JPH06509228A - 改善されたワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 改善されたワクチン 技術分野 本発明は改善されたワクチンに関し、具体的には狂犬病ウィルス、牛−過性熱ウ イルス（すなわちＢＥＦＶ）および水庖性口内炎ウィルス（すなわちＶＳＶ）を 含むラブドウィルス、ならびにヒトの麻疹ウィルスと流行性耳下腺炎ウィルス、 ヒトと牛の呼吸器合胞体ウィルス、牛の牛疫ウィルス、犬のイヌジステンパーウ ィルス、鶏のニューカッスル病ウィルスおよび様々なバラインフルエンザウィル スを含むバラミクソウィルスによって引き起こされる感染症を処置するためのワ クチンに関する。

背景技術 狂犬病はヒトと家畜の医学にとって大きな重要性を持つ中枢神経系の疾患である 。この疾患は、その徴候が一旦現れると治療の方法がない致命的な脳を髄炎を引 き起こす。ウィルス汚染の前または後に予防接種することがこの感染症に対抗す る唯一の方法である。ヒト、獣および家畜の使用について様々なワクチンが認可 されており、それらはすべて殺したウィルスから製造されている。現在までのと ころサブユニットワクチンは商業的には使用されていない。

狂犬病の病原物質はラブドウィルス属すサビラス（ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）であ る。狂犬病ウィルス粒子は、Ｎタンパク質の保護鞘に囲まれた約１２０００ヌク レオチド長のマイナス鎖（−）ＲＮＡ分子からなるリボ核タンパク質（ＲＮＰ） を含有する。このＲＮＰは他の２つのタンパク質（ＬおよびＭｌ）に結合してい て、この構造と共に転写複合体を形成する。この転写複合体は貫膜糖タンパク質 （Ｇ）と内部マトリックスタンパク質（Ｍ２）からなる２つのタンパク質を伴う 脂質二重層膜によって囲まれている。Ｇタンパク質はウィルス粒子の表面に見る ことができるスパイクを形成する。タンパク質の数と機能は異なり得るが、他の ラブドウィルスおよびバラミクソウィルスも類似の構造を持っている。

狂犬病に関する上記の概要はブレハウドら（１９８９）、ＶｉｒｏｌｏｇＹ　１ ７３：３９０−３９９とブレハウドら（１９９０）、　Ｖｉｒｏｌ、ｏｇｙ　１ ７８・４８６−４９７に記述されている。他のいくつかのラブドウィルスとバラ クミソウィルスの構造の要約は、ｒＴｈｅ　ＲｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓＪ　（ １９８７）（アールアール・ワグナ−編、ブレナム・プレス、ニューヨーク）、 エマージン（１９８５）　ｒＶｉｒｏｌｏｇｙＪ　（ビーエヌ・フィールド編、 　１１５７−１１７８頁）、ブンナーら（１９８５）　ｒＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ＶｉｒｕｓｅｓＪ　（第１巻、エムエイチブイ舎ファン拳し ゲンモーテルおよびエイアール・ニューラス編、エルセピア−・プレス、アムス テルダム、　３６７−３８８頁）ならびにオーベルおよびノルビー（１９８５） 　ｒＩｍｍｕｎｏｃｈｅｓｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ＶｉｒｕｓｅｓＪ　（エムエイチ ブイ・ファン・レゲンモーテルおよびエイアール・ニューラス編、　２４１−２ ６４頁）に記載されている。

プレハウドら（１９８９）では狂犬病ウィルスに対する予防接種に伴う問題が解 決には程遠いことが明らかにされている。ワクチンはワクチンの質と有効性に関 して改善されてきたし、それに伴って、狂犬病の診断、疫学およびサーベイラン スにおいても進歩がなされてきたが、この疾患はヒトおよび動物集団にとって脅 威であり続けている。

既に開発されたワクチンまたは候補と見なされているワクチンの種類には次のも のが含まれる。

（ｉ）不活化した狂犬病ウィルス調製物これらのワクチンは現在ヒトと家畜に使 用されている。これらはウィルスが不完全に不活化されている場合を除いて安全 に使用される。これらのワクチンの主たる問題はその生産コストである。

（ＩＩ）減毒した生ワクチン これらのワクチンは野生動物の経口予防接種に使用されてきた。このような目的 にとっては、候補ワクチンが標的種にとっても、ときおり感染し得る非標的動物 にとっても、無発病性であることが必要条件である。また候補生ワクチンは免疫 原性で遺伝子的に安定である必要もある。近年、毒性に影響を与えるいくつかの 突然変異を有する新しい減毒されたウィルス株が製造されている。

（ｔｔｉ）組換えポックスウィルス これらには組換え家禽ポックスウィルスと組換えワクシニアウィルスが含まれる 。両者は共に有効なワクチンであることが示されている。しかし、生きている組 換えポックスウィルスの環境への放出が野生生物に他の危険を提示するかどうか はわかっていない。

１）サブユニットタンパク質またはサブユニット構造ウィルスのサブユニットタ ンパク質またはサブユニット構造から誘導されるワクチンが提唱されている。し かしこれらのワクチンのコストは高い。数種のサブユニットワクチンが提唱され ており、これらにはペンマンソール（１９８５）、　Ａｎｎ、　Ｉｎ５ｔ、　Ｐ ａ５ｔｅｕｒ　Ｖｉｒｏｌ、　１３６Ｅ二１６７−１７３に記述されているＧ− Ｍ２複合体と、モレインら（１９８４）、　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ、　）３０ ８：４５７−４６０に記述されている免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）が含まれる 。リポソームワクチンはベリンら（１９８５）Ｄｅｖ、　５ｔａｎｄ、　Ｂｉｏ ｌ、　１６０：４８３−４９１に記述されており、リボ核タンパク質に基づくワ クチンはディエツショールドら（１９８３）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｃ ｌ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓ＾８０ニア０−７４とツーら（１９９１）Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、@Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ　８８：２００１−２００５に記述されている。昆虫細胞中で発現させたＧタ ンパク質がワクチンとしてマウスで試験されている（ブレハウドら（１９８９） 、上記〕。

Ｖ　Ｓ　Ｖについては、このウィルスが５つの構造タンパク質を含有していて、 これらのタンパク質のそれぞれがＶＳＶの複製、組み立ておよび発芽において役 割を果たすことが知られている。これらには、狂犬病ウィルスについて上述した ものと類似するＲＮＰ転写複合体をウィルスＲＮＡゲノムと共に形成する大ポリ メラーゼタンパク質（Ｌ）、ヌクレオキャブンドタンパク質（Ｎ）およびリンタ ンパク質（ＮＳ）が含まれる。またウィルス包膜（エンベロープ）上のスパイク を形成し、感受性細胞上の受容体と相互作用する糖タンパク質（Ｇ）も含まれる 。狂犬病ウィルスのＭ２タンパク質に類似していると思われるマトリックスタン パク質（Ｍ）も存在し、これは細胞原形質膜の内表面で組み立てられて、粒子形 態形成の間にＧタンパク質およびＲＮＰ複合体との結合を可能にすると考えられ ている。Ｖ　Ｓ　Ｖの構造と形態形成の要約は、バトニアックおよびベルツ（１ ９９１）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩｊＳ＾８８：１３ ７９−１３８３およびｒＴｈｅ　ＲｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓＪ　（１９８７Ｘ アールアール・ワグナ−編、ブレナム・プレス、ニューヨーク）に記述されてい る。

ｖ　Ｓ　Ｖはヒトだけでな（馬、牛、豚にも感染し、従来の狂犬病ワクチンとの 関連で上述したように、過去のワクチンは不活化したウィルスまたは殺したウィ ルスもしくは減毒したウィルスから誘導されてきた。無発病型から有毒型へ変換 が考え得るという問題はＶＳｖワクチンにも同じく当てはまる。Ｇタンパク質に 基づくサブユニットワクチンによって免疫を得ることはできるであろうが、サブ ユニットワクチンは十分には研究されていない（コックスら（１９７７）Ｉｎｆ ｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　１’　６：７５４−７５９　；ル・ フランコイ（１９８４）Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５１：２０８）。Ｎタンパク質と Ｇタンパク質の組み合わせに基づくワクチンもデイエツンヨールドら（１９８３ Ｘ上記）に報告されている。

