭ溶液を０．５ｍｌ加えて調製した。この 混合物を４°Ｃで３０分間培養し、４℃、４００Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離し た。５Ｖ−４０大型Ｔ抗原を含んでいる可能性のある上澄み液を取出し、保存し た。5V-40T virus immortalized endothelial cells (CDC/EU, HMEC- Enzyme immunoassay was performed to detect the expression of 5V-40T in 1). 5V The cell line 5V-T2, which is a BaIb/3T3 mouse embryonic line infected with It was used as a positive control and peripheral lymphocyte lysate was used as a negative control. Cell-free lysis The quality is 0.5% 0.01M 1 p of deoxycholate HCI for 1 cell. 0.5 ml of H8,2 PBS solution and phenylmethylene dissolved in 95% ethanol. The solution was prepared by adding 0.5 ml of a 1 mM solution of ulfulfluoride. this The mixture was incubated at 4°C for 30 min and centrifuged at 400 rpm for 15 min at 4°C. Ta. Remove and save the supernatant that may contain 5V-40 large T antigen. Ta.

ＥＬＩＳＡ試験を行うために抗原を、ミニフォルト■スロットプロッターにュー ／Ｘンプシャー州キーン、５ｃｈｌｅｌｆｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）を用い てニトロセルロース紙上に吸引して付着させた。付着後そのシートを、非特異結 合を防ぐためにスキムミルクの２％０．ＯＩＭＰＢＳ溶液の中で２４時間、４℃ で培養した。その後、スキムミルクを除去し、ニトロセルロースをＴｗｅｅｎ− ２０の０．１％ＰＢＳで室温にて洗った。５Ｖ−４０大型Ｔウイルス抗原に対す るマウスモノクローン抗体を１＝　１０００の希釈率でＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎに加 え、軌道シェーカー上、３７°Ｃで３０分間培養シタ。５Ｖ−４０Ｔ抗原に対す るモノクローン抗体は、マウス雑種細胞系Ｐａｂ１０１　（ＡＴＣＣ＃　ＴＩＢ 　１１７）の上澄み液から得た。ニトロセルロース・シートをＴｗｅ　ｅｎ／Ｐ ＢＳで３回洗浄し、さらに軌道シェーカー上、３７℃で１５分間洗った。ヤギ抗 マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ標識モノクローンＡｂ（カリフォルニア州す ッチモンド、ＢｉｏＲａｄ）を１：　２０００の希釈率で加え、振盪しながら３ ７℃で３０分間培養させた。その後、ニトロセルロース・シートをＴ　ｗ　ｅ　 ｅ　ｎ　／　Ｐ　Ｂ　Ｓで３回洗浄した。ジアミノベンジジン（ミズーリ州セン ト／Ｌ／イス、５１ｇ５ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）（ＤＡＢ）２５ｍｇ１ ＰＢ３５０ｍｌ、２０μｌの３０％Ｈ２０□からなるＤＡＢ溶液を加え、発色さ せた。酵素反応をとめるためにニトロセルロース・シートを脱イオン水で洗った 。Plug the antigen into the MiniFault slot plotter to perform the ELISA test. /X Keene, Hampshire, using 5chlelfher & 5chuell) The sample was suctioned and deposited onto nitrocellulose paper. After adhesion, the sheet is subjected to non-specific binding. 2% of skim milk to prevent 0. 24 hours in OIMPBS solution at 4°C. It was cultured in After that, the skim milk is removed and the nitrocellulose is Tween- Washed with 20 ml of 0.1% PBS at room temperature. 5V-40 large T virus antigen Add mouse monoclonal antibody to PBS/Tween at a dilution of 1 = 1000. Then, incubate for 30 minutes at 37°C on an orbital shaker. against 5V-40T antigen The monoclonal antibody was derived from the mouse hybrid cell line Pab101 (ATCC# TIB Obtained from the supernatant liquid of 117). Tween/P nitrocellulose sheet Washed three times with BS and an additional 15 minutes at 37°C on an orbital shaker. goat anti Mouse horseradish peroxidase-labeled monoclonal Ab (California BioRad) was added at a dilution rate of 1:2000 and the mixture was stirred for 3 minutes with shaking. The cells were incubated at 7°C for 30 minutes. Then, the nitrocellulose sheet was Washed three times with en/PBS. Diaminobenzidine (Missouri Sen. / L / Chair, 51g5a Chemical Co, ) (DAB) 25mg1 Add a DAB solution consisting of 350 ml of PB and 20 μl of 30% H20□ to develop color. I set it. The nitrocellulose sheet was washed with deionized water to stop the enzymatic reaction. .

５Ｖ−４０Ｔ　の　ＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ１と５Ｖ−Ｔ２　（陽性対照）細胞 の無細胞溶解質はＥＬＩＳＡおよびウェスタン・プロットにより５Ｖ−４０Ｔウ イルス抗原を表現した。陰性対照（ヒト末梢血液リンパ球溶解質）細胞は陰性で あった。5V-40T CDC/EU, HMEC1 and 5V-T2 (positive control) cells Cell-free lysate of 5V-40T mice was analyzed by ELISA and Western blot. expressed viral antigens. Negative control (human peripheral blood lymphocyte lysate) cells were negative. there were.

立　の　ＨＤＭＥＣおよびＳＶ４０Ｔ ＨＤＭＥＣ（ＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１）の代表的培養株は、３つの方法でそ の特性を調べる。細胞が内皮細胞に特徴的な丸石形をしているかどうか見るため に倒像位相差顕微鏡で観察する。細胞を一２０℃で１０分間９０％メタノールに 固定した後洗って、１：４０の割合で希釈したウサギ抗ヒト北′二因子（メイン 州スカボロ、Ａｔ１ａｎｔｉｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）で３０分間、ついでＦ ＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧで染色した。３回洗浄して蛍光顕微鏡で観察した 。固定しない細胞は、１，１″ジオクタデシル−１，３，３，３’３　’−過塩 素酸テトラメチルインドカルボシアニン（Ｄｉｌ−ＡＣ−ＬＤＬ）（マサチュー セッツ州ストートン、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ、ｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＋　Ｉｎ ｃ、）で標識したアセチル化低密度リポたんばく（１０℃ｇ／ｍ　ｌ）とともに 成長促進補助剤あるいはウシ給仕血清を添加しない培地１９９で３７℃、４時間 培養した。Ｄｉｌ−ＡＣ−ＬＤＬは、生きている内皮細胞とそれより少量の単球 またはマクロファージを組み込んだ生物学的プローブである。培地を除去した後 細胞を２回洗浄し、標準ローダミン励起発光フィルターをつけた蛍光顕微鏡で観 察する。３つの方法のいずれによっても、内皮細胞のいずれの型の純培養も常法 で評価できることがわかる。Standing HDMEC and SV40T Representative culture strains of HDMEC (CDC/EU, HMEC-1) can be cultured using three methods. Examine the characteristics of. To see if the cells have the cobblestone shape characteristic of endothelial cells. Observe with an indirect phase contrast microscope. Cells were soaked in 90% methanol for 10 min at -20°C. After fixation and washing, rabbit anti-human North'2 factor diluted at a ratio of 1:40 (main At1antic Antibodies, Scarborough, State, for 30 minutes, then F. Stained with ITC-conjugated goat anti-rabbit IgG. Washed three times and observed with a fluorescence microscope. . For unfixed cells, 1,1" dioctadecyl-1,3,3,3'3'-hypersalt Tetramethylindocarbocyanine (Dil-AC-LDL) Stoughton, SE, Biomedica, l Technology + In c,) with acetylated low-density lipoprotein labeled with (10°C g/ml) 4 hours at 37°C in medium 199 without the addition of growth promoting supplements or bovine serving serum. Cultured. Dil-AC-LDL is present in living endothelial cells and to a lesser extent monocytes. or a biological probe that incorporates macrophages. After removing the medium Cells were washed twice and viewed under a fluorescence microscope with a standard rhodamine excitation-emission filter. Sympathize. Pure culture of any type of endothelial cells by any of the three methods is routine. It can be seen that it can be evaluated by

五叉鳳盗亘ト進　基底膜成分を含むＥＨ８肉腫の抽出物であるマトリゲル（マサ チューセッツ州ベトフォード、Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｌｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ）を、厚くあるいは薄く２４大または９６穴の細胞培養プレートに塗布し、３７ ℃で培養する。この温度は抽出物のゲル化を誘発する。ＨＤＭＥＣあるいはＣＤ Ｃ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１をマトリゲル上で培養する。細胞は急速に付着し、１． ２時間以内に伸長過程が認められる。８時間後、内皮細胞培養株には、分岐し融 着する細胞膜のネットワークが多数見られる。Matrigel, an extract of EH8 sarcoma containing basement membrane components. Bedford, Chusetts, Co11aboratlve Re5earch ) was applied thickly or thinly to a 24-well or 96-well cell culture plate, and Incubate at °C. This temperature induces gelation of the extract. HDMEC or CD C/EU, HMEC-1 are cultured on Matrigel. Cells attach rapidly; 1. The elongation process is observed within 2 hours. After 8 hours, the endothelial cell culture has branched and melted. Numerous networks of cell membranes attached to the surface can be seen.