ＢＥＦＶについて、このウィルスは牛と水牛に急性の感染症を引き起こす。現在 までに生産されたワクチンには減毒した生ウィルスまたは不活化した全ウィルス が含まれる。このようなワクチンは現在までのところ商業的に成功であるとは証 明されていないし、不完全な不活化や上述のような有毒型への反転という危険に もさらされている。オーストラリア特許明細書６１３５６／９０とウォーカーら （１９９１）Ｊ、　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ、　７２：６７−７４に記述されている ＢＥＦＶはエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）、核タンパク質（Ｎ）、マトリック スタンパク質（Ｍ２）、ポリメラーゼ関連タンパク質（Ｍ＋）および大ポリメラ ーゼタンパク質（Ｌ）からなる。オーストラリア特許明細書６１３５６／９０は Ｇタンパク質に基づくサブユニットワクチンの使用について述べている。しかし そのようなワクチンは商業的には生産されていない。

バラミクソウィルスとラブドウィルスは共にオーダー・モノネガヴイラレス（Ｏ ｒｄｅｒ　Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）中のウィルスファミリー（それぞ れ、（ラミクソヴイリダエ（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）およびラブドヴ イリダエ（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）　）に分類される。これらのウィルス ファミリーは広く類似する構造、ゲノム編制および遺伝子発現と複製の方法を共 有している。両ファミリーのウィルスは、粒子組み立ての核形成に関与する３′ および５′末端ドメインを組み込む一本鎖（−）センスＲＮＡゲノムと、核タン パク質、マトリックスタンパク質、ポリメラーゼタンパク質、糖タンパク質およ びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコード化するものを含む少なくとも５つの ウィルス遺伝子を有する。これらの対応するタンパク質は両ファミリ−のウィル ス複製において同じ普遍的役割を担っている。パラミクソウィルス粒子の構造に は、マトリックスタンパク質と結合して、細胞原形質膜を通して発芽することに よって、狂犬病ウィルスについて上述した過程に類似する過程で糖タンパク質を 組み込むＲＮＰ複合体が含まれる。パラミクソウィルスには麻疹ウィルス、流行 性耳下腺炎ウィルス、パラインフルエンザウィルス、呼吸器合胞体ウィルス、鶏 のニューカッスル病ウィルス、牛疫ウィルスおよびイヌシスチンツク−ウィルス を含むヒトと獣の重要な病原物質が含まれる。パラミクソウィルスに対する様々 な不活化ワクチン、減毒した生ワクチン、組換えワクチンおよびサブユニットタ ンパク質ワクチンが記述されており、これらはラブドウィルスワクチンにについ て上述した特性に類似する特性を持つ。ラブドウィルスとノくラミクツウィルス の類似性に関する議論はプリンゲル（１９９１）Ａｒｃｈ、　Ｖｉｒｏｌ、　１ １７　：１３７−１４０に記述されており、パラミクソウィルスの構造とパラミ クソウィルスワクチンの要約はレイおよびコンパンス（１９９０）　ｒＩｍａ＋ ｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ＶｉｒｕｓｅｓＪ第■巻（エムエイチブイ・ ファン・レゲンモーテルおよびエイアール・ニューラス編、エルセピア−・プレ ス、アムステルダム、　２１７−２３６頁）に記述されている。

最近になって、培養真核細胞におけるウィルス構造遺伝子の発現によって合成ウ ィルス様粒子（ＶＬＰ）を構築することが可能であることが明らかにされた。そ の手法を用いてポリオウィルスの合成ＶＬＰが構築されている。ウラカワら（１ ９８９）Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　７０：１４５３−１４６３は、バクロ ウィルスのポリヘトリン遺伝子内にポリオウィルスの完全なポリシストロン性ｍ ＲＮＡを挿入したことを報告している。

この組換えバクロウィルスに感染した昆虫細胞はポリオウィルスのポリプロティ ンを合成およびプロセシングし、空のＶＬＰを大量に生産した。これらの合成キ ャプシドはＲＮＡを含有せず、感染性でもなかったが、その他の点では天然のポ リオウィルスと類似していた。類似の方法を用いて、ブルータングウィルス（フ レンチおよびロイ（１９９０）Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６４：１５３０−１５３６ 　；フレンチら（１９９０）Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６４：５６９５−５７００） 、Ｂ型肝炎ウィルス（タケハラら（１９８８）Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　 ６９：２７６３−２７７７）おヨヒ牛免疫不全ウィルス（ラスミュッセンら（１ ９９０）ＶｉｒｏｌｏｇＹ　１７８：４３５−４５１）を含むいくつかの他のウ ィルスのＶＬＰと（核様粒子）ＣＬＰが構築されている。現在までのところ、こ の方法によって形成させた粒子はタンパク質−タンパク質相互作用によって生成 しており、ウィルス核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含有していなかった０ 関連する技術を用いて、いくつかのウィルスの全ゲノムの標本を示すｃＤＮＡク ローンから感染性ウィルスが回収されている。この方法によって、真核細胞にお ける発現に適したプロモーターを含有するプラスミドベクター中に感染性ｃＤＮ Ａがクローン化されている。このようなベクターによる真核細胞の感染は感染性 ウィルスの生産をもたらしている。ポリオウィルス（ラカニエロおよびバルチモ ア（１９８１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１４：９１６−９１９）、シンドバス（Ｓｉ ｎｄｂｕｓ）ウィルス（ライスら（１９８７）Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１　：３ ８０９）、豚小胞疾患ウィルス（イノウニら（１９９０）Ｊ、　Ｇｅｎ、Ｖｉｒ ｏｌ、　７１：１８３５−１８３８）およびスズメノチャヒキモザイクウイルス （アルクイストら（１９８４）Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１　ニア０６６−７０７０）を含 むヒト、植物および動物のウィルスのいくつかに関して、この一般的な方法が使 用されている。この方法はメツセンジャーＲＮＡとして直接機能することができ るプラスセンス（＋）ゲノムＲＮＡを伴うＲＮＡウィルスのみに適用される。こ の方法はマイナス（−）センスＲＮＡゲノムを有するパラミクソウィルスとラブ ドウィルスには適用されない。

発明の開示 本発明の目的は、マイナスセンス（−）ＲＮＡゲノムを含有し、それゆえにゲノ ム断片のみまたは全ゲノムの標本を示すｃＤＮＡクローンから感染性粒子または 欠陥粒子を作成することができないパラミクソウィルスとラブドウィルスに関し て、効果的で完全に非感染性のワクチンを提供することである。またこれらのウ ィルスは粒子形成のためにＲＮＡ上に位置する組み立て要素を必要とし、それゆ えにタンパク質−タンパク質相互作用のみによってＶＬＰを形成させることがで きない。したがって本発明の方法には次の段階が含まれる。

（ｉ）ラブドウィルスまたはパラミクソウィルスのゲノム断片または修飾された ゲノムに対応するＤＮＡ分子を構築する。そのＤＮＡ分子は３°ドメインと少な くとも１つのりボザイムドメインおよび随意に５°ドメインからなることができ 、付着末端を組み込むことができる。

（ｉｉ）段階（ｉ）で得たＤＮＡを真核生物発現ベクターのクローニング部位に 挿入し、上記ゲノム構築物を含有するベクターで真核細胞をトランスフェクショ ンすると同時に、狂犬病ウィルスのＭ２タンパク質、Ｍ、タンパク質、Ｎタンパ ク質およびＧタンパク質に類似する機能をもつものを含むラブドウィルスまたは パラミクソウィルス構造タンパク質のクローン化された遺伝子を含有するベクタ ーで、同じ真核細胞をトランスフェクションする。

（ｉ！１）段階（ｉｆ）でトランスフェクションした細胞から、Ｍ１タンパク質 とＮタンパク質の鞘に包まれてリボ核タンパク質複合体を形成している段階（ｉ ）で構築したＤＮＡ分子から転写されるＲＮＡゲノムと、Ｍ２タンパク質からな る内部マトリックスとＧタンパク質を含む脂質エンベロープで構成されるウィル ス様粒子（ＶＬＰ）を得る。

（ｆｖ）段階（ｔｉｉ）で得たＶＬＰをワクチンに含有させる。

本発明での使用に適したＤＮＡ構築物の範囲に関する一般的構造を図１に例示し 、所望のＶＬＰを生産するための一般的方法を図２に模式的に要約する。

本発明方法の段階（ｉ）に関して、５°および３゛ドメインをラブドウィルスま たはパラミクソウィルスのゲノムの５′および３゛非コード領域の配列から誘導 することができる。ただし必要であれば５゛ドメインを削除することができる。

見虫ザイムドメイン（単数または複数）は既知のりボザイム構造のいずれかから 構築することができ、そのいくつかはハセロツフおよびゲルラッハ（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５８５−５９１に記述されている。リボザイムドメイン （単数または複数）は、本方法の段階（１ｉ）において、真核細胞中で転写され るＲＮＡゲノム構築物の外来部分（ベクター配列やポリ（Ａ）尾など）がその分 子内の適当な位置で切断されて粒子の組み立てを（段階（迅）に記述するように ）可能にすることを保証するであろう。リボザイムドメインはＶＬＰに組み立て られる前にＲＮＡ転写物から切断されてもよいし、あるいはそれが組み立て過程 を防止しないという条件の下でその転写物内に含まれてもよい。リボザイムドメ インのそれぞれは３′および５°ドメインの外部に位！することができ、介在ヌ クレオチド配列をその構築物のドメイン間に挿入してもよい。別法として、リボ ザイムドメイン（単数または複数）を図１に示すように３゛および５“ドメイン の内部に置（こともできる。

フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）ドメインはＶＬＰの形成を防止しない特徴を有するな らいずれのヌクレオチド配列を構成してもよい。好ましくはフィラードメインが 、（−）ＲＮＡゲノムの５”末端非コード領域に隣接するラブドウィルスまたは パラミクソウィルスのＬタンパク質コード領域の一部から誘導される断片を構成 するであろう。フィラードメインは段階（ｆｆｉ）で発現されるべきゲノムがＶ ＬＰの形成を可能にするに足るサイズ（約１０００ヌクレオチド以上）であるこ とを保証するであろう。

狂犬病ＶＬＰの形成に適したＤＮＡ構築物の特定の例を図３〜８に例示する。

例示するＤＮＡ配列は、その構築物が転写されるセンスで一本鎖分子として記載 する。いくつかの構築物で要求され得る二本鎖ＤＮＡ分子は抗相補配列の第２鎖 を組み込むであろう。

図３．４および５は、２つのりボザイムドメイン（Ｒ１およびＲ２）を含む好適 なりＮＡ構築物（ＴＢ−２）の構造上の編制と、配列を例示している。この例で は狂犬病ウィルス（Ｐ■およびＣＶＳ株）のゲノムの５′および３゛末端領域の 既知のヌクレオチド配列から５°および３゛ドメインが誘導される。Ｒ１ドメイ ンはＴＢ−２ＤＮＡ構築物の（−）ＲＮＡ転写物内の部位を標的にするように設 計されている。転写物中のＲ１リボザイムは該ＲＮＡを切断して、転写物の５° 末端が狂犬病ウィルスゲノムのそれに対応するように転写物の外来部分が除去さ れることを保証するであろう。同様にＲ２リボザイムドメインはＴＢ−２ＤＮＡ 構築物の（−）ＲＮＡ転写物内の部位を標的にするように設計されている。Ｒ２ リボザイムは該ＲＮＡを切断して、転写物の３′末端が狂犬病ウィルスゲノムの ３゛末端のそれに近づくように転写物の３°領域（Ｒ２ドメインを含む）の外来 部分が除去されることを保証するであろう。ＴＢ−２構築物内のフィラードメイ ンは狂犬病ウィルス（ＣＶＳ株）Ｌタンパク質遺伝子の５゛末端にある１１３５ ヌクレオチド領域の既知のヌクレオチド配列から誘導される。

図６．７および８は、１つのりポザイムドメイン（、Ｒ）を組み込む好適なりＮ Ａ構築物（ＴＢ−１）の編制と配列を例示している。この例では狂犬病ウィルス （ＰＶおよび０７８株）のゲノムの対応する５′および３′末端領域の既知のヌ クレオチド配列から５゛および３゛ドメインが誘導される。Ｒリポザイムドメイ ンはＴＢ−ＩＤＮＡ構築物の（−）ＲＮＡ転写物内の部位を標的にするように設 計されている。

Ｒリボザイムは該ＲＮＡを切断して、転写物の３゛末端が狂犬病ウィルスゲノム の３゛末端に近づくように転写物の３′領域（Ｒドメインを含む）の外来部分が 除去されることを保証するであろう。ＴＢ−１構築物中のフィラードメインは狂 犬病ウィルス（ＣＶＳ株）Ｌタンパク質遺伝子の５′末端にある１１６７ヌクレ オチド領域のヌクレオチド配列から誘導される。

本発明方法の段階（ｉｌ）に関して、修飾されたゲノムまたはゲノム断片とウィ ルス構造タンパク質を発現させるために好適なベクターのいずれを用いてもよい ことは当業者に理解されるであろう。これには例えば真核系（例：ボックスウィ ルス、パピローマウィルスまたはレトロウィルスベクターを用いる哺乳類細胞、 あるいは酵母細胞中）が含まれ得る。しかし好ましい発現系はスポドブテラ・フ ルギベルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）から得られるもの などの昆虫宿主細胞を感染させるためにバクロウィルスベクターを使用すること である。

本発明方法に関して、昆虫細胞培養とバクロウィルス発現系を用いることによっ てかなり安価で容易に大量のタンパク質を生産し得ることが知られている。この ことはカメロンら（１９８９）ＴＩＢＴＥＣＨ７：６６−７０に記述されている 。バクロウィルスは昆虫に感染する大きなりＮＡウィルスである。感染サイクル の後期にバクロウィルスはいくつかのタンパク質を極めて大量に発現させる。こ れらのタンパク質（例・ポリヘトリンおよびｐｌｏ）を発現させる遺伝子は培養 におけるバクロウィルスの複製とって必須ではなく、外来遺伝子のためのクロー ニング部位として使用されてきた。このような組換えバクロウィルスは外来の真 核またはウィルスタンパク質を、しばしば天然のタンパク質とよく似た形態で、 高レベルに発現させる。多数の動物ウィルスタンパク質がｐｌｏまたはポリへド リンプロモーターの制御下にあるバクロウィルス系で発現されている。ウィルス タンパク質の発現にバクロウィルス系を適用する例はエメリー（１９９１）Ｒｅ ｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙｌ：１１−１７に記述さ れている。ラブドウィルスタンパク質の発現にバクロウィルス系を使用する例は バイレイら（１９８９）ＶｉｒｏｌｏｇＹ　１６９：３２３−３３１、ブレハウ ドら（１９８９）ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７３・３９０−３９９とブレハウドら（ １９９０）ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７８：４８６−４９７に記述されており、バラ ミクソウィルスタンパク質についてはファン・ワイク・コーリングら（１９８７ ）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６０：４６５−４７２に記述されており、ビアラードら （１９８９）はＧタンパク質の発現について記述している。狂犬病Ｇタンパク質 遺伝子はクローン化され、バクロウィルスであるアウトグラファ・カリフォルニ カ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の核ポリへドロシスウィ ルス（ＡｃＮＰＶ）から誘導されたバクロウィルス転移ベクターｐＡｃＹＭｌ中 に挿入された。この組換え転移ベクターとＡｃＮＰＶＤＮＡを用いてスボドプテ ラ・フルギベルダ細胞を同時トランスフェクションし、高レベルの狂犬病Ｇタン パク質を発現させる組換えバクロウィルスをその細胞から回収した。