光学顕微鏡で見ると、はとんどの索が長袖に沿って中央に半透明の構造物を有し ていることが分かる。これは内腔の存在を示唆している。８時間たつと、内皮細 胞は融着細胞の相互連絡ネットワークを形成し、低出力光学顕微鏡で見ると「蜂 の果」形をしている。これらの内皮細胞は、管形成前、形成中、形成後に第■因 子関連抗原を表現する。それらはまた、アセチル化低密度リポたんばくを取込む ため、代謝が活発である。マトリゲル上で１８時間培養した細胞を透過型電子顕 微鏡で見ると、管種構造物の断面には細胞に囲まれた内腔が認められる。When viewed under a light microscope, the ligament has a translucent structure in the center along the long sleeve. I can see that This suggests the presence of a lumen. After 8 hours, the endothelial thin The vacuoles form an interconnected network of fused cells that, when viewed under a low-power light microscope, look like ``bees''. It is shaped like a fruit. These endothelial cells interact with factor II before, during, and after tube formation. Expressing child-associated antigens. They also incorporate acetylated low-density lipoproteins Therefore, the metabolism is active. Transmission electron microscopy of cells cultured on Matrigel for 18 hours. When viewed under a microscope, a lumen surrounded by cells can be seen in the cross section of the tubular structure.

管の内腔を形成している細胞膜は、指状細胞質プロセスにより相互に連結してい る。The cell membranes forming the lumen of the tube are interconnected by digital cytoplasmic processes. Ru.

１三二血亘上ＪＩ　ＨＤＭＥＣおよびＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１の細胞表面分 子の分析を直接免疫蛍光法およびフロー血球計算法により行った。血球計算分析 は、ＦＡＣスキャン・フロー血球計算器（カリフォルニア州マウンテンビュー、 Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｉｎｃ、）を用いて行った。この計器に より、細胞数、前方光散乱、側方散乱および赤色、緑色の蛍光に関するデータが 得られる。１試料につき約１万個の細胞をこれらの方法で分析した。分析される ＨＤＭＥＣｌ　ＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１は、トリプシンやｄｉｓｐａｃｅ感 受性内皮細胞エピトープが失われないよう８−８−１Ｏの５ｍＭのＥＤＴＡと１ ％ＢＳＡを用いて組織培養フラスコから取出す。３７℃で３０分間培養した後、 ＥＤＴＡを不活化するためＣＡ＋十とＭｇ＋十が等量のＨＢＳＳを加え、３回洗 浄する。試験管に１０６個ずつ分取、小球形にし、上澄みを除去した後２０μｍ の希釈していないモノクローン抗体を加える。132 blood flow JI HDMEC and CDC/EU, HMEC-1 cell surface portion Analysis of offspring was performed by direct immunofluorescence and flow cytometry. blood cell count analysis is a FAC Scan Flow Cytometer (Mountain View, California). Becton-Dickinson, Inc.). to this instrument data on cell number, forward light scatter, side scatter, and red and green fluorescence. can get. Approximately 10,000 cells per sample were analyzed using these methods. to be analyzed HDMECl CDC/EU, HMEC-1 has trypsin and disspace. 8-8-1O with 5mM EDTA to avoid loss of susceptible endothelial cell epitopes. %BSA from the tissue culture flask. After culturing at 37°C for 30 minutes, To inactivate EDTA, add HBSS with equal amounts of CA + 10 and Mg + 10 and wash 3 times. Purify. Take 106 pieces into test tubes, make them into small spheres, remove the supernatant, and make 20 μm particles. Add undiluted monoclonal antibody.

軽く撹拌し、氷上で３０分間培養する。その後細胞を３回洗い、適切な第二段階 抗体で染色するか、一段階染色法で直接分析する。Stir gently and incubate on ice for 30 minutes. Then wash the cells three times and perform the appropriate second step. Stain with antibodies or analyze directly using a one-step staining method.