先に言及したプレハウドら（１９９のは、アウトグラファ・カリフォルニカの核 ポリへドロシスウィルスから誘導され、狂犬病ウィルスのＮタンパク質の完全な コード領域を含をするバクロウィルス発現ベクター（ＡｃＮＰＶ３）の製造につ いて記述している。該狂犬病遺伝子をＡＣＮＰＶポリへドリンプロモーターの制 御下に！き、これを、誘導された組換えバクロウィルスによってスポドプテラ・ フルギベルダ細胞内で高レベルに発現させた。バクロウィルス発現系は、例えば スミスら（１９８５）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 　８２：８４０４−８４０８、ミラーら（１９８６）Ｇｅｎｅｔ奄メ@ｅｎｇ ｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　８：２７ ７−２９８、ポ’／　（１９８６）Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、５F４３−５９、 マツウラら（１９８７）Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６７　＋１５１５−１ ５２９、ルクノウら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ■ ６：４７−５５、カング（１９８８）＾ｄｖ、　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、　３５： １７７−１９２、ビショップおよびポジー（１９９０）Ａｄｖ、　Ｇｅｎｅ　Ｔ ｅｃｈｎｏｌ、　１　＋５５−７２およびミラーら（１９８８）Ａｎｎ、　Ｒｅ ｖ」１ｃｒｏｂｉｏ１．４２F１７７− １９９にも報告されている。

合成ＶＬＰの形成に関して、ラブドウィルスおよびバラミクソウィルス粒子の天 然の形成がウィルス構造タンパク質を必要とするが、完全なゲノムＲＮＡを必要 としないことが知られている。例えば、動物または細胞培養のラブドウィルスま タハハラミクソウイルス感染の過程で欠陥干渉（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ−ｉｎｔｅ ｒｆｅｒｉｎｇＸＤ　１）粒子が一般に形成される。ＤＩ粒子はウィルス構造タ ンパク質のすべてを含有し得るが、欠失していて、それゆえに欠陥のあるゲノム を含有する。欠陥ゲノムはＤＩ粒子が完全な非欠陥ウィルスの不在下で複製する ことを不可能にする。ＤＩ粒子の性質に関する側面はハウングおよびバルチモア （１９７７）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１０ニア３−１ １６、ホーランドら（１９８０）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｖｉｒｏｌｏｇ ｙ　１６：１３７−１９２、ベラウルト（１９８１）Ｃｕｒｒ丁ｏｐ、　ｎｊｃ ｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　９３：１５１−２０７およびホーランド（ １９８５）　ｒＶｉｒｏｌｏｇｙＪ　（ビーエヌ・フィールド編、レイパン・プ レス、ニューヨーク、　７７−９９頁）に要約されている。またバトニアクおよ びベルツ（１９９１）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８８：１３７９−１３８３では、５つの〜・”ＳＶ構造タンパク質のす べてをクローン化されたｃＤＮ、Ａから発現させるワクシニアウィルスベクター とＶＳＶＤＩ粒子で細胞を同時に感染させると、ＶＳＶＤＴ粒子の複製が起こり 得ることも知られている。

本発明方法の段階（ｉｌｉ＋）と（ｔｖ）に関して、ラブドウィルスＴＢ−２お よびＴＢ−ＩＤＮＡ構築物について記述し、例示した方法を用いることによって 、合成のラブドウィルスまたはバラミクソウィルス欠陥または感染性ウィルス様 粒子（ＶＬＰ）を昆虫細胞内で生産することができよう。この方法で生産される ＶＬＰはヘルパーウィルスまたはＤＩ粒子およびヘルパー細胞を必要としないで あろう。組み立てと細胞からの放出の後、そのＶＬＰを当該技術分野で知られて いる適当な佐剤と組み合わせて好適なワクチンとして使用することができる。そ のような佐剤にはタイルＡ（Ｑｕｉｌ　Ａ）および他のサポニン、ＴＳＣＯＭ、 フロイント不完全または完全アジュバントと、例えばバンセロウ（１９８７）ｖ ｅｔ、Ｂｕｌｌ　５７：８８１−８９６に記述されているあらゆる他の佐剤が含 まれる。

上述のようにＶＬＰを使用することが、天然の構造に密接に類似する形態で存在 する天然ウィルスの重要な免疫原性タンパク質のすべてを含有するであろうこと は理解されるであろう。ラブドウィルスまたはバラミクソウィルスが引き起こす 疾患または病気に罹り得る主体に投与するためのワクチンに用いれば、ＶＬＰは 現在使用されている不活化したウィルスを組み込んだワクチンとほぼ同じ方法で 免疫を引き起こすであろう。しかしラブドウィルスまたはバラミクソウィルス粒 子を組み込んだワクチンとは異なり、感染性のウィルスが存在する可能性または 毒性への反転が起こる可能性はない。なぜなら本発明のＶＬＰはウィルスゲノム の断片のみを使用し、完全なウィルスタンパク質をコードする遺伝子を使用しな いことができるからである。

狂犬病ウィルスに基づ＜ＶＬＰの構築について記述した原理と方法を、他のあら ゆる（−）センス非***ＲＮＡウィルス（具体的にはラブドウィルスおよびバラ ミクソウィルス）に適用できることも理解されるであろう。基本的に、要求され るＶＬＰは、ラブドウィルスまたはバラミクソウィルスのゲノムの３′末端配列 に対応する３°ドメイン、発現されたＲＮＡが切断されて要求される３゛末端が 生成することを保証する少なくとも１つのりボザイムドメイン、および発現され たサブゲノムＲＮ　Ａが粒子形成を凝集させるに足るサイズ（約１０００ヌクレ オチド）であることを保証するフィラードメインを含む必須組み立て要素を含有 する好適な修飾ゲノムまたはゲノム断片を含有するであろう。３′ドメインと完 全に、または不完全に塩基対を形成する５′ドメインおよび発現されたＲＮＡが 切断されて要求される５゛末端が生成することを保証する第２のりポザイムドメ インをこの構築物に組み込んでもよい。次にすべてのＶＬＰ形成のために、真核 細胞内で、要求されるＤＮＡ構築物の転写物が同種のラブドウィルスまたはバラ ミクソウィルスの要求される構造タンパク質と同時に発現されるであろう。

本発明の好ましい実施態様 本発明の方法を下記の実施例に記述するが、これらの実施例は本発明の例示を目 的とするものであって、本発明の範囲の制限を意図するものではない。

略号と定義 、ＡｃＮＰＶ：アウトグラファ・カリフすルニカ核ポリへドロシスウィルスＢＥ ＦＶ　：牛−過性熱ウイルス ｃＤＮＡ：相補デオキシリボ核酸 ＣＬＰ　：核様粒子 Ｃ〜ｒＳ：チャレンジウィルス標準 ＤＩ、欠陥干渉 ＤＮＡ　：デオキシリボ核酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸ＰＡＣ；Ｅ・ポリアクリルアミドゲル電 気泳動ＰＢＳ　ニリン酸緩衝化食塩水 ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応 ＰＦＵ：プラーク形成単位 ＰＭＳＦ：フッ化フェニルメチルスルホニルポリ（Ａ）・ポリアデニル酸 ＰＶ・パスツールウィルス ＳＤＳ　ニドデシル硫酸ナトリウム トリス（Ｔｒｉｓ）：）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンＲ：ＴＢ−Ｉ　 ＤＮＡ構築物のりボザイムドメインＲ１：ＴＢ−２ＤＮＡ構築物のりボザイム１ ドメインＲ２：ＴＢ−２ＤＮＡ構築物のりギザイム２ドメインＲＮＡ：リポ核酸 ＲＮＰ：リポ核タンパク質 ｒｐｍ・１分あたりの回転数 ＲＴ：室温 ＶＳＶ：水痘性口内炎ウィルス ＶＬＰ：ウィルス様粒子 ｗ／ｗ：重量百分率 材料と一般的な実験手法 合成オリゴヌクレオチド（図９を参照のこと）は脱保護され精製された製品とし て、センター・フォー・モレキュラー・バイオロジー・アンド・バイオテクノロ ジー（オーストラリラ、ブリスベン、セント・ルシア）から供給された。

すべての組換えＤＮＡクローニング手法および分析手法は、制限酵素消化、脱リ ン酸化、連結、形質転換、ＤＮＡ調製およびＤＮＡ電気泳動を含めて、サムプル ツクら（１９８９）　ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａｌＪ　（第２版、コールド・スプリング・ハーバ− ・ラボラトリ−・プレス、ニューヨーク）とパーパル（１９８８）　ｒＡ　ｐｒ ａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇＪ　 （ウィリー、ニューヨーク）に記述されている通りとした。

ヌクレオチド配列分析の手法はサンガーら（１９７７）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４　：５４６３−５４６７に記述されてい る。

５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫プロッティングを含むタンパク質の分析手法はブレ ハウドら、　１９８９．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７３：３９０−３９９．１９９ ０．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７８：４８６−４９７に記述されている通りに行った 。

スボドブテラ・フルギペルダ細胞の培養、シャトルおよび転移ベクターの構築な らびに組換えバクロウィルスの作成、選択および分析を含むバクロウィルス発現 系の使用法はプレハウドら、　１９８９．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７３：３９０ −３９９．１９９０．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７８：４８６−４９７に記述されて いる通りに行った。

好ましい態様の実施例 実施例１　：ＴＢ−２ＤＮＡ分子を含有するプラスミドベクターの構築重複する 合成オリゴヌクレオチドプライマーと狂犬病ゲノムＲＮＡ鋳型を以下の段階で使 用し、数回の連続的なＰＣＲによってＴＢ−２ＤＮＡを構築する。

（ｉ）狂犬病ウィルス（ＣＶＳ株）ゲノム、プライマーＬＬ（図９）および逆転 写酵素を用いて狂犬病Ｌタンパク質遺伝子の必要な部分の一本鎖ｃＤＮＡコピー を調製し、次にプライマーＬ１とＬ２（図９）およびポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）を用いて必要なヌクレオチド配列の二本鎖ＤＮＡ分子を増幅することによ って、フィラードメインを含有するプラスミドベクターを得た。次にそのＤＮＡ 分子を適当なプラスミドベクター（例：ｐＵＣ１１８）のＳｍａＩ部位にクロー ン化した。

フィラードメインを含有するこの組換えプラスミドをｐＦＩＬＬと命名した。ｐ ＦＩＬＬ内の組換えＤＮＡ挿入物の完全なヌクレオチド配列を決定したところ、 図５に記載のフィラードメインのそれに対応することが明らかになった。

（ｉｆ）段階（ｉ）で得たｐＦＩＬＬを鋳型とし、プライマーＴＢ５ＡとＴＢ３ Ａ（図９）を用いるＰＣＲによってフィラードメインを伸長した。

（ｆｆｉ）プライマーＴＢ５ＢとＴＢ３Ｂ（図９）を用いるＰＣＲによって、段 階（ｉｔ）で得たＰＣＲ産物を伸長した。

（汁）プライマーＴＢ５ＣとＴＢ３Ｃ（図９）を用いるＰＣＲによって、段階（ ｆｆｉ）で得たＰＣＲ産物を伸長した。

（ｖ）ＢＡｈ　Ｈ１消化の後、段階（滓）で得たＰＣＲ産物を適当なプラスミド ベクター（例：　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋、ストシタジーン。米国う・ ジョラ）内にクローン化した。ＴＢ−２構築物を含有するプラスミドベクターを ｐＴＢ２と命名した。

ｐＴＢ２中の組換え挿入物の完全なヌクレオチド配列を決定したところ、図５に 記載のＴＢ−２構築物のそれに対応することが明らかになった。

実施例２・ＴＢ−Ｉ　ＤＮＡ分子を含有するプラスミドベクターの構築下記の段 階にしたがってＰＣＲを用いることにより、ＴＢ−２’ＤＮＡ構築物からＴＢ− Ｉ　ＤＮＡを誘導した。

（ｉ）ｐＴＢ−２プラスミドをプライマーＴＢＩとＴＢ３Ｃ（図９）を用いるＰ ＣＲの鋳型として用いた。

（ｉｔ）プライマーＴＢ５ＣとＴＢ３Ｃ（図９）を用いるＰＣＨによって、段階 （ｉ）で得たＰＣＲ産物を伸長した。

（ｔｉｔ）ＢａｍＨ１消化の後、段階（ｉｆ）で得たＰＣＲ産物を適当なプラス ミドベクター（例：　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋、ストラタジーン、米国 う・ジョラ）内にクローン化した。ＴＢ−１構築物を含有するプラスミドベクタ ーをｐＴＢｌと命名した。ｐＴＢｌ中の組換え挿入物の完全なヌクレオチド配列 を決定したところ、図８に記載のＴＢ−Ｉ　ＤＮＡ構築物のそれに対応すること が明らかになった。

プラスミドベクターｐＴＢ２およびｐＴＢｌをＸｂａｌで切断するか、もしくは 切断せず、ｐＧＥＭ発現転写キット（プロメガ、オーストラリア、ＮＳＷ、ロゼ ル）と［”５３ＵＴＰ（アマ／ヤニ・インターナショナル・リミテッド）を用い るＴ３ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写のための鋳型として使用した。

インビトロ転写を３７℃か２８℃で行った。６％ポリアクリルアミド−尿素配列 決定ゲル中での電気泳動によって生成物を分析した。既知の配列を持つプラスミ ドを標準的なジデオキシヌクレオチド配列決定反応中で調製し、分子量ラダーと じて隣接するレーンに流した。電気泳動の後、ゲルを固定し、乾燥し、オートラ ジオグラフィーによって可視化した。３７℃または２７℃のインビトロ転写は共 に、リボザイムドメインによって標的にされる部位でのシス作用性切断の産物に 対応するサイズのＲＮＡ転写物をもたらした。プラスミドｐＴＢ２から３７℃で 得られる転写物について、その結果を図１０に記載する。転写物の５°末端にお けるリボザイムＲ１切断の短い生成物は、Ｔ３転写開始からＲ１切断部位までの 予想される配列に対応する９３ヌクレオチドの分離したバンド（Ａ）として現れ た。転写物の３′末端におけるリボザイムＲ２切断の短い生成物は、Ｘｂａｌ切 断プラスミドを鋳型として用いた場合に、６６ヌクレオチドと６７ヌクレオチド の二重バンド（Ｂ）として現れた。これは１塩基ランオン（インビトロ転写物の ３′末端でしばしば発生することが知られている）とＲ２切断部位からＸｂａ１ 部位までの予想される配列に対応した。予期されるように、切断していないプラ スミドを鋳型として使用した場合には、予期される生成物が大きく、転写終結の 性質に応じて様々なサイズであり得るので、バンドＢは起こらなかった。狂犬病 サブゲノムＲＮＡに対応するＲ１とＲ２の長い切断生成物はバンドＣにその位置 が特定された。転写効率は低かったが、２８℃のＴＢ−２についても類似する結 果が得られた。予期されるように、Ｘｂａｌ切断ｐＴＢ１を用いるインビトロ転 写は、バンドＢと上記バンドＣよりわずかに小さいサイズの大きい生成物のみを もたらした。

これらの結果は、５′および３′リボザイムドメインが共に活性であって、ＤＮ Ａ構築物から誘導される転写物を効率よく切断して所望のサブゲノムＲＮＡ断片 を生成させることを示した。２８℃で起こった切断はりポザイムドメインが昆虫 細胞の周囲温度で活性であることを示した。

ＢａｍＨｌでの消化によって組換えプラスミドｐＴＢ２およびｐＴＢｌからそれ ぞれＴＢ−２およびＴＢ−Ｉ　ＤＮＡ挿入物を得て、ＢａｍＨ１消化し、脱リン 酸化した転移ベクターｐＡｃＹＭ１（ＮＥＲＣＩＶＥＭ、英国オフスフオード） の誘導体中にサブクローニングすることによって、バクロウィルス（ＡｃＮＰＶ ）転移ベクターを構築した。ＴＢ−２およびＴＢ−Ｉ　ＤＮＡ挿入物を含有する 転移ベクターをそれぞれｐＡｃＴＢ２およびｐ　、Ａ、　ｃ　Ｔ　Ｂ　１と命名 した。