例ｌ ５Ｖ４０Ｔ　ＨＤＭＥＣの　イ 細胞系ＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１は第４０継代目である。形質導入後に５Ｖ− ４０Ｔ　ＤＮＡまたはｃＡＭＰ成長補助物質を添加しなかった対照細胞は、形質 導入後２継代で死に絶えた。ＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１は、完全ＨＤＭＥＣ培 地を用いてゼラチン被膜組織培養皿で培養すると「丸石」の形を示し、形態学的 にＨＤＭＥＣと区別がつかなかった（第１図）。しかしながら、過融合になるが ままにしておくと、ＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１は高密度に増殖することができ 、かかる条件の下では細胞は当然ＨＤＭＥＣより小さくなることが認められた。Example l 5V40T HDMEC Cell line CDC/EU, HMEC-1 is at passage 40. 5V- after transduction Control cells to which no 40T DNA or cAMP growth supplements were added It died in the second passage after introduction. CDC/EU, HMEC-1 is complete HDMEC culture. When cultured in gelatin-coated tissue culture dishes using soil, it exhibits a “cobblestone” shape, and the morphological was indistinguishable from HDMEC (Fig. 1). However, it will lead to over-fusion. If left untreated, CDC/EU and HMEC-1 will be able to proliferate to high density. , it was observed that under such conditions the cells naturally become smaller than HDMEC.

ＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１およびＨＤＭＥＣは、直接免疫蛍光法で調べると両 方とも第　因子に対し、陽性染色を示した。これらの細胞型はどちらも暴露４時 間後にアセチル化低密度リポたんばくの取込みを示した（第２図）。CDC/EU, HMEC-1 and HDMEC are both distinct when examined by direct immunofluorescence. Both showed positive staining for factor. Both of these cell types were exposed at 4 h. After a while, uptake of acetylated low-density lipoprotein was observed (Figure 2).

ＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１が管状に形態分化できるかどうか調べるため、これ らの細胞をマトリゲル上で培養した。ＨＤＭＥＣが基底膜系マトリックスで培養 すると毛細管様構造を示すことは先に示されている（Ｋｕｂｏｔａ＋Ｙ、　ｅｔ 　ａｌ、　（１９８９）　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１１１ｉ７：　１５８ Ｂ）。ＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１は、マトリゲルで培養８時間後にＨＤＭＥＣ 七区別できない管形成を示した（第３図）。In order to investigate whether CDC/EU and HMEC-1 can differentiate into tubular shapes, this These cells were cultured on Matrigel. HDMEC cultured in basement membrane matrix It has previously been shown that this results in a capillary-like structure (Kubota+Y, et al. al, (1989) J, Ce1l Biol, 111i7: 158 B). CDC/EU, HMEC-1 are HDMEC after 8 hours of culture in Matrigel. Seven indistinguishable tube formations were observed (Fig. 3).

例２ 」０） ＨＤＭＥＣが最適に成長するには３０％ヒト血清を添加した特別の成長培地が必 要であることは先に示されている（Ｋｕｂｏｔａ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｔ、　（１ ９８８）　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０７：１５８９および個人所見）。Example 2 ”0) HDMEC require a special growth medium supplemented with 30% human serum for optimal growth. It has been shown earlier that it is important (Kubota, Y, et at, (1 988) J, Ce1l Biol, 107:1589 and personal observations).

ヒト血清を２０％あるいはそれ以下にすると基本的に増殖が止まる。ＣＤＣ／Ｅ Ｕ、ＨＭＥＣ−１のヒト血清要件を調べるため、添加ヒト血清の濃度を３０％、 ２０％、１０％、５％、１％にして通常のＨＤＭＥＣ培地を用い、比較試験を行 なった。その結果、ヒト血清濃度を３０％にしたときに最もよ（増殖するが、１ ％でも成長することがわかった（第４図）。細胞倍加時間は、ヒト血清３０％添 加培地で培養した時の５３．６時間から１％添加時の８５．６時間の範囲であっ た。ＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１の成長試験をさらに行なった結果、血清無添加 の通常のＨＤＭＥＣでも***することがわかった（第５図）。When human serum is reduced to 20% or less, proliferation basically stops. CDC/E U, To investigate the human serum requirement of HMEC-1, the concentration of added human serum was 30%, Comparative tests were conducted using regular HDMEC medium at 20%, 10%, 5%, and 1%. became. As a result, when the human serum concentration was 30%, it was found that the growth was the best (proliferation was 1. % (Figure 4). Cell doubling time is determined by adding 30% human serum. The time range was from 53.6 hours when cultured with supplemented medium to 85.6 hours when cultured with 1% addition. Ta. As a result of further growth testing of CDC/EU and HMEC-1, serum-free It was also found that normal HDMEC of 100% of these cells also divide (Fig. 5).