ＴＢ−２およびＴＢ−１サブゲノムＲＮＡを発現させる組換えバクロウィルスを 得るために、組換え転移ベクター（ｐＡｃＴＢ２またはｐＡｃＴＢｌ）ＤＮＡ（ １ｔ、ｔｇ）とバクロウィルスＡｃＲＰ２３−１　ａｃＺウィルスＤＮＡ（１０ ０Ｔｌ　ｇ’）の混合物でスポドブテラ・フルギペルダ細胞をリポフニクション した。過去に記述されているように組換えバクロウィルスを選別しくキッツら、 　１９９０．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１８：５６６７ −５６７２およびブレハウドら、　１９９２．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、印刷中）、 高力価（すなわち＞１０７ＰＦＵ／ｍｌ）の貯蔵物を調製した。ＴＢ−２および ＴＢ−Ｉ　ＤＮＡ構築物を含有する組換えバクロウィルスをそれぞれＡｃ、ＴＢ ２およびＡｃ、ＴＢｌと命名した。

実施例５．スポドブテラ・フルギベルダ細胞の混合感染と狂犬病ＶＬＰの精製（ ｆ）野生型バクロウィルス（Ａ　ｃ　Ｎ　Ｐ　Ｖ）互、ＪＪＪ狂犬病サブゲノム ＲＮＡを発現させる組換えバクロウィルス（Ａｃ、ＴＢ２またはＡｃ、ＴＢｌ） 、または、（ｉｆ　）　狂犬病Ｎ　９　：／ハ’）質（ＡｃＮＰＶ３）、Ｍ１タ ンパク質（ＡｃＮＰＶＭｌ）、Ｍ２タンパク質（ＡＣＮＰｖＭ２）およびＧタン パク質（Ａ　ｃ　Ｎ　Ｐ　Ｖ　２　）ヲ発現すセる組換えバクロウィルス（プレ ハウドら、　１９８９．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７３：３９０−３９９．１９９ ０．　Ｖｉｒ。

１ｏｇｙ　１７８・４８６−４９７を参照のこと）、または、（ｉｆｆ）狂犬病 Ｎ／Ｍ１タンパク質（Ａ、ｃＮＰＶＮ／Ｍｌ）およびＭ２／Ｇタンパク質（Ａ、 ｃＮＰＶＭ２／Ｇ）を発現させる組換え二重発現バクロウィルス、または、（ｔ ｖ）組換え二重発現バクロウィルスＡｃＮＰＶＮ／ＭｌおよびＡｃＮＰＶＭ２／ Ｇならびに狂犬病サブゲノムＲＮＡを発現させる組換えバクロウィルス（Ａｃ。

ＴＢ２またはＡｃ、ＴＢｌ）を用いて、スポドブテラ・フルギベルダ細胞（５Ｘ １０’細胞）の４つの同一な培養をＩＰＦＵ／細胞の多重度で同時感染させた。

それらの培養を３８Ｄで３日間インキュベートした。培養から培養上清を回収し 、ＪＡ２０ローター（ベックマン）中４℃で４００Ｏｒｐｍで１０分間の遠心分 離によって浄化した。５Ｗ２８０−ター（ベックマン）中４℃で２７０００ｒｐ ｍで１時間で、上清から粒子をペレット化した。そのベレットをＴＤ緩衝液（０ ，８ｍＭｈリスーＨＣｌ、１５０ｍ、Ｍ　ＮａＣＬ　５ｍＭ　ＫＣＬ　０．７ｍ Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，４）に再懸濁し、ＴＤ緩衝 液中に作成した１０ないし４０％（Ｗ／Ｗ）の２段階ショ糖勾配中で遠心分離す ることによってさらに精製した。勾配の界面に位置するバンドを集め、５Ｗ４０ ローター（ベックマン）中４℃で３００００ｒｐｍで１時間の遠心分離によって 粒子をペレット化した。ベレットをＴＤ緩衝液に再懸濁し、−２０℃で保存した 。後述の実施例７と実施例８に例示するように、この手法によって狂犬病ウィル スタンパク質とＴＢ−２またはＴＢ−１サブゲノムＲＮＡの両方が発現される培 養だけからＶＬＰが精製された。

上記実施例５に記述した組換えバクロウィルスおよび野生型バクロウィルスを用 いてＩＰＦＵ／細胞の多重度でスポドブテラ・フルギペルダ細胞（１，５Ｘ１０ ６細胞）の４つの同一な培養を同時感染させた。感染の３日後に上清培地を皿か ら除去し、単層をリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で３回濯ぎ、ＲＩＰＡ緩衝液（ １％トリトンＸ−１００，１％ドデンル硫酸ナトリウム、ｐＨ７，４）１５０μ Ｉ中で細胞を溶解した。タンパク質試料の一部を解離緩衝液（２，３％ＳＤＳ、 １０％グリセロール、５％β−メルカプトエタノール、６２．５ｍＭｈリスーＭ ＣＩ、００１％ブロモフェノール・ブルー、ｐＨ６，８）中で１０分間煮沸し、 −２０℃で保上記実施例６に記述したようにして得た細胞溶解調製物と上記実施 例５に記述した培養上清から得られる勾配精製した粒子調製物を、５ＤＳ−ＰＡ ＧＥと免疫プロッティングによって、狂犬病ウィルスタンパク質の存在について 分析した。

１０％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動によって分離したタンパ ク質をニトロセルロース膜に電気プロットした。プロットを遮断溶液（ＰＢＳ中 の３％低脂肪スキムミルク粉末および０．０１％アジ化ナトリウム）と共に２時 間インキュベートした後、１１５００希釈のマウス抗ＣＶＳポリクローナル抗体 を含有する遮断溶液に移し、終夜インキュベートした。洗浄の後、ベルオキシダ ーゼ結合抗マウスＩｇＧ（シグマ・ケミカルズ、米国ミズーリ州セント・ルイス ）を用いて、結合した抗体を検出した。４−クロロ−１−ナフトールと３，３゛ −ジアミノベンンジン四塩酸塩（シグマ・ケミカルズ、米国ミズーリ州セント・ ルイス）をベルオキシダーゼの基質として、上記プロットを発色させた。

この手法による細胞溶解液調製物の分析は、対応する遺伝子を含有する一重また は二重組換えバクロウィルス発現ベクターで感染させた培養の溶解液と、二重組 換えバクロウィルスＡ　ｃ　Ｎ　Ｐ　ＶＮ／Ｍ　１宛主、４．ＡｃＮＰＶＭ２／ Ｇぎ主ｙ組換えバクロウィルスＡｃＴＢ２またはＡｃＴＢｌに感染させた培養か ら得られる溶解液における、狂犬病ウィルスＧＳＮ、ＭｌおよびＭ２タンパク質 の検出をもたらした。野生型バクロウィルス互生ｇ組換えバクロウィルスＡｃ、 ＴＢ２またはＡｃ、ＴＢｌに感染させた培養では狂犬病ウィルスタンパク質が検 出されなかった。

勾配精製した粒子調製物をこの手法で分析したところ、狂犬病ウィルスＮ、Ｍ１ 、Ｍ２およびＧタンパク質が二重組換えバクロウィルスＡｃＮＰＶＮ／Ｍ１およ びＡ　ｃ　Ｎ　Ｐ　Ｖ　Ｍ　２　／　Ｇと組換えバクロウィルスＡｃＴＢ２また はＡｃＴＢｌに感染させた培養から調製した粒子内のみに検出された。上記の実 施例５に記述した池の培養から得られる粒子調製物内では狂犬病抗体との反応は 検出されなかった。

これらの分析の結果を図１１に要約する。これらの結果は狂犬病Ｎ、Ｍｌ、Ｍ２ およびＧタンパク質が対応する遺伝子を含有するバクロウィルス発現ベクターで 感染させたすべての培養内で合成されたことを示している。しかし、狂犬病タン パク質を含有する粒子の放出は、ＴＢ−２およびＴＢ−１サブゲノムＲＮ　Ａを 発現させる組換えバクロウィルスでも感染させた培養だけで起こった。下記実施 例８に記述するようにこれらの粒子は電子顕微鏡法によっても同定された。

実施例８　狂犬病Ｖ　Ｌ　Ｐ調製物の電子顕微鏡検査野生型および組換えバクロ ウィルスで混合感染させた培養に由来する上記実施例５で得た精製画分を炭素被 覆グリッドに滴下し、ＴＤ緩衝液で３回洗浄し、２％酢酸ウラシルでネガティブ に染色した。次に日立透過型電子顕微鏡を用いてその試料を調べた。

（Ｄ野生型バクロウィルス友主り狂犬病サブゲノムＲＮＡを発現させる組換えバ クロウィルス、または、 （ｉｉ）狂犬病Ｎ、Ｍｌ、Ｍ２およびＧタンパク質を発現させる組換えバクロウ ィルス、または、 （ｉｉｉ）狂犬病Ｎ／Ｍｌタンパク質およびＭ２／Ｇタンパク質を発現させる組 換え二重発現バクロウィルス、 で同時感染させた培養から得られる対照調製物では、バクロウィルス粒子の既知 の構造に対応する桿状粒子のみが観測された。その粒子は比較的一定のサイズ（ ２５Ｏｒ＋ｍｘ４Ｑｎｍ）と形状（桿状）を持ち、大部分は無傷であるように思 われた。

狂犬病Ｎ、Ｍｌ、Ｍ２およびＧタンパク質を発現させる組換えバクロウィルスお よび狂犬病サブゲノムＲＮＡを発現させる組換えバクロウィルスで同時感染させ た培養から得られる調製物では、（図１２に例示するように）２種類の粒子が観 測された。１つの粒子は対照調製物中で観測されたバクロウィルス粒子に対応し た。（対照調製物内には決して観測されなかった）もう１つの種類の粒子は直径 がおよそ７０〜８５ｎｍの不規則な構造からなる。これらの粒子はしばしば高電 子密度の核と明るく照らされた周辺部を示し、その周辺を通して数多くの規則正 しい表面スパイクまたは突起物が突き出していた。これらの粒子は狂犬病ＶＬＰ であり、高電子密度の核がリボ核タンパク質複合体を表し、明るく照らされた周 辺部がウィルスの脂質エンベロープを表し、スパイクがウィルスの表面糖タンパ ク質を表すという、数種類のラブドウィルスＤＩ粒子について過去に報告されて いるものと類似しティる（　ｒＴｈｅ　ＲｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓＪ　（１９ ８７）（アールアール・ワグナ−編。

プレナム・プレス、ニューヨーク）を参照のこと）。

本発明に関連する範囲と寄託 本発明の範囲はワクチン成分以外の目的（すなわち診断試薬）でも使用すること ができるＶＬＰと共に上述のＤＮＡ構築物自体をも包含する。

プラスミドｐＡｃＴＢ２は１９９２年７月１６日にオーストラリアン・ガバメン ト・アナリティカル・ラボラトリーズ（ＡＧＡＬＸオーストラリア、エヌ・ニス ・ダブリュ、スオーキン・エステイ・ピンプル）に寄託され、受託番号９２／３ ２５８９を割り当てられた。

（以下余白） 図面の説明 図１・ＶＬＰに包含させるためのラブドウィルスまたはパラミクソウィルスのサ ブゲノムＲＮＡの発現に適したいくつかのＤＮＡ構築物の模式図。Ｒ１とＲ２は 適当なりポザイムドメインを表し、５′ドメインはラブドウィルスまたはパラミ クソウィルスの（−）センスＲＮＡゲノムの５′末端ゲノムに由来する。３°ド メインはラブドウィルスまたはパラミクソウィルスの（−）センスＲＮＡゲノム の３°末末端列に由来し、フィラードメインは何らかの適当なヌクレオチド配列 を表す。ＦｌとＦ２はフィラードメインの一部である。Ｓｌと８２は介在ヌクレ オチド配列を表す。

図２：狂犬病ウィルスＶＬＰの形成を例として、バクロウィルス発現系を用いる ラブドウィルスまたはパラミクソウィルスＶＬＰ形成の一般的過程を表した模式 図。

図３：ＴＢ−２サブゲノムＤＮＡ構築物の編制の模式図。バクロウィルス発現ベ クターのＢａｍＨ１部位へのクローニングに適した二本鎖ＤＮＡ分子として構造 を表す。Ｒ１およびＲ２リポザイム切断部位は、転写が記載の方向に起こると仮 定して、このクローン化されたＤＮＡのＲＮＡ転写物内で活性なものである。

図４ｌ機能的ドメインとＲ１およびＲ２リボザイム切断部位を示した、ＴＢ−２ サブゲノムＤＮＡ構築物の転写物の配列の図解。

図５　：　ＴＢ−２サブゲノムＤＮＡ構築物のヌクレオチド配列（ｉｉ写［＋コ センスの一本鎖ＤＮＡ）。

図６：ＴＢ−１サブゲノムＤＮＡ構築物の編制の模式図。バクロウィルス発現ベ クターのＢａｍＨ１部位へのクローニングに適した二本鎖ＤＮＡ分子として構造 を表す。Ｒリボザイム切断部位は、転写が記載の方向に起こると仮定して、この クローン化されたＤＮＡのＲＮＡ転写物内で活性なものである。

図７二機能的ドメインとＲリポザイム切断部位を示した、ＴＢ−１サブゲノムＤ ＮＡ構築物の転写物の配列の図解。

図８　：ＴＢ−１サブゲノムＤＮＡ構築物のヌクレオチド配列（転写［＋］セン スの一本鎖ＤＮＡとして表したもの）。

図９＝フィラードメイン、ＴＢ−２サブゲノムＤＮＡおよび誘導されたＴＢ−１ サブゲノムＤＮＡの構築においてＰＣＲに使用する合成オリゴヌクレオチドのヌ クレオチド配列。

図１０：Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼを用いた３７℃における未切断およびＸｂａＩ 切断ｐＴＢ２　ＤＮＡのインビトロ転写の生成物を示す、６％ポリアクリルアミ ド−尿素ゲルのオートラジオグラフ。上記明細書中に記述したようにリポザイム 切断産物をバンドＡ、ＢおよびＣと同定する。

図１トポリクローナル抗狂犬病マウス血清を上記明細書中に記述の如く用いた、 組換えバクロウィルスによる混合感染から得られる細胞溶解液および粒子調製物 の免疫プロット。レーンｌ：野生型ＡｃＮＰＶに感染した細胞の溶解液。レーン ２：狂犬病Ｎ／Ｍ１タンパク質およびＭ２／Ｇタンパク質を発現させる組換え二 重発現バクロウィルスに感染した細胞の溶解液。レーン３：狂犬病Ｎ、Ｍｌ、Ｍ ２およびＧタンパク質を発現させる組換え単一発現バクロウィルスに感染した細 胞の溶解液。レーン４・狂犬病Ｎ／Ｍｌタンパク質およびＭ２／Ｇタンパク質を 発現させる組換え二重発現バクロウィルスとＴＢ−２ＤＮＡ構築物を含有する組 換えバクロウィルスＡｃＴＢ２に感染した細胞の培養上清から調製した粒子。

レーン５：狂犬病Ｎ／Ｍｌタンパク質およびＭ２／Ｇタンパク質を発現させる組 換え二重発現バクロウィルスに感染した細胞の培養上清から調製した粒子。

図１２＝狂犬病ＶＬＰ調製物の電子顕微鏡像。上記明細書に記述の如く、狂犬病 Ｎ５Ｍ１、Ｍ２およびＧタンパク質を発現させる組換えバクロウィルスベクター と組換えバクロウィルス発現ベクターＡＣ，ＴＢ２によるスポドブテラ・フルギ ペルダ細胞の混合感染から得た培養上清から試料を調製した。上記明細書に記述 の如く、この顕微鏡像は狂犬病ＶＬＰ（表面突起物を伴う直径７０〜８０ｎｍの 不規則な粒子）と組換えバクロウィルスの粒子（４０Ｘ　２５０　ｎｍの桿状粒 子）の両方を示している。