例３ 剖１ｉ１厘ｊ」Ｌ友男 ＨＤＭＥＣは、その表面にＩ　ＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ４４およびクラス エを含む細胞付着分子を表現するが、クラス　分子の構成的表現をしないことが 先の試験で示されている（Ｆｌｅｃｋ、　Ｒ，ｅｔ　ａｔ、　（１９８Ｇ）　Ｊ 、　Ｉｎｖｅｓｔ。Example 3 Autopsy 1i1rinj” L Tomoo HDMEC has ICAM-1, LFA-3, CD44 and class represents cell adhesion molecules including E, but may not provide a constitutive representation of class molecules. As shown in previous studies (Fleck, R, et at (198G) J , Invest.

Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　８１４７５）。これら細胞表面抗原の表現についてＨＤＭ ＥＣとＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１を比較した。Dermatol, 81475). Regarding the expression of these cell surface antigens, HDM We compared EC, CDC/EU, and HMEC-1.

正常細胞も形質導入細胞もＩ　ＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ４４およびクラス Ｉを表現したが、クラス■は表現しなかった（表１）。しかし、ＨＤＭＥＣとＣ ＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１をγ−インターフェロンで処置すると（５００μ／ｍ ｌ、７２時間）、クラス■の細胞表面抗原表現が誘発された（第６図）。ＣＤＣ ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１は、形質導入しないＨＤＭＥＣに比べ、ＣＤ４４を３倍以 上、ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−３を２倍以上表現した。クラスＩの表現については 両型ともほぼ同じであった。Both normal and transduced cells have I CAM-1, LFA-3, CD44 and class I was expressed, but class ■ was not expressed (Table 1). However, HDMEC and C Treatment of DC/EU, HMEC-1 with γ-interferon (500 μ/m 1, 72 hours), class ■ cell surface antigen expression was induced (Figure 6). C.D.C. /EU, HMEC-1 have more than 3 times more CD44 than non-transduced HDMEC. Above, ICAM-1 and LFA-3 were more than doubled. Regarding the expression of class I Both types were almost the same.

表１　非転換およびＣＤＣ／ＥＵ、ＨＭＥＣ−１ヒト皮膚微小血管内皮細胞に現 れる、免疫的に関連性のある細胞表面抗原の比較 ＨＤＭＥＣＣＤＣ／ＥＵ、１７ＭＥＣ−１１ＣＡＭ−１＋＋ ＬＦＡ−３＋＋ ＣＤ４４　＋　＋ クラスｎ　−− クラス■＊　＋　＋ ＊５００μ／ｍｌのγ−インターフェロンで７２時間処置したもの ＊＊＊＊＊本本本本木本 上記文献は、言及により本明細書に組込まれる。Table 1 Non-converted and CDC/EU, HMEC-1 expressed in human skin microvascular endothelial cells Comparison of immunologically relevant cell surface antigens HDMECCDC/EU, 17MEC-11CAM-1++ LFA-3++ CD44 + + Class n -- Class■＊　＋＋ *Treated with 500μ/ml γ-interferon for 72 hours ＊＊＊＊＊This book this book this book The above documents are incorporated herein by reference.

以上、本発明を詳細に記載したが、本開示を一読すれば本技術分野の熟練者であ れば、本発明と特許請求の範囲から逸脱することな（形式や内容に種々の変更を 加えることができるのは明らかである。Although the present invention has been described in detail above, it will be appreciated by those skilled in the art after reading this disclosure. may make various changes in form and content without departing from the scope of the invention and the claims. It is obvious that more can be added.