Ｆ　Ｉ　ＧＵＲＥ　１ （Ａ）Ｒ１−５ｌ−５’　ドメイン−フイ５−ド）イン−３’　ドメイン−５２ −Ｒ２（Ｂ）５’ドメイン−Ｒ１−フィラードメイン−Ｒ２−３’ドメイン（Ｃ ）Ｒ１−８Ｌ−５°ドメイン−フィラードメイン−Ｒ２−３’ドメイン（Ｄ）　 ５’ドメイン−Ｒ１−フィラードメイン−３゛ドメイン−８２−Ｒ２（Ｅ）Ｒ１ −５’ドメイン−フィラードメイン−３′ドメイン−Ｒ２（Ｆ）５’ドメイン− Ｆ　ｌ　−Ｒｌ−フィラードメイン−Ｒ２−Ｆ２−３’ドメイン（Ｇ）Ｓｌ−フ ィラードメイン−３′ドメイン−Ｒ２（Ｆ）Ｓｌ−フィラードメイン−Ｒ２−３ ’ドメイン（■）５°ト、！インーＦ　１−Ｒｌ−フィラー　トメイ＞−３”ｒ ”メイン−３２−Ｒ２（Ｊ）Ｒ１−Ｓｌ−５’ドメイン−フィラードメイン−Ｒ ２−Ｆ２−３’ドメインＦ　ｉ　ｇ　ｕｒ　ｅ　２　＝狂犬病■ＬＰの構築ＶＬ Ｐｓ 口 ＦＩＧＵＲＥ　５：配列の記載ＴＢ−２ＡτＧＴＧＴＴＴＴＣＧＣＣＧＧＴＣＴ ＧＡ　ＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧ　ＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＧＣ丁ＴＡＡＧＧＡＴ　Ｃ Ｃ１４３２Ｆ　Ｉ　ＧＵＲＥ　計配列の記載ＴＢ−１ＣＧ（ｊＴＡＡＧＧＡ　Ｔ ＣＣ” ＦＩＧＵＲＥ　９　使用したオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配ダＩＣＡＧＧ Ｃ丁ＴＣＣＡ　ＧＧＡＧＴＡ　３’　７１１ｉ丁１５Ｂ： ＴＢ５Ｃ： ５’　ＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＣｒＡＣＧＴＣＡＣＧ　ＣＴ丁八人ＣＡＡＡＴ　Ｘ ＡＡＣＡＡＣ入入Ａ　ＡＡＴＧ入Ｇ入入入Ａ　ＡＣＡＡτＣ■■`Ｃ６０ 人ＡＣＴＡＧＡＧＧ丁　丁ＣＡＧＡ丁τ　３１　７７ＧＸＣＴＣＡＡＴＣ３＋６ ９ ｎ３３Ｂ： ５’　ＡＡＡＣＡＣＡＴＣＧ　ＣＣＧＧＴＧｋＣＧＣＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡ　入 ＡＣＣＡＧＡＧＡＡ　Ｇ入入入へ＾ＧＡＣＡ　ＧＣＧ丁Ｃ入`ＴＴＧ　６０ ＣＡＡＡＧＣＭＡ　３’　６９ Ｂ５６ Ｓ’　ＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣ丁τへＡＧＣＧＴＴＴ　ＣＧＴＣＣＴＣＡＣＧ　Ｇ ＡＣＴＣＡＴＣＡＧ　ＡＣＣＧＧＣＧＡＡＡ　ＡＣＡＣＡＴbＧＣＣ６０ ＧＧＴＧＡＣＧＣＴＴ　入Ａ　３′　７２ＴＢＩ： Ｌｌ。

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Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／ＩＳＡ／２１１Ｘ−−１ａｍｌｙ　−目Ｋｊｕｌｙ　ｌ　９ ９２１　ｓ＋ｖ？＋フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／２０５ 　ＡＦＥ　９２８４−４ＣＣ１２Ｎ　７１０１ ／／（Ｃ１２Ｎ　１５１０９ Ｃ１２Ｒ１：９２） （７２）発明者　プレフォード、クリストフ・シーンオーストラリア連邦　４０ ６７　クイーンズランド、セイント・ルシア、サンドフォード・ストリート　７ ／８２番 Ｉ

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．ラブドウイルスおよびパラミクソウイルスによって引き起こされる感染症を 処置するためのワクチンを製造する方法であって、下記の段階からなる方法。 （ｉ）３′ドメイン、フィラードメインおよびリボザイムドメインを含有する、 ラブドウイルスまたはパラミクソウイルスの完全なゲノム、修飾ゲノムまたはゲ ノム断片に対応するＤＮＡ分子を構築し、（ｉｉ）段階（ｉ）で得たＤＮＡを真 核発現ベクターのクローニング部位に挿入し、そのゲノム構築物を含有するベク ターで真核細胞をトランスフェクションすると同時に、同じ真核細胞を、狂犬病 ウイルスのＧタンパク質、Ｎタンパク質、Ｍ１タンパク質およびＭ２タンパク質 に類似する機能をもつものを含むラブドウィルスまたはパラミクソウイルス構造 タンパク質のクローン化された遺伝子を含有するベクターでトランスフェクショ ンし、（ｉｉｉ）Ｎタンパク質およびＭ１タンパク質の鞘に包まれてリボ核タン パク質複合体を形成している段階（ｉ）で構築したＤＮＡ分子から転写されるＲ ＮＡゲノムと、Ｍ２タンパク質からなる内部マトリックスおよびＧタンパク質を 含む脂質エンベロープから構成されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、段階（ｉｉ ）でトランスフェクションした細胞から得、 （ｉｖ）段階（ｉｉｉ）で得たＶＬＰをワクチンに含ませる。
2. ２．段階（ｉ）において、ＤＮＡ分子がさらに５′ドメインと、発現されたＲＮ Ａがその５′末端で切断されることを保証するための追加のリボザイムドメイン を含有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ３．段階（ｉｉ）において、狂犬病Ｌタンパク質もしくは他のラブドウイルスま たはパラミクソウイルス中の類似のタンパク質に対応するクローン化された遺伝 子がさらに含まれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. ４．段階（ｉ）におけるＤＮＡ分子が付着末端を有することを特徴とする請求項 １に記載の方法。
5. ５．段階（ｉｉｉ）におけるＤＮＡ分子が、狂犬病ウイルスに由来するＬタンパ ク質もしくは他のラブドウイルスまたはパラミクソウイルスの類似のタンパク質 からなるフィラードメインを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. ６．段階（ｉｉ）において、真核発現ベクターがバクロウイルスであり、真核細 胞がスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. ７．段階（ｉｉｉ）においてＶＬＰを佐剤と混合することを特徴とする請求項１ に記載の方法。
8. ８．請求項１に記載の方法によって製造されるワクチン。
9. ９．狂犬病Ｎタンパク質もしくはうブドウイルスまたはパラミクソウイルスに由 来する類似のタンパク質および狂犬病Ｍ１タンパク質もしくはうブドウイルスま たはパラミクソウイルスに由来する類似のタンパク質の鞘によって包まれてリボ 核タンパク質複合体を形成している３′ドメインおよびフィラードメインを含む ＲＮＡゲノムと、狂犬病Ｍ２タンパク質もしくはうブドウイルスまたはパラミク ソウイルスに由来する類似のタンパク質の内部マトリックスおよび狂犬病Ｇタン パク質もしくはうブドウイルスまたはパラミクソウイルスに由来する類似のタン パク質の脂質エンベロープを含有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
10. １０．請求項９のＶＬＰを含むラブドウイルスまたはパラミクソウイルス感染症 のためのワクチン。
11. １１．佐剤を含む請求項１０に記載のワクチン。
12. １２．３′ドメイン、ＤＮＡ構築物から発現されるあらゆるＲＮＡがその３′末 端で発現されることを保証するリボザイムドメインおよびフィラードメインを含 むＤＮＡ構築物。
13. １３．さらに５′ドメインおよびＤＮＡ構築物から発現されるあらゆるＲＮＡが その５′末端で発現されることを保証する追加のリボザイムドメインをも含む請 求項１４に記載のＤＮＡ構築物。
14. １４．図１に記載のＤＮＡ構築物。
15. １５．ＴＢ１。
16. １６．ＴＢ２。
17. １７．ＤＮＡ構築物Ａｃ−ＴＢ２。
18. １８．プラスミドｐＡＣＴＢ２。