ＦＩＧ、　４ ％　ＯＦ　ｌ−ＩＵＭＡＮ　ＳＥＲＵＭＦＩＧ、５ ＴＩＭＥ　（ＨＯＵＰＳ） ＦＩＧ、　６Ａ ＦＩＧ、　６Ｂ 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　エイズ　ニドウィン　ダヴリューアメリカ合衆国３０３４５ジ ョーシア州アトランタレインジウッドテラス２８４４番 （７２）発明者　ロウリー　トーマス　ジェイアメリカ合衆国３０３５０ジョー シア州アトランタ　クラシックウニ１フ６８０番地 （７２）発明者　キャンダル　フランシスコ　ジェイアメリカ合衆国３００２１ ジョーシア州クラークストンロジャーズ　ストリート１１３０番FIG. 4 % OF l-IUMAN SERUMFIG, 5 TIME (HOUPS) FIG, 6A FIG, 6B international search report Continuation of front page (72) Inventor AIDS Nidwin D.A. 30345 USA 2844 Rangewood Terrace, Atlanta, Georgia (72) Inventor Lowry Thomas Jay USA 30350 Joe 680 Classic Uni 1F, Atlanta, Sia (72) Inventor Candal Francisco Jay United States 30021 1130 Rogers Street, Clarkston, Georgia

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．霊長類の皮膚から得て不死化したことを特徴とする微小血管内皮細胞 ２．該霊長類の皮膚がヒトの皮膚であることを特徴とする特許請求の範囲第１項 に記載の微小血管内皮細胞３．該ヒトの皮膚がヒトの***であることを特徴とす る特許請求の範囲第１項に記載の徴小血管内皮細胞４．該細胞がＳＶ４０大型Ｔ 抗原を記号化するＤＮＡを有していることを特徴とする特許請求の範囲第１項に 記載の徴小血管内皮細胞 ５．徴小血管内皮細胞系ＣＤＣ／ＥＵ．ＨＭＥＣ−１，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１０６ ３６ ６． （１）ＳＶ４０大型Ｔ抗原を記号化するＤＮＡを、該細胞が不死化される条件の 下に該細胞に導入し、（２）該細胞系を培養する ことからなる霊長類由来の不死化した微小血管内皮細胞の細胞系を確立する方法 ７．該霊長類の皮膚がヒトの皮膚であることを特徴とする特許請求の範囲第５項 に記載の細胞系を確立する方法 ８．該ヒトの皮膚がヒトの***であることを特徴とする特許請求の範囲第６項に 記載の細胞系を確立する方法９．該ＤＮＡ導入が形質導入（トランスフェクショ ン）によって行われることを特徴とする特許請求の範囲第５項に記載の細胞系を 確立する方法 （規則１２６条により請求項の番号を付しなおした。）第６図：ＣＤＣ／ＥＵ． ＨＭＥＣ−１上のＨＬＡ−ＤＲ表現 （１）＿インタイプ対照 ．．．．．．無処置細胞上のＨＬＡ−ＤＲ（２）＿インタイプ対照 ．．．．．．γ−インターフェロン処置細胞上のＨＬＡ−ＤＲ （３）細胞を７日間γ−インターフェロンで処置したものとしないものを用意し た。ＨＬＡ−ＤＲの表現はＰＥ結合抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ抗血清を用いてＦＡＣス キャン分析により行なった。[Claims] 1. Microvascular endothelial cells obtained from primate skin and immortalized 2. Claim 1, characterized in that the primate skin is human skin. Microvascular endothelial cells described in 3. characterized in that the human skin is human foreskin 4. Small blood vessel endothelial cells according to claim 1; The cells are SV40 large T Claim 1, characterized in that it has DNA encoding an antigen. Small vascular endothelial cells described 5. Small vascular endothelial cell line CDC/EU. HMEC-1, ATCC#CRL106 36 6. (1) DNA encoding the SV40 large T antigen is added to the conditions under which the cells are immortalized. (2) culturing the cell line. A method for establishing an immortalized primate-derived microvascular endothelial cell line consisting of 7. Claim 5, characterized in that the primate skin is human skin. Methods for establishing the cell lines described in 8. Claim 6, wherein the human skin is human foreskin. Methods of establishing the described cell lines9. This DNA introduction is transduction (transfection). The cell line according to claim 5, characterized in that the cell line is produced by How to establish (Claims have been renumbered in accordance with Article 126 of the Regulation.) Figure 6: CDC/EU. HLA-DR expression on HMEC-1 (1)_Intype contrast ．． ．． ．． ．． ．． ．． HLA-DR(2)_intype control on untreated cells ．． ．． ．． ．． ．． ．． HLA-DR on γ-interferon treated cells (3) Prepare cells with and without γ-interferon treatment for 7 days. Ta. Expression of HLA-DR was determined by FAC scan using PE-conjugated anti-human HLA-DR antiserum. This was done by can analysis.